ES2198718T3 - Adn codificador de una sintasa de quitina de artropodo. - Google Patents
Adn codificador de una sintasa de quitina de artropodo.Info
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Abstract
Ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una parte de un enzima que cataliza la síntesis de la quitina en los artrópodos, en el que la parte es un fragmento biológicamente activo o inactivo que es esencial para la actividad del enzima.
Description
ADN codificador de una sintasa de quitina de
artropodo.
La presente invención se refiere a los ácidos
nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos codificadora
de por lo menos una parte de un enzima que cataliza la síntesis de
la quitina en los artrópodos, y a un método para desarrollar dichos
inhibidores.
La quitina es un homopolímero de carbohidrato de
N-acetilglucosamina \beta (1->4) ligada. La
quitina es un polisacárido estructural que ocurre principalmente en
la pared celular de algunos hongos y en el exoesqueleto de los
artrópodos.
La quitina se sintetiza por la acción de enzimas
especializados, llamados sintasas de quitina, que catalizan la
polimerización de los residuos de
\breakN-acetilglucosaminilo en quitina a partir de 5'-difosfo-N-acetilglucosamina de uridina.
Las sintasas de quitina pertenecen a un grupo de
enzimas que catalizan la síntesis de los polisacáridos estructurales
lineales y son llamadas colectivamente glicosiltransferasas
procesadoras. Las estructuras primarias de las glicosil transferasas
procesadoras conocidas (es decir, las sintasas fúngicas de quitina,
las sintasas de celulosa procariótica y eucariótica, las sintasas de
hialuronano procariótica y eucariótica, las sintasas de alginato
procarióticas y las sintasas rizobianas de
quito-oligosacárido) presentan algunas similitudes
de secuencia que sugieren que estos enzimas utilizadores de azúcar
UDP presentan un modo de acción similar. A pesar de las similitudes,
las diversas glucosil transferasas procesadoras presentan
diferencias sustanciales principalmente en sus especificidades de
sustrato, sus parámetros de activación y de inhibición, el tamaño y
la conformación de sus productos.
Dado que varias especies de artrópodos están
consideradas como plagas de plantas y animales, la inhibición de la
maquinaria de síntesis de la quitina ha sido contemplada en
particular como un objetivo atractivo para el desarrollo de un
agente de control de plagas.
Los inhibidores de la síntesis de la quitina en
insectos conocidos, ya sea naturales o sintéticos, entran dentro de
dos categorías principales: (a) inhibidores directos de la síntesis
de la quitina tales como antibióticos Streptomyces
Nikkomicinas y Polioxinas y (b) reguladores del crecimiento de
los insectos que interfieren indirecta pero drásticamente con la
síntesis de la quitina en insectos, tales como los derivados de
benzoilfenil-urea.
Aunque los estudios para la identificación de
estos compuestos tienen una historia de varias décadas, todavía no
se comprende adecuadamente la acción de los inhibidores de la
síntesis de la quitina. Esto se debe tanto a la disponibilidad
limitada de preparaciones apropiadas de enzimas de sintasa de
quitina en los insectos como a la falta de un buen conocimiento
molecular de la síntesis de la quitina y su regulación en los
insectos.
Por tanto, el problema técnico que subyace en la
presente invención es proporcionar nuevos inhibidores para la
síntesis de la quitina con el fin de prevenir los daños causados por
los artrópodos.
La solución al problema técnico planteado es
conseguida previendo las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, se proporciona un ácido nucleico
que comprende una secuencia de nucleótidos codificadora de por lo
menos una parte de un enzima que cataliza la síntesis de la
quitina en los artrópodos, en el que la parte es un fragmento
biológicamente activo o inactivo que resulta esencial para la
actividad del enzima.
Los términos ``ácido nucleico'' y ``secuencia de
nucleótidos'' se refieren a moléculas de ácido endógenamente
expresadas, semisintéticas, sintéticas o químicamente modificadas de
desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos. En una realización
preferida, de la presente invención, la secuencia de nucleótidos
incluye secuencias como se ha ilustrado en las figuras 1 (SEQ ID Nº.
1), 2 (SEQ ID Nº. 3) y 3 (SEQ ID Nº.5), derivados alélicos de dichas
secuencias y secuencias de ADN degeneradas como resultado del
código genético para dichas secuencias. También incluye secuencias
de ADN hibridadoras bajo condiciones estrictas con la secuencia de
nucleótidos definida más arriba. Aunque dichas secuencias alélicas,
degeneradoras e hibridadoras pueden tener divergencias estructurales
debidas a mutaciones (que ocurren naturalmente), tales como pequeñas
borraduras o sustituciones, usualmente todavía mostrarán
esencialmente las mismas propiedades útiles, permitiendo su uso
básicamente en las mismas aplicaciones.
