ES2197868T3 - Oligonucleobases pseudociclicas. - Google Patents

Abstract

Oligonucleobase pseudocíclica que comprende un segmento funcional, un segmento protector y un segmento conector, en la que a) el segmento funcional comprende una oligonucleobase de 11-75 nucleobases que tiene un extremo terminal y un extremo conector; b) el segmento protector comprende una oligonucleobase de 5-30 nucleobases que tiene un extremo terminal y un extremo conector y es al mismo tiempo complementario a una secuencia de nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional y de polaridad opuesta a la secuencia de nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional al que es complementario; c) el segmento funcional y el segmento protector están unidos covalentemente entre sí por sus extremos de conexión mediante el segmento conector, en el que el segmento conector es un enlace directo, una mono- u u oligonucleobasede 2-5 nucleobases, o un grupo químico seleccionado a partir del grupo formado por etilenglicol, tri(etilenglicol), tetra(etilenglicol), penta(etilenglicol), hexa(etilenglicol), -NH(CH2)nNH-, en el que n n es 2, 2, 3, 4, 5 ó 4, 5 ó 6, y y combinaciones de los mismos; y d) el segmento protector y el segmento funcional forman una estructura de cadena doble en condiciones seleccionadas;

Description

Oligonucleobases pseudocíclicas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las oligonucleobases, tales como oligonucleótidos, para su utilización general, que poseen un nuevo motivo estructural que permite a la oligonucleobase circularizarse de modo reversible.

Sumario de la técnica relacionada

Los avances en el descubrimiento y desarrollo de oligonucleótidos antisentido como agentes terapéuticos continúan a ritmo rápido (1-3). Para su utilización eficaz, un oligonucleótido debe interaccionar con el ARNm diana por emparejamiento de bases de Watson-Crick, activar la RNasa H para cortar el ARNm, ser estable frente a las nucleasas y ser captado por las células de forma eficaz (4, 5). Los oligodesoxinucleótidos con enlaces fosforotioato (oligonucleótidos PS) poseen todas estas propiedades y se ha estudiado a fondo sus perfiles de actividad biológica (6-10), de seguridad (3,11-15) y de farmacocinética (15-19) in vitro e in vivo. La posible aplicación de los oligonucleótidos PS como agentes terapéuticos está siendo evaluada en la actualidad en varios ensayos clínicos en seres humanos (2). Con objeto de mejorar las posibilidades de los oligonucleótidos PS como agentes antisentido, hemos presentado y evaluado varios oligonucleótidos con cadena principal mixta (MBOs) (20-24). En los MBOs se mantienen las propiedades deseables de los oligonucleótidos PS, mientras que las propiedades no deseables se reducen al mínimo por una combinación de modificaciones en los oligonucleótidos. Los MBOs que contienen 2'-O-alquilrribonucleótidos se han estudiado a fondo y han arrojado resultados prometedores en lo referente a su actividad biológica, estabilidad in vivo y toxicidad general (21, 25-27). Sobre la base de sus ventajas sobre otros oligonucleótidos PS, los MBOs se han convertido en la primera elección de oligonucleótidos antisentido de segunda generación, y se está estudiando en la actualidad su posible utilidad en ensayos clínicos en seres humanos.

Como continuación de nuestros esfuerzos para mejorar las propiedades de los oligonucleótidos PS como agentes terapéuticos, hemos probado cambios estructurales en los oligonucleótidos PS. En nuestros estudios previos describimos oligonucleótidos autoestabilizados, un oligonucleótido PS que contiene una región en horquilla en el extremo 3' que proporcionaba una mayor estabilidad in vivo frente a las nucleasas y una mayor actividad biológica, y, lo que es más importante, una mejora en la toxicidad en comparación con un oligonucleótido PS sin estructura secundaria en el extremo 3' (12, 28-30). Los estudios de seguimiento realizados por otros han obtenido asimismo resultados prometedores (31).

En los últimos años se han aplicado frecuentemente técnicas basadas en la hibridación complementaria entre oligonucleótidos y ácidos nucleicos diana en diagnóstico molecular, desarrollo de terapias y estudios mecanísticos y de biología molecular. Como resultado del análisis del genoma humano estas técnicas se han convertido en habituales y existe cada vez una mayor demanda de métodos de detección y medición de ácidos nucleicos que sean más rápidos, más precisos y más eficaces. Los métodos basados en fluorescencia son más rápidos y sensibles para la detección y medición de la hibridación que los métodos basados en espectroscopía de absorbancia, calorimetría y espectroscopía de resonancia magnética. La ventaja de las técnicas basadas en fluorescencia para el seguimiento de la hibridación complementaria es que pueden utilizarse tanto en aplicaciones en solución como en fase sólida.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza frecuentemente en la investigación en biología molecular y genética, y se está convirtiendo cada vez más en una herramienta esencial para el diagnóstico molecular. En los últimos años se han desarrollado varios métodos de ensayo de fluorescencia homogénea para el análisis de los productos de amplificación en las reacciones de PCR. Entre ellos se incluyen el TaqMan (40,41), faro molecular (42), horquilla-cebador (43) y escorpión (44).

A pesar de los avances realizados por nosotros y por otros grupos, sigue habiendo una demanda para el oligonucleótidos antisentido con propiedades mejoradas para su utilización como agentes terapéuticos y en aplicaciones diagnósticas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una nueva clase estructural de oligonucleobases, que se denominan en la presente memoria ``oligonucleobases pseudocíclicas'' (PCOs) o, de modo equivalente, ciclicones. En las PCOs, dos oligonucleobases están unidas entre sí (directamente o por medio de un segmento conector). Una oligonucleobase, denominada en la presente memoria el ``segmento funcional'', (o, de modo equivalente, el segmento ``cebador'' o segmento ``cebador-sonda'') proporciona funcionalidad a la PCO (por ejemplo, el segmento funcional puede ser un oligonucleótido antisentido), y la segunda, denominada en la presente memoria el ``segmento protector'' (o, de modo equivalente, el ``segmento modificador'') es complementaria al extremo terminal del segmento funcional (Figura 1).

En condiciones seleccionadas, las PCOs adoptan una estructura intramolecular cíclica o pseudocíclica como resultado de la complementariedad entre los segmentos funcionales y protectores, que forman una estructura intramolecular de cadena doble (Figura 1). La formación de la estructura intramolecular de cadena doble protege el segmento funcional, aumentando su estabilidad. Por ejemplo, cuando el segmento funcional es un oligonucleótido antisentido y el segmento funcional y el segmento protector están conectados por medio de un enlace 3'-3', el enlace proporciona mayor estabilidad frente a las nucleasas, para resistir el ataque 3'-exonucleolítico. La estructura de cadena doble formada entre los segmentos antisentido y protector proporciona estabilidad adicional frente a las nucleasas, para resistir el ataque con 5'-exonucleasas.

Estas oligonucleobases de diseño pueden permanecer en forma lineal o en forma hibridada (Figura 1), dependiendo de la temperatura, concentración de sal y longitud del segmento protector. Si la PCO está en forma pseudocíclica intramolecular, puede presentar menos efectos secundarios relacionados con polianiones (por ejemplo, activación del complemento y prolongación del tiempo parcial de tromboplastina) que se sabe que aparecen con oligonucleótidos PS, debido a que hay menos enlaces fosforotioato expuestos.

Pueden prepararse PCOs según la invención utilizando técnicas estándar para la síntesis de las oligonucleobases constituyentes y son útiles para todos los propósitos para los que la oligonucleobase funcional es útil.

Lo anterior sirve meramente de breve resumen de ciertos aspectos de la invención y no pretende ser, ni debe considerarse, limitante de la invención de ninguna manera.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación gráfica de oligonucleobases según la invención, que muestran dos regiones de oligonucleótido pseudocíclico (PCO): un segmento funcional (un oligonucleótido antisentido) y un segmento protector. En forma pseudocíclica, los segmentos antisentido y protector de una PCO se hibridan entre sí. En presencia de un ARN complementario la PCO adopta una forma lineal debido a la mayor estabilidad de la estructura de cadenas dobles heterólogas entre el oligonucleótido antisentido y el ARN diana.

Las Figuras 2A y 2B muestran los perfiles de electroforesis capilar en gel de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº: 2 (Fig. 2A) y de SEC. ID Nº: 3 (Fig. 2B) en presencia de fosfodiesterasa de veneno de serpiente en los tiempos a)

\hbox{0 min}

, b) 5 min y c) 30 min, en ambos paneles.

La Figura 3 muestra el perfil de corte por la RNasa H del ARN marcado con ^{32}P en 5', en presencia de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº Nº^{s}: 1, 6, 8, 10 y 11 en las calles 2-6, respectivamente. La calle 1, marcada como C, representa el testigo en ausencia de oligonucleótido antisentido.

Las Figuras 4A y 4B muestran la inhibición de la proliferación, independiente del anclaje, de células cancerosas GEO (Fig. 4A) y la proliferación, dependiente del anclaje, de células cancerosas MDA-MB-468 por los oligonucleótidos de SEC. ID Nº Nº^{s}: 1, 8, y 6 a 0,2 \muM (barras sin sombreado), 0,5 \muM (barras con sombreado claro) y 1,0 \muM (barras con sombreado oscuro) (Fig. 4B).

La Figura 5 muestra la estabilidad in vivo de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº Nº^{s}: 1, 6 y 8 en plasma, 1 h (calle 2) y 3 h (calle 3) después de su administración a ratones.

Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran la disposición en los tejidos (Figs. 6A y 6B) y la eliminación en la orina (Fig. 6C) del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 tras su administración por vía subcutánea a ratones. En las Figs. 6A y 6B las barras sin sombreado, con sombreado claro y con sombreado oscuro representan la disposición en los tejidos del oligonucleótido a las 3 h, 48 h y 96 h, respectivamente, tras su administración a ratones. Los datos representan la media \pm DT de por lo menos dos ratones.

La Figura 7 muestra la tabla de los oligonucleótidos utilizados en los Ejemplos, incluidas sus estructuras primarias y secundarias y sus T_{m}s en presencia y en ausencia del ARN diana.

La Figura 8 muestra una representación esquemática de la estructura del ciclicón y su hibridación con una cadena complementaria de ácido nucleico diana. La formación de la estructura cíclica sitúa en proximidad inmediata las moléculas del fluoróforo y del desactivador, lo que se traduce en la FRET. Tras la unión del ciclicón a la cadena diana, la estructura cíclica se desestabiliza y se abre, dando lugar a la emisión de fluorescencia.

La Figura 9A muestra las interacciones intra- (A) e intermoleculares (B) de los ciclicones.

La Figura 9B muestra la fluorescencia del oligonucleótido 14 con concentraciones crecientes de la misma secuencia sintetizada sin etiquetas de fluoróforo y desactivador (0), y la misma solución en presencia de una cadena complementaria de oligodesoxinucleótido (\Delta).

La Figura 10A muestra los espectros de fluorescencia del oligonucleótido 12 solo y en presencia de diferentes concentraciones de oligodesoxinucleótido complementario, determinados en un aparato ABI Prism 7700 Sequence Detection System en modo de lectura de placas. La Figura 10B muestra un incremento lineal en la fluorescencia en función de la concentración de la diana.

La Figura 11A presenta un autorradiograma que muestra la extensión de la cadena con ADN-polimerasa en el molde de 40 unidades, utilizando diferentes cebadores que contenían DABCYL (*) en diferentes posiciones de los cebadores. Los números de las calles mostrados en la parte superior del gel corresponden al número de cebador presentado al pie del gel. Las calles denominadas 1 contenían el oligonucleótido 12 y no muestran ninguna extensión. Las etiquetas a y b representan la mezcla de reacción antes y después de la extensión, respectivamente. La Fig. 11B muestra el gráfico correspondiente de amplificación en tiempo real.

La Figura 12 muestra la especificidad de secuencia de los ciclicones; presenta el oligonucleótido 13 (20 nM) en ausencia (barras en blanco) y presencia (barras sombreadas) del ADN diana (50 nM).

La Figura 13 muestra una curva patrón obtenida con el oligonucleótido 14.

La Figura 14 es una representación de la extensión de la cadena por la polimerasa con un ciclicón unido en 5'-5' como cebador-sonda en la RT-PCR. Las líneas gruesas representan la cadena molde de ARN que necesita ser amplificada. Las líneas finas representan cebadores directos e inversos. Las líneas de puntos representan la elongación de la cadena y su dirección.

La Figura 15 muestra gráficos de amplificación en tiempo real, \DeltaRn frente al número de ciclos, para el ARNm de MDM2 extraído de células JAR, utilizando el oligonucleótido 14 como cebador-sonda inverso (curva 1), y cebadores y sonda TaqMan (curva 2). Los gráficos correspondientes a los testigos con tampón y sin molde se sitúan en la línea de base.

La Figura 16 muestra gráficos que presentan el cambio en la pauta de fluorescencia durante la amplificación en cada ciclo con la sonda TaqMan (arriba) y el oligonucleótido 14 (al pie).

La Figura 17 muestra un ejemplo de la estructura química de un ciclicón según la invención, adaptado para su acoplamiento a un soporte sólido.

La Figura 18 muestra tres configuraciones de un ciclicón unido a un soporte sólido (representado por el círculo negro continuo).

Las Figuras 19A y B presentan una comparación esquemática entre la detección convencional de un ácido nucleico en un chip y la detección de ácidos nucleicos utilizando PCOs de la invención en un chip.

