ES2197604T3

ES2197604T3 - Proceso para fabricar silice coloidal silanizada.

Info

Publication number: ES2197604T3
Application number: ES99902116T
Authority: ES
Inventors: Peter Van Vlasselaer; Shirin W. Hasan
Original assignee: Dendreon Corp
Current assignee: Dendreon Corp
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1999-01-07
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2019-01-07
Also published as: PT1047635E; EP1047635A1; JP4576046B2; NZ506157A; HK1028390A1; AU742446B2; JP2002509070A; ATE237556T1; WO1999036359A1; DK1047635T3; CA2317488C; US6015843A; DE69906930D1; EP1047635B1; AU2217099A; CA2317488A1; DE69906930T2; BR9906965A

Abstract

Un método para la preparación a granel de una suspensión de sílice coloidal organosilanizada estable en un medio acuoso, que comprende proporcionar una solución de organosilano acuosa que tiene un pH que está en el intervalo de aproximadamente 2-3 y se calienta a aproximadamente 80º C durante aproximadamente 1 hora, añadir a dicha solución de organosilano, una suspensión de sílice coloidal para formar una mezcla de sílice organosilano-coloidal que tiene una concentración final de organosilano de aproximadamente un 5 y aproximadamente un 10% v/v; ajustar el pH de dicha mezcla de sílice organosilano- coloidal a un pH superior a aproximadamente 6, 0; curar dicha suspensión durante un período de tiempo eficaz para producir una suspensión coloidal estable, como se demuestra por la falta de formación de precipitados en presencia de sal o ácido fisiológico, donde dicha suspensión de sílice coloidal resultantes es acuosa y no tóxica para células.

Description

Proceso para fabricar sílice coloidal silanizada.

Campo de la invención

La invención se refiere a un proceso para producir una preparación de sílice coloidal silanizada que es útil, por ejemplo, como un medio de separación de células por gradiente de densidad.

Referencias

Ausubel, F.M., et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Willey and Sons, Inc., Media PA (1988).

Antecedentes de la invención

Las preparaciones de sílice coloidal silanizada se usan en una diversidad de aplicaciones industriales incluyendo, por ejemplo, la producción de recubrimientos resistentes a la abrasión, materiales de toner serográfico y separación por gradiente de densidad de materiales biológicos.

La preparación de sílice coloidal silanizada puede ser dificultosa, ya que el sílice coloidal es inherentemente inestable bajo condiciones que son óptimas, si no es necesario, para la silanización, por ejemplo, un pH ácido. Bajo tales condiciones ácidas, el sílice, a menudo está en forma de ``geles'', o pierde sus propiedades de suspensión para formar un material semisólido de tipo gelatinoso. Bajo condiciones más neutras o a pH alcalino, la silanización no se produce eficazmente, posiblemente debido a la autocondensación del silano. Aunque para algunas aplicaciones (por ejemplo recubrimientos anti-abrasión) no es necesario retener las partículas de sílice en un estado suspendido, para otras aplicaciones (por ejemplo, materiales de gradiente de densidad) es importante mantener las propiedades coloidales de la suspensión.

Se han desarrollado varios métodos para solventar los problemas reconocidos de silanización. De acuerdo con un método, la silanización se realiza en presencia de disolventes orgánicos en ausencia de agua; sin embargo, tales disolventes orgánicos son difíciles de eliminar de la preparación y no son deseables en muchas aplicaciones, tales como en materiales de gradiente de densidad, ya que pueden ser tóxicos o perjudiciales de otra forma para la aplicación.

Otro procedimiento conocido para la silanizar partículas de sílice usa un catalizador. De nuevo, esto tiene el problema de añadir materiales indeseados, potencialmente tóxicos a la preparación. Además, la adición de disolventes orgánicos y/o catalizadores en la preparación, crea niveles mayores de residuos tóxicos, que deben desecharse en áreas cada vez más limitadas del campo. Por lo tanto sería útil disponer de métodos de producción alternativos que utilicen reactivos e intermedios solubles en agua y medioambientalmente seguros.

La patente de Estados Unidos Nº 4.927.750 describe un método para preparar una sílice coloidal organosilanizada que es relativamente no tóxico para las células; sin embargo, el método de preparación incluye la adición de silano al sílice coloidal de una forma ``gota a gota'' o gradual durante un período de horas, mientras la mezcla se mantiene a una temperatura relativamente alta (75ºC). Este método requiere tiempo y no es un método fácil para la fabricación a granel. Aunque el método puede realizarse en condiciones alcalinas, se cree que la adición de silano al sílice debe ser gradual. Además, ligeras variaciones del método indicado pueden conducir a la gelificación de la suspensión, haciéndola inadecuada para ciertas aplicaciones, como se ha descrito anteriormente.