En una realización preferida la presente
invención se refiere a una secuencia de ADN aislada que codifica una
parte de un enzima que cataliza la síntesis de la quitina en los
artrópodos. Realizaciones específicas incluyen secuencias de ADN
que se caracterizan por la habilidad para hibridar con la secuencia
de ADN representada en la figura 1 a, por ejemplo, 55^{o}C o
codificar una reacción de polipéptido con un anticuerpo contra el
polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos deducida en las
figuras 1 a 3. La invención se refiere también a una construcción
de expresión de ADN que contiene las secuencias de ADN aisladas y
que codifica un enzima que tiene la especificidad descrita más
arriba.
La presente invención se refiere también a
moléculas recombinantes que comprenden el ácido nucleico como se ha
descrito más arriba opcionalmente ligado a una secuencia de control
de expresión. Tales vectores pueden ser útiles en la producción de
por lo menos dicha parte de un enzima en células estables o
transformadas transitoriamente. Se puede usar varios sistemas de
animales, plantas, hongos y bacterias para la transformación y
proceso de cultivo subsiguiente. Con preferencia, los vectores de
expresión que se puede usar en la invención contienen secuencias
necesarias para la replicación en la célula huésped y son
replicables de forma autónoma. También es preferible usar vectores
que contienen genes marcadores seleccionables que se pueden
seleccionar fácilmente para células transformadas. La preparación
necesaria es bien conocida por los expertos en la materia.
Es otro objeto de la invención proporcionar una
célula huésped transformada por un plásmido de expresión de la
invención y capaz de producir al menos dicha parte de un enzima.
Ejemplos de células huésped apropiadas incluyen varias células
eucarióticas y procarióticas, tales como E. coli, células de
insectos, células de plantas, células de mamíferos, y hongos tales
como levadura.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un polipéptido que comprende al menos la parte arriba
definida de un enzima que cataliza la síntesis de la quitina en los
artrópodos. El término ``polipéptido'' incluye el enzima completo o
un fragmento biológicamente activo o inactivo del mismo codificado
por las secuencias descritas más arriba y que son esenciales para
los rasgos biológicos de dicho enzima. Las secuencias de aminoácidos
de polipéptidos especialmente preferidos contienen las secuencias
representadas en las figuras 1 (SEQ IN Nº. 2), 2 (SEQ ID Nº. 4) y 3
(SEQ ID Nº. 6).
Es otro aspecto de la invención proporcionar un
proceso para la producción del polipéptido antes mencionado. Tal
proceso comprende el cultivo de una célula huésped que se transforma
con una secuencia de ácido nucleico de la presente invención en un
medio de cultivo apropiado y purificando el polipéptido producido.
Así, este proceso permite la producción de suficiente cantidad del
polipéptido deseado para usar en aplicaciones descritas más abajo.
Se puede obtener la célula huésped a partir de bacterias tales como
E. coli, de hongos tales como levadura, de plantas tales como
tabaco, patata, o Arabidopsis, y de animales, en particular
células de vertebrados tales como células CHO.
La invención se refiere también a los métodos
para ensayar los efectos de varios compuestos en la expresión y la
actividad biológica de las sintasas de quitina de los artrópodos.
En estos métodos, el polipéptido en forma enzimáticamente activa,
preferiblemente el enzima sintasa de quitina de un artrópodo es
producido por técnicas de ADN recombinante en las que una secuencia
de ADN aislada que codifica el enzima se expresa a partir de la
construcción de expresión de ADN como se ha esbozado más arriba.
Las figuras muestran:
Las figuras 1 a 3 muestran secuencias de ADN (SEQ
ID Nºs. 1, 3 y 5) y las secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID
Nºs. 2, 4 y 6) de una parte de sintasa de quitina de Drosophila
melanogaster.