La Figura 20 es una representación esquemática de la PCR utilizando una PCO unida a un soporte sólido según la invención.

La Figura 21 es una representación esquemática en la que una PCO de la invención se utiliza en la amplificación, en fase en solución, de un ácido nucleico diana, permitiendo la amplificación y el marcado del ácido nucleico diana en una etapa, con la detección subsiguiente en un chip.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una nueva clase de oligonucleobases, denominadas oligonucleobases pseudocíclicas (``PCOs''), que constan esencialmente de un segmento funcional, un segmento protector y un segmento conector, en las que

a)

el segmento funcional comprende una oligonucleobase de 11-75 nucleobases, que tiene un extremo terminal y un extremo conector;

b)

el segmento protector comprende una oligonucleobase de 5-30 nucleobases, que tiene un extremo terminal y un extremo conector y es al mismo tiempo complementario a una secuencia de nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional y tiene una polaridad opuesta a la secuencia de nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional al que es complementario;

c)

el segmento funcional y el segmento protector están unidos covalentemente entre sí por sus extremos de conexión mediante el segmento conector, en el que el segmento conector es un enlace directo, una mono- u oligonucleobase de 2-5 nucleobases, u otro grupo químico;

d)

el segmento protector y el segmento funcional forman una estructura de cadena doble en condiciones seleccionadas.

Cuando se emplea la PCO de la invención para hibridarla con una nucleobase diana (por ejemplo, y ARNm), el segmento funcional comprende una secuencia de nucleobases complementaria a la nucleobase diana, y la secuencia nucleobásica del segmento funcional comprende 6 o más nucleobases contiguas que son monocatenarias en las condiciones seleccionadas. Por tanto, en dichas realizaciones el segmento funcional es por lo menos 6 nucleobases más largo que el segmento protector. En general, la PCO se construye de modo que el extremo terminal del segmento funcional forme una estructura de cadena doble con el segmento protector, es decir, el segmento protector es complementario al extremo terminal del segmento funcional.

El segmento funcional es una oligonucleobase que realiza una función deseada, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido o un aptámero.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término ``nucleobase'' significa cualquier base heterocíclica que tiene la capacidad de unirse mediante enlaces de hidrógeno con una diana complementaria. En una realización preferida, la nucleobase es una base de purina o pirimidina modificada o sin modificar, sintética o natural, por ejemplo, adenina, guanina, citosina, uridina, timina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 6-azauracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, amino, tiol, tiolalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8,5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidas en 5, y 7-metilguanina. Otras purinas y pirimidinas incluyen las descritas en la patente U.S. nº 3.687.808, las descritas en la Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, J. I, Kroschwitz, Ed. John Wiley & Sons, 1990, en las páginas 858-859, y las descritas por Englisch, et al., Angewandte Chemie, International Edition 1991, 30, 613. Los nucleótidos son nucleobases preferidas.

Una ``oligonucleobase'' es un polímero de nucleobases que puede hibridarse con una diana complementaria mediante, por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick. Las nucleobases de la oligonucleobase pueden conectarse por medio de enlaces internucleobásicos, por ejemplo, enlaces peptidilo (como en el caso de ácidos nucleicos peptídicos (PNAs); Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497 y la patente U. S. nº 5.539.082) y enlaces morfolino (Qin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 11 (2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 187 (1997); Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63 (1997); Taylor et al., J Biol Chem. 271, 17445 (1996); Partridge et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 169 (1996)), o por medio de cualquier otro enlace natural o modificado. Las oligonucleobases pueden ser también ácidos nucleicos cerrados (LNAs). Nielsen et al., J Biomol Struct Dyn 17, 175 (1999); Petersen et al., J Mol Recognit 13, 44 (2000); Nielsen et al., Bioconjug Chem 11, 228 (2000). Los oligonucleótidos son oligonucleobases preferidas.

Además, el documento WO 96 35706 describe oligonucleótidos que tienen una región formadora de estructuras de cadena doble, una región formadora de estructuras de cadena triple y una región conectora, en los que la región formadora de estructuras de cadena doble es complementaria a una región de pirimidina de un ácido nucleico diana y es capaz de formar una estructura de cadena doble con este ácido nucleico diana. La región formadora de estructuras de cadena triple es capaz de hibridarse tanto con la región formadora de estructuras de cadena doble como con la estructura de cadena doble formada entre la región formadora de estructuras de cadena doble y la región de pirimidina del ácido nucleico diana, formando de este modo una estructura de cadena triple. La región formadora de estructuras de cadena doble y la región formadora de estructuras de cadena triple tienen polaridades opuestas y están conectadas entre sí por la región conectora. Estas dos cadenas están unidas con un enlace 3'-3' ó 5'-5', de modo que las cadenas complementarias forman una horquilla doble de cadenas paralelas.

En una realización preferida, las nucleobases están conectadas por medio de una cadena principal de azúcar-fosfato. El grupo azúcar puede ser natural o modificado; preferiblemente el grupo azúcar es un grupo pentosafuranosilo, que puede ser ribosa, ribosa sustituida y 2'-desoxirribosa. Cuando el grupo azúcar es una ribosa, une las nucleobases adyacentes por un enlace 3'-5' (preferiblemente) o un enlace 2'-5'. Los grupos de ribosa sustituida preferidos son ribosa 2'-O-sustituida en la que el sustituyente 2'-O comprende alquilo C_{1-6} saturado o insaturado (preferiblemente metilo), C_{1-6}alcoxiC_{1-6}alquilo (preferiblemente metoxietilo), o un grupo arilo o alilo que tiene 2-6 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede no estar sustituido o puede estar sustituido, por ejemplo, con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o amino; o dicho grupos de ribosa sustituida pueden ser aquellos que portan una sustitución en 2' con un grupo, tal como un grupo amino o halo.

El grupo fosfato es un enlace fosfodiéster modificado o no modificado, incluidos, por ejemplo, enlaces internucleotídicos fosforotioato (preferiblemente), fosforoditioato, C_{1-6}alquilfosfonato, C_{1-6}alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, puente de fosforamidato, puente de metilenfosfonato, puente de fosforotioato, fosfolinol, boranofosfato (Shaw et al., Methods Enzymol. 313, 226 (2000) Rait et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9, 53 (1999); Porter et al., Nucleic Acids Res. 15, 1611 (1997) y sulfona. En ciertas realizaciones preferidas, estos grupos fosfato son enlaces fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato o fosforamidato, o combinaciones de los mismos. Las oligonucleobases según la invención pueden comprender cualquier combinación de nucleobases y enlaces internucleobásicos.

En muchas realizaciones, tiene lugar la formación de una estructura intramolecular de cadena doble entre segmentos de polaridad definida en la forma paralela o antiparalela. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término ``polaridad'' se refiere al concepto de direccionalidad en la estructura primaria (por ejemplo, 3'\rightarrow5' y 5'\rightarrow3' en el caso de ADN y ARN, o N-terminal o C-terminal (o viceversa) en el caso de PNAs). En el caso en el que las PCOs de la invención comprenden oligonucleótidos, por ejemplo, que se hibridan por emparejamiento de bases de Watson-Crick en forma antiparalela, el segmento protector estará en la configuración 3' (ó 2')\rightarrow5' y la secuencia de nucleótidos a la que es complementario en el segmento funcional estará en la configuración 5' a 3' (ó 2'), o viceversa. El cambio en la polaridad de la PCO puede darse en cualquier lugar de la PCO distinto del segmento protector y la secuencia de nucleótidos en el segmento funcional a la que el segmento protector es complementario. En una realización preferida en la que la PCO comprende oligonucleótidos, el segmento funcional está en la configuración 3'\rightarrow5' y el segmento protector está en la configuración 5'\rightarrow3', o viceversa.

La oligonucleobases utilizadas en las PCOs de la invención pueden tener asimismo sustituyentes adicionales, incluidos, sin limitarse a los mismos, grupos lipófilos, agentes de intercalación, biotina, estreptavidina, diaminas y adamantano. Dichos sustituyentes pueden ser deseables, por ejemplo, para aumentar la captación celular. Dichos grupos incluyen, pero sin limitarse a los mismos, grupos lipídicos tales como un grupo colesterol, un grupo colesterilo (Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553), ácido cólico (Manoharan et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4, 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al. (1992) Nucl. Acids Res., 20, 533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o de undecilo (Saison-Behmoaras et al. (1991) EMBO J., 10, 111; Kabanov et al. (1990) FEBS Lett., 259, 327; Svinarchuk et al. (1993) Biochimie, 75, 49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-racglicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H- fosfonato (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651; Shea et al. (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al. (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969), o ácido acético adamantano (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651). Los oligonucleótidos que comprenden grupos lipófilos y los métodos para preparar dichos oligonucleótidos son conocidos en la materia, por ejemplo, las patentes U.S. nº 5.138.045, nº 5.218.105 y nº 5.459.255.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término ``complementario'' se refiere a un par de nucleobases que se unen entre sí mediante enlaces de hidrógeno, con preferencia a otras bases heterocíclicas en condiciones seleccionadas (por ejemplo, fisiológicas). Cuando las nucleobases son purinas y pirimidinas modificadas o no modificadas, naturales o sintéticas, el término ``complementario'' significa complementario en el sentido de Watson y Crick.

En una realización preferida, el segmento funcional y segmento protector son oligonucleótidos que constan de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o combinaciones de los mismos, modificados o no modificados, que tienen enlaces fosfodiéster, enlaces fosforotioato, o combinaciones de los mismos.

Las PCOs adoptan estructuras intramoleculares pseudocíclicas en condiciones seleccionadas (que dependen de la aplicación deseada). Tal como se utilizan en la presente memoria, ``condiciones seleccionadas'', ``condiciones deseadas'' y ``condiciones de interés'' se utilizan de modo intercambiable y se refieren a una o más de las varias condiciones en las que pueden utilizarse las PCOs de la invención. Como se describe con más detalle más adelante, las PCOs de la invención pueden utilizarse como oligonucleótidos antisentido (en cuyo caso las ``condiciones seleccionadas'' pueden ser fisiológicas) así como para ensayos de amplificación catalizada por enzimas (en cuyo caso las ``condiciones seleccionadas'' son las empleadas en la reacción de amplificación, por ejemplo, PCR). El experto en la materia apreciará que las PCOs de la invención pueden necesitar ser construidas de forma diferente para funcionar de modo adecuado en las diferentes condiciones (por ejemplo, concentraciones de sales, etc.). La formación de la estructura intramolecular pseudocíclica se ha demostrado por desnaturalización térmica y por los estudios de estabilidad in vitro e in vivo frente a las nucleasas presentados más adelante. La formación de la estructura intramolecular pseudocíclica aumenta la resistencia a la degradación (nucleolítica o de otra clase).

En el caso en el que la PCO es un oligonucleótido antisentido, adopta una forma lineal en presencia del ARN diana complementario y su unión al ARN diana queda señalada por los estudios de desnaturalización térmica y de corte por la RNasa H. En la forma lineal, el segmento funcional se hibrida (en condiciones filológicas, como mínimo) al ARN diana complementario (si está presente) para formar una estructura de cadena doble. Esta estructura de cadena doble es un sustrato para la RNasa H, y, en presencia de RNasa H y en condiciones adecuadas (por ejemplo, fisiológicas), la cadena de ARN de la estructura de cadena doble será cortada por la RNasa H, impidiendo de este modo la expresión.

Cuando el segmento funcional de la PCO según la invención es un oligonucleótido antisentido, contiene preferiblemente por lo menos 4 desoxirribonucleótidos contiguos con enlaces fosfodiéster o fosforotioato. La secuencia de por lo menos 4 desoxirribonucleótidos contiguos con enlaces fosfodiéster o fosforotioato permite que la estructura de cadena doble formada entre el segmento funcional y un ARN diana complementario sea un sustrato para el corte, por la RNasa H, de un ARN diana.

La única limitación de las nucleobases y los enlaces internucleobásicos es que no eliminan (a) la capacidad del segmento protector para hibridarse y formar una estructura de cadena doble con el segmento funcional de la PCO en las condiciones deseadas, y (b) la capacidad del segmento funcional para llevar a cabo su cometido (por ejemplo, en el caso de un segmento funcional que es un oligonucleótido antisentido, para hibridarse y formar una estructura de cadena doble con un segmento de ARN complementario en condiciones fisiológicas, cuya estructura de cadena doble es un sustrato para la RNasa H). Las nucleobases y enlaces internucleobásicos preferidos son aquellos que aumentan la estabilidad de la PCO frente a las nucleasas y otras formas de degradación química, y/o que aumentan la capacidad del segmento funcional para llevar a cabo su cometido.

En una realización preferida, cuando el segmento funcional es un oligonucleótido antisentido, la PCO según la invención comprenderá uno o más, y preferiblemente de dos a cuatro, nucleótidos sustituidos en 2' (preferiblemente sustituidos en 2'-O, más preferiblemente en 2'-O-metilo o 2'-metiloxietilo), que están preferiblemente en los extremos terminales de los segmentos funcionales/protectores.

En otras realizaciones, el segmento funcional puede ser cualquier motivo de oligonucleobase que realiza o provoca una función o reacción deseada. Así, por ejemplo, el segmento funcional puede ser también una ribozima.

Alternativamente, el segmento funcional puede tener un motivo CpG para provocar la estimulación inmunitaria, como se describe en el documento U. S. 5.856.462.

