ES2198727T3 - Tecnicas de diagnostico que utilizan el receptor soluble de proteina c/proteina c activada de celulas endoteliales. - Google Patents
Tecnicas de diagnostico que utilizan el receptor soluble de proteina c/proteina c activada de celulas endoteliales.Info
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Abstract
Se ha aislado plasma EPCR caracterizado y mostrado para bloquear la activación de proteina C celular y de actividad del anticoagulante APC. El plasma EPCR parece ser de aproximadamente 43.000 daltons y circula a aproximadamente 100 ng/ml (98,4 ñ 27,8 ng/ml, n = 22). El plasma EPCR unido a la proteína C activada, con una afinidad similar a la del EPCR soluble recombinante (Kdapp aproximadamente 30 nM), e inhibe tanto a la proteína C de activación sobre una línea de células endoteliales como a la actividad del anticoagulante APC, en un ensayo de coagulación de factor Xa de una etapa. El plasma soluble EPCR parece atenuar el aumento de EPCR unido a la membrana de activación de proteína C y la función anticoagulante de proteína C activada. El EPCR soluble se ha detectado también en orina. Los niveles de EPCR soluble pueden aumentar en enfermedad inflamatoria asociada con herida vascular, y parece estar relacionada con estados de inflamación y enfermedad asociados con coagulación anormal.
Description
Técnicas de diagnóstico que utilizan el receptor
soluble de proteína C/proteína C activada de células
endoteliales.
La presente invención está de manera general en
el área de los ensayos que implican la detección y/o medida del
receptor de proteína C/proteína C activada de células endoteliales
o formas solubles del mismo derivadas por proteolisis o por ayuste
alternativo.
La activación de la proteína C para dar su
proteasa de serina activa, proteína C activada (PCA), inicia una
serie de acontecimientos que juegan un papel fundamental en la
regulación de la coagulación sanguínea. La importancia clínica de
la ruta de la proteína C es puesta de manifiesto por la multitud de
disfunciones en esta ruta que tienen como resultado trombosis
(Esmon y Schwarz, 1995, Trends Cardiovasc. Med.
5:141-148; Reitsma y col., 1995, Thromb.
Haemost. 73:876-879). Los pacientes deficientes
en proteína C presentan normalmente complicaciones trombóticas en
la infancia que ponen en peligro su vida (Seligsohn y col., 1984,
N. Engl. J. Med. 310:559-562; Esmon, 1992,
Trends Cardiovasc. Med. 2:214-220) que son
corregidas mediante la administración de proteína C (Dreyfus y
col., 1991, N. Engl. J. Med.
325:1565-1568).
La proteína C y la PCA han sido también
implicadas en la regulación de la respuesta de un huésped a la
inflamación. La proteína C activada (PCA) puede prevenir los
efectos letales de E. coli en modelos de sepsis por gram
negativos en babuinos (Taylor y col., 1987, J. Clin. Invest.
79; Patente de EE.UU. Nº 5.009.889 para Taylor y Esmon) y
resultados clínicos preliminares sugieren que la proteína C es
eficaz para tratar ciertas formas de choque séptico humano (Gerson
y col., 1993, Pediatrics 91:418-422). La
inhibición de la proteína S, un componente importante de la ruta de
la proteína C, exacerba la respuesta de primates a niveles
subletales de E. Coli y aumenta la aparición de TNF en la
circulación (Taylor y col., 1991, Blood
78:357-363). Estos resultados sugieren que la
proteína C puede controlar la coagulación e influir sobre la
inflamación.
La proteína C es activada cuando la trombina, el
enzima terminal del sistema de coagulación, se une a una proteína
de la superficie de las células endoteliales, la trombomodulina
(Esmon, 1989, J. Biol. Chem. 264:4743-4746;
Dittman y Majerus, 1990, Blood 75:329-336;
Dittman, 1991, Trends Cardiovasc. Med.
1:331-336). En cultivo celular, la transcripción de
trombomodulina es bloqueada por la exposición de las células
endoteliales al factor de necrosis tumoral (TNF) (Conway y
Rosenberg, 1988, Mol. Cell. Biol.
8:5588-5592) y la actividad trombomodulina y el
antígeno son internalizados posteriormente y degradados (Lentz y
col., 1991, Blood 77:543-550; Moore y col.,
1989, Blood 73:159-165). La C4bBP, una
proteína reguladora del sistema del complemento, se une a la
proteína S para formar un complejo que es funcionalmente inactivo
para apoyar la actividad anticoagulante de la PCA in vitro
(Dahlbäck, 1986, J. Biol. Chem.
261:12022-12027) e in vivo (Taylor y col.,
1991). La C4bBP se comporta como un reactivo de fase aguda
(Dahlbäck, 1991, Thromb. Haemostas.
66:49-61). Por tanto, las proteínas de esta ruta
parece que no sólo regulan la inflamación, sino que también
interaccionan con componentes que regulan la inflamación, y ellas
mismas están sometidas a regulación a la baja por mediadores
inflamatorios.
Las células endoteliales juegan un papel crítico
en la ruta de la proteína C en cuanto a que expresan dos de los
receptores conocidos responsables de la activación eficaz de la
proteína C, la trombomodulina y el receptor endotelial de proteína
C/PCA (EPCR) (Fukudome y Esmon, 1994, J. Biol. Chem.
269:26486-26491; Stearns-Kurosawa y
col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
93:10212-10216). La trombomodulina (CD141) es un
cofactor transmembranal que se une a la trombina circulante con una
elevada afinidad y el complejo enzima-cofactor
resultante se requiere para obtener tasas de activación de
proteína C fisiológicamente relevantes (Esmon y Owen, 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 78:2249-2252;
Dittman, W.A., 1991, Trends Cardiovasc. Med.
1:331-336).
El EPCR es un receptor identificado recientemente
con homología significativa a la familia de CD1/MHC de clase 1
(Fukudome y Esmon, 1994; Fukudome y col., 1996, J. Biol.
Chem. 271:17491-17498; Regan y col., 1996, J.
Biol. Chem. 271:17499-17503). El clonaje y la
función biológica del receptor de la proteína C de células
endoteliales fueron descritos en la PCT/US95/09636 por Oklahoma
Medical Research Foundation, titulada ``Cloning and Regulation of
an Endothelial Cell Protein C/Activated Protein C Receptor''. Se
pronosticó que la proteína constaba de 238 aminoácidos, incluyendo
una secuencia señal de 15 aminoácidos en el extremo N y una región
transmembranal de 23 aminoácidos que caracteriza al receptor como
una proteína transmembranal de tipo 1.
El EPCR se une a la proteína C y a la PCA con una
afinidad similar (Kd_{ap}\sim30 nM) (Fukudome y col., 1996) en
presencia de calcio y facilita la activación de la proteína C
presentando el sustrato proteína C al complejo de activación
trombina-trombomodulina en la superficie celular
(Stearns-Kurosawa y col., 1996). Ambos receptores de
células endoteliales son proteínas transmembranales de tipo 1 en
las que el ligando se une a un dominio extracelular y ambos tienen
una cola citoplásmica intracelular corta (Fukudome y col., 1996;
Jackman y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
84:6425-6429; Wen y col., 1987, Biochemistry
26:4350-4357; Suzuki y col., 1987, EMBO J.
6:1891-1897). Además, su expresión en la superficie
celular in vitro es regulada a la baja de manera similar por
el factor de necrosis tumoral \alpha (Fukudome y Esmon, 1994).
Sin embargo, las características de las formas solubles de
trombomodulina y EPCR difieren en varios aspectos. La
trombomodulina soluble recombinante tiene una actividad como
cofactor reducida con relación a la forma de membrana (Galvin y
col., 1987, J. Biol. Chem. 262:2199-2205;
Parkinson y col., 1990, J. Biol. Chem.
265:12602-12610). Con ambos componentes purificados
y con células, los cambios del sustrato de la trombina inducidos
específicamente por la trombomodulina son el resultado de la
competición por un dominio de unión compartido en la trombina así
como de alteraciones conformacionales en la cavidad del sitio
activo (Ye y col., 1991, J. Biol. Chem.
266:23016-23021; Lu y col., 1989, J. Biol.
Chem. 264:12956-12962; Ye y col., 1992, J.
Biol. Chem. 267:11023-11028; Hofsteenge y col.,
1986, Biochem. J. 237:243-251; Mathews,
1994, Biochemistry 33:13547-13552; Esmon y
col., 1982, J. Biol. Chem. 257:7944-7947;
Sadler y col., 1993, Haemostasis
23:183-193). La trombomodulina soluble acelera
también la inactivación de la trombina por una variedad de
inhibidores (Bourin y Lindahl, 1993, Biochem. J.
289:313-330; Rezaie, 1995, J. Biol. Chem.
270:25336-25339). El plasma y la orina contienen
ambos trombomodulina detectable (Takano y col., 1990, Blood
76:2024-2029; Ishii y Majerus, 1985, J. Clin.
Invest. 76:2178-2181) y como el gen de la
trombomodulina no contiene intrones (Jackman y col., 1987), estas
formas solubles son debidas a proteolisis del dominio extracelular
en la superficie de la célula.
Los productos solubles de la degradación de la
trombomodulina en plasma son un marcador conocido del daño de
células epiteliales en una variedad de estados de enfermedad
(Takano y col., 1990; Tanaka y col., 1991, Clin. Chem.
37:269-272; Takahashi y col., 1991, Am. J.
Hematol. 38:174-177; Asakura y col., 1991,
Am. J. Hematol. 38:281-287; Wada y col.,
1992, Am. J. Hematol. 39:20-24; Takahashi y
col., 1992, Am. J. Hematol. 41:32-39; Ohdama
y col., 1994, Chest 106:666-671) y están
compuestos por una mezcla de fragmentos que se unen a trombina con
afinidades reducidas variables, así como por fragmentos que no se
unen (Takano y col., 1990).
En contraste, el EPCR soluble recombinante
(rsEPCR), truncado justo antes del dominio transmembranal, se une a
la proteína C y a la PCA con una afinidad similar a la observada
para el EPCR intacto expresado en la superficie celular (Fukudome y
col., 1996). La actividad anticoagulante de PCA es inhibida
eficazmente cuando se une al rsEPCR (Regan y col., 1996), debido
presumiblemente a que el rsEPCR y el factor Va comparten ambos
determinantes de unión en una hendidura reminiscente del exositio
de unión de aniones I en la trombina ocupados por trombomodulina
(Mather y col., 1996, EMBO J. 15:6822-6831).
