ES2197475T3

ES2197475T3 - Nuevo adn plasmidico que contiene adn de gen testigo y utilizacion asociada.

Info

Publication number: ES2197475T3
Application number: ES98928625T
Authority: ES
Inventors: Hiroshi Minase Res. Inst. Ono Pharmaceuti Hagiya; Masashi Minase Res. Inst. Ono Pharmaceuti Minami; Hisao Minase Res. Inst. Ono Pharmaceutica Tajima
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-23
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2018-06-23
Also published as: US20050158775A1; WO1999000491A1; DE69813845T2; JP4044969B2; DE69813845D1; EP1016714A1; US6855543B1; ATE238416T1; EP1016714B1; PT1016714E; KR20010014218A; EP1016714A4; AU8038698A; DK1016714T3

Abstract

Un plásmido de ADN que comprende un promotor y un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una región transmembrana y una región funcional de un antígeno Fas seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 136 y 305 del antígeno Fas de ratón, y una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 145 y 319 del antígeno Fas humano, en una región cadena abajo de un elemento de respuesta a la proteína Gal4.

Description

Nuevo ADN plasmídico que contiene ADN de gen testigo y utilización asociada.

Campo técnico

La invención se refiere a (i) un plásmido de ADN que comprende un nuevo gen testigo de ADN, (ii) un transformante transformado con el plásmido de ADN anterior y un ADN que codifica una proteína efectora conocida, (iii) un agente terapéutico contra un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, que comprende los ADN anteriores como ingredientes activos y (iv) un método para detectar un ligando de un receptor intracelular, que comprende el uso del transformante anterior.

Más particularmente, la invención se refiere a (i) un plásmido de ADN que comprende un nuevo gen testigo, a saber, un promotor esencial mínimo y un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una región transmembrana y una región funcional del antígeno Fas para detectar un efecto de expresión génica, en una región cadena abajo de un elemento intensificador en el que se repite varias veces un elemento de respuesta a la proteína Gal4, que es un factor de transcripción basal de levadura (de aquí en adelante, mencionado como ``UAS''), (ii) un transformante transformado con el plásmido de ADN anterior y con un ADN que codifica una proteína de fusión en la que se une una secuencia de aminoácidos que comprende una región de unión a ligando de un receptor intracelular al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ADN de una proteína efectora conocida, a saber, la proteína Gal4, (iii) un agente terapéutico contra un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, que comprende los ADN anteriores como ingredientes activos y (iv) un método para detectar un ligando de un receptor intracelular que comprende el uso del transformante anterior.

Antecedentes de la técnica

Recientemente, se han dado a conocer mediante manipulación génica, los receptores de los factores humorales que tienen actividades fisiológicas importantes, simbolizados por las citoquinas y las hormonas, y se han aislado e identificado un gran número de receptores. Los ejemplos incluyen los receptores de hormonas lipófilas, mencionados generalmente como receptores intracelulares. Como resultado de los análisis de las secuencias de aminoácidos de diversos receptores intracelulares, se ha dado a conocer que éstos son factores de transcripción dependientes de ligando que tienen una estructura común básica y constituyen una familia génica. Esto es, pertenecen a una familia que incluye receptores de esteroides, tales como el receptor de glucocorticoides, receptor de progesterona, receptor de mineralocorticoides, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos y similares; receptores de retinoides, tales como el receptor X de retinoides, receptor del ácido retinoico y similares; un receptor activador de la proliferación de peroxisomas; un receptor de vitamina D_{3}; y un receptor de hormonas tiroideas. Como se ha revelado que las regiones funcionales, tales como un dominio de unión a ligando, un dominio que reconoce una secuencia diana de ADN y similares, están separadas característicamente en estos receptores (véase Science, 240, 889 (1988)), éstos se han aislado en base a la homología, aunque sean ciertos receptores cuyos ligandos sean todavía desconocidos.

Recientemente, un receptor nuclear, el receptor activador de la proliferación de peroxisomas (de aquí en adelante, mencionado como ``receptor PPAR'', abreviadamente en inglés ``peroxisome proliferator-activated receptor'') ha atraído la atención en el campo de los estudios sobre los factores de transcripción relacionados con la expresión e inducción de los genes marcadores de la diferenciación de los adipocitos. En relación con el receptor PPAR, está clonado el ADNc de diversas especies animales y se ha encontrado una pluralidad de genes isomorfos que incluyen los tipos \alpha, \delta y \gamma en los mamíferos. Además, se sabe que el tipo \gamma se expresa en los tejidos adiposos, inmunocitos, glándula suprarrenal, bazo e intestino delgado, y el tipo \alpha en el hígado y la retina, pero el tipo \delta no tiene especificidad de tejido y se expresa de forma ubicua.

Por otro lado, el antígeno Fas es una proteína de membrana cuya participación en la muerte celular programada, denominada apoptosis, se ha demostrado claramente. Yonehara y col. han preparado anticuerpos monoclonales contra antígenos de la superficie celular humana y han obtenido un anticuerpo anti-Fas que muestra una actividad letal frente a diversas células humanas (véase J. Exp. Med., 169, 1747 (1989)). Se ha aislado el ADNc de una molécula de superficie celular reconocible por el anticuerpo anti-Fas y se ha determinado la estructura del antígeno Fas humano (véase Cell, 66, 233 (1991)). Este antígeno Fas se compone de 335 residuos de aminoácidos y se asume que 16 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal son su péptido señal. En una posición central de la molécula está presente una región transmembrana compuesta por 17 residuos de aminoácidos hidrófobos y se considera que existen en su región extracelular 157 residuos de aminoácidos del extremo N-terminal y que su región citoplásmica es una secuencia de 145 residuos de aminoácidos del lado del extremo C-terminal.

Puesto que la estructura del antígeno Fas recuerda a la estructura de un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF), se asume que la apoptosis del antígeno Fas ocurre mediante un mecanismo similar al de la acción del TNF. Gradualmente, se han dado a conocer las regiones funcionales del antígeno Fas y se ha encontrado que la región esencial para la transducción de la señal de la apoptosis (región funcional) es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 175 y 304 (véase J. Biol. Chem., 268, 10932 (1993)). Además, también se ha dado a conocer la secuencia de aminoácidos del antígeno Fas de ratón (véase J. Immunology, 148, 1274 (1992)), teniendo una homología, en su totalidad, del 49,3% con el antígeno Fas humano. También se considera que su región funcional es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 166 y 291, que corresponden a la región del antígeno Fas humano.

Los receptores tienen una región de unión a ligando y una región de transducción de la señal. Cuando se une un ligando a la región de unión a ligando, cambia la estereoestructura de la región de transferencia de la señal y se transfiere una señal a otra proteína o ADN.

Recientemente, se han dirigido de forma positiva muchos estudios sobre la transducción de la señal intracelular mediante una proteína de fusión en la que la región de unión a ligando de un receptor se unen a la región de señalización de una proteína diferente.

Por ejemplo, se ha dado conocer que, en el caso de células transformadas con un gen que codifica una proteína de fusión de la región de unión a ligando de un receptor de estrógenos, que es uno de la familia de los receptores de esteroides, y la región funcional del oncogén humano c-Myc, las células se vuelven cancerosas, proliferando anormalmente, mediante la estimulación del ligando, estrógeno (véase Nature, 340, 66 (1989)).

Se han llevado a cabo estudios similares sobre proteínas de fusión de la región de unión a ligando de cada uno de los receptores de glucocorticoides, mineralocorticoides y estrógenos con la región funcional de cada una de las proteínas del E1A (adenovirus), c-Fos, v-Myb, C/EBP, v-Re1, GATA-1, 2 y 3, GAL4-VP16, Rev (VIH) y c-Ab1 (véase Cell, 54, 1073 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5114 (1991), EMBO J., 10, 3713 (1991), Science, 251, 288 (1991), EMBO J., 11, 4641 (1992), Genes Dev. (en prensa), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993), ibid, 87, 7787 (1990) y EMBO J., 12, 2809 (1993)), confirmándose de las señales respectivas se transfieren mediante la unión de los ligados a sus receptores nucleares correspondientes.

