ES2197901T3 - Aislados de bacillus thuringiensis. - Google Patents
Aislados de bacillus thuringiensis.Info
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Abstract
NUEVAS BACTERIAS AISLADAS DEL B. THURINGIENSIS QUE TIENEN UNA MAYOR TOXICIDAD EN RELACION A ESPECIES DE INSECTOS INSUFICIENTEMENTE SENSIBLES O RESISTENTES YA CONOCIDAS, INCLUIDAS LAS ESPECIES, AUNQUE NO LIMITADAS A ELLAS, PLUTELLA XYLOSTELLA, SPODOPTERA FRUGIPERDA Y SPODOPTERA EXIGUA, ASI COMO CIERTOS INSECTOS SECUNDARIOS TALES COMO EL TRICHOPLUSIA NI. TALES BACTERIAS AISLADAS SE PUEDEN CARACTERIZAR PORQUE POSEEN UNA SUBCLASE PARTICULAR DE GENES QUE CODIFICAN DIVERSAS PROTEINAS DE LA (DELTA)-ENDOTOXINA DEL B. THURINGIENSIS Y PORQUE POSEEN UN PERFIL PLASMIDO CARACTERISTICO, O SISTEMA, QUE SE SABE ESTA ASOCIADO A ELLAS. TAMBIEN SE PRESENTAN UN METODO PARA LA IDENTIFICACION EFICIENTE DE TALES BACTERIAS AISLADAS MEDIANTE LA UTILIZACION GENERALIZADA, O ALTERNATIVA, DE SONDAS DE ADN ESPECIFICAS DE LOS GENES; LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS SINTETIZADOS O CLONADOS UTILES PARA LA PREPARACION DE ESAS SONDAS; LAS COMPOSICIONES QUE CONTIENEN UNA CANTIDAD EFECTIVA, DESDE EL PUNTO DE VISTA INSECTICIDA, DELA BACTERIA AISLADA DE LA INVENCION EN COMBINACION CON UN PORTADOR ACEPTABLE; Y UN METODO PARA EL USO DE LAS MISMAS EN EL CONTROL Y ERRADICACION DE LAS PLAGAS DE INSECTOS.
Description
Aislados de Bacillus thuringiensis.
La presente invención se refiere a organismos que
producen pesticidas biológicos. Más particularmente, se refiere a
nuevas cepas de la bacteria Bacillus thuringiensis que son
eficaces contra ciertas especies de insectos, así como a métodos
para la preparación y uso de las mismas.
Los insecticidas han disfrutado de un amplio uso
en la agricultura comercial y han permitido un enorme aumento en los
rendimientos de los cultivos y en la calidad de los productos. Los
pesticidas también se usan rutinariamente para controlar diversos
insectos, tales como por ejemplo moscas o mosquitos, cuando las
poblaciones de las plagas dañan o suponen un riesgo para la salud de
los seres humanos o del ganado. Sin embargo cada vez hay más
conciencia de los riegos medioambientales asociados con el uso de
ciertos pesticidas sintéticos, incluyendo las preocupaciones sobre
la bioacumulación de pesticidas en la cadena alimentaria o sus
efectos perjudiciales sobre organismos no diana. Por lo tanto, los
pesticidas biológicos y especialmente los biopesticidas naturales
han tenido un interés considerable para los que buscan medios de
control de plagas aceptables desde el punto de vista
medioambiental.
Desde hace mucho tiempo, el microorganismo B.
thuringiensis se ha reconocido como un organismo útil en el
control de plagas de insectos. La célula de B. thuringiensis
en esporulación produce una clase de compuestos, considerados
inicialmente como una sola \delta-endotoxina pero
ahora se entiende que comprenden varias proteínas de toxina
distintas, que se concentran en un cuerpo de inclusión de proteína
cristalina encontrado en la endoespora. Tras la ingestión del cuerpo
de inclusión por una larva de insecto susceptible y la proteolisis
en el intestino del insecto, las proteínas de endotoxinas se
convierten en compuestos activos que destruyen el epitelio del
intestino y finalmente la propia plaga.
Por consiguiente, se ha descubierto que las
\delta-endotoxinas de B. thuringiensis son
útiles como pesticidas cuando se aplican en forma de lisados u
otros extractos de fermentación de cultivos del microorganismo.
Estas toxinas muestran una actividad notable contra una diversidad
de especies de lepidópteros y otros insectos. Sin embargo, las
preparaciones de B. thuringiensis han resultado tener sólo
un valor limitado para combatir insectos tales como los de los
géneros Spodoptera y Plutella, así como otras diversas
plagas de lepidópteros. Se cree que esta toxicidad de preparaciones
de B. thuringiensis contra sólo ciertas especies de plagas, o
toxicidad diferencial, se debe a la expresión de sólo ciertos genes
de endotoxina en cualquier variante de B. thuringiensis dada,
contribuyendo cada toxina de una manera impredecible al perfil de
toxicidad total.
Numerosos investigadores han intentado
identificar cepas de B. thuringiensis que tienen un espectro
más amplio o diferente de actividad pesticida, o manipular el
genoma de B. thuringiensis para promover la expresión de
\delta-endotoxinas particulares. Los esfuerzos
dirigidos a seleccionar aislados individuales con respecto a la
toxicidad han conducido al aislamiento de algunas cepas previamente
desconocidas tales como B. thuringiensis var.
tenebrionis, descrita por Krieg et al. en la Patente de
Estados Unidos Nº 4.766.203, expedida el 23 de agosto de 1988, cepa
que según se ha notificado es eficaz para combatir coleópteros. Sin
embargo, el uso de procedimientos de selección convencionales para
identificar cepas con nueva actividad pesticida requiere tiempo y
mano de obra dadas las innumerables variantes de B.
thuringiensis que existen en la naturaleza.
En los documentos
EP-A-0 401 979;
EP-A-0 256 553; Haider, M.Z. et al.,
Gene, vol. 52 (1987) 285-290; Patentes de Estados
Unidos Nos. 4.935353, 4.206.281, 4.902.507 y 4.695.455; B. Visser et
al., J. Bacteriology, dic. 1990, p. 6783-6788; V.
Sanchis et al., Molecular Microbiology (1988), 2(3),
393-404 también se han descrito composiciones
insecticidas que comprenden un aislado de B. thuringiensis o
una \delta-endotoxina. H. Hofte et al.,
Microbiological Reviews, Junio de 1989, p. 242-255 y
G. Prefontaine et al., Applied and Environmental Microbiology, dic.
1987, p. 2808-2814 describen el uso de sondas
oligonucleotídicas específicas de gen para identificar los genes de
\delta-endotoxina en diferentes cepas de B.
thuringiensis.
Otra estrategia ha sido clonar genes que
codifican para \delta-endotoxinas de B.
thuringiensis y redisponer el genoma de B. thuringiensis
de una forma beneficiosa, o introducir los genes clonados en nuevos
hospedadores microbianos para conseguir la expresión.
Shimizu, M. et al., Agric. Biol. Chem.,
52(6), 1565-1573 (1988) describe la clonación
y expresión en E. coli de un gen de proteína insecticida de
B. thuringiensis.
En la Patente de Estados Unidos Nº 4.771.131,
expedida el 13 de septiembre de 1988, Herrnstadt et al.,
describen la clonación de un gen de toxina M-7 que
se considera adecuado para la expresión en otros microbios tales
como Pseudomonas y que, por lo tanto, confiere la capacidad
de controlar escarabajos del orden Coleoptera. Sin embargo,
estos métodos tienen el inconveniente de que los organismos
resultantes están sometidos a un mayor escrutinio regulador con
respecto a los organismos que existen de forma natural.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de la
identificación de cepas de B. thuringiensis que presenten un
espectro más amplio o diferente de actividad pesticida. Idealmente,
tales cepas se identificarían entre variantes que se producen de
forma natural sin el uso de métodos de selección aleatorios.