Sin embargo, el rsEPCR no parece influir sobre la proteolisis por
PCA de sustratos sintéticos pequeños, ni sobre la inactivación de
la PCA por \alpha1-antitripsina o por un
inhibidor de la proteína C (Regan y col., 1996). A diferencia del
EPCR unido a la membrana que incrementa la activación de la
proteína C (Stearns-Kurosawa y col., 1996), el
rsEPCR tiene poco efecto sobre la activación de la proteína C por
el complejo trombina-trombomodulina soluble (Regan
y col., 1996), sugiriendo que cualquier forma soluble del EPCR
podría inhibir la activación de la proteína C compitiendo con el
EPCR asociado a la membrana por la proteína C.
Fukudome y Esmon (1995) J. Biol. Chem.
270:5571-5577 refieren el clonaje y la expresión
molecular de EPCR murino y bovino.
La inmunohistoquímica indica que el EPCR está
presente primariamente en la superficie de células endoteliales de
vasos grandes y está ausente o presente a bajos niveles en la
mayoría de las células endoteliales de los capilares.
Es por tanto un objeto de la presente invención
identificar utilizaciones terapéuticas y diagnósticas del EPCR
soluble que existe de forma natural.
Es un objeto adicional de la presente invención
caracterizar el EPCR soluble que existe de forma natural.
El EPCR plasmático ha sido aislado y
caracterizado y se ha demostrado que bloquea la activación de la
proteína C celular y la actividad anticoagulante de la PCA. El EPCR
plasmático parece tener 43.000 daltons aproximadamente y circula a
100 ng/ml aproximadamente (98,4 \pm 27,8 ng/ml, n = 22). El EPCR
plasmático fue purificado de plasma citratado humano utilizando
cromatografía de intercambio iónico, de inmunoafinidad y de
afinidad con proteína C. Experimentos de citometría de flujo
demostraron que el EPCR plasmático se unía a la proteína C activada
con una afinidad similar a la determinada previamente a partir de
EPCR truncado recombinante (Kd_{ap} 30 nM aproximadamente),
definido como EPCR que no incluye los dominios transmembranal y
citoplásmico. Además, el EPCR plasmático inhibía la activación de la
proteína C en una línea de células endoteliales y la actividad
anticoagulante de la PCA en un ensayo de coagulación con el factor
Xa de una etapa. Se ha detectado también EPCR soluble en orina
humana. El clonaje del gen que codifica EPCR demuestra que al menos
el EPCR humano puede ser ayustado de manera alternativa,
produciendo un EPCR soluble truncado que incluye un inserto
exclusivo de la forma ayustada alternativamente (sEPCR). Estos
resultados indican que el EPCR plasmático puede provenir de
proteolisis en la superficie celular o de ayuste alternativo.
Si las concentraciones locales de EPCR plasmático
son suficientemente elevadas, particularmente en estados de
enfermedad, el dato indica que el EPCR plasmático soluble truncado
podría atenuar el aumento de activación de la proteína C por el
EPCR unido a la membrana y la función anticoagulante de la proteína
C activada. Según queda demostrado por los ejemplos que comparan
EPCR plasmático normal con los niveles de EPCR de pacientes con una
enfermedad autoinmune (lupus eritematoso sistémico, LES) y sepsis
(un trastorno que implica inflamación y anormalidades de la
coagulación), los niveles de EPCR soluble parecen correlacionarse
con la inflamación y con los estados de enfermedad asociados con la
coagulación anormal. Se describen ensayos basados en la medida de
EPCR soluble que son indicativos de condiciones de enfermedad que
implican a la coagulación, inflamación y enfermedad de los vasos
grandes. Se describen reactivos de ensayo, incluyendo EPCR soluble
aislado y purificado, EPCR soluble truncado recombinante y
anticuerpos hacia los EPCRs solubles.
La Figura 1 es una representación esquemática de
los dos mecanismos conocidos para la producción de un receptor
soluble aplicados al EPCR, por proteolisis del receptor unido a la
membrana para liberar un dominio extracelular y dejar el anclaje a
la membrana, y por ayuste alternativo del ARNm, mostrando las
secuencias exclusivas del EPCR unido a la membrana (mEPCR) y del
EPCR plasmático sometido a proteolisis (pEPCR), y la secuencia
exclusiva del EPCR soluble (sEPCR).
La Figura 2 es una representación esquemática que
compara mEPCR y sEPCR, mostrando el inserto de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos codificada exclusiva del sEPCR.
La Figura 3 muestra la secuencia insertada en el
EPCR humano, bovino, murino y de babuino por el ayuste
alternativo.
La Figura 4a es una gráfica que muestra que el
EPCR plasmático soluble se une a la proteína C y a la PCA humanas.
Células EA.hy926 fueron incubadas con fl-PCA 60 nM
en presencia de rsEPCR 0 - 500 nM (\medbullet) o de EPCR
plasmático (\medcirc) durante 30 minutos sobre hielo. Las células
fueron lavadas y se determinó la fluorescencia unida a las células
mediante citometría de flujo según está descrito. La fluorescencia
intrínseca de las células en ausencia de fl-PCA
añadida está indicada por la flecha. La fluorescencia celular media
(FCM) representada gráficamente representa la media de
determinaciones duplicadas de FCM.
Las Figuras 4b y 4c son gráficas que muestran que
el EPCR plasmático soluble y el rsEPCR inhiben la activación de la
proteína C en la superficie celular. En la Figura 4b, monocapas de
células EA.hy926 fueron preincubadas durante 15 minutos a
temperatura ambiente con proteína C 0,1 \muM sola (\Box) o con
rsEPCR 1 \muM (\medbullet), o con 2 \mug/ml del mAb 1494
(\medcirc). La activación de la proteína C fue iniciada por la
adición de trombina (2 nM final) y las reacciones fueron paradas a
los tiempos indicados. La proteína C activada fue determinada con
un ensayo amidolítico y se representan gráficamente para cada punto
de tiempo las tasas de actividad en mDO/minuto. Se incluyeron
pocillos control sin trombina añadida (\blacksquare). Cada punto
de datos representa la media de las determinaciones de pocillos
triplicados. En la Figura 4c, monocapas de células EA.hy926 fueron
preincubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con proteína
C 0,1 \muM y las concentraciones indicadas de EPCR plasmático
(\medcirc) o rsEPCR (\medbullet). Se añadió trombina (2 nM
final) y la activación procedió durante 60 minutos a temperatura
ambiente. Los sobrenadantes fueron añadidos a una mezcla de
antitrombina y heparina y se determinó la actividad de proteína C
activada (mDO/minuto) con un ensayo amidolítico. Cada punto de
datos representa la media de las determinaciones de pocillos
triplicados.
La Figura 4d es una gráfica que muestra que el
EPCR plasmático soluble inhibe la actividad anticoagulante de la
PCA. La actividad anticoagulante de la PCA (25 nM) fue determinada
con un ensayo de coagulación con Xa de una etapa en presencia de
EPCR plasmático o rsEPCR 460 nM. El efecto fue revertido cuando se
preincubó EPCR soluble durante 5 minutos con 42 \mug/ml del mAb
1496 que bloquea la unión de PCA a EPCR. Los datos representan la
media de 4-6 determinaciones \pm D.E.
La Figura 5 es una gráfica que compara los
niveles de TM plasmática soluble con los de EPCR plasmático soluble
en pacientes con lupus, demostrando que no existe correlación
entre los valores de TM y EPCR, pero que la mayoría de los
pacientes con lupus presentan niveles extremadamente elevados de
EPCR plasmático soluble.
La Figura 6 es una gráfica de la concentración
(ng/ml) del receptor soluble para sTM (normal), sTM (sepsis), sEPCR
(normal) y sEPCR (sepsis). No hay correlación en sTM y sEPCR,
r^{2} = 0,034.
Receptor Endotelial de Proteína C, EPCR.
Soluble, en solución y no unido a la superficie
celular.
Truncado, sin incluir el dominio transmembranal
ni el dominio citoplásmico; puede ser el resultado de proteolisis
o de ayuste alternativo.
Investigaciones previas sobre la función del EPCR
encontraron que la unión de proteína C a la forma de EPCR unido a
la membrana tenía como resultado la facilitación de la activación
de la proteína C por el complejo
trombina-trombomodulina en la superficie celular
(Stearns-Kurusawa y col., 1996), pero que el EPCR
recombinante soluble inhibía la actividad anticoagulante de la PCA
(Regan y col., 1996). Estas observaciones, junto con el conocimiento
de que los productos de la degradación de trombomodulina soluble en
plasma son un marcador de daño endotelial en varios estados de
enfermedad, condujeron a cuestionarse si existía(n)
una(s) forma(s) circulante(s)
soluble(s) del EPCR y, si era así, qué papel
podría(n) tener en la ruta de la proteína C.
Los ejemplos demuestran que una forma soluble del
EPCR circula en el plasma y está presente en la orina. En una
población de donantes sanos, el nivel de EPCR plasmático era de 100
ng/ml aproximadamente y parecía ser una especie antigénica única de
43.000 daltons aproximadamente. La purificación posterior del EPCR
soluble del plasma y estudios funcionales determinaron que era
capaz de unirse a la proteína C y a la PCA con una afinidad similar
a la del EPCR unido a la membrana intacto. Los estudios in
vitro utilizando una línea celular endotelial demostraron que
el EPCR plasmático inhibía la activación de la proteína C a
concentraciones casi fisiológicas de proteína C y trombina. Además,
la adición directa de EPCR plasmático purificado a plasma tuvo como
resultado la inhibición de la actividad anticoagulante de la PCA
que fue revertida con anticuerpos monoclonales hacia el rsEPCR.
La identificación de la proteína plasmática
purificada como EPCR se basó en la comparación con las propiedades
del rsEPCR. Estas proteínas reaccionaban ambas con la misma batería
de anticuerpos monoclonales y policlonales, tenían la misma
secuencia aminoterminal, se unían a proteína C inmovilizada de una
manera dependiente de Ca^{2+}, y bloqueaban la activación de la
proteína C y la actividad anticoagulante de la PCA con curvas
dosis-respuesta similares. Además, las afinidades
de la proteína C y de la PCA por rsEPCR y por el EPCR plasmático
son similares a la afinidad del EPCR intacto unido a la membrana.
Estas propiedades parecen ser exclusivas del EPCR.
