ES2198645T3

ES2198645T3 - Procedimiento mejorado para diagnosticos de alergia.

Info

Publication number: ES2198645T3
Application number: ES98203472T
Authority: ES
Inventors: Ronald Dr. Van Ree; Rob C. Dr. Aalberse
Original assignee: HALMON LAB BEHEER BV; HALMON LABORATORIA BEHEER BV
Current assignee: HALMON LAB BEHEER BV; HALMON LABORATORIA BEHEER BV
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2018-10-15
Also published as: EP0994353B1; DE69814078D1; ATE239230T1; EP0994353A1; DK0994353T3; DE69814078T2

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento mejorado para diagnósticos alérgicos, particularmente para diagnósticos alimentarios de alergia, caracterizado porque los anticuerpos IgE obtenidos de individuos son expuestos a un agente que convierte a los anticuerpos IgE esencialmente incapaces de reaccionar con un epitomo sacárido de un material del mencionado antígeno; y/o a una parte digerida de la proteasa del mencionado material antigénico; y a un nativo, por ejemplo la parte no digerida del mencionado material antigénico; sobre la cual se detecta la formación de complejos antigénicos IgE y evalúa respecto a la determinación de los antígenos no reaccionados y/o complejos IgE/ antígeno clínicamente relevantes en el cual el anticuerpo IgE se une a un epítomo esencialmente peptídico de un antígeno. La presente invención también se refiere a un kit de diagnóstico para ser usado en uno o en más de uno de los procedimientos anteriormente mencionados, particularmente para diagnósticos alimentariosde alergia in vitro o in vivo. Y a un procedimiento para determinar una respuesta alérgica de un individuo a un material antigénico que puede ingerirse por vía oral o nasal, por medio de un ensayo mejorado de piel.

Description

Procedimiento mejorado para diagnósticos de alergia.

Campo de la invención

La presente invención se ubica en el campo de diagnósticos de alergia y proporciona un procedimiento mejorado para diagnosticar con más exactitud factores relevantes clínicamente de alergias graves y menos graves, particularmente de alergias a alimentos. Además se refiere a un kit de prueba para llevar a cabo la determinación del diagnóstico.

Antecedentes

Las enfermedades alérgicas que incluyen alergias a alimentos han aumentado mucho a lo largo de las últimas décadas. El término ``alergia'' tal y como se usa en la presente invención se referirá a una alteración inmunológica mediada por anticuerpos IgE, una alergia denominada tipo I, a no ser que se defina o derive de la descripción otra cosa. Los síntomas inducidos por agentes alérgenos o ingredientes alimenticios alérgenos pueden variar mucho respecto a la gravedad así como al órgano diana que está afectado. Los síntomas leves normalmente están restringidos a la cavidad oral- faringea: hinchazón de labios y lengua, picor en boca y garganta, etc. Este tipo de alergia a alimentos a menudo se denomina como el síndrome de alergia oral (SAO) (1). Los síntomas más graves normalmente son sistémicos y pueden variar desde urticaria generalizada y alteraciones gastrointestinales hasta shock anafiláctico. En el último caso, la alergia a los alimentos es una amenaza para la vida. Son ejemplos conocidos de tales alergias a los alimentos peligrosas las alergias a los cacahuetes y a las gambas. Afortunadamente, son más comunes las alergias leves a alimentos. A menudo tienen lugar en pacientes alérgicos al polen. Un ejemplo bien conocido es la alergia a frutas como la manzana y el melocotón en pacientes con alergia al polen de abedul (2). Se ha demostrado que la base de tales conexiones es la reactividad cruzada de los anticuerpos IgE: estructuras relacionadas en polen y alimentos son reconocidas por los mismos anticuerpos IgE. Algunas de estas estructuras reactivas cruzadas son reconocidas por anticuerpos IgE, pero no inducen alergia clínica a alimentos. Esto se ha demostrado por anticuerpos IgE dirigidos a determinantes carbohidrato en glicoproteínas en alimentos vegetales (3), que incluyen el kiwi (11).

El diagnóstico de alergia a alimentos se lleva a cabo de varias formas, parcialmente complementarias. Se tiene que registrar una profunda anamnesis. El diagnóstico además puede respaldarse por medidas in vivo y ensayos in vitro. La más común de las técnicas in vivo es una prueba de piel con extractos de alérgenos de alimentos. A veces es necesaria una provocación oral para determinar qué componentes alimenticios son los agentes causantes de la alergia observada. Las pruebas in vitro más comunes son el RAST y el ELISA. En estos ensayos, extractos de material antigénico, alérgico potencialmente, se inmovilizan en una fase sólida (por ejemplo, Sefarosa, partículas magnéticas, placas de poliestireno, etc.) Después de la incubación de la fase sólida con suero de una probanda o paciente, se mide normalmente la unión de anticuerpos IgE específicos. Para la detección, se usan más frecuentemente técnicas basadas en radiactividad y/o enzimas. Todos estos ensayos determinan niveles o actividades de anticuerpos IgE específicos. No dan, sin embargo, información sobre la apariencia y relevancia clínica de los complejos alérgeno-IgE determinados. Similares resultados de prueba de piel o prueba in vitro de diferentes pacientes pueden acompañarse por síntomas leves en un paciente y por síntomas graves en otro. La alergia clínica puede incluso estar totalmente ausente. El valor de una prueba de diagnóstico aumentaría enormemente si distinguiera entre respuestas de IgE sin importancia clínica, anticuerpos IgE relacionados con síntomas leves y anticuerpos IgE relacionados con alergia grave. Tal distinción diagnóstica por supuesto aumentaría considerablemente la fiabilidad y eficacia de las recomendaciones dietéticas o de comportamiento. Es un objetivo principal de la presente invención proporcionar tal procedimiento.