Kakizuka y col. han publicado un método en el que el antígeno Fas se usa como una proteína de transducción de la señal para aplicar la proteína de fusión anterior al tratamiento de un cáncer (véase el documento JP-A-7-316200). En este método, se fusiona una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 136 y 305, que incluye no sólo la región funcional sino también la región transmembrana, con la región de unión a ligando del receptor intracelular. Como resultado, puede detectarse eficazmente un ligando capaz de interaccionar con la secuencia de aminoácidos de la región de unión a ligando del receptor nuclear.

Por otro lado, R.M. Evans y col. han publicado un método de análisis por testigo en el que se introducen, dentro de células, un testigo que usa una enzima capaz de convertir un sustrato en un producto quimioluminiscente o un producto colorante visible o capaz de introducir un sustituyente (por ejemplo, luciferasa, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina secretora o cloranfenicol acetiltransferasa), en una región cadena abajo del elemento de respuesta a Gal4 y una proteína preparada mediante la fusión del dominio de unión a ADN de Gal4 y la región de unión a ligando del receptor PPAR (véase la publicación de la solicitud internacional PCT Nº 9.640.128). También se ha publicado otro método de análisis en el que, ya sea mediante la expresión de una proteína receptora PPAR exógena o junto con una proteína receptora PPAR endógena, se introduce el testigo anterior, con la condición de que en este caso, el testigo es un testigo que usa la enzima anterior en una región cadena abajo del elemento de respuesta al receptor PPAR (de aquí en adelante, mencionado como ``PPRE'') (Cell, 83, 803 (1995)). Estos sistemas de análisis son sistemas de detección que pueden evaluar la función como factores de transcripción de los receptores intracelulares.

Sin embargo, puesto que estos métodos requieren un cierto periodo de tiempo para detectar la actividad, es difícil llevar a cabo, una selección a alta velocidad del efecto de los ligandos y compuestos de ensayo. Además, como la introducción de ADN en las células es transitoria, esto causa un problema en el que los resultados no pueden ser fácilmente comparados debido a la insuficiente estabilidad entre los ensayos.

Descripción de la invención

Para llevar a cabo, como un objeto, una selección a alta velocidad de los compuestos que se unen a los ligandos de receptores intracelulares, los autores de la invención han realizado estudios intensivos y han encontrado, como resultado de sus esfuerzos, que el objeto puede conseguirse usando un análisis por testigo en el que se expresa una proteína Fas.

Esto es, se introdujo establemente en fibroblastos de ratón L929 un vector de expresión que comprende un testigo que usa una región funcional de una proteína estructural Fas y un ADN que codifica una proteína preparada mediante fusión de una región de unión a ADN de Gal4 y una región de unión a ligando de un receptor nuclear (particularmente, el receptor PPAR). Estas células fueron capaces de crecer en condiciones en las que los ligandos o compuestos no se unían a la secuencia de aminoácidos de la región de unión a ligando del receptor nuclear, pero la muerte celular ocurría debida a la inducción de la expresión de una proteína Fas cuando los ligandos o compuestos se unían a la secuencia. Subsecuentemente, se ha tenido éxito al llevar a cabo la selección a alta velocidad de un compuesto que interacciona con la región de unión a ligando de un receptor intracelular y puede incrementar o disminuir funcionalmente la actividad del factor de transcripción mediante la separación de las células obtenidas de este modo por muerte celular de las células intactas, tinción de las células intactas con un colorante y medida de la absorbancia de las células teñidas.

El método de selección de alto procesamiento de información junto con la alta velocidad de la invención es un método nuevo que era desconocido completamente.

En el método de la invención, la medida se lleva a cabo mediante la generación de muerte celular a través de la expresión de una proteína Fas usando la región funcional como testigo de una proteína Fas, por lo que es completamente diferente del método de R.M. Evans y col., que usa como testigo una enzima que genera quimioluminiscencia (particularmente, luciferasa) o forma un colorante visible (particularmente, \beta-galactosidasa) y mide la cantidad de enzima expresada (actividad enzimática).

En comparación con los métodos estándar de ensayo, el método de R.M. Evans y col. requiere, en el plazo más corto, un periodo experimental de 4 días, en el que el ADN se introduce en las células y se lleva a cabo la estimulación sérica el primer día, se lleva cabo una re-inoculación opcional, se añade un compuesto de ensayo después de 46 a 48 horas (el tercer día), y se mide la actividad luciferasa 24 horas después (el último día). Además, puesto que la introducción de ADN en las células es transitoria, se produce un problema en términos de estabilidad y comparación entre ensayos. Se puede introducir un vector de expresión que comprende un ADN que codifica otra enzima para comparar cada una de las medidas, pero la manipulación se vuelve compleja. Además, como el valor de la medida varía ampliamente, el método que usa la luciferasa requiere un gran número de casos (generalmente, requiere un número n de 3 a 4). Alternativamente, es necesario normalizar el método con un gen patrón interno introducido simultáneamente (por ejemplo, el gen de la \beta-galactosidasa, etc.) tal como se describe anteriormente.

Por otro lado, la invención es un método, en el plazo más corto, de un programa de dos días, en el que, cuando las células se preparan con antelación, se añade un compuesto de ensayo el primer día y las células pueden medirse mediante una tinción con colorante en la última mitad del día siguiente (después de 36 horas). Además, como se usan las células L929 (el mismo clon), puede hacerse fácilmente la comparación entre ensayos. Adicionalmente, como la variación de los valores es pequeña, cuando se mide mediante el método de la invención, en el que se usan células establemente transfectadas, no se requiere un gran número de casos (generalmente, se puede hacer un juicio suficiente con un número n de 1 a 2).

De este modo, de acuerdo con el método de la invención, es posible llevar a cabo una evaluación a alta velocidad de ligandos y compuestos que pueden cambiar las funciones de los receptores intracelulares y la manipulación per se es simple y fácil. Además, como la variación de los valores medidos es pequeña, los datos entre los distintos ensayos pueden ser fáciles de comparar y son muy estables. Estas ventajas emplean capacidades completas, particularmente en la evaluación a alta velocidad de múltiples muestras. Además, como se une un aparato de medida de la absorbancia como medida estándar a cualquier analizador automático usado general y prácticamente (máquina robótica), el método puede ser visto como un sistema de evaluación de compuestos robotizado. Este es un hecho que no podía esperarse de la técnica anterior pero confirmado, desde el primer momento, mediante experimentos llevados a cabo por los autores de la presente invención. Además, como el método de la invención no requiere sustrato enzimático, se puede reducir inmediatamente el costo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica que muestra los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas, después del tratamiento con cada compuesto, llevándose a cabo un análisis de muerte celular usando células L929 que responden al ligando del PPAR \gamma. En el dibujo, (A) muestra un caso de células que responden al ligando del PPAR \gamma y (B) muestra un caso de células normales L929.

La figura 2 es una gráfica que muestra los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas, después del tratamiento con cada compuesto, llevándose a cabo un análisis de muerte celular usando células L929 que responden al ligando del PPAR \gamma. En el dibujo, (A) muestra un caso de células que responden al ligando del PPAR \gamma y (B) muestra un caso de células normales L929.

La figura 3 es una gráfica que muestra los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas, después del tratamiento con cada compuesto, llevándose a cabo un análisis de muerte celular usando células L929 que responden al ligando del PPAR \alpha. En el dibujo, (A) muestra un caso de células que responden al ligando del PPAR \alpha y (B) muestra un caso de células normales L929.