Estudios previos demostraron que el EPCR unido a
la membrana expresado en células endoteliales aumenta la
activación de la proteína C en un factor de entre tres y cinco
veces, mientras que los ejemplos demuestran que la forma soluble de
EPCR purificada de plasma inhibe la activación de la proteína C en
células endoteliales y la actividad anticoagulante de la PCA. Esto
pronostica que el EPCR podría modular la ruta de la proteína C de
varias maneras. En primer lugar, en los vasos más grandes en los
que la concentración de trombomodulina es baja respecto a la
microcirculación, la expresión de EPCR está incrementada
proporcionalmente (Laszik y col., Circulation, 1997). La
inmunohistoquímica muestra que en la mayoría de los órganos, la
expresión del EPCR es muy intensa en los vasos grandes y disminuye
progresivamente al disminuir el tamaño de los vasos, con poca o
ninguna expresión en el tipo de células endoteliales más abundante,
el endotelio de los capilares. La expresión del EPCR puede jugar un
papel crítico en la captura del sustrato proteína C de la
circulación y en la presentación del mismo al complejo
trombina-trombomodulina para su activación. Esto
está apoyado por observaciones in vitro de que la línea
celular endotelial EA.hy926 y las células endoteliales de la vena
umbilical humana tienen ambas al menos seis veces más antígeno EPCR
expresado en la superficie que trombomodulina. En la
microcirculación en la que la concentración de trombomodulina es
elevada y la de EPCR es baja, se podría pronosticar una baja
influencia sobre la activación de la proteína C. Finalmente, el
EPCR soluble circulante podría reducir la producción de PCA y la
capacidad de la PCA para inactivar el Factor Va.
En un individuo sano, los niveles de EPCR soluble
son de 2,5 nM aproximadamente, una concentración muy por debajo de
la Kd_{ap} (30 nM aproximadamente) y de la concentración de
proteína C (80 nM) en la circulación. Los dos efectos del EPCR
plasmático soluble (inhibición de la actividad anticoagulante de la
PCA y de la activación de la proteína C) requerían concentraciones
considerablemente más elevadas que las que están presentes en el
plasma normal, dejando poco clara la cuestión del papel fisiológico
del EPCR plasmático. Se han identificado pacientes con niveles de
EPCR soluble que superan los 40 nM, según se describe en el
Ejemplo 3 (lupus). Por tanto, si la concentración local cerca de la
superficie de las células endoteliales supera a la concentración
sistémica, la concentración de EPCR soluble alcanzaría niveles que
atenuarían la generación y la actividad de la PCA, contribuyendo al
riesgo trombótico.
Puede producirse una forma soluble de un receptor
mediante el corte proteolítico del receptor unido a la membrana o
mediante mecanismos de ayuste alternativo. La proteolisis en la
superficie de la membrana libera trombomodulina soluble y
receptores de TNF, IL-1, IL-2,
M-CSF, PDGF y NGF (Heaney y col., 1996,
Blood 87:847-857). Los receptores solubles
tienen una multitud de funciones potenciales, incluyendo su
actuación como antagonistas del receptor de membrana, la
estabilización del ligando, el inicio de la producción de señales
mediadas por el ligando, la modulación a la baja de la forma de
membrana y la unión a inhibidores del receptor para facilitar
indirectamente la actividad receptor-ligando. Este
último mecanismo es utilizado por el sistema de receptores de la
IL-1 en el que las isoformas solubles de ambos
receptores de IL-1 se generan por corte
proteolítico y regulan estrechamente la sensibilidad a
IL-1\alpha y a IL-1\beta (Arend
y col., 1994, J. Immunol. 153:4766-4774). La
estructura genómica del EPCR contiene un sitio de ayuste
alternativo que codificaría una proteína soluble truncada justo
antes del dominio transmembranal (Fukudome y Esmon, 1995, J.
Biol. Chem. 270:5571-5577), según se discute más
adelante. Los receptores solubles de IL-6 parecen
generarse por mecanismos proteolíticos y de ayuste alternativo
(Mullberg y col., 1994, J. Immunol.
152:4958-4968; Lust y col., 1992, Cytokine
4:96-100; Horiuchi y col., 1994, Eur. J.
Immunol. 24:1945-1948). Este sitio de corte
puede ser también útil para recuperar grandes cantidades de EPCR
soluble mediante la construcción de un vector de expresión que
codifique el EPCR truncado seguido inmediatamente por una secuencia
peptídica hacia la cual está dirigido específicamente un
anticuerpo, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº
5.298.599 para Morrissey y Esmon, cuyas descripciones se incorporan
a la presente. El epítopo será cortado posteriormente por
proteolisis, antes o después de la administración a un paciente.
Ver también la Patente de EE.UU. Nº 4.782.137 para Hopp y col.
Estudios inmunohistoquímicos han indicado que el
EPCR está situado primariamente en el endotelio de los vasos
grandes y es apenas detectable en los capilares. El EPCR plasmático
derivado del EPCR unido a la membrana puede servir, por tanto, como
un marcador de procesos de enfermedad de los vasos grandes. El EPCR
plasmático puede servir como una comparación útil con los niveles
de trombomodulina plasmática que se ha demostrado que están
modulados en una variedad de estados de enfermedad, pero que
reflejarían procesos de enfermedad de los vasos grandes y pequeños,
pero que estarían dominados probablemente por contribuciones de
los vasos pequeños, ya que la mayoría del endotelio es
microvascular.
Se ha pronosticado que el ADNc del EPCR codifica
una proteína de 238 aminoácidos (Secuencia ID Nº 2), que incluye
una secuencia señal de 15 aminoácidos (von Heijne, 1986, Nucleic
Acids Res. 14:4683-4690) en el extremo
N-terminal. Por tanto, se pronostica que la
proteína madura contiene 223 aminoácidos. La secuenciación directa
de la proteína recombinante mostró que la proteína madura comenzaba
en Ser18. La Secuencia ID Nº 2 es la secuencia de aminoácidos
pronosticada del EPCR. Los aminoácidos 1-15 de la
Secuencia ID Nº 2 (MLTTLLPILLLSGWA) son la supuesta secuencia señal
determinada por el método de von Heijne (von Heijne, 1986). Los
aminoácidos 211-236 de la Secuencia ID Nº 2
(LVLGVLVGGFIIAGVAVGIFLCTGGR) constituyen el supuesto dominio
transmembranal. Están presentes sitios potenciales de
N-glicosilación en los aminoácidos
47-49, 64-66,
136-138 y 172-174 de la Secuencia
ID Nº 2. Están presentes residuos de cisteína extracelulares en los
aminoácidos 17 (eliminado en el EPCR plasmático), 114, 118 y 186 de
la Secuencia ID Nº 2. Se identificó una región transmembranal
potencial (Engelman y col., 1986, Annu. Rev. Biophys. Chem.
15:321-53) que constaba de 23 aminoácidos en el
extremo C-terminal (comenzando en el aminoácido 211
de la Secuencia ID Nº 2).
La proteína es una proteína transmembranal de
tipo 1. El dominio extracelular contiene cuatro sitios potenciales
de N-glicosilación y tres residuos de Cys. La
glicosilación no es esencial para la actividad, según se demostró
por la digestión con N-glicanasa. La región
citoplásmica contiene solamente tres aminoácidos y termina con una
Cys, que está palmitoilada. Si la cisteína terminal no está
palmitoilada apropiadamente, la proteína puede ser secretada. La
alteración de la secuencia del EPCR con el fin de sustituir esta
cisteína por otro aminoácido proporciona de este modo un medio para
producir un EPCR esencialmente de longitud completa, que es
secretado en lugar de estar unido a la membrana.
Según se utilizan en la presente, las secuencias
de nucleótidos que codifican el receptor incluyen la secuencia
mostrada en la Secuencia ID Nº 1, y secuencias que tienen
sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras de la misma que
hibridan con la Secuencia ID Nº 1 bajo condiciones rigurosas. Según
se utilizan en la presente, las secuencias de aminoácidos que
constituyen el receptor incluyen la secuencia mostrada en la
Secuencia ID Nº 2 y secuencias que tienen sustituciones, adiciones
o deleciones conservadoras de la misma que forman un receptor que
tiene una actividad biológica funcionalmente equivalente. Es bien
conocido por los expertos en la técnica lo que constituyen las
sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras, y que pueden
ser determinadas fácilmente como codificadoras, o formadoras, de
una molécula de receptor funcionalmente equivalente utilizando los
ensayos funcionales descritos en la presente. Esto está ilustrado
adicionalmente por referencia a la Figura 3, discutida más
adelante.
Los receptores son visualizados muy a menudo como
proteínas ancladas en una membrana celular con la porción expuesta
al exterior de una célula responsable de la unión a un ligando
específico para generar una respuesta fisiológica. En muchos casos
existe una forma soluble del receptor que es frecuentemente
bastante capaz de unirse a su ligando, a pesar del hecho de que ya
no está restringido a una célula. La unión del ligando a la
isoforma soluble del receptor puede generar también una respuesta
que toma muchas formas, incluyendo la modulación al alza o a la
baja de las interacciones del receptor unido a la membrana, o la
propagación de una respuesta mediante el transporte del ligando a
una célula que normalmente no es sensible (Heaney, ML y DW Golde,
Soluble cytokine receptors, Blood 87:847-857,
1996).
Existen dos mecanismos conocidos para producir un
receptor soluble: mediante proteolisis del receptor unido a la
membrana para liberar un dominio extracelular y dejar el anclaje a
la membrana, y mediante ayuste alternativo del ARNm (Figura 1).
Este último mecanismo puede tomar varias formas, pero la más
sencilla es cuando el marco de lectura continúa a través de un
límite exón-intrón y termina con un codon de parada
antes de alcanzar la secuencia que codifica el anclaje
transmembranal. Esto crea una proteína que es similar a la forma de
membrana pero con diferencias importantes. Es producida, y
secretada, como una proteína soluble y tendrá una cola
carboxilo-terminal exclusiva. Esta cola es formada
por la lectura de una porción de la secuencia de ARNm del intrón
que es ignorada en la formación del receptor unido a la membrana.
La producción de un receptor soluble mediante ayuste alternativo
puede ser también modulada independientemente del receptor unido a
la membrana, a pesar del hecho de que ambos se originan del mismo
molde de ARNm (Heaney y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
92:2365-2369, 1995).
Para demostrar que se ha generado un receptor
soluble por mecanismos de ayuste alternativo, se debe conocer la
secuencia genómica y los límites intrón-exón de la
región relevante. Es también de ayuda relacionar el receptor
soluble con una respuesta fisiológica con el fin de distinguirlo de
un ayuste aberrante del ARNm, encontrado bastante frecuentemente
durante la expresión de los genes de la proteína C y de la proteína
S (Berg y col., Blood Coag Fibrinol.
7:625-631, 1996).
Los detalles de los estudios y resultados
siguientes están descritos en los ejemplos. El plasma humano
contiene 100 ng/ml aproximadamente de EPCR soluble (Tabla 1). Éste
fue medido mediante un inmunoensayo con enzima unido (ELISA)
utilizando dos anticuerpos monoclonales (el mAb 1494 y el mAb 1495)
y técnicas estándar. Se encontraron niveles de EPCR soluble
significativamente elevados en pacientes con lupus eritematoso
sistémico y sepsis. Estos niveles parecían bastante elevados para
un receptor unido a la membrana que está presente, con unas cuantas
excepciones, solamente en la superficie de los vasos sanguíneos
grandes. Para ver esto en perspectiva, la trombomodulina (TM) se
expresa en todo el endotelio, así como en algunas células no
vasculares, aunque los niveles normales de TM soluble son solamente
de 10-40 ng/ml (Takano y col., Blood 76,
2024-2029, 1990). Los niveles de TM soluble estaban
elevados en los pacientes con lupus, pero no con sepsis.