La potencia alergénica total de un material antigénico puede determinarse aproximadamente como la suma de las potencias alergénicas de sus componentes antigénicos de unión a IgE. Esto implica que el perfil IgE individual es un factor crucial para que el sistema inmune de una persona produzca una respuesta alérgica contra un material antigénico con el que ha entrado en contacto. Se ha observado que, por ejemplo, una sustancia A antigénica que se da, por ejemplo, en alimentos se ha reconocido por un sistema inmune de un individuo como un agente alergénico y produce síntomas serios, mientras que otra sustancia B, que puede incluso conocerse por provocar reacciones alergénicas en mucha gente, produce solamente síntomas suaves o quizás ningún síntoma en ese individuo. Incluso a pesar de que los fenómenos en torno a la alergia no se han entendido todavía completamente por lo menos se conocen dos factores que están implicados: la naturaleza bioquímica del epítopo del antígeno reconocido por IgE, y la estabilidad química de la estructura o determinante antigénico de unión a IgE. Si una cadena lateral de carbohidrato en una glicoproteína es una parte esencial del epítopo entonces el material antigénico, por ejemplo, alimento, que contiene tales glicoproteínas se tolera bien normalmente (3). Para la inducción de síntomas alérgicos relevantes clínicamente, el reconocimiento de IgE de epítopos antigénicos de naturaleza peptídico esencialmente parece ser importante.

Las estructuras carbohidrato de unión a IgE son extremadamente estables: son insensibles al calor, a proteasas, etc. En contraste, varias proteínas alergénicas de reacción cruzada son muy lábiles (4). Esto explica la mala calidad de muchos diagnósticos de alergia a alimentos: estructuras carbohidrato antigénicas irrelevantes clínicamente conservan su capacidad de unión a IgE, mientras que estructuras peptídicas relevantes la pierden fácilmente. Algunos agentes o componentes antigénicos con epítopos peptídicos son, sin embargo, extremadamente resistentes a proteasas (5). Su estructura de unión a IgE se mantiene incluso después de una exposición prolongada a pepsina. Si tal proteína es insensible a la digestión con pepsina, es más probable que esté implicada en alergia a alimentos grave. Los alérgenos pepsina-estables son capaces de alcanzar los intestinos en su conformación de unión a IgE. Los alérgenos pepsina-lábiles se digieren en el estómago, limitando esencialmente su alcance alergénico a la cavidad oral-faringea. Las mejoras de diagnósticos de alergias, particularmente los diagnósticos de alergia a alimentos, proporcionados por esta invención, se dirigen a una evitación selectiva de una detección de anticuerpos IgE dirigidos a determinantes carbohidrato irrelevantes clínicamente por un lado y/o a una detección selectiva de anticuerpos IgE contra alérgenos pepsina-estables por el otro lado.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento mejorado de diagnósticos de alergia para evitar o reducir el número de resultados falsos positivos y/o para aumentar la selectividad de detección de factores alergénicos relevantes clínicamente. Así, se facilita un diagnóstico más exacto, aumentando por ello la calidad de vida y la seguridad de los pacientes alérgicos, particularmente alérgicos a alimentos.

La mejora comprende evitar la detección de anticuerpos IgE específicos de carbohidrato y/o la detección selectiva de alérgenos pepsina-estables. Ambas modificaciones se aplican al mismo tipo de ensayo: inmunoensayos para la medida de anticuerpos IgE alérgeno-específicos in vitro e in vivo. La presente invención por tanto se refiere a un procedimiento mejorado para diagnósticos de alergia, particularmente para diagnósticos de alergia a alimentos, que comprende la reacción de uno o más anticuerpos IgE de un individuo con material antigénico para que se pruebe para potencial alergénico, y consecutivamente determinar la formación de complejos IgE/antígeno, caracterizada porque los anticuerpos IgE, preferiblemente una muestra de suero que contiene anticuerpos IgE, que se obtiene de dicho individuo se exponen

a) a un agente que convierte los anticuerpos IgE en substancialmente incapaces de reaccionar con un epítopo sacárido de un antígeno de dicho material antigénico; y/o

b) a una porción digerida por proteasa de dicho material antigénico; y

c) a una porción natural, es decir, no digerida de dicho material antigénico; con lo que

d) la formación de complejos IgE/antígeno se detecta y se evalúa respecto a la determinación de antígenos no unidos y/o complejos IgE/antígeno relevantes clínicamente en la que el anticuerpo IgE se une a un epítopo esencialmente peptídico de un antígeno presente en dicha porción digerida por proteasa y/o no digerida del material antigénico.

El término ``natural'' tal y como se usa en la presente invención se refiere a material antigénico no digerido, es decir, a material antigénico que no se ha sometido a tratamiento proteolítico con proteasa, por ejemplo, enzimático.

La invención se refiere a un procedimiento tal y como se define anteriormente, en el que dicho agente aplicado en la etapa a) comprende un inhibidor que se adhiere o une a y/o bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una especificidad para antígenos con epítopos sacáridos. Dicho agente se elige del grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, extracto de alimento vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura que tiene lugar en un extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal.

Se prefiere también que el material antigénico se proporcione en la forma de un extracto alimenticio, un extracto de planta o un extracto de fruta, particularmente en la forma de un extracto vegetal o de un alimento animal invertebrado, por ejemplo, de gamba.

Ventajosamente, la digestión de proteína del material antigénico se lleva a cabo con al menos una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente con pepsina, mientras que el extracto de polen se digiere preferiblemente usando proteinasa K o pronasa.