La figura 4 es una gráfica que muestra los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas, después del tratamiento con cada compuesto, llevándose a cabo un análisis de muerte celular usando células L929 que responden al ligando del PPAR \delta. En el dibujo, (A) muestra un caso de células que responden al ligando del PPAR \delta y (B) muestra un caso de células normales L929.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a:

(i): un plásmido de ADN nuevo que comprende un gen testigo de ADN,

(ii): un transformante transformado con el plásmido de ADN anterior y un ADN que codifica una proteína efectora conocida,

(iii): un agente terapéutico contra un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, que comprende los ADN anteriores como ingredientes activos, y

(iv): un método para detectar un ligando de un receptor intracelular, que comprende el uso del transformante.

El antígeno Fas y el receptor intracelular para el uso en la invención son aquellos procedentes de los mamíferos, tales como seres humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas y cobayas. El antígeno Fas y el receptor intracelular proceden, preferentemente, de la misma especie, pero también pueden usarse aquellos procedentes de especies diferentes. Mediante la invención se ha confirmado que la transferencia de señales puede tener lugar cuando se usan los procedentes de especies diferentes. Por ejemplo, puede usarse adecuadamente una combinación del antígeno Fas humano con un receptor intracelular humano, una combinación del antígeno Fas de ratón con un receptor intracelular humano, una combinación del antígeno Fas humano con un receptor intracelular de rata, una combinación del antígeno Fas de ratón con un receptor intracelular de rata, una combinación del antígeno Fas humano con un receptor intracelular de ratón o una combinación del antígeno Fas de ratón con un receptor intracelular de ratón.

Se pueden usar, como secuencia de aminoácidos que comprende la región transmembrana y la región que expresa la función de un antígeno Fas y como secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando de un receptor intracelular para uso en la invención, la porción correspondiente de cada región sola, o la porción correspondiente de cada región puede contener adicionalmente una región flanqueante (una región que no toma parte en la región funcional; varias decenas, preferentemente 60 ó menos, de residuos como una secuencia de aminoácidos) en ambos extremos (extremo N-terminal y/o extremo C-terminal). Si se desea, se puede unir una secuencia de aminoácidos que comprende una región de péptido señal al extremo N-terminal de la región transmembrana del antígeno Fas. La secuencia de aminoácidos que corresponde a cada región puede no ser sólo una secuencia de aminoácidos natural sino también su derivado en el que al menos un aminoácido se elimina, sustituye, añade y/o inserta en una extensión tal que la función de apoptosis original del antígeno Fas o la función de unión a ligando del receptor intracelular no se dañan.

La secuencia de aminoácidos que comprende la región transmembrana y la región que expresa la función del antígeno Fas humano es una secuencia desde la Ser 145 a la Val 319 y, en el caso del antígeno Fas de ratón, se usa una secuencia de la Ser 136 a la Leu 305. Además, se usa preferentemente, como secuencia de aminoácidos que comprende una región de péptido señal, una secuencia entre las posiciones -16 y 23 del antígeno Fas humano o una secuencia entre las posiciones -21 y 14 del antígeno Fas de ratón.

Los ejemplos del receptor intracelular en la proteína efectora para uso en la invención incluyen un receptor de esteroides, tal como un receptor de glucocorticoides, un receptor de progesterona, un receptor de mineralocorticoides, un receptor de andrógenos, un receptor de estrógenos y similares; un receptor de retinoides, tal como el receptor X de retinoides, el receptor del ácido retinoico y similares; un receptor activador de la proliferación de peroxisomas; un receptor de la vitamina D_{3} y un receptor de hormonas tiroideas. De entre éstos se usan, preferentemente, el receptor de estrógenos humano o de rata; el receptor X de retinoides \alpha, \beta ó \gamma humano o de ratón; el receptor \alpha, \beta ó \gamma del ácido retinoico humano o de ratón; el receptor PPAR \alpha humano o de ratón; y el receptor PPAR \gamma humano o de ratón.

La región de unión a ligando de cada receptor ya se conoce (véase, Science, 240, 889 (1988); Mol. Endocrinology, 6, 1634 (1992); Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431 (1996); J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157 (1994) y Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7355 (1994)); tal región está entre las posiciones 528 y 777 en el receptor de glucocorticoides humano, entre las posiciones 680 y 934 en el receptor de progesterona humano, entre las posiciones 734 y 984 en el receptor de mineralocorticoides humano, entre las posiciones 676 y 919 en el receptor de andrógenos humano, entre las posiciones 311 y 551 en el receptor de estrógenos humano, entre las posiciones 307 y 557 en el receptor de estrógenos de rata, entre las posiciones 225 y 462 en el receptor X de retinoides \alpha humano, entre las posiciones 297 y 526 en el receptor X de retinoides \beta humano, entre las posiciones 230 y 467 en el receptor X de retinoides \alpha de ratón, entre las posiciones 171 y 410 en el receptor X de retinoides \beta de ratón, entre las posiciones 229 y 463 en el receptor X de retinoides \gamma de ratón, entre las posiciones 198 y 462 en el receptor \alpha del ácido retinoico humano, entre las posiciones 191 y 448 en el receptor \beta del ácido retinoico humano, entre las posiciones 200 y 454 en el receptor \gamma del ácido retinoico humano, entre las posiciones 198 y 462 en el receptor \alpha del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 190 y 448 en el receptor \beta del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 200 y 458 en el receptor \gamma del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 192 y 427 en el receptor de la vitamina D_{3 }humano, entre las posiciones 183 y 410 en el receptor \alpha de hormonas tiroideas humano, entre las posiciones 232 y 456 en el receptor \beta de hormonas tiroideas humano, entre las posiciones 280 y 478 en el receptor PPAR \gamma humano (subtipo PPAR \gamma1 humano), entre las posiciones 278 y 475 en el receptor PPAR \gamma de ratón (subtipo PPAR \gamma1 de ratón), entre las posiciones 273 y 468 en el receptor PPAR \alpha humano, entre las posiciones 273 y 468 en el receptor PPAR \alpha de ratón, entre las posiciones 273 y 468 en el receptor PPAR \alpha de rata, entre las posiciones 246 y 441 en el receptor PPAR \delta humano y entre las posiciones 245 y 440 en el receptor PPAR \delta de ratón.

Los ejemplos preferidos incluyen una secuencia entre la posición 311 y la posición 551 del receptor de estrógenos humano, entre las posiciones 307 y 557 del receptor de estrógenos de rata, entre las posiciones 225 y 462 del receptor X de retinoides \alpha humano, entre las posiciones 297 y 526 del receptor X de retinoides \beta\_humano, entre las posiciones 230 y 467 del receptor X de retinoides \alpha de ratón, entre las posiciones 171 y 410 del receptor X de retinoides \beta de ratón, entre las posiciones 229 y 463 del receptor X de retinoides \gamma de ratón, entre las posiciones 198 y 462 del receptor \alpha del ácido retinoico humano, entre las posiciones 191 y 448 del receptor \beta del ácido retinoico humano, entre las posiciones 200 y 454 del receptor \gamma del ácido retinoico humano, entre las posiciones 198 y 462 del receptor \alpha del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 190 y 448 del receptor \beta del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 200 y 458 del receptor \gamma del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 176 y 478 del receptor PPAR \gamma humano (subtipo PPAR \gamma1 humano), entre las posiciones 174 y 475 del receptor PPAR \gamma de ratón (subtipo PPAR \gamma1 de ratón), entre las posiciones 167 y 468 del receptor PPAR \alpha humano, entre las posiciones 167 y 468 del receptor PPAR \alpha de ratón, entre las posiciones 167 y 468 del receptor PPAR \alpha de rata, entre las posiciones 139 y 441 del receptor PPAR \delta humano y entre las posiciones 138 y 440 del receptor PPAR \delta de ratón.