Por consiguiente, la presente invención comprende
nuevos aislados bacterianos de B. thuringiensis que tienen
mayor toxicidad con respecto a especies de insectos previamente
resistentes o insuficientemente susceptibles. Estos aislados pueden
emplearse contra varias especies de insectos resistentes al
tratamiento con B. thuringiensis incluyendo, pero sin
limitación, Plutella xylostella (palomilla dorso de
diamante), Spodoptera frugiperda (gusano cogollero) y
Spodoptera exigua (gusano de la remolacha), así como ciertas
plagas secundarias tales como Trichoplusia ni (gusano falso
medidor de la col). Los aislados bacterianos de la invención pueden
caracterizarse por su posesión de una subserie particular de los
genes que codifican para las diversas proteínas endotoxinas de B.
thuringiensis y por un perfil o serie de plásmidos
característico que se considera asociado con las mismas.
La presente invención comprende un aislado
bacteriano de Bacillus thuringiensis que tiene una
combinación de genes incluyendo cryIA(a), cryIA(b),
cryIC y cryID que codifican y se expresan como proteínas
\delta-endotoxinas de B. thuringiensis,
donde dicho aislado se caracteriza por el perfil de plásmido
mostrado en la Figura 1 franja 3 en comparación con el marcador de
peso molecular y los perfiles de plásmido de las cepas
HD-1, HD-133, HD-11
mostradas en la Figura 1 franjas 1, 2, 4, 5 respectivamente,
obtenidas por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% en tampón
de TBE, usando un conmutador Pulsewave® 760, donde el gel se mantuvo
a 4ºC procesado a 80 voltios durante 1 hora, se cubrió con una
película de plástico, y se procesó a 50 voltios durante 26 horas,
teniendo los parámetros de forma de onda del proceso normal de
inversión de campo un tiempo A inicial de 9 segundos y un tiempo A
final de 60 segundos y donde la relación de inicio fue 3 y el tiempo
de procesamiento de 26 horas.
La presente invención también comprende un método
para la identificación eficaz de tales aislados bacterianos, en el
que puede usarse una sonda de nucleótidos generalizada para
establecer, en una cepa que ya se sabe que tiene alguna toxicidad
para una plaga de insectos particular, la identidad de esos genes
de endotoxina de la cepa. A continuación, se preparan sondas de ADN
específicas de gen para la detección de esos genes de endotoxina;
después, estas sondas se usan para preseleccionar cepas de B.
thuringiensis para identificar una serie de variantes que son
capaces de sintetizar las correspondientes endotoxinas. Las
variantes seleccionadas de esta manera pueden someterse finalmente a
una selección adicional de una naturaleza más convencional para
obtener variantes particulares que presentan incluso niveles
superiores de actividad pesticida.
Se describen secuencias de nucleótidos clonadas o
sintetizadas que son útiles en la preparación de las sondas de ADN
específicas de gen que pueden usarse para identificar aislados de la
invención. Estas secuencias se determinan por análisis de secuencia
de los genes diana de interés y de acuerdo con el grado de
especificidad deseado. Cuando se requiere una sonda generalizada (es
decir, una capaz de reconocer múltiples genes de endotoxina), puede
construirse una secuencia de nucleótidos que se base en una región
conservada de los genes de toxina de B. thuringiensis. Como
alternativa, pueden usarse secuencias que son únicas para los
diversos genes de toxina para preparar sondas muy específicas.
Además, la presente invención comprende el uso de
aislados bacterianos de la invención en el control o erradicación de
plagas de insectos, así como composiciones que contienen una
cantidad insecticidamente eficaz de tal aislado en combinación con
un vehículo aceptable.
La presente invención se describe con referencia
al dibujo adjunto, en el que la Figura 1 es una serie de perfiles de
plásmidos para la cepa ABTS 1857 de B. thuringiensis y varias
cepas de referencia.
En un aspecto de la presente invención, se
describen aislados bacterianos de B. thuringiensis que se
eligen entre variantes de B. thuringiensis disponibles por
un procedimiento que incluye la preselección de una subserie
seleccionada (cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID) de
los genes que codifican para las proteínas
\delta-endotoxina de B. thuringiensis y que
identifican los aislados que tienen el perfil de plásmidos indicado
anteriormente. Los aislados de la presente invención poseen
toxicidad diferencial hacia especies de insectos particulares e
incluyen aislados de variantes de B. thuringiensis que son
tóxicas para especies de plagas que previamente se ha descubierto
que son resistentes o insuficientemente susceptibles a los
insecticidas de B. thuringiensis.
Son ilustrativas de la invención cepas eficaces
contra plagas seleccionadas entre el grupo compuesto por
Spodoptera frugiperda, S. exigua, Plutella xylostella y
Trichoplusia ni. Ahora se ha descubierto que estas especies
de plagas pueden controlarse con un aislado de B.
thuringiensis que expresa los genes cryIA(a),
cryIA(b), cryIC y cryID y opcionalmente que carece del gen
cryIA(c). Aunque no se desea limitarse con ninguna teoría,
se cree que este complemento génico contribuye, al menos en parte,
a la actividad pesticida superior de estas cepas. Además, se cree
que la actividad de estos genes está relacionada con su
organización dentro del genoma bacteriano. Una serie o perfil de
plásmidos, que se puede obtener fácilmente, por ejemplo, por
separación electroforética de plásmidos bacterianos, puede servir
para caracterizar la arquitectura genética de una cepa y, de esta
manera, puede servir como un identificador adicional de un aislado
bacteriano de la invención. En la Figura 1 se muestra un perfil de
plásmido representativo, obtenido a partir de B.
thuringiensis ABTS 1857.
Un ejemplo preferido de los aislados bacterianos
de la presente invención es el nuevo aislado bacteriano B.
thuringiensis ABTS 1857 descrito en este documento que posee el
complemento génico descrito anteriormente y que demuestra mejor
toxicidad hacia Plutella xylostella en comparación con las
cepas de B. thuringiensis comerciales. B.
thuringiensis ABTS 1857, que es de la subespecie
aizawai, se ha depositado con el número de acceso
SD-1372 con la American Type Culture Collection en
Rockville, Maryland. Además del perfil de plásmidos de la Figura 1,
la cepa ABTS 1857 se puede identificar por las características
bioquímicas del Ejemplo 4 de este documento y así como por la
representación del estereotipo flagelar H-7
(idéntico a la cepa HD-11 del tipo B.
thuringiensis del Ministerio de agricultura de Estados Unidos)
así como la presencia de al menos tres plásmidos que contienen gen
de endotoxina (mostrado por curado térmico).
En otro aspecto de la presente invención se
describen cultivos biológicamente puros de los aislados anteriores.
Por ``cultivo biológicamente puro'', como se usa en este
documento, se entiende un cultivo que carece esencialmente de
contaminación biológica y que tiene una uniformidad genética de tal
forma que diferentes subcultivos tomados a partir del mismo
presentarán genotipos y fenotipos sustancialmente idénticos. Tales
cultivos son útiles en la fermentación a gran escala o, como
alternativa, como material de partida para técnicas de manipulación
de cepas bien conocidas. Por consiguiente, se consideran dentro del
alcance de la invención mutantes, recombinantes y variantes
modificadas genéticamente que tienen el perfil de plásmidos deseados
que proceden de los aislados de la presente invención, y cultivos
de los mismos.