En otra realización, el segmento funcional puede ser una oligonucleobase que se una a una molécula, tal como un aptámero. (Ellington y Szostak (1990) Nature, 346, 818-822); Famulok y Szostak (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 3990-3991; Ellington y Szostak (1992) Nature 355, 850-852; Tuerk y Gold (1990) Science 249, 505-510; Famulok y Szostak (1992) Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 31, 979-988; Bock et al. (1992) Nature 355, 564-566); Famulok y Szostak (1992) Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 31, 979-988; Gannon et al. (1990) EMBO J. 9, 1595-1602; Steven y Lane (1992) J. Mol. Biol. 255, 577-583). Se sabe que las proteínas interaccionan con motivos de nucleótidos específicos, tanto con ácidos nucleicos y oligonucleótidos monocatenarios como bicatenarios.

O, simplemente, el segmento funcional puede ser una sonda para un ácido nucleico diana y puede tener una secuencia de nucleobases que es complementaria a la diana.

El segmento conector puede ser un enlace directo, una mono u oligonucleobase de 2-5 nucleobases, u otro grupo químico. La única limitación en el segmento conector es que no elimine las funciones esenciales de la PCO, es decir, (a) la capacidad de la PCO para formar una estructura intramolecular pseudocíclica en las condiciones de interés (por ejemplo, condiciones fisiológicas) y (b) la capacidad del segmento funcional para llevar a cabo su cometido. Conectores preferidos pertenecientes a ``otro grupo químico'' incluyen, pero sin limitarse a los mismos, etilenglicol, tri(etilenglicol), tetra(etilenglicol), penta(etilenglicol), hexa(etilenglicol) y -NH(CH_{2})_{n}NH-, en el que n es 2, 3, 4, 5 ó 6. Alternativamente, el segmento conector puede ser una combinación de los anteriores. En una realización preferida, el conector es un enlace directo, en cuyo caso los segmentos funcionales y protectores están directamente enlazados en una configuración 3'-3' ó 5'-5'.

El segmento funcional y el segmento protector pueden unirse independientemente al segmento conector por medio de la nucleobase del extremo terminal del conector a la nucleobase o al enlace internucleobásico (que, en el caso de un nucleótido, puede ser el grupo azúcar o fosfato). Si el segmento conector es una mono u oligonucleobase, puede unirse asimismo a los segmentos funcionales y protectores en su enlace básico o internucleobásico (por ejemplo, grupo azúcar o fosfato).

En una realización preferida, el segmento funcional de la PCO de la invención es un oligonucleótido antisentido para cortar un ARN diana, y

a)

el segmento funcional consta esencialmente de un oligonucleótido de 11 a 50 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia complementaria a un ARN que se va a cortar, en el que 11 a 50 nucleótidos contienen una secuencia de 4 a 50 desoxirribonucleótidos con enlaces fosfodiéster o fosforotioato;

b)

el segmento protector consta esencialmente de un oligonucleótido de 5 a 8 nucleótidos de longitud y es complementario a una secuencia de nucleótidos en el segmento funcional;

c)

las condiciones seleccionadas son condiciones fisiológicas en las que, y en ausencia de ARN, el segmento protector y el segmento funcional forman una estructura de cadena doble; y

d)

en condiciones fisiológicas y en presencia de ARN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria al segmento funcional, el segmento funcional forma una estructura de cadena doble con el ARN complementario.

En otra realización, la estructura de cadena doble formada entre el segmento funcional y el segmento protector puede ser, por sí misma, una unidad funcional. Por ejemplo, la estructura de cadena doble puede ser un diana para la unión de un ácido nucleico endógeno por formación de una estructura de cadena triple. Alternativamente, la estructura de cadena doble puede ser el sustrato de una molécula que se une a la estructura de cadena doble, por ejemplo, un factor de transcripción.

En otro aspecto de la invención, las PCOs de la invención comprenden además una molécula de ``Dador'' y una molécula de ``Aceptor''. Uno o ambos del Dador y Aceptor son capaces de afectar a una propiedad observable del otro por medio de transferencia de energía radiante o no radiante cuando se sitúan en proximidad inmediata. El Dador y el Aceptor están acoplados a la PCO de tal manera que, cuando la PCO está en forma cíclica, una propiedad observable del Dador y/o del Aceptor cambia, respecto a lo que sucede cuando la PCO no está en forma cíclica.

Como ejemplo ilustrativo, en una realización preferida el Dador es un dador de energía de fluorescencia (``FRED'') (por ejemplo, un fluoróforo) y el Aceptor es un aceptor de energía de fluorescencia (``FREA'') (por ejemplo, un desactivador). El FRED y el FREA están acoplados de tal manera que, cuando la oligonucleobase está en forma cíclica (por ejemplo, en ausencia del ácido nucleico diana), el FRED y el FREA se acercan lo suficiente como para permitir que entre el FRED y el FREA tenga lugar la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). El resultado es la observación de un cambio en la fluorescencia (por ejemplo, un cambio en la intensidad (bien sea aumento o disminución) o un cambio en el color). Por ejemplo, cuando el FRED es un fluoróforo y el FREA un desactivador, se observa una disminución en la fluorescencia cuando ambos se sitúan en proximidad inmediata. Cuando el segmento funcional se une a la secuencia complementaria en el ácido nucleico diana, la estructura cíclica del ciclicón se abre y el fluoróforo y el desactivador se separan lo suficiente como para alterar la FRET entre las moléculas del dador y el aceptor, dando lugar a fluorescencia espontánea.

En esta realización, el dador de energía por resonancia de fluorescencia (FRED) (por ejemplo, un fluoróforo como la fluoresceína) se acopla al oligonucleótido modificador (es decir, el segmento protector), preferiblemente al extremo libre (3' ó 5'). El modificador tiene preferiblemente una longitud de 4 a 8 nucleobases y es complementario al extremo 3' ó 5' del cebador-sonda (es decir, el segmento funcional), que tiene a su vez preferiblemente una longitud de 15-20 nucleobases y es complementario a un ácido nucleico diana. Un FREA (por ejemplo, un desactivador de la fluorescencia como DABCYL) se incorpora a la secuencia del cebador-sonda (Fig. 8). Alternativamente, el FRED (por ejemplo, un fluoróforo) puede estar en la secuencia del cebador-sonda y el FREA puede estar en el oligonucleótido modificador. En aún otra realización, tanto el FREA como el FRED pueden estar en el mismo segmento, de modo que cuando el segmento funcional del ciclicón interacciona con una molécula diana, con el consiguiente cambio en la estructura terciaria del ciclicón, el FREA y el FRED se sitúan en proximidad inmediata o se separan de tal modo que se facilita o se impide, respectivamente, la transferencia eficaz de energía entre los dos. En general, los pares Dador/Aceptor (ya sean FRED/FREA u otros) pueden situarse en cualquier lugar y estar unidos de cualquier manera que sea congruente con la capacidad de la PCO para formar una estructura intramolecular de cadena doble en condiciones seleccionadas, la capacidad del segmento funcional para llevar a cabo su cometido y el desarrollo de la capacidad de transferencia de energía detectable (por ejemplo, fluorescencia) tras la apertura de la PCO a partir de su estado cíclico.

En ausencia del ácido nucleico diana, los ciclicones forman estructuras intramoleculares cíclicas; en este estado, el fluoróforo y el desactivador se sitúan en proximidad inmediata (Fig. 8), dando lugar a la pérdida de fluorescencia debido a la FRET. En presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en solución, la secuencia de la sonda se hibrida con la secuencia complementaria en la diana, desestabilizando la estructura intramolecular cíclica y provocando su apertura, dando lugar a la emisión espontánea de fluorescencia. La presencia de fluorescencia indica la hibridación entre el ácido nucleico diana y la secuencia de la sonda del ciclicón (Fig. 8).

Generalmente, los ciclicones con oligonucleótido cebador-sonda/modificador unido en 5'-5' presentan menor fluorescencia de fondo que los ciclicones unidos en 3'- 3'. Esta diferencia podría ser un reflejo de la mayor distancia entre el fluoróforo y el desactivador en los ciclicones unidos en 3'-3', como resultado del sesgo hacia 3' de las dos cadenas de la estructura de cadena doble ADN. Es apropiado no saltarse una base entre el fluoróforo y el desactivador en los ciclicones unidos en 3'-3' para reducir la fluorescencia de fondo. La distancia óptima entre las moléculas de FRED y FREA es aproximadamente 70 a 100 \ring{A} para alterar la FRET y conseguir el máximo de fluorescencia (49, 50). Preferiblemente, se mantiene una distancia de aproximadamente diecinueve puentes fosfato internucleotídicos entre las moléculas del dador y del aceptor. En dicha configuración, cuando el ciclicón se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana, las moléculas de FRED y de FREA se separan aproximadamente 70 \ring{A}, reduciendo eficazmente la FRET entre las moléculas y dando lugar a la emisión espontánea de fluorescencia. Es una práctica habitual para un experto en la materia determinar la situación adecuada de las moléculas de dador y de aceptor en la oligonucleobase para que sea posible la transferencia de energía entre las dos cuando el ciclicón esté en forma circular, sin que sea posible cuando esté en forma lineal, o viceversa.

Los segmentos protectores y funcionales están unidos por medio del segmento conector, bien sea en una configuración 3'-3' ó 5'-5', como lo requiera la aplicación del ciclicón. Por ejemplo, para su utilización en estudios celulares, sería más apropiado un enlace 3'-3' debido a la mayor estabilidad de los oligonucleótidos unidos en 3'-3' frente a las nucleasas en estudios in vitro e in vivo (6), mientras que para un cebador en reacciones de PCR, es más apropiado un ciclicón unido en 5'-5' que contenga un extremo 3' libre.

Los ciclicones que portan pares Dador/Aceptor (por ejemplo, un par FRED/FREA) pueden utilizarse para medir la concentración de ARNm ó ADNc específicos en extractos celulares completos o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) amplificados con enzimas (por ejemplo, PCR), en ambiente homogéneo (fase líquida) o cuando la sonda esté unida a una fase sólida. Los ciclicones según este aspecto de la invención son también útiles como cebadores o cebadores-sondas integrados en reacciones de amplificación catalizadas por enzimas (por ejemplo, PCR en tiempo real) para el control de la amplificación de ácidos nucleicos. Para su utilización como cebador o cebador-sonda en la amplificación catalizada por enzimas, el segmento funcional es complementario a la porción terminal del ácido nucleico que se va a amplificar. Cuando se utiliza como cebador o cebador-sonda en una amplificación catalizada por enzimas, el propio ciclicón puede unirse a la superficie sólida o puede ser un componente de la solución que se pone en contacto con la superficie sólida. Véanse las Figs. 20 y 21.

Los ciclicones según la invención presentan ventajas sobre la sonda TAQMAN® en la que se marca una sonda con un desactivador y fluoróforo en cualquiera de los extremos. La sonda TAQMAN® se corta por la actividad 5'-exonucleasa de la ADN-polimerasa durante la PCR, liberando el fluoróforo libre y aumentando de este modo la señal de fluorescencia. La función de sonda de los ciclicones es independiente de la actividad nucleasa de la polimerasa, y, por tanto, pueden utilizarse con polimerasas que carezcan de la actividad nucleasa. Las nucleasas que carecen de actividad polimerasa son mucho más baratas que las polimerasas que portan una subunidad con actividad nucleasa. La función cebador- sonda integrada de los ciclicones es un importante paso adelante en la detección y diagnostico por PCR sin alterar la longitud total del oligonucleótido (en comparación con la longitud y modificaciones incorporadas en el escorpión) ni los costes. Además, la utilización de un cebador-sonda unificado en la detección por PCR simplifica la puesta a punto de la reacción y evita contaminaciones de arrastre innecesarias.

Varias moléculas de dador/aceptor adecuadas para su utilización como FREDs y FREAs son conocidas en la materia. Los expertos en la materia pueden consultar la descripción del documento U. S. 5.866.336 (la patente 5.866.336) relativa a dichas moléculas. Dichas moléculas pueden unirse a los ciclicones de la invención en el grupo de base de la nucleobase o en un grupo de la cadena principal de la oligonucleobase (por ejemplo, la posición 2' de un residuo de azúcar de un nucleótido). Por ejemplo, Yamana et al., Nucleic Acids Res. 27, 2387 (1999) describe oligonucleótidos modificados con 2'-pireno como sondas de ARN muy sensibles. Asimismo, Barrio et al., Biochem. Biophys Res. Commun. 46, 597 (1972) describen los derivados fluorescentes de adenosina y citidina.

Moléculas que se unen habitualmente en la FRET incluyen fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6-carboxirrodamina (R6G), N,N,N',N'-tetrametil-6 -carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), Cy3, Cy5 y ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS). Que un fluoróforo sea un dador o un aceptor depende de sus espectros de excitación y de emisión, y del fluoróforo con el que está emparejado. Por ejemplo, FAM se excita del modo más eficaz con luz de longitud de onda de 488 nm y emite luz con un espectro de 500 a 650 nm y un máximo de emisión de 525 nm. FAM es un fluoróforo dador adecuado para su utilización con JOE, TAMRA y ROX (todos los cuales tienen su máximo de excitación a 514 nm).

Se han incorporado etiquetas FRET en ensayos inmunofluorescentes utilizados para detectar antígenos específicos (Ullman et al. patentes U.S. nº^{s}. 2.998.943; 3.996.345; 4.160.016; 4.174.384 y 4.199.559). Varias patentes describen la aplicación de la transferencia de energía para la hibridación de polinucleótidos (Patentes U.S. nº^{s}. 4.996.143, 5.532.129 y 5.565.322).