Los ejemplos más preferidos incluyen una secuencia entre las posiciones 281 y 595 del receptor de estrógenos humano, entre las posiciones 286 y 600 del receptor de estrógenos de rata, entre las posiciones 176 y 462 del receptor \alpha del ácido retinoico humano, entre las posiciones 177 y 458 del receptor \alpha del ácido retinoico de ratón, entre las posiciones 166 y 478 del receptor PPAR \gamma humano (subtipo PPAR \gamma1 humano) (que corresponde a una secuencia entre las posiciones 194 y 506 del subtipo PPAR \gamma2 humano), entre las posiciones 164 y 475 del receptor PPAR \gamma de ratón (subtipo PPAR \gamma1 de ratón) (que corresponde a una secuencia entre las posiciones 194 y 505 del subtipo PPAR \gamma2 de ratón), entre las posiciones 157 y 468 del receptor PPAR \alpha humano, entre las posiciones 157 y 468 del receptor PPAR \alpha de ratón, entre las posiciones 157 y 468 del receptor PPAR \alpha de rata, entre las posiciones 129 y 441 del receptor PPAR \delta humano y entre las posiciones 128 y 440 del receptor PPAR \delta de ratón.

Los ejemplos de proteína efectora más preferidos, para uso en la invención incluyen:

(i): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 176 a la tirosina (Tyr) 478 del receptor PPAR \gamma1 humano al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4,

(ii): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 174 a la tirosina (Tyr) 475 del receptor PPAR \gamma1 de ratón al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4,

(iii): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 204 a la tirosina (Tyr) 506 del receptor PPAR \gamma2 humano al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4,

(iv): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 204 a la tirosina (Tyr) 505 del receptor PPAR \gamma2 de ratón al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4,

(v): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 167 a la tirosina (Tyr) 468 del receptor PPAR \alpha humano al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4,

(vi): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 167 a la tirosina (Tyr) 468 del receptor PPAR \alpha de ratón al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4,

(vii): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 139 a la tirosina (Tyr) 441 del receptor PPAR \delta humano al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4, y

(viii): una proteína efectora en la que se une una secuencia de aminoácidos desde la serina (Ser) 138 a la tirosina (Tyr) 440 del receptor PPAR \delta de ratón al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de la región de unión a ADN de la proteína Gal4.

En relación al UAS, que es un elemento de respuesta a la proteína Gal4, contenido como una estructura de repetición en el plásmido testigo de la invención, se usó una secuencia ya conocida (véase, Cell, 83, 803 (1995) y Cell, 83, 813 (1995)). Esto es, una secuencia en la que una secuencia 5'-CGACGGAGTACTGTCCTCCG-3' se repite varias veces, específicamente, al menos 3 veces, preferentemente, 4 veces, y más preferentemente, 5 veces.

Los ejemplos del promotor de la invención incluyen el promotor SV40, promotor HSV LTR, promotor de la metalotioneína y promotor de la timidina quinasa (TK). Se prefiere un promotor TK. Más específicamente, se prefiere el uso de una secuencia entre las posiciones -727 y 56 del ARNm del promotor TK, cuando el sitio de inicio de la transcripción se ve como la posición 1, tal como se usa en el plásmido pTK\beta (Clontech Laboratories, Nº de catálogo 6179-1) (que corresponde a una secuencia entre las posiciones 165 y 945 en el mapa del pTK\beta). Es más preferida una secuencia entre las posiciones -105 y 51 del ARNm del promotor TK.

También se incluyen en la invención los ADN que codifican el plásmido testigo de la invención. Como se sabe bien, de 1 a 6 codones codifican un aminoácido (por ejemplo, 1 codón codifica la metionina (Met) y 6 codones codifican la leucina (Leu)). De acuerdo con esto, se puede cambiar la secuencia de nucleótidos de un ADN sin cambiar su correspondiente secuencia de aminoácidos.

Entre los ADN que codifican el plásmido testigo de la invención, se incluyen en la invención un grupo de secuencias de nucleótidos de todas las secuencias de ADN que dan como resultado el mismo polipéptido de proteína Fas. La productividad de la proteína de fusión puede a veces mejorarse cambiando la secuencia de nucleótidos.

El ADN que codifica el plásmido testigo de la invención puede prepararse de acuerdo con el siguiente método.

Esto es, el método se lleva a cabo al:

(i): amplificar los ADN que codifican las secuencias de aminoácidos que comprenden las regiones necesarias de las secuencias de aminoácidos de un antígeno Fas y un receptor intracelular mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), e

(ii): insertar el producto de la PCR obtenido del antígeno Fas y, subsecuentemente, el producto de la PCR obtenido del receptor intracelular, en un vector apropiado.

En detalle, la etapa (i) es una etapa en la que las partes necesarias para la fusión se amplifican mediante PCR. En el caso del antígeno Fas, se sintetiza químicamente una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la región transmembrana y la región que expresa la función y se usa como cebador. Además, en el caso del receptor intracelular, se sintetiza químicamente una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando y se usa como cebador.

Se dispone un sitio para una enzima de restricción específica en el extremo 5' de cada uno de los cebadores obtenidos de ese modo. En relación con el molde para la PCR, se puede usar ARNm aislado y purificado a partir de células o a partir de una línea celular del mamífero correspondiente, tal como un ser humano, ratón o similares. La PCR se lleva a cabo mediante un método conocido. Como los aparatos para la PCR automática se han comenzado a usar de un modo amplio recientemente, idóneamente, se usan tales aparatos.

En la etapa (ii), los ADN que corresponden a la región de unión a ADN de Gal4 y a la región de unión a ligando del receptor nuclear se fusionan en un vector de expresión. Como vector plasmídico para uso en esta etapa, se conocen un gran número de vectores capaces de funcionar en Escherichia coli (por ejemplo, pBR322) o Bacillus subtilis (por ejemplo, pUB110) y cualquiera de ellos puede usarse adecuadamente.

Cuando se va a expresar en células de mamífero, el vector de expresión se prepara mediante la inserción del producto de la PCR de la región de unión a ADN de Gal4 y, seguidamente, la del receptor intracelular, en una región cadena debajo de un promotor apropiado (por ejemplo, promotor SV40, promotor LTR o promotor de la metalotioneína), en un vector apropiado (por ejemplo, un vector retroviral, un vector de papilomavirus, un vector del virus de la vacuna o un vector del SV40). Preferentemente, se usa el pCMX (descrito en Cell, 66, 663 (1991)) o el pSV (descrito en Anal. Biochem., 188, 245 (1990)).

Subsecuentemente, en la etapa (iii) se produce un plásmido testigo. El vector plasmídico para uso en esta etapa puede ser uno cualquiera de aquellos que funcionan en E. coli o B. Subtilis, como se describe anteriormente. También puede insertarse directamente en el vector de expresión. Puede servir para el propósito un plásmido que comprende un ADN en el que se localiza una estructura de repetición del elemento de respuesta a Gal4, un promotor de la timidina quinasa del herpesvirus simple y un ADN que codifica una proteína estructural Fas en un tándem cadena arriba a partir de la región 5', dependiendo de si su origen es un vector que puede funcionar en E. coli o en células de mamífero. Como se describió anteriormente, puede contener adicionalmente una región ori, un factor de control del promotor y, al menos, un gen marcador de selección. Cuando se usan células de mamífero, se pueden obtener las células de ensayo, que mueren de una manera dependiente de la expresión de la proteína Fas, mediante la transformación de las células de mamífero apropiadas usando el plásmido anterior capaz de funcionar en las células de mamífero y el cultivo de los transformantes resultantes en un medio apropiado.

Cuando la expresión se lleva a cabo en células de mamífero, se puede insertar opcionalmente un producto de la PCR de una secuencia de nucleótidos que codifica la región del péptido señal de un antígeno Fas en un sitio inmediatamente cadena abajo del promotor.

