ES2198488T3 - Protegrinas. - Google Patents
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Abstract
SE PROPONEN PEPTIDOS CATIONICOS ANTIMICROBIANOS Y NEUTRALIZADORES DE VIRUS QUE TIENEN ENTRE 16 Y 18 AMINOACIDOS Y QUE INCLUYEN 0-4 CISTEINAS COMO CINCO PROTEGRINAS NATIVAS AISLADAS DE GRANULOS DE LEUCOCITO PORCINO CON DOS PUENTES DE CISTEINA O COMO VARIOS ANALOGOS DE PROTEGRINA CON NINGUN O UN SOLO PUENTE CISTEINA. LAS PROTEGRINAS NATIVAS PRESENTAN, Y LOS ANALOGOS PUEDEN PRESENTAR, AMIDACION EN EL CARBOXILO TERMINAL Y LOS ANALOGOS PUEDEN SER OPCIONALMENTE PREPARADOS EN FORMA ACILADA EN EL AMINO TERMINAL Y/O ESTABILIZADA EN LA CISTEINA Y/O ESTERIFICADA EN EL CARBOXILO TERMINAL. CUALQUIERA DE LAS 1-4 CISTEINAS NATIVAS PUEDE SER REEMPLAZADA POR UN AMINOACIDO HIDROFOBICO O PEQUEÑO Y SE DESCRIBEN VARIOS SUSTITUYENTES PARA LAS POSICIONES 12-16 RESTANTES. SE DESCRIBEN CELULAS HUESPED RECOMBINANTES Y METODOS PARA SU PRODUCCION, ASI COMO COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, COMPOSICIONES PARA APLICACIONES AGRICOLAS, Y METODOS PARA EL USO BACTERIOSTATICO, NEUTRALIZADOR DE VIRUS, E INACTIVADOR DE ENDOTOXINASDE PROTEGRINAS NATIVAS Y SUS ANALOGOS.
Description
Protegrinas.
El invento se refiere al campo de los péptidos
antibióticos. En particular, el invento trata de péptidos cortos,
algunos de los cuales son aislados de leucocitos porcinos, que
tienen un amplio intervalo de actividades antimicrobianas.
Uno de los mecanismos de defensa frente a la
infección tanto por animales como por plantas es la producción de
péptidos que tienen actividad antimicrobiana y antiviral. Diversas
clases de estos péptidos han sido aisladas de tejidos tanto de
plantas como de animales. Una clase bien conocida de tales péptidos
es la taquiplesina que fue primeramente aislada de los hemocitos del
cangrejo de herradura como está descrito por Nakamura, T. y
otros J Biol Chem (1988)
263:16709-16713. Este artículo describió la
taquiplesina inicial aislada, Taquiplesina I, de la especie
japonesa. La Taquiplesina I es un péptido amidado de 17 aminoácidos
que contiene cuatro residuos de cisteína que proporcionan dos
enlaces de cistina intramoleculares. Un artículo posterior de este
grupo, Miyata, T. y otros J Biochem (1989) 106:
663-668, documenta el aislamiento de una segunda
taquiplesina, la Taquiplesina II, que consiste en 17 residuos
amidados en el extremo C-terminal, que contiene
también cuatro residuos de cisteína y dos enlaces disulfuro
intramoleculares. Dos péptidos adicionales de 18 mer, llamados
polifemusinas, altamente homólogos a la Taquiplesina II y que
contienen las mismas posiciones para los cuatro residuos de
cisteína, fueron también aislados de los cangrejos de herradura
americanos. La Polifemusina I y la Polifemusina II se diferencian la
una de la otra sólo en el reemplazo de un residuo de arginina por
una lisina. Todos los péptidos fueron descritos como que tienen una
actividad antifúngica y antibacteriana. Un artículo posterior por
Murakami, T. y otros Chemotherapy (1991) 37:
327-334, describe la actividad antiviral de la
taquiplesina con respecto al virus de la estomatitis vesicular; los
Virus del herpes simplex I & II, Adenovirus I, Rovirus II y
Poliovirus I fueron resistentes a la desactivación por Taquiplesina
I. Morimoto, M. y otros Chemotherapy (1991) 37:
206-211, encontró que la Taquiplesina I era
inhibidora del virus de la inmunodeficiencia humana. Esta actividad
anti-VIH se encontró también que era poseída por un
análogo sintético de la Polifemusina II como se describe por
Nakashima, H. y otros Antimicrobial agents and
chemotherapy (1992) 1249-1255. Se han encontrado
también péptidos antivirales en leucocitos de conejo como se
documenta por Lehrer, R.I. y otros J Virol (1985)
54: 467-472.
Otras clases importantes de péptidos
antimicrobianos que contienen cisteína incluyen defensinas,
\beta-defensinas y defensinas de insectos. Las
defensinas son péptidos algo más largos caracterizados por seis
cisteínas invariantes y tres enlaces disulfuro de cistina
intramoleculares. Las defensinas fueron descritas por Lehrer, R.I.
y otros Cell (1991) 64:
229-230; Lehrer, R.I. y otros Ann Rev
Immunol (1993) 11:105-128. Una revisión
de defensinas derivadas de mamíferos por Lehrer, R.I. y otros
se encuentra en Annual Review Immunol (1993) 11:
105-128; tres patentes se han publicado sobre las
defensinas: los documentos de patentes norteamericanas U.S.
4.705.777; U.S. 4.659.692; y U.S. 4.543.252. Las defensinas han sido
encontradas en los neutrofilos polimorfonucleados (PMN) de humanos y
de varios otros animales, así como en macrófagos alveolares
pulmonares de conejo, y en células epiteliales (Paneth) del
intestino delgado murino y en las células correspondientes en
humanos.
Las \beta-defensinas se
encuentran en células del epitelio respiratorio bovino, en
granulocitos bovinos y en leucocitos de ave. Véase Selsted N.E. y
otros. J Biol Chem (1993) 288:
6641-6648 y Diamond, G. y otros Proc Natl
Acad Sci (USA) (1989) 88: 262-265.
Los péptidos y proteínas antifúngicas y
antibacterianas han sido también encontradas en plantas (Broekaert,
W.F. y otros Biochemistry (1992) 31:
4308-4314) como ha sido revisado por Cornelissen,
B.J.C. y otros Plant Physiol (1993) 101:
709-712. Los sistemas de expresión para la
producción de tales péptidos han sido usados para transformar
plantas para proteger las plantas frente a tal infección como está
descrito, por ejemplo, por Haln, R. y otros Nature
(1993) 361: 153-156.
El presente invento proporciona una nueva clase
de péptidos antimicrobianos y antivirales, designados aquí como
``protegrinas'', miembros representativos de los que han sido
aislados de los leucocitos porcinos. Estos péptidos son útiles como
agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos tanto en plantas
como en animales.
El aislamiento de los péptidos protegrinos del
invento fue documentado por los actuales solicitantes en un artículo
por Kokryakov, V.N. y otros FEBS (1993) un337:
231-236 (artículo de julio). Una publicación
posterior de este grupo describió la presencia de una nueva
protegrina, cuya secuencia, y la de su precursor, fue deducida de su
clon de cADN aislado. Zhao, C y otros, FEBS Letters
(1994) 346: 285-288. Un artículo adicional
que describe los péptidos catiónicos a partir de los neutrófilos
porcinos fue publicado por Mirogorodskaya, O.A. y otros
FEBS (1993) 330: 339-342 (artículo de
septiembre). Storici, P. y otros Biochem Biophys Res
Comm (1993) 196: 1363-1367, documenta la
recuperación de una secuencia de ADN que codifica para un péptido
antimicrobiano de leucocito porcino con una prosecuencia semejante a
catelina. Se documenta que el péptido es una de las protegrinas
descritas aquí a continuación. El documento de patente W095/03325
describe péptidos cortos de protegrina, algunos de los cuales son
aislados y purificados a partir de los leucocitos porcinos que
tienen una actividad antimicrobiana. Publicaciones adicionales
relacionadas con las protegrinas son Harwig, S.S.L., y otros
J.Peptide Sci. (1995) en prensa; y Zhao, C., y otros
FEBS-MS MB-283 (1995) en prensa.
Se ha encontrado también que las protegrinas del
invento se unen a las endotoxinas, es decir, a las composiciones de
lipopolisacárido (LPS) derivadas de bacterias
gram-negativas que se creen responsables de la
sepsis gram-negativa. Este tipo de sepsis es un
estado extremadamente común y frecuentemente es fatal. Otros han
intentado diseñar y estudiar las proteínas que unen LPS/endotoxinas,
y documentos ilustrativos de estos intentos aparecen en Rustici, A.
y otros Science (1993) 259:
361-364; Matsuzaki, K. y otros
Biochemistry (1993) 32: 11704-11710;
Hoess, A. y otros EMBO J (1993) 12:
3351-3356; y Elsbach, P. y otros Current Opinion
in Immunology (1993) 5: 103-107. Las
protegrinas del presente invento proporcionan compuestos adicionales
que son capaces de desactivar el LPS y mejorar sus efectos.
Además de lo anterior, las protegrinas del
invento son eficaces en inhibir el crecimiento de organismos que se
asocian con enfermedades de transmisión sexual. Se ha estimado que
14 millones de personas en todo el mundo están infectadas con el VIH
y que millones de mujeres padecen cada año enfermedades de
inflamación pélvica. La Chlamydia trachomatis y Neisseria
gonorrhoeae causan más de la mitad de estas enfermedades
inflamatorias aunque E. coli, Mycoplasma hominis y
otros microorganismos infecciosos pueden ser también responsables.
Los patógenos incluyen patógenos virales, bacterianos, fúngicos y
protozoicos. Es especialmente importante que los antibióticos usados
para combatir estas infecciones sean eficaces en estados
fisiológicos. Las protegrinas del presente invento ofrecen estas
propiedades.
En una realización, el invento se dirige a los
péptidos de 16-18 residuos aminoacídicos
caracterizados por cuatro cisteínas invariantes y tanto por un
patrón característico de aminoácidos básicos e hidrófobos como por
ser aislables a partir de leucocitos animales usando el método del
invento. En una segunda realización, el invento se dirige a los
péptidos anteriores en los que 1-4 de estas
cisteínas es remplazada por un aminoácido pequeño o hidrófobo. Todos
estos péptidos se pueden producir sintéticamente y algunos se pueden
producir de modo recombinante o se pueden aislar de sus fuentes
naturales y purificarlos para usarlos como conservantes o en
composiciones farmacéuticas para tratar o impedir las infecciones en
animales. Alternativamente, los péptidos pueden ser formulados en
composiciones que pueden ser aplicadas a plantas para protegerlas
frente a infecciones virales o microbianas. En otra aproximación
adicional, el ADN que codifica para los péptidos puede expresarse
in situ, en animales o preferiblemente en plantas, para
combatir infecciones. Los péptidos son también útiles como
estándares en ensayos antimicrobianos y para unir endotoxinas.
Consecuentemente, en un aspecto, el invento está
dirigido a un compuesto purificado y aislado o producido de modo
recombinante de la fórmula
A_{1}-A_{2}-A_{3}-A_{4}-A_{5}-C_{6}-A_{7}-C_{7}-A_{9}-A_{10}-A_{11}-A_{12}-
C_{13}-A_{14}-C_{15}-A_{16}-(A_{17}-A_{18})\eqnum{(1)} y las
formas N-terminal aciladas y/o
C-terminal amidadas o esterificadas del mismo, que
esté tanto en la forma lineal estabilizada opcionalmente en el -SH
como en la forma unida por puentes de cistinas
en la que A_{1} es un aminoácido básico;
cada uno de A_{2} y A_{3} es
independientemente un aminoácido pequeño;
cada uno de A_{5}, A_{7}, A_{14} es
independientemente un aminoácido hidrófobo;
A_{4} es un aminoácido básico o pequeño;
cada uno de A_{9}, A_{12}, y A_{16} es
independientemente un aminoácido básico, hidrófobo, neutro/polar o
pequeño;
A_{10} es prolina;
A_{11} es un aminoácido básico, neutro/polar,
hidrófobo o pequeño o es prolina;
A_{17} no está presente o, si lo está, es un
aminoácido básico, neutro/polar, hidrófobo o pequeño;
A_{18} no está presente o, si lo está, es un
aminoácido básico, hidrófobo, neutro/polar o pequeño, o una forma
modificada de la Fórmula (1) y el N-terminal acilado
y/o C-terminal amidado o formas esterificadas del
mismo en la que al menos una de las 4 cisteínas está reemplazada
independientemente por un aminoácido hidrófobo o un aminoácido
pequeño;
A condición de que el compuesto de Fórmula (1)
deba tener una carga de +3 ó mayor.
En otros aspectos adicionales, el invento está
dirigido a materiales recombinantes útiles para la producción de los
péptidos del invento así como a plantas o animales modificados para
contener sistemas de expresión para la producción de estos péptidos.
El invento está también dirigido a composiciones farmacéuticas y
composiciones para aplicación en plantas que contengan los péptidos
del invento así como ingredientes activos o composiciones que
contengan sistemas de expresión para la producción de los péptidos o
para expresión in situ de la secuencia de nucleótidos que
codifica para estos péptidos. El invento está también dirigido a
métodos para preparar los péptidos del invento de modo sintético, a
anticuerpos específicos para estos péptidos, y para el uso de los
péptidos como conservantes.
En otros aspectos, el invento está dirigido al
uso de los compuestos del invento como estándares en ensayos
antimicrobianos. Los compuestos pueden ser también usados como
antimicrobianos en disoluciones útiles para el cuidado de los ojos,
tales como disoluciones para lentes de contacto, y en composiciones
farmacéuticas tópicas u otras para el tratamiento de enfermedades de
transmisión sexual (ETS). El invento está también dirigido al uso de
los compuestos del invento como conservantes para alimentos u otros
productos perecederos. Como los péptidos del invento pueden
desactivar endotoxinas, el invento está también dirigido a un método
para desactivar endotoxinas usando los compuestos del invento y para
tratar sepsis gram-negativas aprovechando esta
propiedad.
La figura 1 muestra el patrón de elución de un
concentrado del ultrafiltrado de leucocitos porcinos aplicados a una
columna de Biogel P10.
La figura 2 muestra la actividad antibacteriana
de las fracciones P10 obtenidas de la elución de la columna descrita
en la Figura 1.
La figura 3 muestra un patrón de elución obtenido
cuando las fracciones 76-78 de la columna de Biogel
P10 de la Figura 1 se aplican a HPLC.
La figura 4 muestra la actividad antimicrobiana
de las protegrinas porcinas purificadas del invento:
La figura 4a muestra actividad antibacteriana
frente a E. Coli;
La figura 4b muestra actividad antibacteriana
frente a Listeria monocytogenes;
La figura 4c muestra actividad antifúngica frente
a Candida albicans;
La figura 4d muestra actividad antibacteriana
frente a S. aureus.
La figura 4e muestra actividad antibacteriana
frente a K. pneumoneae;
La figura 5 muestra el efecto de diversas
condiciones de ensayo de actividad antimicrobiana:
La figura 5a muestra actividad frente a
Candida albicans en NaCl 100 \muM;
La figura 5b muestra actividad frente a E.
Coli en NaCl 100 \muM;
La figura 5c muestra actividad frente a
Candida albicans en suero de ternera fetal 90%.
La figura 6 muestra la actividad antimicrobiana
de las formas lineales de las protegrinas en diversas condiciones de
ensayo:
La figura 6a muestra la actividad frente a E.
coli en tampón fosfato-citrato 10 mM, pH
6,5;
La figura 6b muestra la actividad frente a E.
coli en el mismo tampón con NaCl 100 mM;
La figura 6c muestra la actividad frente a L.
monocytogenes en el tampón de las figuras
6a-6b;
La figura 6d muestra la actividad frente a L.
monocytogenes en el mismo tampón con la adición de NaCl 100
mM;
La figura 6e muestra la actividad frente a C.
albicans en presencia de fosfato 10 mM; y
La figura 6f muestra la actividad frente a C.
albicans en presencia de fosfato 10 mM más NaCl 100 mM.
