ES2197700T3 - Matriz compuesta porosa, su produccion y utilizacion. - Google Patents

Matriz compuesta porosa, su produccion y utilizacion.

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ES2197700T3 ES99963373T ES99963373T ES2197700T3 ES 2197700 T3 ES2197700 T3 ES 2197700T3 ES 99963373 T ES99963373 T ES 99963373T ES 99963373 T ES99963373 T ES 99963373T ES 2197700 T3 ES2197700 T3 ES 2197700T3
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Abstract

Matriz compuesta porosa, estando formada la matriz por formadores de matriz que comprenden un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, y estando presentes los formadores de matriz en un intervalo de relaciones ponderales de derivado del ácido hialurónico a colágeno hidrolizado comprendido entre 30:70 y 99:1.

Description

Matriz compuesta porosa, su producción y utilización.
La invención se refiere a una matriz compuesta porosa a base de un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, que encuentra empleo como matriz compuesta biocompatible y biodegradable para la reparación de defectos músculo-esqueléticos.
Para la regeneración de defectos de los tejidos es necesario el empleo de una matriz tolerable por el cuerpo, lentamente biodegradable, que haga posible, bajo condiciones apropiadas, la diferenciación de las células incorporadas con producción acentuada de una matriz específica intercelular. En el estado conocido de la técnica son conocidas diferentes matrices de esta clase.
El documento WO 97/28192 da a conocer un procedimiento para la preparación de productos de colágeno exentos de priones, que pueden emplearse como implante esponjoso. Para aplicaciones oculares el producto de colágeno puede mezclarse con 5% en peso de ácido hialurónico para elevar su transparencia. El ácido hialurónico estimula, además, la infiltración celular en el implante.
Los documentos WO 91/18558 y WO 91/16867, así como el documento US 4.880.429, dan a conocer matrices compuestas a base de colágeno y hasta 25% en peso de glucosaminoglucanos tales como, por ejemplo, el ácido hialurónico.
El documento EP-A-0 784 985 da a conocer un cuerpo compuesto poroso que comprende un material hidrófilo bioabsorbible elegido entre gelatina, ácido hialurónico y un derivado del ácido hialurónico. El cuerpo está provisto, para evitar una resorción anticipada, adicionalmente de una capa de polímero de reabsorción retardada.
El documento WO 97/14376 da a conocer una matriz para implante de huesos a base de colágeno que como ligante puede contener ácido hialurónico.
El documento US 5.676.964 da a conocer ésteres reticulados inter- e intra- molecularmente de polisacáridos ácidos tales como, preferentemente, ácido hialurónico. Estos ésteres pueden emplearse como materiales biodegradables, por ejemplo esponjosos, como objetos quirúrgicos.
Las matrices conocidas, no obstante, presentan significativas limitaciones en la puesta a disposición de condiciones del medio, apropiadas para la diferenciación de las células incorporadas (p.ej., resorción anticipada, composición no apropiada de la matriz) y también son insatisfactorias en lo referente a la necesaria estabilidad para la manipulación.
Una misión de la presente invención consiste, por tanto, en poner a disposición una matriz que apoye la diferenciación celular y la producción de matriz intercelular y luego se degrade ella misma lentamente. Además, la matriz debe presentar una estabilidad suficiente que haga a la matriz muy apropiada y fácilmente manipulable no sólo para un precultivo de células in vitro, sino también para un implante.
Se ha encontrado ahora que este problema se resuelve por una matriz compuesta a base de un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado de composición determinada.
La presente invención se refiere, por tanto, a una matriz compuesta porosa, estando constituida la matriz por formadores de matriz que comprenden un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, y estando presentes los formadores de matriz en una relación ponderal de derivado del ácido hialurónico a colágeno hidrolizado que varía desde 30:70 a 99:1.
La matriz compuesta de acuerdo con la invención comprende como formadores de matriz un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, preferentemente en una relación ponderal de 60:40 a 99:1, y de modo especialmente preferido de aproximadamente 70:30.
Preferentemente, la matriz está constituida sólo por el derivado del ácido hialurónico y el colágeno hidrolizado.
Se ha demostrado que las matrices con una porción de derivado del ácido hialurónico inferior al 30% en peso son técnicamente desventajosas en virtud de una estabilidad demasiado pequeña. Por el contrario, mediante la matriz compuesta de acuerdo con la invención a base de un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, se podían mejorar significativamente la adhesión celular, la carga de la matriz con células y la subsiguiente diferenciación celular frente a las matrices a base de 100% de derivado de ácido hialurónico tales como, por ejemplo, las que se conocen a partir del documento US 5.676.964, citado al principio.
Además se absorbe directamente en la matriz compuesta, mediante el derivado del ácido hialurónico, un componente de degradación retardada. Con ello, por ejemplo, puede evitarse el recubrimiento adicional conocido a partir del documento EP-A-0 784 985, o una derivatización del colágeno por lo demás eventualmente necesaria, que es indeseada en virtud de la toxicidad detectada en parte de los agentes de derivatización.