Pueden identificarse combinaciones deseables de
genes de \delta-endotoxina de B.
thuringiensis usando una sonda nucleotídica generalizada capaz
de hibridar con todos estos genes. Se han identificado varios genes
de toxinas, incluyendo cryIA(a), cryIA(b),
cryIA(c) y cryIB, cryIC, cryID, cryIE, cryIIIA,
cryIIIB, cryIVA cryIVB, y cryIVC, y se han publicado
secuencias parciales o enteras de los mismos, como por ejemplo por
Schnepf et al. en J. Biol. Chem.,
260:6264-6272 (1985). Se ha descubierto que ciertas
regiones de estos genes están muy conservadas, lo que permite la
preparación de una sonda de ADN que reconoce en general genes de
endotoxina de B. thuringiensis. Tal sonda generalizada,
cuando hibrida con el genoma de una cepa que se ha descubierto por
medio de la investigación rutinaria que tiene algún grado de
toxicidad hacia una especie de plaga de interés, puede usarse para
identificar y caracterizar los genes de endotoxina presentes en esa
cepa tipo. Estas manipulaciones, así como otras que son útiles en
la práctica de la presente invención para identificar los genes de
endotoxina, pueden realizarse usando técnicas que son bien conocidas
y que pueden encontrarse en referencias tales como Maniatis et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982.
De acuerdo con la invención, un ejemplo de una
sonda generalizada, usada para identificar los genes
cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID que
parecen conferir mejores características de toxicidad sobre B.
thuringiensis, es la nueva sonda que contiene la secuencia
Tales secuencias, cuando se presentan en la
bibliografía, pueden prepararse usando procedimientos
convencionales para la síntesis de polinucleótidos. Como
alternativa, pueden clonarse secuencias directamente a partir de
genes conocidos de interés. También pueden usarse sondas
relacionadas; por ejemplo, también son adecuados fragmentos de la
secuencia anterior, que tengan una longitud suficiente para
hibridar específicamente con \delta-endotoxinas
para uso como sondas de ADN generalizadas de la presente invención.
Debe indicarse que aquí y en otras partes de esta descripción, las
secuencias de nucleótidos se expresan de la manera convencional,
principalmente en la dirección 5' a 3' donde A es adenina, G es
guanina, C es citosina y T es timina.
El método de la invención proporciona el
aislamiento de una serie de variantes de B. thuringiensis
que contienen la combinación anterior de genes y que, por lo
tanto, son capaces de producir la correspondiente combinación de
proteínas de endotoxina. El aislamiento de variantes puede
realizarse determinando primero una secuencia de nucleótidos única
de una porción de cada gen que codifica para cada una de las
endotoxinas deseadas, y después preparando una serie de sondas
nucleotídicas específicas de gen que son capaces de hibridar con
esas secuencias. Tales secuencias únicas se obtienen a partir de lo
que se ha descrito como regiones muy variables (es decir, no
conservadas) de los genes de \delta-endotoxina de
B. thuringiensis. Como ocurre en las sondas generalizadas
descritas anteriormente, la construcción de sondas específicas de
genes en algunos casos puede realizarse haciendo referencia a
secuencias de nucleótidos publicadas. Como alternativa, cuando no se
dispone de datos de secuencia o cuando se ha identificado un nuevo
gen de endotoxina, los genes de interés deben clonarse o
secuenciarse en un grado que permita la identificación de
secuencias únicas útiles para la clonación o síntesis de las
correspondientes secuencias de sonda.
Las sondas específicas de gen que pueden
emplearse en la identificación de los genes de
\delta-endotoxina de B. thuringiensis,
tales como las usadas en la realización preferida del método de
la presente invención, pueden construirse a partir de secuencias de
nucleótidos que incluyen las siguientes:
Estas secuencias pueden usarse en su totalidad o
pueden acortarse, alargarse o modificarse internamente para obtener
sondas que posean el grado deseado de homología y la
correspondiente especificidad de hibridación para los genes de
endotoxina que se pretenden identificar.
Después, las anteriores sondas específicas de
gen, que pueden marcarse en cualquiera de las diversas formas
convencionales para permitir la evaluación de su unión, pueden
usarse para preseleccionar rápida y económicamente todas las cepas
disponibles de B. thuringiensis. Esta preselección puede
realizarse usando técnicas bien conocidas tales como cultivo en
placas replicadas, hibridación, autorradiografía y similares. De
esta manera, se puede seleccionar fácilmente, entre las cepas a
ensayar, una serie de variantes que muestran un modelo de
hibridación representativo del complemento génico que se está
buscando. A este respecto, debe indicarse que el método de la
presente invención puede incluir la preselección no sólo con
respecto a la presencia de genes de metoxina particulares, sino
también con respecto a la ausencia de otros que se ha descubierto
que inhiben o que no tienen ningún efecto discernible sobre la
toxicidad deseada.
Se prevé que el método de aislamiento anterior de
la invención, aunque se ha descrito anteriormente en relación con
la identificación y la preselección de genes de
\delta-endotoxina de B. thuringiensis, es
igualmente adecuado para la selección de series de cepas variantes
que llevan otras secuencias de ADN no pertenecientes a toxinas que,
sin embargo, puede descubrirse que participan en la determinación
de una toxicidad diferencial. Por ejemplo, si se identifica un gen
regulador o una secuencia no expresada que afecta a la cantidad de
endotoxinas producidas o la especificidad de esas toxinas hacia una
plaga diana, pueden prepararse sondas de nucleótidos específicas de
secuencia y usarse para preseleccionar las variantes de B.
thuringiensis naturales con respecto a la presencia o ausencia
de tales secuencias. Por consiguiente, por ``genes'' o ``genes que
codifican para proteínas de endotoxina'', como se usa en este
documento, se entiende no sólo secuencias de ADN expresadas como
endotoxinas, sino también las secuencias que regulan tal expresión
o que, cuando se expresan por sí mismas, modifican el perfil de
toxicidad de la cepa de B. thuringiensis que las
contiene.
Entre las variantes seleccionadas por la
preselección, puede identificarse una cepa de B.
thuringiensis preferida por la selección convencional pero a
pequeña escala con respecto a la toxicidad. Después, el aislado
seleccionado finalmente puede optimizarse con respecto a la
producción de toxinas usando técnicas conocidas o mejoras de
rendimiento o por medio de la manipulación de la propia cepa, tal
como por la producción de mutantes, recombinantes o derivados
modificados por ingeniería genética de los mismos que tengan una
combinación de genes incluyendo cryIA(a), cryIA(b),
cryIC y cryID y que tienen el perfil de plásmidos de la
Fig. 1 franja 3.
Tal manipulación también puede incluir la
preparación de un fenotipo preferido del aislado seleccionado, tal
como por ejemplo un mutante spo^{-} (asporógeno) que produce un
cristal de toxina pero no esporas.