La detección de complejos de IgE/antígeno y/o antígenos que no reaccionan se lleva a cabo por procedimientos bien conocidos en la materia, particularmente por inmunoensayos tales como ELISA (ensayo de inmunoabsorbencia de unión a enzima) o RAST (prueba absorbente radio-alergo), o procedimientos quimiluminiscentes.

En otra forma de realización la prueba de alergia de la presente invención se aplica como una prueba de piel en la que los anticuerpos IgE que se dan o se liberan a las capas de piel superiores de un individuo se someten a las etapas mencionadas anteriormente a) a d).

La presente invención se refiere también a un kit de diagnóstico para uso en uno o más de los procedimientos mencionados anteriormente, particularmente para diagnósticos de alergia a alimentos in vitro o in vivo. Dichos kits de pruebas comprenden

- una muestra de un material antigénico natural, es decir, no digerido, para probarlo para potencial alergénico; y

- un agente que convierte anticuerpos IgE en substancialmente incapaces de reaccionar con un epítopo sacárido de un antígeno del material antigénico, y/o una porción de dicho material antigénico digerida por proteasa, preferiblemente digerida por pepsina.

En dichos kits de pruebas, el agente anteriormente mencionado se elige del grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, extracto alimenticio vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura que se da en un extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal. Se prefiere también que el material antigénico digerido por proteasa se digiera al menos por una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente por pepsina.

La presente invención además se refiere al uso de una muestra de un material antigénico natural, no digerido para probarla para potencial alérgico junto con una porción de la misma digerida por proteasa y/o junto con un inhibidor que se adhiere o se une y/o bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una especificidad para antígenos con epítopos sacáridos, para la elaboración de una composición para determinar una respuesta alérgica de un individuo a un material antigénico ingerible por vía oral o nasal por medio de una prueba de piel.

Se prefiere que según este uso el material antigénico digerido por proteasa que se use estuviera digerido por al menos una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente por pepsina.

Dicho agente para convertir anticuerpos IgE en substancialmente incapaces de reaccionar con epítopos esencialmente sacáridos de moléculas antigénicas se elige del grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, un extracto alimenticio vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura que se da en un extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal.

En este contexto el término ``epítopo sacárido'' tal y como se usa en la presente invención se referirá a un determinante antigénico de una molécula orgánica, particularmente de una proteína o glicoproteína, en el que dicho determinante está sustancialmente o completamente compuesto por moléculas de carbohidrato y/o derivados de los mismos.

Del mismo modo, el término ``epítopo peptídico'' se referirá a un determinante antigénico de una molécula orgánica, particularmente de una proteína o glicoproteína, en el que dicho determinante está sustancialmente o completamente compuesto por moléculas de aminoácidos y/o derivados de los mismos, al menos algunas de ellas unidas por unión por péptido.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1A, 1B, 1C muestran la influencia de la digestión de la proteinasa K sobre los contenidos de tres principales alérgenos en extracto de polen de hierba. Los principales alérgenos purificados marcados radiactivamente se sometieron a RIA competitivo usando extracto de polen de hierba digerido y no digerido como agentes competidores (``inhibidores'') contra anticuerpos IgE monoclonales alérgeno- específicos como las dianas de unión. Los resultados se expresan en % de unión de alérgeno marcado radiactivamente.

La Fig. 2 muestra un RAST con extracto de polen de hierba no digerido y digerido con proteinasa K con 4 sueros de pacientes alérgicos al polen de hierba. Los sueros I y II reconocen claramente antígenos presentes todavía en extracto de polen digerido, a pesar de que hay un descenso significativo comparado con el extracto de polen no digerido. Esta diferencia se produce por una pérdida de epítopos peptídicos. Los sueros III y IV no se unen al extracto de polen digerido, indicando que la reactividad de los anticuerpos IgE de esos sueros con extracto de polen está exclusivamente dirigida a epítopos peptídicos.

La Fig. 3 demuestra la influencia del tratamiento de periodato de extractos de polen y de alimentos en un RAST con extractos no tratados (-) y tratados (+). Para el suero PB, el tratamiento de periodato no tuvo un efecto significativo en la unión a IgE. Para el suero VW, la unión a IgE desapareció casi completamente después de un tratamiento de periodato indicando que este suero contiene anticuerpos IgE reactivos principalmente con determinantes carbohidrato periodato-sensibles.

La Fig. 4 describe la unión de IgE específicos de carbohidrato a glicoproteínas no relacionadas. Se realizó un RAST con 4 sueros que contienen anticuerpos IgE que son reactivos con extractos de polen digeridos con proteasa. Se incluyó un suero de un paciente alérgico al polen (suero 5) que no mostró reactividad IgE con extractos de polen digeridos. Se probaron cinco proteínas no relacionadas en absoluto: bromelaína de pedúnculo de piña, peroxidasa de rábano picante (HRP), Lolp11 de polen de hierba Lolium perenne, fitohemaglutinina-L (PHA-L) de Phaseolus vulgaris, y fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) de veneno de abeja. Los 4 sueros carbohidrato-reactivos se unen a todas las 5 glicoproteínas, el suero control es no reactivo. La explicación para esta observación es que estas proteínas y antígenos no relacionados presentes en el extracto de polen tienen estructuras carbohidrato muy similares en sus epítopos de unión a IgE.

La Fig. 5 describe cuanto se inhibe la actividad de unión de los anticuerpos IgE a extracto de polen digerido por proteasa acoplada a sefarosa (en este caso polen de abedul) por la adición de extracto de polen de abedul, peroxidasa de rábano picante (HRP) y la glicoproteína humana transferrina. La última proteína se usó como una glicoproteína control con un N-glicano que es diferente de los típicos N- glicanos de planta. Tanto el extracto del polen digerido como el HRP inhibieron casi completamente la unión. Con transferrina, sin embargo, no se observó inhibición.