La solicitud de patente europea con el número de publicación EP 0 229 943 A2 describe las distancias específicas entre dador y aceptor para una FRET máxima. También describe cómo pueden se situarse las etiquetas del dador y del aceptor en la misma sonda.

Una aplicación similar de la transferencia de energía fue descrita por Cardullo et al. en un método para detectar la hibridación de ácidos nucleicos (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794 y WO 92/14845). La fluoresceína (dador) y la rodamina (aceptor) se acoplan a los extremos 5' de oligodesoxinucleótidos complementarios.

Otras publicaciones han descrito la utilización de la transferencia de energía en un método para el cálculo de distancias entre sitios específicos de ADN (Ozaki y McLaughlin, 1992, Nucl. Acids Res., 20: 5205-5214), en un método para el análisis de la estructura de un cruce de ADN de cuatro direcciones (Clegg et al. 1992, Biochem., 31: 4846-4856) y en un método para la observación de la geometría helicoidal del ADN (Clegg et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2994-2998).

La patente 5.866.336 describe la utilización de pares de FRED/FREA en análogos sintéticos de estructuras en horquilla presentes en la naturaleza. Los ciclicones de la presente invención son construcciones estructuralmente distintas, que no están presentes en la naturaleza y que comprenden por lo menos dos secuencias terminales (el segmento funcional y el segmento protector) de polaridad opuesta, dando como resultado una molécula que tiene dos extremos 3' o dos extremos 5'. Estos rasgos se traducen en diferentes características fisicoquímicas, y generalmente permiten también que los ciclicones consten de menos nucleobases y que su preparación sea, por tanto, menos costosa.

Como se desprende de lo anterior, todo el segmento funcional, o cualquier porción del mismo, puede conferir a la PCO su funcionalidad. Así, por ejemplo, en el caso de que la funcionalidad de la PCO sea un agente antisentido, todo el segmento funcional, o sólo una porción del mismo puede ser antisentido a la diana. O, en otro ejemplo, en el caso de que la funcionalidad de la PCO sea la unión de una proteína a la estructura de cadena doble (palindrómica o de señuelo) de la PCO, la funcionalidad reside en la secuencia de nucleótidos en el segmento funcional que es complementaria al segmento protector, es decir, la secuencia que participa en la formación de la estructura de cadena doble.

Pueden sintetizarse convenientemente PCOs según la invención en un soporte sólido adecuado utilizando estrategias químicas bien conocidas, incluidas, para el caso de oligonucleótidos, técnicas químicas de H-fosfonato, técnicas químicas de fosforamidito, o una combinación de técnicas químicas de H-fosfonato y técnicas químicas de fosforamidito (es decir, técnicas químicas de H-fosfonato para algunos ciclos y técnicas químicas de fosforamidito para otros ciclos). Los soportes sólidos adecuados incluyen cualquiera de los soportes sólidos estándar utilizados para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, tales como vidrio de poro controlado (CPG). (Véase, por ejemplo, Pon (1993) Methods in Molec. Biol. 20, 465).

Las PCOs según la invención pueden utilizarse para cualquier propósito para el que la oligonucleobase constituyente del segmento funcional pueda utilizarse. Por ejemplo, pueden utilizarse como ``sondas.'' Pueden utilizarse también para elucidar la función biológica y/o fisiológica de un gen diana cuando se emplean para inhibir la actividad del gen en un cultivo de células experimental o en un sistema animal. En tales aplicaciones, las PCOs de la invención se utilizan para llevar a cabo el corte de una molécula de ARNm diana poniendo en contacto la PCO con el ARNm diana en presencia de una RNasa H, que corta el ARN de las estructuras de cadena doble de ARN/ADN. Esto se logra in vitro o in vivo administrando a una célula o a un animal, respectivamente, una PCO según la invención en la que el segmento funcional comprende una oligonucleobase antisentido (preferiblemente un oligonucleótido) complementaria al ARNm diana y observando los efectos. En esta utilización, las PCOs según la invención son preferibles a las estrategias tradicionales de ``desactivación (knockout) de genes'' ya que son más fáciles de usar y pueden utilizarse para inhibir la actividad génica en etapas seleccionadas del desarrollo o diferenciación de tumores.

Cuando el segmento funcional es una oligonucleobase antisentido (preferiblemente un oligonucleótido), las PCOs según la invención son también útiles en estrategias terapéuticas en las que se desea la inhibición de la expresión de genes. Estas estrategias pueden incluir, por ejemplo, la inhibición de un gen endógeno (por ejemplo, un oncogén) o un gen exógeno (por ejemplo, un gen esencial para el crecimiento y/o el metabolismo de un patógeno).

Las PCOs según la invención pueden utilizarse en fase soluble o en fase sólida, por ejemplo, acopladas a un biochip o a perlas magnéticas para el escrutinio de alto rendimiento de ácidos nucleicos y PCR en fase sólida. El acoplamiento puede realizarse en cualquiera de los extremos de la PCO (es decir, el extremo del segmento protector o el extremo del segmento funcional), o en cualquier lugar dentro de los segmentos funcionales, protectores o conectores, y puede realizarse mediante cualesquiera medios convenientes conocidos en la materia. Las PCOs pueden utilizarse en micromatrices de ADN u oligonucleótidos en soportes sólidos (vidrio, membrana, fibra óptica, chips de sílice, etc.) para la caracterización y análisis de la expresión génica, diagnóstico, toxicología, detección de mutaciones genéticas, análisis de polimorfismos de un solo nucleótido, farmacología molecular, etc. Véase, por ejemplo, Case-Green et al., Current Opnion in Chem Biol. 2, 404 (1998). La utilización de las PCOs según la invención para la detección en fase sólida, por ejemplo, ofrece varias ventajas sobre las técnicas convencionales de detección en un chip, como se muestra en la Fig.19. Mientras que el control de calidad de cada mancha fluorescente es difícil y cualitativo con la tecnología convencional de chips, la utilización de las PCOs de la invención permite la cuantificación precisa. La detección convencional en un chip requiere una sonda independiente con una etiqueta de detección, lo que se traduce en un procedimiento de detección en dos etapas: 1) la hibridación inicial con el ácido nucleico diana, y 2) una hibridación secundaria entre el ácido nucleico diana y la sonda de detección. En contraposición, las PCOs permiten la hibridación y detección en una sola etapa.

La Figura 20 muestra un diagrama esquemático en el que una PCO marcada con el par Dador/Aceptor está unida a una superficie sólida, en la que el segmento funcional de la PCO es complementario a un ácido nucleico diana que se va a amplificar por PCR (aunque podrían emplearse otros protocolos de amplificación enzimática). Durante la amplificación, cuando la PCO participa en la hibridación intermolecular, se emite una señal detectable por la molécula del dador (por ejemplo, FRED).

La Figura 21 muestra un diagrama esquemático en el que el segmento funcional de una PCO marcada con un par Dador/Aceptor sirve como cebador-sonda. La amplificación da lugar a un ácido nucleico marcado que puede aplicarse directamente a un chip de micromatrices de ADNc. Este método evita la necesidad de purificar, aislar y marcar el ADNc antes de la hibridación con una micromatriz de genes de ADNc. Además, no es necesario llevar a cabo reacciones independientes para la identificación de ARNs (o expresiones de genes) diferentes. Pueden emplearse para la amplificación diferentes cebadores/sondas biotinilados y diferentes ciclicones para cada ARN específico, y aplicarse la solución resultante directamente a la micromatriz, sin separación, aislamiento o marcado ulteriores para identificar los genes que se expresan. Dado que el primer reconocimiento del ARN procede del cebador/sonda biotinilado y el segundo reconocimiento procede del ciclicón cebador-sonda, la especificidad de la amplificación debería ser muy superior a la de los procedimientos habituales de amplificación, reduciéndose de este modo los positivos falsos.

Otro aspecto de la invención comprende PCOs adaptadas para unirse a una superficie sólida. Tales PCOs comprenden PCOs según la invención que tienen un grupo químico acoplado a las mismas, que facilita la unión de la PCO con el soporte sólido (por ejemplo, vidrio, chips de silicio, perlas magnéticas, membranas (por ejemplo, membranas de nylon), placas de plástico de 96 pocillos, etc.) Dichos grupos químicos incluyen aquellos para enlace covalente con un soporte sólido, tales como conectores C_{1}-C_{12}alquilamino opcionalmente sustituidos con hidroxi-C_{1}-C_{6}alquilo, C_{1}-C_{12}alquilsuccinimidas, tiol, así como aquellos para enlace no covalente, tales como biotina, avidina o estreptavidina (para la unión a un soporte sólido que porte su par conjugado). Dichos grupos químicos pueden acoplarse en cualquier parte de la PCO (siempre y cuando no interfieran con la función básica del segmento funcional o impidan la formación de la estructura intramolecular de cadena doble) utilizando técnicas convencionales. En las realizaciones en las que el segmento funcional está construido para hibridarse con una molécula diana complementaria (por ejemplo un ARNm), un segmento de por lo menos 6 nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional será complementario a la diana y será monocatenario cuando la PCO forme una estructura intramolecular de cadena doble. En dichas realizaciones, las PCOs se hibridan con la secuencia diana en dos etapas. La primera etapa implica la hibridación de la región monocatenaria de la PCO a la secuencia diana. La estabilidad de la estructura intermolecular de cadena doble así formada fuerza a continuación la desestabilización de la estructura intramolecular de cadena doble de la PCO y permite la hibridación completa con la diana. Dado que hay dos etapas de reconocimiento, dichas PCOs son más específicas para detectar el ARN complementario que sus correspondientes formas lineales. La utilización de las PCOs como sondas en solución o en fase sólida (bien sea por los extremos 3' ó 5' o por medio de las bases) serán más específicas que sus correspondientes formas lineales.

Los estudios presentados más adelante demuestran que las PCOs que contienen segmentos funcionales antisentido mantienen la actividad antisentido en cultivos celulares. La ventaja prevista con estas PCOs es que su formación de estructuras pseudocíclicas intramoleculares posibilita una menor interacción con macromoléculas que no son dianas (incluidos ácidos nucleicos y proteínas) y también menos efectos secundarios relacionados con polianiones, y se linealizarán solamente en presencia del ARNm diana.

En otro aspecto, la invención es un kit. En este aspecto, el kit comprenderá por lo menos una PCO de la invención y uno o más reactivos distintos que facilitan la utilización de la PCO. En realizaciones específicas, los kits comprenden una o más PCOs para su utilización en la amplificación de ácidos nucleicos catalizada por enzimas (por ejemplo, PCR, RT-PCR) en uno o más envases y comprenden además componentes adicionales para llevar a cabo las reacciones de amplificación. En el caso en el que la secuencia de ácido nucleico diana que se amplifica sea una que esté implicada en una enfermedad o en un trastorno, los kits pueden utilizarse para el diagnóstico o el pronóstico. En una realización específica, se proporciona un kit que comprende, en uno o más envases, PCOs para su utilización como cebadores directos e inversos para realizar la amplificación y, opcionalmente, una ADN-polimerasa u otra polimerasa (por ejemplo, una polimerasa inversa para su utilización en RT-PCR) con y sin actividad exonucleasa. Un kit para la triamplificación puede comprender además, en uno o más envases, un oligonucleótido bloqueante y, opcionalmente, ADN-ligasa.

Las PCOs en envases pueden estar en cualquier forma, por ejemplo, liofilizada o en solución (por ejemplo, una solución de agua destilada o tamponada), etc. Las PCOs y otros reactivos preparados para su utilización en la misma reacción de amplificación pueden combinarse en un solo envase o pueden estar en envases separados.

En otra realización de este aspecto de la invención, un kit para la detección de una secuencia diana seleccionada en un ADN diana comprende en uno o más envases (a) cebadores para la amplificación catalizada por enzimas, siendo uno de ellos o ambos PCOs marcadas con grupos fluorescentes y desactivadores; y opcionalmente: (b) una secuencia diana de ADN testigo; (c) un tampón optimizado para la amplificación; (d) enzimas apropiadas para el método de amplificación contemplado, por ejemplo, una ADN-polimerasa para PCR o triamplificación o SDA, una transcriptasa inversa para NASBA; (d) un conjunto de instrucciones para llevar a cabo la amplificación, por ejemplo, describiendo las condiciones óptimas, por ejemplo, la temperatura, número de ciclos por amplificación. Opcionalmente, el kit proporciona (e) medios para estimular y detectar las emisiones de luz fluorescente, por ejemplo, un lector de placas de fluorescencia o una combinación de termociclador-placa-lector para realizar el análisis.

Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a efectos ilustrativos y no pretenden ser, ni deben considerarse, limitantes de la invención en modo alguno.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis y análisis de oligonucleótidos

Para estudiar el potencial terapéutico de las PCOs, hemos utilizado un oligonucleótido PS (de 18 unidades) complementario a la subunidad reguladora de la PKA (RI\alpha) (7, 32). Un oligonucleótido antisentido complementario a esta región del ARNm de la PKA RI\alpha se ha estudiado en detalle en modelos in vitro e in vivo (7, 32, 33) y se está evaluando actualmente en ensayos clínicos en seres humanos.

