ES2198479T3

ES2198479T3 - Vectores que llevan genes terapeuticos codificantes de peptidos antimicrobianos para terapia genica.

Info

Publication number: ES2198479T3
Application number: ES96907398T
Authority: ES
Inventors: Walter H. Gunzburg; David Winder; Robert Michael Saller
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2016-03-08
Also published as: DE69627644D1; ATE238427T1; EP0817858B1; JPH11503305A; AU5103996A; WO1996028563A1; DE69627644T2; PT817858E; JP3908274B2; US7022319B1; DK0817858T3; EP0817858A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A VECTORES RETROVIRALES PORTADORES DE SECUENCIAS QUE CODIFICAN PEPTIDOS ANTIMICROBIANOS NATURALES O SUS DERIVADOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES EN MAMIFEROS, INFECCIONES VIRICAS TALES COMO INFECCION POR HIV E INFECCIONES BACTERIANAS Y FUNGICAS. EN PARTICULAR, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A VECTORES RETROVIRALES QUE SUFREN CONVERSION DE PROMOTOR (VECTORES PROCON) PORTADORES DE DICHAS SECUENCIAS. PUESTO QUE ESTOS VECTORES SON TAMBIEN PORTADORES DE ELEMENTOS REGULADORES ESPECIFICOS DE VIRUS O DE TUMOR, EL PEPTIDO ANTIMICROBIANO TERAPEUTICO SERA TRANSPORTADO Y EXPRESADO UNICAMENTE EN LAS CELULAS RELEVANTES AFECTADAS Y NO EN CELULAS INOCENTES ADYACENTES.

Description

Vectores que llevan genes terapéuticos codificantes de péptidos antimicrobianos para terapia génica.

La presente invención se refiere a vectores recombinantes que contienen secuencias que codifican péptidos antimicrobianos existentes en la naturaleza. En particular, la presente invención se refiere a vectores retrovirales. Además, la presente invención se refiere a vectores retrovirales que experimentan una conversión de promotor (vectores Procon), que contienen dichas secuencias. Dado que dichos vectores también contienen elementos reguladores específicos de tumor o de virus, los péptidos antimicrobianos terapéuticos sólo se distribuirán y expresarán en las células relevantes afectadas y no en células espectadoras inocentes.

Antecedentes de la invención

El principal objetivo de la terapia génica es la introducción de genes terapéuticos en células para el tratamiento de enfermedades tan diversas como las resultantes de defectos genéticos, del cáncer y de infecciones virales. El cáncer y las enfermedades tales como el SIDA, proveniente de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), son particularmente difíciles de tratar, aunque están en marcha un gran número de protocolos clínicos que utilizan aproximaciones basadas en la terapia génica. El péptido anfipático melitina, el componente principal del veneno de abeja, ha mostrado tener actividad selectiva anticancerígena (Sharma, 1992; Sharma, 1993) y anti-HIV (Wachinger et al., 1992); la patente U.S. Nº 4,822,608 de Benton et al. y la solicitud de patente WO 91/08753 de Erfle et al. hacen referencia a estas propiedades terapéuticas. La patente U.S. Nº 4,822,608 publicada por Benton et al. el 18 de abril de 1989 y titulada ``Métodos y composiciones para el tratamiento de infecciones de mamíferos utilizando medicamentos que comprenden veneno de himenópteros o componentes proteínicos o polipeptídicos del mismo'' divulga que los agentes secundarios derivados de la naturaleza, como por ejemplo el veneno de himenópteros o los componentes proteínicos o polipeptídicos del mismo, tienen un efecto potenciador sobre agentes antibacterianos. Esta referencia sugiere además que tales composiciones pueden tener también efectos anti-virales, carcinoestáticos o anti-carcinogénicos potenciados sobre diferentes enfermedades. Más particularmente, la referencia de Benton et al. describe la utilización de la melitina, que es el componente principal de la toxina de la abeja de la miel, en combinación con un agente antibiótico seleccionado por su actividad antibacteriana contra infecciones predeterminadas. Además, esta referencia divulga que puede conseguirse un beneficio sinergístico combinando la melitina y antibióticos seleccionados en diversas cantidades efectivas terapéuticamente.

La solicitud de patente WO 91/08753 de Erfle et al. se refiere a un procedimiento y una composición para el tratamiento de infecciones de HIV en mamíferos que emplea veneno de himenópteros o los componentes proteínicos o polipeptídicos del mismo y que se introduce en los huéspedes mamíferos y que se puede ajustar individualmente para restringir o inhibir sustancialmente la replicación vírica en las células del mamífero infectadas por HIV.

En estos estudios, se añadió el péptido purificado de melitina a células en cultivo, pero aunque éste es útil a nivel experimental, no es relevante para terapia. Incluso la administración in vivo de la proteína purificada de la melitina (por ejemplo i.v.) no es aconsejable, probablemente debido a las concentraciones relativamente elevadas y a las repetidas dosis que se requerirían para mantener los niveles terapéuticos. Además, dado que este tipo de distribución generalizada provocaría que el péptido anfipático no alcanzara sólo las células diana sino también otras células, provocando así potencialmente efectos laterales no deseados, sería ventajoso poder dirigir la distribución de la melitina u otros péptidos antimicrobianos, en particular el péptido de la melitina y los péptidos mencionados más abajo.

Una segunda clase de genes terapéuticos de interés son las cecropinas, aisladas de las crisálidas de las polillas de seda gigantes (Boman 1995, Hultmark et al, 1980). Existen tres cecropinas principales, A, B y D, con una estructura similar a la de la melitina (Hultmark et al, 1982). Las cecropinas A y B muestran una actividad antibacteriana específica sin que se manifiesten efectos dañinos sobre las células de mamífero (Steiner et al., 1981). Recientemente, Moore y cotrabajadores demostrado que los péptidos antibacterianos de la cecropina: B, P y Shiva-1 muestran actividad antibacteriana contra diversas líneas celulares tumorales (Moore et al. 1994).

Las cecropinas se aislaron inicialmente a partir de la hemolinfa de la polilla de seda gigante, Hyalophora cecropia, tras la inducción por bacterias no patogénicas vivas. Las principales cecropinas de insecto (A, B y D) tienen de 35 a 37 residuos de longitud, carecen de cisteína y tienen un extremo N-terminal unido al extremo C-terminal neutro mediante una unión glicina-prolina flexible. La estructura general de la cecropina A deducida a través de RMN son dos segmentos anfipáticos casi perfectos unidos por una bisagra Gly-Pro. Un péptido de 31 residuos similar a la cecropina (cecropina P1), aislado del intestino delgado de un cerdo (Lee et al., 1989), sugiere que las cecropinas pueden estar extendidas en el reino animal. Se cree que el mecanismo de acción de las cecropinas implica la formación de canales en membranas y una posterior lisis.