La Fig. 6 muestra los resultados obtenidos cuando un suero que contiene anticuerpos IgE contra determinantes carbohidrato, y otro suero que contiene anticuerpos IgE contra profilina se probaron en un RAST con diferentes extractos de polen y alimentos vegetales. Según solo estos resultados RAST es prácticamente imposible distinguir entre estos dos tipos de suero.

Las Figs. 7A, 7B, 7C muestran los resultados de un RAST modificado para evitar la detección de anticuerpos IgE irrelevantes clínicamente contra determinantes carbohidrato. Se hizo una comparación entre un RAST convencional (no modificado) y el RAST modificado (es decir, en presencia de extracto de polen digerido por proteasa) según la presente invención. Para este propósito se usó suero de tres pacientes típicos: 1) un paciente alérgico al polen con un RAST positivo a alimentos vegetales sin ningún síntoma relacionado de alergia a alimentos (asintomático); 2) un paciente alérgico a polen de abedul con síntomas leves de alergia a alimentos (síndrome de alergia oral), basado en alérgenos de reacción cruzada de polen-alimentos vegetales; 3) un paciente alérgico al polen de hierba con alergia a fruta más grave (anafilaxis), pero sin reactividad cruzada entre polen y alimentos vegetales. Se demuestra que el RAST convencional produce un resultado falso positivo para el paciente asintomático mientras que el RAST modificado da una imagen mucho más realista sobre la amenaza alérgica potencial.

La Fig. 8 muestra resultados de RAST usando un extracto de melocotón tratado con pepsina como una fuente de alérgeno. El extracto de melocotón se digirió con la pepsina durante diferentes periodos de tiempo (1 min a 1 h). Después de la digestión, se acoplaron a Sefarosa muestras del extracto para aplicación en un RAST. El análisis RAST se realizó con suero de un paciente con una alergia a la fruta leve relacionada con polen de abedul (SAO) y con un suero de un paciente que sufría una alergia a la fruta más grave (anafilaxis). Mientras que los anticuerpos de ambos pacientes son reactivos con extracto de melocotón no digerido, virtualmente no se observó reactividad IgE del paciente 1 (SAO) con extracto de melocotón digerido con pepsina. Este efecto tuvo también lugar con extracto de melocotón que se había tratado con pepsina durante sólo 1 minuto. Para el otro paciente el valor RAST no cambió significativamente, no incluso cuando se usó un extracto de melocotón que se había sometido a un tratamiento con pepsina 1 hora. Esto indica que los anticuerpos IgE del segundo paciente reconocen un alérgeno que es extremadamente resistente al tratamiento con pepsina. En otras palabras, reconocen y se unen a una molécula alergénica que muy probablemente pasará el estómago en una conformación de unión a IgE.

La Fig. 9 se refiere a un RAST de inhibición con extracto de melocotón no digerido y tratado con pepsina (durante 1 hora). Se usaron suero de un paciente con una alergia leve (SAO) y otro suero de un paciente con alergia grave (anafilaxis). Después de la digestión con pepsina, la potencia inhibitoria del extracto no cambió para el suero del paciente con alergia grave, lo que indica que los anticuerpos IgE del paciente reconocen selectivamente y se unen a un epítopo que no se destruye por el tratamiento con pepsina. Para el suero del paciente con SAO se observó una disminución de al menos un orden de magnitud lo que indica que los anticuerpos IgE del paciente se unen a un epítopo peptídico que está presente en el extracto de melocotón no digerido pero que está ausente en el extracto de melocotón digerido debido a la división por pepsina.

Las Figs. 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, 10F muestran resultados obtenidos del análisis RAST de varios extractos de alimentos naturales (es decir, no digeridos) y digeridos con pepsina. Para varios tipos de frutos secos y fruta se ha investigado la reactividad de un suero que contiene anticuerpos IgE contra alérgeno(s) insensible(s) a pepsina y un suero que contiene anticuerpos IgE contra alérgeno(s) sensible(s) a pepsina. El RAST modificado según la presente invención distingue claramente entre ambos tipos de suero.

La Fig. 11 muestra el resultado de un RAST con extracto de alérgeno de gamba no digerido y digerido por pepsina. Para dos sueros de pacientes que sufren alergia grave relacionada con las gambas se demuestra que las estructuras de unión a IgE son insensibles a la digestión por pepsina.

Descripción detallada de la invención

Los ensayos para la medida de la IgE específica tienen las siguientes características. El material antigénico deseado, por ejemplo, un supuesto o conocido agente alergénico tal como un extracto de alimento, se inmoviliza en una fase sólida, ya sea por unión covalente a una fase sólida activada químicamente (por ejemplo, Sefarosa, gotas magnéticas, discos de papel, etc.) o por unión no covalente (por ejemplo, a placas de micropocillos de poliestireno). El suero obtenido de un individuo, normalmente de un paciente alérgico o potencialmente alérgico, se incuba con la fase sólida para dejar que los anticuerpos IgE alérgeno-específicos se unan a los alérgenos inmovilizados. En algunos ensayos, el material antigénico se hapteniza (por ejemplo, biotinilado) y se incuba con suero, antes de la adición de una fase sólida que contiene ligandos (por ejemplo, estreptavidina) con afinidad por el hapteno. En este caso, la inmovilización de los antígenos tiene lugar después de la formación de complejos IgE antígeno- específico. Todos los ensayos tienen en común que la incubación de suero y material antigénico es seguida por varias etapas de lavado para retirar los componentes de suero no unidos. Consecutivamente, se lleva a cabo una segunda incubación con anticuerpos dirigidos a IgE humano. Estos anticuerpos están marcados para permitir la detección de anticuerpos unidos tras la incubación. El marcado se puede conseguir de muchas formas como con radiactividad, con enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o con marcas fluorescentes o quimiluminiscentes. La segunda incubación es seguida de nuevo de varias etapas de lavado para retirar los anti-IgE marcados no unidos. La detección de la marca unida se realiza con las técnicas apropiadas bien conocidas en la materia.