Los ejemplos del vector de replicación o de expresión que comprenden el ADN de la invención incluyen un vector plasmídico, un vector viral y un vector de bacteriófago que comprenden una región ori y, opcionalmente, un promotor para la expresión del ADN anterior y un factor de control del promotor o similares. Adicionalmente, el vector puede contener, al menos, un gen marcador de selección (por ejemplo, gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la blasticidina S).

Adicionalmente, como sistema de expresión de la proteína de la invención, la proteína de fusión del objeto puede producirse mediante transformación de las células de mamífero apropiadas (por ejemplo, células COS-7 de mono, células CHO de hamster chino, células L de ratón, fibroblastos de ratón, células cancerosas humanas y similares) con el vector de expresión anterior, que funciona en células de mamífero y el cultivo de los transformantes resultantes en el medio apropiado. El polipéptido obtenido de este modo puede aislarse y purificarse por medios bioquímicos usados generalmente.

Las células hospedadoras transformadas con un vector de replicación o de expresión que comprenden el ADN de la invención se incluyen en la invención.

Aplicación industrial

El plásmido de ADN de la invención obtenido de esta manera puede usarse como agente terapéutico contra un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria. Esto es, se administra tópicamente un vector de expresión, que comprende el plásmido de ADN de la invención, dirigido a la parte focal de un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria mediante un método dirigido a diana (por ejemplo, mediante su inclusión en liposomas). Este vector penetra en las células cancerosas de la parte focal y alcanza a los genes. Subsecuentemente, cuando se administre un ligando correspondiente al receptor intracelular que constituye una parte de la proteína efectora de la invención (por ejemplo, el ácido 9-cis-retinoico en el caso en el que se use un receptor X de retinoides como receptor o la vitamina A en el caso en el que se use un receptor de ácido retinoico), se activa el efector y la proteína Fas se expresa. Se transduce la señal de apoptosis mediante la proteína Fas producida en las células cancerosas y de este modo las células se extinguen.

Además, el plásmido de ADN de la invención puede usarse ampliamente como un método de selección de un agonista o un antagonista de un receptor intracelular. Esto es, se añade una muestra de ensayo a las células en las que se ha insertado un vector de expresión que comprende el ADN que codifica la proteína efectora (un vector de expresión de ADN que comprende un ADN que codifica la región de unión a ligando de diversos receptores nucleares en una región cadena debajo de la región de unión a ADN de Gal4) y el ADN testigo para uso en la presente invención. La muerte de las células indica que la muestra de ensayo tiene actividad agonista y la supervivencia de las células en presencia de un agonista revela que la muestra tiene actividad antagonista.

De acuerdo con el método de selección de la invención, puede realizarse una evaluación a alta velocidad de los ligandos y compuestos capaces de cambiar las funciones de los receptores intracelulares. Puesto que los efectos (resultados) se observan como muerte celular, el juicio es fácil y la manipulación per se} también es simple y fácil. Además, cuando se dispone un ADN que codifica la región de unión a ligando de diversos receptores nucleares en una región cadena debajo de la región de unión a ADN de Gal4 como proteína efectora, se convierte en un método de uso general con el que se pueden seleccionar compuestos que actúan sobre receptores nucleares que incluyen a los receptores huérfanos cuyos ligandos son desconocidos. Por rutina, es posible buscar los ligandos fisiológicos de los receptores nucleares huérfanos. Específicamente, puede aplicarse en la identificación de ligandos o en su purificación a partir de fracciones que tengan actividades de ligando mediante la adición de un ligando fisiológico que se espere que sea un candidato o mediante la adición de una muestra parcialmente fraccionada de suero a las células anteriores y la observación de la presencia o ausencia de muerte celular.

Además, como la variación de los valores medidos mediante el método de la invención es pequeña, los datos entre los ensayos pueden compararse fácilmente y son muy estables. Estas ventajas emplean capacidades completas, particularmente en la evaluación a alta velocidad de múltiples muestras. Adicionalmente, como se une un aparato de medida de la absorbancia como medida estándar a cualquier analizador automático usado general y prácticamente (máquina robótica), el método puede ser visto como un sistema de evaluación de compuestos robotizado. Adicionalmente, como el método de selección de la invención no requiere un sustrato enzimático, se puede reducir inmediatamente el costo.

El mejor modo de llevar a cabo la invención

Adicionalmente, la invención se describe en detalle y específicamente mediante los siguientes ejemplos, aunque, por rutina, la invención no está restringida a los mismos.

Ejemplo 1 Preparación del producto de la PCR del antígeno Fas de ratón.

Se prepararon los siguientes cebadores en base a la estructura del antígeno Fas de ratón de acuerdo con el método publicado por Fukunaga y col. (véase, J. Immunology, 148, 1274 (1992)) o por Kakizuka y col. (véase, el documento JP-A-7-316.200).

F1: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'-CCAAGCTTGGCGACCAGCAATACAAACTGCAGGAAAC-3' (SEQ ID Nº 1), que corresponde a la estructura de una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 131 y 143, a saber, Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn Cys Arg Lys Gln, en el que se introduce un sitio para la enzima de restricción HindIII en una parte del extremo 5'.

R1: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'-TCAGGATCCAGACATTGTCCTTCATTTTCATT-3' (SEQ ID Nº 2), que corresponde a una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 298 y 306 (C-terminal), a saber, Asn Glu Asn Gln Gly Gln Cys Leu Glu, y a una porción de la región 3' no traducida, en el que se introduce un sitio BamHI en una parte del extremo 3'.

Usando como molde ARNm obtenido de una línea de linfocitos T de ratón, RLM-11 (Cell, 68, 1109 (1992)), y los cebadores F1 y R1 para la PCR, se llevó a cabo una RT-PCR usando un secuenciador térmico (GeneAmp PCR System 9600, Perkin Elmer) en las condiciones: 180 segundos x 1 a 95ºC \rightarrow (60 segundos a 95ºC, 60 segundos a 55ºC, 60 segundos a 72ºC) x 15 \rightarrow 180 segundos a 72ºC. Como resultado, se obtuvo un fragmento de aproximadamente 520 pb (de aquí en adelante, mencionado como ``MFas'') y se insertó en el sitio de multiclonado del pBluescript (nombre comercial, Promega), entre los sitios para las enzimas de restricción HindIII-BamHI, de aquí en adelante mencionado como ``pBSMFas''.

Ejemplo 2 Preparación del producto de la PCR del receptor PPAR \alpha, \gamma ó \delta humano.

Se prepararon los siguientes cebadores en base a la estructura de los receptores PPAR \alpha, \gamma ó \delta humanos descritos por R. Mukherjee y col. (véase, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157 (1994)); M.E. Greene y col. (véase, Gene Expression, 4, 281 (1995)); A. Elbrecht y col. (véase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431 (1996)); o Schmidt (véase, Mol. Endocrinol., 6, 1134 (1992).

F2: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'-AACCAGCACCATCTGGTCGCGATGGT-3' (SEQ ID Nº 3), que corresponde a la región 5' no traducida y a los aminoácidos del extremo N-terminal Met^{1}-Val^{2} del PPAR \alpha humano.

R2: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'-AGGTGTGGCTGATCTGAAGGAACTCA-3' (SEQ ID Nº 4), que corresponde a la región 3' no traducida del PPAR \alpha humano y a un codón de terminación de aminoácidos.

F3: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'-AGAAATGACCATGGTTGACACAGAGA-3' (SEQ ID Nº 5), que corresponde a la región 5' no traducida y a los aminoácidos del extremo N-terminal Met^{1}-Met^{8} del PPAR \gamma humano (subtipo \gamma1).

R3: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'-AAATGTTGGCAGTGGCTCAGGACTCT-3' (SEQ ID Nº 6), que corresponde a la región 3' no traducida del PPAR \gamma (subtipo \gamma1).

F4: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'-AGATCAGCCATGGAGCAGCCACAGGA-3' (SEQ ID Nº 7), que corresponde a la región 5' no traducida y a los aminoácidos del extremo N-terminal Met^{1}-Glu^{6} del PPAR \delta humano.