Significativamente, no había correlación entre los niveles
plasmáticos de EPCR y TM en estos grupos de pacientes (r^{2} =
0,028 y 0,034, respectivamente).
| EPCR plasmático | TM plasmática | |
| ng/ml | ng/ml | |
| Voluntarios normales, | 133,4 \pm 53,4 | 35,5 \pm 20,4 |
| n = 20 | ||
| Lupus eritematoso | 262,1 \pm 154,5* | 104,7 \pm 77,5* |
| sistémico, n = 40 | (P = 0,0004) | (P = 0,0008) |
| Sepsis, n = 24 | 224,9 \pm 74,5* | 39,9 \pm 73,1 |
| (P = 0,00009) | ||
| *Diferencia significativa entre las medias con relación a los normales; test t de Student no pareado. |
La estructura genómica de la TM no contiene
intrones (Jackman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
84:6425-6429, 1987), por lo que la única manera de
crear una isoforma soluble de la TM es mediante proteolisis del
receptor unido a la membrana. Se ha demostrado in vitro la
proteolisis de la TM endotelial por la elastasa de neutrófilos y
por la catepsina G, sugiriendo que los niveles elevados de TM
soluble encontrados en una variedad de estados de enfermedad son el
resultado de la proteolisis mediada por los productos de las
células inflamatorias activadas en la superficie endotelial (Boehme
y col., Immunology 87:134-140, 1996 y Abe y
col., J. Lab. Clin. Med. 123:874-881,
1994).
La falta de correlación entre los niveles
plasmáticos de EPCR y TM y la elevada concentración de EPCR
plasmático, es consistente con el concepto de que el EPCR
plasmático se origina a partir de mecanismos proteolíticos y de
ayuste alternativo. La estructura genómica del EPCR humano contiene
cuatro exones, separados por intrones. La revisión de esta
secuencia revela una secuencia de lectura en marco después del
límite exón III - intrón III (en GT 5') que incluye un codon de
parada TAA en la posición 7527. Como este codon de parada está
corriente arriba del exón IV que codifica el dominio
transmembranal, la proteína pronosticada contendría una cola
exclusiva carboxilo-terminal de 48 residuos
(codificada por la secuencia del intrón) y no contendría un anclaje
transmembranal.
La Figura 1 es un diagrama de dos maneras
potenciales de las que puede derivar el EPCR truncado: por
proteolisis inmediatamente antes del dominio transmembranal o por
ayuste alternativo. Según está mostrado por la Figura 2, el ayuste
alternativo tiene como resultado la inclusión de una secuencia
peptídica en el EPCR truncado ayustado alternativamente. Según está
mostrado por la Figura 3, esta secuencia está altamente conservada
entre las especies, aunque existen ligeras diferencias, teniendo
como resultado una nueva cola carboxilo-terminal de
48 residuos para el EPCR humano y bovino, de 51 residuos para el
EPCR murino y de 22 residuos para el EPCR de babuino.
Muestras de pacientes pueden ser sometidas a
selección por la presencia de, y por la cantidad de, sEPCR o EPCR,
utilizando anticuerpos hacia EPCR, el único inserto presente en el
inserto de EPCR ayustado alternativamente, o bien utilizando
anticuerpos que se unan con mayor afinidad a EPCR o a sEPCR debido
a diferencias conformacionales. Las muestras pueden ser también
sometidas a selección utilizando otras técnicas estándar para
cuantificar específicamente las proteínas que estén presentes.
Pueden generarse anticuerpos hacia el EPCR y, en
particular, hacia el EPCR soluble (``sEPCR''), y hacia el EPCR
soluble recombinante (``rsEPCR'') que sean útiles para la
detección, caracterización o aislamiento de las proteínas
receptoras, así como para modificar la actividad de las proteínas
receptoras a través de, en la mayoría de los casos, la inhibición
de la unión del ligando. Los anticuerpos son producidos mediante
técnicas estándar utilizando como inmunógeno proteínas receptoras
humanas o animales purificadas o recombinantes, o fragmentos de las
mismas.
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales hacia EPCR
según está descrito para otras proteínas por Esmon y col., 1993,
Methods Enzymol. 222, 359-385. Los
anticuerpos referidos como mAbs 1494, 1495 y 1496 son anticuerpos
IgG1\kappa que se unen al EPCR soluble recombinante y al EPCR
expresado en la superficie celular. Los mAbs 1494 y 1496 bloquean
la unión de la proteína C y de la PCA al EPCR, e inhiben la
capacidad del EPCR celular para facilitar la activación de la
proteína C por el complejo trombina-trombomodulina.
El mAb 1495 no bloquea la unión del ligando al EPCR, no altera la
activación de la proteína C en la superficie celular y tiene un
epítopo de unión distinto del de los mAbs 1494 ó 1496. Los
anticuerpos pueden ser marcados utilizando técnicas estándar tales
como radiomarcaje, marcaje enzimático, marcas fluorescentes tales
como fluoresceína, partículas de oro, colorantes y otros medios
para la detección de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede
ser biotinilados con el éster biotinamidocaproato
N-hidroxisuccinimida utilizando procedimientos
estándar. El anticuerpo puede ser inmovilizado en un soporte sólido
para ser utilizado en inmunoensayos, por ejemplo en
AffiGel-10™, nitrocelulosa o en pocillos de
microvaloración, o puede ser utilizado en inmunoensayos en fase de
solución.
En una realización preferida, el EPCR es medido
utilizando placas de microvaloración (Maxisorp™, NUNC NS, Roskilde,
Dinamarca) revestidas con 50 microlitros de 4 microgramos/ml del
mAb 1495 en Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,6, a
4ºC durante una noche. A temperatura ambiente, las placas son
lavadas posteriormente tres veces con Tris-HCl 20
mM, NaCl 0,1 M, Tween 20 0,05%, pH 7,5 (tampón de ensayo) y
bloqueadas con tampón de ensayo conteniendo un 0,1% (peso/volumen)
de gelatina durante al menos una hora. Los pocillos son lavados
posteriormente, se añaden muestras de 50 microlitros en pocillos
triplicados y se incuban las placas durante una hora. Los pocillos
son aspirados, lavados tres veces con tampón de ensayo y se añaden
50 microlitros de biotina-mAb 1494 2
microgramos/ml. Las placas son incubadas durante 1 hora, lavadas
tres veces y se añaden 50 microlitros del conjugado
estreptavidina-fosfatasa alcalina 0,25
microgramos/ml (GIBCO BRL) y se incuban durante una hora adicional.
Los pocillos son lavados cinco veces y se añaden secuencialmente a
intervalos de 15 minutos el sustrato y los reactivos amplificadores
de un kit de amplificación mediante ELISA (GIBCO BRL) de acuerdo
con las direcciones del fabricante. El desarrollo de color es
parado con H_{2}SO_{4} 0,3 M y se lee la absorbancia de punto
final a 490 nm en un lector de microplacas Vmax. Los estándares en
pocillos triplicados son desde 1,5 a 100 ng de rsEPCR/ml en
Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M y EDTA 1 mM, gelatina
0,1%, pH 7,5. La curva estándar es lineal desde 1,5 a 12,5 ng/ml, y
las muestras son diluidas con el mismo tampón con el fin de que
entren dentro del rango lineal. Los estudios muestran que entre un
uno y un dos por ciento de plasma no afecta a la linealidad del
ensayo ni a la sensibilidad de la curva estándar. Muestras de
plasma de voluntarios sanos fueron diluidas con tampón de ensayo
que contenía EDTA 1 mM hasta un contenido final de plasma del 2%,
y se calcularon los niveles del antígeno EPCR a partir de la media
de pocillos triplicados por referencia a la curva estándar
determinada en la misma placa.
El ensayo para determinar EPCR soluble es útil en
la detección y en el análisis de estados y enfermedades de la
coagulación e inflamatorias según se discute en la presente, tales
como enfermedades autoinmunes como el lupus, en la monitorización
de trasplantes, sepsis, choque, pre-eclampsia,
diabetes, ``bypass'' cardiopulmonar, angina inestable, restenosis,
angioplastia (esto es, enfermedad vascular), enfermedad renal o
hepática. Por ejemplo, el EPCR es un marcador de los vasos
sanguíneos grandes y, por tanto, de daño en los vasos sanguíneos
grandes. Un incremento de la cantidad de EPCR soluble es indicativo
de una lesión en un vaso grande, que tiene como resultado la
proteolisis del EPCR o la estimulación de la síntesis de sEPCR.
Puede determinarse también la relación de EPCR respecto a
trombomodulina, sobre la base de muestras de sangre u orina, que es
indicativa del grado relativo de daño microvascular frente al de
vasos grandes. Pueden utilizarse también las cantidades relativas
de EPCR respecto a citoquinas, marcadores de activación de
leucocitos y factores del complemento o marcadores de activación,
para indicar el estado de enfermedad.
Como el EPCR está presente en las células
endoteliales, es útil como marcador de daño de células
endoteliales. Puede ser utilizado como indicador del efecto de un
fármaco, tanto de su toxicidad como de su eficacia. Por ejemplo, en
pacientes con lupus, los fármacos que minimicen eficazmente el daño
a los vasos grandes mediado por inflamación/coagulación, tendrían
como resultado una disminución de los niveles de EPCR.
La presente invención será comprendida
adicionalmente por referencia a los ejemplos no limitantes
siguientes.
Se utilizan las abreviaturas siguientes: rsEPCR,
EPCR soluble recombinante con el epítopo HPC4 insertado en lugar
del dominio transmembranal y la cola citosólica; mAb, anticuerpo
monoclonal; SDS-PAGE, electroforesis en gel de
dodecilsulfato de sodio poliacrilamida.
Los reactivos siguientes fueron adquiridos a los
proveedores indicados:
Heparina de mucosa intestinal porcina,
fluorofosfato de diisopropilo, éster biotinamidocaproato
N-hidroxisuccinimida, seroalbúmina bovina, Sigma
(St. Louis, MO); Espectrozima PCa, American Diagnostica (Greenwich,
CT); kit de amplificación por ELISA, Gibco BRL (Gaithersburg, MD);
AffiGel-10, BioRad (Hercules, CA); solución de sales
equilibrada de Hank, ácido
3-(N-morfolina)propano sulfónico (MOPS),
Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Todos los demás reactivos fueron
de la mejor calidad comercialmente disponible.
La proteína C humana (Esmon y col., 1993,
Methods Enzymol. 222:359-385), la trombina
bovina (Owen y col., 1974, J. Biol. Chem.