En otro aspecto de la presente invención, se
describen composiciones que comprenden una cantidad
insecticidamente eficaz de un aislado bacteriano de la invención,
o la combinación de endotoxinas obtenidas a partir del mismo, en
combinación con un vehículo aceptable. Después de la identificación
y de la estabilización y una variante de B. thuringiensis de
acuerdo con la metodología anterior, puede realizarse una
fermentación a gran escala usando medios y técnicas de fermentación
que son convencionales en la industria. Después, los cristales de
endotoxina (junto con las esporas a partir de las cuales los
cristales no se separan fácilmente) pueden separarse del caldo de
fermentación y liofilizarse o formularse en cualquiera de las
diversas formas bien conocidas, incluyendo como un concentrado
líquido, polvo seco o humectable o suspensión para pulverizar o
bajo el follaje, y una preparación granulada para la aplicación al
sustrato. Por ``vehículo aceptable'', como se usa en este documento,
se entiende una carga inerte de otra forma o excipiente que
confiere a la composición una capacidad de almacenamiento deseable,
característica de la manipulación y aplicación del material; los
vehículos usados comúnmente pueden incluir cargas, aglutinantes,
tensioactivos, dispersantes, agentes de adhesión y similares. Un
ejemplo preferido de una composición de la invención es una que
contiene el aislado B. thuringiensis ABTS 1857 o un mutante,
recombinante o derivado modificado por ingeniería genética del
mismo que tenga una combinación de genes incluyendo
cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID y que
tenga el perfil de plásmido de la Fig, 1 franja 3.
En otro aspecto de la presente invención, se
describe un método para controlar plagas de insectos que comprende
aplicar, en un área infestada con dichas plagas, una cantidad
insecticidamente eficaz de un aislado bacteriano de la invención o
la combinación de endotoxinas obtenidas a partir del mismo. Por
``cantidad insecticidamente eficaz'' como se usa en este documento,
se entiende la cantidad de un aislado bacteriano o endotoxina que
es capaz de erradicar sustancialmente la plaga diana según se mide,
por ejemplo, por medio de la mortalidad de la plaga o la ausencia
de una lesión de cultivo adicional. Numerosos factores afectarán a
la cantidad de aislado bacteriano o endotoxina necesaria,
incluyendo el método de aplicación; las condiciones climáticas
predominantes tales como la temperatura, la humedad, la lluvia y el
viento; el grado de la infestación de la plaga; la fase de
crecimiento de la especie diana y similares. Cuando los insectos a
combatir son plagas tales como Spodoptera frugiperda, S. exigua,
Plutella xylostella y Trichoplusia ni, una realización
preferida del método de control de plagas de la invención es una
en la que el agente activo aplicado es un aislado bacteriano de
B. thuringiensis ABTS 1857 o un mutante, recombinante o
derivado modificado por ingeniería genética del mismo que tiene una
combinación de genes incluyendo cryIA(a), cryIA(b),
cryIC y cryID y que tiene el perfil de plásmidos de la
Fig. 1 franja 3.
El aislamiento de cepas de B.
thuringiensis del sustrato se realizó usando procedimientos
diseñados para favorecer la germinación de bacilos de tipo B.
thuringiensis sobre otros microorganismos que incluyen de seis a
diez especies de bacilos formadores de esporas así como bacterias
no esporulantes, levaduras y hongos. Se utilizó un tratamiento
térmico corto (80ºC durante 10 minutos) para activar las esporas,
después de lo cual las muestras se subcultivaron rápidamente en
medio de agar NSYM por Myers y Youseten 1980.
Se seleccionaron colonias de bacilos de tipo
B. thuringiensis en función de la morfología de las colonias
y de las características de crecimiento típicas de esta especie.
También se usó un examen microscópico para identificar la proteína
cristalina endotoxina que diferencia B. thuringiensis de
Bacillus cereus, una bacteria del sustrato común que, por
lo demás, es morfológica y bioquímicamente indistinguible.
Se cultivaron aislados de B. thuringiensis
para uso en bioensayos en matraces de cultivo de 250 ml que
contenían 50 ml de medio 168 (18 g de harina de soja, 0,3 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,7 g K_{2}HPO_{4}, 0/5 g
CaCO_{3}, 1,0 ml FeSO_{4} al 1%\cdotH_{2}O y 1,0 ml
ZnSO_{4} al 1% en 1 litro de agua desionizada; esterilizado en
autoclave; aproximadamente 2,5 ml de solución de glucosa al 20%
estéril por 100 ml, añadido antes del uso). Los cultivos se
incubaron durante 72 horas a 28ºC con agitación a 250 rpm, después
de lo cual se suministraron muestras de 3 ml en tubos de
polipropileno estériles de 15 ml y se congelaron a -20ºC para un
análisis posterior.
La toxicidad de aislados bacterianos se ensayó en
el laboratorio exponiendo larvas de especie de plagas a una dieta
de insectos tratada con cantidades variables de la bacteria. Se
prepararon diluciones en serie en paralelo de la cepa de ensayo y
de una bacteria de referencia, seleccionando intervalos de
concentraciones (después del pre-ensayo inicial, si
es necesario) para obtener puntos medios en serie en o cerca de
los valores de DL_{50} respectivos. A alícuotas de 36 ml de una
dieta de insectos convencional (principalmente agar, harina de
soja, nutrientes sólidos y suplementos de vitamina) mantenida en
estado líquido a 60ºC, se les añadieron 4 ml de cada dilución,
incluyendo patrones de agua desionizada. Después de la mezcla, cada
muestra de 40 ml de la dieta tratada se dividió, mientras aún
estaba caliente, en seis recipientes de plástico de una onza y se
dejó enfriar hasta que la dieta solidificó y alcanzó la temperatura
ambiente durante al menos 1 hora.
Después, las muestras se infectaron con la
especie de plaga de interés, como por ejemplo con dos larvas de dos
días de edad en la segunda fase larvaria en el caso de S.
frugiperda, poniendo cuidadosamente las larvas en cada
recipiente. Los recipientes se cubrieron individualmente y se
incubaron durante 64 a 68 horas en una cámara ambiental (24 horas
de oscuridad, 28ºC, 20-50% de humedad relativa).
Después de la incubación, se contaron los números de larvas vivas y
muertas y los resultados se usaron para un análisis de CL_{50}
posterior.
Se prepararon sondas de ADN generalizadas y
específicas de gen para uso en el método de la invención
sintetizando los ologonucleótidos deseados en un sintetizador de
ADN automático de tres columnas Applied Biosystems 380B® , usando
las químicas de \beta-cianoetanol fosforamidita
convencionales proporcionadas con este dispositivo. Los
oligonucleótidos resultantes se marcaron terminalmente usando
\gamma-AT^{32}P (Amersham) y empleando el
procedimiento de Maxam y Gilbert (1980) para el marcaje 5'
terminal con polinucleótido quinasa de T4.
Se prepararon aislados bacterianos para la
hibridación con las sondas anteriores por dilución en serie y
cultivo en placas, después de lo cual se pusieron colonias
individuales con palillos de dientes estériles en placas de
microtitulación de 96 pocillos que contenían medio LB líquido (5 g
de NaCl, 10 g de bactotriptona y 5 g de extracto de levadura por
litro) y se incubaron durante al menos 4 horas a 28ºC. Usando una
prensa metálica 96 prong, las series de cultivo se multirreplicaron
por transferencia a membranas de hibridación de nylon de 1,2
micrómetros puestas sobre placas de agar LB sólidas y en una placa
de bioensayo maestra, y se dejaron incubar a 28ºC durante
aproximadamente 16 horas.
Después, las colonias resultantes se sometieron a
un tratamiento de protoplastos por flotación de los filtros durante
1 hora, con las colonias mirando hacia arriba, en una solución de
lisozima de 10 mg/ml en tampón TES (Tris-HCI 30 mM,
EDTA 5 mM, NaCl 50 mM). Después del tratamiento de los protoplastos,
los filtros se lavaron sacudiéndolos suavemente en un exceso,
primero de tampón desnaturalizante (NaOH 0,5 M, NaCl 2,5 M) durante
30 minutos con un cambio de tampón, y después de tampón
neutralizador (Tris 0,5 M, pH 7,0, NaCl 3,0 M) también durante 30
minutos con un cambio de tampón. Los filtros se secaron brevemente
al aire y se pusieron en una estufa a 80ºC durante al menos 1 hora
antes de la prehibridación y la hibridación, de acuerdo con el
método de Southern (1975).