Las figuras 4 y 5 muestran múltiples
alineamientos de secuencias de proteínas de la parte de sintasa de
quitina de Drosophila melanogaster con las regiones
correspondientes de un nematodo, tres sintasas de quitina de
levadura y una sintasa de quito-oligosacárido
rizobiano. En particular, los múltiples alineamientos de secuencias
muestran la parte aislada de sintasa de quitina de Drosophila
melanogaster (Dmechs1 en la figura 4, y Dmechs2 en la figura 5)
con las correspondientes regiones de la sintasa de quitina de
nematodo (Celchs), la sintasa de quitina 1 (Scechs1), la sintasa de
quitina 2 (Scechs2) y sintasa de quitina 3 (Scechs3) de levadura y
la sintasa de quito-oligosacárido rizobiana
(RlenodC). Los puntos de encima del alineamiento indican similitud y
los asteriscos, identidad.
En lo que sigue se esbozan con más detalle
realizaciones preferidas de la presente invención.
Con el aislamiento de la primera sintasa de
quitina de insecto aquí descrita, la de Drosophila
melanogaster (mosca de la fruta), puede usarse metodología
recombinante para la expresión, purificación e identificación de
sintasas de quitina. Estos métodos empleados en ensayos para la
evaluación y caracterización de inhibidores de sintasa de quitina de
insectos pueden conducir al desarrollo de nuevos agentes potentes de
control de las plagas.
La presente invención fue posibilitada con
identificación de la secuencia de ADN mostrada en las figuras 1 a 3,
codificando una parte de sintasa de quitina de Drosophila
melanogaster.
Una búsqueda del banco de datos GENBANK usando la
secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia Drosohpila
melanogaster reveló similitudes significativas con una secuencia
de nematodos que codifica al parecer una sintasa de quitina, con
varias secuencias que codifican sintasas de quitina fúngica, y con
varias sintasas de quito-oligosacárido rizobiano.
Los múltiples alineamientos de secuencia de la sintasa de quitina de
Drosophila melanogaster con estas secuencias están
presentadas en las figuras
\hbox{4 y 5.}
A pesar de las similitudes de secuencia de la
sintasa de quitina de Drosohpila melanogaster con los enzimas
antes descritos, se pudo observar la hibridación del ADN de
Drosophila melanogaster ni en el nematodo ni en el ADN
genómico fúngico incluso en condiciones de baja limitación (0,75M
[Na^{+}], 55ºC).
Con el aislamiento del nuevo gen de sintasa de
quitina de insecto, el de D. melanogaster, se puede emplear
el uso de metodología recombinante en la producción, caracterización
e identificación de sintasas de quitina de artrópodos.
Con referencia a la secuencia de ADN citada a
continuación, se puede usar métodos de hibridación, inmunoquímicos o
amplificación de reacción de cadena polimerasa para el aislamiento
bien sea ANDc o ADN genómico de sintasa de quitina a partir de esta
especie. Se puede usar el mismo enfoque para la identificación y el
aislamiento de ADN que codifica las sintasas de quitina de otras
especies de artrópodos.
Las secuencias de ADN aisladas que entran en el
ámbito de esta invención pueden usarse para expresar las sintasas de
quitina codificadas en grandes cantidades en célula huésped bien sea
procariótica o eucariótica.
En otro aspecto, la invención se refiere a
métodos para desarrollar agentes de control de plagas. Se puede
producir sintasas de quitina de artrópodos por metodología de ADN
recombinante como se esboza más arriba y se usa en ensayos de
enzimas para la evaluación y caracterización de inhibidores de
sintasa de quitina específicos. Estas preparaciones pueden usarse
también en el tamizado para la identificación de nuevos inhibidores
de síntesis de la quitina.
Además, puede usarse construcciones de ADN de las
sintasas de quitina de artrópodos fundidas con genes informadores
(lacZ, GPF, luciferasa) para obtener insectos transgénicos o líneas
celulares transformadas como se ha esbozado más arriba. Estos
animales y líneas celulares pueden usarse en la evaluación del
efecto que tienen los reguladores de crecimiento de los insectos en
la biosíntesis de la quitina.
La presente invención será ilustrada
adicionalmente por los siguientes ejemplos.
Se inserta un fragmento de ADN conteniendo la
secuencia de ADN aislada y que codifica la sintasa de quitina de
insecto, en un vector de expresión conteniendo un promotor inducible
lac. Se usa la construcción para transformar células E. coli.
Se cultiva células en medio LB a fase semi-log y se
induce la expresión de la sintasa de quitina por la adición de 1 mM
IPTG.
Al cabo de 4 horas se recoge las células por
centrifugación y se lisan por sonicación. Se centrifuga el
homogenado a 2000 g. durante 30 minutos a 4ºC y se ultracentrifuga
el sobrenadante de la centrifugación a 100 000 g. durante una hora.