La síntesis de oligonucleótidos se llevó a cabo en una escala de 1-4 moles en un sintetizador de ADN Biosearch 8900 utilizando desoxinucleósido-3'-fosforamiditos (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) para la elongación de la cadena desde el extremo 3' hasta el extremo 5', y desoxinucleósido-5'-fosforamiditos (Glen Research, Sterling, VA) para la elongación de la cadena desde el extremo 5' hasta el extremo 3'. Todos los oligonucleótidos, excepto el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1, se sintetizaron en dos etapas. Primero, los oligonucleótidos (excepto los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3) se sintetizaron desde el extremo 5' hasta el extremo 3' utilizando 3'-dimetoxitritil -desoxinucleósido-CPG (Glen Research, Sterling, VA) y desoxinucleósido-5' -fosforamiditos apropiados utilizando un programa de síntesis de ARN modificado, en el que el tiempo de destritilación y el volumen de la solución de destritilación se doblaron, en comparación con el programa estándar de síntesis de ARN. La segunda parte de los oligonucleótidos (excepto para el caso de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3) se sintetizó desde el extremo 3' hasta el extremo 5', utilizando desoxinucleósido-3'-fosforamiditos y un programa estándar de síntesis de ADN. Los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3 se sintetizaron primero desde el extremo 3' hasta el extremo 5', después desde el extremo 5' hasta el extremo 3' utilizando nucleósidos y nucleósido fosforamiditos apropiados, unidos a soporte de CPG, y un programa de síntesis. El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1 se sintetizó utilizando desoxinucleósido-3' -fosforamiditos y un programa estándar de síntesis de ADN. La oxidación posterior a cada acoplamiento se llevó a cabo utilizando 3H-1,2-benzoditiol-3 -ona-1,1-dióxido, para obtener un enlace fosforotioato, o utilizando reactivo de yoduro, para obtener un enlace fosfodiéster, según lo deseado. La desprotección de todos los oligonucleótidos se completó incubando con solución concentrada de hidróxido de amonio a 65ºC durante toda la noche. Los oligonucleótidos se purificaron utilizando electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida y se desalinizaron utilizando cartuchos C18 Sep-Pak (Waters). El análisis de los oligonucleótidos se llevó a cabo utilizando electroforesis capilar en gel (CGE). La pureza de los oligonucleótidos, sobre la base de la relación A_{260}/masa fue > 98%, y sobre la base de CGE fue 95%, siendo el resto productos n-1, n-2, etc.

Para los presentes estudios, seleccionamos un oligonucleótido PS de 18 unidades (SEC. ID Nº: 1) que es complementario al ARNm de la subunidad reguladora de la proteína-quinasa A (RI\alpha) y que se ha comprobado que es eficaz en la inhibición de la proliferación de varias células cancerosas in vitro y del crecimiento de tumores en modelos de xenoinjerto en ratones, por un mecanismo antisentido específico de la secuencia (7, 32, 33).

PCOs que contenían el segmento funcional de fosfodiéster: En primer lugar, se sintetizaron el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 (Tabla 1), que tiene un oligonucleótido fosfodiéster (oligonucleótido PO) de 18 unidades como segmento funcional y un oligómero de 6 unidades como oligonucleótido PO protector, unidos por sus extremos 5'. Como testigo, se sintetizó el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3 (Tabla 1), en el que el segmento funcional es el mismo que el del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2, pero que contiene dos emparejamientos incorrectos en el oligonucleótido PO protector.

Ejemplo 2 Síntesis de oligonucleótido marcado con ^{35}S

Para el marcado con ^{35}S, se sintetizó el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8, que contenía cuatro enlaces H-fosfonato en el extremo 5' del segmento funcional. Para el producto marcado, la síntesis del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 se llevó a cabo en tres etapas – las etapas primera y segunda se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. En la tercera etapa, los cuatro últimos acoplamientos se llevaron a cabo utilizando técnicas químicas de nucleósido-H-fosfonato y de H-fosfonato. La oxidación de los cuatro últimos enlaces H-fosfonato se llevó a cabo con ^{35}S-azufre elemental (0,5-2,5 Ci/mg, Amersham) como se describió previamente (34). El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 marcado con ^{35}S se purificó utilizando electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida al 20% y se desalinizó utilizando cartuchos C18 Sep-Pak. La actividad específica del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 obtenido fue 0,2 \muCi/\mug.

Ejemplo 3 Experimentos de desnaturalización térmica

Las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos solos y en presencia de ARN complementario se determinaron en un tampón que contenía NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, Na_{2}EDTA 0,1 mM y fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 (23). Cada oligonucleótido se colocó, solo o mezclado con ARN complementario en una relación 1:1, en un tubo Eppendorf y se secó en un concentrador a vacío y se resuspendió en 1 ml de tampón. La concentración final del oligonucleótido en cada muestra fue 1 \muM y la concentración final del ARN complementario fue 1 \muM. Las muestras que contenían el oligonucleótido solo se calentaron a 85ºC durante 2 min y se enfriaron inmediatamente en hielo durante 5 min para permitir la formación de estructuras intramoleculares de cadena doble. Las muestras que contenían el oligonucleótido con el ARN complementario se incubaron a temperatura ambiente (21ºC) durante 1 h. Después se registraron las curvas de absorbancia UV en función de la temperatura en un espectrofotómetro Lambda 20 UV/Vis (Perkin-Elmer) a 260 nm, utilizando un soporte de celdillas múltiples (6 celdillas) con movimiento lineal. La temperatura se controló con un sistema Peltier PTP-6 acoplado al espectrofotómetro. La velocidad de calentamiento fue 0,5ºC/min. Los datos se recogieron en un ordenador Dell conectado al instrumento mediante una interfaz y se procesaron con el software UV-WinLab suministrado con el aparato. Las temperaturas de fusión (T_{m}s) se midieron a partir de la primera derivada de las curvas. Cada valor de T_{m}s era un promedio de por lo menos dos mediciones y la reproducibilidad se situaba en el intervalo de \pm 1,0ºC.

La T_{m}s del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 solo fue 51,9ºC, mientras que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3 solo mostró una transición amplia sin una T_{m}s definida, lo que indica que el segmento funcional se hibrida con el segmento protector complementario de 6 unidades y forma una estructura intramolecular pseudocíclica como se muestra en la Figura 1. Alternativamente, el oligonucleótido de SEC. ID Nº 2 puede formar un complejo de tándem lineal intermolecular en las condiciones experimentales. Sin embargo, dicho complejo lineal intermolecular tendría una T_{m}s menor que la observada para el caso del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 solo. Además, no se observaron bandas de movimiento lento en geles no desnaturalizantes, lo que descarta la posibilidad de formación de estructuras lineales en tándem (datos no mostrados). El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3, que tenía dos emparejamientos incorrectos en el segmento protector, no se hibrida con el segmento funcional y permanece en forma lineal.

En presencia del ARN complementario, los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3 tuvieron T_{m}s de 76,7ºC y 76,8ºC, respectivamente, lo que sugiere que los segmentos funcionales de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3 se hibridaron con el ARN diana y formaron estructuras estables de cadenas dobles heterólogas. Las T_{m}s se registraron mezclando la forma hibridada del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 y el ARN complementario a temperatura ambiente (21ºC) en vez de calentar hasta 85ºC y después enfriar la mezcla para desestabilizar la estructura intramolecular pseudocíclica del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 para favorecer la formación de una estructura de cadena doble con el ARN. Estos resultados sugieren que la estructura intramolecular pseudocíclica del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 se desestabiliza en presencia del ARN complementario y forma una estructura estable de cadena doble heteróloga. La estabilidad térmica de la estructura de cadena doble del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 y del ARN fue mayor que la estabilidad térmica de la estructura intramolecular pseudocíclica del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 (Tabla 1), lo que también favorecería la desestabilización de la estructura pseudocíclica del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2.

Los estudios de desnaturalización térmica demostraron que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 6 solo tuvo una amplia transición, mientras que los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 7-9 solos tuvieron T_{m}s de 48ºC, 50,2ºC y 55,3ºC, respectivamente. Estos resultados sugieren que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 5, en el que el segmento protector tenía sólo una longitud de cinco oligonucleótidos, no formó una estructura pseudocíclica estable con la región 5' del segmento funcional (oligonucleótido PS). La estabilidad de las estructuras pseudocíclicas de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 7-9, en los que la longitud del segmento protector aumentó de seis bases a ocho bases, respectivamente, se incrementó progresivamente. Los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 10 y 11, que contenían emparejamientos incorrectos en el segmento protector, mostraron amplias transiciones de desnaturalización, sin una T_{m}s definitiva. En presencia del ARN complementario, los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6-11 mostraron T_{m}s similares (Tabla 1), lo que sugiere que todos los oligonucleótidos adoptaban la forma lineal en presencia de ARN y formaban estructuras de cadenas dobles heterólogas.

Ejemplo 4 Estabilidad de los oligonucleótidos frente a las nucleasas

Se calentó una unidad de A_{260} de oligonucleótidos hasta 90ºC durante 2 min en un tampón que contenía NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, Tris-HCl 25 mM pH 7,5 y después se enfrió rápidamente hasta 0ºC. Las muestras hibridadas se incubaron con fosfodiesterasa de veneno de serpiente (0,1 \mug Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 5 min ó 30 min. La digestión se paró calentando hasta 90ºC durante 5 min. Los oligonucleótidos digeridos se desalinizaron utilizando cartuchos Sep-Pak C18, antes del análisis por CGE (Modelo 2200, Beckman Instruments).

Para determinar si la forma pseudocíclica del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 le confiere mayor estabilidad frente a las nucleasas que la que se observa con el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3, ambos oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3 se incubaron con fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD). Se tomaron partes alícuotas de las mezclas de incubación a los 0,5 y 30 min y se analizaron por CGE. La Figura 2 muestra cómo el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 fue relativamente más estable que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3: el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 intacto era todavía detectable después de 30 min, mientras que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3 estaba completamente degradado a los 5 min en las mismas condiciones experimentales. Estos resultados sugieren que, a pesar de la presencia de dos extremos 3' en estos oligonucleótidos, sólo el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2 es estable frente a la actividad 3'-exonucleasa de la SVPD debido a la presencia de la estructura intramolecular pseudocíclica.

En la etapa siguiente se sintetizaron y estudiaron los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 4 y 5, en los que los oligonucleótidos PO antisentido y protector estaban unidos por enlaces 3'-3'. Los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 4 y 5 tuvieron T_{m}s similares a las de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 2 y 3, respectivamente (Tabla 1). En los experimentos de estabilidad frente a las nucleasas, con fosfodiesterasa de bazo (una 5'-exonucleasa), el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 4, que existe en forma pseudocíclica, fue estable (como en el caso del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 2); el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 5, que no puede formar una estructura intramolecular pseudocíclica, se digirió completamente (como en el caso del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 3; datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la formación de la estructura intramolecular pseudocíclica proporciona oligonucleótidos antisentido con estabilidad frente a las exonucleasas.

Animados por estos resultados, sintetizamos los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6-9, que constaban de un oligonucleótido PS de 18 unidades como segmento funcional y un oligonucleótido PO como segmento protector, unidos por medio de sus extremos 3' (enlace 3'-3'). La longitud del segmento protector variaba de 5 a 8 unidades (oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6-9, respectivamente) (Tabla 1). Como testigos, se sintetizaron los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 10 y 11, que contenían dos y tres emparejamientos incorrectos, respectivamente, en el segmento protector. Estos testigos se correspondían, en longitud, con los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6 y 9. El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1, un oligonucleótido PS de 18 unidades, sin apéndice de segmento protector, se sintetizó a efectos comparativos.

Ejemplo 5 Experimentos de corte con la RNasa H

El ARN se marcó con ^{32}P en el extremo 5' utilizando polinucleótido-quinasa T4 (Pharmacia) y [\gamma-^{32}P]ATP (Amersham), como se ha descrito previamente (24). Los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 1, 6, 8, 10 y 11 se disolvieron en 10 \mul de tampón (HEPES.KOH 30 mM, pH 8,0, KCI 75 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 1,5 mM, BSA 75 \mug/ml), se calentaron a 85ºC durante 1 min y después se enfriaron en hielo durante 5 min. Se añadieron aproximadamente 50.000 CPM de ARN marcado en el extremo 5' con ^{32}P en 4 \mul de agua al oligonucleótido hibridado en solución tampón (10 \mul), y se incubaron a 37ºC durante 10 min. Se añadió RNasa H (0,65 \mul de solución diluida 1:10; Pharmacia) a la mezcla y se incubó a 37ºC durante 10 min. La reacción se paró por adición de 1 \mul de EDTA 0,5 M y 20 \mul de formamida, y se analizó utilizando electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 20% y autorradiografía.

Los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 5-11 se incubaron con el ARN complementario que se había marcado en el extremo 5' con ^{32}P y RNasa H. La RNasa H se une a la estructura de cadenas dobles heterólogas de ADN-ARN y corta el ARN en el extremo 3' del ARN en la estructura de cadenas dobles heterólogas (24). La pauta de corte del ARN en presencia de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6-11 fue similar a la del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1 (Figura 3), lo que sugiere que estos oligonucleótidos adoptaban una forma lineal en presencia del ARN complementario y que todos los oligonucleótidos formaron estructuras de cadenas dobles heterólogas con el ARN diana; esta estructuras de cadenas dobles heterólogas fueron sustratos para la RNasa H, que es una de las propiedades importantes necesarias para la actividad antisentido.