Los filtros hibridados se lavaron dos veces, cada
uno durante 1 hora, con tampón citrato (SDS al 0,1% p/v, citrato
sódico 30 mM, NaCl 0,3 M, ajustado a pH 7,0 con HCl) a 58ºC durante
1 hora y se secaron al aire en papel secante. Después, las
hibridaciones se evaluaron por exposición durante una noche de los
filtros en un congelador de -70ºC, a una película Kodak
X-Omat® AR usando una pantalla de identificación, y
mediante el revelado posterior y análisis de la película.
Se identificaron genes de
\delta-endotoxina de B. thuringiensis
relacionados con la toxicidad contra el gusano de la remolacha y el
gusano cogollero y la polilla dorso de diamante como se indica a
continuación: Varias observaciones de toxicidad variable contra
Spodoptera exigua y Trichoplusia ni sobre la parte de
variantes HD-1 de B. thuringiensis condujo
al hallazgo de que la pérdida de un gen de toxina, como se
determina por transferencia de Southern, producía una reducción
significativa en las muertes de Spodoptera. La pérdida del
gen correspondiente, identificado posteriormente como
cryIA(b), se confirmó por análisis de transferencia
de Southern. Independientemente, los genes cryIA(b) y
cryIA(c) clonados se expresaron en Escherichia
coli, a partir de los cuales se prepararon gránulos y
extractos aislados que también presentaban una toxicidad
diferencial notable contra estas especies de plaga. Conjuntamente,
los estudios sugirieron que el gen cryIA(b) era
esencial para la toxicidad, pero que cryIA(c) podría
ser innecesario conjuntamente.
Después se preparó una cepa derivada de B.
thuringiensis HD-1 por curado térmico, y los
cristales purificados de esta cepa se ensayaron con respecto a la
toxicidad contra larvas de S. frugiperda y T. ni. La
cepa derivada, que contenía los genes cryIA(a) y
cryIA(b) pero que carecían de cryIA(c)
mostraron una actividad sustancialmente mejorada contra S.
frugiperda. Por consiguiente, se prepararon sondas de ADN
específicas de gen para cryIA(a), cryIA(b) y
cryIA(c) y se usaron para seleccionar aislados del
sustrato de B. thuringiensis con respecto a variantes que
tenían un complemento génico idéntico.
Se identificaron aproximadamente veinte de tales
variantes y se bioensayaron con respecto a la actividad contra
S. frugiperda. Una cepa en particular, denominada ABTS 5803,
se identificó como muy activa, presentando dos veces la toxicidad
hacia esa especie como la cepa de referencia HD-1.
Por lo tanto, la cepa ABTS 5803 se analizó por tratamiento con una
sonda de ADN generalizada modelada después de una región conservada
de los genes de endotoxina de B. thuringiensis conocidos
entonces y se descubrió, usando análisis de Southern, que contenía
dos nuevos genes además de cryIA(a) y de
cryIA(b). Tras la clonación y secuenciación, estos
genes se identificaron como cryIC y cryID. Otros
estudios realizados usando el curado térmico de plásmidos demostró
que los genes estaban localizados en al menos tres plásmidos
separados, estando cryIC y cryID localizados
conjuntamente, si no adyacentemente. Se descubrió que ciertos
derivados de ABTS que carecían de uno o más de estos genes tenían
toxicidades atenuadas; por consiguiente, se eligió la combinación
de genes cryIA(a), cryIA(b), cryIC y
cryID (excluyendo de cryIA(c)) para uso en la
posterior preselección.
Se obtuvo un aislado bacteriano representativo de
la presente invención como se indica a continuación: Usando sondas
específicas de gen para la combinación anterior de 4 genes de
endotoxina, se preseleccionaron aislados de sustrato de una sola
colonia de B. thuringiensis hasta que se identificaron
aproximadamente 100 variantes que poseían esos genes. A su vez,
estos se ensayaron con respecto a la actividad contra S.
frugiperda. Se descubrió que una variante, aislada a partir
del sustrato recogido en Ephriam, Wisconsin e identificada como
cepa ABTS 5686, tenía una actividad superior a las otras, y que
producía un complejo de toxina/espora que tenía tres veces la
toxicidad hacia S. frugiperda de la cepa de referencia B.
thuringiensis HD-1.
Usando de nuevo sondas específicas de gen, la
pureza genotípica de la cepa ABTS 5686 se verificó examinando
aislados de una sola colonia de esa cepa con respecto a la
retención de los cuatro genes de endotoxina deseados y, de esta
forma, de todos los plásmidos que llevaban genes. Se reunieron
treinta y tres colonias con un complemento de gen entero y, por lo
tanto, aparentemente estable y se redenominaron cepa ABTS 1857. El
examen adicional de la estabilidad del plásmido a 34ºC (en lugar de
la temperatura de cultivo habitual de 28ºC) confirmó la estabilidad
del genoma, con una pérdida de gen cryIA(b) de sólo
un 2% durante 72 horas a esta temperatura elevada. Después, la cepa
ABTS 1857 de B. thuringiensis se caracterizó más
concretamente y se ensayó con respecto a la actividad pesticida
como se describe más adelante.
Se evaluaron las características metabólicas y de
crecimiento diferenciales de B. thuringiensis ABTS 1857 de
acuerdo con Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.
2, 1986, páginas 1104-1129, con variaciones del
procedimiento que se indica a continuación. Se anotaron las
siguientes características (en las que X = positivo, 0 = negativo,
V = variable y T= respuesta muy pequeña):
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Diámetro celular > 1,0 micrómetros \+ X\cr Esporas redondas
\+ 0\cr Esporangio hinchado \+ 0\cr Cristales de paraesporas \+
X\cr Catalasa \+ X\cr Crecimiento anaerobio \+ X\cr Ensayo de
Voges-Proskauer \+ X\cr \qquad pH en caldo
V-P < 6,0 \+ X\cr Ácido de\+\cr \qquad
D-glucosa \+ X\cr \qquad
L-arabinosa \+ V\cr \qquad
D-xilosa \+ V\cr \qquad D-manitol
\+ V\cr Gas de glucosa \+ 0\cr Hidrólisis de\+\cr \qquad
Caseína \+ X\cr \qquad Gelatina \+ X\cr \qquad Almidón \+ X\cr
Utilización de\+\cr \qquad Citrato \+ X\cr \qquad Propionato
\+ X\cr Degradación de tirosina \+ 0\cr Desaminación de
fenilalanina \+ 0\cr Lecitinasa de yema de huevo \+ X\cr Nitrato
reducido a nitrito \+ X\cr Formación de\+\cr \qquad Indol \+
0\cr \qquad Dihidroxiacetona \+ 0\cr \qquad NaCl y KCl
requeridos \+ 0\cr \qquad Alantoína o urato requeridos \+ 0\cr
Crecimiento a pH\+\cr \qquad 6,8 caldo nutriente \+ X\cr
\qquad 5,7 \+ X\cr Crecimiento en NaCl (%)\+\cr \qquad 0 \+
X\cr \qquad 2 \+ X\cr \qquad 5 \+ X\cr \qquad 7 \+ 0\cr
\qquad 10 \+ 0\cr Crecimiento a (ºC)\+\cr \qquad 5 \+ 0\cr
\qquad 10 \+ T\cr \qquad 15 \+ X\cr \qquad 20 \+ X\cr
\qquad 25 \+ X\cr \qquad 30 \+ X\cr \qquad 35 \+ X\cr
\qquad 40 \+ X\cr \qquad 45 \+ X\cr \qquad 50 \+ X\cr
\qquad 55 \+ 0\cr Crecimiento con lisozima presente \+ X\cr
Autótrofo con H _{2} y CO _{2} \+
0\cr}
En la detección de lecitinasa, se usó un medio de
agar sólido en lugar del medio líquido recomendado en
Bergey, anteriormente, de forma que la estimación de la
producción de lecitinasa fue más precisa. Para el análisis del
crecimiento auxótrofo, se usaron recipientes Gaspak® y generadores
de gas (BBL) para proporcionar el medio de gas apropiado, y el
crecimiento se clasificó después de 3 y 6 días de incubación a
20-30ºC.