Como colágeno hidrolizado es apropiado el colágeno parcial y/o completamente hidrolizado, en especial gelatina, es decir colágeno en forma fuertemente hidrolizada. Por ejemplo puede emplearse gelatina de cerdo o de buey. Sin embargo, pueden emplearse también formas de gelatina con una elevada tasa de agregación en dirección fibrillas. El colágeno más fuertemente agregado puede conducir a una mejora de la estabilidad de la matriz. Tales colágenos, con formas de degradación de diferente magnitud, pueden producirse mediante una hidrólisis controlada, lenta, de colágeno fibrilar.
El colágeno hidrolizado, si se desea, adicionalmente puede derivatizarse y/o reticularse transversalmente.
Como derivado del ácido hialurónico para la preparación de la matriz compuesta de acuerdo con la invención se prefieren los ésteres del ácido hialurónico, tales como el éster etílico y, en especial, el bencílico, en virtud de sus mejores propiedades biomecánicas, pudiendo presentar el ácido hialurónico diferentes grados de esterificación. En la patente de EE.UU. nº 5.676.964 se citan ejemplos de ésteres del ácido hialurónico utilizables de acuerdo con la invención.
Es ventajoso el derivado del ácido hialurónico empleado, preponderantemente hidrófobo.
Un éster preferido del ácido hialurónico es un éster bencílico del ácido hialurónico (HYAFF) que, por ejemplo, puede adquirirse de la Firma ``Fidia Advanced Biopolymers'' de Abano Therme en Italia. HYAFF se ofrece en diferentes grados de esterificación, de los que se prefiere, de acuerdo con la invención, un éster bencílico del ácido hialurónico de elevada esterificación ``HYAFF 11'' (100% de éster bencílico) que puede obtenerse en el comercio como material hidrófilo para vendajes ``JALOSKIN'', ya autorizado.
También son utilizables, sin embargo, otros ésteres del ácido hialurónico con grados más bajos de esterificación (por ejemplo HYAFF 11 p 75, un éster bencílico del ácido hialurónico con un grado de esterificación de aproximadamente 75%) y/u otros radicales alcohólicos tales como, por ejemplo, el éster etílico del ácido hialurónico (tal como p. ej. HYAFF 7), o con mezclas de diferentes radicales alcohólicos.
La matriz compuesta de acuerdo con la invención es porosa, en especial de poros abiertos. Preferentemente, los poros en la matriz compuesta tienen un diámetro medio en el intervalo de 10 - 1000 \mum, en especial de 50 - 500 \mum. Se ha demostrado que poros demasiado grandes (> 1000 \mum) en la colonización con células conducen a una elevada pérdida de células de la matriz, especialmente en el caso de pequeños diámetros alveolares. En el caso de poros demasiado pequeños (< 100 \mum) se muestra un fuerte efecto de tamizado y las células no pueden colonizarse en zonas más profundas de la matriz. Sin embargo, mediante una determinada proporción de poros más pequeños puede lograrse una densidad más baja y una estructura más suelta de la matriz compuesta. Con ello puede lograrse una aceleración de la degradación in vivo sin variación del tamaño de poros accesible para las células.
Los poros con un diámetro medio en el intervalo de 100 - 350 \mum y los poros con un diámetro medio en el intervalo de 350 - 1000 \mum se han manifestado ventajosos. Si se desea una densidad inferior o una estructura más suelta de la matriz compuesta, pueden existir adicionalmente poros en el intervalo de 
\hbox{10 - 100  \mu m}
, en especial en el intervalo de aproximadamente 50 \mum. También pueden ponerse a disposición poros p. ej. de igual tamaño o poros con un gradiente de tamaños.
Adicionalmente, la matriz compuesta de acuerdo con la invención puede reticularse transversalmente por vía química o física. Con ello se puede retrasar, según demanda, la posibilidad de degradación biológica de la matriz compuesta. Además, puede evitarse una lixiviación prematura de eventuales aditivos. Como agente de reticulación es apropiada, por ejemplo, cianamida, que reticula proteínas y polisacáridos y, en caso de degradación biológica, no produce sustancias residuales dañinas, extrañas al cuerpo, ya que se degrada para dar urea.
La matriz compuesta de acuerdo con la invención puede comprender, además, compuestos biológicamente activos. En este caso se puede tratar de compuestos, por ejemplo, que hacen óptima la propiedad de la matriz para la colonización de células, tales como, por ejemplo, antibióticos, compuestos para la mejora de la adhesión celular, sales de calcio, factores inductivos u otros glucosamino-glucanos y sus derivados. Ventajosamente se puede mejorar la adhesión celular mediante adición de poli-L-lisina muy polímera o recubrimiento con un derivado de succinilo activo de la poli-L-lisina o de la adición de fibronectina o péptidos con secuencias RGD.
