ES2198583T3 - Reactivos para ensayos del acido micofenolico. - Google Patents
Reactivos para ensayos del acido micofenolico.Info
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Abstract
UN ASPECTO DE LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA LA LIBERACION DE UN LIGANDO DE UN COMPLEJO QUE CONTIENE EL MISMO. EL METODO COMPRENDE LA PUESTA EN CONTACTO DE UN MEDIO SUSCEPTIBLE DE CONTENER DICHO COMPLEJO CON UNA CANTIDAD EFICAZ DE UN COMPUESTO EFICAZ PARA PRODUCIR LA LIBERACION DEL LIGANDO. OTRO ASPECTO DE LA PRESENTE INVENCION ES UNA MEJORA DE UN METODO PARA LA DETERMINACION DE UN ANALITO QUE ES UN MIEMBRO DE UNA PAREJA DE UNION ESPECIFICA EN UNA MUESTRA SUSCEPTIBLE DE CONTENER DICHO ANALITO. EL METODO INCLUYE LOS PASOS DE (A) COMBINACION EN UN MEDIO DE ENSAYO DE LA MUESTRA Y UN COMPAÑERO DE UNION PARA EL ANALITO Y (B) LA DETECCION DE LA UNION DEL COMPAÑERO DE UNION AL ANALITO. LA MEJORA CONSISTE EN INCLUIR EN EL MEDIO DE ENSAYO UN COMPUESTO DE LA INVENCION EN UNA CANTIDAD SUFICIENTE PARA MEJORAR LA PRECISION DE LA DETERMINACION. LA INVENCION TIENE UNA APLICACION PARTICULAR A UN METODO PARA LA LIBERACION DEL ACIDO MICOFENOLICO DE UN COMPLEJO QUE CONTIENE EL MISMO. EL METODO PROPORCIONA UNA MEJORA EN UN METODO PARA LA DETERMINACION DEL ACIDO MICOFENOLICO EN UNA MUESTRA SUSCEPTIBLE DE CONTENER ACIDO MICOFENOLICO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA REACTIVOS DE ENSAYO, ASI COMO KITS UTILES PARA LA REALIZACION DE LOS METODOS DE LA INVENCION.
Description
Reactivos para ensayos del ácido
micofenólico.
Esta invención se refiere a las técnicas de
ensayo de unión ligando-receptor. La determinación
de la presencia o concentración de un ligando analito que es un
miembro de un par de unión específica (``miembro sbp'') que consiste
en un ligando y su receptor complementario, en el suero u otros
fluidos del cuerpo depende cada vez más de las técnicas de ensayo
de unión específica. Estas técnicas están basadas en la formación
de un complejo entre los miembros sbp en los que uno u otro del
complejo pueden estar marcados con una resto que produce una señal
bien directa o indirectamente. En el caso de técnicas de ensayo de
unión específicas competitivas, el analito en una muestra de fluido
que está siendo analizada para determinar su presencia compite con
una cantidad conocida de analito marcado en unirse a una cantidad
limitada de un miembro sbp complementario. Así, la cantidad de
analito marcado unido al miembro sbp varía inversamente con la
cantidad de analito en la muestra. En los ensayos inmunométricos,
el analito es generalmente un ligando y el ensayo emplea un miembro
sbp complementario y un segundo receptor marcado, generalmente un
anticuerpo. En este tipo de ensayo, la cantidad de receptor marcado
asociado con el complejo está directamente relacionado con la
cantidad de sustancia analítica en la muestra fluida. También se
utilizan numerosas variaciones de lo anterior en la detección de
analitos tal como la utilización de un receptor para un receptor
para el analito u otros pares de unión tal como
avidina-biotina y similares.
La presencia en la muestra de una o más
sustancias que interfieren, tal como proteínas, por ejemplo,
albúmina, que se une no específicamente al analito en cuestión o a
un reactivo que se está empleando en un ensayo para determinar ese
analito puede ser un factor serio comprometiendo el carácter
cuantitativo de un ensayo ligando-receptor. El
analito está presente generalmente en cantidades muy pequeñas. Una
sustancia que interfiere puede estar presente en mayores cantidades
y puede unirse a un número significativo de moléculas de analito y,
así, reducir la sensibilidad del ensayo. En muchas situaciones, la
cantidad de sustancia que interfiere variará en cada muestra
impidiendo por ello una referencia exacta a un patrón o calibrador
empleado normalmente para proporcionar la traducción de la señal
observada a concentración del analito. Para aumentar la exactitud
de un ensayo, es deseable disminuir o eliminar completamente el
efecto de la sustancia que interfiere con la señal observada.
El ácido micofenólico (``MPA'') se produce por la
fermentación de varias especies de penicilina. Tiene un amplio
espectro de actividades, un modo específico de acción, y es
tolerable en grandes dosis con un mínimo de efectos secundarios,
Epinette, et al., Journal of the American Academy of
Dermatology 17(6):962-71(1987). El
MPA ha demostrado tener actividad antitumoral, antiviral,
antipsoriatica, inmunosupresiva, anti-inflamatoria,
Lee, et al., Pharmaceutical Research
7(2):161-166 (1990), junto con actividad
antibacteriana y antifúngica, Nelson, et al., Journal of
Medicinal Chemistry 33(2):833-838 (1990).
Inhibe la inosina monofosfato deshidrogenasa, una enzima en la
síntesis de novo de nucleótidos de purina (Wu,
Perspectives in Drug Discovery and Design (1994)
2:185-204). Ya que los linfocitos T y B
dependen en gran medida de esta síntesis de novo, el MPA es
capaz de inhibir la proliferación de linfocitos, que es un factor
muy importante de la respuesta inmune.
El éster morfolinoetílico de MPA,
(E)-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-
3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato
de morfolinoetílico (``MPA-M'') se hidroliza
rápidamente in vivo a MPA. La administración de MPA en la
forma de este éster mejora enormemente la biodisponibilidad del
MPA.
Debido a que el MPA es un material biológicamente
activo potente, un inmunoensayo efectivo podría ser útil para
monitorizar su biodisponibilidad. Además, puede ser importante
monitorizar niveles terapéuticos de medicamentos, es decir, los
niveles necesarios óptimos de medicamentos para una inmunosupresión
adecuada. Ya que el MPA-M se hidroliza rápidamente a
MPA, un ensayo para determinar el MPA permitiría encontrar el medio
de regular y optimizar las dosis de MPA-M. Se sabe
que el MPA está altamente unido a proteína en el plasma
(83->98%) y cualquier factor que altere la concentración de
proteínas en el plasma en los pacientes puede afectar a la exactitud
de un ensayo de MPA (Shaw, et al., Therapeutic Drug
Monitoring (1995) 17:690-699).
A los pacientes bajo tratamiento con MPA y
ciclosporina o tacrolimus se les puede
co-administrar numerosos medicamentos incluyendo,
pero no limitándose a, azatioprina, prednisona, metilprednisolona,
antivirales, antibióticos, antifúngicos, agentes cardiovasculares,
agentes diabéticos y agentes diuréticos. Muchos de estos
medicamentos tienen profundos efectos en el metabolismo y dan como
resultado cambios en concentraciones de varios componentes del
suero/plasma. Por lo tanto, existe un potencial de interferencia de
estos componentes, bien directa o indirectamente, en la
determinación del MPA en la población diana de pacientes.
En general, los ensayos de suero están limitados
por la dificultad de variaciones de concentraciones de proteínas en
el plasma en la población de pacientes. Además, las variaciones de
los componentes de la matriz en la muestra que alteran fracciones
de MPA unidas y libres, tal como la concentración de albúmina,
puede conducir a resultados inexactos de inmunoensayos sin liberar
el MPA de su fracción unida. En concreto, la concentración aparente
de MPA puede ser más alta o más baja dependiendo de la
concentración de proteína en la sangre. Por ejemplo, al principio
del periodo de postrasplante, las concentraciones de albúmina son
bajas en relación a un calibrador con concentraciones de proteína
normales en el plasma por lo que la cuantificación del MPA en ese
paciente puede ser alta. Un número de factores que incluyen tiempo
postrasplante y diferencias metabólicas debido a la coadministración
de medicamentos o estados enfermizos del paciente pueden dar como
resultado concentraciones de proteína anormales. Estas
concentraciones anormales de proteína pueden alterar la razón de
MPA libre a unido y, por lo tanto, afectar a la exactitud de los
resultados del inmunoensayo. La recuperación variable como una
función de la concentración de proteína de las muestras impide la
selección de una concentración media de proteína para calibradores,
que represente todas las muestras.
Se conoce que el salicilato aumenta la fracción
de MPA libre en el plasma humano normal cuando está presente en
concentraciones que se pueden observar en la administración crónica
de aspirina (Nowak, más adelante). Sin embargo, hemos
encontrado que la utilización de salicilato como un agente de
liberación puede dar como resultado una disminución del
25-50% en la curva de respuesta total de la dosis
en un inmunoensayo enzimático de MPA. También se conoce que el
ácido
8-anilino-1-naftalensulfónico
(ANS) funciona como un agente liberador en inmunoensayos (Nerli
et al., Arc Int Physiol Biochim Biophys (1994)
102(1):5-8 y Seth, et al., Clin
Chem (1975) 21(10):1406-1413). Sin
embargo, el ANS tiene desventajas debido a su absorbancia de fondo a
340 nm y su susceptibilidad a la degradación con la luz. La
absorbancia de fondo es especialmente una desventaja en los
inmunoensayos enzimáticos. Sin embargo, el ANS se ha utilizado en
algunos ensayos enzimáticos bajo condiciones en las que sus
desventajas pueden tolerarse.
La presente invención evita las deficiencias de
los compuestos anteriormente conocidos utilizados como agentes de
liberación en ensayos de ligandos.
Nowak, et al., Clin. Chem. (1995)
41(7):1011-1017 describe la unión del ácido
micofenólico a la albúmina humana en el suero: caracterización y su
relación farmacodinámica.
Langman, et al., Therapeutic Drug
Monitoring (1994) 16:802-807 describe la
distribución del ácido micofenólico en la sangre.
La solicitud de patente europea 0 218 309 B1
describe un método para medir ligandos libres en fluidos
biológicos. Se emplearon el salicilato sódico y el
2,4-dinitrofenol para evitar que análogos de
triyodotironina y tetrayodotironina marcados se unieran a la
albúmina y prealbúmina ligante del tiroides.
La solicitud de patente europea 0 392 332 A2
describe un inmunoensayo de polarización fluorescente y sus
reactivos. Se describen varios compuestos para convertir un
metabolito de marihuana, que estaba unido a la albúmina en el suero
y a otras proteínas en la orina, en la forma libre. Estos compuestos
incluyen, entre otros, ANS, ácido salicílico y ácido
5-metoxisalicílico.
La solicitud de patente PCT WO 96/02004 describe
anticuerpos útiles en ensayos para el ácido micofenólico (MPA).
También describe conjugados de marcadores y MPA o análogos de MPA
así como un método para la determinación de MPA utilizando
anticuerpos y/o conjugados.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un método para liberar ácido micofenólico de uno de sus complejos.