R4: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'-ATTGGAGTCTGCAGGGAGGCCTGGGT-3' (SEQ ID Nº 8), que corresponde a la región 3' no traducida del PPAR \delta humano.

Usando como genoteca de ADNc, la genoteca de ADNc de hígado humano ``Superscript Human Liver cDNA Library'' (nombre comercial, Nº de catálogo: 10.422-012, fabricada por Gibco BRL), y los cebadores F2 y R2, F3 y R3 ó F4 y R4 como cebadores para la PCR, se llevó a cabo una PCR usando un secuenciador térmico ( GeneAmp PCR System 9600, fabricado por Perkin Elmer) en las condiciones: 120 segundos x 1 a 95ºC \rightarrow (60 segundos a 95ºC, 90 segundos a 60ºC, 120 segundos a 72ºC) x 30 \rightarrow 180 segundos a 72ºC. Como resultado, se obtuvieron el PPAR \alpha humano de 1450 pb, el PPAR \gamma humano de 1469 pb y el PPAR \delta humano de 1367 pb, y se insertaron en un vector-T (vector pT7Blue-T, Nº de catálogo: 69.836-1), fabricado por Novagen, para confirmar sus secuencias de nucleótidos completas.

Ejemplo 3 Sistema de expresión de la proteína efectora; construcción del vector de expresión que comprende el ADNc que codifica la proteína de fusión (proteína del receptor quimérico Gal4) de la proteína Gal4 y la región de unión a ligando del receptor nuclear.

Se construyó un vector capaz de expresar la proteína del receptor quimérico Gal4 como un gen estructural bajo control del promotor SV40, usando como vector básico, el vector ``Pica Gene Basic Vector 2'' (nombre comercial, PGBV2, Nº de catálogo: 309-04821, fabricado por Toyo Ink). Esto es, esto se completó mediante la escisión de un gen estructural de luciferasa del PGBV2 usando las enzimas de restricción NcoI y XbaI y la inserción del ADNc que codifica la proteína del receptor quimérico Gal4 preparado de la siguiente manera:

(1): Inserción en el vector de expresión del ADN que codifica la región de unión a ADN del factor de transcripción Gal4.

Se amplificó como ADNc de la región de unión a ADN de un factor de transcripción basal de levadura, proteína Gal4, un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1 y 147 de Gal4, mediante PCR en las mismas condiciones que en el ejemplo 2 usando como molde el pGBT9 (fabricado por Clontech, Nº de catálogo: K1605-A). Se usaron como cebadores los siguientes F5 y R5:

F5: Se sintetizó un cebador con sentido 5'- GCAAGCTTCACCATGAAGCTACTGTCTTCTA TCGAAC-3' (SEQ ID Nº 9), que corresponde a una secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal entre las posiciones 1 y 8 de la región de unión a ADN de Gal4, en el que se añadió un sitio HindIII y una secuencia kozak en orden, para obtener una expresión eficaz de la proteína en células de mamífero, en una parte del extremo 5'.

R5: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'- AGCCATGGCCGGCGATACAGTCA ACTGTCTTTG-3' (SEQ ID Nº 10), que corresponde a una secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal entre las posiciones 141 y 147 de la región de unión a ADN de Gal4, en el que se añadió un sitio NcoI en una parte del extremo 5', y el cebador sintetizado de este modo se amplificó mediante PCR en las mismas condiciones que en el ejemplo 2. Como resultado, tras confirmar su secuencia de nucleótidos completa, se recombinó un ADN amplificado de aproximadamente 465 pb con el sitio HindIII/NcoI en el vector PGBV2 (de aquí en adelante mencionado como ``pGVgal'').

(2): Preparación del ADN que codifica la región de unión a ligando del PPAR \gamma humano y construcción del vector de expresión de la proteína del receptor quimérico Gal4-PPAR \gamma humano.

Usando como molde, el ADNc, que codifica el PPAR \gamma humano completo, aislado de una genoteca de ADNc de hígado humano de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 2 y sintetizando los siguientes cebadores, se amplificó mediante PCR, en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, un ADN que codifica una secuencia desde la Ser^{176} a la Tyr^{478} que incluye la región de unión a ligando del PPAR \gamma humano.

F6: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'-GCCATGGCTCCTAAGAAGAAGCGTAAGGTAGGATCCCATAATGCCATCAGGTTTGGGCGGAT-3' (SEQ ID Nº 11), que corresponde a una secuencia desde la Ser^{176} a la Met^{185}, en el que se dispusieron, en este orden, un sitio NcoI, una señal de transporte al núcleo procedente del antígeno SV40 T (Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly) y un sitio BamHI, en el extremo 5'.

R6: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'- CCTCTAGACTAGCTGGCATAGTC GGGCACGTCGTAGGGGTAGTCGACGTACAAGTCCTTGTAGATCTCC-3' (SEQ ID Nº 12), que corresponde a una secuencia desde el Glu^{472} a la Tyr^{478}, en el que se dispusieron, en este orden, un sitio SalI, un epítopo de la hemaglutinina de la gripe (Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) como secuencia de etiquetado del epítopo para uso en la detección de la proteína expresada, un codón de terminación de la traducción y un sitio XbaI.

El gen estructural de la luciferasa en el pGVgal anterior se escindió de tanto el sitio XbaI de la región cadena abajo del gen estructural de la luciferasa como del sitio NcoI de la región cadena abajo del ADN que codifica la región de unión a ADN de Gal4, y se reemplazó por un ADN que codifica la región de unión a ligando del PPAR \gamma humano, obteniéndose de este modo el vector de expresión de la proteína efectora de interés (de aquí en adelante mencionado como ``pGVgal/\gammaLBD'').

(3): Preparación del ADN que codifica la región de unión a ligando del PPAR \alpha humano y construcción del vector de expresión de la proteína del receptor quimérico Gal4-PPAR \alpha humano.

Se sintetizó un gen estructural de la región de unión a ligando del PPAR \alpha mediante la síntesis de los siguientes cebadores que comprenden la región de unión a ligando del PPAR \alpha humano y llevando a cabo una amplificación por PCR en las mismas condiciones que en el ejemplo 2. El gen estructural de la región de unión a ligando del PPAR \alpha obtenido de esta manera se insertó entre los sitios para las enzimas de restricción BamHI-SalI del vector pGVgal/\gammaLBD sintetizado anteriormente que había sido digerido con estas enzimas de restricción para escindir selectivamente el gen estructural de la región de unión a ligando del PPAR \gamma para construir el vector de expresión de la proteína del receptor quimérico Gal4-PPAR \alpha humano (de aquí en adelante, mencionado como ``pGVgal/\alphaLBD'').

F7: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'-CACGGATCCCACAACGCGATTCGTTTTGGACGA-3' (SEQ ID Nº 13), que corresponde a una secuencia de aminoácidos desde la Ser^{167} a la Arg^{175} del PPAR \alpha humano y que tiene un sitio BamHI en su extremo 5'.

R7: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'-ATGGTCGACGTACATGTCCCTGTAGATCTCCTG-3' (SEQ ID Nº 14), que corresponde a una secuencia de aminoácidos desde la Gln^{461} a la Tyr^{468} del PPAR \alpha humano y que tiene un sitio SalI en su extremo 5'.

(4): Preparación del ADN que codifica la región de unión a ligando del PPAR \delta humano y construcción del vector de expresión de la proteína del receptor quimérico Gal4-PPAR \delta humano.