La figura 7 muestra un material compuesto de cADN
que codifica para los precursores de PG-1,
PG-2, PG-3 y
PG-4.
La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y
la secuencia aminoacídica deducida del ADN genómico que codifica
para la proteína precursora para los compuestos antimicrobianos del
invento PG-1, PG-3, y
PG-5.
La figura 9 muestra la organización del ADN
genómico de la protegrina.
La figura 10 muestra las secuencias aminoacídicas
de las protegrinas PG-1 a PG-5.
Las figuras 11a-11c muestran la
actividad antimicrobiana del PG-5 preparado
sintéticamente comparada con el PG-1 preparado
sintéticamente.
Las figuras 12a-12d muestran los
efectos de diversas protegrinas frente a diversos microbios
diana.
La figura 13 muestra una representación gráfica
de los efectos de las formas de cometa y bala del
PG-1 frente a bacterias gram- positivas.
La figura 14 muestra una representación gráfica
de los efectos de las formas de cometa y bala del
PG-1 frente a bacterias gram- negativas.
Figura 15 es una representación gráfica de la
actividad antimicrobiana de la forma de serpiente del
PG-1 frente a bacterias gram- positivas.
Figura 16 es una representación gráfica de la
actividad antimicrobiana de la forma de serpiente del
PG-1 frente a bacterias gram- negativas.
Los péptidos del invento se describen mediante la
fórmula:
A_{1}-A_{2}-A_{3}-A_{4}-A_{5}-C_{6}-A_{7}-C_{8}-A_{9}-A_{10}-A_{11}-A_{12}-
C_{13}-A_{14}-C_{15}-A_{16}-(A_{17}-A_{18})\eqnum{(1)} y sus
formas modificadas definidas. Aquellos péptidos que están presentes
de forma natural deben estar en forma purificada y aislada o
preparados de modo recombinante.
La designación A_{n} en cada caso representa un
aminoácido en la posición especificada en el péptido. Como A_{17}
y A_{18} pueden estar o no presentes, los péptidos del invento
contienen bien 16, 17 ó 18 aminoácidos. Las posiciones de los
residuos de cisteína, mostrados como C en la Fórmula (1), son
invariantes en los péptidos del invento; sin embargo, en las formas
modificadas de los péptidos de la Fórmula (1), también incluidos
dentro del alcance del invento, al menos una de 1-4
de estas cisteínas puede estar reemplazada por un aminoácido
hidrófobo o pequeño.
El amino terminal del péptido puede estar en
forma de amino libre o puede estar acilado por un grupo de la
fórmula RCO-, en el que R representa un grupo hidrocarbilo de
1-6C. El grupo hidrocarbilo está saturado o
insaturado y es típicamente, por ejemplo, metilo, etilo,
i-propilo, t-butilo,
n-pentilo, ciclohexilo,
ciclohexén-2-ilo,
hexén-3-ilo,
hexín-4-ilo, y similares.
El extremo C-terminal de los
péptidos del invento puede estar en forma de grupo carboxilo sin
derivatizar, bien como el ácido libre o bien como una sal aceptable,
tal como el potasio, sodio, calcio, magnesio, u otra sal de un ión
inorgánico o de un ión orgánico como la cafeína. El carboxilo
terminal puede también derivatizarse mediante la formación de un
éster con un alcohol de la fórmula ROH, o puede estar amidado
mediante una amina de la fórmula NH_{3}, o RNH_{2}, o R_{2}NH,
en el que cada R es independientemente hidrocarbilo de
1-6C como se define anteriormente. Son preferidas
las formas amidadas de los péptidos en los que el
C-terminal tiene la fórmula CONH_{2}.
Como los péptidos del invento contienen números
sustanciales de aminoácidos básicos, los péptidos del invento pueden
ser suministrados en la forma de sales de adición ácidas. Las sales
de adición ácidas típicas incluyen aquellas de iones inorgánicos
tales como cloruro, bromuro, yoduro, fluoruro o similares, sulfato,
nitrato, o fosfato, o pueden ser sales de aniones orgánicos tales
como acetato, formiato, benzoato y similares. La aceptabilidad de
cada una de tales sales es dependiente del uso pretendido, como se
comprende comúnmente.
Los péptidos del invento que contienen al menos
dos cisteínas pueden estar en forma de cadena lineal o cíclica. Las
formas de cadena lineal son convertibles a las formas cíclicas, y
vice versa. Métodos para formar puentes disulfuro para crear
los péptidos cíclicos son bien conocidos en la técnica, ya que son
métodos para reducir disulfuros para formar los compuestos lineales.
Los compuestos lineales se pueden estabilizar mediante la adición de
un agente alquilante adecuado tal como yodoacetamida.
Las formas cíclicas son el resultado de la
formación de uniones de cistina entre todos o algunos de los cuatro
residuos de cisteína invariantes. Las formas cíclicas del invento
incluyen todas las posibles permutaciones de la formación del enlace
de cistina; si las cisteínas se numeran por orden de aparición
empezando en el N-terminal como C_{6}, C_{8},
C_{13} y C_{15}, estas permutaciones incluyen:
C_{6} - C_{8};
C_{6} - C_{13};
C_{6} - C_{15};
C_{8} - C_{13};
C_{8} - C_{15};
C_{13} - C_{15};
C_{6} - C_{8}, C_{13} - C_{15};
C_{6} - C_{13}, C_{8} - C_{15}; y
C_{6} - C_{15}, C_{8} - C_{13}.
En las formas modificadas de los péptidos, en los
que las cisteínas de 1- 4 son reemplazadas, permutaciones similares
están disponibles cuando las cisteínas 2-3 están
presentes.
Las formas nativas de las protegrinas contienen
dos enlaces de cistina que están entre las cisteínas en la posición
6 y la cisteína en la posición 15 y el otro entre las cisteínas en
la posición 8 y la cisteína en la posición 13. Consecuentemente, en
aquellas realizaciones que tienen dos enlaces de cistina, la forma
C_{6}-C_{15}, C_{8}-C_{13}
es preferida. Sin embargo, se ha descubierto por los actuales
solicitantes que las formas de las protegrinas que contienen sólo
una unión de cistina son activas y se preparan fácilmente. Son
preferidas entre las realizaciones que tienen una sola unión de
cistina aquellas representadas por C_{6}-C_{15}
sola y por C_{8}-C_{13} sola.
Las formas que contienen una cistina
C_{6}-C_{15} como la única unión de cistina se
designan generalmente como formas ``bala'' de las protegrinas;
aquellas en las que la única cistina es
C_{8}-C_{13} se designan como formas ``cometa''.
Las formas cometas y balas pueden ser muy convenientemente hechas
mediante el reemplazamiento de las cistinas en las posiciones que no
estén unidas por cistina con un aminoácido neutro, preferiblemente
un aminoácido pequeño tal como glicina, serina, alanina o treonina y
menos preferiblemente por un aminoácido neutro polar tal como
asparagina o glutamina. Así, en realizaciones de la forma de bala,
cada uno de C_{8} y C_{13} es independientemente alanina,
serina, treonina o glicina, preferiblemente ambos son alanina. Por
el contrario, en la forma de cometa, C_{6} y C_{15} están así
reemplazadas.
Como las formas linealizadas de los péptidos
cíclicos nativos tienen actividades valiosas, incluso cuando se
estabilizan químicamente para conservar la forma sulfhidrilo de
cisteína por ejemplo, mediante reacción con yodoacetamida, los
compuestos del invento incluyen también formas linealizadas que
están estabilizadas con reactivos adecuados. Como se define aquí,
las formas ``estabilizadas en SH-'' de los péptidos del invento
contienen grupos sulfhidrilo hechos reaccionar con reactivos
estándares para impedir la reformación en uniones disulfuro.
Una aproximación alternativa para proporcionar
formas lineales de las protegrinas del invento comprende el uso de
la forma modificada de los péptidos en los que los residuos de
cisteína son reemplazados por aminoácidos que no forman uniones de
cistina. En este caso, también, las 4 (o al menos 3) de las
cisteínas en las posiciones 6, 8, 13, y 15 son reemplazados por
aminoácidos neutros polares o pequeños como se indica anteriormente.
Es preferible que los 4 residuos de cisteína sean reemplazados para
minimizar la probabilidad de enlaces intermoleculares.
Los aminoácidos señalados por A_{n} pueden ser
aquellos codificados por el gen o análogos del mismo, y pueden ser
también los isómeros D de los mismos. Una realización preferida de
los péptidos del invento es esa forma en la que todos los residuos
están en la configuración D otorgando de ese modo resistencia a la
actividad proteasa mientras que conservan propiedades
antimicrobianas o antivirales. Las protegrinas resultantes son ellas
mismas enantiómeros de las formas que contienen L- aminoácidos
nativos.
Las notaciones de los aminoácidos usadas aquí son
convencionales y son como se indica a continuación:
| Aminoácido | Símbolo de una letra | Símbolo de tres letras |
| Alanina | A | Ala |
| Arginina | R | Arg |
| Asparagina | N | Asn |
| Ácido aspártico | D | Asp |
| Cisteína | C | Cys |
| Glutamina | Q | Gln |
| Ácido glutámico | E | Glu |
| Glicina | G | Gly |
| Histidina | H | His |
| Isoleucina | I | Ile |
| Leucina | L | Leu |
(Continuación)
| Aminoácido | Símbolo de una letra | Símbolo de tres letras |
| Lisina | K | Lys |
| Metionina | M | Met |
| Fenilalanina | F | Phe |
| Prolina | P | Pro |
| Serina | S | Ser |
| Treonina | T | Thr |
| Triptófano | W | Trp |
| Tirosina | Y | Tyr |
| valina | V | val |
Los aminoácidos no codificados genéticamente se
abrevian como se indica en la discusión a continuación.
En los péptidos específicos mostrados en la
presente solicitud, la forma L de cualquier residuo aminoacídico que
tenga un isómero óptico es deseable a menos que la forma D esté
expresamente indicada por un símbolo de daga (^\dagger).
Los compuestos del invento son péptidos que están
definidos parcialmente en términos de residuos aminoacídicos de las
clases designadas. Los residuos aminoacídicos pueden estar
generalmente subclasificados en subclases principales como
sigue:
Ácidos: El residuo tiene una carga negativa
debido a la pérdida del ión H a un pH fisiológico y el residuo es
atraído por una disolución acuosa de modo que busque las posiciones
en superficie en la conformación de un péptido en el que está
contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a un pH
fisiológico.
Básico: El residuo tiene una carga positiva
debido a la asociación con ión H a un pH fisiológico y el residuo es
atraído por una disolución acuosa de modo que busque las posiciones
en superficie en la conformación de un péptido en el que está
contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a un pH
fisiológico.
Hidrófobo: los residuos no están cargados a un pH
fisiológico y el residuo es repelido por una disolución acuosa de
modo que busque las posiciones internas en la conformación de un
péptido en el que está contenido cuando el péptido está en un medio
acuoso.
Neutro/polar: Los residuos no están cargados a un
pH fisiológico, pero el residuo no es suficientemente repelido por
disoluciones acuosas de modo que buscara las posiciones internas en
la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el
péptido está en un medio acuoso.
Esta descripción también caracteriza ciertos
aminoácidos como ``pequeños'' puesto que sus cadenas laterales no
son lo suficientemente largas, incluso si faltan los grupos polares,
para conferir hidrofobicidad. Aminoácidos ``pequeños'' son aquellos
con cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en
la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no.
Se entiende, por supuesto, que en una colección
estadística de moléculas de residuos individuales algunas moléculas
estarán cargadas, y otras no, y que habrá una atracción por o una
repulsión desde un medio acuoso en mayor o menor extensión. Para
adaptar la definición de ``cargado'', un porcentaje significativo
(al menos el 25% aproximadamente) de las moléculas individuales
están cargadas a un pH fisiológico. El grado de atracción o
repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es
arbitrario y, por tanto, aminoácidos específicamente contemplados
por el invento han sido clasificados como uno u otro. La mayoría de
los aminoácidos no nombrados específicamente pueden estar
clasificados en base al comportamiento conocido.
Los residuos aminoacídicos pueden estar además
subclasificados como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no
aromáticos, clasificaciones autoexplicatorias con respecto a los
grupos sustituyentes de la cadena lateral de los residuos, y como
pequeños o grandes. El residuo se considera pequeño si contiene un
total de cuatro átomos de carbono o menos, inclusive el carbono del
carboxilo, con tal de que un sustituyente polar adicional esté
presente; sino tres o menos. Los residuos pequeños son siempre, por
supuesto, no aromáticos.
Para los aminoácidos proteicos presentes de
manera natural, las subclasificaciones según el esquema anterior son
como sigue.
\newpage
Ácido: ácido aspártico y ácido
glutámico;
| Básico: | no cíclico: Arginina, Lisina; |
| Cíclico: Histidina; |
Pequeño: Glicina, Serina, Alanina,
Treonina;
Polar/grande: Asparagina, Glutamina;
Hidrófobo: Tirosina, Valina, Isoleucina,
Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano.
El aminoácido secundario prolina codificado por
un gen es un caso especial debido a sus efectos conocidos en la
conformación secundaria de las cadenas peptídicas, y por lo tanto,
no se incluye en un grupo. Los residuos de cisteína no están tampoco
incluidos en estas clasificaciones puesto que su capacidad para
formar enlaces disulfuro para proporcionar una estructura secundaria
es crítica en los compuestos del presente invento.
Ciertos aminoácidos encontrados comúnmente, que
no están codificados por el código genético, incluyen, por ejemplo,
beta-alanina (beta-Ala), u otros
aminoácidos omega, tales como 3-aminopropiónico,
2,3-diaminopropiónico (2,3-diaP),
4-aminobutírico y así sucesivamente, ácido
alfa-aminisobutírico (Aib), sarcosina (Sar),
ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-butilalanina
(t-BuA),
t-butil-glicina
(t-BuG), N-metilisoleucina
(N-MeIle), fenilglicina (Phg), y ciclohexilalanina
(Cha), norleucina (Nle), 2-naftilalanina
(2-Nal); ácido 1, 2, 3,
4-tetrahidro-isoquinolín-3-carboxílico
(Tic); \beta-2-tienilalanina
(Thi); metioninsulfóxido (MSO); y homoarginina (Har). Estos también
caen en categorías convenientemente particulares.
Basado en las definiciones anteriores,
Sar, beta-Ala, 2,
3-diaP y Aib son pequeños;
t-BuA, t-BuG,
N-MeIle, Nle, Mvl, Cha, Phg, Nal, Thi y Tic son
hidrófobos;
Orn y Har son básicos;
Cit, Acetil Lis, y MSO son neutros/polares.
Los diversos aminoácidos omega se clasifican
según el tamaño como pequeños (beta-Ala y
3-aminopropiónico) o como grandes e hidrófobos
(todos los demás).
Otras sustituciones aminoacídicas de aquellos
aminoácidos codificados en el gen pueden estar también incluidas en
compuestos peptídicos dentro del alcance del invento y pueden estar
clasificadas dentro de este esquema general según sus
estructuras.
En todos los péptidos del invento, una o más
uniones amida (-CO-NH-) pueden ser opcionalmente
reemplazadas con otra unión que sea un isóstero tal como
-CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}CH_{2}, -CH=CH- (cis y trans),
-COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-. Este
reemplazo se puede realizar mediante métodos conocidos en la
técnica. Las siguientes referencias describen la preparación de
péptidos análogos que incluyen estos restos de unión alternativa:
Spatola, A.F., Vega Data (Marzo 1983), Vol. 1, número 3,
``Peptide Backbone Modifications'' (revisión general); Spatola,
A.F., en ``Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and
Proteins'', B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267
(1983) (revisión general); Morley, J.S., Trends Pharm Sci
(1980) pp. 463-468 (revisión general); Hudson, D., y
otros., Int J Pept Prot Res (1979) 14:
177-185 (-CH_{2}NH-,-CH_{2}CH_{2}-); Spatola,
A.F., y otros, Life Sci (1986) 38:
1243-1249 (-CH_{2}-S); Hann, M.M.,
J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314
(-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R.G., y otros,
J Med Chem (1980) 23: 1392-1398
(-COCH_{2}-); Jennings-White, C., y otros,
Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533 (-COCH_{2}-);
Szelke, M., y otros, Solicitud Europea EP 45665 (1982) CA:
97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH_{2}-); Holladay,
M.W., y otros Tetrahedron Lett (1983) 24:
4401-4404 (-C(OH)CH_{2}-); y Hruby,
V.J., Life Sci (1982) 31: 189-199
(-CH_{2}-S-).