El método comprende poner en contacto un medio que se sospecha que
contiene dicho complejo con una cantidad efectiva del compuesto de
fórmula:
en la que R^{1} es alquilo; R^{2} es
hidrógeno o alquilo; X es O, S ó N; n es 1 cuando X es O ó S y n es
2 cuando X es N; y m es 1 ó 2 (Compuesto
I).
Otra realización de la presente invención es una
mejora en un método de determinación de ácido micofenólico en una
muestra que se sospecha que contiene ácido micofenólico. El método
comprende (a) proporcionar en un medio de ensayo la muestra y un
copartícipe de unión para el ácido micofenólico, y (b) detectar la
unión del copartícipe de unión al ácido micofenólico. La mejora
comprende incluir en el medio del ensayo el Compuesto I en una
cantidad suficiente para aumentar la exactitud de la
determinación.
Otra realización de la presente invención es una
mejora en un método para medir la cantidad de ácido micofenólico en
una muestra que se sospecha que contiene ácido micofenólico y
proteínas endógenas que se unen al ácido micofenólico. El método
comprende (a) combinar en un medio acuoso la muestra, ácido
micofenólico conjugado a un marcador detectable, y un anticuerpo
capaz de unirse al ácido micofenólico, y (b) determinar el efecto
de la muestra sobre la actividad del marcador. La mejora comprende
incluir en el medio un compuesto de fórmula:
en la que R^{1}es alquilo y R^{2} es
hidrógeno o alquilo (Compuesto II) en una cantidad efectiva para
liberar el ácido micofenólico de las proteínas
endógenas.
La presente invención además incluye un kit para
realizar un ensayo para la determinación de ácido micofenólico que
comprende en una combinación empaquetada un anticuerpo capaz de
unirse al ácido micofenólico, un compuesto que comprende ácido
micofenólico unido a un marcador detectable, y el Compuesto I.
Antes de proceder con la descripción de las
realizaciones específicas de la invención, se definen algunos
términos.
El ácido micofenólico puede encontrarse
directamente en una muestra tal como el tejido biológico,
incluyendo fluidos corporales de un hospedador. La muestra puede
examinarse directamente o puede pretratarse para hacer el ácido
micofenólico más fácilmente perceptible eliminando materiales
indeseados. La muestra puede ser pretratada para separar o lisar
células; precipitar, hidrolizar o desnaturalizar proteínas;
hidrolizar lípidos; solubilizar el ácido micofenólico, o similares.
Tal pretratamiento puede incluir, sin limitación: centrifugación;
tratamiento de la muestra con un disolvente orgánico, por ejemplo,
un alcohol, tal como metanol; y tratamiento con detergentes. La
muestra puede prepararse por cualquier medio conveniente que no
interfiera con el ensayo. Se prefiere un medio acuoso.
Además, el ácido micofenólico puede determinarse
detectando un agente probatorio del ácido micofenólico, tal como un
miembro específico de unión complementario del ácido micofenólico,
cuya presencia se detectará sólo cuando el ácido micofenólico esté
presente en la muestra. Así, el agente probatorio del ácido
micofenólico se convierte en el analito que se detecta en el
ensayo.
El tejido biológico incluye tejido extraído de un
órgano o de otra parte del cuerpo del hospedador y fluidos
corporales, por ejemplo, orina, sangre completa, plasma, suero,
saliva, semen, heces, esputo, fluido cerebroespinal, lágrimas,
moco, y similares. Preferiblemente, la muestra es plasma o
suero.
Éster de micofenolato - incluye, pero no se
limita a, ésteres de MPA en el grupo del ácido carboxílico de la
cadena lateral unida en la posición 1' del sistema del anillo
isobenzofuranilo del MPA tal como MPA-M.
Metabolito de MPA - un producto del metabolismo
del MPA, preferiblemente un producto que contiene el sistema del
anillo de isobenzofuranilo, más preferiblemente productos que
contienen también una porción de la cadena lateral tal como el
glucuronido de acilo o fenólico de MPA.
Medida de la cantidad de un analito - métodos
cuantitativos, semicuantitativos, y cualitativos así como todos los
otros métodos para determinar un analito se consideran como métodos
para medir la cantidad de un analito. Por ejemplo, un método que
detecta simplemente la presencia o ausencia de un analito en una
muestra que se sospecha que contiene el analito se considera
incluido dentro del alcance de la presente invención. Los términos
``detectar'' y ``determinar'', así como otros sinónimos corrientes
para medir, se contemplan dentro del alcance de la presente
invención.
Capaz de distinguir entre - la capacidad de un
receptor o anticuerpo de unirse preferencialmente a un primer
ligando en relación a un segundo ligando. Generalmente al menos se
unirá 5 veces más del primer ligando que del segundo ligando cuando
el anticuerpo se combine con una muestra que contiene los ligandos.
Preferiblemente, se unirá al menos 10 veces más y, más
preferiblemente, al menos 20 veces más del primer ligando. Aunque
las uniones relativas de cada ligando dependan de las
concentraciones relativas en la muestra, generalmente estas
condiciones se alcanzan cuando la constante de unión del anticuerpo
al primer ligando es al menos igual a la constante de unión del
segundo ligando, y preferiblemente, es al menos 10 veces, más
preferiblemente, al menos 50 veces la constante de unión del
segundo ligando.
Conjugado - una molécula que comprende dos o más
moléculas unidas, opcionalmente a través de un grupo de unión, para
formar una sola estructura. La unión puede llevarse a cabo bien por
una conexión directa (por ejemplo, un enlace químico) entre las
moléculas o por la utilización de un grupo de unión. Por ejemplo, un
análogo de analito conjugado con una enzima es un conjugado de
analito de análogo-enzima.
Miembro de un par de unión específica (miembro
``sbp'') - una de las dos moléculas que tienen una zona en la
superficie o en una cavidad a la que específicamente se une, y por
lo tanto, se define como complementaria, con una organización
espacial y polar concreta de la otra molécula. A los miembros del
sbp se les puede denominar ligando y receptor tal como los miembros
de un par inmunológico, por ejemplo,
antígeno-anticuerpo. Los miembros sbp
complementarios se unen unos a otros, como por ejemplo, un ligando
y su receptor complementario. Respecto a dos miembros sbp
complementarios, se puede referir a uno de ellos como
``copartícipe de unión'' por el otro. Los miembros sbp pueden ser
pares inmunológicos tal como un antígeno y anticuerpo, o pares no
inmunológicos tal como la avidina y la biotina. Los miembros sbp
pueden también ser moléculas pequeñas o residuos de moléculas
pequeñas y sus receptores. Las moléculas pequeñas tienen un peso
molecular desde 100-2000, preferiblemente
150-1000, y un receptor para molécula pequeña puede
existir o ser preparado. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen
derivados de biotina, ácido lisérgico, fluoresceina o un derivado
de fluoresceina, y vitamina B_{12}, con los correspondientes
receptores siendo avidina o estreptavidina, ácido
anti-lisérgico, anti-fluoresceina y
factor intrínseco, respectivamente. Las moléculas pequeñas están a
menudo enlazadas covalentemente a otros miembros sbp para formar un
conjugado teniendo al menos una, y frecuentemente
2-20 moléculas pequeñas. El enlace de la molécula
pequeña al miembro sbp puede llevarse a cabo por reacciones
químicas que dan como resultado la sustitución de un átomo de
hidrógeno de la molécula pequeña con un enlace al miembro sbp o por
un grupo de enlace entre la molécula pequeña y el miembro sbp de
cualquier tamaño pero preferiblemente no mayor de lo necesario para
permitir unirse al conjugado de ambos, el receptor para la molécula
pequeña y el miembro sbp.
Ligando - cualquier compuesto orgánico para el
cual existe un receptor natural o puede ser preparado.
Análogo de ligando (o análogo de analito) - un
ligando modificado, un radical orgánico o análogo de analito,
generalmente de peso molecular mayor que 100, que puede competir
con el ligando análogo por un receptor, proporcionando la
modificación medios para unir un análogo de ligando a otra molécula.
El análogo de ligando generalmente se diferenciará del ligando por
algo más que la sustitución de un hidrógeno con un enlace que une
el análogo de ligando a un centro o marcador, pero no
necesariamente. El análogo del ligando se puede unir al receptor de
una forma similar al ligando. El análogo puede ser, por ejemplo, un
anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo al
ligando.
Receptor (``antiligando'') - cualquier compuesto
o composición capaz de reconocer una organización concreta espacial
y polar de una molécula, por ejemplo, un sitio epitópico o
determinante. Receptores ilustrativos incluyen receptores que
tienen lugar naturalmente, por ejemplo, tiroxina unida a globulina,
anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, ácidos nucleicos,
proteína A, componente complementario C1q, y similares.
Uniones específicas - el reconocimiento
específico de una de dos moléculas diferentes por la otra,
comparado al reconocimiento considerablemente menor de otras
moléculas. Generalmente, las moléculas tienen zonas en sus
superficies o en cavidades que dan lugar al reconocimiento
específico entre dos moléculas. Ejemplos de uniones específicas son
interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones
enzima-sustrato, interacciones de polinucleótidos, y
así sucesivamente.
Uniones no específicas - enlaces no covalentes
entre moléculas que es relativamente independiente de las
estructuras específicas de la superficie. Las uniones no
específicas pueden ser el resultado de distintos factores incluyendo
interacciones hidrofóbicas entre moléculas.
Complejo no específico de un ligando - un ligando
unido no específicamente a otra sustancia, generalmente, sustancias
endógenas presentes en una muestra para ser analizada. Las
sustancias endógenas generalmente son proteínas endógenas tal como
proteínas del plasma, por ejemplo, albúmina, globulinas,
glicoproteínas, lipoproteínas, y similares.
Anticuerpo - una inmunoglobulina que se une
específicamente y se define por lo tanto como complementaria de
una organización concreta espacial y polar de otra molécula. El
anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse por
técnicas que son conocidas en la técnica tal como inmunización de un
hospedador y recogida de suero (policlonal) o preparando líneas
continuas de células híbridas y recogiendo la proteína segregada
(monoclonal), o por clonación y expresión de secuencias de
nucleótidos o sus versiones mutagénicas que codifican al menos las
secuencias de aminoácidos que se necesitan para la unión específica
de los anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una
inmunoglobulina completa o uno de sus fragmentos, incluyendo las
inmunoglobulinas varias clases de isotipos, tales como IgA, IgD,
IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Sus fragmentos pueden
incluir Fab, Fv y F(ab')_{2}, Fab', y similares. Además,
agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus
fragmentos pueden utilizarse cuando sea apropiado siempre y cuando
se mantenga la afinidad de la unión por una molécula concreta.
Se obtiene antisuero conteniendo anticuerpos
(policlonal) por técnicas conocidas que implican la inmunización de
un animal, tal como un conejo, conejillo de Indias, o cabra, con un
inmunógeno apropiado y obteniendo antisuero de la sangre del animal
inmunizado después de un periodo de espera apropiado. Una revisión
del estado de la técnica lo proporcionan Parker, Radioimmunoassay of
Biologically Active Compounds, Prentice-Hall
(Englewood Cliffs, N.J., U.S., 1976); Butler, J.Immunol. Meth.