Para evitar la detección de anticuerpos IgE específicos de carbohidrato con diagnósticos de alérgenos de alimentos, se añade un inhibidor soluble en la primera etapa de incubación (suero más antígeno). El inhibidor soluble reacciona con y bloquea los anticuerpos IgE específicos de carbohidrato, previniéndoles por tanto de unirse a la fase sólida. Este inhibidor soluble puede ser un extracto de polen digerido por proteasa. La digestión con proteasa, por ejemplo, proteinasa K o pronasa resulta en la destrucción de las cadenas principales del péptido de las (glico)proteínas, pero deja estructuras carbohidrato intactas (6). Los pólenes son la primera elección como fuente de epítopos sacáridos, porque la inducción de los anticuerpos IgE específicos de carbohidrato tiene lugar principalmente por inhalación de polen (2). Estos anticuerpos IgE son reactivos cruzados con estructuras carbohidrato relacionadas estrechamente en alimentos vegetales. Por lo tanto, los extractos de alimentos vegetales digeridos con proteasa pueden servir como inhibidores alternativos. Finalmente, pueden usarse también péptidos sintéticos que imitan epítopos sacáridos (7, 8).

Para detectar selectivamente anticuerpos IgE dirigidos a alérgenos que sobreviven el paso a través del estómago y así producir alergias graves, el material antigénico se somete a digestión con pepsina. En el caso de extracto alimenticio de masa seca congelada (que se usa normalmente en diagnósticos de alergia a alimentos) como el material antigénico el extracto se somete a una hora de digestión con pepsina a 37ºC. La pepsina puede ser soluble o inmovilizarse en una matriz sólida como agarosa. La digestión se lleva a cabo en HCl 10mMol/L a concentraciones de proteína (extracto de alérgeno) de aproximadamente 1 a 5 mg/ml y concentraciones de pepsina de 0,35% (peso/volumen). Después de 1 hora, se para la digestión por la adición de un \textonehalf volumen de K_{2}HPO_{4} 0,5 Mol/L (pH 8,2). La digestión es seguida por una diálisis sobre un medio adecuado para uso adicional del extracto de alérgeno digerido (por ejemplo, acoplamiento a fase sólida). Según el mejor modo de la invención la detección selectiva de anticuerpos IgE dirigidos a epítopos IgE estables, es decir, resistentes a pepsina de naturaleza peptídica se combina con la adición de un inhibidor de IgE que permite evitar la detección de anticuerpos IgE dirigidos a epítopos similarmente estables pero irrelevantes clínicamente.

En pruebas de piel convencionales, el material antigénico, por ejemplo, un extracto alimenticio, se inyecta en la piel para medir la respuesta alérgica inmediata inducida por IgE. Esta respuesta está mediada por el entrecruzamiento de los anticuerpos IgE unidos al mastocito. Esto requiere el reconocimiento de al menos dos epítopos en una única molécula de alérgeno. En el extracto de polen digerido con proteasa los epítopos sacáridos son entidades de unión a IgE monovalentes libres. No actuarán, por tanto, como un agente entrecruzador pero bloquearán los anticuerpos IgE unidos al mastocito con especificidad carbohidrato. Cualquier reacción posible de la piel mediada por estos anticuerpos IgE se inhibirá por tanto si el extracto de polen digerido con proteasa se añade al material de la prueba de la piel.

Cuando se usa material antigénico digerido con pepsina solamente los alérgenos insensibles a pepsina serán capaces de inducir una reacción de la piel. Los materiales de la prueba de piel tratados con pepsina son, por lo tanto, reagentes adecuados para probar in vivo las respuestas de IgE a alérgenos estables, incluyendo alérgenos de alimentos estables, que se introducen en el cuerpo de un individuo vía la ruta oral.

Para que la invención descrita en el presente documento se pueda entender mejor, se ponen los siguientes ejemplos. Los ejemplos tienen sólo propósitos ilustrativos y no deben interpreten como limitantes en ningún sentido de esta invención. En particular, el experto en la materia entenderá que los resultados informados de aquí en lo sucesivo para alérgenos alimenticios pueden bien extrapolarse a cualquier otro material antigénico ingerido oralmente de naturaleza química similar o comparable.

Ejemplo 1 Reducción o prevención de la detección de resultados falsos positivos Una digestión con proteasa de extracto de polen