La presente invención resuelve muchos de los problemas inherentes en las preparaciones obtenidas usando los métodos de la técnica anterior, tales como la inestabilidad de las preparaciones, la presencia de disolventes orgánicos y otros intermedios tóxicos y la generación de subproductos tóxicos y perjudiciales. Es decir, de acuerdo con los métodos de la técnica anterior, las formulaciones acuosas sólo podrían prepararse por un mezclado laborioso y lento del organosilosano con el sílice coloidal; de otra forma, la suspensión se precipitaría. Como alternativa, la preparación podría obtenerse usando disolventes orgánicos; sin embargo, el uso de tales reactivos no es deseable para las composiciones de sílice coloidal para ciertos usos, tales como en preparaciones de materiales biológicos. El uso de tales reactivos no es particularmente deseable desde el punto de vista de la minimización de la producción de residuos peligrosos.

Por lo tanto, la presente invención soluciona los problemas inherentes en los métodos de la técnica anterior proporcionando un método para preparar partículas de sílice coloidal organosilanizadas que permite la silanización del sílice en condiciones acuosas que pueden aumentarse a escala fácilmente para procesos de fabricación a granel. La preparación de sílice coloidal silanizada resultante es extremadamente estable y permanece en fase soluble, incluso después de múltiples ciclos de autoclave o irradiación gamma como se requiere para la esterilización del medio. La formulación es particularmente adecuada para uso en preparaciones celulares animales, ya que puede suspenderse en una solución salina fisiológica sin gelificarse o precipitarse. Además es relativamente no tóxica para tales células, como se evidencia por la observación que puede usarse para procesar células humanas para trasplante sin inducir efectos adversos en los pacientes que las reciben.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un nuevo método medioambientalmente seguro para la preparación de una suspensión de sílice coloidal organosilanizada en condiciones acuosas. El método es particularmente adecuado para la preparación a granel de partículas de sílice coloidal organosilanizadas.

El descubrimiento de la invención es que los reactivos principales para obtener la suspensión de sílice coloidal organosilanizada pueden mezclarse conjuntamente de una forma bastante rápida, sin recurrir a la infusión lenta o a adiciones gota a gota que son necesarias en los métodos de la técnica anterior. Esto es posible, cuando el pH del reactivo de organosilosano se ajusta para estar dentro de un intervalo de aproximadamente 2-3, y el reactivo se calienta adicionalmente aproximadamente a 80ºC durante aproximadamente 1 hora. A este organosilosano tratado después se le añade una suspensión de sílice coloidal para formar una mezcla de organosilosano-sílice coloidal que tiene una concentración final de entre aproximadamente un 5 y aproximadamente un 10% vol/vol de organosiloxano. El pH de la mezcla de organosiloxano-sílice coloidal se ajusta a un pH mayor de aproximadamente 6,0 y en las realizaciones preferidas, en el intervalo de 6-7, más específicamente a un pH de 6,2-6,5. La suspensión después se ``cura'' durante un período de tiempo eficaz para producir una suspensión coloidal estable. De acuerdo con las realizaciones preferidas el curado se realiza, por ejemplo, por calentamiento a al menos aproximadamente 80ºC o por irradiación ultravioleta. Tal suspensión estable se evidencia por la ausencia de formación de precipitados en presencia de sal o ácido fisiológico.

En una realización preferida, el organosilosano tiene la fórmula general: (X)_{3}-Si-(CH_{2})_{3}-Y, donde

Y se selecciona entre el grupo compuesto por 1 -O_{2}CCH_{3}, -N(CH_{2}CH_{2}OH)_{2}, -CO_{2}CH_{3}, -NH(CH_{2})_{2}NH(CH_{2})_{2}CO_{2}CH_{3}, NHCOCH_{2}NHC(CH_{3})O, 2 y 3 De acuerdo con esta realización, X se selecciona entre el grupo compuesto por H_{3}CO, Cl y H_{3}C_{2}O.

En otra realización preferida, el organosilosano es gamma- glicidoxipropiltrimeoxisilano.

En una realización preferida adicional, el intervalo de pH de la reacción es de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0; y preferiblemente en el intervalo de 6,2 a 6,5.

Las partículas de sílice que constituyen la suspensión de sílice coloidal pueden ser de cualquier intervalo de tamaños coherente con el mantenimiento de una suspensión coloidal; los intervalos de tamaños preferidos incluyen de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 nm, de diámetro; e incluso más preferiblemente, de aproximadamente 7 a 12 nm de diámetro.

De acuerdo con una característica importante de la invención, la estabilidad de la suspensión de sílice se evidencia por la resistencia a procesos de autoclave repetidos y por la resistencia a tratamiento de irradiación gamma, y por la estabilidad en presencia de concentraciones fisiológicas de sales, tales como cloruro sódico al 0,9% (solución salina). El proceso de fabricación anterior también es relativamente no tóxico para el medioambiente, ya que los reactivos y componentes son acuosos. La composición resultante también es relativamente no tóxica para las células suspendidas en el sílice coloidal silanizada.