7:1-24 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem.
22:726-732 (1976); y Playfair, et al.,
Br.Med. Bull. 30:24-31 (1974).
Los anticuerpos también se pueden obtener por
técnicas de hibridación de células somáticas, siendo denominados
tales anticuerpos generalmente como anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos monoclonales pueden producirse según las técnicas
patrón de Köhler y Milstein, Nature
265:495-497, 1975. Se pueden encontrar
revisones de técnicas de anticuerpos moloclonales en Lymphocite
Hybridomas, ed. Melchers, et al.,
Springer-Verlag (New York 1978), Nature
266:495(1977), Science 208:692 (1980), y Methods of
Enzymology 73(Part B):3-46 (1981). Muestras
de una preparación inmunogénica apropiada se inyectan en un animal
tal como un ratón y, después de un tiempo suficiente, se sacrifica
el animal y se obtienen células del bazo. Alternativamente, las
células del bazo de un animal no inmunizado se pueden sensibilizar
al inmunógeno in vitro. Los cromosomas de las células del
bazo que codifican las secuencias de bases de las inmunoglobulinas
deseadas pueden comprimirse fusionando las células del bazo,
generalmente en presencia de un detergente no iónico, por ejemplo,
polietilenglicol, con una línea celular de mieloma. Las células
resultantes, que incluyen hibridomas fusionados, se crecen en un
medio selectivo, tal como un medio de HAT, y las células
sobrevivientes inmortalizadas se crecen en tal medio utilizando
condiciones limitantes de dilución. Las células se crecen en un
recipiente apropiado, por ejemplo, pocillos de microtitulación, y se
criba el sobrenadante para obtener los anticuerpos moclonales de la
especificidad deseada.
Existen varias técnicas para aumentar los
rendimientos de los anticuerpos monoclonales, tal como la inyección
de las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un mamífero
hospedador, que acepta las células, y recolectando las ascitis
fluidas. Cuando se recoge una cantidad insuficiente de anticuerpos
monoclonales en las ascitis fluidas, los anticuerpos se recolectan
de la sangre del hospedador. Alternativamente, las células que
producen los anticuerpos deseados pueden crecerse en un sistema de
cultivo de células de fibras huecas o en un sistema de matraz
centrifugador, siendo ambos conocidos en el estado de la técnica.
Existen varios métodos convencionales para el aislamiento y
purificación de los anticuerpos monoclonales a partir de otras
proteínas y otros contaminantes (véase Köhler y Milstein,
anteriormente).
En otro enfoque para la preparación de
anticuerpos se puede extraer la secuencia que codifica los sitios
de unión de los anticuerpos del ADN del cromosoma e insertarlo en
un vector que clone que pueda ser expresado en bacterias para
producir proteínas recombinantes que tengan los correspondientes
sitios de unión de los anticuerpos.
En general, los anticuerpos se pueden purificar
por medio de técnicas conocidas tal como cromatografía, por
ejemplo, cromatografía DEAE, cromatografía Abx, y similares,
filtración, y así sucesivamente.
Hapteno - un compuesto capaz de unirse
específicamente a los anticuerpos correspondientes, pero que no
actúan como inmunógenos (o antígenos) para la preparación de
anticuerpos. Se pueden preparar los anticuerpos que reconocen a un
hapteno contra compuestos que comprenden el hapteno unido a un
vehículo inmunogénico (o antigénico). Los haptenos son un subgrupo
de los ligandos.
Análogo de MPA - MPA modificado. La modificación
proporciona medios para unir este análogo a otra molécula. El
análogo generalmente se diferencia del MPA por algo más que la
sustitución de un hidrógeno con un enlace que une el análogo a un
centro o lugar marcado.
Vehículo immunogénico - un grupo que, cuando se
conjuga con un hapteno y se inyecta en un mamífero, inducirá una
respuesta inmune y obtendrá la producción de anticuerpos que se
unen al hapteno, en este caso el MPA. A los vehículos immunogénicos
también se les denomina vehículos antigénicos. Vehículos
immunogénicos típicos incluyen, sin limitación, poliaminoácidos,
polisacáridos, ácidos nucleicos y partículas (materiales biológicos
y sintéticos). Una gran variedad de tales vehículos se describen en
Davalian, et al., solicitud de patente de EE.UU. nº
5.089.390, columna 4, línea 57 a columna 5, línea 5. Otros
vehículos immunogénicos adecuados incluyen albúminas, proteínas del
suero, por ejemplo, globulinas, proteínas de la lente ocular y
lipoproteínas. Proteínas ilustrativas incluyen albúmina de suero
bovino, hemocianina de agujero de lapa (``KLH''), ovoalbúmina y
gamma-globulina bovina.
Soporte o superficie - una fase sólida,
generalmente un soporte o superficie, que es un material poroso o
no poroso insoluble en agua que puede tener cualquier forma, tal
como tira, bastoncillo, lámina, cavidad, partícula y perla. Una
amplia variedad de soportes adecuados se describen en Ullman, et
al., solicitud de patente de EE.UU. nº 5.185.243, columnas
10-11, Kum, et al., solicitud de patente de
EE.UU. nº 4.868.104 columna 6, líneas 21-42 y
Milburn, et al., solicitud de patente de EE.UU. nº
4.959.303, columna 6, líneas 14-31. Uniones de
miembros sbp a un soporte o superficie pueden obtenerse por
técnicas conocidas, disponibles normalmente en la bibliografía.
Véase, por ejemplo, ``Immobilized Enzymes'', Ichiro Chibata,
Halsted Press, New York (1978) y Cuatrecasas, J.
Biol. Chem. 245:3059 (1970). Como se utiliza en esta
invención, el término ``capaz de unirse a un soporte'' significa,
por ejemplo, que un reactivo, tal como un anticuerpo de
anti-analito, está unido a un primer miembro sbp o
a una molécula pequeña y un segundo miembro sbp complementario o
receptor de la molécula pequeña, está a su vez unido a un soporte.
Alternativamente, un receptor para el anticuerpo
anti-analito, tal como un anticuerpo
anti-ratón, está unido a un soporte y se utiliza
para capturar el anticuerpo del anti-analito. Por
lo tanto, el anticuerpo anti-analito no está
realmente unido al soporte, pero se unirá cuando se añada un miembro
sbp complementario o un receptor.
Sistema productor de señal (``sps'') - uno o más
componentes, al menos un componente que es un marcador detectable,
que genera una señal detectable que se relaciona con la cantidad de
marcador unido y/o no unido, es decir, la cantidad de marcador
unido o no unido al compuesto que se detecta. El marcador es
cualquier molécula que produce o puede ser inducida a producir una
señal, y preferiblemente es un fluorescente, marcador radioactivo,
enzima, quimioluminiscente o fotosensibilizador. Así la señal se
detecta y/o se mide detectando la fluorescencia o luminiscencia,
radioactividad, actividad enzimática o absorbancia de la luz.
Marcadores adecuados incluyen, a modo de
ilustración pero no de limitación, enzimas tal como fosfatasa
alcalina, glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (``G6PDH'') y peroxidasa del rábano picante;
ribozima; un sustrato para una replicasa tal como la replicasa QB;
promotores; colorantes; fluorescentes, tal como fluoresceína,
compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina,
oftaldehído, y fluorescamina; quimioluminiscentes tal como
isoluminol; sensibilizantes; coenzimas; sustratos enzimáticos;
marcadores radioactivos tal como ^{125}I, ^{131}I, ^{14}C,
^{3}H, ^{57}Co y ^{75}Se; partículas tal como latex o
partículas de carbón, metal sol, cristalita, liposomas, células,
etc., que pueden marcarse además con un colorante, catalizador u
otro grupo detectable. Enzimas y coenzimas adecuadas se describen
en Litman, et al., solicitud de patente de EE.UU. nº
4.275.149, columnas 19-28, y Bogulaski, et
al., solicitud de patente de EE.UU. nº 4.318.980, columnas
10-14; fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados
se describen en Litman, et al., solicitud de patente EE.UU.
nº 4.275.149, columnas 30 y 31.
Existen numerosos métodos por los que el marcador
puede producir una señal perceptible por medios externos, por
ejemplo, por examen visual, radiación electromagnética, calor, y
agentes químicos. El marcador y otros miembros sps también pueden
estar unidos a un miembro sbp, a otra molécula o a un soporte.
El marcador puede producir directamente una
señal, y por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para
producir una señal. Muchas moléculas orgánicas, por ejemplo, las
fluorescentes, son capaces de absorber la luz visible y
ultravioleta, entonces la absorción de la luz transfiere energía a
estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. Esta
energía absorbida se disipa entonces por emisión de luz a una
segunda longitud de onda. Otros marcadores que producen
directamente una señal incluyen isótopos radioactivos y
colorantes.
Alternativamente, el marcador puede necesitar
otros componentes para producir una señal, y el sistema que produce
la señal incluiría entonces todos los componentes necesarios para
producir una señal mensurable, que puede incluir sustratos,
coenzimas, aumentadores, enzimas adicionales, sustancias que
reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores,
cofactores, inhibidores, captadores, iones metálicos, y una
sustancia de unión específica necesaria para la unión de sustancias
que generan una señal. Una discusión detallada de sistemas
productores de señales adecuadas se puede encontrar en Ullman,
et al., solicitud de patente de EE.UU. nº 5.185.243, columnas
11-13.
El marcador puede unirse covalentemente a
numerosos miembros sbp: un anticuerpo; un receptor de un
anticuerpo; un receptor que es capaz de unirse a una molécula
pequeña conjugado a un anticuerpo; o un análogo de ligando. La unión
del marcador al miembro sbp se puede llevar a cabo por reacciones
químicas que dan como resultado la sustitución de un átomo de
hidrógeno del marcador con un enlace al miembro sbp o puede incluir
un grupo de unión entre el marcador y el miembro sbp. Otros
miembros sbp también pueden estar unidos covalentemente a miembros
sbp. Por ejemplo, dos miembros sbp tal como un fluorescente y un
inhibidor pueden cada uno estar unidos a un anticuerpo diferente que
forme un complejo específico con el analito. La formación del
complejo pone al fluorescente y al inhibidor en proximidad,
permitiendo así al extintor interaccionar con el fluorescente para
producir una señal. Métodos de conjugación son conocidos en la
técnica. Véase por ejemplo, Rubenstein, et al., solicitud
de patente de EE.UU. nº 3.817.837. Esta invención también contempla
el tener un anticuerpo unido a un primer miembro sps y un marcador
detectable como segundo miembro sps. Por ejemplo, cuando el marcador
detectable está unido a un análogo de ligando, la extensión de la
unión del anticuerpo al análogo se puede medir detectando la señal
producida por la interacción de los miembros sps.
Materiales auxiliares - Varios materiales
auxiliares se emplearán frecuentemente en un ensayo de acuerdo con
la presente invención. Por ejemplo, estarán presentes tampones en
el medio de ensayo, así como estabilizadores para el medio de
ensayo y los componentes del ensayo. Frecuentemente, además de esos
aditivos, pueden incluirse proteínas adicionales, tal como
albúminas o tensioactivos, concretamente tensioactivos no iónicos,
aumentadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles,
preservativos, antimicrobianos, o similares.