Ejemplo 6 Estabilidad de los oligonucleótidos in vivo

Los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 1, 6 y 8 se administraron por vía intravenosa a ratones CD-1 (20-25 g) a una dosis de 50 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre de ratones en tubos heparinizados 1 y 3 h después de la administración. El plasma (100 ml) se incubó con proteinasa K (60 \mug, Sigma) en el tampón de extracción (SDS al 0,5%, NaCl 10 mM, Tris-HCI 20 mM, pH 7,6, EDTA 10 mM) durante 2 h a 60ºC. Las muestras se extrajeron dos veces con fenol/cloroformo (1:1, v/v) y se precipitaron con etanol tras la adición de glucógeno (1 \mug). Las muestras se marcaron en el extremo 5' terminal con [\gamma-^{32}P]ATP (Amersham) utilizando polinucleótido-quinasa T4 (10 unidades, New England Biolabs), y después se analizaron utilizando electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 20% y autorradiografía.

Tras haber demostrado que los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6-9 adoptan formas intramoleculares pseudocíclicas en condiciones fisiológicas, adoptan una forma lineal en presencia del ARN complementario, mantienen afinidad por la unión para activar la RNasa H, y tienen actividad biológica, decidimos examinar la estabilidad de estos oligonucleótidos in vivo frente a las nucleasas, comparada con la del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1. Estudiamos la estabilidad comparada in vivo de tres oligonucleótidos, SEC. ID Nº^{s}: 1, 6 y 8. Se administraron estos tres oligonucleótidos por vía intravenosa a ratones, a una dosis de 50 mg/kg. 1 y 3 h después de la administración, se recogió la sangre en tubos heparinizados y se prepararon muestras de plasma. Los oligonucleótidos se extrajeron del plasma utilizando los protocolos descritos anteriormente (35) y se marcaron con ^{32}P utilizando polinucleótido-quinasa. El análisis de los oligonucleótidos marcados por electroforesis en gel de poliacrilamida demostró la presencia de oligonucleótidos intactos, así como productos de degradación de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 1, 6 y 8, en plasma (Figura 5).

El análisis de los resultados de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6 y 8 demostró principalmente la presencia de bandas con movilidad más lenta que la del oligonucleótido de 18 unidades intacto de SEC. ID Nº: 1, mientras que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1 demostró la presencia de productos de degradación, lo que sugiere que el enlace 3'-3' entre el segmento protector y el segmento funcional proporciona mayor estabilidad frente a las nucleasas. La comparación entre los productos de degradación de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6 y 8, que tienen un segmento protector de 5 y 7 unidades, respectivamente, sugiere que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 7 es más estable que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 5. El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 7 forma una estructura intramolecular pseudocíclica más estable que la del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 5 (ver más adelante los datos de T_{m}). Conviene mencionar que la degradación de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº: 6 y SEC. ID Nº: 8 produce un oligonucleótido PS de 18 unidades (oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1) que contiene por lo menos un nucleótido unido por medio de un enlace 3'-3' como producto intermediario, que proporciona mayor estabilidad (véase la Figura 5).

Ejemplo 7 Farmacocinética y disposición en los tejidos

El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 se administró por vía subcutánea a una dosis de 2 mg/kg (una mezcla de oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 no marcado y marcado con ^{35}S) en 100 \mul de solución salina a ratones CD-1 machos (20-24 g; Charles River, Wilmington, MA). A las 3, 48 y 96 h tras la administración, se sacrificaron dos ratones en cada punto temporal por exposición a metofano (Malinkrodt Veterinary, Mundelein) seguido por luxación cervical. Se recogió la sangre en tubos que contenían EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se extrajeron el hígado, riñón, bazo, corazón y pulmones y se secaron con un trozo de gasa, se pesaron y se almacenaron a -20ºC. Para el recuento de ^{35}S, se añadieron 50 \mul de plasma a 1 ml de TS-2 (Research Product International, Mt. Prospect, IL), se agitó y se mezcló con 250 \mul de ácido acético glacial al 10%. La muestra se agitó una vez más hasta hacerla uniforme, después se añadieron 18 ml de líquido de centelleo 3a70B (Research Product International). Se prepararon muestras por triplicado y se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente antes del recuento. Se colocaron trozos de tejidos, por triplicado, que pesaban entre 10-50 mg en viales de centelleo, a los que se añadió 1 ml de tejido solubilizado en TS-2. Los viales se incubaron durante 2-4 h a 50ºC, se mezclaron con 250 \mul de ácido acético glacial al 10% y, tras mezclar, se añadieron 18 ml de líquido de centelleo 3a70B. El vial se agitó nuevamente y se dejó reposar durante toda la noche para reducir la quimioluminiscencia. El nivel de radioactividad se contó utilizando un contador de centelleo Beckman.

Los resultados anteriores demuestran que los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6 y 8 tienen una mayor estabilidad in vivo que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1, y que el aumento en la estabilidad de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 6 y 8 es el resultado de la formación de estructuras intramoleculares pseudocíclicas en condiciones fisiológicas, así como de la protección del extremo 3' por el enlace 3'-3'. Se llevó a cabo un estudio farmacocinético preliminar sobre la disposición, en los tejidos de ratones, del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8. Se administraron 2 mg/kg del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 (una mezcla de oligonucleótido marcado con ^{35}S y no marcado) por vía subcutánea a ratones para averiguar si había diferencias significativas en los perfiles farmacocinéticos y de distribución, en comparación con los oligonucleótidos PS en general. A las 3, 48 y 96 h tras la administración, se sacrificaron los ratones y se extrajo el hígado, riñón, corazón, pulmón y bazo. Los tejidos se homogeneizaron y se cuantificaron los niveles de radioactividad.

La concentración del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8, sobre la base de los niveles de radioactividad en los tejidos, se presenta en las Figuras 6A y B. Estos datos demuestran que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 se distribuyó en los principales tejidos y que el perfil de disposición en los tejidos fue similar a lo que se ha notificado para el caso de otros oligonucleótidos PS (36-39). Sin embargo, se observaron cambios notables en el aclaramiento a partir de los tejidos, en comparación con los oligonucleótidos PS (16, 17, 19, 36). La Figura 6A muestra el porcentaje de la dosis administrada distribuido en hígado, riñón y bazo a las 3, 48 y 96 h. La Figura 6C demuestra que más del 60% de la dosis administrada se eliminó en la orina a los 7 días. El aclaramiento del oligonucleótido a partir de los tejidos fue más rápido que el observado generalmente con oligonucleótidos PS en general (16, 17, 19, 36). Esta observación sugiere que el oligonucleótido de SEC. ID Nº: 8 permanece en forma intramolecular pseudocíclica en estos tejidos, interacciona menos con macromoléculas y, por tanto, se elimina rápidamente a partir de estos tejidos.

Ejemplo 8 Inhibición de la proliferación celular

Tras haber comprobado que estos oligonucleótidos formaban estructuras intramoleculares pseudocíclicas en condiciones fisiológicas y que adoptaban una forma lineal y se unían a la diana en presencia del ARN complementario, llevamos a cabo experimentos adicionales para determinar si las estructuras pseudocíclicas eran captadas por la célula, se unían al ARNm y finalmente ejercían una actividad biológica similar a la del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1, que no posee un apéndice de segmento protector y tampoco forma estructuras intramoleculares. Los estudios se llevaron a cabo utilizando los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 1 y 7-9 para examinar la inhibición de la proliferación de células cancerosas de las líneas celulares MDA-MB 468 (cáncer de mama) y GEO (cáncer de colon), utilizando ensayos dependientes del anclaje e independientes del anclaje. En el sistema de ensayo descrito más adelante, no se requiere la utilización de lípidos para el suministro de los oligonucleótidos. Era deseable evitar la utilización de lípidos debido a que las PCOs presentan estructuras polianiónicas variables y su encapsulación con lípidos puede no ser uniforme.

Cultivo celular. Se obtuvieron células cancerosas MDA-MB-468 de mama humana de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células se mantuvieron habitualmente en una mezcla 1:1 (v/v) de medio de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) y medio de Ham F12 enriquecido con suero de ternero fetal, termoinactivado, al 10%, Hepes 20 mM (pH 7,4), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml) (Flow, Irvine, UK). Las células GEO fueron donadas por el Dr. M. Brattain (Baylor College of Medicine, Houston, TX). Las células GEO se mantuvieron en medio de McCoy, enriquecido con suero bovino fetal, termoinactivado, al 10%, Hepes 20 mM (pH 7,4), penicilina (100 U/ml), y estreptomicina (100 \mug/ml) en una atmósfera humedecida compuesta de 95% de aire y 5% de CO_{2} a 37ºC.

Ensayo de proliferación dependiente del anclaje. Se sembraron células MDA-MB-468 (10^{4} células/pocillo) en placas de cultivo de 48 pocillos (Becton Dickinson, Milán, Italia) y se trataron cada 24 h con las concentraciones indicadas de los oligonucleótidos. Tras 5 días en cultivo, las células se tripsinizaron y se contaron con un hemocitómetro.

Ensayo clonogénico. Se sembraron células GEO (5 X 10^{3} células/pocillo) en Bactoagar Difco (Difco, Detroit, MI) al 0,3%, enriquecido con medio de cultivo completo. Esta suspensión se extendió sobre una capa base de 0,5 ml de medio-agar al 0,8% en placas de cultivo de 24 pocillos (Becton Dickinson, Milán, Italia). Tras 12 días, se tiñeron las colonias con nitroazul de tetrazolio y se contaron las colonias mayores de 50 \mum con un contador de colonias Artek 880 (Artek Systems, Farmingdale, NY).

El oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1 se ha estudiado a fondo en diversas líneas celulares cancerosas y se ha demostrado que inhibe la proliferación celular por un mecanismo antisentido (7, 32, 33). Los resultados del porcentaje de inhibición de la proliferación utilizando estos oligonucleótidos se resumen en la Figura 4. Todos los oligonucleótidos mostraron una actividad similar de inhibición de la proliferación dependiente de la dosis. Estos resultados confirman que los oligonucleótidos de SEC. ID Nº^{s}: 7-9, que tienen la misma secuencia antisentido que la del oligonucleótido de SEC. ID Nº: 1, tuvieron una actividad similar de inhibición de la proliferación celular, y que la porción del segmento protector de los oligonucleótidos de SEC. ID Nº Nº^{s}: 7-9 no interfería con su actividad biológica. Los estudios futuros se centrarán en la exploración de actividades no dependientes de la secuencia, si las hay, de la porción del segmento protector con testigos apropiados.

Ejemplo 9 Ciclicones marcados con fluoróforos Diseño y síntesis de ciclicones

Los ciclicones se diseñaron para contener un largo oligonucleótido cebador-sonda y un corto oligonucleótido modificador unidos por medio de un enlace 3'-3' ó 5'-5'. El cebador-sonda estudiado en la presente memoria tenía una secuencia de veinte nucleótidos de longitud que era complementaria a una porción del ARNm de MDM2 humano. El oligonucleótido modificador era complementario a seis a ocho nucleótidos del extremo 3' o del extremo 5' de la secuencia del cebador-sonda. Si el oligonucleótido modificador era complementario al extremo 5' del cebador/sonda, los dos oligonucleótidos estaban unidos por medio de un enlace 3'-3'. Si el oligonucleótido modificador era complementario al extremo 3' del cebador-sonda, los dos oligonucleótidos estaban unidos por medio de un enlace 5'-5'.

Diseño de la sonda fluorescente del ciclicón

Para detectar la hibridación entre la secuencia de sonda del ciclicón y el ácido nucleico diana, se acopló un fluoróforo (fluoresceína) o un dador de energía por resonancia de fluorescencia (FRED) al extremo libre (3' ó 5') del oligonucleótido modificador. Se incorporó un desactivador de fluorescencia (DABCYL) o aceptor de energía por resonancia de fluorescencia (FREA) en una base de timina (en la posición 5) en la secuencia del cebador-sonda (Fig. 8). En ausencia del ácido nucleico diana, los ciclicones forman estructuras intramoleculares cíclicas; en este estado, el fluoróforo y el desactivador se sitúan en proximidad inmediata (Fig. 8), dando como resultado la pérdida de fluorescencia debida a FRET. En presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en solución, la secuencia de la sonda se hibrida con la secuencia complementaria en la diana, desestabilizando la estructura intramolecular cíclica y provocando su apertura, dando lugar a la emisión espontánea de fluorescencia. La presencia de fluorescencia indica la hibridación entre el ácido nucleico diana y la secuencia de la sonda del ciclicón (Fig. 8).