Los compuestos de Fórmula (1) se definen
generalmente como
A_{1}-A_{2}-A_{3}-A_{4}-A_{5}-C_{6}-A_{7}-C_{7}-A_{9}-A_{10}-A_{11}-A_{12}-
C_{13}-A_{14}-C_{15}-A_{16}-(A_{17}-A_{18})\eqnum{(1)} y las
formas N-terminal aciladas y/o
C-terminal amidadas o esterificadas de la misma, que
están tanto en la forma lineal opcionalmente estabilizada en el -SH
como en forma unida por puente de cistinas,
en la que A_{1} es un aminoácido básico;
cada uno de A_{2} y A_{3} es
independientemente un aminoácido pequeño;
cada uno de A_{5}, A_{7}, A_{14} es
independientemente un aminoácido hidrófobo;
A_{4} es un aminoácido básico o pequeño;
cada uno de A_{9}, A_{12}, y A_{16} es
independientemente un aminoácido básico, hidrófobo, neutro/polar o
pequeño;
A_{10} es prolina;
A_{11} es un aminoácido básico, neutro/polar,
hidrófobo o pequeño o es prolina;
A_{17} no está presente o, si lo está, es un
aminoácido básico, neutro/polar, hidrófobo o pequeño;
A_{18} no está presente o, si lo está, es un
aminoácido básico, hidrófobo, neutro/polar o pequeño, o una forma
modificada de la Fórmula (1) y las formas N-terminal
aciladas y/o C-terminal amidadas o esterificadas del
mismo en las que al menos una de las 4 cisteínas es reemplazada
independientemente por un aminoácido hidrófobo o un aminoácido
pequeño;
a condición de que el compuesto de Fórmula (1)
deba tener una carga de +3 ó mayor.
En las realizaciones preferidas de los compuestos
del invento, cada uno de A_{1} y A_{9} es independientemente
seleccionado del grupo que consiste en R, K y Har; más
preferiblemente, que ambos A_{1} y A_{9} sean R.
En otra clase de realizaciones preferidas, cada
uno A_{2} y A_{3} es independientemente seleccionado del grupo
que consiste en G, A, S y T; más preferiblemente, que A_{2} y
A_{3} sean G.
En otro grupo de realizaciones preferidas,
A_{4} es seleccionado del grupo que consiste en R, K, Har, G, A,
S y T; más preferiblemente, que A_{4} sea R o G.
En otro grupo de realizaciones preferidas, cada
uno de A_{5}, A_{14} y A_{16} es independientemente
seleccionado independientemente del grupo que consiste en I, V, L,
Nle y F; preferiblemente I, V, L y F.
En otro grupo de realizaciones preferidas, cada
uno de A_{7} y A_{12} es independientemente seleccionado del
grupo que consiste en I, V, L, W, Y y F; preferiblemente que A_{7}
sea Y y A_{12} sea I o F.
En otro grupo de realizaciones preferidas,
A_{11} es R o W.
A_{17}, cuando está presente, es
preferiblemente G, A, S o T, más preferiblemente G;
A_{18}, cuando está presente, es
preferiblemente R, K o Har, más preferiblemente R.
Como se describe anteriormente, los compuestos de
Fórmula (1) están tanto en forma cíclica como no cíclica
(linealizados) o pueden estar modificados en los que
1-4 de las cisteínas están reemplazadas por un
residuo aminoacídico pequeño o un residuo hidrófobo o un residuo de
aminoácido grande no polar. Si las formas linealizadas del compuesto
de Fórmula (1) están preparadas, o si las formas linealizadas de
estos péptidos modificados que contienen al menos dos cisteínas
están preparadas, es preferible que los grupos sulfhidrilo estén
estabilizados por adición de un reactivo adecuado. Las realizaciones
preferidas para aminoácidos hidrófobos para reemplazar residuos de
cisteína son I, V, L y NLe, preferiblemente I, V o L. Los
aminoácidos pequeños preferidos para reemplazar los residuos de
cisteína incluyen G, A, S y T, más preferiblemente G. Los
aminoácidos grandes polares preferidos son N y Q.
En una realización alternativa, los péptidos del
invento se definen como se describe mediante la Fórmula (1), pero en
la que las definiciones de A_{n} en cada caso están determinadas
por la aislabilidad del péptido a partir de leucocitos de animal
mediante el método del invento. El método del invento comprende las
etapas de proporcionar un ultrafiltrado de un lisado de leucocitos
de animal y de aislar los péptidos de 16-18
aminoácidos.
Estos péptidos pueden definirse además por la
capacidad del ADN que los codifica para hibridar bajo condiciones
rigurosas con el ADN que codifica para los péptidos ejemplificados
como PG-1, PG-2,
PG-3, PG-4 y PG-5
aquí presentes.
Los compuestos del invento particularmente
preferidos son:
| PG-5: | R-G-G-R-L-C-Y-C-R-P-R-F-C-V-C-V-G-R |
| PG-5: | R-G-G-R-L-C-Y-C-R-P-R-F-C-V-C-V-G-R |
| IB-324: | R-G-G-G-L-C-Y-C-R-P-R-F-C-V-C-V-G-R-OH |
| IB-218: | R-G-G-G-L-C-Y-C-F-P-K-F-C-V-C-V-G-R |
ambas formas lineales y mono- y bicíclicas del
mismo, e incluyendo las formas N-terminal aciladas y
C-terminal amidadas;
| IB-225: | R-G-G-G-L-C-Y-A-R-P-R-F-A-V-C-V-G-R |
| IB-226: | R-G-G-G-L-C-Y-T-R-P-R-F-T-V-C-V-G-R |
ambas formas lineales y cíclicas (donde sea
posible) del mismo, e incluyendo las formas
N-terminal aciladas y C-terminal
amidadas.
Particularmente preferidos son los compuestos en
los que un único enlace de cistina está formado entre C_{6} y
C_{15} ó entre C_{8} y C_{13} en los que cuatro compuestos que
tienen un enlace de cistina entre C_{8} y C_{13} cada uno de
C_{6} y C_{15} es independientemente reemplazado por ``X'' en el
que X es un aminoácido hidrófobo, pequeño, o grande polar.
Igualmente, en el que el enlace único de cistina está entre C_{8}
y C_{13}, estando cada uno de C_{6} y C_{15} reemplazado
independientemente por X como se define anteriormente. También
preferidas son las formas de ``serpiente'' de los compuestos del
invento donde todas las 4 cisteínas son reemplazadas por X como se
define anteriormente. Las realizaciones particularmente preferidas
de estos compuestos del invento incluyen:
Forma de cometa-5
Forma de bala-5
en las que X es como se define
anteriormente.
Las realizaciones particularmente preferidas de X
son aquellas en las que X es un aminoácido pequeño, especialmente S
y A, especialmente A.
Los compuestos del invento, frecuentemente
designados aquí ``protegrinas'' son esencialmente esqueletos
peptídicos que pueden estar modificados en el N- ó C- terminal y
pueden también contener uno o dos uniones disulfuro de cistinas. Los
péptidos pueden ser primero sintetizados en forma no cíclica. Estos
péptidos pueden ser entonces convertidos en péptidos cíclicos si se
desea por métodos estándar de formación de enlace de cistina. Como
se aplica aquí a las protegrinas, las ``formas cíclicas'' se
refieren a esas formas que contienen porciones cíclicas en virtud de
la formación de uniones disulfuro entre residuos de cisteína en el
péptido. Si las formas de cadena lineal son preferidas, es
preferible estabilizar los grupos sulfhidrilo para cualquiera de los
péptidos del invento que contengan dos o más residuos de
cisteína.
Se conocen métodos estándar de síntesis de
péptidos del tamaño de las protegrinas. Actualmente los más
comúnmente usados son las técnicas de síntesis en fase sólida; en
realidad, se pueden comprar equipos automatizados para la
construcción sistemática de cadenas peptídicas. También se puede
usar una síntesis de fase líquida pero es considerablemente menos
conveniente. Cuando se sintetiza usando estas técnicas estándar, los
aminoácidos no codificados por el gen y los enantiómeros D se pueden
emplear en la síntesis. Así, un camino muy práctico para obtener los
compuestos del invento es emplear estas técnicas estándares de
síntesis química.
Además para proporcionar el esqueleto peptídico,
el N y/ó C- terminal pueden ser derivatizados, usando de nuevo las
técnicas químicas convencionales. Los compuestos del invento pueden
contener opcionalmente un grupo acilo, preferiblemente un grupo
acetilo en el amino terminal. Métodos para acetilar o, más
generalmente, acilar, el grupo amino libre en el
N-terminal son generalmente conocidos en la técnica;
además, el aminoácido N-terminal puede ser
suministrado en la síntesis en la forma acilada.
En el extremo carboxi terminal, el grupo
carboxilo puede, por supuesto, estar presente en forma de una sal;
en el caso de composiciones farmacéuticas esto será una sal
farmacéuticamente aceptable. Las sales adecuadas incluyen aquellas
formadas con iones inorgánicos tales como NH_{4}^{+}, Na^{+},
K^{+}, Mg^{++}, Ca^{++}, y los similares así como las sales
formadas con cationes orgánicos tales como aquellos de la cafeína y
otras aminas altamente sustituídas. El extremo carboxi terminal
puede ser también esterificado usando alcoholes de la fórmula ROH en
la que R es hidrocarbilo (1-6C) como se define
anteriormente. Igualmente, el extremo carboxi terminal puede estar
amidado para tener la fórmula -CONH_{2}, CONHR, ó -CONR_{2}, en
la que cada R es independientemente hidrocarbilo
(1-6C) como se define aquí. Técnicas para
esterificación y amidación así como de neutralización en presencia
de la base para formar sales son todas técnicas estándar de química
orgánica.
Si los péptidos del invento se preparan en
condiciones fisiológicas, los grupos amino de la cadena lateral de
los aminoácidos básicos estarán en la forma de sales de adición
ácida relevantes.
La formación de uniones disulfuro, si se desea,
es llevada a cabo en presencia de agentes oxidantes suaves. Se
pueden usar agentes químicos oxidantes, o los compuestos pueden ser
simplemente expuestos al oxígeno del aire para efectuar estas
uniones. Diversos métodos son conocidos en la técnica. Procesos
útiles para la formación de enlaces disulfuro han sido descritos por
Tam, J.P. y otros, Synthesis (1979) 955-957;
Stewart, J.M. y otros, ``Solid Phase Peptide Synthesis'' 2d Ed.
Pierce Chemical Company Rockford, IL (1984); Ahmed A.K. y otros,
J Biol Chem (1975) 250: 8477-8482 y
Pennington M.W. y otros, Peptides 1990, E. Giralt y
otros, ESCOM Leiden, The Netherlands (1991) 164-166.
Una alternativa adicional está descrita por Kamber, B. y otros,
Helv Chim Acta (1980) 63: 899-915. Un
método llevado a cabo en soportes sólidos está descrito por
Albericio Int J Pept Protein Res (1985) 26:
92-97.
Un método particularmente preferido es una
disolución de oxidación que usa oxígeno molecular. Este método ha
sido usado por los inventores aquí para replegar los
PG-1, PG-3 sintéticos en sus formas
amida o ácidas, enantioPG-1 y los dos
compuestos unisulfuro PG-1
(C_{6}-C_{15} y
C_{8}-C_{13}). Las recuperaciones son tan altas
como el 30%.
Si el esqueleto peptídico está comprendido
enteramente de aminoácidos codificados genéticamente, o si alguna
porción de esté está así compuesta, el péptido o la porción
relevante puede ser también sintetizada usando técnicas de ADN
recombinante. El ADN que codifica para los péptidos del invento
puede sintetizarse él mismo usando equipos comercialmente
disponibles; la elección del codon se puede integrar dentro de la
síntesis dependiendo de la naturaleza del hospedante.
Alternativamente, aunque menos conveniente, el ADN se puede obtener,
al menos inicialmente, por cribado de una biblioteca de cADN
preparada a partir de leucocitos de porcino usando sondas o
cebadores de PCR basados en las secuencias de las protegrinas aquí
descritas. Esto da como resultado la recuperación de la secuencia
que codifica para las protegrinas del invento presentes de manera
natural. La obtención de esta secuencia nativa es significativa para
propósitos distintos de la síntesis de las protegrinas per
se; la disponibilidad de las secuencias presentes de manera
natural proporciona una sonda útil para obtener el ADN
correspondiente que codifica para las protegrinas de otras especies.
Así, las bibliotecas de cADN, por ejemplo, de leucocitos derivados
de otros animales se pueden cribar usando el ADN nativo,
preferiblemente bajo condiciones de alta restricción. Alta
restricción es como se define por Maniatis, y otros Molecular
Cloning: a Laboratory Manual 2^{nd} Ed, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989), las porciones relevantes de las que se
incorporan aquí por referencia. Este procedimiento también permite
recuperar las variantes alélicas de estos péptidos a partir de las
mismas especies.
Alternativamente, las protegrinas se pueden
preparar mediante el aislamiento a partir de leucocitos de una
especie deseada usando técnicas similares a aquellas descritas aquí
para el aislamiento de protegrinas de porcino. En general, estas
técnicas implican la preparación del lisado de una preparación de
leucocitos, el ultrafiltrado del sobrenadante del lisado clarificado
y la recuperación del ultrafiltrado. El ultrafiltrado se somete
entonces a separación cromatográfica. La localización de los
fragmentos que tienen actividad anitimicrobiana y antiviral
correspondiente a las protegrinas se puede evaluar usando criterios
de peso molecular y ensayando las fracciones en lo que respecta a
las actividades deseadas como aquí se describe. Las formas nativas
de estos péptidos se cree que están en forma cíclica; si se desea,
las formas linealizadas se pueden preparar tratando los péptidos con
agentes reductores y estabilizando los grupos sulfhidrilo que
resultan.
Las formas aisladas y producidas de modo
recombinante de las protegrinas pueden requerir derivatizaciones
posteriores para modificar el extremo N-terminal y/ó
el extremo C-terminal y, dependiendo del
procedimiento de aislamiento, efectuar la formación de enlaces de
cistina como se describe anteriormente. Dependiendo del organismo
hospedante usado para la producción recombinante y la fuente animal
de la que se aísla la proteína, algunos o todas estas conversiones
pueden haber sido ya efectuadas.
Para la producción recombinante, el ADN que
codifica para las protegrinas del invento está incluido en un
sistema de expresión que coloca estas secuencias codificantes bajo
control de un promotor adecuado y otras secuencias de control
compatibles con una célula hospedante deseada. Los tipos de células
hospedantes disponibles abarcan casi todo el rango del reino animal
y vegetal. Así, las protegrinas del invento podrían producirse en
bacterias o levaduras (hasta el punto de que se pueden producir en
una forma no tóxica o refráctil o utilizar cepas resistentes) así
como en células animales, células de insectos y células vegetales.
En realidad, se pueden usar células vegetales modificadas para
regenerar plantas que contengan los sistemas de expresión relevantes
de modo que la planta transgénica resultante sea capaz de
autoprotegerse cara-a-cara frente a
estos agentes infecciosos.
Las protegrinas del invento se pueden producir en
una forma que resultará en su secreción de la célula hospedante
fusionándose con el ADN que codifica para la protegrina, un ADN que
codifica para un péptido señal adecuado, o pueden ser producidas
intracelularmente. También pueden ser producidas como proteínas de
fusión con secuencias aminoacídicas adicionales que podrán o no
necesitar ser eliminadas posteriormente previo al uso de estos
compuestos como antimicrobianos o antivirales.