Grupo de unión - una porción de una estructura
que conecta 2 o más subestructuras. El grupo de unión puede ser un
enlace o puede tener al menos 1 cadena ininterrumpida de átomos
distintos del hidrógeno (u otros átomos monovalentes) situada entre
las subestructuras. El número de átomos en la cadena será de al
menos uno y se determina contando el número de átomos distintos del
hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras
que se conectan, y es generalmente 1-30, usualmente
2-10, preferiblemente 3-8, átomos,
cada uno seleccionado independientemente, del grupo que consiste en
carbono, oxigeno, nitrógeno, azufre y fósforo. El número total de
átomos en el grupo de unión se determina contando el total de
átomos de carbono, oxigeno, nitrógeno, azufre y fósforo, es decir,
los átomos distintos del hidrógeno. Generalmente, el grupo de unión
tiene un total de menos de 30 átomos, preferiblemente menos de 20
átomos, más preferiblemente menos de 10 átomos. Como regla general,
la longitud de un grupo de unión concreto puede seleccionarse
arbitrariamente para proporcionar comodidad en la síntesis y en la
incorporación de cualquier grupo deseado. Los grupos de unión
pueden ser alifáticos o aromáticos, aunque con grupos diazo,
generalmente habrá grupos aromáticos implicados. El oxigeno estará
generalmente presente como oxo u oxi, unido a un carbono, azufre,
nitrógeno o fósforo; el nitrógeno estará generalmente presente como
nitro, nitroso o amino, normalmente unido a un carbono, oxigeno,
azufre o fósforo; el azufre será análogo al oxigeno; mientras que
el fósforo estará unido al carbono, azufre, oxigeno o nitrógeno,
usualmente como fosfonato y fosfato mono- o diéster.
Las funciones más comunes que forman un enlace
covalente entre el grupo de unión y la molécula conjugada son
alquilamina, amidina, tioamida, ditiol, éter, urea, tiourea,
guanidina, azo, tioéter y carboxilato, sulfonato, ésteres de
fosfato, amidas y tioésteres.
Alquilo - un radical monovalente ramificado o sin
ramificar derivado de un hidrocarburo alifático por eliminación de
un átomo de H; incluye ambos, alquilo inferior y alquilo
superior.
Alquilo inferior - alquilo que contiene de 1 a 5
átomos de carbono tal como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo,
butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, etc.
Alquilo superior - alquilo que contiene más de 6
átomos de carbono, generalmente de 6 a 20 átomos de carbono, tal
como, por ejemplo, hexilo, heptilo, octilo, etc.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un método para liberar a un ligando de su complejo no específico
tal como un complejo en el que el ligando está unido no
específicamente a otra sustancia tal como una muestra de proteínas
endógenas y otras sustancias no específicas. El método comprende
poner en contacto un medio que se sospecha que contiene tal
complejo con una cantidad efectiva del Compuesto I.
Ejemplos representativos de compuestos que tienen
la fórmula anterior se encuentran en la Tabla 1, como modo de
ilustración y no de limitación.
| Compuesto | X | R^{1} | R^{2} | n | m | Posición en el anillo* |
| I-A | O | alquilo | H | 1 | 2 | orto |
| I-B | O | alquilo | H | 1 | 2 | meta |
| I-C | O | alquilo | alquilo | 1 | 2 | orto |
| I-D | O | alquilo | alquilo | 1 | 2 | meta |
| I-E | S | alquilo | H | 1 | 2 | orto |
| I-F | S | alquilo | H | 1 | 2 | meta |
| I-G | S | alquilo | alquilo | 1 | 2 | orto |
| I-H | S | alquilo | alquilo | 1 | 2 | meta |
| I-I | N | alquilo | H | 2 | 2 | orto |
| I-J | N | alquilo | H | 2 | 2 | meta |
| I-K | N | alquilo | alquilo | 2 | 2 | orto |
| I-L | N | alquilo | alquilo | 2 | 2 | meta |
| I-M | O | alquilo | H | 1 | 1 | orto |
| I-N | O | alquilo | H | 1 | 1 | meta |
| I-O | O | alquilo | H | 1 | 1 | para |
| I-P | O | alquilo | alquilo | 1 | 1 | orto |
| I-Q | O | alquilo | alquilo | 1 | 1 | meta |
| I-R | O | alquilo | alquilo | 1 | 1 | para |
| I-S | S | alquilo | H | 1 | 1 | orto |
| I-T | S | alquilo | H | 1 | 1 | meta |
| I-U | S | alquilo | H | 1 | 1 | para |
| I-V | S | alquilo | alquilo | 1 | 1 | orto |
TABLA 1
(continuación)
| Compuesto | X | R^{1} | R^{2} | n | m | Posición en el anillo* |
| I-W | S | alquilo | alquilo | 1 | 1 | meta |
| I-X | S | alquilo | alquilo | 1 | 1 | para |
| I-Y | N | alquilo | H | 2 | 1 | orto |
| I-Z | N | alquilo | H | 2 | 1 | meta |
| I-AA | N | alquilo | H | 2 | 1 | para |
| I-BB | N | alquilo | alquilo | 2 | 1 | orto |
| I-CC | N | alquilo | alquilo | 2 | 1 | meta |
| I-DD | N | alquilo | alquilo | 2 | 1 | para |
| *Posición en el anillo se refiere a la posición en el anillo de benceno del grupo -XR^{1} en | ||||||
| relación al grupo carboxilo. |
Preferiblemente, los compuestos que se utilizan
en los métodos de la presente invención tienen una relación orto
entre el grupo carboxilo y el sustituyente -XR^{1} y tienen la
fórmula (designados Compuestos I'):
en la que R^{1} es alquilo; R^{2} es
hidrógeno o alquilo; X es O, S o N. Compuestos representativos de
esta categoría, como modo de ejemplo y no de limitación, son los
Compuestos I-M, I-P,
I-S, I-V, I-Y e
I-BB
anteriores.
Compuestos preferidos de la fórmula I anterior
son aquellos de la fórmula del Compuesto II. Compuestos
representativos de este grupo, como modo de ilustración y no de
limitación, son los Compuestos I-M,
I-N, I-O, I-P,
I-Q e I-R anteriores.
Más preferiblemente, compuestos útiles en la
presente invención son aquellos de la fórmula siguiente (Compuestos
III):
en la que R^{1} es alquilo y R^{2} es
hidrógeno o alquilo. Compuestos representativos en este grupo, como
modo de ilustración y no de limitación, son los Compuestos
I-M e I-P anteriores. Compuestos
particularmente preferidos en esta categoría son aquellos en los
que R^{1} es un alquilo inferior, más preferiblemente,
metilo.
\newpage
Más preferidos son los compuestos de la fórmula
siguiente (Compuestos IV):
en los que R^{3} es un alquilo inferior.
Particularmente preferido es el ácido
o-metoxibenzoico también conocido como ácido
o-anisico.
En la presente invención es importante que el
Compuesto I concreto empleado no se una en ningún grado
significativo a un miembro sbp o copartícipe de unión del ácido
micofenólico utilizado en el ensayo del ácido micofenólico. Lo que
constituye un grado significativo depende de la sensibilidad
necesaria para el ensayo; cuanto más alta sensibilidad se necesita
para el ensayo, menos tolerable es la cantidad de unión entre el
miembro sbp o copartícipede unión con el ácido micofenólico. El
término ``grado significativo'' significa que el Compuesto I
concreto no se une a un miembro sbp o pareja de unión hasta el punto
que podría afectar la exactitud o la naturaleza cuantitativa o
cualitativa de la naturaleza del resultado del ensayo. Según esto,
cualquier unión entre un compuesto I concreto y un miembro sbp o un
copartícipe de unión debe ser, preferiblemente, menor de 1%, más
preferiblemente, menor de 0,01%, lo más preferiblemente 0%. Tal
porcentaje se determina midiendo la cuantificación aparente de ácido
micofenólico de la cantidad dada del agente liberado y expresando
el resultado como una fracción de la concentración actual. Además,
el Compuesto I concreto seleccionado debe tener un mínimo, si es
que tiene algo, de interferencia con la unión de miembros sbp uno a
otro o con la capacidad del sistema productor de la señal para
producir una señal en relación con la presencia o cantidad de ácido
micofenólico en una muestra.
El término ``cantidad eficaz'' quiere decir una
cantidad suficiente para producir la liberación del ligando del
complejo para que preferiblemente al menos aproximadamente 90%, más
preferiblemente al menos 99% y lo más preferiblemente 100% del
ligando esté en una forma libre de tal complejo. La cantidad eficaz
de Compuesto I que debe utilizarse en un ensayo concreto depende de
la naturaleza del ligando y del ensayo y reactivos empleados en
dicho ensayo. Preferiblemente, la cantidad eficaz se determina
empíricamente basada en el intervalo sospechado de concentración de
ácido micofenólico en la muestra. En general, una cantidad eficaz
de Compuesto I es una cantidad en exceso sobre la cantidad
sospechada de ácido micofenólico. Considerando un ensayo para el MPA
en el que el nivel esperado de medicamento en una muestra es
aproximadamente 1,5 a 45 \muM, la cantidad eficaz de Compuesto I
en el medio de ensayo es aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100
mM, preferiblemente, aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mM, más
preferiblemente, aproximadamente 2 a 12 mM.
Muchos de los compuestos útiles en la presente
invención están disponibles comercialmente y/o su síntesis es
conocida en la bibliografía. Los compuestos útiles en los métodos
de la presente invención pueden prepararse por procedimientos
conocidos a partir de productos de partida que están disponibles
tal como el ácido benzoico o ácido hidroxibenzoico. Tales
procedimientos implican la formación de uno o más grupos alcoxi en
el anillo de benceno y esterificación del compuesto resultante
cuando se desea un éster. Ambos de los compuestos anteriores pueden
llevarse a cabo por procedimientos conocidos que no se repiten en
esta invención. Véase, por ejemplo, Heathcock, et al.,
``Introduction to Organic Chemistry'', MacMillan Publishing Company,
New York, New York, Tercera edición, 1985, páginas 814 y 493;
Carey, ``Organic Chemistry'', McGraw Hill Inc., New York, New York,
Segunda edición, 1987, páginas 994-995 y 609.