Para hacer óptimo el empleo de la matriz compuesta de acuerdo con la invención en la terapia de defectos de tejido óseo, la matriz puede contener sales de calcio, tales como p. ej. sulfato cálcico, fosfato cálcico y carbonato cálcico por ejemplo, como suspensión o solución.
Para disminuir el peligro de infección en el implante de la matriz compuesta de acuerdo con la invención, ésta puede contener también antibióticos.
Como otros compuestos biológicamente activos, la matriz compuesta de acuerdo con la invención puede contener, por ejemplo, para hacer óptima la reparación de defectos músculo-esqueléticos factores inductivos, en especial citoquinas, tales como p. ej. bFGF (fibroblast growth factor-factor del crecimiento de fibroblastos), IGF (insulin-like growth factor - factor de crecimiento similar a insulina) o TGFbeta (transforming growth factor - factor de crecimiento transformante).
La matriz compuesta es especialmente apropiada para la generación in vitro e in vivo de tejidos diferenciados a partir de células condrocitarias, células de origen y progenitoras mesenquimales, osteoblastos y células de tejido conjuntivo, excepto células embrionarias humanas. La invención se refiere, por tanto, también a matrices compuestas que comprenden estas células.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la preparación de la matriz compuesta porosa precedentemente descrita. Este procedimiento comprende la disolución o suspensión del derivado del ácido hialurónico y del colágeno hidrolizado en un primer disolvente apropiado, la adición de un compuesto pulverulento que no se disuelve prácticamente en el primer disolvente, pero que es soluble en un segundo disolvente, en el que son prácticamente insolubles los formadores de la matriz, derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, a la solución o suspensión, presentando el compuesto pulverulento una granulometría media en el intervalo del tamaño de poros deseado de la matriz compuesta que se ha de preparar, la retirada del primer disolvente y, a continuación, la disolución del compuesto pulverulento en un segundo disolvente, en el que se disuelve el compuesto pulverulento y prácticamente no se disuelven los formadores de la matriz.
Como primer disolvente es apropiado en especial el 1,1,1,3,3,3- hexafluoroisopropanol (HFIP). En este caso se trata de un líquido de elevada volatilidad en el que se disuelven o suspenden simultáneamente a la temperatura ambiente el ácido hialurónico esterificado, el colágeno hidrolizado (gelatina), así como otras sustancias necesarias para los requisitos específicos, tales como, p. ej., factores de crecimiento y compuestos de calcio. Cuanto mayores sean los agregadores moleculares del colágeno hidrolizado, tanto peor es la solubilidad de los mismos en HFIP. El colágeno fibrilar ya no se disuelve.
Las concentraciones de las sustancias de partida en el primer disolvente no son esenciales para el procedimiento de acuerdo con la invención y pueden variarse, siempre que se obtengan soluciones o suspensiones manipulables. Esto se refiere tanto a las concentraciones de los componentes individuales, como también a la concentración total de los componentes en el primer disolvente. Las concentraciones individuales del derivado del ácido hialurónico y del colágeno hidrolizado determinan la relación ponderal de ambos componentes en el producto final. Puesto que finalmente se extrae del producto final el primer disolvente, la concentración total determina la densidad y estabilidad del producto final.
Para la manipulación de la matriz compuesta de acuerdo con la invención su estabilidad mecánica en estado húmedo desempeña un importante cometido. La resistencia de la matriz compuesta es la máxima en el caso de elevada proporción de derivado del ácido hialurónico en la matriz, puesto que aquí la matriz se hincha lo mínimo. Con proporción creciente del colágeno hidrolizado, se hincha la matriz compuesta fuertemente de modo creciente y se hace menos estable.
Preferentemente, en el procedimiento de acuerdo con la invención el HYAFF se disuelve con 5% en peso en HFIP. Para ello puede añadirse gelatina en concentración individual variable, por ejemplo hasta 7,5% en peso, de modo que en la solución se alcanza una elevada concentración total de 12,5% en peso de formadores de matriz. Con ello se compensa la disminución de estabilidad a causa del fuerte hinchamiento. Las soluciones con una concentración total de más del 12,5% en peso son muy viscosas y se dejan manipular mal. Una elevación de la proporción de la gelatina en el producto final sólo es, pues, realizable si se reduce la proporción de HYAFF. Sin embargo, una reducción de la proporción de HYAFF (por ejemplo a una concentración individual de 2,77% en peso con una concentración total de 9,23% en peso de formadores de la matriz en la solución, lo que corresponde a una relación ponderal de HYAFF a gelatina de 30:70) reduce la estabilidad de la matriz sin dar por resultado una mejora de la biocompatibilidad.
Fundamentalmente, la adición de gelatina repercute positivamente en la biocompatibilidad y en la propiedad histógena de la matriz. In vivo e in vitro se acreditó una relación ponderal de derivado del ácido hialurónico a colágeno hidrolizado de aproximadamente 70:30, pudiendo quedar, sin embargo, según sea la aplicación, por ejemplo para la formación de cartílago o para la regeneración de tejido óseo, las relaciones ponderales óptimas en el intervalo de 99:1 a 60:40.