Se sintetizó un gen estructural de la región de unión a ligando del PPAR \delta mediante la síntesis de los siguientes cebadores que comprenden la región de unión a ligando del PPAR \delta humano y llevando a cabo una amplificación por PCR en las mismas condiciones que en el ejemplo 2. El gen estructural de la región de unión a ligando del PPAR \delta obtenido de esta manera se insertó entre los sitios para las enzimas de restricción BamHI-SalI del vector pGVgal/\gammaLBD sintetizado anteriormente que había sido digerido con estas enzimas de restricción para escindir selectivamente el gen estructural de la región de unión a ligando del PPAR \gamma para construir el vector de expresión de la proteína del receptor quimérico Gal4-PPAR \delta humano (de aquí en adelante, mencionado como ``pGVgal/\deltaLBD'').

F8: Se sintetizó un cebador con sentido, 5'- CACGGATCCCACAACGCTATCCGTTTTGGTC GG-3' (SEQ ID Nº 15), que corresponde a una secuencia de aminoácidos desde la Ser^{139} a la Arg^{147} del PPAR \delta humano y que tiene un sitio BamHI en su extremo 5'.

R8: Se sintetizó un cebador de sentido opuesto, 5'-ATGGTCGACGTACATGTCCTTGTAGATCTCCTG-3' (SEQ ID Nº 16), que corresponde una secuencia de aminoácidos desde la Gln^{434} a la Tyr^{441} del PPAR \delta humano y que tiene un sitio SalI en su extremo 5'.

Ejemplo 4 Gen testigo; construcción del plásmido testigo en el que se disponen el promotor TK y el gen estructural MFas en la región cadena abajo del elemento de respuesta al factor de transcripción Gal4.

Se usó un vector de expresión pTK\beta (fabricado por Clontech, Nº de catálogo 6179-1) bajo control del promotor de la timidina quinasa (TK) del herpesvirus simple. Se digirió en los sitios NotI cadena arriba y cadena abajo del gen estructural de la \beta-galactosidasa del pTK\beta y ambos extremos se hicieron romos. Seguidamente, se escindió, como ADN para ser insertado, un ADN que codifica la proteína MFas a partir del pBSMFas, usando las enzimas de restricción HindIII y BamHI y haciendo los extremos romos. Se ligaron los dos ADN para seleccionar un clon en el que el gen estructural MFas está conectado a la región cadena abajo del promotor TK en la dirección directa. El plásmido pTK-MFas obtenido este modo, de aproximadamente 4400 pb, contiene un ADN que codifica la proteína MFas bajo control del promotor TK. Seguidamente, se digirió y se hizo romo el sitio SalI localizado en la región cadena arriba del promotor TK del plásmido pTK-MFas y, seguidamente, se insertó como ADN de engarce, un sitio de multiclonado (SEQ ID Nº 17: EcoRI-SalI-KpnI-EcoRV-SacI-NotI):

5'- GAATTCGTCGACGGTACCGATATCGAG CTCGCGGCCGC-3'

3'- CTTAAGCAGCTGCCATGGCTATAGCTC GAGCGCCGGCG-5'

para obtener el pTK-MFas-ML1(5'-EcoRI-SalI-KpnI-EcoRV-SacI-NotI-3').

Se produjo una región intensificadora mediante la inserción de un elemento de respuesta a Gal4, 5'-T(CGACGGAGTACTGTCCTCCG) x 4 AGCT-3' (SEQ ID Nº 18), que tiene 4 repeticiones de una unidad basal (UAS) y un sitio SalI/SacI en ambos extremos, en un sitio SalI-SacI dentro del sitio de multiclonado del pTK-MFas-ML1. Como resultado, se construyó el p4xUAS-TK-MFas (aproximadamente 4600 pb) en el que se dispusieron el 4xUAS, el promotor TK y el gen estructural MFas en ese orden.

Cada uno de los vectores de expresión obtenidos de este modo, pSVgal/\alphaLBD, pSVgal/\gammaLBD y pSVgal/\deltaLBD, el plásmido testigo y el pSV2bsr (fabricado por Kaken Pharmaceutical, Nº de catálogo KK-500) se sometieron, respectivamente, a linearización mediante el tratamiento con una enzima de restricción AatII o NotI o no se trataron (forma circular), y se introdujeron en una relación cuantitativa de 1:1:0,1 en fibroblastos L929 de ratón, usando ``Lipofect AMINE'' (fabricado por Gibco, Nº de catálogo 18.324-012). Se seleccionaron las células transformadas establemente de acuerdo con el método (selección mediante blasticidina S) descrito en Exp. Cell Res., 197, 229 (1991).

Ejemplo 5 Selección del clon de respuesta a ligando

Después de 1 a 2 semanas de selección, las colonias observadas se sometieron a clonado celular mediante dilución limitante y crecimiento. Por ejemplo, cada subclón se suspendió en Eagle's MEM que contiene suero fetal de ternera al 10% (FCS) a una densidad de 2 x 10^{4} células / 100 \mul, se distribuyó en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivó a 37ºC durante 4 a 6 horas en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Las células que significativamente murieron en presencia de un ligando se seleccionaron usando CS-045 y BRL-49653, conocidos como ligandos del PPAR \gamma (véase, Cell, 83, 863 (1995); Endocrinology, 137, 4189 (1996) y J. Med. Chem., 39, 665 (1996)); carbaciclina y ETYA, conocidos como ligandos del PPAR \alpha (véase, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157 (1994); Cell Structure and Function, 18, 267 (1993); Gene & Development, 10, 974 (1996) y Eur. J. Biochem., 233, 242 (1996)); carbaciclina, conocida como ligando del PPAR \delta (véase, Gene & Development, 10, 974 (1996)) y un compuesto descrito por Merck (véase, el compuesto del ejemplo 7 en la publicación de la solicitud internacional PCT Nº 9.728.149). Esto es, se añadió cada muestra de estos compuestos, que tiene una concentración dos veces mayor que su concentración final de 10 \muM, a cada uno de los pocillos de cultivo anteriores y se cultivaron las células de nuevo durante 40 horas. Después de descartar el sobrenadante, la placa resultante se incubó en una solución de cloruro de metilrosanilina (``Cristal Violet'') (cloruro de metilrosanilina 0,75%-NaCl 0,25%-formaldehido 1,75% en etanol al 50%) durante 20 minutos a temperatura ambiente y, seguidamente, se lavó dos veces con tampón fosfato salino (PBS), realizándose, de este modo, la tinción de las células supervivientes (véase, Cell, 66, 233 (1991)). Se midió directamente la absorbancia de cada pocillo de la placa a 570 nm, usando un lector de microplacas.

Ejemplo 6 Análisis de muerte celular usando células L929 transfectadas establemente con el plásmido que codifica el PPAR \gamma, \alpha ó \delta, que responde a ligando.

Se cultivó cada uno de los clones que tuvieran la capacidad de respuesta más alta, obtenidos en el ejemplo 5, mediante el método anterior; se indujo, mediante los compuestos anteriores, la muerte celular de las células cultivadas de este modo, mediante el método anterior y, seguidamente, se tiñeron las células supervivientes para medir la absorbancia. La muerte celular aparece significativamente después de 24 horas y se completó durante las 36 a 40 horas al alcanzarse el estado estacionario.

Se muestran en la figura 1 (A) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después de 40 horas de tratamiento con CS-045 y BRL-49653 del clon que responde al ligando del PPAR \gamma, y se muestran en la figura 1 (B) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después del tratamiento del mismo modo con estos compuestos de las células control (L929). Se muestran en la figura 2 (A) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después de 40 horas de tratamiento con carbaciclina y Wy-14643 del clon que responde al ligando del PPAR \gamma, y se muestran en la figura 2 (B) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después del tratamiento de la misma manera con estos compuestos de las células control (L929).

Además, se muestran en la figura 3 (A) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después de 40 horas de tratamiento con carbaciclina, ETYA, Wy-14634 y CS-045 del clon que responde al ligando del PPAR \alpha, y se muestran en la figura 3 (B) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después del tratamiento de la misma manera con estos compuestos de las células control (L929).