El método de la presente invención puede
aplicarse a ensayos para la determinación de ácido micofenólico,
especialmente para la determinación de ácido micofenólico libre. En
general, una muestra que se sospeche que contiene ácido
micofenólico se combina en un medio de ensayo con un copartícipe de
unión del ácido micofenólico y otros reactivos dependiendo del
ensayo concreto llevado a cabo. La unión del copartícipe de la
unión del ácido micofenólico, se detecta, si está presente. Una
cantidad eficaz de Compuesto I se incluye en el medio de ensayo. El
ensayo puede llevarse a cabo sin separación (homogéneo) o con
separación (heterogéneo) de cualquiera de los componentes o
productos del ensayo. Los inmunoensayos homogéneos se ejemplifican
por los productos de ensayo EMIT® (Behring Diagnostics Inc, antes
Syva Company, San Jose, CA) descritos en Rubenstein, et al.,
solicitud de patente de EE.UU. nº 3.817.837, columna 3, línea 6 a
columna 6, línea 64; métodos de inmunofluorescencia tales como los
descritos en Ullman, et al., solicitud de patente de EE.UU.
nº 3.996.345, columna 17, línea 59 a columna 23, línea 25; técnicas
de encauzamiento de enzima tales como las descritas en Maggio,
et al., solicitud de patente de EE.UU. nº 4.233.402, columna
6, línea 25 a columna 9, línea 63; y otros inmunoensayos
enzimáticos tal como el ensayo de enzima unida a inmunoabsorbente
(``ELISA'' se describen en Maggio, E.T. anterior). Ejemplos de
ensayos heterogéneos son los radioinmunoensayos, descritos en
Yalow, et al., J. Clin. Invest.
39:1157(1960).
Un ensayo sandwich característico no competitivo
es un ensayo descrito en David, et al., solicitud de patente
de EE.UU. nº 4.486.530, columna 8, línea 6 a columna 15, línea 63.
En este método, un complejo sandwich inmune se forma en un medio de
ensayo que contiene una cantidad eficaz del Compuesto I. El complejo
comprende el analito, un primer anticuerpo (monoclonal o
policlonal) que se une al analito y un segundo anticuerpo que se
une al analito o un complejo del analito y el primer anticuerpo. A
continuación, se detecta el complejo sandwich inmune y se relaciona
con la cantidad de analito en la muestra. El complejo sandwich
inmune se detecta en virtud de la presencia en el complejo de un
marcador que contiene uno o ambos del primer anticuerpo y el segundo
anticuerpo que contienen marcadores o sustituyentes capaces de
combinar con marcadores, tal como, por ejemplo, proporcionando un
anticuerpo unido a biotina y proporcionando avidina unida a un
marcador.
Otro método que es útil para llevar a cabo el
ensayo de la invención se describe en Ullman, et al.,
solicitud de patente de EE.UU. nº 4.857.453, columna 11, línea 21 a
columna 14, línea 42, y columna 18, línea 21 a columna 21, línea
55.
El ensayo se lleva a cabo normalmente en un medio
acuoso tamponado a un pH moderado, generalmente aquel que
proporciona una sensibilidad óptima para el ensayo. El medio acuoso
puede ser únicamente agua o puede incluir algún porcentaje de un
codisolvente, por ejemplo, de 0-40 por ciento en
volumen de un codisolvente. El pH del medio estará generalmente en
el intervalo de 4-11, más generalmente en el
intervalo de 5-10, y preferiblemente en el intervalo
de 6,5-9,5. El pH normalmente será un compromiso
entre la unión óptima de los miembros de unión de cualquier par de
unión específica, la liberación óptima de ácido micofenólico de su
complejo no específico de acuerdo con la presente invención, y el
pH óptimo para otros reactivos del ensayo tal como miembros del
sistema que producen la señal.
Se pueden utilizar varios tampones para alcanzar
el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Ejemplos
de tampones incluyen borato, fosfato, carbonato, tris y barbital.
El tampón concreto empleado no es crítico para la invención, pero
en un ensayo individual se puede preferir un tampón u otro.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas
para llevar a cabo el ensayo y generalmente las temperaturas son
constantes durante el periodo de medidas, especialmente para
medidas de velocidad. Las temperaturas de incubación estarán
generalmente en el intervalo de 4-45ºC, más
usualmente de 15-40ºC. Las temperaturas durante las
medidas estarán generalmente en el intervalo
10-50ºC, más usualmente de
15-40ºC.
La concentración de ácido micofenólico que puede
ensayarse generalmente variará de 10^{-4} a 10^{-13} M, más
generalmente desde 10^{-5} a 10^{-7} M. Consideraciones tales
como, si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo
(relativo a la cantidad de ácido micofenólico presente en la
muestra), la técnica concreta de detección y la concentración del
ácido micofenólico determinarán generalmente las concentraciones de
los diversos reactivos.
Las concentraciones de los diversos reactivos en
el medio de ensayo se determinarán generalmente por el intervalo de
concentración del ácido micofenólico de interés. Sin embargo, la
concentración final de cada uno de los reactivos se determinará
empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el
intervalo. Esto es, una variación en la concentración de ácido
micofenólico que sea significativa debe proporcionar una diferencia
exacta en la medida de la señal.
Mientras que el orden de adición puede variar
ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la
naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple es añadir
todos los materiales simultáneamente y determinar el efecto que el
medio del ensayo tiene en la señal de un ensayo homogéneo.
Alternativamente, los reactivos se pueden combinar secuencialmente.
Opcionalmente, puede hacerse un paso de incubación posteriormente a
cada adición, generalmente en el intervalo de 30 segundos a 6
horas, más generalmente de 1 minuto a 1 hora.
Los siguientes ejemplos describen más las
realizaciones específicas de la invención.
En un ensayo homogéneo después de que todos los
reactivos se han combinado, se determina la señal y se relaciona
con la cantidad de MPA en la muestra. Por ejemplo, en un ensayo
EMIT para el MPA, una muestra que se sospecha que contiene MPA se
combina en una medio acuoso bien simultáneamente o secuencialmente
con un conjugado enzimático de MPA y un anticuerpo capaz de
reconocer el MPA y el conjugado. El medio también contiene una
cantidad efectiva de Compuesto I. Generalmente, se añade un
sustrato para la enzima que da como resultado la formación de un
producto cromogénico o fluorogénico en la reacción catalizada por
la enzima. Enzimas preferidas son
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
fosfatasa alcalina. El Compuesto I actúa para liberar el MPA de
cualquiera de sus complejos no específicos que pueda haber presente
en la muestra. El MPA y el conjugado enzimático de MPA compiten por
sitios de unión en el anticuerpo. Entonces se determina la
actividad de la enzima, generalmente por medios espectroscópicos, y
se compara con la actividad de la enzima determinada cuando se
prueban calibradores o muestras de referencia en las que está
presente una cantidad conocida de MPA. Normalmente, los
calibradores se prueban de manera similar a la prueba de la muestra
que se sospecha que contiene el MPA. Los calibradores normalmente
contendrán concentraciones diferentes, pero conocidas, del analito
de MPA a determinar. Preferiblemente, el intervalo de concentración
presente en los calibradores abarcará el intervalo de
concentraciones sospechadas de MPA en las muestras
desconocidas.
Los ensayos heterogéneos normalmente implican uno
o más pasos de separación y pueden ser competitivos o no
competitivos. Diversos formatos de ensayo competitivo y no
competitivo se describen en Davalian, et al., solicitud de
patente de EE.UU. nº 5.089.390, columna 14, línea 25 a columna 15,
línea 9. En un ensayo competitivo característico se pone en
contacto un soporte que contiene unido un anticuerpo de MPA con un
medio que contiene la muestra y un conjugado de MPA a un marcador
detectable tal como una enzima. El medio también contiene una
cantidad eficaz de Compuesto I. El MPA en la muestra compite con el
conjugado para unirse al anticuerpo. Después de separar el soporte y
el medio, se determina la actividad marcadora del soporte o del
medio por técnicas convencionales y se relacionan con la cantidad
de MPA en la muestra.
Como se ha mencionado anteriormente, la presente
invención proporciona ventajas sobre compuestos conocidos para
liberar analitos de la sustancias de unión no específicas presentes
en las muestras para análisis. Con la presente invención se puede
liberar hasta un 100% de ácido micofenólico de sustancias endógenas
de uniones no específicas tal como proteínas del plasma. Así, la
recuperación variable de ácido micofenólico como una función de la
concentración de proteína relativa a la matriz del calibrador se
reduce sustancialmente o se elimina. Además, la recuperación
variable de ácido micofenólico como una función de la presencia de
medicamentos co-administrados se reduce
sustancialmente o se elimina porque la competitividad por los
sitios de unión en las sustancias de unión endógenas no específicas
entre el ácido micofenólico y otros medicamentos que se unen a
tales sustancias se reduce o se elimina. Una alta absorbancia de
fondo asociada con algunos de los agentes conocidos se evita en la
presente invención. Según esto, los métodos presentes proporcionan
ventajas concretas para los ensayos en los que se utiliza un
sistema productor de señales en el rango de aproximadamente 300 a
aproximadamente 700. Esta es una ventaja importante particularmente
para los inmunoensayos basados en espectrofotometría. Todavía otra
ventaja de la utilización de los compuestos de la presente
invención es el evitar los efectos perniciosos en las curvas de
respuesta de la dosis total que si no, se obtienen en los ensayos
que no utilizan los presentes compuestos. Todavía otra ventaja de
la presente invención es que el agente de liberación presente no
presenta degradación sensible a la luz.
En un ensayo de MPA de acuerdo con la presente
invención, se utilizan anticuerpos que son capaces de unirse al MPA
y a sus ésteres y metabolitos. En otro ensayo de MPA de acuerdo con
la presente invención, se utilizan anticuerpos que son capaces de
distinguir entre los ésteres de MPA y micofenolatos, tal como
MPA-M. En otra realización de un ensayo de MPA de
acuerdo con la invención, los anticuerpos utilizados son capaces de
distinguir entre MPA y metabolitos de MPA, tal como
MPA-G.
La unión de un anticuerpo al MPA se puede
detectar de muchas maneras que son conocidas de la técnica. La
unión de un anticuerpo y MPA forma un complejo inmune que puede
detectarse directa o indirectamente. Los complejos inmunes se
detectan directamente, por ejemplo, cuando los anticuerpos
utilizados están conjugados a un marcador. El complejo inmune se
detecta indirectamente examinando el efecto de formación de
complejo inmune en un medio de ensayo en un sistema productor de
señal o empleando un receptor marcado que se une especificamente a
un anticuerpo de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a kits útiles para llevar a cabo convenientemente un ensayo para la
determinación de ácido micofenólico. Un kit de acuerdo con la
presente invención comprende en un paquete una combinación de un
copartícipe de unión de ácido micofenólico y un Compuesto I. El kit
puede además contener un conjugado del ácido micofenólico unido a
un marcador detectable. Un kit para la determinación de un MPA
comprende en un paquete una combinación de un anticuerpo capaz de
unirse al MPA, un conjugado de MPA y un marcador, y Compuesto
I.
Para aumentar la versatilidad del objeto de la
invención, los reactivos del kit se pueden proporcionar
empaquetados en combinación, en el mismo o diferente envase, en
forma de líquido o liofilizados de forma que la proporción de los
reactivos proporciona una optimización sustancial del método y del
ensayo. Los reactivos pueden estar cada uno en envases separados o
varios reactivos pueden estar en uno o más envases dependiendo de
la reactividad cruzada y estabilidad de los reactivos. Por ejemplo,
una solución acuosa de un Compuesto I puede proporcionarse en un
envase separado. Alternativamente, un Compuesto I incluirse en uno
de los reactivos para realizar un ensayo. Por ejemplo, el Compuesto
I puede incluirse en un medio acuoso que contiene un anticuerpo
reactivo; tal medio acuoso puede empaquetarse en un envase
separado.