El SB-37 (un análogo cercano a la cecropina B) y el Siva-1 (un análogo de la cecropina B que comparte aproximadamente un 40% de homología de secuencia y mantiene la misma distribución de carga e hidrofobicidad que el péptido) han demostrado ser capaces de lisar diferentes leucemias de mamífero y líneas celulares de linfoma in vitro. Efectos antitumorales similares se han demostrado para las magaininas, un grupo relacionado de péptidos antimicrobianos (Cruciani et al., 1991; Ohaski et al., 1992).

La utilización de vectores retrovirales (RV) para la terapia génica ha recibido una gran atención y es el procedimiento actual de elección para transferir genes terapéuticos en diversos protocolos aprobados en los EEUU y en Europa (Kotani et al., 1994). Sin embargo, la mayoría de estos protocolos requieren que la infección de las células diana por el RV que contiene el gen terapéutico tiene lugar in vitro, y las células infectadas con éxito se devuelven después al individuo afectado (Rosenberg et al., 1992; para un artículo de revisión véase Anderson, 1992). Dichos protocolos de terapia génica ex vivo son ideales para la corrección de afecciones médicas en las cuales la población de células diana puede aislarse fácilmente (por ejemplo linfocitos). Adicionalmente, la infección ex vivo de las células diana permite la administración de grandes cantidades de virus concentrado que pueden analizarse rigurosamente a nivel de seguridad antes de su utilización.

Desafortunadamente, sólo una pequeña porción de las posibles aplicaciones de la terapia génica implican células diana que pueden aislarse fácilmente, cultivarse y después reintroducirse. Adicionalmente, la compleja tecnología y los elevados costes asociados a la terapia génica ex vivo impiden realmente su utilización a nivel universal. Futuras terapias génicas fáciles y rentables requerirán una aproximación in vivo en la cual el vector viral, o las células que producen el vector viral, se administren directamente al paciente en forma de una inyección o implantación simple de células productoras de RV.

Este tipo de aproximación in vivo introduce, evidentemente diversos problemas nuevos. En primer lugar, y ante todo, debe hacerse referencia a consideraciones de seguridad. Se producirá un virus, posiblemente a partir de una implantación de células productoras de virus, y no habrá oportunidad de analizar previamente el virus producido. Es importante ser consciente del riesgo finito implicado en la utilización de dichos sistemas, así como tratar de producir nuevos sistemas que minimicen este riesgo.

La integración esencialmente al azar de la forma pro-vírica del genoma retroviral en el genoma de la célula infectada condujo a la identificación de un gran número de proto-oncogenes celulares gracias a su activación insercional (Varmus, 1988). La posibilidad de que un mecanismo similar pueda provocar cánceres en pacientes tratados con RVs que contienen genes terapéuticos destinados a tratar otras afecciones médicas pre-existentes, ha planteado un problema ético recurrente. La mayoría de los investigadores estarían de acuerdo en que la probabilidad de que un RV defectivo en cuanto a replicación, como por ejemplo los utilizados habitualmente, se integre en un gen celular o cerca de un gen celular implicado en el control de la proliferación celular, es muy pequeña. Sin embargo, también se asume generalmente que la expansión explosiva de una población de retrovirus competente para la replicación a partir de un solo acontecimiento de infección, proporcionará eventualmente suficientes acontecimientos de infección como para que dicha integración fenotípica sea una posibilidad muy real.

Los sistemas de vectores retrovirales se optimizan para minimizar la posibilidad de que se presente una replicación de virus competentes. Sin embargo, está bien documentado el hecho de que los acontecimientos de recombinación entre los componentes del sistema RV pueden conducir a la generación de virus competentes para la replicación potencialmente patogénicos y se ha construido un gran número de generaciones de sistemas vectoriales para minimizar este riesgo de recombinación (artículo de revisión en Salmons y Günzburg, 1993). Sin embargo, se conoce poco sobre la probabilidad finita de estos acontecimientos. Dado que no será nunca posible reducir el riesgo asociado a este u otros sistemas vectoriales a cero, se tendrá que tomar siempre una decisión fundamentada sobre el riesgo-beneficio. Así, se hace muy importante determinar empíricamente la probabilidad de (1) la disrupción o activación insercional de genes aislados a través de la integración del retrovirus y (2) el riesgo de generación de virus competentes para la replicación por recombinación en generaciones actuales de líneas celulares ensambladoras. Un examen detallado del mecanismo a través del cual tienen lugar estos acontecimientos permitirá también la construcción de nuevos tipos de sistemas diseñados para limitar estos acontecimientos.

Una consideración adicional sobre práctica de la terapia génica in vivo, en cuanto a consideraciones de seguridad y también desde un punto de vista de eficiencia y desde un punto de vista puramente práctico, es dirigir la expresión de los RVs. Está claro que los genes terapéuticos incluidos en los vectores no deberían expresarse de forma indiscriminada en todos los tejidos y células, sino preferentemente sólo en la célula diana precisa. Esto es especialmente importante si los genes a transferir son genes de toxina que tienen como objetivo suprimir células tumorales específicas. La supresión de otras células diferentes de las diana sería obviamente muy indeseable. La expresión dirigida de los genes terapéuticos contenidos puede conseguirse mediante diversos medios.

Los sistemas vectoriales retrovirales consisten en dos componentes (Fig. 1):

1) El propio vector retroviral es un retrovirus modificado (vector plasmídico) en el cual los genes que codifican las proteínas víricas se han substituido por los genes terapéuticos, incluyéndose opcionalmente genes marcadores para transferir a la célula diana. Dado que la substitución de los genes que codifican las proteínas víricas inutiliza efectivamente el virus, éste debe rescatarse mediante el segundo componente del sistema que proporciona las proteínas víricas que faltan en el retrovirus modificado.

El segundo componente es:

2) una línea celular que produce grandes cantidades de las proteínas víricas, pero que carece de la capacidad de producir virus competentes para la replicación. Esta línea celular se conoce como la línea celular ensambladora y consiste en una línea celular transfectada con un segundo plásmido que contiene los genes que permiten que el vector retroviral modificado se ensamble. Este plásmido dirige la síntesis de las proteínas víricas necesarias requeridas para la producción del virión.