La formación de poros se efectúa mediante adición de un compuesto pulverulento que prácticamente no es soluble en el primer disolvente. Si se emplea HFIP como primer disolvente, entonces era apropiado, por ejemplo, cloruro sódico como compuesto pulverulento para la formación de poros. El cloruro sódico es prácticamente insoluble en HFIP, además es inocuo y barato.
Junto al cloruro sódico es apropiado, además, p. ej., cuando se usa HFIP como primer disolvente, toda sal alcalina o alcalinotérrea soluble en agua y no soluble en HFIP, en especial los halogenuros. Debido a los motivos antes citados, se prefiere, sin embargo, el cloruro sódico.
La cantidad añadida del compuesto pulverulento determina el número de poros y, con ello, la densidad y también estabilidad de la matriz preparada. Se ha manifestado ventajosa una relación ponderal de solución o suspensión a cristales de cloruro sódico de aproximadamente 1:2.
El tamaño de los poros se determina a través de la elección del tamaño de grano del compuesto pulverulento. El cloruro sódico adquirible en el comercio tiene preponderantemente granos con un diámetro entre 500 y 1000 \mum. Pueden prepararse fracciones de menores tamaños fácilmente mediante molienda en mortero de granos mayores y tamizado a través de tamices calibrados.
La mezcla a base de HYAFF, gelatina y cristales de cloruro sódico tiene la consistencia de una pasta espesa. Mediante compresión con troquel en moldes, por ejemplo de plástico inerte (PTFE, PE, PVC), es posible producir objetos de matriz cuya forma puede adaptarse ampliamente a la demanda. Puesto que el HFIP como disolvente es muy volátil, se produce un rápido secado de la mezcla. Por dicho motivo debía conservarse la mezcla en recipientes cerrados y elaborarse lo más rápidamente posible. El secado puede lograrse, por ejemplo, durante la noche bajo una campana de ventilación y, a continuación, algunas horas al vacío. Después puede extraerse del molde la matriz compuesta.
Puesto que la mezcla durante el secado apenas encoge, la separación de la matriz puede ofrecer dificultades. Por ello debían estar configurados los moldes de manera que el contenido secado pueda extraerse con un troquel. Por ejemplo pueden prepararse fácilmente matrices de forma cilíndrica con un diámetro de 3 - 18 mm y una altura de 2 - 15 mm. Para la preparación de bloques de matrices mayores se han manifestado especialmente apropiados los moldes cuboides, en forma de bandejas, constituidos por piezas desmontables de pared y de suelo.
Los poros de la matriz compuesta de acuerdo con la invención se obtienen a continuación por disolución del compuesto pulverulento en un segundo disolvente, en el que se disuelve el compuesto pulverulento y los formadores de matriz prácticamente no se disuelven. Si se emplean cristales de cloruro sódico como compuesto pulverulento, es apropiada el agua en especial como segundo disolvente. Un lavado múltiple en agua pura retira la sal y las trazas de HFIP eventualmente adheridas todavía. En el caso de muestras pequeñas se recomiendan cuatro cambios del segundo disolvente después de 15 minutos de tiempo de inmersión cada vez, en el caso de muestras mayores, 6 cambios después de 20 minutos cada vez.
En el primer secado de la matriz compuesta por evaporación del primer disolvente se producen poros primarios cerrados, con granos de sal contenidos en su interior. Durante el proceso de lavado se hincha la sustancia semipermeable de la matriz y se produce en los poros la formación de una solución salina de elevada actividad osmótica. Como consecuencia, con ulterior absorción de agua, los poros revientan y la matriz finalmente se vuelve de poros abiertos.
En caso de que se desee, la matriz compuesta puede cargarse durante su preparación o después de ella adicionalmente con compuestos biológicamente activos, tales como los citados antes a modo de ejemplo. Ventajosamente se añaden los compuestos biológicamente activos a la solución o suspensión de los componentes de la matriz todavía antes de la adición del compuesto pulverulento.
Ventajosamente, a continuación se seca la matriz compuesta así preparada. Esto puede lograrse, por ejemplo, por inmersión en acetona de concentración creciente (50%, 80%, 100%), escurrido sobre papel de filtro y subsiguiente secado al vacío.
Finalmente, es conveniente retirar una delgada capa superficial de la matriz compuesta, por ejemplo con una cuchilla afilada, puesto que en esta capa permanece un elevado número de poros cerrados, lo que impide la penetración de las células en profundidad.
Antes de una carga con células, la matriz compuesta se esteriliza ventajosamente. Esto puede efectuarse por diferentes procedimientos conocidos de esterilización, tales como, por ejemplo, con alcohol, óxido de etileno o por esterilización gamma. Se prefiere una esterilización gamma con, por ejemplo, 350.000 rad.