El pélet conteniendo la fracción de membrana fue resuspendido en un
tampón conteniendo 25 mM de Tris HCl pH 7,0 y 10 mM de cloruro de
magnesio. Esta preparación de membrana se usa posteriormente en
ensayos de inhibición de sintasa de quitina.
Se lleva a cabo los ensayos incubando una muestra
de la fracción de membrana con UDP-GlcNAc 5mM y se
prueba los compuestos en la inhibición de la síntesis de la
quitina. Se evalúa la actividad de sintasa de quitina por medición o
bien por incorporación de GlcNAc radiomarcado procedente de
UDP-GlcNAc en quitina o por la estimación
espectrofotométrica del UDP liberado por el método del ensayo de
reacciones enzimáticas acopladas. Se usa comparación de la actividad
medida con la obtenida bajo condiciones de control (no se añade
compuesto) para la evaluación de los compuestos como inhibidor de
sintasa de quitina.
Se fusiona un fragmento de ADN codificador del
promotor y una parte de las regiones codificadoras de la sintasa de
quitina de insecto con el gen informador lacZ. Se usa la
construcción de ADN conteniendo la fusión traslacional de sintasa de
quitina lacZ para la transformación de las células de insecto Kc.
Después de la selección y el aislamiento de los transformantes
estables se usa la línea celular transformada para la prueba o el
tamizado del compuesto que afecta a la activación transcripcional
del gen de sintasa de quitina. En estos ensayos se incuba la línea
celular con los compuestos durante 24 horas y se evalúa el efecto de
los compuestos midiendo y comparando la actividad
beta-galactosidasa con la del control.
Se usa 100 ng del fragmento de ADN, codificando
la secuencia presentada en la figura 2, para la incorporación de
nucleótidos radioactivos en ADN de doble cordón de acuerdo con la
metodología de ``traslación nick'' estándar. Las sondas de ADN
radiactivas, generadas por este método, se usan para la
identificación y el aislamiento de clones que codifican las sintasas
de quitina a partir de una biblioteca cósmida ADN genómica de D.
melanogaster. Se pone (empapa) sobre el ADN de los cósmidos
recombinantes sobre filtros de nitrocelulosa, desnaturalizado e
híbrida finamente con la sonda de ADN radiactiva. Se ejecuta la
hibridación en condiciones poco rigurosas (0,75N [Na^{+}], 55ºC).
Luego se lava y expone los filtros para
auto-radiografía.
Los cósmidos que hibridaron con la sonda (clones
positivos), se aíslan y después se caracterizan con análisis
enzimático de restricción y análisis de secuencia de ADN.
A partir del procedimiento descrito más arriba se
identifica un segundo gen (Dmechs2) codificador de la sintasa de
quitina en esta especie y se secuencia parcialmente. La secuencia de
ADN y la secuencia de aminoácidos deducida son presentadas en la
figura 3.
La figura 5 muestra el alineamiento de secuencias
de proteínas múltiples de la porción Dmechs2 con las
correspondientes regiones de un nematodo, tres sintasas de quitina
de levadura y una sintasa de quito-oligosacárido
rizobiano.
Claims (8)
1. Acido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica al menos una parte de un enzima que
cataliza la síntesis de la quitina en los artrópodos, en el que la
parte es un fragmento biológicamente activo o inactivo que es
esencial para la actividad del enzima.
2. Acido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos contiene la
secuencia de ADN como se muestra en SEQ ID Nºs. 1, 3 ó 5.
3. Molécula recombinante que comprende un ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
4. Molécula recombinante de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que dicha secuencia de ácido nucleico está
ligada funcionalmente a una secuencia de control de expresión.
5. Huésped que contiene el ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o la molécula recombinante de
acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.
6. Polipéptido que comprende al menos una parte
de un enzima que cataliza la síntesis de la quitina en los
artrópodos, en el que la citada parte es un fragmento
biológicamente activo o inactivo que es esencial para la actividad
del enzima.
7. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
6, en la que la parte contiene la secuencia de aminoácidos como se
muestra en SEQ ID Nºs. 2, 4 ó 6.
8. Método para desarrollar inhibidores de sintasa
de quitina, comprendiendo los pasos consistentes en:
- (a)
- producir un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 6 ó 7 usando tecnología de ADN recombinante, y
- (b)
- caracterizar inhibidores de sintasa de quitina específicos en ensayos enzimáticos.
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