Para generar el vector ensamblado, el vector plasmídico se transfecta en la línea celular ensambladora. Bajo estas condiciones, el genoma retroviral modificado, que incluye genes terapéuticos insertados y genes marcadores opcionales, se transcribe a partir del vector plasmídico y se ensambla en las partículas retrovíricas modificadas (partículas víricas recombinantes). Una célula infectada con dichas partículas virales recombinantes no puede producir nuevos vectores virales dado que no están presentes las proteínas víricas en estas células. Sin embargo, el vector que contiene los genes terapéuticos y genes marcadores está presente y estos pueden expresarse ahora en la célula infectada.

Objetos de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcional un nuevo agente terapéutico con actividades antitumorales, antivíricas, antibacterianas y/o antifúngicas.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un nuevo agente terapéutico con alta selectividad para células diana seleccionadas y reducidos efectos laterales no deseados.

La invención

Para conseguir los objetos anteriores y otros, la presente invención proporciona un vector recombinante para introducir ADN en una célula eucariótica, comprendiendo dicho vector, en unión operativa,

a): El ADN de, o correspondiente a, al menos una porción de un vector retroviral, siendo capaz dicha porción de infectar y dirigir la expresión en las células diana; y

b): Una o más secuencias codificadoras en las cuales al menos una secuencia codifica al menos un péptido antimicrobiano terapéutico presente en la naturaleza o un derivado del mismo, en el cual la secuencia que codifica el péptido antimicrobiano terapéutico presente en la naturaleza o el derivado del mismo, codifica la secuencia de aminoácidos de la melitina, premelitina, prepromelitina, cecropina, prececropina, preprocecropina, magainina y/o un homólogo, un recombinante y/o una combinación de los mismos, de dichos péptidos antimicrobianos, o en el cual el derivado de la melitina incluye una hélice anfifílica con o sin péptido señal y dominios de activación, o en el cual el derivado de la melitina es

Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Gly.

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, la secuencia que codifica un péptido antimicrobiano terapéutico codifica un veneno de himenópteros, al menos un componente proteínico activo de un veneno de himenópteros, al menos un componente polipeptídico de un veneno de himenópteros y las mezclas de los mismos.

El gen de himenóptero se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en genes que codifican el veneno de la abeja de la miel, el veneno de la abeja, el veneno de abejorro, el veneno de avispón amarillo, el veneno del avispón de cara blanca, los componentes de proteína activa de dicho veneno, los componentes proteínicos activos de dicho veneno y las mezclas de los mismos.

Además, los derivados de la melitina incluyen una hélice anfifílica con o sin péptido señal y dominios de activación.

En una realización preferida, el vector recombinante se selecciona entre vectores virales y plasmídicos. Algunos ejemplos de vectores virales son los vectores virales de ARN y ADN. Particularmente se prefiere un vector retroviral, más particularmente un vector procon, como vector viral de ARN,. Algunos ejemplos de vectores virales de ADN son los adenovirus, los virus asociados a adenovirus y los vectores derivados de los virus herpes. Los vectores plasmídicos incluyen todos los vectores de expresión eucarióticos.

En una realización preferida de la invención, el vector recombinante es un vector retroviral.

El genoma retroviral consiste en una molécula de ARN con la estructura R-U5-gag-pol-env-U3-R (Fig. 1). Durante el proceso de retrotranscripción, la región U5 se duplica y sitúa en el extremo derecho del ADN generado, mientras que la región U3 se duplica y se sitúa en el extremo izquierdo de la molécula de ADN generada (Fig. 1). La estructura resultante U3-R-U5 se denomina LTR (Long Terminal Repeat - repetición terminal larga -) y por lo tanto es idéntica y está repetida en ambos extremos de la estructura de ADN o provirus. La región U3 en el extremo izquierdo del provirus aloja el promotor. Este promotor dirige la síntesis de un transcripto de ARN que se inicia en el límite entre las regiones izquierda U3 y R y que termina en el límite entre la región derecha R y U5 (Fig. 1). El ARN se ensambla en partículas retrovíricas y se transporta a la célula diana a infectar. En la célula diana, el genoma de ARN se retrotranscribe de nuevo tal y como se ha descrito más arriba.

De acuerdo con otra realización de la invención, puede construirse un vector de conversión de promotor (vector procon) en el cual la región derecha U3 está alterada (Fig. 3), pero se mantiene la estructura izquierda U3 normal (Fig. 3); el vector puede transcribirse normalmente en ARN utilizando el promotor retroviral normal localizado en la región izquierda U3 (Fig. 3). Sin embargo, el ARN generado sólo contendrá la estructura derecha U3 alterada. En la célula diana infectada, después de la retrotranscripción, esta estructura U3 alterada se situará en ambos extremos de la estructura retrovírica (Fig. 3).

Si la región alterada acarrea un poliligador en vez de la región U3, entonces puede insertarse fácilmente cualquier promotor, incluyendo aquellos que dictan una expresión específica de tejido, como por ejemplo el promotor WAP. Este promotor se utilizará entonces exclusivamente en la célula diana para la expresión de genes unidos transportados en el vector retroviral. Alternativamente o adicionalmente, pueden insertarse en el poliligador segmentos de ADN homólogos a una o más secuencias celulares con el objetivo de dirigir la expresión del gen.

En la línea celular ensambladora, la expresión del vector retroviral está regulada entonces por el promotor retroviral no selectivo normal (Fig. 3). Sin embargo, tan pronto como el vector entra en la célula diana tiene lugar la conversión de promotor y los genes terapéuticos se expresan a partir de un promotor de elección específico de tejido introducido en el poliligador (Fig. 3). No sólo puede incluirse virtualmente cualquier promotor específico de tejido, haciendo factible la expresión selectiva en una amplia variedad de diferentes tipos celulares, sino que adicionalmente, tras el acontecimiento de conversión, la estructura y propiedades del vector retroviral no se asemejan más a la de un virus. Esto, evidentemente, tiene consecuencias extremadamente importantes desde el punto de vista de seguridad, dado que los vectores retrovirales ordinarios o del estado de la técnica, experimentan fácilmente una recombinación genética con el vector ensamblador produciendo virus potencialmente patogénicos. Los vectores de conversión de promotor (Procon) no asemejan los retrovirus porque ya no contienen promotores retrovirales U3 después de la conversión, reduciéndose así la posibilidad de que tenga lugar una recombinación génica cuando están insertados en el poliligador con el objetivo de dirigir la expresión del gen.

Para una completa descripción de los vectores procon, se incluye completamente en este punto de la presente invención el contenido de la patente danesa DK 1017/94, registrada el 2 de septiembre de 1994.