Los extractos de polen se digirieron con proteinasa K o pronasa por una incubación durante la noche a 50ºC. Para la digestión de 25 mg de proteínas de polen, se usaron aproximadamente 3 unidades de proteinasa K o pronasa respectivamente, siguiendo un procedimiento descrito en (6). Es esencial comprobar si la cadena principal del péptido de las proteínas (alergénicas) se ha digerido suficientemente para asegurar que virtualmente todos (>99,9%) los epítopos peptídicos se han destruido, es decir, se han partido o de otra manera se han hecho inactivos. Para este propósito los contenidos de tres alérgenos principales únicos, denominados alérgeno grupo 1 (Fig. 1A), alérgeno grupo 5 (Fig. 1B) y alérgeno grupo 11 (Fig. 1C), se midieron con inmunoensayos basados en anticuerpos IgE monoclonales. Las Figuras 1A, 1B y 1C ilustran el elevado grado de digestión de proteína de estos tres alérgenos principales en extracto de polen de hierba tratado con proteinasa K, como se determina en los RIA competitivos: cuando se usa extracto de polen de hierba digerido con proteinasa K como el agente competidor (``inhibidor'') las concentraciones de los principales alérgenos marcados radiactivamente purificados unidos a IgE permanecen virtualmente sin afectar, es decir, constantes a los niveles iniciales, incluso al aplicar las más elevadas concentraciones de inhibidor. Por otro lado, cuando se usa extracto de polen no digerido, los alérgenos naturales contenidos en él compiten con los alérgenos purificados marcados radiactivamente para unirse a los anticuerpos IgE alérgeno-específicos, lo que resulta en una inhibición dependiente de dosis y así en una disminución de alérgenos marcados radiactivamente unidos a IgE detectables. Estos resultados indican que en los tres casos al menos el 99% de la actividad original, es decir, de los epítopos peptídicos de unión a IgE originales de los alérgenos principales probados, se destruyeron. Como un segundo control de la digestión eficaz, se analizaron por SDS-PAGE conjuntamente con teñido con plata, extractos no digeridos y digeridos. Los extractos digeridos carecían virtualmente de todas las bandas de proteínas presentes originalmente en los extractos.

B Prueba de la existencia de anticuerpos IgE dirigidos a epítopos sacáridos

Se acopló extracto de polen de hierba digerido con proteasa a Sefarosa para aplicación en un RAST. La cantidad de extracto de polen de hierba digerido acoplado a sefarosa era equivalente a la cantidad no digerida (4mg peso seco en 100 mg Sefarosa) acoplada a la misma para una prueba rutinaria. La Fig. 2 ilustra que algunos sueros reconocieron extracto de polen digerido y no digerido, mientras que otros solo reconocieron extracto de polen no digerido. Esto era una primera indicación de que el primer grupo podía haber reconocido epítopos sacáridos. La Fig. 3 muestra que la unión a IgE se perdió después de tratamiento de periodato de extractos de alérgeno, indicando la implicación de determinantes azúcar. Lo que es más, los sueros que eran activos en la unión de IgE a extractos de polen digerido también reconocieron glicoproteínas purificadas no relacionadas en absoluto con las que tenían solamente un N- glicano similar en común (Fig. 4). El RAST a una muestra de extracto de polen digerido se inhibió completamente por dicha glicoproteína no relacionada (Fig. 5). Juntos, estos datos demuestran que un RAST positivo para extractos de polen digeridos por proteasa se explica por la unión de IgE a determinantes carbohidrato.

C Grado de reactividad cruzada

Sueros de pacientes con anticuerpos IgE carbohidrato-específicos mostraron tener un RAST positivo para un amplio espectro de alimentos vegetales (2). Por inhibición RAST estos anticuerpos IgE mostraron ser muy reactivos cruzados. Sin embargo, no todos los sueros con dicho amplio espectro de reactividad cruzada de IgE tienen anticuerpos anti-carbohidrato. En algunos casos los anticuerpos IgE mostraron estar implicados en la elevada reactividad cruzada de alérgeno profilina (1, 2, 9). Es muy difícil distinguir entre ambos tipos de suero según RASTs de alimentos habituales (Fig. 6). La reactividad con profilina se reconoce, sin embargo, que indica una elevada probabilidad de desarrollar alergia clínica a alimentos en muchos casos, en donde los sujetos con IgE anticarbohidrato carecen de síntomas de alergia relacionada con alimentos.

D Actividad biológica pobre de IgE contra epítopos sacáridos

Un grupo de pacientes alérgicos al polen de hierba (n=173) se discriminó en un RAST para anticuerpos IgE contra cacahuetes (3). Casi 1/3 (n=50) tuvo un RAST de cacahuete positivo claro. Ninguno de estos pacientes, sin embargo, desarrolló síntomas de alergia clínica relacionada con el cacahuete. Cuando se probaron los anticuerpos IgE contra estructuras carbohidrato, más del 90% fueron positivos, lo que sugiere que los anticuerpos con esta especificidad eran en gran medida responsables de los resultados de RAST de cacahuete falsos positivos. Esto se confirmó en un ensayo de inhibición RAST de cacahuete. El RAST de cacahuete se inhibió completamente por extracto de polen de hierba digerido. Este no fue el caso para el suero de los pacientes con una alergia a cacahuetes clínica. Estos datos implican que los anticuerpos IgE contra determinantes carbohidrato son inductores pobres, si llegan, de una liberación de moléculas mediadoras que inician una reacción alérgica y que se liberan desde células efectoras, principalmente células mastocitos y basófilas. Esto se confirmó tanto in vivo como in vitro.

Las pruebas de pinchazo de piel con extracto de cacahuete son negativas en sujetos no sintomáticos. La liberación de histamina de basófilos de individuos no sintomáticos puede inducirse pero solamente a concentraciones de extracto de cacahuete aproximadamente 1000 veces mayores que aquellas que se requieren para una estimulación correspondiente de basófilos de individuos sintomáticos. Este hallazgo confirma que los anticuerpos IgE carbohidrato-específicos tienen actividad biológica pobre y la detección de dichos anticuerpos no es indicativa de una probabilidad para desarrollar una alergia clínica a alimentos.