249:594-605) y la antitrombina bovina (Esmon, 1977,
``Factors regulating the inhibition of thrombin by antithrombin
III. In Chemistry and Biology of Thrombin''. R.L. Lundblad, J.W.
Fenton, II y K.G. Mann, editores. Ann. Arbor. Science, Ann. Arbor.,
403-411) fueron purificadas según está descrito. El
EPCR soluble recombinante, rsEPCR, consta del dominio extracelular
del EPCR truncado en el residuo 210 justo antes del dominio
transmembranal, seguido por una secuencia de 12 residuos que
permite la purificación por inmunoafinidad dependiente de calcio
sobre el anticuerpo monoclonal HPC4 (Takahashi y col., 1992;
Stearns y col., 1988, J. Biol. Chem.
263:826-832). La construcción, purificación y las
características de unión del rsEPCR a proteína C/PCA (Fukudome y
col., 1996). Se preparó suero preinmune y antisuero policlonal de
cabra hacia rsEPCR y se purificó la IgG (Fukudome y col., 1996). El
anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de cabra fue
biotinilado con el éster biotinamidocaproato
N-hidroxisuccinimida utilizando procedimientos
estándar.
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales (mAb)
contra el rsEPCR según está descrito para otras proteínas (Esmon y
col., 1993). Los mAbs 1494, 1495 y 1496 son anticuerpos
IgG1\kappa que se unen al rsEPCR y al EPCR expresado en la
superficie celular. Los mAbs 1494 y 1496 bloquean la unión de la
proteína C y de la PCA al EPCR e inhiben la capacidad del EPCR
celular para facilitar la activación de la proteína C por el
complejo trombina-trombomodulina
(Stearns-Kurosawa y col., 1996). El mAb 1495 no
bloquea la unión del ligando al EPCR, no altera la activación de la
proteína C en la superficie celular y tiene un epítopo de unión
distinto del de los mAbs 1494 ó 1496. Los mAbs 1494 y 1495 fueron
biotinilados con el éster biotinamidocaproato
N-hidroxisuccinimida utilizando procedimientos
estándar. El mAb 1494 fue acoplado a AffiGel-10, de
acuerdo con las direcciones del fabricante, para purificar
mediante inmunoafinidad el EPCR plasmático. La selección de los
mAbs anti-EPCR fue realizada utilizando los métodos
descritos por Stearns-Kurosawa y col. (1996);
Fukudome y col. (1996).
El efecto del rsEPCR o del EPCR plasmático
purificado sobre la actividad anticoagulante de la PCA (25 nM) en
un ensayo de coagulación con factor Xa de una etapa fue realizado
(Regan y col., 1996) en presencia o ausencia de 83 \mug/ml del
mAb 1496, un anticuerpo que bloquea la interacción
PCA-EPCR (Stearns-Kurosawa y col.,
1996). Los EPCRs solubles y el mAb 1496 fueron preincubados durante
15 minutos antes del ensayo.
Todas las líneas celulares humanas fueron
mantenidas según se describió previamente (Fukudome y col., 1996).
Las células EA.hy926, una línea de células endoteliales humanas
transformadas (Edgell y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 80:3734-3737), fueron proporcionadas
amablemente por Cora-Jean Edgell (University of
North Carolina en Chapel Hill).
Con el fin de que sirviera como sonda
fluorescente, la PCA fue marcada con fluoresceína en el sitio
activo (fl-PCA) según está descrito (Fukudome y
Esmon, 1994; Bock, P.E., 1988, Biochemistry
27:6633-6639). El efecto del rsEPCR o del EPCR
plasmático sobre la unión de PCA a células EA.hy926 fue estudiado
mediante citometría de flujo (Fukudome y col., 1996). Brevemente,
las células recogidas fueron incubadas durante 30 minutos sobre
hielo con fl-PCA 60 nM en ausencia o presencia de
concentraciones crecientes de una preparación de EPCR soluble, se
lavaron y se determinó la fluorescencia unida a las células
mediante citometría de flujo con 10.000 acontecimientos contados
por muestra. Todos los ensayos fueron realizados en solución de
sales equilibrada de Hank suplementada con un 1% de seroalbúmina
bovina, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM y un 0,02% de azida de
sodio.
Células EA.hy926 fueron cultivadas en placas de
cultivo de tejidos de 96 pocillos (Stearns-Kurosawa
y col., 1996). Las monocapas confluentes fueron lavadas tres veces
con solución de sales equilibrada de Hank suplementada con un 1%
(p/v) de seroalbúmina bovina, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM y
un 0,02% de azida de sodio. Todos los ensayos fueron realizados a
temperatura ambiente en el mismo tampón en un volumen final de 60
\mul, y todas las concentraciones de proteína representan la
concentración final en el ensayo. Se añadió proteína C (0,1 \muM)
en ausencia o presencia de rsEPCR, EPCR plasmático o del mAb 1494 a
las concentraciones indicadas y se preincubó con las células
durante 15 minutos. Se añadió trombina a las mezclas (2 nM) para
iniciar las reacciones de activación. Al tiempo indicado, se
retiraron alícuotas de 50 \mul y se añadieron a 10 \mul de
antitrombina (0,7 \muM final) y heparina (5 U/ml final) en una
placa de microvaloración de 96 pocillos. La actividad amidolítica
de la PCA fue determinada por la adición del sustrato Espectrozima
PCa (0,2 mM) y se midió la velocidad de cambio de la absorbancia a
405 nm (mDO/minuto) en un lector de microplacas cinético Vmax
(Molecular Devices, Menlo Park, CA). Todos los puntos del ensayo se
realizaron en pocillos triplicados y se activó menos de un 10% del
sustrato proteína C según se determinó mediante referencia a una
curva estándar de proteína C totalmente activada frente a
mDO/minuto.
Se recogió sangre completa de voluntarios
adultos normales (12 mujeres y 10 hombres) mediante punción venosa
en una solución tamponada de citrato al 3,8% o en tubos sin
anticoagulante (tubos Vacutainer; Becton Dickinson, Franklin Lakes,
NJ). No se intentó una selección de los donantes con respecto a la
edad, a la dieta u a otras variables. Todos los voluntarios fueron
informados del estudio y dieron su consentimiento escrito. La
sangre fue centrifugada a 1160 x g durante 10 minutos. El plasma y
el suero fueron alicuotados y almacenados congelados a -80ºC hasta
el ensayo.
Se desarrolló un ensayo sobre inmunoabsorbente
con enzima unido para detectar el antígeno EPCR en plasma. Placas
de microvaloración (Maxisorp; Nunc, Rockilde, Dinamarca) fueron
revestidas con 50 \mul del mAb 1495 4 \mug/ml en
Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,6 a 4ºC durante una
noche. Las etapas siguientes fueron realizadas a temperatura
ambiente. Los pocillos fueron lavados tres veces con
Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, Tween 20 0,05%, pH 7,5
(tampón de ensayo) y bloqueados con tampón de ensayo que contenía
un 0,1% (p/v) de gelatina durante al menos una hora. Los pocillos
fueron lavados, se añadieron muestras de 50 \mul en pocillos
triplicados y las placas fueron incubadas durante una hora. Los
pocillos fueron aspirados, lavados tres veces con tampón de ensayo
y se añadieron 50 \mul de biotina-mAb 1494 2
\mug/ml. Las placas fueron incubadas durante una hora, se lavaron
tres veces y se añadieron 50 \mul del conjugado
estreptavidina-fosfatasa alcalina 0,25 \mug/ml
(Gibco BRL) y se incubaron durante una hora adicional. Los pocillos
fueron lavados cinco veces y se añadieron el sustrato y los
reactivos amplificadores de un kit de amplificación por ELISA
(Gibco BRL) secuencialmente a intervalos de 15 minutos de acuerdo
con las direcciones del fabricante. La producción de color fue
parada con H_{2}SO_{4} 0,3 M y se leyó la absorbancia de punto
final a 490 nm en un lector de microplacas Vmax. Cada placa
contenía estándares en pocillos triplicados de 1,5 - 100 ng/ml de
rsEPCR en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM,
gelatina 0,1%, pH 7,5. La curva estándar era lineal (r = 0,99)
desde 1,5 a 12,5 ng/ml y las muestras de plasma fueron diluidas con
el mismo tampón para que entraran dentro del rango lineal.
Experimentos preliminares determinaron que una concentración final
de plasma del 1-2% no afectaba a la linealidad ni a
la sensibilidad de la curva estándar. Muestras de plasma de
voluntarios sanos fueron diluidas con tampón de ensayo que contenía
EDTA 1 mM hasta una concentración final de plasma del 2% y se
calcularon los niveles de antígeno EPCR a partir de la media de
pocillos triplicados por referencia a una curva estándar
determinada en la misma placa.
Se desarrolló un ensayo alternativo en el que se
invirtieron el anticuerpo de revestimiento y el anticuerpo de
detección (revestimiento mAb 1494; detección
biotina-mAb 1495) y la unión del anticuerpo se
detectó con el sustrato Blue Phos (KPL Laboratories; Gaithersburg,
MD). Este método fue utilizado para analizar EPCR plasmático en
pacientes con sepsis. Este ensayo era más sensible, probablemente
debido a diferencias de afinidad, pero ambos ensayos dieron
resultados cualitativamente similares.
Se realizó una electroforesis en gel de dodecil
sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) de las
muestras de plasma o suero con geles de acrilamida al 10% con el
sistema de tampones de Laemmli (Nature 227,
680-685) bajo condiciones no reductoras utilizando
procedimientos estándar. Los geles fueron transferidos a membranas
de polivinilidina (PVDF; Millipore, Bedford, MA), las membranas
fueron bloqueadas e incubadas posteriormente durante 30 minutos con
IgG de cabra preinmune (50 \mug/ml) o con IgG policlonal de
cabra anti-rsEPCR (50 \mug/ml). Después de lavar,
las membranas fueron incubadas con el conjugado
anti-IgG de cabra producido en
ratón-peroxidasa de rábano picante (Pierce,
Rockford, IL) a una dilución 1:20.000 durante 30 minutos. Las
membranas fueron lavadas y se detectó el conjugado anticuerpo
unido-enzima con un sustrato quimioluminiscente
intensificado (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Muestras de suero o plasma citratado (400
\mul) de voluntarios sanos fueron incubadas con 50 \mul de mAb
1495 conjugado a AffiGel-10 (5 mg de IgG/ml de
resina) durante una noche a 4ºC con mezclado. Las muestras fueron
centrifugadas, se retiró el sobrenadante y la resina fue lavada
tres veces con 1 ml de Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M,
azida de sodio 0,02%, pH 7,5. Se añadió a la resina lavada tampón
de muestra para SDS-PAGE que contenía una
concentración final de ditiotreitol de 20 mM, las muestras fueron
llevadas a ebullición durante tres minutos y procesadas para
SDS-PAGE y transferencia Western. Las membranas
fueron sondadas con anticuerpo policlonal
anti-rsEPCR de cabra biotinilado a 4 \mug/ml y el
anticuerpo unido fue detectado con un conjugado
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante
(Pierce) y un sistema de detección quimioluminiscente
intensificado. Experimentos preliminares determinaron que la
preadsorción de las muestras con 100 \mul de resina
AffiGel-10 inactivada con Tris durante
1-4 horas a temperatura ambiente, seguido por
inmunoadsorción durante una noche con mAb
1495-AffiGel-10, daba resultados de
transferencia Western idénticos.