Estos y otros objetos y características de la invención estarán más claros cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención, junto con las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra una secuencia de reacción para la silanización de grupos silanol sobre la superficie de una partícula de sílice coloidal (Ejemplo 1);

Las Figs. 2A y 2B muestran el efecto de procesos de autoclave repetidos sobre la medida de densidad del sílice coloidal preparado de acuerdo con el método de la invención en ausencia (2A) y presencia (2B) de sales;

Las Figs. 3A y 3B muestran el efecto de procesos de autoclave repetidos sobre la medida de la osmolalidad del sílice coloidal preparado de acuerdo con el método de la invención en ausencia (3A) y presencia (3B) de sales;

Las Figs. 4A y 4B muestran el efecto de procesos de autoclave repetidos sobre la medida de pH del sílice coloidal preparado de acuerdo con el método de la invención en ausencia (4A) y presencia (4B) de sales;

La Fig. 5 muestra el porcentaje de recuperación de diversos tipos de células presentes en la interfase de la muestra después del procesamiento en sílice coloidal preparado de acuerdo con el método de la invención;

La Fig. 6 muestra el porcentaje de células viables incubadas en presencia y ausencia del sílice coloidal preparado de acuerdo con el método de la invención (Ejemplo 3); y

La Fig. 7 muestra el porcentaje de recuperación de células (unidades formadoras de colonias; CFU) preparadas en condiciones diferentes (Ejemplo 3).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

``Sílice coloidal'' se refiere a una suspensión acuosa de partículas de sílice coloidal, habitualmente formados por polimerización de ácido monosilícico en SiO_{2} disuelto en agua.

``Partículas de sílice coloidal organosilanizada (OCS)'' se refiere a una composición de sílice coloidal a la se le ha unido covalentemente un recubrimiento de organosilano. La patente de Estados Unidos No. 4.927.749 se incorpora en este documento como referencia en su totalidad para la descripción de una preparación de sílice coloidal organosilanizada.

La expresión ``suspensión de sílice coloidal estable'' como se usa en este documento se refiere a partículas de sílice que se han organosilanizada de acuerdo con lo descrito anteriormente, caracterizada adicionalmente porque tiene una estabilidad de composición con respecto al pH, osmolalidad y densidad durante un periodo de varios días o después de uno o más procesos de autoclave o exposición a irradiación gamma. Una suspensión de sílice coloidal estable se evidencia por la ausencia de precipitación o ``gelificación'' después de tales tratamientos. Tales suspensiones estables también permanecen estables en presencia de, o después de la adición de, concentraciones de sales fisiológicas, tales como cloruro sódico al 0,9% (p/v), y son estables a la adición de ácido para producir un pH de aproximadamente 5-6. Por el contrario, cuando se añaden sales fisiológicas o suficiente ácido, se produce gelificación o precipitación, evidenciado por que la suspensión, en principio transparente, se vuelve blanca u opaca.

El término ``sol'' como se usa en este documento se refiere a un coloide líquido, suspensión o mezcla en el que las partículas sólidas se dispersan de forma estable en una fase líquida.

El término ``gel'' como se usa en este documento se refiere a una suspensión coloidal de un líquido en un sólido, que forman un material de tipo gel, en una forma más sólida que una sol.

El término ``no tóxico'' a células significa que una sustancia es capaz de ponerse en contacto estrecho con una suspensión de células biológicas durante un periodo de al menos 30 minutos sin disminuir el número de células viables en más de un 20%. Preferiblemente, tales células viables también son funcionales, como se aprecia por un ensayo funcional apropiado. En los ejemplos 3-5 de este documento se proporcionan ejemplos de métodos de medida de la toxicidad y funcionalidad celular.

II. Método para preparar una suspensión de sílice coloidal silanizada

Como se ha resumido anteriormente, los métodos de la técnica anterior para formar partículas de sílice coloidal silanizada han utilizado una de dos series de condiciones de reacción: (1) en un medio acuoso, la reacción se realiza a un pH ácido (aproximadamente pH 5,5), donde se añade el silano a la ``sol'' de sílice coloidal de una forma gota a gota o en forma de una infusión muy lenta, con el fin de prevenir la gelificación de la sol, o (2) la reacción se realiza en un disolvente orgánico. La reacción se ``cura'' o estabiliza, en ambos métodos generales, durante la síntesis química.

Como se ha descrito anteriormente, el uso de disolventes orgánicos generalmente se considera indeseable en varias aplicaciones, debido a la toxicidad y residuos tóxicos relacionados. De forma particular, en el contexto de la preparación de materiales para separación de fracciones biológicas basados en la densidad, la inclusión de disolventes orgánicos generalmente conduce a toxicidad celular. Los métodos conocidos para silanización de sílice coloidal en condiciones acuosas generalmente son molestos y consumen demasiado tiempo para los tipos de alta capacidad necesarios para la producción industrial del material; además, aún usando estos métodos, puede producirse la gelificación del producto.

El método que es objeto de la presente invención elimina la necesidad de la tediosa adición lenta (gota a gota) de reactivo, y produce un producto silanizada que es estable y no tóxico para materiales biológicos tales como células, según se demuestra en la Sección IV, mostrada a continuación. Aunque la técnica antecedente sugiere que las composiciones organosilanizadas son inestables en condiciones acuosas, el método de la presente invención proporciona una mejora significativa proporcionando un método medioambientalmente seguro para formar una composición acuosa estable.