El kit además puede incluir otros reactivos
empaquetados separadamente para llevar a cabo el ensayo, tal como
miembros sbp adicionales, reactivos auxiliares tal como un sustrato
enzimático auxiliar, y así sucesivamente. Las cantidades relativas
de los diversos reactivos en los kits pueden variar ampliamente para
proporcionar concentraciones de los reactivos que sustancialmente
optimicen las reacciones que necesitan tener lugar durante el
presente método y para además optimizar sustancialmente la
sensibilidad del ensayo. Bajo circunstancias apropiadas uno o más
reactivos en el kit puede proporcionarse como un polvo seco,
generalmente liofilizado, incluyendo los excipientes, que en
disolución proporcionarán una solución de reactivos que tiene las
concentraciones apropiadas par realizar un método o ensayo de
acuerdo con la presente invención. El kit además puede incluir una
descripción escrita del método de acuerdo con la presente invención
como se ha descrito anteriormente.
La invención se demuestra más por los siguientes
ejemplos ilustrativos. Partes y porcentajes en estos ejemplos son
en peso a no ser que se indique otra cosa. Las temperaturas son en
grados centígrados (ºC).
\newpage
Se prepararon los reactivos siguientes:
Reactivo
A
| # Componente | % Comp. | Comp. en | Fuente del |
| (en peso) | Peso/vol. | componente | |
| (g/L) | |||
| (a 20ºC) | |||
| 1 NAD | 2,346 | 23,88 | Boehringer Mannheim |
| 2 G6P | 0,615 | 6,26 | Calzyme |
| 3 cloruro sódico | 0,491 | 5,00 | Mallinckrodt |
| 4 MIT | 0,098 | 1,00 | Boehringer Mannheim |
| 5 Na2 EDTA | 0,036 | 0,37 | Sigma |
| 6 Pluronic® 25R2 | 0,010 | 0,1028 | BASF Chemicals |
| 7 Ácido o-anisico | 0,149 | 1,52 | Sigma |
| 8 BSA | 0,098 | 1,00 | Miles Diagnostics |
| 9 Azida sódica | 0,092 | 0,94 | Amersham USB |
| 10 Anticuerpo de MPA | 0,001 | 0,0075 | (1) |
| 11 Agua | 96,062 | 977,82 | Boehringer Mannheim |
| 100,00 | 1017,9 | ||
| pH | 5,6 \pm 0,1 |
Reactivo
B
| # Componente | % Comp. | Comp. en | Fuente del |
| (en peso) | Peso/vol. | componente | |
| (g/L) | |||
| (a 20ºC) | |||
| 12 Tris base | 2,120 | 21,54 | Sigma |
| 13 Tris HCl | 3,447 | 35,02 | Sigma |
| 14 BLG | 0,098 | 1,00 | International Enzymes |
| 15 Na2 EDTA | 0,036 | 0,37 | Sigma |
| 16 MIT | 0,098 | 1,00 | Boehringer Mannheim |
| 17 Azida sódica | 0,093 | 0,94 | Amersham USB |
| 18 Pluronic 25R2 | 0,030 | 0,3084 | BASF Chemicals |
| 19 MPA-G6PDH | 0,00005 | 0,0005 | (2) |
| 20 Anticuerpo estabilizador | 0,00007 | 0,00075 | (1) |
| 21 Agua | 94,077 | 955,92 | Millipore deionized |
| 100,00 | 1016,1 | ||
| pH | 8,15 \pm 0,15 | ||
| (1) Preparado de manera similar a la descrita por Galfre, et al., (1981) Preparation of monoclonal | |||
| antibodies: strategies and procedures, Methods Enzymol. 73:3-46 | |||
| (2) Preparado de manera similar a la descrita por Grabarek, et al., (1990) Zero-lenght crosslinking | |||
| procedure with the use of active esters, Anal. Biochem. 185: 131-135. | |||
| (3) Pluronic es una marca registrada de BASF corporation. |
| NAD: | nicotinamida adenina dinucleotido |
| G6P: | D-glucosa-6-fosfato, sal monosódica |
| Ácido o-anisico: | ácido o-metoxibenzoico |
| BSA: | albúmina de suero bovino |
| Na2 EDTA: | sal disódica de ácido etilendiamintetraacético, dihidrato |
| MIT: | hidrocloruro de N-metilisotiazolona |
| MPA: | ácido micofenólico |
| Tris base: | tris(hidroximetil)aminometano |
| Tris HCl: | Tris hidrocloruro |
| BLG: | \beta-lactoglobulina |
| MPA-G6PDH: | ácido micofenólico conjugado con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa |
Los reactivos A y B se prepararon de la forma
siguiente.
Una solución 1,028% en peso de Pluronic 25R2 se
preparó de 2 a 25ºC para utilizarse en ambos reactivos.
El reactivo A se preparó haciendo primero la
solución de ácido anisico. El ácido anisico se disolvió en NaOH 1N
en una cantidad igual a 25mL por 1,52 gramos de ácido anisico. En
un recipiente separado se pesó 70% del peso final de agua
desionizada, a la cual se añadieron los componentes 1 a 5 inclusive
y también el componente 6 utilizando la solución preparada de
Pluronic 25R2 a 10 mL por 1017,9 g (o 1,0 litros) de solución
final. Esta solución se agitó y se añadió la solución de ácido
anisico. Si fuera necesario, el pH de la preparación se ajusta
dentro del intervalo de 5,50 a 5,70 con NaOH 6N. A continuación, se
añadieron los componentes 8 y 9 y se agitó la mezcla. Si fuera
necesario, el pH se ajusta al intervalo anterior. Entonces la
solución se llevó a su peso final con agua desionizada y se filtró
a través de un filtro de 0,2 micras. El pH final fue de 5,50 a
5,70. La solución resultante se designó como diluyente A. El
reactivo A se completó añadiendo el anticuerpo, es decir, el
componente 10, al diluyente A hasta una concentración final de
anticuerpo de 7,5 mg/L (o 7,5 \mug/mL).
Se observa que el reactivo A contiene BSA, que al
igual que la albúmina de suero humano se une al MPA. Sin embargo,
la BSA se encontró que se prefería para estabilizar el Reactivo A
sobre otras varias proteínas que se evaluaron, y por esta razón se
incluyó en el reactivo A. Cualquier agente liberador de MPA, por lo
tanto, se formulará para superar este efecto de la BSA así como
cualquier unión de la muestra que se va a analizar. La formulación
anterior tenía más de 500 molar en exceso de ácido
o-anisico a BSA en el Reactivo A. Esta
concentración de ácido o-anisico se encontró ser más
que suficiente para liberar todo el MPA en el sistema y mantenerlo
desplazado.
Para el reactivo B se pesó el agua en una
cantidad igual al 80% del peso final. A esta agua se añadieron con
agitación los componentes 12 a 17 inclusive así como el componente
18, utilizando 30 mL de Pluronic 25R2 en solución por 1016,1 g (por
1,0 litro) de solución final. La solución se llevó al peso final con
agua desionizada, pH en el intervalo de 8,0 a 8,3, y se filtró a
través de un filtro de 0,2 micras. La solución se designó en ese
momento como diluyente B, que se utilizó para hacer el Reactivo B
por adición de volúmenes o pesos relativamente despreciables de los
componentes 19 y 20. Por ejemplo, 0,37 mL de anticuerpo
estabilizador a 20,6 mg/mL y 6,1 ml de conjugado a 0,8 mg/mL se
añadieron a 10L (o 10,18 kg) de Reactivo B. El anticuerpo
estabilizador, componente 20, se añadió a una concentración final
de 0,75 mg/L (o 0,75 \mug/mL). El conjugado, componente 19, se
añadió para alcanzar una velocidad de 300 \pm 10 mA/min; la
velocidad se define como el cambio de absorbancia a 340 nm por
minuto de tiempo de reacción y se expresa generalmente como
mA/min.
Se determinaron velocidades en un instrumento
Cobas Mira Plus® (Roche Diagnostics Systems, Inc., Branchburg, New
Jersey). La temperatura se mantuvo a 37ºC durante todo el ensayo.
Los tiempos se determinaron en ciclos siendo cada ciclo de 25
segundos. En el ciclo 1, el primer ciclo, se mezclaron 75 \muL de
agua y 3 \muL de una muestra con 155 \muL de diluyente A en una
cubeta de 0,6 cm de recorrido de longitud. Esta mezcla se incubó
hasta la adición del Reactivo B en el ciclo 7. Para establecer la
proporción del conjugado, la mezcla utilizada no contenía ningún
MPA. En el ciclo 7, se añadieron setenta y cinco \muL de Reactivo
B seguidos de 20 \muL de agua y entonces se añadieron a la
cubeta, mezclaron e incubaron hasta el final del ciclo 25 en cuyo
momento se terminó el ensayo. Durante el ensayo, las lecturas de
absorbancia se hicieron a 340 nm al final de cada ciclo. Entonces
se hizo la mejor representación lineal utilizando 12 lecturas de
absorbancia consecutivas de los ciclos 14 hasta 25 contra el tiempo
en minutos. La pendiente de esta línea fue la velocidad.
Entonces se hicieron las preparaciones del
reactivo A añadiendo anticuerpo a diferentes niveles al diluyente
A. Estos niveles de valoración se midieron con el Reactivo B y
calibradores con diferentes niveles de MPA (por ejemplo, 0, 0,5,
2,0, 5,0, 10,0 y 15,0 \mug/mL). El nivel de anticuerpo que da la
máxima proporción de separaciones entre dos extremos inferiores de
los calibradores y entre los dos extremos superiores de los
calibradores se utilizaron entonces para formular el Reactivo A
final.
\newpage
Una vez que se prepararon los Reactivos A y B se
utilizaron, junto con los calibradores, para determinar las
concentraciones desconocidas de MPA.
Para determinar una concentración desconocida de
MPA, se utilizaron los calibradores con los Reactivos A y B, y se
determinaron las proporciones para cada uno como se ha descrito
anteriormente, excepto que el Reactivo A que contiene el anticuerpo
se sustituyó por el diluyente A. Generalmente se determinaron las
velocidades por duplicado para cada calibrador y se hizo la media.
Los parámetros de la curva de calibración se calcularon utilizando
concentraciones de MPA, las velocidades medias del calibrador y un
modelo matemático apropiado tal como logit/log 4 modelo adecuado.