Así, las protegrinas del invento pueden ser
producidas en una variedad de modalidades que incluyen síntesis
química, producción recombinante, aislamiento a partir de fuentes
naturales, o alguna combinación de estas técnicas.
Esos miembros de la clase protegrina presentes de
manera natural son suministrados en forma purificada y aislada. Por
``purificada y aislada'' se refiere libre del entorno en el que el
péptido se encuentra normalmente (en el caso de tales péptidos
presentes de manera natural) y en una forma en la que se puede usar
de modo práctico. Así, forma ``purificada y aislada'' significa que
el péptido es sustancialmente puro, es decir, más del 90% puro,
preferiblemente más del 95% puro y más preferiblemente más del 99%
puro o que esté en un contexto completamente diferente tal como el
de una preparación farmacéutica.
Anticuerpos frente a las protegrinas del invento
pueden también producirse usando técnicas inmunológicas estándar
para la producción de antisueros policlonales y, si se desea,
inmortalizando las células productoras de anticuerpos del hospedante
inmunizado para fuentes de producción de anticuerpos monoclonales.
Son bien conocidas las técnicas para producir anticuerpos frente a
cualquier sustancia de interés. Puede ser necesario potenciar la
inmunogenicidad de la sustancia, particularmente como aquí, en que
el material es sólo un péptido corto, acoplando el hapteno al
vehículo. Los vehículos adecuados para este propósito incluyen
sustancias que no produzcan por sí mismas una respuesta inmune en el
mamífero al que se administra el conjugado
hapteno-vehículo. Los vehículos comunes usados
incluyen hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide diftérico,
albúmina sérica, y la cubierta viral proteica del rotavirus, VP6. El
acoplamiento del hapteno al vehículo se efectúa por técnicas
estándares tales como poner en contacto el vehículo con el péptido
en presencia de un agente deshidratante tal como la
diciclohexilcarbodiimida o a través del uso de péptidos de unión
tales como aquellos disponibles a través de la compañía química
Pierce Chemical Company, Chicago, IL.
Las protegrinas del invento en forma inmunogénica
son luego inyectadas en un hospedante mamífero adecuado y las
concentraciones de anticuerpos en suero se monitorizan. Debería
observarse, sin embargo, que algunas formas de las protegrinas
requieren modificación antes de que sean capaces de provocar la
producción de anticuerpos, debido a su resistencia al procesamiento
antigénico. Por ejemplo, la forma nativa de PG-1,
que contiene dos puentes de cistina no es inmunogénica cuando se
administra sin acoplar a un vehículo más grande y era un inmunógeno
débil incluso en presencia de adyuvantes potentes y que cuando se
acopla a glutaraldehído o a KLH. Los solicitantes creen que esto es
debido a su resistencia al ataque por serínproteasas de leucocitos
(elastasa humana PMN y catepsina G) así como al ataque por una
aspárticoproteasa (pepsina) que se asemeja a varias catepsinas de
macrófagos. La falta de inmunogenicidad puede por tanto resulta de
la resistencia al procesamiento hacia una forma lineal que pueda
encajar en el bolsillo que presenta al antígeno de las células
presentadoras de antígenos. La inmunogenicidad de estas formas de
las protegrinas se puede potenciar mediante el corte de los enlaces
disulfuro.
Los antisuero policlonales puede ser recogidos
cuando las concentraciones son lo suficientemente altas.
Alternativamente, las células productoras de anticuerpos del
hospedante tales como células de bazo o linfocitos de sangre
periférica pueden ser recogidas e inmortalizadas. Las células
inmortalizadas son entonces clonadas como colonias individuales y
seleccionadas para la producción de los anticuerpos monoclonales
deseados.
Los anticuerpos del invento son, por supuesto,
útiles en inmunoensayos para determinar la cantidad o presencia de
las protegrinas. Tales ensayos son esenciales en producción de
calidad controlada de las composiciones que contienen las
protegrinas del invento. Además, los anticuerpos pueden usarse para
evaluar la eficacia de la producción recombinante de las
protegrinas, así como para cribar las bibliotecas de expresión en lo
que respecta a la presencia de genes que codifican para
protegrinas.
Las protegrinas del invento son eficaces en
desactivar un amplio rango de dianas microbianas y virales,
incluyendo bacterias gram-positivas y
gram-negativas, levaduras, protozoos y ciertas cepas
de virus. Consecuentemente, se pueden usar en composiciones
desinfectantes y como conservantes para materiales tales como
comestibles, cosméticos, medicamentos, u otros materiales que
contengan nutrientes para organismos. Para el uso en tales
contextos, las protegrinas son suministradas bien como una única
protegrina, en mezcla con otras varias protegrinas, o bien en mezcla
con agentes antimicrobianos adicionales. En general, como estas son
conservantes en este contexto, están normalmente presentes en
cantidades relativamente pequeñas, de menos del 5%, por peso de la
composición total, más preferiblemente menos del 1%, aún más
preferiblemente menos del 0,1%.
Los péptidos del invento son también útiles como
estándares en ensayos antimicrobianos y en ensayos para determinar
la capacidad de los compuestos de ensayo de unirse a endotoxinas
tales como lipopolisacáridos.
Para uso como antimicrobianos o antivirales para
el tratamiento de sujetos animales, las protegrinas del invento
pueden ser formuladas como composiciones farmacéuticas o
veterinarias. Dependiendo del sujeto a tratar, el modo de
administración, y el tipo de tratamiento deseado - por ejemplo,
prevención profilaxis, terapia; las protegrinas se formulan en modos
en consonancia con estos parámetros. Un resumen de tales técnicas se
encuentra en Pharmaceutical Sciences de Remington, última
edición, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Las protegrinas son particularmente atractivas
como un ingrediente activo de composiciones farmacéuticas útiles en
el tratamiento de enfermedades de transmisión sexual, incluyendo
aquellas causadas por Chlamydia trachomatis, Treponema
pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas
vaginalis, Herpes simplex tipo 2 y VIH. Las formulaciones
tópicas son preferidas e incluyen cremas, ungüentos, aceites,
polvos, geles y similares. Los vehículos tópicos adecuados son bien
conocidos en la técnica y pueden ser adaptados para usos
particulares por aquellos profesionales de conocimiento común.
En general, para el uso en tratamiento o
profilaxis de ETS, las protegrinas del invento se pueden usar solas
o en combinación con otros antibióticos tales como eritromicina,
tetraciclina, macrólidos, por ejemplo azitromicina y las
cefalosporinas. Dependiendo del modo de administración, las
protegrinas se formularán en composiciones adecuadas para permitir
la liberación superficial a las áreas afectadas. Las protegrinas se
pueden usar en formas que contengan uno o dos puentes disulfuro o
pueden estar en forma lineal. Además, el uso de formas
enantioméricas que contienen todos los D-aminoácidos
pueden otorgar ventajas tales como resistencia a esas proteasas,
tales como tripsina y quimotripsina, para las que las protegrinas
que contienen L-aminoácidos son menos
resistentes.
Las protegrinas del invento se pueden administrar
individualmente o como mezcla de varias protegrinas o en combinación
con otros componentes farmacéuticamente activos. Las formulaciones
se pueden preparar en una forma adecuada para administración
sistémica o tópica o administración local. Las formulaciones
sistémicas incluyen aquellas designadas para inyección (por ejemplo,
inyección intramuscular, intravenosa o subcutánea) o se puede
preparar para administración transdérmica, transmucosal, u oral. La
formulación incluirá generalmente un diluyente así como, en algunos
casos, adyuvantes, tampones, conservantes y similares. Las
protegrinas se pueden administrar también en composiciones
liposomales o como microemulsiones.
Si la administración tiene que ser oral, las
protegrinas del invento deben protegerse de la degradación en el
estómago usando un revestimiento entérico adecuado. Esto puede
evitarse en cierta extensión utilizando aminoácidos en configuración
D, que proporcionan de ese modo resistencia a la proteasa. Sin
embargo, el péptido es aún susceptible a la hidrólisis debido a las
condiciones ácidas del estómago; de ese modo, puede aún requerirse
cierto grado de revestimiento entérico.
Como se describe en los ejemplos a continuación,
los péptidos del invento conservan su actividad frente a microbios
en el contexto de disoluciones de borato que son comúnmente usadas
en los productos para el cuidado de los ojos. También se ha
demostrado que cuando se ha ensayado la actividad antimicrobiana
frente a E. coli en presencia y ausencia de lisozima en
salino de borato tamponado, la presencia de lisozima potencia la
eficacia del PG-3. Este efecto fue más pronunciado
cuando el PG-3 fue autoclavado y patrones similares
se obtuvieron para tanto la forma libre de ácidos como la forma
amida. Consecuentemente, las protegrinas se pueden usar como
conservantes en tales composiciones o como antimicrobianos para el
tratamiento de infecciones oculares.
Es particularmente importante que las protegrinas
conserven su actividad en condiciones fisiológicas incluyendo
concentración de salino relativamente alta y en presencia de suero.
Además, las protegrinas no son citotóxicas con respecto a las
células de organismos superiores. Estas propiedades, descritas aquí
a continuación en los Ejemplos, las hacen particularmente adecuadas
para uso in vivo y terapéutico.
Las protegrinas del invento pueden aplicarse
también a las plantas o a su entorno para impedir enfermedades
inducidas por virus y microbios en estas plantas. Las composiciones
adecuadas para este uso contendrán típicamente un diluyente así como
un agente de difusión u otros ajustes subsidiarios beneficiosos para
la planta o el entorno.
De ese modo, las protegrinas del invento pueden
usarse en cualquier contexto en el que se requiera una acción
antimicrobiana y/o antiviral. Este uso puede ser un uso totalmente
in vitro, o se puede administrar los péptidos a los
organismos.
Además, la actividad antimicrobiana o antiviral
se puede generar in situ administrando un sistema de
expresión adecuado para la producción de las protegrinas del
invento. Tales sistemas de expresión pueden ser suministrados a
sujetos vegetales y animales usando técnicas conocidas. Por ejemplo,
en animales, se pueden usar vectores de expresión basados en virus
pox para generar los péptidos in situ. Igualmente, las
células vegetales pueden ser transformadas con vectores de expresión
y luego regeneradas como plantas completas que son capaces de su
propia producción de los péptidos.
Una propiedad particularmente útil de las
protegrinas es su actividad en presencia de suero. A diferencia de
las defensinas, las protegrinas son capaces de ejercer sus efectos
antimicrobianos en presencia de suero.
Como se muestra aquí a continuación, las
protegrinas son capaces de desactivar endotoxinas derivadas de las
bacterias gram-negativas -es decir,
lipopolisacáridos (LPS)- en ensayos estándar. Consecuentemente, las
protegrinas se pueden usar en cualquier circunstancia en la que la
desactivación de LPS es deseada. Una de tales situaciones está en el
tratamiento o mejora de la sepsis gram-negativa.
Las protegrinas del invento, por tanto,
representan una clase peculiarmente útil de compuestos debido a las
siguientes propiedades:
1) Tienen un efecto antimicrobiano con respecto a
un amplio espectro de sistemas microbianos diana, incluyendo virus,
incluyendo retrovirus, bacterias, hongos, levaduras y protozoos.
2) Su actividad antimicrobiana es eficaz en
condiciones fisiológicas - es decir, salino fisiológico y en
presencia de suero.
3) No son tóxicas a las células de organismos
superiores.
4) Se pueden preparar en forma no inmunogénica
extendiendo así el número de especies a las que se pueden
administrar.
5) Se pueden preparar en formas que son
resistentes a ciertas proteasas que sugieren que son antimicrobianas
incluso en lisosomas.
6) Se pueden preparar en formas que resisten la
degradación cuando se autoclavan, simplificando así su preparación
como componentes de fármacos.
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar pero
no limitar el invento.
Se recogió sangre porcina fresca en recipientes
de 15 litros que contenían 5% de EDTA en salino normal, pH 7,4 como
un anticoagulante (33 ml/litro de sangre). Se dejó que las células
de la sangre sedimentaran durante 90 minutos a temperatura ambiente
y el sobrenadante rico en leucocitos fue eliminado y centrifugado a
200 x g durante 5,7 minutos. Los precipitados fueron juntados y
resuspendidos en cloruro amónico 0,84% para lisar los eritrocitos y
los leucocitos resultantes (70-75% de PMN,
5-10% de eosinófilos, 15-25% de
linfocitos y monocitos) fueron lavados en salino normal,
resuspendidos en ácido acético 10% enfriado en hielo a 10^{8}/ml,
homogeneizados y agitados durante toda la noche a 4ºC. La
preparación fue centrifugada a 25.000 x g durante 3 horas a 4ºC y el
sobrenadante fue liofilizado y pesado.
950 mg (peso seco) de extracto liofilizado, que
contenían 520 mg de proteína mediante análisis de BCA, fueron
agitados durante toda la noche a 4ºC en 100 ml de ácido acético 10%
y luego centrifugados a 25.000 x g durante 2 horas. El sobrenadante
fue retirado y pasado por presión a través de una celdilla de
ultracentrifugación 50 ml por agitación (Amicon, Danvers, Ma) que
contenía un filtro YM-5. El ultrafiltrado (24,5 mg
de proteína por BCA) fue concentrado a 3 ml mediante centrifugación
al vacío (SpeedVac concentrator, Savant Instruments, Hicksville,
NY), aplicado a una columna de BioGel P10 2,5 x 117 cm
(Bio-Rad, Hercules, CA) y eluído a 4ºC con ácido
acético 5%.
Se obtuvieron fracciones que contenían 6,6 ml.
Las fracciones fueron ensayadas mediante la absorción a 280 nm y el
patrón de elución se muestra en la Figura 1.
Alícuotas (66 \mul) de cada fracción fueron
secadas mediante centrifugación al vacío y resuspendidas en 6,6
\mul de ácido acético 0,01%. Muestras de cinco \mul de este
concentrado fueron ensayadas en lo que respecta a la actividad
antimicrobiana frente a E. coli ML-35, L.
monocytogenes, cepa EGD y C. albicans, cepa 820, usando
radiodifusión y técnicas de solapamiento en gel como está descrito
por Lehrer, R.I. y otros J Immunol Meth (1991) 137:
167-173. Brevemente, los agares de recubrimiento
usados para todos los organismo tuvieron un pH final de 6,5 y
contenían fosfato sódico 9 mM/ tampón citrato sódico 1 mM, agarosa
1% p/v y polvo de caldo de soja triptocasa 0,30 \mug/ml (BBL
Cockeysville, MD). Las unidades de actividad en el ensayo de
difusión radial fueron medidas como se describe; 10 unidades
correspondientes a una zona clara de 1 mm de diámetro alrededor del
pocillo de la muestra. Las actividades obtenidas para las diversas
fracciones se muestran en la Figura 2. Se encontró actividad en un
gran número de fracciones.
Las fracciones activas fueron examinadas
adicionalmente mediante PAGE de ácido urea (AU-PAGE)
y SDS PAGE. Los resultados de estos análisis mostraron que los
péptidos antimicrobianos activos del peso molecular apropiado
estaban presentes y concentrados en las fracciones
76-78.
Las fracciones 76-78 de la
columna de Biogel P10 fueron luego juntadas y cromatografiadas sobre
una columna Vydac 218 TP1010 de 1 x 25 cm con un gradiente (tampón A
es 0,1% TFA; tampón B es 0,1% TFA en acetonitrilo) el aumento en
concentración de acetonitrilo fue de 1% por minuto. Los resultados,
evaluados en términos de absorbancia a 280 nm y a 225 nm se muestran
en la Figura 3. Los picos correspondientes a los tres péptidos
ilustrados aquí están etiquetados en la figura. La figura contiene
también un recuadro que muestra los resultados de un gel de
ácido-urea PAGE teñido con Azul de Coomassie que
contiene una mezcla inicial compuesta de fracciones reunidas y
especies PG individuales. Estas están etiquetadas M, 1, 2 y 3 en el
recuadro. Los resultados muestran claramente la presencia de tres
proteínas distintas.