E Procedimiento mejorado

Como se señala, el procedimiento mejorado se dirige a evitar la detección de anticuerpos IgE carbohidrato-específicos en pruebas de diagnóstico para alergia a alimentos. Esto puede conseguirse por la adición de extracto de polen digerido por proteasa soluble. A una concentración de 50 \mug por prueba los RAST de cacahuete falsos positivos se inhibieron completamente, mientras que las pruebas positivas relevantes clínicamente permanecieron positivas (3). Este enfoque se probó también para otros alimentos vegetales. En la Fig. 7A se muestran dos ejemplos de la inhibición de un RAST falso positivo para alimentos vegetales. Como control, se probaron sueros tomados de pacientes que sufrían síntomas de alergia clínica usando los procedimientos RAST convencional y mejorado (Fig. 7B, Fig. 7C). Se observó que la exposición de estos sueros a extracto de polen de hierba digerido con proteasa según la presente invención no resultaron en una inhibición de los anticuerpos IgE lo que confirma la asunción de que en estos casos los anticuerpos IgE se dirigen a los epítopos peptídicos más relevantes clínicamente de los alérgenos alimenticios probados.

Era importante darse cuenta de que la reactividad de IgE con los alimentos vegetales no es necesariamente o completamente anti-carbohidrato o anti-péptido. Los sueros pueden contener y normalmente lo hacen poblaciones mezcladas de anticuerpos IgE con especificidades contra diferentes componentes antigénicos de alimentos vegetales. Esto significa que la inhibición de un RAST con extractos de polen digeridos por proteasa puede también ser parcial. El objetivo del procedimiento mejorado según la presente invención es reducir o prevenir totalmente la detección de anticuerpos IgE que se dirigen a epítopos sacáridos de moléculas antigénicas.

Ejemplo 2 Mejora de la exactitud y fiabilidad de los resultados positivos Una digestión con pepsina de extractos de alérgenos de alimentos

Como se menciona anteriormente la aparición clínica de alergia a ingredientes alimenticios, particularmente de alimentos vegetales, puede diferir muy considerablemente. Los pacientes alérgicos al polen de abedul con alergia a frutas como la manzana y el melocotón normalmente demuestran síntomas locales leves (SAO). La base para la coincidencia de la alergia por inhalación y la alergia a alimentos se encuentra en la presencia de alérgenos relacionados en el polen y la fruta (2). Los anticuerpos IgE de reacción cruzada dirigidos al alérgeno del polen de abedul Bet v 1 y al alérgeno del polen profilina reconocen homólogos en frutas. Pacientes con síntomas más graves por consumo de frutas como manzana y melocotón no tienen necesariamente alergia al polen (10). La alergia a las frutas en este caso es independiente de una sensibilización al polen.

Los alérgenos en fruta que producen formas más graves de alergia a alimentos son extremadamente resistentes a la digestión con pepsina. Los alérgenos de reacción cruzada típicos relacionados con el polen se digieren completamente en minutos. La estabilidad se probó usando muestras de extracto de melocotón, expuestas durante tiempos diferentes a pepsina, en un RAST con muestras de suero de un paciente alérgico leve a la fruta (reacción cruzada con polen) y uno grave (no reactivo con polen) (Fig. 8). El suero de estos pacientes se usó también en una inhibición RAST de melocotón con extracto de melocotón digerido con pepsina y no digerido. Después de 1 hora de digestión con pepsina, solo el RAST del paciente con síntomas más graves se inhibió (Fig. 9).

B Procedimiento mejorado

Para medir selectivamente anticuerpos IgE dirigidios a alérgenos insensibles a pepsina, se trataron extractos de alimentos con pepsina antes de la inmovilización en sefarosa. Este enfoque se probó con varios extractos de alérgenos de alimentos: manzana, melocotón, avellana, nuez, cacahuete y almendra. Además, el enfoque se probó también para extractos de alimentos de origen animal que se conocía que producían alergias graves a alimentos, particularmente para extractos obtenidos de animales invertebrados tales como gambas. Este enfoque era para probar diferentes tipos de pacientes con alergia leve a alimentos relacionada con polen y con alergia a alimentos ``real'' más grave y para descubrir si la digestión con pepsina resultaría en una detección selectiva de anticuerpos IgE en el último grupo (es decir, aquellos con síntomas de alergia más grave).

En las Figuras 10A a 10F se ilustra que el enfoque de hecho distingue entre ambos tipos de pacientes. Algunos sueros tienen un RAST positivo con extractos digeridos y no digeridos, otros solo con no digeridos. También probamos varios sueros obtenidos de pacientes con alergia conocida a las gambas (lo que es una importante representación de animales invertebrados que son parte de muchos platos y creaciones alimenticias) usando tanto extractos digeridos como no digeridos. Aquí no encontramos ninguna disminución significativa en la unión a IgE después del tratamiento con pepsina (Fig. 11). Esto confirma la estabilidad y la alergenicidad potencial de los alérgenos alimenticios que se da en gambas y probablemente en invertebrados relacionados del mismo tipo.

Referencias

1. van Ree. The oral allergy syndrome. In: Contact Urticaria syndrome. Eds. S. Amin, A. Latí, H. I. Maibach. CRC Press, Boca Raton. 1997; 289-299.

2. van Ree, R.C. Aalberse. Pollen vegetable food crossreactivity; serological and clinical relevance of crossreactive IgE. J. Clin. Immunoassay 1993; 16, 124-130.

3. van der Veen, R. van Ree, R. C. Aalberse, J. H. Akkerdaas, S.J. Koppelman, H. M. Cansen, J.S. van der Zee. Poor biologic activity of cross-reactive IgE directed to carbohidrate determinants of glicoproteins. J. Allergy clin. Immunol. 1997; 100: 327-334.