Sin comprometerse con ninguna teoría particular, se cree que el proceso de la invención da como resultado la formación de un enlace del siloxano inicial entre los grupos silanol sobre la superficie de la partícula de sílice y el resto reactivo del grupo silano, y que la unión del organosilano a la partícula de sílice se fortalece a lo largo del proceso de curado que implica la exposición de la reacción a una temperatura de reacción relativamente alta (mayor de aproximadamente el 80ºC) durante un periodo de aproximadamente una a varias horas. Esta reacción se ilustra en la Fig. 1, usando el organosilano \gamma-glicioxipropiltrimetoxisilano como un ejemplo.

El Ejemplo 1 proporciona detalles del método de la invención como puede realizarse usando \gamma-glicidoxipropil-trimetoxisilano (GPMS) como un agente silanizante. Se entenderá que este método puede adaptarse fácilmente a cualquiera de todos los organosilanos que tengan suficiente reactividad para formar enlaces de siloxano en solución. La Tabla 1 proporciona una lista de ejemplos de organosilanos que pueden usarse para formar composiciones de la invención. Aunque el método de la invención se ejemplifica usando GPMS como reactivo de organosilano, se entiende que los tiempos de reacción y la optimización de las condiciones dependerán del reactivo particular seleccionado; estando dentro de la experiencia del especialista determinar tales condiciones optimizadas.

El Ejemplo 1 ejemplifica el uso de GPMS para partículas de sílice coloidal organosilanizantes adecuadas para la preparación de un medio de separación biológico. En este caso, primero se añade agua para formar una solución que tenga una concentración final de aproximadamente un 10% vol/vol. De acuerdo con una característica importante de la invención, esta solución se acidifica (pH aproximadamente 2,5) por la adición de ácido y después se calienta a aproximadamente 80ºC durante 60 minutos. La solución después se enfría a temperatura ambiente. Se añade sílice coloidal a la solución de silano acuoso mientras se agita de forma continuada hasta que la concentración total del silano está en el intervalo del 5-10%, y preferiblemente es de aproximadamente un 6-8% vol/vol. El pH de la mezcla de silano-sílice se ajusta de 6,2 a 6,5, y la solución se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 15-30 minutos.

El silano usado para las etapas preparativas anteriores puede ser cualquiera de varios compuestos de silano. La característica crítica de selección de silano es que el compuesto sea soluble en condiciones acuosas. Por consiguiente, además de GPMS, los organosilanos apropiados incluyen, pero sin limitación, los mencionados en la Patente de Estados Unidos No. 4.927.749 (DORN), incorporada en este documento como referencia. La Tabla 1 proporciona ejemplos de diversos silanos que pueden usarse en la presente invención; sin embargo, la invención no se limita por lo citado en la Tabla 1.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Organosilanos que pueden usarse para preparar reactivo-sílice coloidal modificado

4

5

6

7

8

Preferiblemente, el método de la invención usará trialcoxisilanos que tienen la fórmula RSi(OR_{1})_{3}, donde el grupo R_{1} es un radical alifático o arilo orgánico, típicamente de 1 a 20 átomos de carbono, tales como n-butilo, n-hexilo, n- heptilo, n-octilo, t-butilo, 3-butenilo, fenilo o similares. Estos compuestos, ejemplificados por GPMS en este documento, son preferibles debido a sus altas reactividades, en comparación, por ejemplo, con dialcoxisilanos y monoalcoxisilanos, que también pueden usarse. En la Patente de Estados Unidos No. 4.644.077 (Gupta), incorporada en este documento como referencia, se proporcionan ejemplos de trialcoxisilanos.

El material de partida de sílice coloidal es preferiblemente una composición particulada de sílice coloidal que comprende una suspensión acuosa de partículas de sílice que varía en tamaño de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 nm; para fines de preparación de un material de separación celular, son deseables partículas que varían en tamaño de 3 a 22 nm, y particularmente de 7-10 nm. Un ejemplo de material de partida es ``LUDOX HS-40'' obtenido de W.R. Grace & Co., como se describe en e ejemplo 1, en ese documento.

Como se ha mencionado anteriormente, sin limitarse a un mecanismo subyacente de la invención, se cree que la formación de enlaces entre las partículas y el reactivo de silano añadido se fortalece, por la formación de más enlaces de siloxano, enlaces intramoleculares o similares, por un proceso de ``curado'' posterior. Típicamente, tal curado se realiza por tratamiento térmico; por ejemplo, calentando la suspensión a 80ºC durante 60 minutos y posteriormente a 95ºC durante 3 horas, como se detalla en el Ejemplo 1 de este documento. Sin embargo, como alternativa o adicionalmente, el curado puede realizarse por tratamiento con luz ultravioleta, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4.822.828, incorporada en este documento como referencia. Por ejemplo, con el fin de asegurar que se completa el proceso de curado, un régimen de calentamiento se seguirá por exposición a la luz ultravioleta. Otros procesos de curado equivalentes y adecuados serán evidentes para los especialistas en la técnica.