La matriz compuesta de acuerdo con la invención es apropiada para la generación in vitro e in vivo de tejidos diferenciados a partir de células condrocitarias, células de origen y progenitoras mesenquimales, osteoblastos y células de tejido conjuntivo, excluidas las células embrionarias humanas. Mediante una composición específicamente adaptada de la matriz, así como su disposición geométrica, se hace posible así la reparación de defectos músculo-esqueléticos.
La presente invención se refiere, por tanto, también al empleo de la matriz compuesta antes descrita para la generación de tejidos diferenciados a partir de células condrocitarias o células de origen y progenitoras mesenquimales, excluidas las células embrionarias humanas, añadiéndose a la matriz compuesta células recientemente extraídas o amplificadas y cultivándose eventualmente bajo condiciones 
\hbox{condro-,}
osteo- o fibrógenas.
Mediante la adición de condrocites o células de origen y progenitoras mesenquimales recientemente extraídas, o de condrocitos o células de origen o progenitoras mesenquimales, excluidas células embrionaria humanas, desdiferenciadas, amplificadas in vitro, a la matriz compuesta de acuerdo con la invención bajo condiciones de cultivo condrógenas, puede así prepararse un tejido artrocartilaginoso que puede solicitarse biomecánicamente. La matriz compuesta de acuerdo con la invención es apropiada, por tanto, para la histoingeniería de tipos de tejido del aparato de unión y del de sostén, en especial del tejido condral y óseo.
Una matriz compuesta biocompatible y biodegradable, así preparada, sin cultivo precedente in vitro o con él, es apropiada para la diferencación in vivo para dar tipos de tejido del aparato de unión y del de sostén, en especial para dar tejido condral y óseo bajo injerto ectópico o autotópico.
La matriz compuesta de acuerdo con la invención es apropiada, por ejemplo, para condrocitos humanos, que se obtuvieron a partir de cartílago hialino. En este caso pueden representar la fuente de extracción los artrocartílagos hialinos de autopsias, así como las existencias de cartílagos residuales procedentes de la realización de endoprótesis totales.
Además, pueden emplearse células de origen y progenitoras mesenquimales adultas, por ejemplo de médula ósea, sinovio o periostio, así como, preferentemente, células de origen y progenitoras mesenquimales embrionarias del cordón umbilical. Las células de origen mesenquimales embrionarias ofrecen la ventaja de un inexistente rechazo en caso de trasplante alógeno. Además, están disponibles permanentemente en suficiente número y pueden obtenerse sin una intervención quirúrgica adicional en el paciente.
Otro aspecto de la presente invención es un implante que comprende una matriz compuesta porosa de acuerdo con la invención. Un implante de este tipo que, preferentemente, está recubierto con la matriz compuesta, tiene la ventaja de que se prepara una mejor integración al hueso y eventualmente también al tejido conjuntivo que lo rodea.
Como superficies de implante que se recubren con la matriz compuesta de acuerdo con la invención son apropiadas en especial las superficies de metal, tal como por ejemplo titanio o acero, un polímero o material cerámico.
La matriz compuesta de acuerdo con la invención presenta la ventaja de que al cargar la matriz con células, sólo se produce una pequeña variación de tamaño. Matrices de colágeno conocidas presentan, al cargarlas con células, fuertes diferencias de tamaño (en principio hinchamiento masivo, luego fuerte tendencia a hacerse bolas). Para su aplicación en ingeniería de tejidos (producción in vitro de tejido con la finalidad de incorporar éste a un defecto) es sin embargo muy ventajosa una estabilidad de tamaño de la matriz también después de la carga de células y el cultivo. Esto se logra por la matriz compuesta de acuerdo con la invención y, en especial, por la mezcla simultánea de los formadores de la matriz con empleo de HFIP.
Además, con la matriz compuesta de acuerdo con la invención se logran las otras ventajas siguientes:
En cultivo estacionario es posible una rediferenciación de condrocitos amplificados en la matriz compuesta. Se forman proteoglicanos típicos de cartílago (sulfato de condroitina, sulfato de queratano, agregano), así como colágeno II. Esto pudo detectarse después de cultivo durante 2, 4 y 6 semanas.
El producto producido in vitro a partir de condrocitos cultivados en la matriz compuesta demuestra un significativo aumento de la estabilidad biomecánica en comparación con la condición de partida en el momento de la aplicación de células sobre la matriz.
Sin células se disuelve la matriz in vitro después de 14 días aproximadamente. In vivo se puede observar una resorción después de 6 - 8 semanas aproximadamente (ratón desprovisto del sistema inmune, conejo).
Buena capacidad de diferenciación de células de la médula ósea para dar tejido tipo hialino in vitro.
Muy buena diferenciación para dar tejido óseo en la incorporación al tejido subcutáneo de ratones desprovistos del sistema inmune, resorción de la matriz in vivo no antes de transcurrir 6 semanas.
En el caso de la incorporación a defectos osteocondrales en la articulación de la rodilla de conejos es reconocible una integración del conjunto célula-matriz (en este caso las células eran células de médula ósea o condrocitos), es reconocible diferenciación para dar tejido cartilaginoso. En la parte ósea defectuosa se muestra integración ósea y diferenciación para dar nuevo tejido óseo.