Las proteínas aisladas fueron sometidas a
análisis de aminoácidos usando tres métodos independientes, y a la
degradación de Edman, digestión por quimotripsina, y a análisis de
espectrometría de masa por bombardeo de átomos rápidos. Los
péptidos, llamados ``protegrinas'', se muestra que tienen las
secuencias de aminoácidos como sigue:
PG-1: RGGRLCYCRRRFCVCVGR
PG-2: RGGRLCYCRRRFCICV
PG-3: RGGGLCYCRRRFCVCVGR,
y están amidadas en el extremo
C-terminal.
El status de amidación de los péptidos aislados
se estableció por síntesis de PG-3, ambos en las
formas de carboxilo libre y carboxiamidadas. Estos péptidos
sintéticos se compararon luego para aislar PG-3
usando AU-PAGE y usando también HPLC de fase
inversa. En ambos casos, el producto nativo comigró con la forma
amidada sintética.
La situación de las uniones disulfuro en las
protegrinas aisladas fue también estudiada usando
PG-2 como modelo. La determinación fue realizada
usando digestión enzimática secuencial (quimotripsina seguida por
termolisina) con análisis directos usando
LC-ESI-MS en los fragmentos
obtenidos. Los resultados de estos análisis mostraron que los dos
enlaces disulfuro intramoleculares fueron
C_{6}-C_{15} y C_{8}-C_{13}.
Con la situación de los disulfuros en estas posiciones, es probable
que las moléculas de protegrina existan como láminas \beta
antiparalelas similares a la taquiplesina en conformación
global.
Las proteínas antimicrobianas anteriores están
presentes en concentraciones mucho menores en extractos iniciales
que lo están las defensinas de conejo en los extractos brutos
correspondientes en los que las defensinas constituyen más del 15%
de la proteína total en granulocitos de conejo. Usando el método
analítico AU-PAGE en diversos estadíos de
purificación, los péptidos son sólo visibles débilmente en extractos
brutos, mientras que los extractos brutos correspondientes de
granulocitos de conejo muestran claramente la presencia de las
defensinas. Los péptidos del invento se vuelven claramente
evidentes sólo después de la etapa de ultrafiltración.
Debido a que las protegrinas, cuyas estructuras
están expuestas anteriormente, muestran homología de secuencia en la
región decapeptídica correspondiente a los residuos
1-10 de la defensina de conejo NP-3a
en la región decapeptídica en las posiciones 4-13 de
PG-3, las protegrinas, y en particular
PG-3, pueden compartir la propiedad de la defensina
NP-3a en ser capaces de antagonizar
competitivamente la síntesis esteroidea mediada por ACTH por
adrenocitos. Esta propiedad, llamada ``corticostasis'', puede
influir en la eficacia de las protegrinas como agentes
antiinfecciosos cuando se emplean in vivo.
El ensayo de difusión radial en geles de agarosa
descrito en el Ejemplo 1 fue usado también para ensayar la actividad
de las protegrinas purificadas. Las Figuras 4a, 4b y 4c muestran los
resultados frente a tres organismos de ensayo en unidades como se
describe anteriormente. La defensina de conejo
(NP-1) y la defensina humana (HNP-1)
fueron usadas como testigos.
La figura 4a muestra que PG-1 y
PG-3 son más eficaces frente a E. coli
ML-35P que HNP-1 y sólo ligeramente
menos eficaz que NP-1. PG-1 y
PH-3 fueron también eficaces frente a Listeria
monocytogenes, cepa EGD como se muestra en la Figura 4b. En la
Figura 4c, PG-1 y PG-3 se mostraron
también eficaces frente a Candida albicans. En general, estos
péptidos son aproximadamente tan eficaces como la defensina
NP-1 de conejo en base al peso y son más eficaces
que el HNP-1. En todos los casos,
PG-2 fue también eficaz frente a los tres organismos
ensayados pero no fue tan activo como los otros dos péptidos.
Además de su actividad en inhibir el crecimiento
de los organismos anteriormente mencionados, el PG-1
del invento se ha demostrado directamente que inhibe el crecimiento
de Staphylococcus aureus (véase la Figura 4d) y K.
pneumoneae 270 (Figura 4e). El HNP-1 usado como
un testigo fue menos eficaz frente a S. aureus y casi
enteramente ineficaz frente a K. pneumoneae.
Las protegrinas del invento han sido también
ensayadas frente a otros diversos organismos y muestran actividad de
amplio espectro. Además de su eficacia en inhibir el crecimiento de
o infección por microorganismos asociados con ETS como se describe
en el Ejemplo 9 aquí a continuación, las protegrinas muestran una
fuerte actividad frente a los siguientes microorganismos además de
los ensayados aquí anteriormente: Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, Histoplasma capsulatum, Myobacterium
avium-intracellulare, y Mycobacterium
tuberculosis. Las protegrinas mostraron sólo una débil actividad
frente a Vibrio vulnificus y fueron inactivas frente a
Vibrio cholerae y Borrelia burgdorferi.
La actividad antimicrobiana de los compuestos del
invento fue ensayada como se expone anteriormente, pero bajo
condiciones de NaCl 100 \muM y en presencia de suero de ternera
fetal 90%. Las figuras 5a y 5b muestran que PG-1 y
PG-3 conservan su actividad con respecto a C.
albicans y E. coli respectivamente, incluso en presencia
de NaCl 100 mM. Ni NP-1 ni NHP-2
tienen esta propiedad. La figura 5c muestra que aunque
NP-1 y NHP-2 pierden su capacidad
para desactivar C. albicans en de suero ternera fetal 90%, la
desactivación por PG-3 se conserva.
Consecuentemente, las protegrinas del invento
conservan sus propiedades antimicrobianas en condiciones
fisiológicas útiles, incluyendo disoluciones isotónicas y de borato
apropiadas para el uso en productos para el cuidado de los ojos.
Además, el PG-1 sintético se
ensayó con respeto a su actividad frente a E. coli
ML-35 (sensible a suero) en geles de recubrimiento
que contenían sólo tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7,4 y una
dilución de 1:100 de caldo de soja triptocasa, ambos en presencia y
ausencia de 2,5% de suero humano normal, que está debajo de la
concentración lítica para esta cepa de E. coli. En presencia
de suero, la concentración bactericida mínima se redujo desde 1,0
\mug/ml aproximadamente a alrededor de 0,1 \mug/ml. Este tipo de
efecto no fue observado ni por un fragmento lineal de catepsina G ni
por la defensina HNP-1.
Igualmente, usando C. albicans como un
organismo diana, geles de recubrimiento fueron preparados con
fosfato sódico 10 mM con y sin suero humano normal 10%. La
concentración fungicida mínima cayó desde alrededor del 1,3
\mug/ml en ausencia de suero a 0,14 \mug/ml en su presencia. El
suero por sí mismo a esta concentración no afectó a C.
albicans.
Así, la acción de las protegrinas no sólo no es
inhibida por la presencia del suero sino que es potenciada de este
modo. Resultados similares fueron obtenidos usando L.
monocytogenes como el organismo diana.
Las protegrinas PG-1 y
PG-3 fueron incubadas durante 4 horas a pH 2,0 con
pepsina 0,5 \mug/ml y luego neutralizadas. La actividad
antimicrobiana residual frente a C. albicans, E. coli y L.
monocytogenes fue evaluada y se encontró completamente
conservada. Experimentos similares muestran que estos compuestos no
se degradan por elastasa de leucocito humano o por catepsina G de
leucocitos humanos, incluso cuando están expuestos a altas
concentraciones de estas enzimas y a un pH de 7,0 - 8,0 favorable
para la actividad proteolítica. Además, la amida
PG-3 sintética y el ácido PG-3
sintético fueron autoclavados y ensayados en lo que respecta a
actividad antimicrobiana frente a E. coli, L monocyogenese y
C. albicans; conservando una actividad antimicrobiana total
en todos los casos. Es posible que la estabilidad de estos
compuestos a la degradación de proteasa y al autoclavado sea
potenciada por la presencia de enlaces disulfuro.
Las protegrinas del invento fueron ensayadas en
lo que respecta a su capacidad para unir el lípido polisacárido
(LPS) de la bacteria gram-negativa de la cepa 0,55B5
de E. coli. El ensayo fue el ensayo de lisado de amebocitos
de Limulus (LAL) para endotoxinas llevado a cabo en presencia y
ausencia de los compuestos de ensayo. El ensayo fue llevado a cabo
usando el procedimiento descrito en el Sigma Technical Bulletin Nº
210 como se revisó en Diciembre de 1992 y se publicó por Sigma
Chemical Company, St Louis, Mo.
El ensayo LAL se basa en la capacidad del LPS de
afectar la gelificación en el reactivo comercial
E-Toxate™ que se prepara a partir del lisado de
amebocitos circulantes del cangrejo de herradura Limulus
polyphemus. Como se describe en el boletín técnico, cuando se
expone a cantidades mínimas de LPS, el lisado aumenta en opacidad
tanto como en viscosidad y puede gelificar dependiendo de la
concentración de endotoxina. El boletín técnico continua en
especular que el mecanismo parece análogo a la coagulación de sangre
de mamífero e implica las etapas de activación de una enzima de
precoagulación similar a la tripsina por el LPS en presencia de ión
calcio, seguido por modificaciones enzimáticas de un ``coagulógeno''
por proteolisis para producir una proteína coagulable. Estas etapas
se consideran unidas a la porción biológicamente activa o
``pirogénica'' de la molécula. Se ha mostrado previamente que el LPS
destoxificado (o endotoxina) da un ensayo LAL negativo.
Los compuestos del ensayo fueron usados a
diversas concentraciones desde 0,25 \mug-10 \mug
en un volumen final de 0,2 ml y las mezclas del ensayo contenían LPS
a una concentración final de 0,05 unidades de endotoxina/ml y
E-Toxate™ a la misma concentración. Los compuestos
de ensayo fueron incubados junto con el LPS durante 15 minutos antes
de que el E-Toxate™ se añadiera a un volumen final
después de la adición de 0,2 ml de E-Toxate™. Los
tubos fueron luego incubados durante 30 minutos a 37ºC y examinados
en lo que respecta a la formación de un gel.
Ambas protegrinas nativas aisladas (nPGs) y
protegrinas preparadas sintéticamente (sPGs) fueron ensayadas. Las
sPGs fueron preparadas con un grupo carboxilo en el extremo
C-terminal o con un extremo
C-terminal amidado. Las nPGs están amidadas en el
extremo C-terminal. También se ensayaron seis
defensinas diferentes de conejo (NPs) y cuatro defensinas nativas de
humano (HNPs). Los resultados se muestran en la Tabla 1.
| Péptido | 10 \mug | 5 \mug | 2,5 \mug | 1,0 \mug | 0,5 \mug | 0,25 \mug |
| nPG-1 | sin gel | sin gel | sin gel | sin gel | + | ++ |
| nPG-2 | sin gel | sin gel | sin gel | sin gel | + | ++ |
| nPG-3 | sin gel | sin gel | trazas | ++ | ++ | ++ |
| sPG-3 ácido | sin gel | sin gel | trazas | ++ | ++ | ++ |
| sPG-3 amida | sin gel | sin gel | sin gel | + | ++ | ++ |
| NP-1 | no ensayado | no ensayado | ++ | ++ | ++ | ++ |
| NP-2 | trazas? | + | + | ++ | ++ | ++ |
| NP-3a | sin gel | sin gel | sin gel | ++ | ++ | ++ |
| NP-3b | sin gel | sin gel | + | ++ | ++ | ++ |
| NP-4 | no ensayado | no ensayado | + | ++ | ++ | ++ |
| NP-5 | sin gel | trazas | + | + | ++ | ++ |
| HNP-1 | sin gel | + | + | ++ | ++ | ++ |
| HNP-2 | trazas | trazas | trazas | + | + | ++ |
| HNP-3 | sin gel | + | + | ++ | ++ | ++ |
| HNP-4 | sin gel | trazas | trazas | ++ | + | ++ |
Como se observa a partir de los resultados, todas
las protegrinas, tanto sintéticas como nativas, y tanto en las
formas amidadas como no amidadas son capaces de unirse
suficientemente al LPS para impedir cualquier formación sustancial
de gel a concentraciones tan bajas como 2,5 \mug/0,2 ml.
nPG-1 y nPG-2 son eficaces a
concentraciones algo más bajas. Las protegrinas fueron
sustancialmente más eficaces que los compuestos de ensayo NP o HNP;
el más eficaz de entre estos testigos fue el NP-3a,
un péptido cuya secuencia primaria se parece más próxima a la de las
protegrinas.
En un experimento de seguimiento, la
concentración de LPS se varió desde 0,05-0,25
unidades de endotoxina (U.E.) y la amida PG-3
sintética se usó como compuesto de ensayo. Los resultados se
muestran en la Tabla 2.
| Unidades de endotoxina | 0,25 U.E. | 0,10 U.E. | 0,05 U.E. |
| sPG-3 (2,5 \mug) | sin gel | sin gel | sin gel |
| sPG-3 (1,0 \mug) | sin gel | sin gel | sin gel |
| sPG-3 (0,5 \mug) | ++ | ++ | sin gel |
| sin proteína añadida | ++ | ++ | ++ |
Estos resultados muestran que puesto que la
inhibición de gelificación puede ser superada incrementando la
concentración de LPS, la interacción con LPS es responsable de la
ausencia de gelificación, más que interfiriendo con la cascada de la
enzima de gelificación.
nPG-1 y nPG-3
fueron convertidas a la forma lineal usando un agente reductor para
convertir las uniones disulfuro en grupos sulfhidrilo, que fueron
luego estabilizados mediante alquilación con yodoacetamida.
La capacidad tanto de PG-1 y
PG-3 cíclicos como linealizados para inhibir la
gelificación en el ensayo LAL estándar fue evaluada luego como se
describe en el Ejemplo 4 y los resultados se muestran en la Tabla
3.
| Péptido | 5 \mug | 2,5 \mug | 1,0 \mug | 0,25 \mug | |
| nPG-1 | sin gel | sin gel | ++ | ++ | ++ |
| cam-nPG-1 | sin gel | sin gel | ++ | ++ | ++ |
| nPG-3 | sin gel | sin gel | ++ | ++ | ++ |
| cam-nPG-3 | sin gel | sin gel | ++ | ++ | ++ |
Estos resultados muestran que las formas
linealizadas y cíclicas de las protegrinas son igualmente capaces de
inhibir la gelificación y unirse a las endotoxinas.
La actividad antimicrobiana de las formas
linealizadas fue también comparada con la de las protegrinas
nativas. Ambas formas cíclicas y linealizadas de las protegrinas
ensayadas continúan mostrando actividad antimicrobiana, aunque la
eficacia de estos péptidos como antimicrobianos depende de la
naturaleza del organismo diana y de las condiciones de ensayo. La
actividad antimicrobiana del PG-1 nativo y su forma
linealizada (cam-PG-1) y PG-3
y su forma linealizada (cam-PG-3) se
ensayaron según el procedimiento expuesto en el Ejemplo1 como se
describe por Lehrer, R.I. y otros J Immunol Meth
(1991) 137:167-173. Los resultados están
expuestos en las Figuras 6a-6f.
Las figuras 6a y 6b muestran la actividad
antimicrobiana de estos péptidos en el intervalo de concentración de
20 \mug/ml-125 \mug/ml con respecto a E.
coli ML-35P tanto en tampón
fosfato-citrato10 mM, pH 6,5 (Figura 6a) como en
presencia de este tampón más NaCl 100 mM (Figura 6b). Ambas
protegrinas mostraron una fuerte actividad antimicrobiana con
respecto a este organismo; la forma lineal fue ligeramente más
potente en presencia del tampón solo que lo que lo fue la forma
cíclica; por otro lado, la forma cíclica fue más potente que la
forma lineal bajo condiciones isotónicas.
Las figuras 6c y 6d muestran el efecto
antimicrobiano con respecto a L. monocytogenes. En la figura
6c donde se usó el tampón solo anteriormente mencionado, ambas
formas cíclicas y linealizadas de las protegrinas mostraron una
fuerte actividad antimicrobiana y ambas fueron aproximadamente
igualmente eficaces a lo largo del intervalo de concentración
ensayado (20 \mug/ml-125 \mug/ml).