De este modo, en una realización preferida adicional de la invención se proporciona un vector retroviral que experimenta conversión de promotor (vector procon) que comprende una región 5'LTR de estructura U3-R-U5; una o más secuencias codificadoras donde al menos una de dichas secuencias codificadoras codifica un péptido antimicrobiano presente en la naturaleza o un derivado del mismo (parte, un análogo, un homólogo, recombinantes o una combinación de los mismos, de dicho gen antimicrobiano) para el tratamiento de al menos una enfermedad seleccionada a partir de tumores de mamíferos, infecciones víricas, infecciones bacterianas e infecciones fúngicas; y una región 3'LTR que comprende una región U3 completa o parcialmente deleccionada en la cual dicha región U3 deleccionada se substituye por una secuencia poliligadora, seguida por la región R y R5.

Y en una realización preferida adicional se proporciona un vector retroviral donde dicho vector retroviral incluye, en unión operativa, una región 5'LTR y una región 3'LTR, comprendiendo dicha región 5'LTR la estructura U3-R-U5 y comprendiendo dicha región 3'LTR una región U3 deleccionada completa o parcialmente, donde dicha región U3 se substituye por una o más de dichas secuencias codificadoras donde al menos una secuencia codifica al menos un péptido antimicrobiano terapéutico presente en la naturaleza o un derivado del mismo para el tratamiento de al menos una enfermedad, seleccionada entre tumores de mamíferos, infecciones víricas, bacterianas y fúngicas, expresado a partir de un promotor viral o heterólogo, seguido por la región R y U5.

De acuerdo con la invención, el término ``poliligador'' se utiliza para denominar una extensión corta de ADN sintetizado artificialmente que contiene un gran número de dianas de restricción únicas, permitiendo la inserción fácil de cualquier promotor o segmento de ADN. El término ``heterólogo'' se utiliza para denominar cualquier combinación de secuencias de ADN que no se encuentran normalmente asociadas de forma íntima en la naturaleza.

En referencia a los vectores procon, dicha secuencia poliligadora contiene al menos una diana de restricción única y contienen preferentemente al menos una inserción de un fragmento de ADN heterólogo. Dicho fragmento de ADN heterólogo se selecciona preferentemente entre elementos reguladores y promotores, preferentemente que sean específicos para la célula diana en cuanto a su expresión. La estructura del promotor retroviral se denomina LTR. Los LTRs contienen señales que les permiten entrar y salir del genoma de la célula diana. Dichos elementos transposables por ``salto'' pueden contribuir también a cambios patogénicos. Los vectores procon pueden contener LTRs modificados que ya no contienen las señales requeridas para el ``salto''. Esto incrementa de nuevo la seguridad potencial de estos sistemas vectoriales.

La expresión génica se regula mediante promotores. En ausencia de la función promotora, no se expresará un gen. El promotor retroviral MLV normal es poco selectivo dado que está activo en la mayoría de tipos celulares. Sin embargo, existe un gran número de promotores que muestran actividad sólo en tipos celulares muy específicos. Dichos promotores específicos de tejido serán los candidatos ideales para la regulación de la expresión génica en vectores retrovirales, limitando la expresión de los genes terapéuticos en células diana específicas.

Los elementos reguladores y promotores específicos para la célula diana son preferentemente, a modo no limitativo, un elemento o más del grupo que consiste en los elementos reguladores y promotores específicos de la Proteína Acídica del Suero (WAP), el Virus del Tumor de Mama de Ratón (MMTV), la \beta-lactoglobulina y la caseína, que pueden utilizarse para dirigir la expresión en tumores de mama humana; los elementos reguladores y promotores específicos para el páncreas, que incluyen elementos reguladores y promotores de la anhidrasa carbónica II y la \beta-glucoquinasa; los elementos reguladores y promotores específicos para linfocitos, incluyendo el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), de la inmunoglobulina; y los elementos reguladores y promotores específicos linfocíticos del MMTV y los elementos reguladores y promotores específicos del MMTV como por ejemplo ^{MMTV}P2, que confieren la capacidad de respuesta a hormonas glucocorticoides o que dirigen la expresión en la glándula mamaria; los elementos reguladores y promotores específicos para células T como por ejemplo el gen receptor de células T y el promotor del receptor CD4 y los elementos reguladores y promotores específicos de células B como por ejemplo el promotor de la inmunoglobulina y mb1. Dichos elementos reguladores y promotores regulan preferentemente la expresión de al menos una de las secuencias codificadoras de dicho vector retroviral.

Las regiones LTR se seleccionan preferentemente, a modo no limitativo, entre al menos un elemento del grupo que consiste en LTR's del Virus de la Leucemia Murina (MLV), el Virus del Tumor de Mama de Ratón (MMTV), el Virus del Sarcoma Murino (MSV), el Virus de a Inmunodeficiencia Simia (SIV), el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), el Virus de la Leucemia de Células T Humanas (HTLV), el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (FIV), el Virus de la Leucemia Felina (FELV), el Virus de la Leucemia Bovina (BLV) y el Virus de Mono Mason-Pfizer (MPMV).

Los genes antimicrobianos de la presente invención se situarán bajo el control transcripcional de por ejemplo el promotor HIV o un promotor mínimo situado bajo la regulación del elemento de respuesta a HIV tat (TAR) para target células infectadas por HIV. El targeting se conseguirá debido a que el promotor HIV depende de la presencia de Tat, una proteína autoreguladora codificada por el HIV (Haseltine, 1991). Así, sólo las células infectadas por HIV y que por lo tanto expresan Tat serán capaces de producir el péptido anfipático introducido en el vector Procon (Fig. 2). Alternativamente, el péptido anfipático podría expresarse a partir de promotores específicos de células T como por ejemplo el gen del receptor de células T o CD4. Para target las células diana, pueden utilizarse promotores de genes de los que se sabe que están sobreexpresados en estas células (por ejemplo c-myc, c-fos).

Los genes antimicrobianos de la presente invención pueden situarse también bajo el control transcripcional de otros promotores conocidos en el estado de la técnica. Algunos ejemplos de dichos promotores son el grupo de SV40, el citomegalovirus, el virus del sarcoma de Rous, la \beta-actina, el HIV-LTR, el MMTV-LTR, los promotores específicos de células T y los promotores específicos de tumor.

El vector retroviral en una de las realizaciones de la invención es un vector BAG (Price et al., 1987), pero también incluye otros vectores retrovirales.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, al menos una secuencia retrovírica que codifica una proteína retrovírica implicada en la integración de retrovirus está alterada o al menos parcialmente deleccionada.

Dicho fragmento de ADN heterólogo es preferentemente homólogo a una o más secuencias celulares. Los elementos reguladores y promotores se regulan preferentemente mediante moléculas trans-actoras.

En otra realización preferida de la invención, se proporciona un sistema vectorial retroviral que comprende un vector retroviral tal y como se ha descrito más arriba como un primer componente y una línea celular ensambladora que hospeda al menos una construcción retrovírica o retrovírica recombinante que codifica proteínas requeridas para que dicho vector retroviral se ensamble.