El EPCR plasmático fue purificado a partir de
plasma citratado humano (Oklahoma Blood Institute), utilizando una
combinación de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía
de inmunoafinidad con mAb anti-rsEPCR y
cromatografía en columnas de afinidad con proteína C. Se realizaron
dos preparaciones de maneras ligeramente diferentes.
En la primera preparación, el plasma (1 l) fue
diluido con un volumen igual de Tris-HCl 20 mM, pH
7,5, benzamidina 10 mM, 400 unidades de heparina sódica y
adsorbido por lotes durante 1 hora con 1 g de resina QAE
pre-hinchada. Después de sedimentar, la resina fue
procesada para purificar proteína C (Esmon y col., 1993). Se añadió
sulfato de amonio sólido al sobrenadante a 4ºC hasta un 40% de
saturación, se centrifugó y se añadió sulfato de amonio adicional
al sobrenadante hasta alcanzar un 70% de saturación. Después de
centrifugar, la pella blanda fue colocada en bolsas de diálisis y
dializada durante una noche frente a 12 l de
Tris-HCl 20 mM, azida de sodio 0,02%, pH 7,4. El
dializado fue aplicado a una columna de inmunoafinidad mAb
1496-AffiGel-10 (6 ml de resina; 5
mg de IgG/ml de resina) equilibrada en Tris-HCl 20
mM, NaCl 0,1 M, azida de sodio 0,02%, pH 7,4. La columna fue lavada
con más de 12 ml del mismo tampón y eluida con etilén glicol al 50%
(v/v) en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 (Jun Xu,
observaciones no publicadas). Las fracciones de la elución
correspondientes a los picos fueron agrupadas (DO_{280} total
0,37), concentradas (Centripep 30, Millipore) y se cambió el tampón
a Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 3 mM,
MgCl_{2} 0,6 mM, azida de sodio 0,02%, pH 7,4. Este material fue
aplicado a una columna de afinidad de proteína C que había sido
preparada previamente aplicando la proteína C purificada (3 mg) a
una columna de HPC4-AffiGel-10 (5
mg de IgG/ml de resina; 0,9 x 8 cm) en el mismo tampón. El mAb HPC4
se une a la región de activación de la proteína C de manera
dependiente de calcio (Esmon y col., 1993; Stearns y col., 1988) y
no interfiere con la unión posterior del EPCR a la proteína C.
Después de aplicar la muestra conteniendo EPCR plasmático, la
columna fue lavada con 12 ml aproximadamente de tampón y eluida con
Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 5 mM, MOPS 10 mM,
azida de sodio 0,02%, pH 7,5. Las fracciones fueron monitorizadas
para determinar su absorbancia a 260 nm y para determinar el
antígeno EPCR utilizando el ELISA anteriormente descrito. El eluato
que contenía proteína C y EPCR plasmático fue aplicado a una
columna Mono Q de FPLC (Pharmacia-LKB, Uppsala,
Suecia) y la columna fue procesada con un gradiente lineal de NaCl
0,1-1 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5.
La mitad aproximadamente del EPCR plasmático no se unía a la
columna Mono Q, la mitad eluía a NaCl 0,2 M aproximadamente y la
proteína C eluía a NaCl 0,5 M aproximadamente. Ambas especies
iónicas de EPCR plasmático aparecían idénticas en los geles de
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no
reductoras con tinción de plata, con tinción BB de Coomassie o con
tinción de oro (Pierce) después de la transferencia a membranas de
PVDF y en las transferencias Western con la sonda de anticuerpo
policlonal anti-rsEPCR-biotina.
La segunda preparación de EPCR plasmático fue
realizada partiendo de 4 l de plasma con el fin de purificar
suficiente proteína para los estudios funcionales. En este caso, la
resina 1496-AffiGel-10 (20 ml de 5
mg de IgG/ml de resina) fue añadida directamente al plasma
citratado, junto con concentraciones finales de 10 mM de
benzamidina, 1 mM de fluorofosfato de diisopropilo y 0,5
unidades/ml de heparina sódica. El plasma fue adsorbido por lotes
durante una noche a 4ºC con mezclado suave. Una vez que sedimentó
la resina, el sobrenadante fue procesado para purificar la proteína
C (Esmon y col., 1993). La resina fue empaquetada en una columna
de 2,5 x 30 cm, lavada extensamente con Tris-HCl 20
mM, NaCl 0,1 M, azida de sodio 0,02%, pH 7,4 y eluida con etilén
glicol al 50% en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4. El eluato
fue agrupado y concentrado (DO_{280} total 5,5), aplicado a una
columna Mono Q y las dos especies iónicas (el avance y el pico de
eluato a NaCl 0,2 M) fueron aplicadas de nuevo a la resina de
1496-AffiGel-10 (1,5 x 11 cm). La
columna fue eluida con etilén glicol al 50% igual que
anteriormente. El eluato (DOs 0,71) fue concentrado y el tampón
cambiado a Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 3
mM, MgCl_{2} 0,6 mM, azida de sodio 0,02% con Centriprep 30. Este
material fue luego aplicado a una columna de afinidad en la que se
había aplicado inicialmente proteína C (2,9 mg) en el mismo tampón
a una columna de HPC2-AffiGel-10
(0,6 x 17 cm). El mAb HPC2 se une al dominio proteasa de serina de
la proteína C y no interfiere con la unión del EPCR (Fukudome y
col., 1996). El EPCR unido fue eluido con tampón que contenía EDTA
5 mM. El amiloide P sérico contaminante (procedente de la muestra
de proteína C) fue eliminado mediante cromatografía de intercambio
iónico en la columna Mono Q de FPLC. La muestra fue aplicada en
NaCl 0,2 M, de tal manera que el EPCR plasmático no se unía, y fue
separada de los contaminantes que eluían a NaCl
0,4-0,5 M. El EPCR plasmático purificado resultante
(DO_{280} 0,193) aparecía homogéneo por SDS-PAGE
con tinción con plata y por transferencia Western con
anti-rsEPCR policlonal. Este material fue utilizado
para los estudios funcionales y para el análisis de la secuencia
aminoterminal.
El análisis de la secuencia aminoterminal del
EPCR plasmático soluble fue realizado en el laboratorio del Dr.
Kenneth Jackson en la Molecular Biology Research Facility, W.K.
Warren Medical Research Institute, Oklahoma City. Los aminoácidos
están designados por el código estándar de una letra.
Como una primera aproximación, muestras de plasma
y suero de tres voluntarios sanos fueron diluidas (4% v/v),
procesadas en geles de SDS-PAGE al 10% bajo
condiciones no reductoras y procesadas para transferencia Western
utilizando un anticuerpo policlonal de cabra producido contra el
rsEPCR. Muestras de plasma y suero (4% v/v) procedentes de
voluntarios sanos fueron procesadas para SDS-PAGE en
geles al 10% bajo condiciones no reductoras, transferidas a
membranas y las membranas sondadas con anticuerpo policlonal
anti-rsEPCR de cabra. Los resultados fueron
comparados con rsEPCR (0,2 ng). El anticuerpo unido fue detectado
con anti-IgG de cabra producido en ratón y un
sistema de detección de quimioluminiscencia intensificada. Las
muestras de plasma de dos voluntarios sanos fueron inmunoadsorbidas
con una resina de 1495-AffiGel-10.
La resina lavada fue eluida y procesada para
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Se realizó una
transferencia Western utilizando como sonda
anti-rsEPCR de cabra-biotina.
La pureza del EPCR plasmático fue determinada a
partir de geles al 10% de SDS-PAGE teñidos con plata
y de transferencias Western de membranas sondadas con
anti-rsEPCR de cabra-biotina
(reducido y no reducido). Una única banda de 43.000 Da
aproximadamente aparece en las muestras de suero y plasma después
de que la membrana haya sido sondada con el anticuerpo policlonal.
El tamaño de la proteína detectada parece ligeramente mayor que el
del rsEPCR. Las otras bandas detectadas eran la unión de fondo de
la IgG según se estimó sondando con IgG preinmune y con tiempos de
exposición mayores. La incubación durante una noche de las muestras
de plasma con el mAb 1495 anti-EPCR acoplado a la
resina AffiGel-10, seguido por lavado y elución del
antígeno unido bajo condiciones reductoras, tuvo como resultado una
única banda detectada por transferencia Western con el anticuerpo
policlonal anti-rsEPCR de
cabra-biotina.
La determinación del antígeno EPCR soluble en el
plasma de voluntarios sanos por ELISA utilizando el mAb 1495 como
anticuerpo de revestimiento, encontró niveles de antígeno de 91,1
+/- 24,5 ng/ml en mujeres (n=12) y de 107,2 +/- 30,2 ng/ml en
hombres (n=10). Cuando se calcularon juntos, los niveles medios de
antígeno EPCR plasmático fueron de 98,4 +/- 27,8 ng/ml. El valor de
los hombres parecía ser ligeramente superior al de las mujeres, de
manera similar al de la trombomodulina (Quehenberger y col.,
Thromb. Haemost. 76:729-734), aunque la
población estudiada era demasiado limitada para un análisis
estadístico y este estudio no estaba diseñado para determinar
diferencias debidas al género, edad, dieta u otras variables.
Como parecía que el EPCR plasmático era una única
especie a 100 ng/ml aproximadamente, era importante determinar si
el EPCR circulante podía unirse a la proteína C y a la PCA. Se
purificó EPCR soluble de plasma humano mediante una combinación de
cromatografía de intercambio iónico, precipitación con sulfato de
amonio e inmunoadsorción por cromatografía en una columna de mAb
1496
anti-EPCR-AffiGel-10
según se describió en Procedimientos Experimentales.
Este EPCR plasmático (110 \mug aproximadamente)
fue aplicado a una columna de afinidad de proteína C preparada
aplicando proteína C (3 mg) a una columna de mAb HPC4 anti-
proteína C-AffiGel-10 en tampón
conteniendo CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM. La columna fue
lavada y el EPCR plasmático fue aplicado a la fracción 19. La
columna fue lavada y eluida con tampón que contenía EDTA 5 mM
comenzando en la fracción 35. Se determinó la absorbancia a 280 nm
y el antígeno EPCR de las fracciones. El antígeno EPCR fue
determinado mediante ELISA.