El adecuarlo se puede hacer en línea por el analizador o por
programas de ordenador adecuados que optimizan los parámetros Ro,
Kc, a y b en la ecuación siguiente: R=Ro + \frac{Kc}{1 + exp[-(a
+ b \cdot In \; C)]} en la que
| Ro, Kc, a, b | son parámetros de la curva |
| C | es la concentración de MPA |
| R | es la velocidad observada con la concentración de MPA |
Al resolver esta ecuación para C permitió
determinar la concentración desconocida de MPA a partir de su
velocidad, R, y los parámetros de la curva como:
C = exp[[a + In[
Kc/(R-Ro)-1,0]]/-b]
Los resultados se resumen de la forma
siguiente:
La efectividad de la formulación se evaluó con
ácido o-anisico midiendo la concordancia entre la
cuantificación de 10 \mug/mL de MPA mezclados en plasma humano
normal (NHP) y la cuantificación de una mezcla similar en un tampón
salino de fosfato de Dulbecco (PBS), comprado de BioWhittaker,
Walkersville, Maryland. Para ambos, NHP y PBS, se hicieron dos
mezclas separadas. La PBS contenía 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L
KH_{2}PO_{4}, 2,16 g/L Na_{2}PO_{4}\cdot7 H_{2}0 y 8,0
g/L NaCl a un pH final de 6,4 a 7,6. La PBS no tenía proteína y por
tanto no podía ocurrir unión de proteína a MPA. Los calibradores
fueron NHP con 7 niveles de MPA a 0, 0,3, 0,5, 2,5, 5, 10, y 20
\mug/mL. Las mezclas de NHP y PBS cuantificaron casi lo mismo,
dando medias respectivas de 10,2 y 10,4 \mug/mL MPA (desviación
estándar conjunta (SD) = 0,4 \mug/mL). Estos resultados indican
que el método medía el MPA total y no estaba influenciado por la
unión normal de la albúmina del suero al MPA.
En este ejemplo se compararon cuatro agentes,
ácido o-anisico (o-AA), sus
isómeros meta (m-AA) y para (p-AA),
y el agente liberador conocido ácido
8-anilino-1-naftalen
sulfónico (ANS). Todos los ácidos anisicos se compraron en Sigma
Chemical Company, St. Louis, Missouri; el ANS se obtuvo de
Calbiochem, La Jolla, California.
En estos experimentos, el diluyente para el
Reactivo A (Rgt A) se hizo de forma algo diferente que en el
ejemplo 1. Sin embargo, la composición fue la misma, excepto el
componente 7 (agente liberador, ácido o-anisico) y
componente 10 (concentración de anticuerpo de MPA). Se prepararon
cinco diluyentes, cuatro con cada uno de los agentes anteriores y
un control sin agente. Primero, una solución x2 se hizo de la forma
descrita en el Ejemplo 1 pero que tenía sólo componentes los 1 a 5
y 9 al doble de las cantidades en la lista. A continuación, para
tres de los diluyentes, cada uno de los tres isómeros de ácido
anisico se pesó para alcanzar una molaridad final de 12,5 mM y
predisueltos en un cuarto del volumen final de agua y una cantidad
mínima de NaOH 6N (aproximadamente 6 gotas por 0,2 gramos de ácido
anisico). Para el cuarto diluyente, se pesó el agente ANS, para dar
una concentración final de 0,25 mM y se añadió a un cuarto del
volumen final de agua. El quinto diluyente, el control, no contenía
agente liberador. Para hacer cada uno de estos cinco diluyentes, se
combinaron las cantidades apropiadas de solución x2, la cantidad de
BSA x1, componente 8, y la cantidad de solución de Pluronic 25R x1,
componente 6. Cuatro de estos recibieron entonces el agente
apropiado. Todos se mezclaron bien. Cuando fue necesario, se
hicieron ajustes de pH como se ha descrito previamente y cada
preparación se llevó al volumen final con agua desionizada para
alcanzar las concentraciones de los componentes x1. Cada uno de
estos diluyentes A se filtró entonces a través de un filtro de 0,2
micras. Las medidas finales de pH de cada uno estuvieron todas
entre 5,5 y 5,7. Para cada uno de estos cinco diluyentes A, se hizo
un Reactivo A correspondiente añadiendo anticuerpo de MPA para una
concentración final de 6,5 \mug/mL. El Reactivo B (Rgt B) se
preparó como se describe en el Ejemplo 1 excepto que se omitió el
componente 20 y 0,1% BSA (Miles Diagnostics, Kankakee, Illinois) se
sustituyó por BLG.
Debe observarse que la concentración de ANS en el
Reactivo A era limitada debido a su contribución a la absorbancia
de fondo. Mayores concentraciones de ANS crearon una lectura de
absorbancia fuera de la escala, evitando que se recogieran los
datos de la velocidad. Además debe observarse que todas las
preparaciones del reactivo A eran visualmente transparentes excepto
el Reactivo A con ANS que tenía un color amarillo marrón.
Se examinó en un total de dos veces, los efectos
de cada uno de los cuatro agentes relativo al control sin agente,
respecto a (1) la absorbancia de fondo a 340 nm, (2) la velocidad
de una muestra negativa de MPA, (3) evaluación del intervalo de
velocidad entre 0 y 10 \mug/mL de MPA, y (4) la cercanía de la
velocidad de la mezcla de 10 \mug/mL de MPA en NHP y en tampón.
Ambas veces se incluyó el Reactivo A como control. La primera vez
se evaluó el Reactivo A con ANS mientras que la segunda se evaluó
la preparación del Reactivo A conteniendo los isómeros
estructurales del ácido anisico.
El MPA se mezcló con NHP y con tampón (Buff) para
alcanzar una concentración final de 10 \mug/mL de MPA. El tampón
en este ejemplo fue de 50 mM MES, ácido
(2[N-morfolino]-etanosulfónico,
obtenido de Sigma Chemical Company) con 0,1% (peso/volumen) de
azida sódica, pH 7,1. Como con PBS, este tampón no contenía
proteína, por lo que no podía tener lugar la unión de proteína a
MPA.
Ambas veces, la absorbancia de fondo a 340 nm
para cada Reactivo A se midió por duplicado en 230 \muL de una
combinación de 3 \muL NHP negativo, 72 \muL de agua
desionizada, y 155 \muL de Reactivo A. El recorrido de la
longitud de la celda fue de 0,6 cm. Los valores medios A_{340}
(A=absorbancia) se encuentran en la columna C de la Tabla 1. Se
determinaron por duplicado en el NHP y el tampón mezclado y sin
mezclar como en el Ejemplo 1. Los únicos cambios del Ejemplo 1 para
la determinaciones de proporciones fueron en los protocolos de los
tiempos. Estos cambios fueron de la forma siguiente. Se añadieron el
Reactivo B y agua en el ciclo 4. El análisis se terminó al final
del ciclo 15. Las velocidades se determinaron utilizando las 5
lecturas de absorbancia de los ciclos 11 hasta 15.
Las medias de las proporciones se resumen en la
Tabla 2 en las columnas E a H.
| A | B | C | D | E | F | G | H | I | J | |
| M | Agente | A= | NHP | NHP | Tampón | Tampón | (H-G) | (H-F) | ||
| E | agente | con | con | con | con | |||||
| D | - | 0 | 10 | 0 | 10 | Tampón | ||||
| I | control | \mug/mL | \mug/mL | \mug/mL | \mug/mL | Tampón | ||||
| -NHP | ||||||||||
| D | Conc. | MPA | MPA | MPA | MPA | Velocid. | ||||
| A | en | Periodo | Difer. | |||||||
| Rgt A | A 340 | A 340 | Velocid. | Velocid. | Velocid. | Velocid. | Velocid. | |||
| # | mM | nm | nm | mA/min | mA/min | mA/min | mA/min | mA/min | mA/min | |
| Ninguno | ||||||||||
| 1 | (control) | 0 | 4,457 | - | 161,0 | 240,5 | 159,4 | 250,8 | 91,4 | 10,3 |
| ANS | 0,25 | 0,779 | 0,322 | 158,2 | 274,2 | 156,0 | 276,2 | 120,2 | 2,0 | |
| Ninguno | ||||||||||
| 2 | (control) | 0 | 0,486 | - | 159,1 | 238,7 | 159,5 | 250,6 | 91,1 | 11,9 |
| o-AA | 12,5 | 0,490 | 0,004 | 169,5 | 276,9 | 168,2 | 277,5 | 109,3 | 0,6 | |
| m-AA | 12,5 | 0,494 | 0,008 | 188,1 | 280,3 | 189,4 | 279,7 | 90,3 | -0,6 | |
| p-AA | 12,5 | 0,494 | 0,008 | 182,8 | 280,4 | 182,3 | 278,3 | 96,0 | -2,1 |
La efectividad del agente liberadores determinó
restando la velocidad de la mezcla de NHP de la velocidad de la
mezcla del tampón (columna H-columna F). Cuanto más
cercano a cero sea este valor, mejor es el efecto liberador. Basado
en este criterio, los tres agentes de ácido anisico mostraron una
liberación mejor de MPA al compararlos con el control, como se
puede observar por los resultados de la columna J. Así, los tres
agentes de ácido anisico disminuyen o eliminan el efecto de la
medida del NHP sobre el MPA, indicando que se mide el MPA
total.
Además se ha visto que, aunque el ANS puede
funcionar como un agente liberador, el ANS contribuye
perjudicialmente a la absorbancia de fondo (columna C y D) mientras
que los isómeros estructurales del ácido anisico tienen poco o
ningún efecto en la absorbancia de fondo. También, se encontró que
el Reactivo A con ANS se decoloraba visiblemente cuando se exponía
a la luz. Esto no ocurrió con el control o los reactivos del ácido
anisico.
Los cuatro agentes mostraron algún efecto
perjudicial o tolerable bien en la velocidad negativa y/o periodo
de la velocidad comparados con los valores control. Esto indicó que
los agentes tenían otros efectos que reducir el efecto matriz del
NHP. El ANS tuvo el mayor aumento en el periodo de la velocidad. Los
ácidos anisicos tuvieron un aumento marcado en la velocidad
negativa sobre el control mientras que el ANS tuvo poco o no
efecto. Aunque existían estos efectos en la velocidad negativa
relativa a los agentes sin ácido anisico, no parece que hubo ningún
impacto en la actuación del ensayo porque las proporciones negativas
para el tampón y el NHP fueron las mismas (ver columnas E y G). Se
obtuvo un ensayo con una sensibilidad muy buena con el ácido
o-anisico.
En resumen, los resultados del estudio mostraron
que los tres ácidos anisico actuaron bien como agentes liberadores
con el ácido o-anisico mostrando resultados algo
mejores que los isómeros meta y para basados en el pequeño efecto
en la velocidad negativa. Los resultados mostraron que el ANS tenía
varios efectos de comportamiento que no eran deseables como un
aumento de la absorbancia y decoloración del reactivo cuando se
expuso a la luz. El ANS tiene una contribución significativa a la
absorbancia de fondo incluso a un nivel relativamente bajo de 0,25
mM en el Reactivo A, limitando así su utilización en ensayos,
especialmente aquellos que tienen un máximo de absorbancia.
Los isómeros del ácido anisico no demostraron
estos efectos en la absorbancia o coloración a la exposición de la
luz y todos fueron efectivos en la liberación de MPA del NHP como
se ha visto por las proporciones equivalentes o casi equivalentes
de MPA en una matriz no proteica (tampón) y NHP. Sin estos agentes,
el MPA en el tampón dio una proporción mayor (más MPA aparente) que
la misma concentración de MPA en NHP. El isómero orto tuvo el menor
efecto en la velocidad negativa. Además, el ácido
o-anisico cuantificó MPA de forma equivalente en
una matriz sin proteína y NHP.