III. Estabilidad de partículas silanizadas

De acuerdo con un aspecto importante de la presente invención, las partículas silanizadas preparadas de acuerdo con el método de fabricación reivindicado son particularmente estables a altas temperaturas, tales como las impuestas por condiciones de autoclave convencionales (121ºC, 2,1 Bar, 30 min), así como a la irradiación ionizante, tal como una irradiación gamma que proporciona una dosis comprendida entre aproximadamente 2,5 y 4,0 megarads. La estabilidad típicamente se mide comparando parámetros físicos tales como el pH, la osmolalidad y la densidad de la preparación antes y después del tratamiento, como se describe más adelante. La estabilidad también se evalúa añadiendo sal o ácido a la suspensión, para producir una concentración de sal fisiológica (cloruro sódico al 0,9% peso/vol.) o un pH de aproximadamente 5-6, respectivamente. Cuando se realizan tales adiciones, una suspensión estable no precipitará o ``gelificará'', mientras que una suspensión inestable se vuelve blanca u opaca debido a la precipitación o a la gelificación.

Las Figs. 2A y 2B muestran el efecto de procesos de autoclave repetidos (2-4 ciclos, 121ºC, 30 min, cada uno) sobre la medida de la densidad de la sílice coloidal organosilanizada. Como se muestra, en ausencia o presencia de sales fisiológicas, la densidad de la suspensión permanece constante.

De forma análoga, la osmolalidad y el pH de la suspensión permanece constante en ausencia o presencia de sales después de 2-4 ciclos de autoclave (Figs. 3A, 3B, 4A, 4B). En estos experimentos, las condiciones iniciales y finales de la suspensión fueron como se indican a continuación: densidad de 1º,0605 g/ml, pH 7,4, osmolalidad 280 mOsm (+ sales). Tales parámetros fisicoquímicos se usan para aislar ciertos tipos de células útiles, tales como células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos, células dendríticas, células mesenquimáticas y similares.

En otros experimentos realizados para apoyar la presente invención, se ha descubierto que la sílice coloidal silanizada preparada de acuerdo con el método de la presente invención también es estable ante la irradiación, particularmente en el intervalo de 2,5-4,0 megarad. Esto corresponde a un intervalo de dosis que se usan convencionalmente para la esterilización final de soluciones, por ejemplo, para el aislamiento de células biológicas.

IV. Compatibilidad biológica de la sílice coloidal silanizada

La separación de células por centrifugación por gradiente de densidad es una técnica popular en la biotecnología aprovecha el fenómeno de la separación de células en un medio de densidad definido de acuerdo con sus boyantes densidades. Para tales separaciones se usan diversos materiales gradientes, incluyendo medios basados en sílice coloidal.

Un ejemplo de un medio de densidad basado en sílice coloidal usado comúnmente en la separación por gradiente de densidad es ``PERCOLL'' (una marca registrada de Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). PERCOLL es una suspensión estable de partículas de sílice coloidal que tiene recubrimientos de polivinilpirrolidona. Aunque PERCOLL es bastante estable a un pH fisiológico, es inestable en la esterilización usando calor o irradiación ionizada, en condiciones fisiológicas (por ejemplo, cuando se diluye en una solución salina fisiológica). Estas propiedades limitan la utilidad del producto, especialmente en el contexto de las aplicaciones clínicas que implican la reintroducción de células separadas en seres humanos o en cualquier otro lugar donde se requiera finalmente el material esterilizado.

La Patente de Estados Unidos 4.927.749 proporciona una preparación de partícula (OCSP) de sílice coloidal organosilanizada (OCS) para la separación por gradiente de densidad que resuelve algunos de los problemas analizados anteriormente. Este medio tiene la ventaja, con respecto a PERCOLL, de ser mucho menos tóxico para las células, particularmente células sanguíneas ``raras'', tales como células progenitoras hematopoyéticas, células madre, linfocitos específicos de antígeno, células mesenquimáticas y similares, particularmente después de que se esterilice el medio. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, el método de la preparación descrita en la Patente de Estados Unidos 4.927.749 incluye una adición lenta de silano a la preparación, que no se puede practicar y que es cara para métodos de producción a granel.

El descubrimiento de la presente invención es que una preparación de partícula de sílice coloidal silanizada puede obtenerse usando el método descrito anteriormente y que esta preparación es igualmente no tóxica a preparaciones biológicas, particularmente fracciones de células sanguíneas aisladas, como se describe más adelante. En contraste, como se ha analizado anteriormente, los productos de la técnica anterior normalmente son difíciles de separar, son inestables para esterilización y/o tóxicos a las células.

La Fig. 5, muestra el porcentaje de recuperación de diversos tipos de células presentes en la interfaz de la muestra de sangre después de procesarse en la sílice coloidal de acuerdo con el método de la invención. En resumen, se cargaron PBMC en un tubo de centrífuga en la parte superior de la sílice coloidal organosilanizada que tenían una densidad de 1,0605, pH 7,4, 280 mOsm y se centrifugaron como se describe en el Ejemplo 2. Las células se recuperan de la interfaz entre el material de carga y el material de gradiente de densidad y se analizaron para el tipo de célula, usando tinción y procedimientos analíticos FACS, como se detalla en el Ejemplo 4. Como se muestra en la Fig. 5, las células CD34^{+} y CD14^{+} fueron las formas predominantes de células aisladas, como se esperaban en las condiciones usadas.