No es detectable tendencia alguna a la inflamación de la articulación de la rodilla por el material (ningún derrame en la articulación, ningún aumento masivo de células de inflamación).
Incorporación del conjunto matriz-célula en defectos del menisco del conejo posible después de cultivo previo in vitro, buena regeneración del defecto del menisco, ninguna tendencia a la inflamación en la articulación de la rodilla.
En la combinación con el derivado del ácido hialurónico no se da hinchazón, negativa si aparece, en gelatina o colágeno después de humedecer la matriz seca. Esto es especialmente favorable para matrices de ingeniería de tejidos, con las que ha de repararse una determinada área defectuosa preestablecida.
Las figuras anejas muestran ampliaciones de la matriz compuesta de acuerdo con la invención. Muestran:
La figura 1, una estructura más estable (arriba) y una estructura más débil (abajo) ampliadas 50 veces,
La figura 2, una estructura más estable (arriba) y una estructura más débil (abajo) ampliadas 100 veces,
La figura 3, una estructura más estable (arriba) y una estructura más débil (abajo) ampliadas 200 veces y
La figura 4, condrocitos que crecen en los poros con una ampliación de 200 veces (arriba) y de 1000 veces (abajo).
La respectiva estructura más estable en las figuras 1 - 3 se obtuvo mediante una concentración total más elevada de los componentes de la matriz en la solución durante la preparación, habiéndose variado la concentración total desde 6,3% para la estructura más débil hasta 9,2% para la estructura más estable.
Las estructuras filamentosas de la figura 4 se refieren a la incipiente producción de la matriz extracelular.
Los siguientes ejemplos deben explicar más detalladamente la presente invención.
Ejemplo 1
Una matriz compuesta de acuerdo con la invención se preparó por disolución de HYAFF y gelatina en HFIP, adición de cristales de cloruro sódico, moldeo y secado de la pasta resultante, así como por retirada del cloruro sódico mediante lavado múltiple con agua. Después del secado se sometió la matriz compuesta a una esterilización gamma.
Ejemplo 2 Descripción del preparado Obtención de condrocitos para el cultivo celular primario Cartílago de la articulación adulto
Un cartílago de la articulación (adulto) hialino se trasladó inmediatamente después de su extracción a medio RPMI y se elaboró lo más rápidamente posibles (antes de 24 h). Para ello se separó en principio el cartílago del hueso mecánicamente y luego se trituró con un escalpelo (tamaño final: trocitos de cartílago de 1 - 2 mm). A 37ºC se efectuó a continuación con basculación permanente una digestión enzimática con colagenasa, hialuronidasa y ADNasa. Las enzimas se resuspendieron en medio RPMI con tampón Hepes, L-glutamina y adición de penicilina/estreptomicina (adición de antibióticos). El intervalo óptimo de disociación enzimática ascendió a 12 horas. Mediante adición de medio con contenido en suero (RPMI con suero AB al 10% o RPMI con suero bovino fetal (FBS) al 10%) se tamponó la actividad enzimática. A continuación se efectuó la extracción de los trozos de matriz extracelular que todavía quedaban mediante filtración y centrifugación de la suspensión, desecho del material sobrenadante y resuspensión del nódulo celular en RPMI con suero AB al 10% o RPMI con FBS al 10%. Después de un recuento celular siguió un cultivo estacionario y una amplificación de los condrocitos durante 14-21 días (cambio de medio 2 veces por semana con medio con contenido en suero). Después de lograr la confluencia, se efectuó un pasaje de las células (retirada del medio, adición de 0,25% de tripsina, después de eliminar la adherencia celular, adición de medio con contenido en suero, centrifugación de la suspensión celular y resuspensión del nódulo obtenido a continuación en medio reciente, recuento celular y siembra renovada de las células). En este caso se realizó la mayor parte de las veces una división de 1 a 4, es decir un frasco de cultivo suministraba las células para 4 nuevos frascos. Tras renovada confluencia (aproximadamente después de 2 - 4 semanas) se separaron las células (cultivo secundario) del caldo de cultivo mediante nuevo tratamiento con tripsina (véase antes) y se prepararon para la carga de las matrices.
Sin embargo, pueden emplearse también células en cultivo primario y terciario (2 etapas de pasaje).
Células de origen y progenitoras mesenquimales embrionarias a partir del cordón umbilical
Las células se cultivaron en medio DMEM con FBS al 10% y, después de alcanzar la confluencia, se emplearon como cultivo primario para la carga de la matriz. La obtención de las células adherentes se efectuó de nuevo por la aplicación de tripsina, antes descrita.