4. A. Jankiewicz, H. Aulepp, W. Baltes, K. W. Bögl, L.I. Dehne, T. Zuberbier, S. Vieths. Allergic sensitization to native and heated celery root in pollen-sensitive patients investigated by skin test and IgE binding. Int. Arch. Allergy Immunol. 1996; 111: 268-278.

5. J. D. Astwood, J. N. Leach, R. L. Fuchs. Stability of food allergens to digestion in vitro. Nature Biotechnol. 1996; 14: 1269-1273.

6. R. van Ree, D. Hoffman, W. van Dijk, V. Brodard, K. Mahieu, C. A. M. Koeleman, M. Grande, W. A. van Leeuwen, R. C. Aalberse, Lol p 11, a new major grass pollen allergen, is a member of a family of soybean trypsin inhibitor related proteins. J. Allergy Clin. Immunol. 1995; 95: 970-978.

7. K. R. Oldenburg, D. Loganathan, I. J. Goldstein, P.G. Schultz, M.A. Gallop. Peptide ligands for a sugar-binding protein isolated from a random peptide library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992; 89: 5393-5397.

8. S.L. Harris, L. Craig, J.S. Mehroke, M. Rashed, M.B. Zwick, K. Kenar, E.J. Toone, N. Greenspan, F.-I. Auzanneau, J.-R. Marino-Albernas, B.M. Pinto, J.K. Scott. Exploring the basis of peptide-carbohidrate crossreactivity: evidence for discrimination by peptides between closely related anti-carbohidrate antibodies. Proc. Natl. Aca. Sci. USA. 1997; 94: 2454-2459.

9. R. van Ree, V. Voitenko, W.A. van Leeuwen, R.C. Aalberse. Profilin is a cross-reactive allergen in pollen and vegetable foods. Int. Arch. Allergy Immunol. 1992; 98: 96-104.

10. M. Fernandez Rivas, R. van Ree, M. Cuevas. Allergy to Rosaceae fruits without related pollinosis. J. Allergy Clin. Immunol. 1998; in press.

11. B. Fahlbush et al (1998) Invest. Allergol. Clin. Immunol. 8, 325-332.

Claims

1. Un procedimiento para diagnósticos de alergia, particularmente para diagnósticos de alergia a alimentos, que comprende la reacción de uno o más anticuerpos IgE de un individuo con material antigénico para probarlo para potencial alergénico, y consecutivamente determinar la formación de complejos IgE/antígeno, caracterizados porque los anticuerpos IgE, preferiblemente una muestra de suero que contiene anticuerpos IgE, obtenidos de dicho individuo se exponen a

a) un inhibidor que se adhiere o une a y/o bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una especificidad para antígenos con epítopos sacáridos, en el que el inhibidor se elige del grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, extracto de alimento vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura que se da en un extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal, convirtiendo por ello anticuerpos IgE en sustancialmente incapaces de reaccionar con un epítopo sacárido de un antígeno de dicho material antigénico; y/o a

b) una porción digerida por proteasa de dicho material antigénico; y a

c) una porción no digerida de dicho material antigénico; con lo que la formación de complejos IgE/antígeno se detecta y se evalúa respecto a la determinación de complejos IgE/antígeno relevantes clínicamente en los que el anticuerpo IgE se une a un epítopo esencialmente peptídico de un antígeno que se da en dicha porción digerida por proteasa de dicho material antigénico y/o en dicha porción no digerida.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el material antigénico es un extracto alimenticio, un extracto de planta o un extracto de fruta, particularmente un extracto de alimento vegetal o animal.

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la digestión de proteína del material antigénico se lleva a cabo con al menos una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente con pepsina.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor es un extracto alimenticio vegetal o de polen digerido por proteinasa K o pronasa.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la detección de los complejos IgE/antígeno y/o de los antígenos no unidos se lleva a cabo por inmunoensayos tales como ELISA (ensayo de inmunoabsorbencia de unión a enzima) o RAST (prueba de absorbencia radio- alergo), o por procedimientos quimiluminiscentes.

6. Un kit de diagnóstico que comprende

a) una muestra de material antigénico natural, no digerido para probarlo para potencial alergénico; y

b) un inhibidor que se adhiere o se une a y/o bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una especificidad para antígenos con un epítopo sacárido y que convierten anticuerpos IgE en sustancialmente incapaces de reaccionar con epítopos sacáridos presentes en una porción digerida por proteasa y/o no digerida de dicho material antigénico, en el que el inhibidor se elige del grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, un extracto alimenticio vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura que la que se da en un extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal; y/o

c) una porción digerida por proteasa, preferiblemente digerida por pepsina, de dicho material antigénico, que permite una estimación de la gravedad esperada de la respuesta alérgica o una detección selectiva de los anticuerpos IgE en pacientes con síntomas de alergia más graves;

para uso en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Uso de una muestra de un material antigénico natural, no digerido para probarlo para potencial alérgico junto con una porción digerida por proteasa del mismo y/o junto con un inhibidor que se adhiere o se une a y/o bloquea el paratopo de los anticuerpos IgE que tienen una especificidad para antígenos con epítopos sacáridos, en el que el inhibidor se elige del grupo formado por extracto de polen digerido por proteasa, un extracto alimenticio vegetal digerido por proteasa, un péptido que imita la estructura o naturaleza antigénica de un glicano, y una molécula sintética que comprende un epítopo sacárido de esencialmente la misma composición y estructura que la que se da en un extracto de polen o en un extracto de alimento vegetal, para la elaboración de una composición para determinar una respuesta alérgica de un individuo a un material antigénico ingerible por vía oral o nasal para aplicarse en una prueba de piel.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el material antigénico digerido por proteasa se digiere por al menos una proteasa que se da en el estómago o tracto intestinal humano, preferiblemente por pepsina.