La figura 6d muestra el efecto con respecto a la
L. monocytogenes en presencia de este tampón más NaCl 100 mM
a lo largo del mismo intervalo de concentración. La forma cíclica
conservó una actividad antimicrobiana fuerte con una dependencia de
concentración ligeramente superior. La linealización pareció reducir
la actividad apreciablemente aunque concentraciones altas fueron
todavía capaces de mostrar un efecto antimicrobiano.
La levadura C. albicans fue ensayada con
los resultados mostrados en las figuras 6e y 6f. La figura 6e
muestra que todas las formas de estas protegrinas eran
antimicrobianas de un modo dosis dependiente a lo largo del
intervalo de concentración anterior cuando se ensayó en presencia de
tampón fosfato solo 10 mM, aunque los péptidos linealizados fueron
ligeramente menos eficaces. La figura 6f muestra los resultados del
mismo ensayo llevado a cabo en presencia de tampón más NaCl 100 mM.
Mientras las formas cíclicas conservaron aproximadamente el mismo
nivel de efecto antimicrobiano, la actividad de las formas
linealizadas disminuyó sumamente de modo que a concentraciones por
debajo de 100 \mug/ml de la protegrina, no se observó virtualmente
efecto antimicrobiano. Sin embargo, a concentraciones superiores de
130 \mug/ml, se observó un efecto antimicrobiano moderado.
Así, dependiendo del microorganismo diana y de
las condiciones usadas, ambas formas cíclicas y linealizadas de las
protegrinas tienen actividad antimicrobiana.
\newpage
Disoluciones para lentes de contacto son
formuladas típicamente con salino fisiológico tamponado con borato y
además pueden o no contener EDTA. Las protegrinas en forma de amida
PG-3 sintética y de ácido PG sintético fueron
ensayadas generalmente en el ensayo descrito en el Ejemplo 1 en el
que todos los geles de recubrimiento contenían tampón borato 25 mM,
pH 7,4, caldo de soja triptocasa 1% (v/v) (0,3 \mug/ml de polvo
TSB) y agarosa 1%. Las adiciones incluyen tanto NaCl 100 mM, EDTA 1
mM o una combinación de los mismos. Otros compuestos de ensayo
usados como testigos fueron la defensina NP-1 y la
lisozima. Se determinaron curvas de dosis respuesta.
La Tabla 4 muestra las concentraciones
bactericidas mínimas estimadas en \mug/ml de los diversos
compuestos de ensayo.
| Concentraciones fungicidas minimas estimadas (\mug/ml) | ||||
| Péptido | tampón | + EDTA | + NaCl | + EDTA \textamp NaCl |
| sPG-3 amida | 13,0 | 9,5 | 4,1 | 3,1 |
| sPG-3 ácido | 15,0 | 9,5 | 4,6 | 3,7 |
| NP-1 | 35,0 | 45,0 | >200 | >200 |
| lisozima | 75,0 | 45,0 | >200 | >200 |
Aunque las protegrinas son algo menos activas en
25 mM de salino tamponado con borato que en tampón fosfato 25 mM, la
actividad antimicrobiana es potenciada mediante la adición de salino
fisiológico y modestamente potenciada por EDTA 1 mM, como se muestra
en la tabla.
Un ensayo similar se llevó a cabo con Candida
albicans como el organismo diana con los resultados mostrados en
la Tabla 5, que muestran también estimaciones de concentraciones
mínimas fungicidas.
| Concentraciones fungicidas minimas estimadas (\mug/ml) | |||
| Péptido | tampón borato | Tampón borato | Tampón borato |
| 25 mM | + de NaCl 120 mM | + EDTA \textamp NaCl | |
| nPG-3 | 32,0 | 9,0 | 8,0 |
| sPG-3 amida | 19,0 | 7,7 | 7,0 |
| sPG-3 ácido | 19,0 | 9,2 | 9,3 |
| NP-1 | 23,0 | 60,0 | 65,0 |
| HNP-1 | 25,0 | >200 | >200 |
\newpage
La Tabla 6 muestra los resultados de experimentos
similares llevados a cabo con L. monocytogenes como
diana.
| Concentraciones bactericidas minimas estimadas (\mug/ml) | |||
| Péptido | tampón borato | Tampón borato | Tampón borato |
| 25 mM | + de NaCl 120 mM | + EDTA \textamp NaCl | |
| nPG-3 | 25,0 | 7,0 | 5,7 |
| sPG-3 amida | 21,0 | 5,7 | 5,2 |
| sPG-3 ácido | 30,0 | 7,0 | 7,0 |
| NP-1 | 20,0 | 11,0 | 3,8 |
| HNP-1 | 11,0 | >200 | >200 |
Los resultados mostrados indican que estos
compuestos son capaces de ejercer sus efectos antimicrobianos en
condiciones típicamente asociadas con condiciones adecuadas para los
productos del cuidado de los ojos.
Se extrajo ARN total de las células de la médula
ósea de un cerdo Duroc rojo joven con tiocianato de guanidinio. Un
\mug de ARN total se usó para sintetizar la primera hebra de cADN,
con 20 pmoles de cebador Oligo (dT) y 200 U de transcriptasa inversa
de virus Moloney de leucemia murina (M-MLV)
(Clontech Laboratory, Palo Alto, CA) en un volumen de reacción
total de 20 \mul. Se prepararon dos cebadores de PCR. El cebador
homosentido (5' -GTCGGAATTCATGGAGACCCAGAG (A ó G)
GCCAG-3') correspondía a las regiones 5' de cADN de
PG-2 y PR-39 y contenía un sitio de
restricción EcoRI. El cebador antisentido (5' -GTCGTCTAGA (C ó G)
GTTTCACAAGAATTTATTT-3') era complementario a los
extremos 3' de PG-2 y PR-39 de cADN
precediendo inmediatamente sus colas poli A y contenían un sitio de
restricción XbaI. La PCR se llevó a cabo en un volumen de 50 \mul
usando 1/10 de volumen del cADN anterior de cerdo como molde, 25
pmoles de cebadores y 2,5 unidades de polimerasa de ADN AmpliTaq
(Perkin Elmer-Cetus). La reacción se llevó a cabo
durante 30 ciclos, con 1 minuto de desnaturalización (94ºC) y etapas
de hibridación (60ºC) y una etapa de extensión de 2 min (72ºC) por
ciclo.
El cADN amplificado se fraccionó por
electroforesis de agarosa preparativa y setiñó con bromuro de
etidio. El fragmento principal se recortó, se digirió con EcoR I y
endonucleasas Xba I (New England Biolabs, Beverly, MA), se subclonó
en un vector bacteriófago M13mp18, y se transformó en células
competentes E. coli XL1-Blue MRF'
(Stratagene, La Jolla, CA). La secuenciación del ADN se realizó con
un equipo (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Secuencias de
nucleótido y proteína se analizaron con PC-GENE
(Intelligenetics, Palo Alto, CA).
Diez \mug de RNA total fueron desnaturalizados
en formamida 50%, separados por electroforesis a través de geles de
agarosa 1% en formaldehído 0,62 M, y transferidos a las membranas
GeneScreen Plus (Dupont, Boston, MA) por transferencia capilar. La
membrana se introdujo en un horno a 80ºC durante 2 h, y se hibridó
con una sonda marcada con ^{32}P en un tampón de hibridación
rápida (Amersham, Arlington Height, IL).
Los resultados de secuenciar diversos clones que
codifican para las diversas protegrinas se resumen en la Figura 7.
Las secuencias de cADN de las protegrinas PG-1,
PG-3 y PG-4 contienen 691 bases
como se había mostrado previamente para PG-2 por
Storici, P. y otros Biochem Biophys Res Comm (1993)
196: 1363-1368. Los cADN muestran una
secuencia corriente arriba que codifica para 110 aminoácidos que
parecen idénticos para todas las protegrinas. Diferencias
adicionales, que son bastante ligeras en naturaleza, se muestran en
la Figura 7.
Los análisis mostraron la presencia de la
protegrina PG-4 que tiene una secuencia de
aminoácidos de Fórmula (1) en la que A_{10} es un aminoácido
pequeño y A_{11} es un aminoácido hidrófobo como se distingue de
las protegrinas previamente conocidas en las que estos residuos son
básicos. La secuencia de aminoácido de PG-4 es por
tanto RGGRLCYCRGWICFCVGRG, en la que 1, 2, ó 3 aminoácidos en el
extremo N-terminal pueden ser suprimidos.
Se obtuvieron clones adicionales por
amplificación de ARN de célula ósea porcina retrotranscrita usando
un cebador aguas arriba que corresponde al extremo 5' de
PG-2 y otro péptido asociado a catelina, PR39,
(Agerbeth B y otros, Eur J Biochem (1991) 202:
849-854; Storici, P. y otros Biochem
Biophys Res Comm (1993) 186: 1058-1065) y
un cebador aguas abajo que se une la región que precede
inmediatamente a la región poli A. El producto de PCR resultante de
0,7 kb aproximadamente se subclonó en M13mp18 y se eligieron placas
recombinantes para purificación y secuenciación. De esta manera, las
secuencias para los precursores de PG-1,
PG-3 y PG-4 fueron recuperadas.
Todos estos péptidos están codificados por una secuencia
nucleotídica que codifica para un precursor que contiene una
secuencia adicional de aminoácidos aguas arriba de A_{1} del
compuesto de fórmula 1 (como se muestra para PG-4 en
la Figura 7).
ADN genómico molecular grande fue purificado a
partir de glóbulos blancos de sangre de cerdo con un kit de ADN de
sangre QIAGEN (QIAGEN, Chatsworth, CA). Para amplificar los genes de
protegrina (PG), se realizó una PCR usando ADN genómico como
molde.
El cebador homosentido (5'
-GTCGGAATTCATGGAGACCCAGAG (A ó G)GCCAG-3') se
corresponde a las regiones 5' de cADN de PG, del Ejemplo 7 y
proporcionó un sitio de restricción EcoRI. El cebador antisentido
(5' -GTCGTCTAGA(C ó
G)GTTTCACAAGAATTTATTT-3') era complementario
a los extremos 3' de los cADN de PG precediendo inmediatamente sus
colas poli (A) y proporcionando un sitio de restricción XbaI. La
reacción se llevó a cabo en un volumen total de 50 \mul, que
contenía 200 ng de ADN genómico purificado de cerdo, 25 pmoles de
cada cebador, 1 \mul de dNTP 10 mM, 5 \mul de tampón para PCR
10X (Tris-HCl 200 mM, (NH_{4})_{2} 100 mM,
MgSO_{4} 20 mM, Tritón X-100 1%, BSA 0,1%), y 2,5
unidades de de ADN polimerasa Pfu clonada (Stratagene, La Jolla,
CA). Se realizaron treinta ciclos, cada uno con 1 min de
desnaturalización a 94ºC, 1 min de hibridación de cebador a 55ºC, 2
min de extensión del cebador a 72ºC, y una etapa de extensión final
a 72ºC durante 10 min.
El producto PCR amplificado se digirió con EcoRI
y XbaI, se recortó del gel agarosa, se purificó, y se ligó en el
vector pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) que había sido
digerido con EcoRI y XbaI y se purificó. Ambas hebras de ADN se
secuenciaron por el método didesoxi usando el kit de Sequenasa
versión 2.0 (United States Biochemical, Cleveland, OH), cebadores
universales pBluescript y cebadores oligoméricos específicos basados
en el PG genómico y secuencias de cADN. Se realizó un análisis
informático de las secuencias de ADN usando el programa
PC-Gene (Intelligenetics, Palo Alto, CA).
Un producto PCR de alrededor de 1,85 kb se
confirmó como relacionado con las protegrinas mediante hibridización
con una sonda oligonucleotídica específica de protegrina
complementaria a los nucleótidos 403-429 de las
secuencias de cADN de protegrina. El producto de PCR fue luego
subclonado en un vector pBluescript, y plásmidos recombinantes
fueron sometidos a purificación de ADN y secuenciación. Secuencias
génicas para tres protegrinas diferentes fueron identificadas
PG-1, PG-3 y PG-5.
Las secuencias nucleotídicas y las secuencias aminoacídicas
deducidas se muestran en la Figura 8.
La comparación de cADN y genes de protegrinas
reveló que las regiones codificantes de los genes de protegrina
consistían de cuatro exones, interrumpidos por tres intrones
(Figuras 8 y 9). El primer exón contenía la región 5' no codificante
y los codones para los 66 primeros aminoácidos del prepropéptido de
protegrina, incluyendo un péptido señal de 29 residuos y los 37
primeros residuos de la catelina. Los exones II y III eran
relativamente pequeños, sólo 108 y 72 pb respectivamente, y juntos
contenían los siguientes 60 residuos de catelina. Los últimos dos
residuos de catelina estaban en el Exón IV, y estaban seguidos por
las secuencias de protegrina. Las secuencias de los sitios de corte
y empalme exón-intrón se muestran en la Tabla 7, y
se ajustan a la regla de consenso: todos los intrones acaban en un
doblete AG, precedido por una extensión rica en T/C de
8-12 bases, mientras todos los intrones empiezan con
GT, seguidos predominantemente por la secuencia A/G A/G G.
| Exón | Tamaño | Donador del sitio de corte y | Intrón | Tamaño | Aceptor del sitio de corte y |
| empalme en 5' | empalme en 3' | ||||
| 1 | ? + 198 | AAGGCCgtgagtcg | 1 | 405 | ttgaccagGACGAG |
| 2 | 108 | AACGGGgtgaggct | 2 | 152 | ccttccagCGGGTG |
| 3 | 72 | AATGAGgtgagtgg | 3 | 596 | ggtcacagGTTCAA |
| 4 | 313 |
La región de catelina altamente conservada que
abarca los exones I-IV y el exón IV contiene la
secuencia completa del péptido de protegrina madura seguido por una
secuencia de consenso de amidación, una región 3' no traducida, y el
sitio putativo de poliadenilación. Los tres intrones oscilan en
tamaño desde 152 hasta 596 pb. Si los genes de protegrina son
representativos de otros genes similares a la catelina, el tercer
intrón de los péptidos asociados a la catelina se encontrará que
separa todos excepto los dos últimos residuos de la región de
catelina altamente conservada de los péptidos antimicrobianos
variables codificados en el exón IV. Tal disposición favorecería los
mecanismos de recombinación que implican la asociación de los
diversos exones IV con los tres primeros exones especificando las
preproregiones que contiene catelina.
La familia de las protegrinas presentes de manera
natural contiene de este modo al menos 5 miembros. La Figura 10
muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de las
cinco protegrinas encontradas hasta ahora en los leucocitos de
porcino. Hay una completa homología en las posiciones
1-3, 5-9, 13 y
15-16.
La búsqueda de homología de los genes de
protegrina frente al EMBL/GenBank no identificó genes
significativamente homólogos. Más específicamente, las estructuras
génicas y secuencias nucleotídicas de las protegrinas fueron muy
diferentes de las de las defensinas, que contienen tres exones en
los genes de la defensina mieloide, y dos exones en los genes de la
defensina entérica. Como se esperaba, la búsqueda produjo la gran
familia de cADN correspondientes a los péptidos asociados a las
catelinas de leucocitos de bovino, porcino y conejo.
Para evaluar adicionalmente los genes
relacionados a la protegrina, exploramos una biblioteca genómica de
porcino de aproximadamente 2,3 x 10^{5} clones en
EMBL-3 SP6/T7 con el cADN de protegrina marcado con
^{32}P, y 45 clones híbridados identificados.
Una biblioteca genómica de hígado de porcino en
fagos EMBL3 SP6/T7 fue comprada a Clontech (Palo Alto, CA). La cepa
K803 de E. coli se usó como hospedante, y ADN de placas de
fagos se transfirió a membranas de nilón (DuPont, Boston, MA). Los
filtros se hibridaron con cADN 691de PG-3 de porcino
marcado con ^{32}P. Los filtros fueron lavados varias veces,
finalmente a 60ºC en 0,1x SSC y 0,1% de SDS, y fueron expuestos a
película de rayos X con una pantalla intensificadora a -70ºC. Los
clones positivos fueron sometidos a dos rondas adicionales de
purificación de placa a baja densidad.