Células de origen y progenitoras mesenquimales adultas a partir de médula ósea
La médula ósea se obtuvo de la cresta ilíaca de liebres blancas de Nueva Zelanda de 4 meses de edad. Al producto aspirado se añadió ``Dolbecco's modified Eagle's Medium'' (medio de Eagle modificado por Dolbecco) (DMEM) con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Después de determinar el número de células se cultivaron 20x10^{6} células en placas de cultivo de 100 mm a 37ºC con 5% de CO_{2}. El medio se cambió dos veces por semana hasta que las células fueron confluentes en un 80%. Las células adherentes se trataron con tripsina, como antes se ha descrito, se contaron, lavaron y resuspendieron en DMEM a una concentración final de 5x10^{5} células/25 \muL.
Carga de la matriz
Para la carga de la matriz se recogió el nódulo celular en poco medio (1 mm^{3}/1 \mul). A continuación, se efectuó la carga de la matriz (estéril, seca hasta entonces) de un lado. Con ello se aseguró el desprendimiento del aire que se encontraba en la matriz (tiempo de actuación 1 - 5 minutos). A continuación, por medio de la producción de una subpresión y una sobrepresión se trasladó a la matriz con la punta de una pipeta el medio todavía remanente con elevada concentración celular. Se debía alcanzar una distribución lo más homogéna posible de las células en la matriz. Mediante la adición de sustancias detergentes puede facilitarse la carga.
A continuación se efectuó una incubación de 2 h en la incubadora (37ºC, 5% de CO_{2}). Esto permitió a las células adherirse a la matriz presente.
Finalmente, se recubrió completamente con medio el conjunto matriz-célula y se continuó cultivando.
Descripción del cultivo Cultivo estacionario
Para ello se emplearon diferentes medios de cultivo:
RPMI con suero AB al 10% (humano),
RPMI con FBS al 10% o
``Dulbecco's modified Eagle's Medium'' (medio de Eagle modificado por Dulbecco) (DMEM) con elevado contenido en glucosa y sustancias nutritivas así como aditivos (ITS y piruvato más dexametasona, ácido ascórbico y TGF betal). (Véase B. Johnstone en Exp. Cell Res. 238 (1998)).
Cultivo continuo de perfusión
Representa una condición alternativa de cultivo el cultivo continuo de perfusión en medio RPMI con suero AB al 10%.
Ejemplo 3
Para investigar la eficacia de la carga con células de la matriz compuesta de acuerdo con la invención, se cargó una matriz compuesta preparada según el Ejemplo 1 con las células de médula ósea obtenidas según el Ejemplo 2. Una parte de las matrices se fijó inmediatamente en formalina, se lavó y se incrustó en parafina (grupo I). Otras matrices cargadas (grupo II) se cultivaron durante 14 días en un medio condrógeno que contenía DMEM con ITS + mezcla previa (Collaborative Biomechanical Products), piruvato (1 mM), ácido 2-fosfatoascórbico (37,5 \mug/ml), dexametasona (10^{-7}M) y TGF-\beta1 (10 ng/ml). El medio se cambió tres veces por semana.
La suspensión celular se incorporó a la matriz bajo ligero hinchamiento del conjunto. Mediante zonas coloreadas con azul de toluidina de las matrices del grupo I pudo demostrarse que estaba presente una elevada carga de células en todos los poros de las matrices. Después de 14 días bajo condiciones condrógenas de cultivo (
\hbox{grupo II}
) estaban endurecidos los conjuntos matriz-célula originalmente blandos. Las zonas coloreadas con azul de toluidina mostraban células con una matriz extracelular acentuada, que se coloreaba metacromáticamente, que estaba presente en toda la matriz compuesta. La matriz extracelular contenía colágeno II. Ejemplo 4
Se implantaron subcutáneamente en ratones inmunodeficientes matrices compuestas cargadas con células tal como en el Ejemplo 3 (grupo III). Matrices iguales se cultivaron durante 14 días in vitro en el medio condrógeno descrito en el Ejemplo 3 y luego se implantaron in vivo (grupo IV). Los implantes se retiraron después de 3 semanas, se fijaron en formalina, se descalcificaron y se incrustaron en parafina.
Se cortaron rodajas de las muestras de 5 \mum de espesor y se colorearon con azul de toluidina. Las zonas coloreadas se valoraron después según su diferenciación osteocondral [0 (ni hueso ni cartílago en los poros de la matriz) a 4 (más del 75% de los poros contienen hueso y/o cartílago)].
Después de 3 semanas in vivo no apareció en los implantes del grupo III ni en los del grupo IV una variación esencial de tamaño. Los implantes cultivados previamente in vitro durante 14 días, (grupo IV) aparecieron sin embargo cualitativamente más duros que las matrices compuestas que se implantaron inmediatamente después de la carga con las células (
\hbox{grupo III}
). La coloración con azul de toluidina dio por resultado una diferenciación osteocondral de las células en las matrices compuestas de ambos grupos, habiéndose llenado los poros con cartílago y hueso. Sin embargo, las matrices compuestas del grupo IV contenían más hueso y cartílago (valoración media = 4, comparada con una valoración de 3 para el 
\hbox{grupo
III}
). Además, era mayor la proporción en hueso en las muestras del grupo IV (relación de hueso: cartílago: tejido fibroso en el grupo III: 40:20:40 y en el grupo IV: 85:10:5).