Más de un 98% del antígeno EPCR plasmático
aplicado se unía a la columna de afinidad de proteína C. El perfil
de absorbancia indica la coelución de EPCR y proteína C de la
columna de anticuerpo, consistente con la dependencia de calcio de
la unión de la proteína C a este anticuerpo (Stearns y col.,
1988).
Con el fin de purificar proteína suficiente para
los estudios funcionales y estructurales, se purificó EPCR a partir
de 4 l de plasma utilizando un procedimiento similar, pero
modificado ligeramente. Después de la elución de una columna de
afinidad de proteína C-anticuerpo, las proteínas
contaminantes residuales fueron eliminadas por cromatografía de
intercambio iónico en una columna Mono Q de FPLC. La preparación
resultante de EPCR plasmático aparecía homogénea en geles de
SDS-PAGE al 10% con tinción de plata y se
obtuvieron resultados idénticos con transferencias Western sondadas
con anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de
cabra-biotina bajo condiciones reductoras y no
reductoras. El análisis de la secuencia aminoterminal de la
proteína purificada produjo solamente una secuencia,
S-Q-D-A-S-D,
que es idéntica a la secuencia aminoterminal del EPCR soluble
recombinante (Secuencia ID Nº 2). Ésta es la primera determinación
de la secuencia aminoterminal de EPCR procedente de una fuente
natural.
La capacidad del EPCR plasmático para unirse a la
PCA fue determinada mediante estudios de competición en los cuales
se permitió competir al EPCR plasmático con EPCR celular por la
PCA, y la PCA libre resultante que podía unirse al EPCR celular fue
determinada por citometría de flujo (Figura 4a). PCA marcada con
fluoresceína en el sitio activo (fl-PCA) fue
incubada con células EA.hy926 en presencia o ausencia de EPCR
plasmático o de rsEPCR. La dependencia de la concentración de EPCR
para inhibir la unión de PCA a las células era similar para ambas
formas solubles del EPCR. Esta observación indica que la afinidad
del EPCR plasmático para unirse a la PCA es similar a la
determinada previamente para la interacción de unión
rsEPCR-PCA (Kd_{ap} 30 nM aproximadamente).
Aunque el rsEPCR tiene poco efecto sobre la
activación de la proteína C en un sistema soluble (Regan y col.,
1996), el EPCR unido a la membrana tiene una capacidad muy potente
para facilitar la activación en la superficie celular
(Stearns-Kurosawa y col., 1996). Los datos actuales
que demuestran la existencia de una forma circulante de EPCR capaz
de unirse a la proteína C y a la PCA, sugieren que el EPCR
plasmático tiene potencial para alterar la activación de la
proteína C en la superficie celular. La activación dependiente de
trombina de un nivel aproximadamente fisiológico de proteína C (0,1
\muM) en células EA.hy926 fue inhibida por un exceso de rsEPCR
casi hasta el nivel observado con el mAb 1494
anti-rsEPCR que bloquea la interacción de unión
EPCR-proteína C, según está mostrado en la Figura
4b. Estudios previos han demostrado que el rsEPCR no tiene efecto
sobre la actividad amidolítica de la PCA utilizando sustratos
sintéticos pequeños (Regan y col., 1996). El EPCR plasmático era
ligeramente más eficaz en su capacidad para inhibir la activación
de la proteína C en la superficie celular de células EA.hy926 con
relación al rsEPCR, según está mostrado en la Figura 4c.
En un ensayo de coagulación con factor Xa de una
etapa, el EPCR plasmático purificado y el EPCR recombinante soluble
inhibían la prolongación de los tiempos de coagulación inducida por
PCA de manera similar (Figura 4d). La inhibición de la actividad
anticoagulante de la PCA por rsEPCR había sido observada
previamente (Regan y col., 1996). Según se esperaba, el mAb 1496
revertía este efecto bloqueando la interacción de unión
PCA-EPCR plasmático.
Para responder a la pregunta de si está presente
EPCR soluble en orina, se recogieron cuatro muestras de orina
(primera emisión de la mañana) y se analizaron para determinar la
presencia de EPCR soluble mediante transferencia Western y
ELISA.
Muestras de orina pediátrica sin diluir fueron
comparadas con un plasma normal al 4% y con EPCR soluble
recombinante (1 ng). Las muestras fueron incubadas con
anti-rsEPCR de cabra-biotina y un
sistema de detección estreptavidina-fosfatasa
alcalina.
La transferencia Western indica que (a) EPCR
soluble está presente en orina y que (b) el antígeno EPCR soluble
está presente en un nivel similar al observado en plasma. No se
observa una degradación obvia.
La cantidad de EPCR soluble en las cuatro
muestras, según se cuantificó por ELISA, fue de 40,3, 6,1, 35,6 y
90,1 ng/ml.
La concentración de EPCR plasmático en humanos
normales es de 100 ng/ml aproximadamente (98,4 \pm 27,8 ng/ml;
2,5 nM), según se discutió anteriormente. Se analizó un panel de
muestras de pacientes con lupus eritematoso (n = 54) y se encontró
que los niveles de EPCR soluble variaban desde niveles no
detectables hasta niveles mayores de 1.700 ng/ml. Quince pacientes
tenían niveles de EPCR soluble mayores de 200 ng/ml.
Estudios previos han demostrado niveles de TM
plasmática soluble elevados en pacientes con lupus debido al daño
endotelial, y las presentes muestras de pacientes con lupus fueron
analizadas para determinar TM plasmática como referencia. Se
encontró que sus niveles de TM soluble no tenían absolutamente
ninguna correlación con sus niveles de EPCR soluble, según está
mostrado por la Figura 5. Ésta es una observación importante que
sugiere que la fuente de EPCR plasmático soluble no procede
simplemente de un endotelio dañado aleatoriamente. En contraste con
la TM, la expresión de EPCR unido a la membrana en humanos y
primates está restringida primariamente al endotelio de los vasos
grandes, expresando los capilares poco EPCR. Se espera que la
localización distintiva del EPCR aumente la activación de proteína
C localmente para impedir la trombosis en los vasos grandes. La
localización primaria del EPCR unido a la membrana en los vasos
grandes, señala un riesgo trombótico dirigido en los vasos grandes
que puede ser pronosticado por las concentraciones de EPCR
plasmático soluble.
Se define sepsis (conferencia de consenso
accp/sccm, Chest, 1992, 101:1644-1655) como
la respuesta inflamatoria sistémica a una infección, incluyendo,
pero no limitándose a, más de una de las manifestaciones clínicas
siguientes:
- 1)
- temperatura corporal mayor de 38ºC o menor de 36ºC;
- 2)
- ritmo cardíaco mayor de 90 latidos por minuto;
- 3)
- taquipnea manifestada por:
- a) frecuencia respiratoria mayor de 20 respiraciones por minuto;
- b) hiperventilación como de una PaCO_{2} menor de 32 mm Hg;
- 4)
- recuento de glóbulos blancos sanguíneos mayor de 12.000/mm^{3} o menor de 4.000/mm^{3}, o la presencia de más de un 10% de neutrófilos inmaduros (bandas).
Las muestras fueron obtenidas de pacientes con
complicaciones post-quirúrgicas con o sin sepsis
grave, definidas por sepsis asociada con disfunción orgánica,
hipofusión o hipotensión. Las anormalidades de perfusión pueden
incluir acidosis láctica, oliguria o alteraciones agudas del estado
mental. El choque séptico se refiere a sepsis con hipotensión que
requiere fármacos vasoactivos durante más de 24 horas a pesar de la
reanimación con los fluidos adecuados y la ausencia de choque
cardiogénico.
Todos los pacientes incluidos en el estudio
cumplían los criterios siguientes:
- a)
- admisión en la unidad de cuidados intensivos debido a sepsis y/o complicaciones post-quirúrgicas que requerían una ayuda respiratoria (ventilación controlada durante más de 24 horas) y/o hemodinámica (requerimiento de fármacos inotrópicos, dopamina o dobutamina a una dosis de más de, o igual a, 5 microgramos/kg/minuto y/o aminas vasoactivas, epinefrina o norepinefrina);
- b)
- edad entre 18 y 75 años;
- c)
- actividad antitrombina menor del 70% (analizada localmente).
Los pacientes eran excluidos si tenían
politrauma, cirrosis hepática o insuficiencia hepática aguda,
cáncer en fase terminal, inmunodeficiencia, leucemia, embarazo o
terapia con heparina.
Se tomaron muestras de sangre de los pacientes a
tiempo 0 (ingreso en la Unidad de Cuidados Intensivos, UCI) y a los
dos días y a los seis días después del tratamiento con
anti-trombina II (ATIII) o placebo. El EPCR soluble
plasmático y la trombomodulina (TM) soluble fueron analizados
solamente en las muestras de tiempo 0.
sEPCR:
normal: 133,4 \pm 53,4 ng/ml (media \pm
DE)
sepsis: 224,9 \pm 74,5
ng/ml
Diferencia significativa entre las medias,
P=0,00009
sTM:
normal: 35,5 \pm 20,4 ng/ml (media \pm
DE)
sepsis: 39,9 \pm 73,1
ng/ml
Sin diferencia significativa entre las medias,
P=0,81
No hay correlación entre los niveles en plasma de
sEPCR y sTM, r^{2} =
0,34.
Estos resultados están mostrados gráficamente en
la Figura 6. Igual que en los pacientes con lupus, los pacientes
con sepsis muestran elevaciones muy significativas de los niveles
de EPCR plasmático, no correlacionados con los niveles de TM
soluble.
La observación de que el EPCR plasmático soluble
inhibe la activación de la proteína C y la actividad anticoagulante
de la proteína C activada, indica que los niveles elevados de EPCR
plasmático en estos pacientes representa un riesgo trombótico
adicional y señala la evidencia de una lesión/respuesta vascular.
Ejemplos de condiciones que son indicativas incluyen trastornos
asociados con la estimulación de células endoteliales,
aterogénesis, adhesión de leucocitos y ruptura de la placa.
Como una aproximación inicial para determinar si
una isoforma de EPCR soluble podría ser generada por un mecanismo
de ayuste alternativo, se aisló ARN de tejidos humanos y de babuino
y se realizó una PCR con transcriptasa inversa
(RT-PCR) con cebadores específicos de genes. Aunque
no se conoce la secuencia genómica del EPCR de babuino, se
utilizaron cebadores basados en la secuencia humana sobre la base
del razonamiento de que los babuinos y los humanos están
estrechamente relacionados en la escala evolutiva.
En el procedimiento de RT-PCR, el
ARN total es generalmente aislado a partir de tejido homogeneizado.