Las sensibilidades a antibióticos, cuando se
ensayaron según el criterio de S.O.P.
047T-12-034A del Comité Nacional de
Normas de Laboratorio Clínico con respecto a la respuesta del
organismo de control Staphylococcus aureus fueron las
siguientes (donde R = resistente y S = sensible):
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Gentamicina \+ S\cr Kanamicina \+ S\cr Eritromicina \+ S\cr
Clindamicina \+ S\cr Penicilina \+ R\cr Ampicilina \+ R\cr
Cefalotina \+ R\cr Vancomicina \+ S\cr Cloranfenicol \+ S\cr
Trimetoprim/Sulfametoxazol \+
S\cr}
Se obtuvo un perfil de plásmidos de la cepa ABTS
1857 de B. thuringiensis usando un procedimiento adoptado de
Gryczan et al. (1978) modificado por Shivakumar et
al. (1986) y en comparación con los perfiles de B.
thuringiensis Kurstaki HD-1 y con dos cepas
tipo de B. thuringiensis subsp. Aizawai
HD-11 y HD-133 como se indica a
continuación: Se desarrollaron cultivos de las cepas en tubos de
centrífuga de polipropileno de 50 ml que contenían 20 ml de LB
durante aproximadamente 16 horas a 28ºC con agitación (250 rpm). Se
recogieron células por centrifugación a 4800xg durante 10 minutos a
4ºC y se lavaron dos veces con 1 ml de tampón TES (Tris 30 mM, pH
7,5, EDTA 5 mM, NaCl 40 mM) antes de sedimentar en una
microcentrífuga después de cada lavado. El sobrenadante se aspiró y
los sedimentos se resuspendieron en 180 \mul de medio de sacarosa
(sacarosa al 25%, NaCl 0,1 M, Tris 0,05 M, pH 7,5). Las muestras se
mezclaron minuciosamente y se añadieron 20 \mul de lisozima (50
mg/ml en medio de sacarosa) sin mezcla adicional. Después de
incubar a 37ºC durante 1 hora, las células se lisaron añadiendo 48
\mul de NaCl 5M, 12 \mul de EDAT 0,5 M y 260 \mul de SDS al
2% en NaCl 0,7 M a cada muestra y mezclando lentamente invirtiendo
los tubos dos veces, seguido de una incubación adicional durante 10
minutos a 68ºC. Después, las muestras se enfriaron durante 1 hora
en un baño de hielo y el ADN cromosómico y los desechos celulares se
retiraron por microcentrifugación durante 15 minutos mientras se
mantenía una temperatura de 4ºC. Se retiraron suavemente
aproximadamente 300 \mul de sobrenadante de cada muestra con una
pipeta eppendorf de extremo romo, previniendo el contacto con la
interfase de la muestra para evitar el cizallamiento del ADN, y se
transfirieron a un tubo eppendorf limpio.
Después, las muestras se trataron con 33 \mul
de acetato sódico 3 M y 670 \mul de etanol a 4ºC para precipitar
el ADN plasmídico, y se mantuvieron a -20ºC durante 18 horas antes
de microcentrifugarse a 4ºC durante 15 minutos. El etanol se
decantó y los bordes del tubo se secaron, y los sedimentos se
secaron por centrifugación al vacío durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Después, cada sedimento se cubrió con 200 \mul de
tampón TES y se dejó en reposo durante 15 minutos antes de la
resuspensión por medio de un pipeteo suave usando una pipeta
eppendorf de extremo romo y presionando ligeramente con la punta
del dedo. Se añadieron 2 \mul de cada una de RNasa A (10 mg/ml) y
T1 RNasa (100 U/ml) a cada muestra y las muestras se incubaron en
un baño de agua de 37ºC durante 1 hora. Después de añadir 20 \mul
de proteinasa K (10 mg/ml), cada muestra se incubó durante 2 horas
más.
Las proteasas se retiraron de las muestras por
extracción con fenol usando 200 \mul de fenol tamponado
(8-hidroxiquinolona añadida al 0,1%; extraída con
un lavado de Tris 1 M, pH 8 y dos lavados de Tris 0,1 M, pH 8 para
producir un pH de 5,6) y mezclándose brevemente durante 10
segundos. Después, cada muestra se microcentrifugó durante 3
minutos y la fase acuosa se transfirió a un tubo eppendorf nuevo.
Se añadió un volumen igual (200 \mul) de cloroformo:alcohol
isoamílico (24:1 v/v) y las muestras se mezclaron y se
centrifugaron como se ha indicado anteriormente. La fase acuosa se
retiró y se precipitó de nuevo con la adición de un volumen de 1/10
de acetato sódico 3 M (20 \mul) y 2,5 volúmenes de etanol (0,5
ml) a 4ºC, y las muestras se mantuvieron a -20ºC durante 1 hora.
Después, las muestras se sedimentaron, se secaron y se
resuspendieron en tampón TES como se ha indicado anteriormente.
Se realizaron separaciones en gel usando un
conmutador Pulsewave® 760 (Bio-Rad) y perlas de gel
de tipo puente, de 10 x 15 cm, que se taparon en cada extremo con
agarosa al 1,5% obtenida en tampón TBE (base Tris 8 mM, ácido
bórico 89 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3). Se vertieron geles de agarosa
(0,8%), obtenidos en tampón TBE hasta una profundidad de
aproximadamente 4 mm y se equiparon con cardas de gel de 1,5 x 7
mm. Los geles, mantenidos a 4ºC, se procesaron a 80 voltios durante
1 hora y después se cubrieron con una película de plástico, y el
voltaje se redujo a 50 voltios durante 26 horas. Los parámetros de
la forma de onda fueron ``inversión de campo, proceso normal'' con
un tiempo A inicial de 9 segundos y un tiempo A final de 60
segundos. La relación de inicio fue de 3 y el tiempo de procesado
se fijó a 26 horas.
Los geles terminados se tiñeron con bromuro de
etidio a aproximadamente el 0,6% durante 30 minutos y se destiñeron
durante 15 minutos en agua, antes de fotografiarse con iluminación
por detrás con una luz UV de onda corta. Se usó una combinación de
dos filtros Tiffen® (25-rojo y
16-naranja), exponiéndose la película Polaroid 667
durante 20 segundos a f22.
El perfil de plásmido resultante de la cepa ABTS
1857 se muestra en la figura 1 como franja 3, conteniendo la franja
1 marcadores de peso molecular que tienen los pesos moleculares
relativos indicados (en mDa). Los perfiles de plásmidos de las
cepas HD-1, HD-133 y
HD-11 se muestran como franjas 2, 4 y 5
respectivamente. En el caso de la cepa ABTS 1857, se observó que
cinco bandas de plásmido migraban detrás de la banda cromosómica y
que diez migraban antes, oscureciéndose parcialmente una de las
diez por el frotis cromosómico. De las nueve restantes, dos
migraron casi conjuntamente como un doblete. Se observó que el
perfil de plásmido de ABTS 1857 era único y claramente distinguible
de los de las tres cepas de referencia.