El ADN purificado de los clones hibridados se
digirió con diversas endonucleasas de restricción (New England
Biolabs, Beverly, MA), se fraccionó en geles de agarosa 0,8%, y se
transfirió a una membrana GeneScreen Plus (DuPont, Boston, MA). Las
sondas de hibridación se marcaron con ^{32}P e incluían cADN de
PG-3 de porcino, oligonucleótido específico de
protegrina marcado en 5'- complementario a los nts
403-429 de cADN de PG-1, 2 y 3.
Para la sonda de cADN, las condiciones de hibridación y lavado se
llevaron a cabo como para el cribado de la biblioteca. Para la sonda
oligonucleotídica, las membranas se lavaron a 42ºC en 0,1x SSC, SDS
0,1%.
El análisis de transferencia por Southern se
llevó a cabo con ADN purificado a partir de clones positivos
mediante hibridación con cADN de protegrina y un oligonucleótido
específico para protegrina complementario a los nts
403-429 de las secuencias de cADN de protegrina.
Aunque todos los clones hibridaron con la sonda de cADN completa,
solamente alrededor de la mitad de ellos hibridaron con la sonda
específica para protegrina. Una sonda oligonucleotídica específica
para profenina porcina, otro péptido antimicrobiano derivado de
leucocito porcino asociado a catelina, hibridaron con varios de los
clones que no eran protegrinas. Estos resultados confirman a) que la
proregión homóloga a catelina conservada está presente dentro del
mismo gen como los péptidos antimicrobianos maduros y no se añade
por eventos postranscripcionales, y b) que las protegrinas dan
cuenta de alrededor de la mitad de los genes relacionados con la
catelina en cerdo.
Un péptido sintético correspondiente a la
secuencia de aminoácido de PG-5 se preparó y se
ensayó con respecto a la actividad antimicrobiana frente a E.
coli, L. monocytogenes y C. albicans. Los resultados se
compararon con los obtenidos con un PG-1 preparado
sintéticamente. Los resultados se muestran en las Figuras
11a-11c. Como se muestra en estas representaciones
gráficas de los resultados, el PG-5 tiene actividad
antimicrobiana comparable a la del PG-1 frente a los
tres organismos ensayados.
Usando técnicas de fase sólida estándar, se
preparó una protegrina que tenía la secuencia aminoacídica de
PG-1, pero en la que cada aminoácido está en la
forma D. Esta forma de protegrina se ensayó frente a E. coli, L.
monocytogenes, C. albicans y otros microbios en ausencia y en
presencia de proteasas y de otro modo como se describió para el
ensayo de radiodifusión en geles de agarosa expuesto en el Ejemplo
1. Los resultados se muestran en las Figuras
12a-12g.
La figura 12a muestra que ambos
PG-1 nativo y enantioPG-1 en
ausencia de proteasa son igualmente eficaces en inhibir el
crecimiento de E. coli. La figura 12b muestra que ni la
tripsina ni la quimotripsina inhiben el efecto antibacteriano del
enantioPG-1. La figura 12c muestra que en
presencia de estas enzimas proteolíticas, la capacidad del
PG-1 nativo para inhibir el crecimiento de L.
monocytogenes está adversamente afectada, aunque, como se
muestra en la figura 12d, en ausencia de estas proteasas el
PG-1 es activo comparablemente a un
enantioPG-1.
La Tabla 8 resume la actividad de la protegrina
PG-1 como se compara con la defensina
HNP-1 frente al crecimiento de patógenos de ETS. En
estos resultados, ``activo'' significa que el péptido fue eficaz a
menos de 10 \mug/ml; moderadamente activo indica que era activo en
10-25 \mug/ml; y ligeramente activo significa
actividad a 25-50 \mug/ml. Si no se obtiene efecto
a 50-200 \mug/ml el compuesto se considera
inactivo.
| Actividad frente a patógenos humanos de ETS | Protegrina PG-1 | Defensina HNP-1 |
| VIH-1 | Activa | Ligeramente activa |
| Chlamydia trachomatis | Activa | Ligeramente activa |
| Treponema pallidum | Activa | Inactiva |
| Neisseria gonorrhoeae | Activa | Inactiva |
| Trichomonas vaginalis | Moderadamente activa | Inactiva |
| Herpes simplex tipo 2 | Moderadamente activa | Ligeramente activa |
| Herpes simplex tipo 1 | Inactiva | Ligeramente activa |
| Hemophilus ducreyi | No ensayada | No ensayada |
| papiloma virus humano | No ensayada | No ensayada |
A diferencia de otras bacterias asociadas con
ETSs, la Chlamydia requiere un hábitat intracelular para una
actividad metabólica y una fisión binaria. El ciclo de vida es como
sigue: hay una forma extracelular que es una partícula inactiva
metabólicamente algo similar a una espora en su comportamiento,
mencionado como un cuerpo elemental (CE). El CE se une a la célula
hospedante y es ingerido para formar un espacio interno vacuolar
llamado frecuentemente una ``inclusión''. La bacteria se reorganiza
a un cuerpo reticulado delicado (CR) que no es infeccioso pero que
es metabólicamente activo y que a lo largo de un período de
48-72 horas sufre una reforma al estado CE. Los CE
son luego liberados de la célula. Más que una capa de
peptidoglicano, la Chlamydia contiene múltiples uniones
disulfuro en proteínas ricas en cisteína para la protección en el
estado CE.
Las protegrinas del invento se ensayaron en lo
que respecta a su actividad antimicrobiana frente a Chlamydia
usando el sistema de cultivo clamidial ``oro estándar'' para
muestras clínicas descritas por Clarke, L.M. en Clinical
Microbiology Procedures Handbook II (1992), Isenberg, H.T. Ed.
Am. Soc. Microbiol. Washington, D.C.; pp. 8,0,1 a 8,24,3,9,
Brevemente, células McCoy (una línea celular de ratón) en EMEM con
cicloheximida con suero bovino fetal (FBS) 10% se usan como
hospedantes. Previamente a la inoculación clamidial, el medio de
mantenimiento se aspira sin alterar la capa celular y la capa
celular se mantiene sobre un cubreobjetos en un vial estándar. Cada
vial se inocula luego con 100-300 \muL de inóculo
y se centrifuga a 3500 x g durante una hora a 20ºC. El fluido se
aspira entonces y se añade 1 ml de EMEM. Los viales se tapan y se
incuban a 37ºC durante 48 horas. Después de 48 horas el medio se
aspira de nuevo, los cubreobjetos se enjuagan dos veces con PBS y se
fijan con 300 \muL de EtOH durante 10 minutos. El EtOH se aspira y
los viales se dejan secar; luego se añade una gota de PBS más 30
\muL de anticuerpo monoclonal Syva Microtrak a la proteína
principal de la membrana externa de Chlamydia para teñirla.
Después de una incubación a 37ºC durante 30 minutos, las células se
lavan con agua destilada y se examinan en lo que respecta a
inclusiones que son fácilmente reconocibles como vacuolas
citoplasmáticas brillantes, con tinción manzana verde. Representan
el equivalente de una colonia de bacterias en libertad en medios de
cultivo bacterianos estándares.
En los ensayos llevados a cabo más adelante, se
usó C trachomatis serovar L2 (L2/434Bu) descrito por Kuo,
C.C. y otros en Nongynococcal Urethritis and Related
Infections (1977), Taylor-Robinson, D. y
otros Ed. Am. Soc. Microbiol. Washington, D.C., pp.
322-326. El germen se prepara a partir de un cultivo
sonicado en L929 de células de fibroblastos de ratón, y parcialmente
purificado mediante centrifugación. Puesto que la proteína
hospedante está aún presente en las alícuotas del germen, cada lote
de gérmen se valora en cuanto a su concentración al tiempo de
preparación con diluciones seriadas de diez veces diluídas hasta 2 x
10^{-9}. El germen que contiene 9,2 x 10^{6} UFI/ml se
descongela rápidamente a 37ºC y se diluye a 10^{-2} con
sacarosa/sales de fosfato /glicina para producir UFI de alrededor de
200 después de una preincubación a temperatura ambiente y para
diluir la proteína eucariótica de fondo.
En los ensayos iniciales, los péptidos fueron
preparados como disoluciones patrón en ácido acético glacial 0,01%.
100 \muL del germen clamidial diluido fueron alicuotados en tubos
eppendorf de 1,5 ml y se añadieron 200 \muL del péptido
antibiótico por tubo. Las alícuotas del péptido patrón (y testigos)
se incubaron con el germen a temperatura ambiente durante una hora,
dos horas y cuatro horas. Durante 10 minutos antes del final de cada
período de incubación, los medios de mantenimiento se aspiraron a
partir de los viales McCoy en preparación para la inoculación y el
cultivo estándar. El cultivo se realizó luego en presencia y
ausencia de los péptidos; en algunos casos, los péptidos se
añadieron a la concentración final en los medios de cultivo junto
con la incubación del precultivo. El ensayo se evaluó
microscópicamente.
Los resultados que usaban 50 \mug de protegrina
por adición fueron dramáticos. En cultivos testigo, donde no se
añadieron péptidos, se contaron 222-460 inclusiones.
En todos los protocolos donde se añadió protegrina, tanto antes de
que se añadiera el germen de Chlamydia a las células, como
antes y después, no se encontraron inclusiones. Se obtuvieron
resultados similares con adiciones de 20 \mug de taquiplesina. Las
defensinas NP-1 y HNP-1 tuvieron
efectos protectores menores. En resumen, las protegrinas ensayadas
muestran actividad antimicrobiana frente a Chlamydia.
En las siguientes series de experimentos, se
usaron diversas concentraciones de protegrina (1 \mug, 12,5
\mug, 25 \mug y 50 \mug) en las dos horas de preincubación.
Concentraciones tan bajas como 12,5 \mug redujeron el número de
inclusiones a cero. Incluso a una concentración de 1 \mug/ml, el
número de inclusiones se redujo dramáticamente desde alrededor de
110 a alrededor de 30.
En el siguiente grupo de experimentos, se ensayó
el efecto de la presencia de suero. El germen de Chlamydia se
preincubó durante dos horas con y sin FBS 10% y también con o sin
protegrina a 25 \mug. La protegrina fue altamente eficaz tanto con
como sin suero, mientras que la defensina humana
HNP-2, usada como testigo, fue razonablemente eficaz
en ausencia de suero pero sólo ligeramente eficaz en su
presencia.
Los experimentos se repitieron pero se añadieron
25 \mug de protegrina una después del inicio del cultivo
clamidial, es decir, después de la centrifugación y mezcla del medio
final y una hora dentro del comienzo del período de cultivo de 48
horas. La protegrina redujo el número de inclusiones en
aproximadamente el 57% de los testigos sin tratar aunque el
HNP-2 fue completamente ineficaz. Finalmente, la
protegrina (a 25 \mug) se añadió al germen clamidial y luego la
mezcla se cultivó inmediatamente. En este caso, sin preincubación y
sin el intervalo de una hora posterior a la infección, la protegrina
fue mínimamente eficaz con o sin suero.
El efecto del suero es particularmente importante
puesto que para que un agente tópico sea eficaz en combatir la
infección por Chlamydia, debe actuar en presencia de
suero.
Además, hay varios modelos basados en ratón para
la infección por Chlamydia que se pueden usar para evaluar la
eficacia de las protegrinas. Estos incluyen los descritos por
Patton, D.L. y otros en Chlamydial Infections (1990)
Bowie, W.R. y otros Eds. Cambridge University Press NY pp.
223-231; Swenson, C.E. y otros J. Infect.
Dis. (1983) pp. 1101-1107, y Barron, A.L. y
otros J. Infect. Dis. (1981) 143:
63-66.
En más detalle, la capacidad de las protegrinas
para inhibir N. gonorrhoeae se ensayó mediante una
modificación del método de Miyasaki y otros, Antimicrob
Agent Chemother (1993) 37: 2710-2715.
Variantes transparentes si pilli de cepas FA 19 y F 62 se propagaron
en placas de agar GCB que contenían suplementos de glucosa y de
hierro durante la noche a 37ºC a 3,8% V/V de CO_{2}. Estas cepas
se eligieron por su adaptabilidad al ensayo.
Lo que había crecido durante la noche se retiró
de la placa de agar y se suspendió en caldo GCB que contenía
suplementos y bicarbonato de sodio y creció con agitación a 37ºC
hasta la mitad de la fase logarítmica. El cultivo se diluyó 1:100 en
caldo GCB para dar alrededor de 10^{6} UFC/ml y se colocaron
disoluciones seriadas en agar GCB.
Los péptidos se disuelven en ácido acético 0,01%
v/v para dar una disolución patrón de 1 mg/ml y se diluyen en serie.
Diez \mul de cada disolución se añade a tubos de poliestireno
estériles que contenían 90 \mul de bacterias diluidas y los tubos
se agitan a 37ºC durante 45 minutos. Los contenidos se diluyen en
serie 1:10 y se colocan en placas de agar GCB que son incubadas en
un incubador de CO_{2}. Las UFC se cuentan después de 24 horas y
se calcula la actividad bactericida logarítmica.
El PG-1 nativo,
PG-1 sintético, PG-3 amida sintética
y PG-3 sintética sin amidación dan todos una
reducción de más de 5 unidades logarítmicas en UFC por ml en este
ensayo. El PG-2 nativo (que contiene 16 aminoácidos)
dio una reducción de 2,6 veces.
Además, el enantioPG-1, el
PG-1 unidisulfuro
(C_{6}-C_{15}), y el PG-1
unisulfuro (C_{8}-C_{13}) dieron una reducción
de más de 5 veces en unidades logarítmicas en UFC/ml en este
ensayo.
Se ensayó también la actividad bactericida frente
a este organismo, que es el agente etiológico de la sífilis. Los
péptidos se evaluaron en una serie de concentraciones desde 1,758
\mug a 56,25 \mug en 90 \mul de suero de conejo normal sin
calentar. El suero sirvió como nutriente para las espiroquetas para
permitir su supervivencia durante la incubación así como para
proporcionar una fuente de complemento. Diez \mul de una
suspensión de T. pallidum que contenían alrededor de 5 x
10^{7} organismos/\mul se añadieron a cada tubo y las mezclas
con los péptidos apropiados se incubaron a 34ºC en N_{2} 95% y 5%
de CO_{2}. A tiempo cero, previamente a la incubación, 4 horas y
16 horas, se examinaron 24 organismos seleccionados aleatoriamente
en lo que respecta a la presencia o ausencia de movilidad. El 50%
del punto final de inmovilidad (IE_{50}) se calculó para indicar
la concentración necesaria para inmovilizar al 50% de las
espiroquetas. En presencia de PG-1, el IE_{50} a 0
y 4 horas fue de 2,717 \mug y < 1, 758 \mug, respectivamente.
Los IE_{50} de Taquiplesina fueron 5,231 \mug y 2,539 \mug
durante 0 y 4 horas. Esto estaba en contraste con las preparaciones
de HNP y NP que mostraron una pequeña capacidad inmovilizante.
Usando patrones virales preparados en células
VERO, hechas crecer en un medio esencial mínimo (MEM) con suero de
ternera fetal 2%, el efecto de diversos péptidos sobre la cepa HSV 1
MacIntyre, un grupo de diez HSV 1 clínicos aislado,
HSV-2G, y un grupo de diez HSV 2 clínicos aislado,
todos sensibles a aciclovir 3 \muM fueron ensayados. Dos líneas
celulares de fibroblasto, W138 humana y CCL57 equina, fueron usadas
como dianas y se hicieron ensayos por neutralización viral directa y
se retardó la adición de péptido.