El ARN es mezclado con un cebador antisentido específico,
nucleótidos y el enzima transcriptasa inversa. En la mezcla, el ARN
sirve como molde para que la transcriptasa inversa cree una primera
hebra de ADNc. Este nuevo molde de ADNc es luego amplificado
mediante PCR convencional utilizando cebadores específicos y
polimerasa Taq. Se eligieron cebadores que amplificarían la forma
de membrana del EPCR (424 pb) y el producto ayustado
alternativamente pronosticado (674 pb). Los productos
correspondientes a ambas formas del EPCR fueron amplificados a
partir de una variedad de tejidos de babuino (Figura 4) y de pulmón
y placenta humanos. Era poco probable la posible contaminación con
ADN genómico según se estimó por los controles sin transcriptasa
inversa y la ausencia de una banda de 1.885 pb en las reacciones
con los tejidos.
Para confirmar que la secuencia de ADN genómico
de babuino tenía el límite exón-intrón apropiado y
la secuencia de lectura en marco en el intrón para ayuste
alternativo, la secuencia intrónica del ADN genómico de riñón de
babuino fue amplificada por PCR convencional. Se asumió que la
estructura genómica estaba conservada entre las especies y se
utilizaron cebadores (secuencia humana) que flanqueaban el intrón
III. Éste es el intrón (secuencia humana) que se cree que contiene
la secuencia ayustada alternativamente. Se homogeneizó tejido de
riñón de babuino y se extrajo el ADN. El ADN fue mezclado con los
cebadores específicos y se amplificó un producto por PCR. El
producto de ADN fue purificado y sometido a electroforesis en un
gel de agarosa.
El anticuerpo de revestimiento es el mAb 1494
que se une al dominio de unión al ligando del EPCR. El anticuerpo
de detección es el mAb 1495 biotinilado, que no bloquea la unión de
la proteína C/PCA, y no reacciona de manera cruzada con el mAb
1494. El sistema de detección es
estreptavidina-fosfatasa alcalina y el sustrato
BluePhos (de KPL).
Los tejidos (50-100 mg) fueron
homogeneizados en Trizol (Gibco BRL). La fase superior que contenía
ARN fue extraída con cloroformo, precipitada con isopropanol,
lavada y solubilizada en DEPC-agua. El ARN
(1-5 \mug) fue mezclado con nucleótidos, el
cebador antisentido CREA y transcriptasa inversa en el tampón
apropiado de acuerdo con las direcciones del fabricante (Sistema de
Preamplificación Superscript™ para la síntesis de la primera hebra
de ADNc, Gibco BRL). El producto ADNc fue amplificado mediante PCR
convencional utilizando los cebadores CRES y CREA durante 30
ciclos. Los productos ADNc fueron purificados mediante extracción
con cloroformo y precipitación con alcohol, solubilizados en agua y
sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 2% utilizando
procedimientos estándar. Los geles fueron teñidos con Verde Vistra
(Amersham) y se tomaron imágenes en un ``Phosphoimager'' (escáner
Storm™, Molecular Dynamics, Inc.).
ADN de riñón de babuino (82 mg) fue
homogeneizado en el reactivo Trizol. La fase inferior que contenía
el ADN fue extraída, precipitada y solubilizada en agua estéril. El
ADN fue amplificado por PCR convencional en una mezcla con tampón,
nucleótidos y los cebadores HRT-1 y
HRT-2 durante 30 ciclos. El ADN amplificado fue
extraído, precipitado, solubilizado en agua estéril y sometido a
electroforesis en un gel de agarosa al 2% utilizando procedimientos
estándar. La única banda (465 pb) fue visualizada con bromuro de
etidio, cortada y el producto de PCR purificado en una columna de
centrifugación de acuerdo con las direcciones del fabricante
(Qiagen). El producto de PCR fue secuenciado utilizando los mismos
cebadores.
- CRES: 5'-TCGTGCGCCTGGTGCACCAGGAGC-3'
- (cebador sentido 5' cerca del extremo del exón II)
- CREA: 5'-CGCCGTCCACCTGTGCACAGGAAG-3'
- (cebador antisentido 3' en el exón IV)
- HRT-1: 5'-AGCAGCTCAATGCCTACAACCG-3'
- (cebador sentido 5' cerca del extremo del exón III)
- HRT-2: 5'-CCGTAGAAGGACACGTGTCCACCTGCCGC-3'
- (cebador antisentido 3' en el exón IV)
Había una única banda amplificada procedente del
ADN genómico de riñón que fue cortada del gel, purificada y
secuenciada. La secuencia era un 92% idéntica a la secuencia humana
y se conservaban los límites exón-intrón. El elevado
nivel de similitud en esta secuencia intrónica es notable, ya que
las secuencias intrónicas no están típicamente bien conservadas
entre especies. Había también una secuencia de lectura en marco
dentro del intrón que contenía un codon de parada, pronosticando
una cola exclusiva carboxilo-terminal de 22
residuos en la proteína soluble ayustada alternativamente de
babuino.
La observación de que las isoformas de EPCR
soluble pronosticadas tendrán colas
carboxilo-terminales exclusivas, proporciona una
diferencia estructural para distinguir entre las isoformas
utilizando anticuerpos específicos de isoforma. El modelo de trabajo
es que los niveles plasmáticos de EPCR soluble proteolizado
informarán de un daño endotelial, mientras que los niveles de EPCR
soluble ayustado alternativamente informarán de una respuesta
endotelial a estímulos. Se anticipa que los niveles plasmáticos
relativos de las isoformas de EPCR soluble proporcionarán
información sobre la disfunción y el daño endotelial de vasos
grandes en patologías específicas.
Los productos de la RT-PCR de
tejidos humanos: placenta, pulmón y lengua, fueron sometidos a
electroforesis utilizando los cebadores CRES/CREA específicos para
el EPCR. Los procedimientos fueron los mismos que los utilizados
para los tejidos de babuino. Se observaron los productos
correspondientes a la isoforma de membrana del EPCR (mEPCR) y a la
isoforma de EPCR soluble (sEPCR) ayustada alternativamente. Los
productos parecían esencialmente los mismos que los observados
utilizando los tejidos de babuino. La única diferencia es que el
tejido placentario parece tener productos adicionales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Oklahoma Medical Research Foundation
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO QUE UTILIZAN EL RECEPTOR SOLUBLE DE PROTEÍNA C/PROTEÍNA C ACTIVADA DE CÉLULAS ENDOTELIALES.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Patrea L. Pabst
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2800 One Atlantic Center
1201 West Peachtree Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Atlanta
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Georgia
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 30309-3450
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pabst, Patrea L.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.284
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: OMRF168
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (404) 873-8794
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (404) 873-8795
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1302 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_varias
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1302
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los nucleótidos 25 a 738 codifican el Receptor de Proteína de Células Endoteliales de la Secuencia ID Nº 2.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 238 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_varias
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..365
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Receptor de Proteína de Células Endoteliales codificado por los nucleótidos 1 a 1302 de la Secuencia ID Nº 1.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..15
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 1-15 representan una supuesta secuencia señal.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Dominio
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 211..236
\vskip0.333000\baselineskip
- (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 211-236 representan un supuesto dominio transmembranal.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio activo
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 47..174
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 47-49, 64-66, 136-138 y 172-174 representan sitios potenciales de N-glicosilación.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio activo
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: Cys 17
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= precede inmediatamente al sitio de corte del aminoácido
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio activo
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: Gly 201
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= insertos peptídicos en el EPCR ayustado alternativamente
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 17..186
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 17, 114, 118 y 186 representan residuos de cisteína extracelulares.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 148 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_varias
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..24
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador sentido 5' próximo al extremo del exón II.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCGTGCGCCT GGTGCACCAG GAGC
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_varias
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..24
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador antisentido 3' en el exón IV.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCCGTCCAC CTGTGCACAG GAAG
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_varias
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..22
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador sentido 5' próximo al extremo del exón III.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGCAGCTCAA TGCCTACAAC CG
\hfill22
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: características_varias
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..29
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador antisentido 3' en el exón IV.''
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCGTAGAAGG ACACGTGTCC ACCTGCCGC
\hfill29
Claims (15)
1. Un ensayo para determinar el receptor
endotelial soluble de la proteína C que comprende la medida de la
cantidad de receptor endotelial soluble de la proteína C en una
muestra obtenida de un paciente a analizar.
2. El ensayo de la reivindicación 1 en el que la
muestra es seleccionada del grupo que consta de orina, plasma,
suero, muestras de tejido y fluido intersticial.
3. El ensayo de la reivindicación 1 que comprende
además la etapa de correlacionar la cantidad de receptor de
proteína C endotelial soluble con estándares de calibración.
4. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el
paciente tiene un trastorno o enfermedad seleccionados del grupo
que consta de estados y trastornos de coagulación e inflamatorios,
trastornos o enfermedades que implican un daño al endotelio y una
enfermedad de los vasos sanguíneos grandes.
5. El ensayo de la reivindicación 4, en el que el
trastorno o enfermedad es seleccionado del grupo que consta de
enfermedades autoinmunes, trasplantes, sepsis, choque,
pre-eclampsia, diabetes, enfermedad vascular,
enfermedad renal y enfermedad hepática.
6. El ensayo de la reivindicación 5, en el que la
enfermedad vascular es seleccionada del grupo que consta de
``by-pass'' cardiopulmonar, angina inestable,
restenosis y angioplastia.
7. El ensayo de la reivindicación 1 para detectar
un daño en los vasos sanguíneos grandes.
8. Un kit para la detección y medida del receptor
endotelial de la proteína C que contiene
un anticuerpo inmunorreactivo con el receptor
endotelial de la proteína C,
reactivos para detectar una reacción entre el
anticuerpo y el receptor endotelial de la proteína C en una muestra
de un paciente y
estándares para correlacionar el nivel de
reacción con niveles normales y anormales de receptor endotelial de
la proteína C.
9. El kit de la reivindicación 8, en el que el
anticuerpo tiene mayor afinidad por el receptor endotelial de la
proteína C que incluye el dominio transmembranal que por el
receptor endotelial de la proteína C que no incluye el dominio
transmembranal.
10. El kit de la reivindicación 8, en el que el
anticuerpo es inmunorreactivo con el inserto de un receptor
endotelial de la proteína C ayustado alternativamente.
11. El kit de la reivindicación 8, en el que los
anticuerpos bloquean la unión del receptor endotelial de la
proteína C y la proteína C activada o la proteína C.
12. Un receptor endotelial de la proteína C
modificado que se une a la proteína C, en el cual el residuo de
cisteína carboxilo-terminal está sustituido por otro
aminoácido o no está palmitoilado.
13. Un receptor endotelial de la proteína C
modificado que se une a la proteína C, que no está glicosilado.
14. Un receptor endotelial de la proteína C que
no incluye un dominio transmembranal codificado por un ácido
nucleico ayustado alternativamente que codifica el receptor
endotelial de la proteína C.
15. Un receptor endotelial soluble de la proteína
C aislado que existe de forma natural.
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