Además, se muestran en la figura 4 (A) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después de 40 horas de tratamiento con carbaciclina, el compuesto de Merck, ETYA y CS-045 del clon que responde al ligando del PPAR \alpha, y se muestran en la figura 4 (B) los cambios dependientes de dosis en el número de células intactas después del tratamiento de la misma manera con estos compuestos de las células control (L929).

Además, la relación del número de células intactas cuando cada compuesto fue sustituido por un disolvente, se expresó como el 100% en cada dibujo.

Como es evidente en la figura 1, en el caso de las células en las que se introdujo establemente el vector de expresión de la proteína del receptor quimérico proteína efectora Gal4-PPAR \gamma humano, el CS-045 y BRL-49653, conocidos como agonistas del PPAR \gamma, no mostraron una toxicidad directa sobre las células normales L929, pero causaron una muerte celular significativa de las células de respuesta, de una manera dependiente de dosis. Además, aunque son el mismo agonista del PPAR \gamma, el compuesto que tiene una afinidad de unión por la proteína PPAR \gamma mayor o una capacidad de activación de la transcripción mayor (véase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 431 (1996)), muestra una acción citocida notable a una concentración menor.

Como es evidente en la figura 2, la carbaciclina y Wy-14643, conocidos como agonistas del PPAR \alpha, no causan muerte celular a las concentraciones respectivas de 10 \muM o menos y 100 \muM o menos, que no son tóxicas para las células. Particularmente, a una concentración de 10 \muM o menos, a la cual la carbaciclina no muestra actividad agonista frente al PPAR \gamma (véase, Genes & Development, 10, 974 (1996)), ésta no causa muerte celular en las células que responden al ligando del PPAR \gamma.

Como es evidente en la figura 3, la carbaciclina, ETYA y Wy-14643, conocidos como agonistas del PPAR \alpha, causan muerte celular dependiente de dosis. Por otro lado, el CS-045, conocido como un agonista del PPAR \gamma, no causa muerte celular a una concentración de 10 \muM o menos, que no muestra toxicidad. Además, aunque los tres anteriores son el mismo agonista del PPAR \alpha, el compuesto que tiene una afinidad de unión por la proteína PPAR \alpha mayor o una capacidad de activación de la transcripción mayor, muestra una acción citocida notable a una concentración menor.

Como es evidente en la figura 4, la carbaciclina y el compuesto de Merck, conocidos como agonistas del PPAR \delta, causan una muerte celular dependiente de dosis. Por otro lado, el CS-045, conocido como un agonista del PPAR \gamma, y ETYA, conocido como un agonista del PPAR \alpha, no causan muerte celular a una concentración de 10 \muM o menos, que no muestra toxicidad. Además, aunque los dos compuestos anteriores son el mismo agonista del PPAR \delta, el compuesto que tiene una afinidad de unión por la proteína PPAR \delta mayor o una capacidad de activación de la transcripción mayor, muestra una acción citocida notable a una concentración menor.

En base a los resultados mostrados en las figuras 1,2, 3 y 4, se ha puesto al descubierto que, cuando la muerte celular está mediada por la sobreexpresión de un péptido funcional MFas, la muerte celular de las células que responden al ligando del PPAR \gamma presenta una buena correlación con la potencia de acción del ligando del PPAR \gamma; la de las células que responden al ligando del PPAR \alpha la presentan correlativamente con la potencia de acción del ligando del PPAR \alpha y la de las células que responden al ligando del PPAR \delta con el ligando del PPAR \delta. Además, la muerte celular se presenta cuando se usa no sólo el PPAR sino también otros receptores nucleares y cuando se usa el PPAR no solamente humano sino también de otra procedencia animal. Cuando se usa el análisis testigo de la invención, se pueden evaluar fácil y específicamente ligandos de receptores nucleares mediante la obtención de clones de respuesta elevada a ligando mediante la introducción estable del plásmido respectivo en ellos. Adicionalmente, puesto que la cantidad eficaz de los compuestos de ensayo para su evaluación mediante el análisis testigo coincide notablemente con el intervalo de concentraciones que muestra acción citocida en el sistema de la invención, éste es un método excelente mediante el que se puede evaluar simultáneamente la potencia de los ligandos respectivos.

Claims

1. Un plásmido de ADN que comprende un promotor y un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una región transmembrana y una región funcional de un antígeno Fas seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 136 y 305 del antígeno Fas de ratón, y una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 145 y 319 del antígeno Fas humano, en una región cadena abajo de un elemento de respuesta a la proteína Gal4.

2. El plásmido de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se une una secuencia de aminoácidos que comprende una región de péptido señal del antígeno Fas al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos que comprende la región transmembrana y la región funcional del antígeno Fas.

3. El plásmido de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende la región de péptido señal del antígeno Fas es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones -21 y 14 del antígeno Fas de ratón o una secuencia de aminoácidos entre las posiciones -16 y 23 del antígeno Fas humano.

4. Un transformante transformado con tanto el plásmido de ADN de la reivindicación 1 como con un ADN que codifica una proteína efectora.

5. El transformante de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la proteína efectora es una proteína de fusión en la que se une una secuencia de aminoácidos que comprende una región de unión a ligando de un receptor nuclear al extremo C-terminal de una secuencia de aminoácidos que comprende una región de unión a ADN de la proteína Gal4.

6. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor de esteroides.

7. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor \alpha activador de la proliferación de peroxisomas (PPAR).

8. El transformante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando del receptor nuclear es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 167 y 468 del receptor PPAR \alpha humano o una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 167 y 468 del receptor PPAR \alpha de ratón.

9. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor PPAR \delta.

10. El transformante de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando del receptor nuclear es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 139 y 441 del receptor PPAR \delta humano o una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 138 y 440 del receptor PPAR \delta de ratón.

11. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor PPAR \gamma.

12. El transformante de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando del receptor nuclear es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 176 y 478 del receptor PPAR \gamma1 humano, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 174 y 475 del receptor PPAR \gamma1 de ratón, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 204 y 506 del receptor PPAR \gamma2 humano o una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 204 y 505 del receptor PPAR \gamma2 de ratón.

13. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor X de retinoides.

14. El transformante de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando del receptor nuclear es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 225 y 462 del receptor X de retinoides \alpha humano, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 297 y 526 del receptor X de retinoides \beta humano, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 230 y 467 del receptor X de retinoides \alpha de ratón, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 171 y 410 del receptor X de retinoides \beta de ratón o una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 229 y 463 del receptor X de retinoides \gamma de ratón.

15. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor del ácido retinoico.

16. El transformante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende la región de unión a ligando del receptor nuclear es una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 198 y 462 del receptor \alpha del ácido retinoico humano, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 191 y 448 del receptor \beta del ácido retinoico humano, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 200 y 454 del receptor \gamma del ácido retinoico humano, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 198 y 462 del receptor \alpha del ácido retinoico de ratón, una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 190 y 448 del receptor \beta del ácido retinoico de ratón o una secuencia de aminoácidos entre las posiciones 200 y 458 del receptor \gamma del ácido retinoico de ratón.

17. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el receptor nuclear es un receptor de la vitamina D_{3}.

18. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5 en el que el receptor nuclear es un receptor de hormonas tiroideas.

19. Un agente terapéutico contra un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, que comprende el plásmido de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un ADN que codifica una proteína efectora.

20. Un agente terapéutico contra un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria, que comprende el plásmido de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un ADN que codifica una proteína efectora para transformar el transformante de una cualquiera de la reivindicaciones 4 a 18 como ingrediente activo.

21. Un método para seleccionar un agonista o un antagonista de un receptor intracelular, que comprende usar el transformante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18.

22. un método de acuerdo con la reivindicación 21, para seleccionar un agonista o un antagonista de un receptor PPAR \alpha, un receptor PPAR \gamma ó un receptor PPAR \delta, en el que el transformante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18 es un fibroblasto L929 de ratón o una célula cancerosa humana HeLa.