Claims (24)

1. Matriz compuesta porosa, estando formada la matriz por formadores de matriz que comprenden un derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, y estando presentes los formadores de matriz en un intervalo de relaciones ponderales de derivado del ácido hialurónico a colágeno hidrolizado comprendido entre 30:70 y 99:1.
2. Matriz compuesta según la reivindicación 1, estando presentes los formadores de matriz en un intervalo de relaciones ponderales de derivado del ácido hialurónico a colágeno hidrolizado comprendido entre 60:40 y 99:1, preferentemente en una relación ponderal de aproximadamente 70:30.
3. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones, en donde el colágeno hidrolizado está parcial y/o completamente hidrolizado.
4. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones, en donde el colágeno hidrolizado transformado está adicionalmente derivatizado y/o transversalmente reticulado.
5. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones, en donde el derivado del ácido hialurónico es un éster del ácido hialurónico.
6. Matriz compuesta según la reivindicación 5, en donde el éster del ácido hialurónico es un éster etílico o bencílico del ácido hialurónico.
7. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones, que comprende poros con un diámetro medio en el intervalo de 10-1000 \mum.
8. Matriz compuesta según la reivindicación 7, presentando los poros un diámetro medio en el intervalo de 100-350 \mum.
9. Matriz compuesta según reivindicación 7, en donde los poros presentan un diámetro medio en el intervalo de 350-1000 \mum.
10. Matriz compuesta según la reivindicación 8 ó 9, en donde adicionalmente los poros están presentes en el intervalo de 10-100 \mum.
11. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones que presenta reticulaciones transversales.
12. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones, que comprende compuestos biológicamente activos tales como antibióticos, compuestos para la mejora de la adhesión celular, sales de calcio, factores inductivos u otros glucosamino-glucanos y sus derivados.
13. Matriz compuesta según una de las precedentes reivindicaciones, que comprende condrocitos, células de origen y progenitoras mesenquimales, osteoblastos o células de tejido conjuntivo, excepto células obtenidas de embriones humanos.
14. Procedimiento para la preparación de una matriz compuesta porosa según una de las reivindicaciones 1-13, que comprende la disolución o suspensión del derivado del ácido hialurónico y del colágeno hidrolizado en un primer disolvente apropiado, la adición de un compuesto pulverulento que no se disuelve prácticamente en el primer disolvente, pero que es soluble en un segundo disolvente en el que prácticamente son insolubles los formadores de matriz derivado del ácido hialurónico y colágeno hidrolizado, a la solución o suspensión, presentando el compuesto pulverulento una granulometría media en el intervalo del tamaño deseado de poros de la matriz compuesta que se ha de preparar, la retirada del primer disolvente y, a continuación, la disolución del compuesto pulverulento en un segundo disolvente, en el que se disuelve el compuesto pulverulento y no se disuelven prácticamente los formadores de matriz.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el primer disolvente es 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que al compuesto pulverulento es una sal alcalina o alcalinotérrea soluble en agua, en especial un halogenuro alcalino tal como cloruro sódico.
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14-16, en el que el segundo disolvente es agua.
18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14-17, en el que la matriz compuesta adicionalmente se moldea, se seca y eventualmente se esteriliza.
19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14-18, en el que la matriz compuesta adicionalmente se carga, eventualmente, con compuestos biológicamente activos y condrocitos, células de origen y progenitoras mesenquimales, osteoblastos o células del tejido conjuntivo, excepto células obtenidas a partir de embriones humanos.
20. Empleo de una matriz compuesta según una de las reivindicaciones 1-13, para la generación de tejidos diferenciados a partir de células condrocitarias o células primitivas y progenitoras mesenquimales, excepto células obtenidas de embriones humanos, añadiéndose a la matriz compuesta células recién extraídas o amplificadas y cultivándose bajo condiciones condro-, osteo- o fibrógenas.
21. Empleo según la reivindicación 20 para ingeniería de tejidos de tipos de tejidos del aparato de unión y del de sostén, en especial de tejidos condrales y óseos.
22. Empleo de una matriz compuesta según una de las reivindicaciones 1-13 para la preparación de un medicamento para la reparación de defectos músculo- esqueléticos, añadiéndose a la matriz compuesta células recién extraídas o amplificadas, células condrocitarias o células de origen y progenitoras mesenquimales, excepto células embrionarias humanas, y cultivándose eventualmente bajo condiciones 
\hbox{condro-,}
osteo- o fibrinógenas, y diferenciándose las células para dar tipos de tejido del aparato de unión y del sostén, en especial para dar tejidos condrales y óseos.
23. Implante que comprende una matriz compuesta porosa según una de las reivindicaciones 1-13.
24. Procedimiento para la preparación de un implante según la reivindicación 23, en el que se deposita una matriz compuesta porosa según una de las reivindicaciones 1-13 sobre la superficie del implante.
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