Otros experimentos mostraron que las células progenitoras hematopoyéticas eran viables, incluso cuando se incubaban con la sílice coloidal organosilanizada durante 24 horas. La Fig. 6 muestra los resultados de los experimentos en los que las células CD34^{+} se incubaron con tampón (PBS), sílice coloidal (cs) o suero de ternero fetal (FCS) durante 30 minutos y 24 horas, después se ensayaron para la viabilidad. Como se muestra, las células incubadas con sílice coloidal fueron tan viables como lo fueron las células incubadas con tampón o suero de ternero fetal.

En otros estudios, detallados en el Ejemplo 3, se midió la viabilidad funcional de diversos tipos de células después de la exposición a PBS o sílice coloidal durante 30, PBS o sílice coloidal durante 30 minutos seguido de medio de crecimiento de células (tampón de Iscove + suero) durante 24 horas, o PBS o sílice coloidal en presencia de suero durante 24 horas. Como se muestra en la Fig. 4, la viabilidad funcional (potencial biológico, proliferativo y de diferenciación) se calculó por un ensayo formador de colonias, como se describe en el Ejemplo 5. Los datos muestran que incluso en las condiciones de incubación más rigurosas, las características que forman colonias no cambiaron para las células CD34^{+}.

Los ensayos toxicológicos in vivo realizados para apoyar la presente invención en especies mamíferas también indicaron que el producto es aparentemente no tóxico cuando se administra por vía intravenosa o intracutánea. Como tal, el producto tiene la ventaja adicional de que puede ser adecuado para uso en la separación y preparación de células para la introducción en especies mamíferas, tal como en el transplante de células madre.

La invención también proporciona un método medioambientalmente seguro para preparar el material de sílice coloidal, ya que se realiza usando materiales de preparación acuosos, relativamente no tóxicos.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero de ninguna forma intentan limitar la presente invención.

Materiales A. Preparación de células progenitoras de sangre periférica

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recogidas por aféresis de pacientes con linfoma de no Hodgkins (NHL), linfoma de Hodgkins (HL) y cáncer de mama se obtuvieron a partir del Laboratorio de Transplante de Médula Ósea en Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, Estados Unidos. Las PBMC se movilizaron en pacientes con NHL mediante el tratamiento con citofosfamida (4 g/m^{2}, por vía intravenosa) seguido de G-CSF (10 \mug/Kg, por vía intravenosa, al día). Las PBMC se movilizaron en pacientes con cáncer de mama mediante el tratamiento con VP-16 (2 g/m^{2}, por vía intravenosa) seguido de G-CSP (10 \mug/kg, por vía intravenosa, al día). Las PBMC se movilizaron en pacientes con HL mediante el tratamiento con G-CSF solo.

B. Anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra antígenos de superficie específicos para células progenitoras hematopoyéticas (CD34, anti- HPCA-2) y leucocitos (CD45, anti-HLe-1) se obtuvieron de Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA). Lo diferentes mAb se marcaron directamente con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o con ficoeritrina (PE), de acuerdo con métodos convencionales (Ausubel, et al., 1993). Los anticuerpos policlonales IgG1 de control de isotipo marcados con PE se obtuvieron en Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA).

Ejemplo 1 Preparación de la sílice coloidal silanizada

Se añadió \gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPMS; United Chemicals, Bristol, PA) a agua para formar una solución que tenía una concentración final del 10% v/v. El pH se disminuyó a 2,5 con HCl 1N, con agitación continua. La solución se calentó a 80 grados C durante 60 minutos, después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió gradualmente sílice coloidal (Ludox HS-40, W. R. Grace y Co. Columbia, MD) a la solución salina acuosa mientras se agitaba continuamente hasta que la concentración final de silano fue del 7% v/v. El pH de la mezcla de sílice de silano se ajustó a 6,2-6,5 y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, la solución se calentó a 80ºC durante 60 minutos y posteriormente a 95 grados durante 3 horas. La solución se enfrió a temperatura ambiente y el pH se aumentó a 9-10 con NaOH 1N. La preparación de sílice coloidal silanizada se pasó a través de una columna de carbón activada para retirar los subproductos de reacción.

Ejemplo 2 Centrifugación por gradiente de densidad

Las PBMC se colocaron por capas en la solución por gradiente de densidad usando una pipeta. La separación por capas se realizó lentamente para evitar mezclar la muestra con la solución. Se colocaron por capas un máximo de 2 X 10^{9} células por tubos. La centrifugación se realizó durante 30 minutos a 850 g a temperatura ambiente. Para prevenir la mezcla de las células y la solución por gradiente de densidad, la centrífuga se detuvo sin la fuerza del freno. Las células se dividieron en dos fracciones de baja densidad localizadas en la interfaz y en una fracción de alta densidad que forma el sedimento. Ambas fracciones se recogieron usando una pipeta se vertieron en otro tuvo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Las células se lavaron una vez y se almacenaron en D-PBS de Dulbecco sin Ca^{++} y Mg^{++} a temperatura ambiente hasta una manipulación adicional. El número y la funcionalidad de las células progenitoras hematopoyéticas (células CD34^{+}) se determinó en ambas fracciones celulares por análisis de FACS o por ensayos clonogénicos como se muestra en las Figuras 5 y 7, respectivamente.