Se realizaron ensayos en invernadero y en el
campo para determinar la eficacia de un aislado bacteriano de la
invención en el control de plagas de lepidópteros significativas de
cultivos vegetales y, en particular, las plagas de Plutella
xylostella (ensayado en el campo) y Spodoptera exigua
(ensayada en el invernadero, después de infestar artificialmente
cada planta con 20 larvas cultivadas en laboratorio en la 2ª fase
larvaria). Se usó una variedad de especies de cultivo. El aislado,
B. thuringiensis ABTS 1857, se preparó como un polvo de
calidad técnica y se ensayó usando un diseño experimental de bloque
completo aleatorio con 6 a 8 réplicas. Los patrones para la
comparación fueron un polvo técnico de B. thuringiensis
kurstaki HD-1 preparado de una manera idéntica,
y DiPel® 2X WP (Abbott), un pesticida de B. thuringiensis
comercial. Las preparaciones pesticidas se aplicaron en el
invernadero con un pulverizador de aire comprimido en proporciones
que variaban de 0,5 a 4,8 mg/ml (recibiendo cada planta una
pulverización de 2 ml), y en el campo con un pulverizador de
mochila presurizado con CO_{2} en proporciones de 0,125 a 1,0
libras por acre, expresadas en cada caso como equivalentes de polvo
técnico.
Las actividades de las preparaciones se evaluaron
basándose en la mortalidad de las larvas de insectos o en la
reducción de la población después del tratamiento, y realizando
estimaciones de los cultivos cuando fuera apropiado. Los datos se
registraron no antes de 3 días después del tratamiento, y
típicamente a intervalos de 5 a 7 días cuando se realizaron
aplicaciones múltiples en ensayos estacionales. La Tabla 1
presentada a continuación muestran resultados representativos de
estos ensayos, en los que se evaluó la desfoliación en una escala
de 0 a 4, siendo el 4 una desfoliación completa.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Plaga diana \+ Cultivo \+ Tratamiento \+
Cantidad \+ % de \+ Desfoliación \cr \+ \+ \+
\+ Mortalidad \+\cr S. exigua \+ Remolacha \+ 1857 \+
0,5 \+ 89 \+ 0.68\cr \+ \+ \+ 1,0 \+ 99 \+ 0,36\cr \+ \+ \+ 2,0
\+ 100 \+ 0,0\cr \+ \+ HD-1 \+ 0,5 \+ 84 \+ 0,81\cr
\+ \+ \+ 1,0 \+ 95 \+ 0,68\cr \+ \+ \+ 2,0 \+ 96 \+ 0,13\cr \+
\+ DiPel® \+ 2,4 \+ 45 \+ 2,16\cr \+ \+ \+ 4,8 \+ 67 \+ 1,15\cr
S. exigua \+ Brassica \+ 1857 \+ 1,2 \+ 97 \+ 0,15\cr
\+ oleracea \+ \+ 2,4 \+ 100 \+ 0,04\cr \+
acephala \+\+\+\+\cr \+ \+ HD-1 \+ 1,2 \+ 78
\+ 0,75\cr \+ \+ \+ 2,4 \+ 91 \+ 0,44\cr \+ \+ DiPel® \+ 2,4 \+
61 \+ 0,78\cr \+ \+ \+ 4,8 \+ 73 \+ 0,74\cr P. xylostella
\+ Coliflor \+ 1857 \+ 0,125 \+ 48 \+ -\cr \+ \+ \+ 0,5 \+ 92 \+
-\cr \+ \+ HD-1 \+ 0,125 \+ 40 \+ -\cr \+ \+ \+
0,5 \+ 48 \+ -\cr \+ \+ DiPel® \+ 1,0 \+ 53 \+ -\cr P.
xylostella \+ Colza \+ 1857 \+ 0,125 \+ 62 \+ -\cr \+ \+ \+
0,5 \+ 78 \+ -\cr \+ \+ HD-1 \+ 0,125 \+ 23 \+ -\cr
\+ \+ \+ 0,5 \+ 40 \+
-\cr}
Estos datos demuestran que la cepa de ensayo ABTS
1857 tiene una actividad significativamente mayor contra larvas de
polilla dorso de diamante resistentes a piretroides y a B.
thuringiensis y el gusano de la remolacha en comparación con
la cepa convencional HD-1. Además, se descubrió que
la cepa de ensayo proporcionaba una protección de cultivos
comercialmente aceptable contra la polilla de dorso de diamante no
resistente, el gusano falso medidor de la col y el gusano de la col
importado, contra el que mostró una actividad al menos igual al de
productos de B. thuringiensis convencionales.
Los aislados y otros aspectos de la presente
invención se describen anteriormente en relación con las cepas de
B. thuringiensis que son principalmente de la subespecie
kurstaki y aizawai. Sin embargo, debe indicarse que
las técnicas descritas en este documento son aplicables a la
identificación y uso de nuevos aislados de B. thuringiensis
de cualquier tipo o serovariante.
Claims (18)
1. Un método para obtener un aislado bacteriano
de Bacillus thuringiensis que tiene una combinación de genes
incluyendo cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID que
codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxina de B. thuringiensis,
donde dicho aislado se caracteriza por el perfil de
plásmidos mostrado en la figura 1 franja 3 en comparación con el
marcador de peso molecular y los perfiles de plásmidos de las cepas
HD-1, HD-133, HD-11
mostradas en la figura 1 franjas 1, 2, 4, 5 respectivamente,
obtenidos por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8% en
tampón TBE, usando un conmutador Pulsewave® 760, donde el gel se
mantuvo a 4ºC procesado a 80 voltios durante 1 hora, se cubrió con
una película de plástico, y se procesó a 50 voltios durante 26
horas, teniendo los parámetros de forma de onda de inversión de
campo normal un tiempo A inicial de 9 segundos y un tiempo A final
de 60 segundos y donde la relación de inicio fue de 3 y el tiempo
de procesamiento de 26 horas,
comprendiendo dicho método (a) aislar entre
aislados de cepas de B. thuringiensis que contienen la
combinación de genes cryIA(a), cryIA(b), cryIC y
cryID que codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxinas, donde los genomas de dichas
cepas primero se ponen en contacto con una sonda marcada
generalizada capaz de hibridar con cada uno de dichos genes y se
detecta dicha sonda marcada hibridada con dicho gen, y (b)
seleleccionar aislados que tengan dicho perfil de plásmidos.