La línea celular ensambladora hospeda construcciones retrovíricas o retrovíricas recombinantes que codifican aquellas proteínas retrovíricas que no están codificadas en dicho vector retroviral. La línea celular ensambladora se selecciona preferentemente entre un elemento del grupo que consiste en \Psi-2, \Psi-Crip, \Psi-AM, GP+E-86, PA317 y GP+envAM-12.

Después de replicarse, el vector retroviral de la invención tal y como se ha descrito más arriba en un sistema vectorial retroviral tal y como se ha descrito más arriba, se proporciona un provirus retroviral donde dicho poliligador y cualquiera de las secuencias insertadas en dicho polímero en el 3'LTR se duplica durante el proceso de retrotranscripción en la célula target infectada y aparece también en el 5'LTR de la misma manera que en el 3'LTR del provirus resultante.

El vector retroviral de la invención se refiere a un vector retroviral de secuencia de ADN a nivel de secuencia de ADN.

Sin embargo, la invención incluye también un provirus retroviral y ARNm de un provirus retroviral de acuerdo con la invención y cualquier ARN proveniente de un vector retroviral de acuerdo con la invención y los ADNc de los mismos.

Otra realización de la invención proporciona un procedimiento no-terapéutico o terapéutico para introducir secuencias nucleotídicas homólogas y/o heterólogas en células humanas o animales in vitro, que comprende transfectar una línea celular ensambladora de un sistema vectorial retroviral de acuerdo con la invención con un vector retroviral de acuerdo con la invención e infectar una población de células diana con retrovirus recombinantes producidos por la línea celular ensambladora. Las secuencias nucleotídicas se seleccionan entre uno o más de los elementos del grupo que consiste en genes o partes de genes que codifican péptidos antimicrobianos terapéuticos, secuencias reguladoras y promotores.

El vector retroviral, el sistema vectorial retroviral y el provirus retroviral, así como el ARN de los mismos, se utilizan para producir una composición farmacéutica para la terapia génica somática en mamíferos, incluidos los humanos. Además, se utilizan para la integración dirigida en secuencias celulares homólogas.

Principio para la construcción de vectores ProCon para dirigir la expresión génica

En el vector del virus de la leucemia murina (MLV) conocido como BAG (Price et al., 1987), el gen de la \beta-galactosidasa está bajo el control del promotor promíscuo (es decir, no específico de tejido) MLV en la región U3 del LTR (Fig. 3). De acuerdo con una realización de la presente invención, se ha construido un derivado del vector BAG en el cual el promotor MLV (U3) localizado en el 3'LTR (Fig. 3) se ha deleccionado y se ha reemplazado por un poliligador, permitiendo dicho poliligador la fácil introducción de promotores heterólogos. El vector BAG que carece de U3 se expresa a partir del promotor MLV (U3) en el 5'LTR cuando se introduce en una línea celular ensambladora. Como resultado de las reorganizaciones que tienen lugar en el genoma retroviral durante su ciclo de vida, después de la infección de su célula diana, el poliligador se duplicará en ambos extremos del genoma retroviral tal y como se describe más arriba. De esta manera puede construirse un vector retroviral en el cual la expresión del gen de la \beta-galactosidasa de BAG esté controlada por el poliligador o cualquier promotor insertado en el poliligador en la célula diana (Fig. 3).

Además, el reemplazo de la \beta-galactosidasa por un gen terapéutico como por ejemplo uno que codifica la melitina, la cecropina o cualquier péptido antimicrobiano, dará como resultado un vector que puede manipularse para expresar este gen a partir de cualquier promotor insertado.

Los vectores Procon que contienen promotores y elementos reguladores específicos de tejido como por ejemplo el elemento de respuesta tat (TAR) del HIV, serán útiles para dirigir la expresión de las secuencias de péptidos antimicrobianos terapéuticos presentes en la naturaleza o derivados de los mismos en tipos celulares, tejidos y órganos predeterminados. Algunas secuencias potencialmente terapéuticas incluyen la melitina, que tienen efectos anti-HIV y anti-tumorales, secuencias de la cecropina y megainina y las secuencias que dictan la muerte celular, incluyendo los genes de la timidina quinasa, de la guanina fosforibosiltransferasa y de la citosina desaminasa.

Los dibujos

Figura 1 Forma de retrotranscripción de un retrovirus.

Figura 2 Construcciones vectoriales retrovíricas que contienen secuencias que codifican la melitina y la cecropina.

Figura 3 Construcción del vector BAG desprovisto de U3.

Figura 4 La construcción del vector retroviral p125.Cecr.A que contiene el gen de PreProCecropina.

Figura 5 La construcción de los vectores retrovirales pBAGpMel y pBAGppMel que contienen, respectivamente, el gen de la PreMelitina y el gen de la PreProMelitina.

Figura 6 pBAGpMel y pBAGppMel.

Figura 7 pBAG.

Figura 8 Principio del análisis S1 de los clones transfectados con Cecropina y Melitina.

Figura 9 Análisis S1: electroforesis en gel PAGE y exposición mediante el sistema de imagen de fósforo.

Figura 10 Actividad antitumoral de los vectores retrovirales que contienen secuencias codificadoras de la PreProCecropina.

Figura 11 Actividad antitumoral de los vectores retrovirales que contienen secuencias codificadoras de la Melitina.

Figura 12 Regulación descendente de la expresión del LTR del HIV en vectores retrovirales que contienen secuencias codificadoras de la Cecropina y la Melitina.

Figura 13 Regulación descendente de la expresión de LTR de HIV de vectores retrovirales que contienen secuencias codificadoras de la Cecropina.

Figura 14 Regulación descendente de la expresión de LTRs del Virus de Tumor de Mama de Ratón (MMTV) por vectores retrovirales que contienen secuencias codificadoras de la Cecropina y la Melitina.

Los siguientes ejemplos ilustrarán mejor la invención. Sin embargo, de ninguna manera se ofrecen estos ejemplos a modo limitativo del alcance de la presente invención, dado que serán evidentes algunas modificaciones obvias, e incluso serán evidentes para un experto medio en la técnica otras modificaciones y substituciones.

Los métodos de ADN recombinante empleados en la práctica de la presente invención son procedimientos estándar bien conocidos por los expertos medios en la técnica, y están descritos en detalle, por ejemplo, en ``Molecular Clona'' - Clonación Molecular -, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) y B. Perbal, ``A Practical Guide to Molecular Clona'' - Una Guía Práctica de Clonación Molecular -, John Wiley & Sons (1984).