Síntesis

Se sintetizaron los ciclicones con enlaces 3'-3' y 5'-5' en una escala de 1 a 2 \mumol en un sintetizador de ADN Biosearch 8900 como se ha descrito previamente (45-47), utilizando 3'- y 5'-fosforamiditos, según lo necesario. Los 5'-fosforamiditos, 6-FAM fosforamidito, 6-FAM-CPG, DABCYL-T fosforamidito y DABCYL-CPG se obtuvieron de Glen Research Corporation. Los desoxinucleósido-3'-fosforamiditos se obtuvieron de Perkin-Elmer. Tras la síntesis, los oligonucleótidos se desprotegieron con hidróxido de amonio concentrado y se purificaron en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. Tras la escisión y extracción, a partir de los geles, de la banda apropiada de oligonucleótido de longitud completa, se desalinizaron utilizando cartuchos C_{18} Sep-Pack, de Waters. Los oligonucleótidos se secaron en un aparato Speed-Vac en vacío y las concentraciones se determinaron midiendo la absorbancia a 260 nm. Las secuencias de oligonucleótidos sintetizados y utilizados en los siguientes Ejemplos son:

Oligonucleótido 12 (SEC. ID Nº: 12)

5'-TGACACCT (Q) GTTCTCACTCAC-3'-3'-ACTGTG-F; (+364 a +383)

Oligonucleótido 13 (SEC. ID Nº: 13)

5'-TGACACCTGT (Q) TCTCACTCAC-3'-3'-ACTGTGGA-F;

Oligonucleótido 14 (SEC. ID Nº: 14)

3'-CACTCACT (Q) CTTGTCCACAGT-5'-5'-GTGAGT-F;

Oligonucleótido 15 (SEC. ID Nº: 1)

5 3'-CACTCACTCT (Q) TGTCCACAGT-5'-5'-GTGAGTGA-F

todos los cuales son ciclicones (Q y F representan el desactivador DABCYL y el fluoróforo fluoresceína);

Oligonucleótido 16 (SEC. ID Nº: 16)

ADN diana: 5'-ATCTGTGAGTGAGAACAGGTGTCACCTT-3'

Mediciones de la fluorescencia

Las mediciones de la fluorescencia se llevaron a cabo en un aparato ABI Prism 7700 de Perkin-Elmer, en modo de lectura de placas en una placa de 96 pocillos. Cada muestra tenía un volumen de 50 \mul. Todas las reacciones se llevaron a cabo en Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1 mM.

Extensión de la cadena con ADN-polimerasa

El molde de 40 unidades (SEC. ID. Nº.: 17 3'-TTCCACTGTGGACAAGAGTGAGT GTCTACATGGACCCAGG-5') (0,15 unidades de A_{260}) se mezcló con cebadores marcados con ^{32}P en el extremo 5' (0,08 unidades de A_{260}) en

\hbox{16  \mu l}

de KCI 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0. Las muestras se calentaron hasta 95ºC durante

\hbox{5
min}

y se enfriaron hasta la temperatura ambiente durante 15 min antes de la liofilización. Después se incubaron en un volumen final de 30 \mul los moldes/cebadores hibridados durante 3 h a 37ºC con 5 unidades de ADN-polimerasa Taq (Amersham Pharmacia), dNTPs 200 \muM (Perkin-Elmer), KCI 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0. Los productos de la extensión se fraccionaron en PAGE desnaturalizante al 15% y se visualizaron por autorradiografía. RT-PCR

El ARNm de MDM2 se extrajo a partir de células JAR como se ha descrito (45) y se utilizó en las reacciones de PCR. Todos los reactivos para PCR se adquirieron de PE-BioSystems, CA. Los cebadores y sondas TaqMan utilizados son 3'-GACTAACTGATGATGGTTCAAGGACA-5' (SEC. ID. Nº:13; cebador directo; +311 a +366), 3'-CACTCTTGTCCACAGTGGAACT-5' (SEC. ID. Nº: 14; cebador inverso; +368 a +389), 3'-TAMRA-TCCTTAGTAGCCTGAGTCCATGTAGACAC-6-FAM-5' (SEC. ID. Nº: 15; sonda; +338 a +389) y 3'-CATGTTCTCGAAGTCCTTCTC-5' (SEC. ID. Nº: 16; cebador inverso-2; +415 a +435). Típicamente, cada reacción se llevó a cabo en un volumen final de 200 \mul que contenía 1 X tampón TaqMan EZ, manganeso 3 mM, 300 \muM de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, 600 \muM de dUTP, 200 nM de cada uno de los cebadores directos e inversos, 100 nM de la sonda TaqMan, 0,1 U/\mul de ADN-polimerasa rTth, 0,01 U/\mul de AmpErase UNG y 1 a 50 ng del ARN molde. En las reacciones en las que la sonda TaqMan y el cebador inverso se sustituyen con el ciclicón unido en 5'-5', la concentración final de ciclicón fue 300 nM. Todas las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo por triplicado (50 \mul de cada una). La amplificación se realizó en un aparato ABI Prism 7700 Sequence Detection System, de Perkin-Elmer. Los parámetros del ciclo térmico fueron - un período inicial de 2 min a 50ºC y un período de 30 min a 60ºC, un período de desactivación de 5 min a 95ºC, seguido por 38 a 40 ciclos de una etapa de desnaturalización de 20 s a 94ºC y una etapa de hibridación /extensión a 60ºC.

Estructura de los ciclicones

La formación de estructuras intramoleculares cíclicas por los ciclicones se examinó incubando una pequeña cantidad (\sim20 nM) de ciclicón fluorescente con concentraciones crecientes (hasta una relación de 1:1000) del mismo ciclicón sintetizado sin etiquetas fluorescentes y de desactivador, y midiendo la fluorescencia. En el caso de que los ciclicones formaran estructuras intermoleculares lineales o cíclicas, debería aparecer una señal de fluorescencia como resultado del exceso de ciclicón no fluorescente en solución (Fig. 9). Acoplamos el desactivador en la posición 5 de timina en el presente estudio; estas moléculas pueden acoplarse también en otras posiciones, incluidas la posición 2' de un grupo azúcar (48). La Figura 9 muestra que el aumento en la fluorescencia como resultado de las concentraciones crecientes de ciclicón no fluorescente es mínima. Cuando se añadió un gran exceso del ADN diana sobre ciclicón no fluorescente en la misma solución, sin embargo, se detectó la fluorescencia completa (Fig. 9B). Estos resultados sugieren que los ciclicones existen en forma de estructura intramolecular cíclica en ausencia de la secuencia diana. Además, los estudios de desnaturalización térmica con UV, dependiente de la concentración, de los ciclicones solos presentaron T_{m}s en el intervalo de \pm 1,0ºC, lo que sugiere la formación de estructura intramolecular cíclica en ausencia de la secuencia diana (datos no mostrados).

Enlaces 3'-3' frente a 5'-5' en los ciclicones

El desactivador se incorpora en la secuencia de la sonda de tal modo que cuando se forma la estructura cíclica, el fluoróforo se aproxima al FREA y la fluorescencia se desactiva completamente. El examen de la fluorescencia de los oligonucleótidos 12-15 solos demostró que los oligonucleótidos 12 y 13 unidos en 3'-3' tenían una mayor fluorescencia de fondo que los oligonucleótidos 14 y 15 unidos en 5'-5'. Esta diferencia podría reflejar una mayor distancia entre el fluoróforo y el desactivador en los ciclicones unidos en 3'-3' como resultado del sesgo hacia 3' de las dos cadenas del ADN de cadena doble. Sería apropiado no saltarse una base entre el fluoróforo y el desactivador en los ciclicones unidos en 3'-3' para reducir la fluorescencia de fondo. La distancia óptima entre las moléculas de FRED y FREA sería aproximadamente 70 a 100 \ring{A} para alterar la FRET y alcanzar la fluorescencia completa (49, 50). Se mantuvo una distancia de aproximadamente diecinueve puentes fosfato internucleotídicos entre las moléculas del dador y el aceptor. Cuando el ciclicón se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana, las moléculas de FRED y FREA se apartan aproximadamente 70 \ring{A}, reduciendo eficazmente la FRET entre las moléculas y dando lugar a la emisión espontánea de fluorescencia. El enlace entre la sonda y los oligonucleótidos cortos puede ser 3'-3' ó 5'-5', según lo requiera la aplicación del ciclicón. Por ejemplo, para su utilización en estudios celulares, un enlace 3'-3' sería más apropiado, debido a la mayor estabilidad de los oligonucleótidos unidos en 3'-3' frente a las nucleasas en estudios in vitro e in vivo (45), mientras que para un cebador en reacciones de PCR, es más apropiado un ciclicón unido en 5'-5' que contenga un extremo 3' libre.

Especificidad de la hibridación de los ciclicones con el ácido nucleico diana

Para determinar la especificidad de los ciclicones, se preparó una mezcla sintética que contenía una a ocho diferentes secuencias de oligonucleótidos (de 20 a 24 unidades) y se mezcló con los ciclicones en ausencia y en presencia de ADN diana perfectamente complementario. El oligonucleótido 2 (20 nM) en ausencia (barras en blanco en la Fig. 12) y en presencia (barras sombreadas en la Fig. 12) del ADN diana (50 nM). En la muestra 1 no se añadieron otros oligonucleótidos no específicos. En la muestra 2 se añadió una secuencia de oligonucleótidos aleatorios de 20 unidades (1 \muM). En la muestra 3, se añadieron dos oligonucleótidos de 20 unidades (1 \muM) que no eran complementarios al ciclicón. En la muestra 4, se añadieron cuatro oligonucleótidos de 20 unidades (2 \muM) que no eran complementarios al ciclicón. En la muestra 5 se añadieron ocho oligonucleótidos de 20 unidades (2 \muM) que no eran complementarios al ciclicón. La Figura 12 demuestra que en ausencia de un ADN diana complementario, los ciclicones no presentaron fluorescencia, o presentaron muy poca. Cuando se añadió la cadena de ADN diana perfectamente complementaria a la misma solución, se detectó fluorescencia, lo que sugiere que la estructura intramolecular cíclica del ciclicón se abría en presencia del ácido nucleico diana pero no en presencia de secuencias de ácidos nucleicos que no eran dianas.

Efecto de la presencia y posición del DABCYL en la extensión del cebador

Para determinar si la presencia de desactivador en una timina del cebador podría interferir con la extensión por la polimerasa Taq, hemos sintetizado cuatro oligodesoxinucleótidos de 20 unidades con DABCYL-timina en las posiciones nucleotídicas 2, 3, 5 y 7 a partir del extremo 3', y hemos comparado la extensión de la cadena del cebador con la de un cebador sin DABCYL. La Figura 11 muestra los productos de extensión de la polimerasa Taq en presencia de cada cebador. Estos resultados demuestran que todos los cinco oligonucleótidos sirvieron como cebadores, lo que sugiere que la presencia de DABCYL en el cebador no interfería con la actividad de extensión de la cadena por la polimerasa. Esto permite flexibilidad en la incorporación del desactivador en la secuencia en los sitios apropiados.

Detección y cuantificación del ácido nucleico diana con ciclicones

Hicimos un control de la hibridación del ciclicón con el ácido nucleico diana y medimos el aumento en la fluorescencia en función de la concentración de ácido nucleico diana. La Figura 10 muestra los espectros de fluorescencia del oligonucleótido 12 en ausencia y en presencia de la cadena de ADN del ácido nucleico diana, determinados por un aparato ABI Prism 7700 Sequence Detector en modo de lectura de placas. La fluorescencia de fondo en ausencia de la diana fue el resultado de una mayor distancia entre el fluoróforo y el desactivador en los ciclicones unidos en 3'-3'. La adición de la cadena de ADN diana a la solución aumentó la fluorescencia, como resultado de la hibridación de la secuencia sonda del ciclicón con la cadena del ácido nucleico diana y la apertura de la estructura intramolecular cíclica (Fig. 10). El aumento lineal en la fluorescencia al aumentar la concentración de la diana (Fig. 10B) sugiere que el método puede utilizarse para la detección cuantitativa de la secuencia del ácido nucleico diana en solución.

Para verificar si se emitía la fluorescencia completa tras la hibridación del ciclicón con el ácido nucleico diana, se trataron ciclicones solos y en presencia del ADN diana con DNasa I y se midió la fluorescencia (datos no mostrados). Las lecturas de fluorescencia se encontraban dentro del \pm10% de las observadas sin tratamiento con DNasa I en presencia del ácido nucleico diana, lo que sugiere que se emitía la fluorescencia completa tras la hibridación del ciclicón con el ácido nucleico diana del estudio.

Para examinar adicionalmente la aplicabilidad del cebador-sonda del ciclicón para la determinación de los niveles de ARNm en muestras desconocidas, por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, hemos construido una curva patrón con cantidades conocidas de ARNm de MDM2 extraído de células JAR (Fig. 13) utilizando el oligonucleótido 14 como cebador-sonda inverso. La curva patrón mostrada en la Fig. 13 sugiere que el método podría ser aplicable a la medición precisa de ARNm de MDM2 en muestras desconocidas.

Los ciclicones como cebadores-sondas unimoleculares en la amplificación por PCR en tiempo real

El ciclicón unido en 5'-5' puede utilizarse como cebador-sonda unimolecular para el seguimiento de la RT-PCR en tiempo real (Figura 14). Realizamos la RT-PCR del ARNm de MDM2 extraído de células JAR como se ha descrito anteriormente. Comparamos los resultados de la amplificación obtenidos con cebadores y sonda TaqMan con los correspondientes al cebador-sonda del ciclicón. En estos experimentos, el cebador directo fue el mismo tanto en ambas reacciones y el cebador y sonda TaqMan inversos bimoleculares se sustituyeron con un cebador-sonda unimolecular del ciclicón unido en 5'-5'.

El ciclicón unido en 5'-5' tenía dos extremos 3'. Sólo el segmento de oligonucleótido del cebador-sonda era complementario al ARN de MDM2 y este extremo 3' se extendió al ser reconocido y se hibridó con el ARN en la primera ronda de la RT-PCR. El extremo 3' del oligonucleótido modificador no fue extendible, debido a que el oligonucleótido modificador no se unía al ARN, y su extremo 3' estaba bloqueado por el grupo de fluoresceína.