Ejemplo 3 Toxicología in vitro

El propósito de estos experimentos fue evaluar el efecto de la mezcla y de la posterior incubación de sangre periférica humana en la solución por gradiente de densidad. El objetivo del estudio fue determinar si la solución por gradiente de densidad ejerce algún efecto en la viabilidad y en la funcionalidad de células madre hematopoyéticas humanas. En estos experimentos se usaron seis diferentes paradigmas de mezcla e incubación, como se describe a continuación.

Específicamente, se suspendieron 3 X 10^{7} células en tampón de ensayo de 5 ml o en solución por gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mililitros. Después, la muestra se incubó durante un período de tiempo definido a temperatura ambiente, como se indica a continuación en la Tabla 2. Las células se incubaron durante 30 minutos, 30 minutos después de 24 horas en medio de cultivo celular (tampón de Iscove + suero de ternero fetal al 10%) o 24 horas. Las células se recogieron y se seleccionaron en función de la capacidad de formar colonias hematopoyéticas (CFU-E, BFU-E, CFU-GM y CFU-GEMM). Se realizaron otras evaluaciones midiendo el volumen de la muestra de PBMC y colocando la mitad del volumen en cada uno de los dos tubos de centrífuga de 50 ml. Después, las muestras se resuspendieron en un volumen total de 50 ml usando 1 X D-PBS (sin Ca^{++}, Mg^{++}). Un tubo se centrifugó a 550 g durante 10 minutos y el sobrenadante se desechó. El sedimento se resuspendió hasta el volumen original en ml usando solución enriquecida con CD34. Después, se contabilizaron las células en cada alícuota.

TABLA 2

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|l|}\hline
 Condición  \+ Tampón/Medio  \+ Incubación \\\hline  1  \+ 
D  -  PBS sin Ca ^{2+} , Mg ^{2+}   \+  30 min a temp.
ambiente \\\hline  2  \+ Medio por gradiente de densidad  \+  30 min
a temp. ambiente \\\hline  3  \+   D  -  PBS sin
Ca ^{2+} , Mg ^{2+}   \+ 30 min a temp. ambiente, \\   \+  \+
sedimento, resuspender en \\   \+  \+ medio celular, después 24 \\  
\+  \+ horas, temp. ambiente \\\hline  4  \+ Medio por gradiente de
densidad  \+ 30 min a temp. ambiente, \\   \+  \+ sedimento,
resuspender en \\   \+  \+ medio celular después 24 \\   \+  \+
horas, temp. ambiente \\\hline  5  \+   D  -  PBS sin
Ca ^{2+} , Mg ^{2+} + Suero de  \+ 24 horas, temp. ambiente \\   \+
ternero fetal al 10% \+ \\\hline  6  \+   Medio por gradiente de
densidad   \+ 24 horas, temp. ambiente \\   \+ + Suero de ternero
fetal al 10% \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 4 Procedimiento de tinción y cuantificación de células CD34^{+} por análisis FACS

La cuantificación de células CD34^{+} se realizó por análisis de FACS. Las células se marcaron con un tinte nuclear y mA dirigido a CD34 y CD45. El porcentaje de células CD34 se determinó en la entrada de células nucleadas. Este procedimiento se eligió para evitar la interferencia de material particulado no nucleado con la precisión del análisis de células CD34 en el FACS.

Una suspensión celular de 2 X 10^{7} células/ml se realizó en D-PBS sin Ca^{++} y Mg^{++}. Se distribuyen 50 \mul de esta suspensión celular en pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos, a una concentración de 1 X 10^{6} células por pocillo. Después, se añadieron 50 \mul de una solución de suero de conejo inactivado térmicamente al 20%/D-PBS a cada pocillo, seguido de 10 \mul de una solución de LDS de 10 \mug/ml y de una solución de 75 \mul/D-PBS a cada pocillo. Los contenidos de cada pocillo se mezclaron. La placa de microtitulación se cubrió con papel de aluminio y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A cada pocillo de control se le añadieron 20 \mul de IgG1-ficoeritrina (IgG1-PE) y 20 \mul de CD34-PE, después se mezcló. La placa se recubrió con papel de aluminio y se incubó durante 15 minutos a 4ºC. Después, las placas se centrifugaron a 850 g durante 2 minutos a 4ºC. Después, las placas se volcaron rápidamente para retirar los sobrenadantes, seguido de la suspensión de cada sedimento celular en 200 \mul de un 1 X DPBS (sin Ca^{++} y Mg^{++}) frío (4ºC). Las placas se centrifugaron a 850 g durante 5 minutos a 4ºC, después se volcaron rápidamente para retirar el sobrenadante. Cada sedimento celular se resuspendió en 50 \mul de solución de suero de conejo inactivada caliente al 20%. Se añadieron 20 \mul de CD45-FITC a cada pocillo de control y de ensayo, después se mezcló. Las placas se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC. Se añadió una alícuota de 100 \mul de 1 X D-PBS (sin Ca^{++} y Mg^{++}) frío (4ºC) a todos los pocillos de control y de ensayo. Cada placa se centrifugó a 850 g durante 5 minutos a 4ºC, después se volcaron para retirar los sobrenadantes. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 \mul de 1 X D-PBS (sin Ca^{++} y Mg^{++}) frío (4ºC) seguido de centrifugación a 850 g durante 5 minutos a 4ºC. Después, las placas se volcaron rápidamente para retirar el sobrenadante y cada sedimento celular se resuspendió en 200 \mul de paraformaldehído al 1% (4ºC). Las placas se cubrieron con papel de aluminio y se dejaron a 4ºC hasta el análisis FACS.