Ejemplos Construcción de vectores retrovirales que contienen la secuencia de la PreCecropina A Construcción de p125gal

En el vector retroviral del virus de la leucemia murina (MLV) conocido como BAG (Price et al., 1987), el gen de la \beta-galactosidasa está bajo el control del promotor promíscuo (es decir, no específico de tejido) MLV en la región U3 del LTR (Fig. 3). Se ha construido un derivado del vector BAG en el cual el promotor MLV (U3) localizado en el 3'LTR (Fig. 3) se ha deleccionado mediante PCR. En esta posición se ha insertado un poliligador que contiene las dianas de restricción SacII y MluI, permitiendo la fácil introducción de los promotores heterólogos. El vector BAG que carece de U3 se expresa a partir del promotor MLV (U3) en el 5'LTR cuando se introduce en una línea celular ensambladora. Como resultado de las reorganizaciones que tienen lugar en el genoma retroviral durante su ciclo de vida, después de la infección de su célula diana, el poliligador se duplicará en ambos extremos del genoma retroviral tal y como se describe en la solicitud de patente danesa Nº 1017/94. De esta manera puede construirse un vector retroviral en el cual la expresión del gen de la \beta-galactosidasa de BAG esté controlada por el poliligador o cualquier promotor insertado en el poliligador en la célula diana (Fig. 3).

La región U3 (mtv-2) del Virus de Tumor de Mama de Ratón (MMTV) sin las repeticiones invertidas, que contiene los promotores MMTV así como la región que confiere la capacidad de respuesta frente a hormonas glucocorticoides y una región que contiene un elemento que dirige la expresión de la glándula mamaria, se inserta en la región poliligadora del vector BAG modificado, obteniéndose p125gal (Fig. 4a).

Construcción de p125CecrA

La Figura 4 ilustra la construcción de un vector retroviral p125CecrA. El plásmido pCecrA (obtenido por Boman et al.) e ilustrado en la Fig. 4a, contiene el ADNc del gen de la PreProCecropina A de la polilla de seda gigante (Hyaophora cecropia) clonado frente al promotor sp6 bacteriano. La secuencia de la PreProCecropina se obtuvo mediante amplificación por PCR de este plásmido utilizando los siguientes cebadores:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Cebador 1: \+ CecrA1
5'-TATGACGTC-TCGTTAGAACGCGGCT-3'\cr
 Cebador 2: \+ CecrA3
5'-GGCAGATCT-TAAATGTATCATGCAAT-3'\cr}

CecrA1 contiene una diana de restricción para AatII (GACGTC) en la extensión 5' con una protección de 3 pares de bases (TAT). De forma similar, CecrA3 contiene una diana de restricción para BglII (AGATCT) en la extensión 5' con una protección de 3 pares de bases (GGC).

A continuación, el producto de PCR (370 pb) se digirió con AatII y BglII para hacer que las dianas de restricción fueran adecuadas para la clonación (Fib 4b).

Se digirió P125gal con las enzimas de restricción AatII y BamHI, obteniéndose un fragmento de 5043 pares de bases (Fig. 4b) y se ligó al fragmento que contiene el gen de la PreProCecropina A de pCercA. Esto dio como resultado la formación de p125.CercA (Fig. 4c), perdiéndose las dianas de restricción BamHI/BglII.

Construcción de vectores retrovirales que contienen la secuencia de la PreProMelitina y la PreMelitina

La Figura 5 ilustra la construcción de los vectores retrovirales pBAGpMel y pBAGppMel. El plásmido pUM13/4 (Vlasak, R., Uger-Ullmann, C., Keil, G. y Frischauf, A-M, ``Nucleotide sequences of cloned cDNA coding for honeybee prepromelittin'' - Secuencia nucleotídica del ADNc clonado que codifica la prepromelitina de la abeja de la miel -, Eur. J. Biochem. 135:123-126 (1989)) (Fig. 5a), contiene el ADNc que codifica el gen de la PreProMelitina de la apis mellifera. La secuencia de la PreProMelitina y la PreMelitina se obtuvieron mediante amplificación por PCR utilizando los siguientes cebadores:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Cebador 1: \+
5'-ATAGACGTC-AAGGAAGGAAGCGATCGGA-3'\cr
 Cebador 2: \+
5'-TATGGATCC-AACCCTGTTGCCTCTTACG-3'\cr
 Cebador 3: \+
5'-TCTTACATCTATGCG-GGAATTGGAGCAGTTCTGAA-3'\cr
 Cebador 3': \+
5'-AACTGCTCCAATTCC-CGCATAGATGTAAGAAATGT-3'\cr}

El cebador 1 contiene una diana de restricción para AatII (GACGTC) en la extensión 5' con una protección de 3 pb ATA y el cebador 2 contiene una diana de restricción para BamHI (GGATCC) en la extensión 5' con una protección de 3 pb TAT.

Una PCR del plásmido pUM13/4 con los cebadores 1 y 2 provoca la amplificación de la secuencia completa de la PreProMelitina (Fig. 5bi), que contiene dianas de restricción para AatII y BamHI para permitir la clonación en el vector retroviral pBAG (Fig. 5a) después de la digestión del plásmido con AatII y BamHI (Fig. 5c). El plásmido resultante pBAGppMeI se muestra en la Fig. 6.

La amplificación de la secuencia de la PreMelitina se llevó a cabo utilizando una combinación de PCR convencional y PCR recombinante. El cebador 3, a través de la unión al gen de la melitina, contiene una extensión 5' que corresponde a la secuencia 3' de la secuencia Pre. De forma similar, el cebador 3', a través de la unión en la región 3' de la secuencia Pre, contiene una extensión 5' que corresponde a la secuencia en la región 5' del gen de la melitina. Inicialmente, se realizó una PCR con cada par de cebadores 1 y 3' ó 2 y 3. Los productos de estas dos reacciones se utilizaron entonces para realizar una PCR recombinante. Esto permitió hibridar los dos productos de PCR entre ellos utilizando las extensiones 5' introducidas en los cebadores 3 y 3'. La adición posterior de los cebadores 1 y 2, que añade las dianas de restricción para AatII y BamHI para clonar en pBAG, permitió la amplificación de la secuencia completa de la PreMelitina (Fig. 5bii). El plásmido pBAGMel (Fig. 6) se obtuvo mediante la digestión de este producto de PCR y pBAG con AatII y BamHI seguido por la ligación de los fragmentos.

Aislamiento de los clones

Se transfectaron células EJ con p125.CercA y se aislaron los clones que expresaban resistencia a la neomicina. Se aislaron seis clones: Cecropina A1.4, Cecropina A1.7, Cecropina A1.8, Cecropina A10.3, Cecropina A10.4 y Cecropina A10.8.