2. Un método para obtener una composición
pesticida que comprende un aislado bacteriano de Bacillus
thuringiensis o la combinación de endotoxinas obtenida a partir
del mismo, teniendo dicho aislado una combinación de genes que
incluyen cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID que
codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxina de B. thuringiensis,
donde dicho aislado se caracteriza por el perfil de
plásmidos mostrado en la figura 1 franja 3 en comparación con el
marcador de peso molecular y los perfiles de plásmidos de las cepas
HD-1, HD-133, HD-11
mostradas en la figura 1 franjas 1, 2, 4, 5 respectivamente,
obtenidos por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8%
en tampón TBE, usando un conmutador Pulsewave® 760 donde el gel se
mantuvo a 4ºC a 80 voltios durante 1 hora, se cubrió con una
película de plástico, y se procesó a 50 voltios durante 26 horas,
teniendo los parámetros de forma de onda de inversión de campo
normal un tiempo A inicial de 9 segundos y un tiempo A final de 60
segundos y donde la relación de inicio fue de 3 y el tiempo de
procesamiento de 26 horas,
comprendiendo dicho método (a) aislar entre
aislados de cepas de B. thuringiensis que contienen la
combinación de genes cryIA(a), cryIA(b), cryIC y
cryID que codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxinas, donde los genomas de dichas
cepas primero se ponen en contacto con una sonda marcada
generalizada capaz de hibridar con cada uno de dichos genes y se
detecta dicha sonda marcada hibridada con dichos genes, (b)
seleccionar aislados que tengan dicho perfil de plásmidos y (c) (i)
formular dicho aislado con un vehículo aceptable para preparar
dicha composición pesticida o (ii) obtener dicha combinación de
endotoxinas a partir de un cultivo de dicho aislado y formular
dichas combinaciones de toxinas con un vehículo aceptable para
preparar dicha composición pesticida.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, donde dicha sonda generalizada es
o fragmentos de la misma que tienen una longitud
suficiente como para hibridar de forma específica con las
secuencias génicas de B. thuringiensis de cryIA(a),
cryIA(b), cryIC y cryID que codifican para proteínas
\delta-endotoxina.
4. Un método para obtener un aislado bacteriano
de B. thuringiensis que tiene una combinación de genes
incluyendo cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID que
codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxina de B. thuringiensis,
donde dicho aislado se caracteriza por el perfil de plásmidos
mostrado en la figura 1 franja 3 en comparación con el marcador de
peso molecular y los perfiles de plásmidos de las cepas
HD-1, HD-133, HD-11
mostradas en la figura 1 franjas 1, 2, 4, 5 respectivamente,
obtenidos por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8%
en tampón TBE, usando un conmutador Pulsewave® 760, donde el gel se
mantuvo a 4ºC procesado a 80 voltios durante 1 hora, se cubrió con
una película de plástico, y se procesó a 50 voltios durante 26
horas, teniendo los parámetros de forma de onda de inversión de
campo normal un tiempo A inicial de 9 segundos y un tiempo A final
de 60 segundos y donde la relación de inicio fue de 3 y el tiempo
de procesamiento de 26 horas,
comprendiendo dicho método (a) aislar entre
aislados de cepas de B. thuringiensis que contienen la
combinación de genes cryIA(a), cryIA(b), cryIC y
cryID que codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxinas, donde los genomas de dichas
cepas se ponen en contacto con un conjunto de sondas marcadas
generalizadas capaces de hibridar con un gen diferente de dichos
genes y se detectan dichas sondas marcadas hibridadas con dichos
genes, y (b) seleccionar aislados que tengan dicho perfil de
plásmidos.
5. Un método para obtener una composición
pesticida que comprende un aislado bacteriano de Bacillus
thuringiensis o la combinación de endotoxinas obtenida a partir
del mismo, teniendo dicho aislado una combinación de genes que
incluyen cryIA(a), cryIA(b), cryIC y cryID que
codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxina de B. thuringiensis,
donde dicho aislado se caracteriza por el perfil de
plásmidos mostrado en la figura 1 franja 3 en comparación con el
marcador de peso molecular y los perfiles de plásmidos de las cepas
HD-1, HD-133, HD-11
mostradas en la figura 1 franjas 1, 2, 4, 5 respectivamente,
obtenidos por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8%
en tampón TBE, usando un conmutador Pulsewave® 760 donde el gel se
mantuvo a 4ºC procesado a 80 voltios durante 1 hora, se cubrió con
una película de plástico, y se procesó a 50 voltios durante 26
horas, teniendo los parámetros de forma de onda de inversión de
campo normal un tiempo A inicial de 9 segundos y un tiempo A final
de 60 segundos y donde la relación de inicio fue de 3 y el tiempo
de procesamiento de 26 horas,
comprendiendo dicho método (a) aislar entre
aislados de cepas de B. thuringiensis que contienen la
combinación de genes cryIA(a), cryIA(b), cryIC y
cryID que codifican para y expresados como proteínas
\delta-endotoxinas, donde los genomas de dichas
cepas se ponen en contacto con un conjunto de sondas marcadas
generalizadas capaces de hibridar con uno diferente de dichos genes
y se detectan dichas sondas marcadas hibridadas con dichos genes,
(b) seleccionar aislados que tengan dicho perfil de plásmidos y (c)
(i) formular dicho aislado con un vehículo aceptable para preparar
dicha composición pesticida o (ii) obtener dicha combinación de
endotoxinas a partir de un cultivo de dicho aislado y formular
dichas combinaciones de toxinas con un vehículo aceptable para
preparar dicha composición pesticida.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 ó
5 donde dichas sondas específicas de gen son
o fragmentos de los mismos con una longitud
suficiente para hibridar de forma específica con dicho
gen.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6
para obtener una aislado que carece del gen cryIA(c) donde
dichas sondas específicas de gen incluyen
para la identificación del gen cryIA(c),
significando la ausencia de detección de la SEC ID Nº 4 marcada
que dicho aislado carece del gen
cryIA(c).
8. Uso de un aislado bacteriano que puede
obtenerse de acuerdo con el proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 o la combinación de endotoxinas obtenidas a
partir de las mismas en la producción de composiciones pesticidas
que contienen una cantidad insecticidamente eficaz de dicho aislado
o endotoxinas, para la aplicación a un área sometida a infestación
por una plaga de insectos.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8,
donde dicho aislado bacteriano es eficaz contra una plaga de
insectos seleccionado entre el grupo compuesto por Spodoptera
frugiperda, S. Exigua, Plutella xylostella y
Trichoplusia ni.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8,
donde dicho aislado bacteriano carece del gen cryIA(c).
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 8,
donde dicho aislado bacteriano pertenece a la subespecie de B.
thuringiensis aizawai.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 8
donde dicho aislado es B. thuringiensis ATCC 69074, o un
mutante, recombinante o derivado modificado por ingeniería genética
del mismo que tiene las características de identificación descritas
en las reivindicaciones 1 a 7.
13. Una composición que comprende una cantidad
insecticidamente eficaz de un aislado bacteriano, que puede
obtenerse por el proceso de una cualquiera de la reivindicaciones de
1 a 7, o la combinación de endotoxinas obtenidas a partir del mismo,
en combinación con un vehículo aceptable.
14. La composición de acuerdo con la
reivindicación 13, donde dicho aislado bacteriano carece del gen
cryIA(c).
15. La composición de acuerdo con la
reivindicación 13, donde dicho aislado bacteriano pertenece a la
subespecie de B. thuringiensis aizawai.
16. La composición de acuerdo con la
reivindicación 13, donde dicho aislado es B. thuringiensis
ATCC 69074 o un mutante recombinante o derivado modificado por
ingeniería genética del mismo, que tiene las características de
identificación descritas en las reivindicaciones 1 a 7.
17. Un método para combatir plagas de insectos
tales como Spodoptera frugiperda, S. Exigua,
Plutella xylostella y Trichoplusia ni que comprende
aplicar a un área sometida a infestación una cantidad
insecticidamente eficaz de un aislado bacteriano que puede obtenerse
de acuerdo con el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7 o la combinación de endotoxinas obtenidas a partir del
mismo.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
17, donde dicho aislado es B. thuringiensis ATCC 69074, o un
mutante, recombinante o derivado modificado por ingeniería genética
del mismo que tiene las características de identificación descritas
en las reivindicaciones 1 a 7.
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