El análisis FACS se realizó en 10^{4} eventos de flujo usando un sistema FACSStar Plus equipado con un programa LYSYS II (Becton Dickinson, Inc.). Se colocó una puerta (Región 1) al rededor de las células nucleadas por tinción de LDS 751 en FL3 para dar entrada a los glóbulos rojos, las plaquetas y las partículas. FL1 y FL2 se representaron como un gráfico de puntos usando la Región 1. Se colocó una puerta (Región 2) al rededor de la población celular que tiñe tanto con mAb anti-CD45 como con mAb anti-CD34. El porcentaje de células que tiñen con los mAb anti-CD34 (FL2) como con los mAb anti-CD45 (FL1) se determinó en la Región 2. Esto representa el porcentaje de pliegues positivos de CD34 en el número total de células nucleadas. El número total de células positivas de CD34 se determinó en la muestra no procesada y en la fracción celular obtenida a partir de la interfaz y del sedimento después del procesamiento de las muestras de PBMC en la solución por gradiente de densidad.

Ejemplo 5 Ensayo forador de colonias (CFU)

Las células se mezclaron a 10^{5} células en metilcelulosa semisólida de 1 ml que contenía diferentes factores estimuladores de colonias y eritropoyetina (medio MethoCult™ H4433, Terry Fox Laboratories, Vancuver). Después de 14 días de cultivo a 37ºC, se contabilizaron el granulocito/macrófago eritroide (CFU-E, BFU-E) y las colonias mezcladas (CFU-GEMM) en un microscopio invertido (40x).

Ejemplo 6 Análisis estadístico

El porcentaje de recuperación de células se determinó por la fórmula:

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 % de recuperación = \+  Nº de células después de la manipulación \+
X 100\cr  \+ Nº de células al
principio\+\cr}

El porcentaje de recuperación de células CD34 se determinó por la fórmula:

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 % de recuperación = \+ 100 x \+ Nº de células CD34 después de la
manipulación\cr  \+ \+ Nº de células CD34 al
principio\cr}

El porcentaje de recuperación de células clonogénicas se determinó por la fórmula:

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  % de recuperación = \+ 100 x \+ Nº de células clonogénicas después
de la  manipulación\cr  \+ \+ Nº de células clonogénicas al
principio\cr}

Aunque la invención se ha descrito con referencia a métodos y a realizaciones específicos, se apreciará que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones sin alejarse de la invención.

Claims

1. Un método para la preparación a granel de una suspensión de sílice coloidal organosilanizada estable en un medio acuoso, que comprende

proporcionar una solución de organosilano acuosa que tiene un pH que está en el intervalo de aproximadamente 2-3 y se calienta a aproximadamente 80 grados C durante aproximadamente 1 hora,

añadir a dicha solución de organosilano, una suspensión de sílice coloidal para formar una mezcla de sílice organosilano-coloidal que tiene una concentración final de organosilano de aproximadamente un 5 y aproximadamente un 10% v/v;

ajustar el pH de dicha mezcla de sílice organosilano-coloidal a un pH superior a aproximadamente 6,0;

curar dicha suspensión durante un período de tiempo eficaz para producir una suspensión coloidal estable, como se demuestra por la falta de formación de precipitados en presencia de sal o ácido fisiológico,

donde dicha suspensión de sílice coloidal resultantes es acuosa y no tóxica para células.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicho organosilano tiene la fórmula (X)_{3}-Si(CH_{2})_{3}-Y en la que

Y se selecciona entre el grupo compuesto por 9 -O_{2}CCH_{3}, -N(CH_{2}CH_{2}OH)_{2}, -CO_{2}CH_{3},

\hbox{-NH  (CH _{2} )   _{2} NH  (CH _{2} )   _{2} CO _{2} CH _{3} }

, NHCOCH_{2}NHC(CH_{3})O, 10 y 11 y donde X se selecciona entre el grupo compuesto por H_{3}CO; Cl y H_{5}C_{2}O.

3. El método de la reivindicación 1 donde dicho organosilano es gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicha curación se realiza calentando dicha suspensión a al menos 80 grados C durante al menos una hora.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicha curación se realiza exponiendo dicha suspensión a irradiación ultravioleta.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicho pH de dicha mezcla de sílice organosilano-coloidal se ajusta a un pH que está en el intervalo de 6,0 a 7,0.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicho pH está en el intervalo de 6,2 a 6,5.

8. El método de la reivindicación 1, donde dichas partículas de sílice que comprenden dicha suspensión de sílice coloidal se caracterizan por un tamaño que varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 nm de diámetro.

9. El método de la reivindicación 8, donde dichas partículas de sílice se caracterizan por un tamaño que varía de aproximadamente 7 a 12 nm de diámetro.