De forma similar, se transfectaron células Ej con pBAGpMel y pBAGppMel y se aislaron los clones que expresaban resistencia a la neomicina. Se aislaron tres clones que contenían el gen de la premelitina: Pre Melitina 1, Pre Melitina 4 y Pre Melitina 6.

Se aislaron dos clones que contenían la prepromelitina: Pre Pro Melitina 1 y Pre Pro Melitina 5.

Análisis S1 de los clones transfectados con Cecropina/Melitina

Se llevó a cabo un análisis S1 utilizando pBAG digerido con SpeI como sonda (Fig. 7), comprendiendo el fragmento resultante, de 6,1 kb, el 3'LTR, la región temprana de polioma y el 5'LTR. A continuación se marcó en el extremo del fragmento utilizando la polinucleótido quinasa con ^{32}P y se hibridizó con el ARN total aislado de los clones celulares EJ (línea celular de carcinoma de vejiga humana) que habían sido transfectados con las construcciones vectoriales retrovíricas que contenían la preprocecropina (clones A1.4, A1.7, A1.8, A10.4, A10.3 y A10.8), la premelitina (clones 1, 4 y 6) y la prepromelitina (clones 1 y 5) o el vector vacío aislado (clones pBAG 3 y 6) (Fig. 8a).

A continuación se llevó a cabo una digestión con la nucleasa S1 (Fig. 8b), enzima que sólo degrada ácidos nucleicos de cadena simple, dando como resultado un fragmento de 288 pb resultante de la hibridación de la sonda con el ARNm procedente del vector retroviral que está presente en el ADN genómico de los clones transfectados.

La separación posterior utilizando un gel de poliacrilamida al 6% y la exposición del gel utilizando un sistema de imagen de fósforo (Fuji BAS1000) reveló las bandas esperadas tal y como puede comprobarse en la Figura 9.

Experimentos antitumorales

Muchos polipéptidos anfipáticos se sintetizan en una preproforma que es inactiva (Boman, 1995). Se piensa que la endopeptidasa que rompe el péptido preseñal en un proceso co-translacional está presente en todas las células, mientras que la proteasa que convierte la forma de la promelitina en la forma activa de la melitina muestra estar presente sólo en determinadas células (Kreil et al., 1980).

La línea celular derivada del carcinoma de vejiga humana, EJ, produce tumores que crecen progresivamente tras la inyección en ratones desnudos inmunocomprometidos (Fig. 10). Los clones estables de células EJ que contienen construcciones para la expresión de la melitina o cecropina obtenidos tal y como se ha descrito más arriba se analizaron en cuanto a su capacidad tumorigénica en ratones desnudos. Generalmente, los clones celulares que contenían la cecropina, prepromelitina o premelitina muestran una proporción reducida de crecimiento tumoral en ratones (Fig. 10-11), es decir, tanto la melitina como la cecropina tienen efectos anti-tumorales. En un experimento separado (datos no mostrados) el clon de la Cecropina A1.4 se analizó en 4 ratones, sólo de los cuales mostró un tumor.

Actividad anti-vírica

Los clones celulares derivados de EJ que contenían el vector de expresión para la melitina o la cecropina o el vector parental BAG, que no contenía un gen terapéutico, se supertransfectaron con una construcción indicadora que contenía el LTR de HIV (y por lo tanto el promotor de HIV) unido a un gen indicador de la luciferasa de la mosca brava (HIV-luc) en ausencia o presencia de una construcción separada que expresa Tat. En ausencia de Tat había poca actividad luciferasa detectable proveniente de la construcción HIV-luc en todos los clones celulares, tal y como se esperaba, dado que el promotor HIV requiere Tat para su actividad. Por el contrario, en presencia de Tat, los clones celulares que contenían BAG o los clones celulares que contenían una construcción que contiene la premelitina muestran niveles significativos de expresión de luciferasa, mientras que un clon celular transfectado con una construcción para la expresión de la prepromelitina o la cecropina mostró poca expresión de luciferasa (Fig. 12 y 13). Esto sugiere que la cecropina, la prepromelitina y, en menor grado la premelitina, inhiben la expresión controlada por Tat proveniente del LTR de HIV. Así, la producción de HIV por las células infectadas será inhibida por el vector retroviral terapéutico que contiene el gen del péptido antimicrobiano. Este efecto se espera que conduzca a una falta de producción de virus por las células infectadas por HIV.

Puede observarse un experimento similar al de las figuras 12 y 13 en la figura 14, donde dos LTRs diferentes que controlan la expresión de un gen indicador de la luciferasa (Wintersberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 2745.2749) se supertransfectaron separadamente en células que contenían la PreProCecropina o la PreProMelitina bajo el control de un promotor MLV. Estos experimentos mostraron que el efecto downregulador de la Cecropina no se restringe al promotor del HIV, sino que también funciona con otros vectores retrovirales.

Como conclusión, la presente invención proporciona productos terapéuticos para el tratamiento de infecciones retrovíricas que incluyen HIV, tumores, infecciones bacterianas y víricas, que comprende construcciones vectoriales que contienen genes, o derivados de los mismos, de péptidos activos terapéuticamente, incluidos los de las melitinas, las cecropinas y las magaininas.

Referencias

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Claims

1. Un vector recombinante para introducir en el ADN de una célula eucariótica, comprendiendo dicho vector, en unión operativa,

: a) el ADN de, o correspondiente a, al menos una porción de un vector retroviral, siendo dicha porción capaz de infectar y dirigir la expresión en las células diana; y

: b) Una o más secuencias codificadoras en las cuales al menos una secuencia codifica al menos un péptido antimicrobiano terapéutico presente en la naturaleza o un derivado del mismo, en el cual la secuencia que codifica el péptido antimicrobiano terapéutico presente en la naturaleza o el derivado del mismo, codifica la secuencia de aminoácidos de la melitina, premelitina, prepromelitina, cecropina, prececropina, preprocecropina, magainina y/o un homólogo, un recombinante y/o una combinación de los mismos, de dichos péptidos antimicrobianos, o en el cual el derivado de la melitina incluye una hélice anfifílica con o sin péptido señal y dominios de activación, o en el cual el derivado de la melitina es Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser- Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly.

2. Un vector recombinante según la reivindicación 1, en el cual el derivado de la melitina incluye una hélice anfifílica con o sin péptido señal y dominios de activación.

3. Un vector recombinante según la reivindicación 1 ó 2, en el cual el derivado de la melitina es Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr- Thr-Gly-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly.

4. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, incluyendo dicho vector retroviral, en unión operativa,

: a) una región 5'LTR que comprende la estructura U3-R-U5, y

: b) una región 3'LTR que comprende una región U3 deleccionada completa o parcialmente, en el cual dicha región U3 se substituye por una o más de dichas secuencias codificadoras, seguida por la región R y U5.

5. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, incluyendo dicho vector retroviral, en unión operativa,

: a) una región 5'LTR que comprende la estructura U3-R-U5;

: b) una o más de dichas secuencias codificadoras; y

: c) una región 3'LTR que comprende una región U3 deleccionada completa o parcialmente, en el cual dicha región U3 se substituye por una secuencia poliligadora, seguida por la región R y U5.

6. Un vector recombinante según la reivindicación 5, en el cual dicha secuencia poliligadora contiene al menos una diana de restricción única.

7. Un vector recombinante según la reivindicación 5 ó 6, en el cual dicha secuencia poliligadora contiene al menos una inserción de un fragmento de ADN heterólogo.

8. Un vector recombinante según la reivindicación 7, en el cual dicho fragmento de ADN heterólogo se selecciona entre uno o más elementos del grupo que consiste en elementos reguladores y promotores.

9. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dicha secuencia codificadora comprende adicionalmente al menos una secuencia no-codificadora seleccionada entre el grupo de elementos reguladores y promotores.

10. Un vector recombinante según la reivindicación 9, en el cual dichos elementos reguladores o promotores se seleccionan entre el grupo de promotores del SV40, del citomegalovirus, del virus del sarcoma de Rous, de la \beta-actina, del HIV-LTR, del MMTV-LTR, promotores específicos de células B o de células T y promotores específicos de tumores.

11. Un vector recombinante según la reivindicación 8 ó 9, en el cual dichos elementos reguladores y promotores son específicos para las células diana a nivel de expresión.

12. Un vector recombinante según la reivindicación 11, en el cual dichos elementos reguladores y promotores específicos para la célula diana se seleccionan entre uno o más de los elementos del grupo que consiste en los elementos reguladores y promotores específicos del HIV, del WAP, dell MMTV, de la \beta-lactoglobulina y de la caseína, los elementos reguladores y promotores específicos para el páncreas, incluidos los elementos reguladores y los promotores de la anhidrasa carbónica II y de la \beta-glucoquinasa, los elementos reguladores y promotores específicos para linfocitos, incluidos los elementos reguladores y promotores específicos de la inmunoglobulina y los elementos reguladores y promotores específicos linfocíticos del MMTV y los elementos reguladores y promotores específicos del MMTV como por ejemplo ^{MMTV}P2, que confieren la capacidad de respuesta a hormonas glucocorticoides o que dirigen la expresión a la glándula mamaria, los elementos reguladores y promotores específicos de células T como por ejemplo el gen receptor de las células T y el promotor del receptor CD4 y los elementos reguladores y promotores específicos de las células B como por ejemplo el promotor de la inmunoglobulina y mb1.

13. Un vector recombinante según la reivindicación 8 ó 9, en el cual dichos elementos reguladores son regulables mediante moléculas transactoras.

14. Un vector recombinante según la reivindicación 8 ó 9, en el cual dichos elementos reguladores y promotores regulan la expresión de al menos una de las secuencias codificadoras de dicho vector retroviral.

15. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual las regiones LTR de dicho vector retroviral se seleccionan entre al menos un elemento del grupo que consiste en los LTRs de MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV y MPMV.

16. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dicha secuencia codificadora se selecciona adicionalmente entre uno o más elementos del grupo que consiste en genes marcadores, genes terapéuticos, genes antivirales, genes antitumorales y genes de citoquina.

17. Un vector recombinante según la reivindicación 16, en el cual dicho gen marcador o terapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en genes marcadores que codifican proteínas tales como la \beta-galactosidasa, la neomicina, la alcohol deshidrogenasa, la puromicina, la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), la higromicina y la fosfatasa alcalina secretada o genes terapéuticos que codifican proteínas tales como la timidina quinasa del Virus Herpes Simplex, la citosina desaminasa, la guanina fosforibosil transferasa (gpt), el citocromo P 450 y genes reguladores del ciclo celular que codifica proteínas tales como P.T.O., SDI o genes supresores de tumores que codifican proteínas tales como p53 o genes de antiproliferación o citoquinas tales como IL-2.

18. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dichas secuencias retrovíricas implicadas en la integración se retrovirus están alteradas o al menos parcialmente deleccionadas.

19. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dicho vector retroviral comprende además secuencias de ADN homólogas a una o más secuencias celulares.

20. Una célula productora que produce una partícula vírica, comprendiendo dicha célula productora un vector retroviral según cualquiera de las reividicaciones anteriores 1 a 19 como primer componente; y una construcción de ADN que codifica proteínas requeridas para que dicho vector retroviral se ensamble.

21. Una partícula retrovírica que comprende el vector retroviral según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19.

22. Una partícula retrovírica según la reivindicación 21, que puede obtenerse transfectando la célula productora según la reivindicación 20 con un vector retroviral según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19.

23. Un provirus retroviral producido por la infección de una célula diana con una partícula retrovírica según la reivindicación 21 ó 22.

24. Un procedimiento para introducir secuencias homólogas y/o heterólogas en células humanas o animales in vitro, que comprende infectar una población de células diana con dichos retrovirus recombinantes producidos por la célula productora según la reivindicación 20.

25. Una célula huésped infectada con la partícula vírica según la reivindicación 21 ó 22, o transducida con el vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19.

26. Utilización de un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19 y/o una partícula retrovírica según la reivindicación 21 ó 22 para la integración dirigida in vitro en secuencias celulares homólogas.

27. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19, la célula productora según la reivindicación 20 y/o la partícula retrovírica según la reivindicación 21 ó 22 para el tratamiento de al menos una enfermedad seleccionada entre una enfermedad tumoral y entre infecciones víricas, bacterianas y fúngicas.

28. Un vector, una célula productora y/o una partícula según la reivindicación 27 para el tratamiento de infecciones retrovíricas.

29. Un vector, una célula productora y/o una partícula según la reivindicación 28 para el tratamiento de infecciones de HIV.

30. Utilización de un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 19, una célula productora según la reivindicación 20 y/o una partícula retrovírica según la reivindicación 21 ó 22 para producir una composición farmacéutica para el tratamiento de al menos una enfermedad seleccionada entre enfermedad tumoral y entre infecciones víricas, bacterianas y fúngicas.

31. Utilización según la reivindicación 30 para el tratamiento de infecciones retrovíricas.

32. Utilización según la reivindicación 30 para el tratamiento de infecciones por el HIV.

33. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva terapéuticamente de un vector, una célula productora y/o una partícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 27 a 29.