En un estudio separado otro agente, el ácido
salicílico, (ácido 2-hidroxibenzoico) se formuló
en el Reactivo A a 12,5 y 25 mM. Este agente redujo la distancia de
la velocidad en 47% y aumentó la velocidad negativa en 38% relativa
al control sin agente liberador. Las velocidades se determinaron de
una forma similar a la descrita en el Ejemplo 2. Adicionalmente, los
25 mM de ácido salicílico contribuyeron 0,311 unidades de
absorbancia sobre el fondo del control a 340 nm. También se observó
que la preparación del Reactivo A con ácido salicílico tenía un
ligero tinte rosa. Este color visual y la absorbancia de fondo a
340 nm pueden deberse a la interacción del ácido salicílico que
contiene sales férricas como describe el Merck Index, eleventh
edition, Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, página 3800. El
ácido salicílico se eliminó de estudios comparativos más extensos
debido a estos resultados experimentales.
En un estudio separado, se comparó la capacidad
del ácido o-anisico para eliminar el efecto del
salicilato en las velocidad es de MPA mezclado con plasma. Se
prepararon dos grupos de reactivos de anticuerpos (Reactivo A) con
la formulación básica descrita en el Ejemplo 2 anteriormente. En un
reactivo no se añadió agente liberador; en otro reactivo se añadió
ácido o-anisico a 12,5 mM. Se preparó un Reactivo B
común como se describe en el Ejemplo 2.
Se midieron velocidades de cuatro niveles de
mezclas de MPA en plasma y un control de plasma con cada grupo de
reactivos. Se preparó un grupo de mezcla de plasma similar
conteniendo medicamentos coadministrados que no interfieren, y se
preparó otro grupo de mezcla de plasma conteniendo medicamentos que
no interfieren, más salicilato. Las concentraciones de medicamentos
que no interfieren en \mug/mL fueron las siguientes: ampicilina,
36; cefaclor, 26; cloranfenicol, 64; trimetoprim, 2; albuterol, 7;
isoproterenol, 18; metoprolol, 77; diltiazem, 28; nifedipina, 22;
verapamil, 12; fenoprofeno, 16; indometacina, 36; ketoconazole, 75;
miconazole, 106; isoniazida, 120;
5-fluorouracilo,23; griseofulvina, 10;
methotrexato, 2; difenhidramina, 93; dl-efedrina,
103; fenilefrina, 76; disopiramida, 52; procainamida, 64;
metoclorpramida, 5; niacina, 25; niacinamida 47; acetaminofeno, 87;
y lidocaina, 43;. El salicilato estaba presente a 659
\mug/mL.
Las velocidades se determinaron como se describe
en el Ejemplo 2 anterior con la excepción de la ventana de la
absorbancia leída, que se extendió al ciclo 20 en que terminó el
ensayo. Las velocidades se determinaron utilizando las 10 lecturas
consecutivas de absorbancia de los ciclos 11 a 20. Los resultados se
resumen en la Tabla 3.
| Reactivo anticuerpo sólo | Reactivo anticuerpo + | |
| ácido o-anisico | ||
| MPA + MeOH* | ||
| 0 \mug/MI | 149 | 161 |
| 0,5 \mug/mL | 155 | 171 |
| 2,5 \mug/mL | 181 | 210 |
| 5 \mug/mL | 201 | 234 |
| 15 \mug/mL | 240 | 264 |
| MPA + NI** | ||
| 0 \mug/MI | 149 | 161 |
| 0,5 \mug/mL | 158 | 173 |
| 2,5 \mug/mL | 183 | 211 |
| 5 \mug/mL | 204 | 234 |
| 15 \mug/mL | 242 | 263 |
| MPA + NI + Salicilato** | ||
| 0 \mug/mL | 149 | 161 |
| 0,5 \mug/mL | 157 | 171 |
| 2,5 \mug/mL | 190 | 211 |
| 5 \mug/mL | 210 | 234 |
| 15 \mug/mL | 250 | 263 |
| *MeOH = plasma mezclado con metanol como control para la mezcla de NI | ||
| **NI = plasma que contiene mezclas de medicamentos que no interfieren coadministrados además del MPA |
En resumen, el salicilato aumentó las velocidades
de MPA en plasma humano normal en ausencia de agentes liberadores,
que podrían resultar en la cuantificación inexacta de MPA en el
ensayo. La presencia de ácido o-anisico como agente
liberador en el reactivo de anticuerpo eliminó este problema
potencial en un ensayo para MPA.
La discusión anterior incluye ciertas teorías
como mecanismos implicados en la presente invención. Estas teorías
no deben considerarse como limitantes de la presente invención de
ninguna forma, ya que se ha demostrado que la presente invención
alcanza el resultado descrito.
La descripción anterior y ejemplos describen
completamente la invención incluyendo sus realizaciones
preferidas.
Claims (26)
1. Un método para liberar ácido micofenólico de
un complejo del mismo, comprendiendo dicho método poner en contacto
un medio que se sospecha que contiene dicho complejo con una
cantidad eficaz de un compuesto de fórmula:
en la que R^{1} es alquilo, R^{2} es
hidrógeno o alquilo; X es O, S o N; n es 1 cuando X es O o S y n es
2 cuando X es N; y m es 1 o
2.
2. El método de la reivindicación 1, en el que X
es O.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el
que dicho compuesto es ácido metoxibenzoico.
4. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en el
que dicho compuesto es ácido o-metoxibenzoico.
5. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el
que dicho complejo de ácido micofenólico está presente en una
muestra y dicha muestra y dicho compuesto y un copartícipe de unión
para el ácido micofenólico se proporcionan en un medio de ensayo
para la determinación de ácido micofenólico y en el que la cantidad
de dicho compuesto es suficiente para aumentar la exactitud de
dicha determinación.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
dicho copartícipe de unión específica es un anticuerpo.
7. El método de la reivindicación 5, en el que un
análogo marcado del ácido micofenólico se pone en contacto con
dicha muestra.
8. El método de la reivindicación 5, en el que
dicho copartícipe de unión está unido a un soporte o es capaz de
estar unido a un soporte.
9. El método de la reivindicación 5 o 6, en el
que dicho complejo es un complejo de ácido micofenólico y proteínas
endógenas y en el que el ácido micofenólico conjugado a un marcador
detectable está presente en un medio acuoso.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
dicho marcador perceptible es una enzima y dicha determinación
comprende medir la actividad de dicha enzima.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
está presente un substrato para la enzima.
12. El método de la reivindicación 10, en el que
dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
fosfatasa alcalina.
13. El método de la reivindicación 9, en el que
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
14. El método de la reivindicación 9, en el que
el anticuerpo está unido a un soporte o es capaz de estar unido a
un soporte.
15. El método de la reivindicación 9, en el que
el anticuerpo es capaz de distinguir entre ácido micofenólico y uno
de sus ésteres.
16. El método de la reivindicación 9, en el que
el anticuerpo es capaz de distinguir entre ácido micofenólico y un
metabolito de ácido micofenólico.
17. El método de la reivindicación 9, que es un
inmunoensayo homogéneo y en el que la actividad del marcador
detectable se compara con la actividad enzimática observada con una
muestra que contiene una cantidad conocida de dicho ácido
micofenólico.
18. Un kit para realizar un ensayo para la
determinación de ácido micofenólico, comprendiendo dicho kit una
combinación empaquetada de:
\newpage
(a) un copartícipe de unión para dicho ácido
micofenólico
(b) un compuesto de fórmula
en la que R^{1} es alquilo, R^{2} es
hidrógeno o alquilo; X es O, S o N; n es 1 cuando X es O o S y n es
2 cuando X es N; y m es 1 o
2.
19. El kit de la reivindicación 18, que además
comprende ácido micofenólico unido a un marcador perceptible.
20. El kit de la reivindicación 18, en el que
dicho compuesto es ácido metoxibenzoico.
21. El kit de la reivindicación 18, en el que
dicho compuesto es ácido o-metoxibenzoico.
22. El kit de la reivindicación 18, en el que
dicho copartícipe de unión es un anticuerpo.
23. El kit de la reivindicación 22, en el que el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
24. El kit de la reivindicación 22, en el que el
anticuerpo está unido a un soporte o es capaz de estar unido a un
soporte.
25. El kit de la reivindicación 22, en el que el
anticuerpo es capaz de distinguir entre ácido micofenólico y uno de
sus ésteres.
26. El kit de la reivindicación 22, en el que el
anticuerpo es capaz de distinguir entre ácido micofenólico y un
metabolito de ácido micofenólico.
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Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| NL7605447A (nl) | 1975-06-26 | 1976-12-28 | Byk Mallinckrodt Chem Prod | Radioimmunoproefmethode voor de bepaling van thyroxine. |
| US4052504A (en) | 1976-06-30 | 1977-10-04 | Corning Glass Works | Assay for thyroxine binding globulin |
| US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4233402A (en) | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
| US4318980A (en) | 1978-04-10 | 1982-03-09 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label |
| US4332786A (en) * | 1980-05-15 | 1982-06-01 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Method and composition for vitamin B-12 Assay |
| US4486530A (en) | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4451571A (en) * | 1981-04-06 | 1984-05-29 | University Patents, Inc. | Preparation of samples for vitamin B12 and/or folate assay and assay |
| WO1983000147A1 (en) | 1981-06-26 | 1983-01-20 | Duffy, Patrick | 8-anilino naphthalene-1-sulphonic acid analogues |
| US4454232A (en) * | 1982-06-07 | 1984-06-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Estriol assay |
| JPS5923252A (ja) | 1982-07-30 | 1984-02-06 | Fuji Photo Film Co Ltd | チロキシンの蛍光測定もしくは比色による定量分析法 |
| GB8404843D0 (en) | 1984-02-24 | 1984-03-28 | Amersham Int Plc | Free analyte assay |
| EP0165669A1 (en) | 1984-05-04 | 1985-12-27 | Corning Glass Works | Improved method of measuring free ligand |
| US4601591A (en) | 1984-05-14 | 1986-07-22 | The Garrett Corporation | Elastomeric bearing damper apparatus and associated methods |
| US4559291A (en) * | 1984-12-28 | 1985-12-17 | Eastman Kodak Company | Ligands for metallizable dyes |
| US4868104A (en) | 1985-09-06 | 1989-09-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Homogeneous assay for specific polynucleotides |
| EP0218309B1 (en) * | 1985-10-04 | 1995-11-15 | Diagnostic Products Corporation | Method for measuring free ligands in biological fluids |
| US4798804A (en) * | 1987-02-05 | 1989-01-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serum pretreatment in digoxin immunoassay |
| US4857453A (en) | 1987-04-07 | 1989-08-15 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunoassay device |
| US5089390A (en) | 1987-09-04 | 1992-02-18 | Syntex (U.S.A.) Inc. | 2-methyl-4-hexene- and 2-methyl-4-heptene-1,2-diol derivatives |
| US4959303A (en) | 1987-12-21 | 1990-09-25 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Assay for antigens by binding immune complexes to solid supports free of protein and non-ionic binders |
| US5185243A (en) | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| EP0392332A3 (de) | 1989-04-12 | 1992-01-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay und Reagentien dafür |
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| CA2231569A1 (en) * | 1996-07-18 | 1998-01-29 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Reagents for assays for mycophenolic acid |
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