Los resultados de la amplificación del ARN de MDM2 por RT-PCR con cebadores y sonda TaqMan y ciclicón se muestran en la Figura 15. Estos gráficos sugieren que el ciclicón unido en 5'-5' sirvió como cebador-sonda unimolecular eficaz. Con el objeto de examinar el producto de amplificación, marcamos el extremo 5' de cada producto de las reacciones de PCR con ^{32}P y lo analizamos por PAGE desnaturalizante. Los resultados demostraron la presencia del producto de amplificación de longitud esperada, en el que el ciclicón se utilizó como cebador sonda, como en el caso del cebador TaqMan (datos no mostrados).

Mecanismos de señalización

Para examinar los mecanismos de la señalización de fluorescencia por el ciclicón durante los ciclos de PCR, hicimos una representación gráfica de la señal de fluorescencia para los ciclos 14 a 40 de la PCR tanto para la sonda TaqMan como para el ciclicón (Figura 16). Como se esperaba, los mecanismos de la señalización fueron diferentes para ambas sondas y presentaron diferentes características. Como se aprecia en la Figura 9A, la sonda TaqMan registró un aumento en la señal de fluorescencia con la amplificación y nunca presentó un descenso en la señal de fluorescencia como se esperaba. En contraposición, el ciclicón presentó un aumento en la señal de fluorescencia con la amplificación y una menor señal de fluorescencia durante el período a 60ºC.

Referencias adicionales

1.

Agrawal (1996) Trends Biotech., 14, 376-387.

2.

Ciba Foundation Symposium. (1997) Oligonucleotides as Therapeutic Agents; John Wiley, Nueva York.

3.

Agrawal y Zhao (1998) Cur. Opn. Chem. Biol., 2, 519-528.

4.

Agrawal. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press, New Jersey.

5.

Crooke. (1998) Antisense Research and Application, Springer, Nueva York.

6.

Chen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 195-200.

7.

Cho-Chung et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7, 217-223.

8.

Akhtar. y Agrawal (1997) Trends Pharmaceutical Sci., 18, 12-18.

9.

Bennett (1998) Biochem. Pharmacol., 55, 9-19.

10.

Dean y McKay (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 11762-11766.

11.

Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7, 495-502.

12.

Agrawal et al. (1997) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 7, 575-584.

13.

Schechter y Martin, R. R. (1998) En Crooke, S. T. (ed), Antisense Research and Applications. Springer, Nueva York, págs. 233-241.

14.

Henry et al. (1997) Anti-Cancer Drug Des., 12, 395-408.

15.

Srinivasan y Iversen (1995) J. Clin. Lab. Anal., 9, 129-137.

16.

Agrawal et al. (1995) Clin. Pharmacokin., 28, 7-16.

17.

Grindel et al. (1998) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 8, 43-52.

18.

Zhang et al. (1995) Clin. Pharm. Expt. Ther., 58, 44-53.

19.

Nicklin et al. (1998) En Crooke, S. T. (ed), Antisense Research and Applications. Springer, Nueva York, págs. 141-168.

20.

Metelev et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett., 4, 2929-2934.

21.

Agrawal et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2620-2625.

22.

Kandimalla et al. (1995) Nucleosides and Nucleotides, 14, 1031-1035.

23.

Kandimalla et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 370-378.

24.

Shen et al. (1998) Bioorg. Med. Chem., 6, 1695-1705.

25.

Agrawal y Zhao (1998) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 8, 135-139.

26.

Altman et al. (1996) Chimia, 50, 168-.

27.

Nicklin et al. (1997) Nucleosides and Nucleotides, 16, 1145-1153.

28.

Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res., 21, 2729-2735.

29.

Agrawal et al. (1995) En Akhtar, S. (ed), Delivery Stratagies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics. CRC Press, Boca Raton, FL, págs 105-121.

30.

Zhang et al. (1995) Clin. Chem., 41, 836-843.

31.

Abe et al. (1998) FEBS Lett., 425, 91-96.

32.

Srivastava et al. (1998) Breast Cancer Res. Treat., 49, 97-107.

33.

Nesterova y Cho-Chung (1995) Nature Med., 1, 528-533.

34.

Agrawal y Iyer (1997) En Schlingensiepen, R. y Schlingensiepen, W. B. K.-H. (eds), Antisense - From Technology to Therapy, Blackwell Sciences, Berlín, Alemania, págs. 59-77.

35.

Temsamani et al. (1997) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 7, 159-165.

36.

Agrawal et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595-7599.

37.

Zhang et al. (1995) Biochem. Pharmacol., 49, 929-939.

38.

Sands et al. (1994) Mol. Pharmacol., 45, 932-943.

39.

Orr et al. (1997) Nucleosides and Nucleotides, 16, 1699-1702.

40.

Holland et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7276-7280.

41.

Lie et al. (1998) J. Cur. Opn. Biotech., 9, 43-48.

42.

Tyagi et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 303-308.

43.

Nazarenko et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 2516-2521.

44.

Whitcombe et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17, 804-807.

45.

Jiang et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. 7, 2727-2735,

46.

Kandimalla et al. (1995) J. Am. Chem. Soc., 117, 6416-6417,

47.

Kandimalla et al. (1996) Biochemistry, 35, 15332-15339.

48.

Yamana et al. (1995) Tetrahedron Lett., 36, 8427-8430.

49.

Cardullo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794.

50.

Selvin et al. (1995) Enzymology, 246, 300-334.

Claims (33)

1. Oligonucleobase pseudocíclica que comprende un segmento funcional, un segmento protector y un segmento conector, en la que

a)

el segmento funcional comprende una oligonucleobase de 11-75 nucleobases que tiene un extremo terminal y un extremo conector;

b)

el segmento protector comprende una oligonucleobase de 5-30 nucleobases que tiene un extremo terminal y un extremo conector y es al mismo tiempo complementario a una secuencia de nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional y de polaridad opuesta a la secuencia de nucleobases en el extremo terminal del segmento funcional al que es complementario;

c)

el segmento funcional y el segmento protector están unidos covalentemente entre sí por sus extremos de conexión mediante el segmento conector, en el que el segmento conector es un enlace directo, una mono- u oligonucleobase de 2-5 nucleobases, o un grupo químico seleccionado a partir del grupo formado por etilenglicol, tri(etilenglicol), tetra(etilenglicol), penta(etilenglicol), hexa(etilenglicol), -NH(CH_{2})_{n}NH-, en el que n es 2, 3, 4, 5 ó 6, y combinaciones de los mismos; y

d)

el segmento protector y el segmento funcional forman una estructura de cadena doble en condiciones seleccionadas;

2. Oligonucleobase según la reivindicación 1, en la que el segmento funcional tiene por lo menos seis nucleobases más que el segmento protector, el segmento funcional es complementario a una oligonucleobase diana, y una región de por lo menos 6 nucleobases contiguas del segmento funcional es monocatenaria en condiciones seleccionadas.

3. Oligonucleobase según la reivindicación 2, en la que el segmento funcional y el segmento protector son oligonucleótidos y el segmento conector es un enlace directo, un mono- u oligonucleótido de 2 a 5 nucleótidos, o un grupo químico seleccionado a partir del grupo formado por etilenglicol, tri(etilenglicol), tetra(etilenglicol), penta(etilenglicol), hexa(etilenglicol), -NH(CH_{2})_{n}NH-, en el que n es 2, 3, 4, 5 ó 6, y combinaciones de los mismos.

4. Oligonucleobase según la reivindicación 3, en la que el segmento funcional comprende una secuencia de al menos cuatro desoxirribonucleótidos contiguos con enlaces fosfodiéster y/o fosforotioato.

5. Oligonucleobase según la reivindicación 4, que comprende además uno o más nucleótidos sustituidos en 2'.

6. Oligonucleobase según la reivindicación 5, en la que por lo menos los dos nucleótidos terminales del segmento funcional y/o del segmento protector son nucleótidos sustituidos en 2'.

7. Oligonucleobase según la reivindicación 5, en la que los nucleótidos sustituidos en 2' son 2'-O-metil o 2'-O metoxietil nucleótidos.

8. Oligonucleobase según la reivindicación 3, que comprende además uno o más nucleótidos con un enlace internucleotídico modificado seleccionado a partir del grupo formado por enlaces internucleotídicos fosforotioato, fosforoditioato, C_{1}-C_{6} alquilfosfonato, C_{1}-C_{6}-alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, puente de fosforamidato, puente de metilenfosfonato, puente de fosforotioato, fosfolinol, boranofosfato, morfolino y sulfona.

9. Oligonucleobase según la reivindicación 1, en la que la oligonucleobase es una PNA o una LNA.

10. Oligonucleobase según la reivindicación 1, que tiene acoplado un grupo químico seleccionado a partir del grupo formado por grupos lipófilos, agentes de intercalación, biotina, estreptavidina, diaminas, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y adamantano.

11. Oligonucleobase según la reivindicación 1, que tiene acoplada una molécula de Dador y de Aceptor, en la que hay una diferencia observable en una propiedad fisicoquímica de la molécula del Dador y/o del Aceptor entre un estado de la oligonucleobase en el que el segmento funcional y el segmento protector forman una estructura de cadena doble y un estado en el que el segmento funcional y el segmento protector no forman una estructura de cadena doble.

12. Oligonucleobase según la reivindicación 11, en la que la molécula del Dador es un FRED, la molécula del aceptor es un FREA, y la propiedad fisicoquímica es la fluorescencia.

13. Oligonucleobase según la reivindicación 12, en la que el segmento funcional comprende una oligonucleobase de 11 a 75 nucleobases, el segmento funcional tiene por lo menos 6 nucleobases más que el segmento protector, el segmento funcional es complementario a una oligonucleobase diana, y una región de por lo menos 6 nucleobases contiguas del segmento funcional es monocatenaria en condiciones seleccionadas.

14. Oligonucleobase según la reivindicación 13, en la que el segmento funcional y el segmento protector son oligonucleótidos y el segmento conector es un enlace directo, un mono- u oligonucleótido de 2 a 5 nucleótidos, o un grupo químico seleccionado a partir del grupo formado por etilenglicol, tri(etilenglicol), tetra(etilenglicol), penta(etilenglicol), hexa(etilenglicol), -NH(CH_{2})_{n}NH-, en el que n es 2 ,3, 4, 5 ó 6, y combinaciones de los mismos.

15. Oligonucleobase según la reivindicación 14, en la que el segmento funcional comprende una secuencia de al menos cuatro desoxirribonucleótidos contiguos con enlaces fosfodiéster y/o fosforotioato.

16. Oligonucleobase según la reivindicación 15, que comprende además uno o más nucleótidos sustituidos en 2'.

17. Oligonucleobase según la reivindicación 16, en la que por lo menos los dos nucleótidos terminales del segmento funcional y/o del segmento protector son nucleótidos sustituidos en 2'.

18. Oligonucleobase según la reivindicación 16, en la que los nucleótidos sustituidos en 2' son 2'-O-metil o 2'-O metoxietil nucleótidos.

19. Oligonucleobase según la reivindicación 14, que comprende además uno o más nucleótidos con un enlace internucleotídico modificado seleccionado a partir del grupo formado por enlaces internucleotídicos fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, puente de fosforamidato, puente de metilenfosfonato, puente de fosforotioato, fosfolinol, boranofosfato, morfolino y sulfona.

20. Oligonucleobase según la reivindicación 12, en la que la oligonucleobase es una PNA o LNA.

21. Oligonucleobase según la reivindicación 12, que tiene acoplado un grupo químico seleccionado a partir del grupo formado por grupos lipófilos, agentes de intercalación, biotina, estreptavidina, diaminas, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y adamantano.

22. Oligonucleobase según la reivindicación 1, 11 ó 12, en la que el segmento funcional es una ribozima.

23. Oligonucleobase según la reivindicación 1, 11 ó 12, en la que el segmento funcional es un aptámero.

24. Oligonucleobase según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 11, 12 y 14, en la que la oligonucleobase está adaptada para unirse a una superficie sólida.

25. Oligonucleobase según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 11, 12 y 14, en la que la oligonucleobase está unida a una superficie sólida.

26. Kit que comprende en uno o más envases una oligonucleobase según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 11, 12 y 14.

27. Kit que comprende en uno o más envases una oligonucleobase según la reivindicación 24.

28. Kit que comprende en uno o más envases una oligonucleobase según la reivindicación 25.

29. Método de corte de una molécula de ARNm, que comprende poner en contacto la molécula de ARNm con una oligonucleobase según cualquiera de las reivindicaciones 2-10 en presencia de una RNasa H en condiciones que permiten la hibridación del segmento funcional con por lo menos una porción del ARNm y el corte subsiguiente del ARNm, en el que el segmento funcional de la oligonucleobase es complementario a por lo menos una porción del ARNm.

30. Método de detección de una oligonucleobase diana, que comprende poner en contacto la oligonucleobase diana con una oligonucleobase según cualquiera de las reivindicaciones 11-21, en el que el segmento funcional de la oligonucleobase es complementario a por lo menos una porción de la oligonucleobase diana.

31. Método de detección de una oligonucleobase diana, que comprende poner en contacto la oligonucleobase diana con una oligonucleobase según la reivindicación 25.

32. Método de amplificación de un ácido nucleico diana, que comprende utilizar una oligonucleobase según cualquiera de las reivindicaciones 11-21 como cebador y/o cebador sonda, en la que el segmento funcional es complementario al ácido nucleico diana que se va a amplificar.

\newpage

33. Método de amplificación de un ácido nucleico diana, que comprende utilizar una oligonucleobase según la reivindicación 25 como cebador y/o cebador-sonda, en la que el segmento funcional es complementario al ácido nucleico diana que se va a amplificar.