En el formato de neutralización directa, el virus
se preincubó con los péptidos durante 90 minutos antes de ser
añadido a las monocapas de cultivo tisular. En el formato de adición
de péptido retardado, el virus se añadió y se dejó 50 min que se
adsorbiera a las células diana, luego las monocapas se lavaron y los
péptidos se añadieron durante 90 min. Finalmente, la monocapa se
lavó para retirar el péptido y las células se alimentaron con MEM
libre de péptido y se cultivaron hasta que las monocapas infectadas
sin tratar exhibieron un efecto citopático (CPE) 4+ (a alrededor de
60 horas).
En ambos formatos se observó actividad antiviral,
pero fue más pronunciada con el modo de adición de péptido
retardado. En experimentos realizados con células W138 y CCL57 en
formato de neutralización directa, el PG-1 impidió
completamente que el HSV-2G provocara CPE a
concentraciones de 50 \mug/ml y 25 \mug/ml, pero estas
concentraciones no proporcionaron protección frente a
HSV-1, que produjo 4+ de CPE.
En el formato de adición de péptido retardado, el
PG-1 impidió completamente CPE por
HSV-2G a 35 \mug/ml y 50 \mug/ml y también
protegió completamente frente al grupo de HSV-2
clínico a ambas concentraciones.
Así, el PG-1 protegió células
humanas y animales frente a infección por cepas
HSV-2 de laboratorio y clínicas, incluso cuando los
péptidos fueron añadidos tan tarde como 60 min después de que el
virus fuera introducido en el cultivo de la célula.
La cepa C1 de trichomonas vaginallis (ATCC
30001) fue hecha crecer como se describe por Gorrell, T.E. y
otros, Carlsberg Res Comm (1984) 49:
259-268. En experimentos realizados en RPMI + suero
de ternera fetal activado por calor 1%, dentro de pocos minutos
después de exposición a PG-1 50 \mug/ml, la T.
vaginallis (hasta este momento vigorosamente móvil) se volvió
estacionaria. Inmediatamente después, los organismos se volvieron
permeables al azul de tripán, y, durante los siguientes
15-30 minutos, se lisaron. Como se esperaba, tales
organismos fueron incapaces de crecer cuando se introdujeron en su
medio de crecimiento habitual (Diamond's medium). Los organismos
expuestos a 25 \mug/ml de PG-3 retuvieron su
movilidad.
Estudios iniciales con dos cepas de T.
vaginallis altamente resistentes a metronidazol aislados
clínicamente, cepas MR y TV mostraron ambas ser susceptibles a
PG-1, incluyendo C_{8}-C_{13} y
C_{6}-C_{15} uni-disulfuros y
enantioPG-1 a concentraciones de 100 y 50 \mug/ml.
Ambos PG-1 sintético y nativo y
PG-2 nativo fueron ensayados en lo que respecta a la
actividad antiviral frente a cepas de VIH usando el método descrito
en Miles, S.A. y otros, Blood (1991) 78:
3200-3208. Brevemente, la fracción de células
mononucleadas se recupera a partir de leukopacs de donantes normales
de la Cruz Roja Americana usando un gradiente de densidad
Ficoll-hypaque. Las células mononucleadas se
resuspenden a 1 x 10^{6} células por ml en medio RPMI 1640 con
suero bovino fetal 20%, penicilina/estreptomicina 1% con fungizona
y PHA 0,5% e incubados durante 24 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}.
Las células son centrifugadas, lavadas y luego puestas a expandir
durante 24 horas en un medio de crecimiento.
VIH_{JR-CSF} y
VIH_{JR-FL} clonados no adaptado al laboratorio,
fueron electroporados en células mononucleadas de sangre periférica
humana preparadas como se describe anteriormente. Las
concentraciones se determinaron y en general, se usaron los valores
de multiplicidad de infección (MOI) de alrededor de 4.000 unidades
infecciosas por célula (lo que corresponde a 25-40
picogramos por ml de antígeno p24 de VIH en el sobrenadante).
En el ensayo, los patrones de VIH preparados como
antes se diluyeron al número correcto de MOI y los PBM se añadieron
a placas de 24 pocillos a una concentración de 2 x 10^{6} por ml.
Un \mul de volumen total se añade a cada pocillo. El péptido a ser
ensayado es añadido en un medio de crecimiento para lograr la
concentración final deseada. Luego se añade el número apropiado de
MOI. Para ensayar el crecimiento viral, 200 \mul de sobrenadante
se retiran en los días 3 y 7 y la concentración de antígeno p24 se
determina usando un ensayo comercial (Coulter Immunology, Hialeah,
Florida). Los testigos incluyen fuentes duplicadas que contienen
células solas, células más péptido a 5 \mug/ml de células con
virus pero no péptido y células con virus en presencia de AZT a
10^{-5} M - 10^{-8} M.
Usando este ensayo, se demostró que ambos,
PG-1 nativo y sintético, inhiben completamente la
infección por VIH a concentraciones entre 1-5
\mug/ml; el IC_{90} fue < 5 \mug/ml. El tiempo de adición
de péptido fue luego variado. Células pretratadas durante 2 horas
previas a la adición del virus, al tiempo de adición del virus, ó 2
horas después de la infección mostraron actividad antiviral para el
péptido. Sin embargo, si el PG-1 era añadido 24
horas después de la infección, no había actividad antiviral.
Además, el PG-2 muestra actividad
similar pero a un nivel de aproximadamente 5-veces
menos. Los antibióticos alternativos tales como las defensinas
humanas y defensinas de conejo carecieron de actividad potente en
este ensayo. Los resultados fueron similares para ambos VIH
_{JR-CSF} y VIH_{JR-FL} que son
aislados no adaptados a laboratorio (Koyanagi, Y.S. y otros,
Science (1987) 236: 819-822).
Las protegrinas muestran actividad similar con
respecto a otros retrovirus.
Las formas de cometa y bala de
PG-1 en las que todas las X son alanina se
sintetizaron usando química convencional Fmoc.
El péptido sintético bruto fue reducido mediante
adición de ditiotreitol (DTT) igual en peso al péptido sintético que
había sido disuelto a 10 mg de péptido/ml en una disolución que
contenía HCl de guanidinio 6 molar, tampón tris 0,5 molar, y de EDTA
2 mM, pH 8,05 e incubado durante dos horas a 52ºC bajo atmósfera de
nitrógeno. La mezcla se pasó a través de un filtro de 0,45 \mum,
se acidificó con 1/20 (v/v) de ácido acético glacial y se sometió a
una purificación convencional de RP-HPLC con una
columna C-18. Los PG-1 bala y cometa
reducidos sintéticamente, purificados por HPLC se concentraron
parcialmente por centrifugación al vacío en un speed vac y se
dejaron plegar durante 24 horas a temperatura ambiente al aire libre
en Tris 0,1 M pH 7,7 a baja concentración (0,1 mg péptido/ml) para
minimizar la formación de enlaces disulfuros de cistína
intercatenarios. La mezcla se concentró luego y se acidificó con
HOAC a una concentración final de 5% y se sometió a purificación por
RP-HPLC.
La pureza de los productos finales de
PG-1 bala y cometa se verificó por
AU-PAGE, HPLC analítico, y espectrometría de masa
por FAB. La AU-PAGE mostró una banda única para el
producto final en cada caso. Los valores de masa MH+ observados
fueron 2093 en ambos casos.
Los compuestos PG-1 cometa y bala
preparados en el Ejemplo 12 fueron ensayados en lo que respecta a su
actividad antimicrobiana usando el ensayo de difusión radial
descrito en el Ejemplo 1 como se publicó por Lehrer, R. I. y
otros, J Immunol Meth (1991) 137:
167-173, excepto que los agares de recubrimiento
contenían tampón fosfato sódico 10 mM con un pH final de 7,4. Como
se describe en el Ejemplo 1, polvo de caldo de soja triptocasa 0,3
mg/ml y agarosa 1% fueron usados también en el agar de
recubrimiento. En algunos casos NaCl 100 mM o RPMI más suero humano
normal (NHS) 2,5% fueron añadidos al agar.
En un primer grupo de determinaciones, las formas
bala y cometa de PG-1 se ensayaron en lo que
respecta a actividad antimicrobiana frente a L. monocytogenes, E.
faecium (VR) o S. aureus bajo estos tres grupos de
condiciones. La Figura 13 muestra el resultado.
Como se muestra, las formas bala y cometa fueron
aproximadamente igual de eficaces frente a estas tres bacterias
usando condiciones de ensayo estándar. Sin embargo, cuando se añadió
NaCl 100 mM al agar, las formas cometa parecieron ligeramente menos
activas que las formas bala que parecieron tener una actividad
antimicrobiana ligeramente potenciada frente a las tres cepas
excepto S. aureus en estas condiciones. Igualmente, cuando
RPMI más NHS 2,5% fueron añadidos, las formas bala fueron de nuevo
más eficaces que las formas cometa. La actividad de la forma cometa
frente a E. faecium fue significativamente menor en estas
condiciones.
Como se muestra en la Figura 14, estas formas de
PG-1 se ensayaron también frente a E. coli, K.
pneumoniae y P. aeruginosa. Estos tres microorganismos
fueron inhibidos por ambas formas de cometa y bala en condiciones
estándares. Esta actividad antimicrobiana se mantuvo también en NaCl
100 mM y RPMI más NHS.
La forma serpiente de PG-1 en la
que todas las X son alanina se realizó usando métodos estándares por
Synpep Inc., Dublin, CA y el valor MH+ en espectrometría de masas de
FAB- fue 2031,3 como se esperaba. La forma serpiente se purificó
para conseguir homogeneidad mediante RP-HPLC.
El PG-1 en forma de serpiente se
ensayó con respecto a los mismos seis organismos y usando las mismas
condiciones como se expuso en el Ejemplo 13 con respecto a las
formas bala y cometa de PG-1. Los resultados se
muestran en las Figuras 15 y 16. En este caso, la forma nativa de
PG-1 de dos cistinas (nativa) fue usada como
testigo. Mientras la forma de serpiente muestra una actividad algo
superior con respecto a L. monocytogenes, E. faecium, y S.
aureus bajo condiciones estándares, es notablemente menos eficaz
que la forma nativa en presencia tanto de NaCl 100 mM como de RPMI
más NHS. Se sigue el mismo patrón, como se muestra en la Figura 16
cuando los organismos de ensayo son E. coli, K. pneumoniae, y
P. aeruginosa.
Las concentraciones inhibitorias mínimas (MICs)
de una variedad de protegrinas fueron determinadas frente a los
siguientes organismos: Staphilococcus aureus resistente a
meticilina (MRSA), Pseudomonas aeruginosa (Psa),
Enterococcus fecium resistente a vancomicina (VREF),
Candida albicans (Candid) y Escherichia coli (E. Co),
y se muestran en la Tabla 9.
| Secuencia | MRSA | Ps a | VREF | Candi d | E. Co | |
| IB-324 | RGGGLCYCRPRFCVCVGR-OH | 17,7 | 3,51 | |||
| IB-218 | RGGGLCYCFPKFCVCVGR | 3,48 | 1,2 | 15,96 | ||
| Protegrinas uni-disulfuro | ||||||
| IB-225 | RGGGLCYARPRFAVCVGR | |||||
| IB-226 | RGGGLCYTRPRFTVCVGR | 8,7 | 0,07 | 1,53 |
Claims (16)
1. Un compuesto purificado y aislado o producido
de modo recombinante de fórmula
A_{1}-A_{2}-A_{3}-A_{4}-A_{5}-C_{6}-A_{7}-C_{8}-A_{9}-A_{10}-A_{11}-A_{12}-
C_{13}-A_{14}-C_{15}-A_{16}-(A_{17}-A_{18})\eqnum{(1)} y las
formas N-terminal aciladas y/o
C-terminal amidadas o esterificadas de la misma, que
está o bien en la forma lineal estabilizada opcionalmente en el -SH
o en forma unida por puentes de cistina,
en la que A_{1} es un aminoácido básico;
cada uno de A_{2} y A_{3} es
independientemente un aminoácido pequeño;
cada uno de A_{5}, A_{7}, A_{14} es
independientemente un aminoácido hidrófobo;
A_{4} es un aminoácido básico o pequeño;
cada uno de A_{9}, A_{12}, y A_{16} es
independientemente un aminoácido básico, hidrófobo, neutro/polar o
pequeño;
A_{10} es prolina;
A_{11} es un aminoácido básico, neutro/polar,
hidrófobo o pequeño o es prolina;
A_{17} no está presente o, si lo está, es un
aminoácido básico, neutro/polar, hidrófobo o pequeño;
A_{18} no está presente o, si lo está, es un
aminoácido básico, hidrófobo, neutro/polar o pequeño, o una forma
modificada de la Fórmula (1) y sus formas N-terminal
aciladas y/o C-terminal amidadas o esterificadas, en
las que al menos una de las 4 cisteínas está reemplazada
independientemente por un aminoácido hidrófobo o un aminoácido
pequeño;
a condición de que el compuesto de Fórmula (1)
debe tener una carga de +3 ó mayor.
2. El compuesto de la reivindicación 1, que
contiene dos puentes de cistina.
3. El compuesto de la reivindicación 1, que
contiene un puente de cistina, que es
C_{6}-C_{15} ó
C_{8}-C_{13}.
4. El compuesto de la reivindicación 1, que está
en forma lineal.
5. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que el extremo carboxilo
C-terminal es de la fórmula seleccionada del grupo
que consiste en COOH ó de las sales del mismo; COOR, CONH_{2},
CONHR, y CONR_{2} en los que cada R es independientemente
hidrocarbilo (1-6C);
y/o en el que el grupo amino en el extremo
N-terminal es de la fórmula NH_{2} ó NHCOR, en el
que R es hidrocarbilo (1-6C);
y/o en el que cada uno de A_{1} y A_{9} es
independientemente seleccionado del grupo que consiste en R, K y
Har;
y/o en el que cada uno de A_{2} y A_{3} es
independientemente seleccionado del grupo que consiste en G, A, S y
T;
y/o en el que A_{4} es R o G;
y/o en el que cada uno de A_{5}, A_{14} y
A_{16} es independientemente seleccionado del grupo que consiste
en I, V, Nle, L y F;
y/o en el que cada uno de A_{7} y A_{12} es
independientemente seleccionado del grupo que consiste en I, V, L,
W, Y y F;
y/o en el que A_{11} es R ó W.
6. Un compuesto de la reivindicación 1, que es
seleccionado del grupo que consiste en
y las formas amidadas de los mismos tanto en
forma lineal como en la forma de puentes de cistina.
7. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que todos los
aminoácidos están en la configuración D.
8. Un sistema de expresión recombinante para la
producción de un péptido antimicrobiano que tiene la secuencia
aminoacídica del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones
1-6, sistema de expresión que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica para dicho péptido
operativamente unido a las secuencias testigo para efectuar la
expresión.
9. Una célula hospedante recombinante modificada
para contener el sistema de expresión de la reivindicación 8.
10. Un método para producir un péptido
antimicrobiano o antiviral o un péptido intermediario para esto,
método que comprende cultivar las células hospedantes modificadas de
la reivindicación 9, en condiciones en las que dicho péptido se
produce; y recuperar el péptido del cultivo.
11. El método de la reivindicación 10, que
comprende además efectuar uniones de cistina de dicho péptido y/o
modificar el extremo N-terminal y/o el extremo
C-terminal de dicho péptido.
12. Una composición farmacéutica para uso
antimicrobiano o antiviral que comprende el compuesto de cualquiera
de las reivindicaciones de 1-7 en mezcla con al
menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición para aplicación a plantas o
entornos vegetales para conferir resistencia a infecciones
microbianas o virales en plantas, que comprende el compuesto de
cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en mezcla con
al menos un diluyente ambientalmente aceptable.
14. Un método para impedir el crecimiento de un
virus o microbio, método que comprende poner en contacto una
composición que soporta el crecimiento de dicho virus o microbio con
una cantidad del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones
1-7 eficaz para impedir dicho crecimiento.
15. Un método para desactivar la endotoxina de
las bacterias gram-negativas, método que comprende
poner en contacto dicha endotoxina con una cantidad del compuesto de
cualquiera de las reivindicaciones 1-7 eficaz para
desactivar dicha endotoxina.
16. Anticuerpos específicamente reactivos con el
compuesto de cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
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