ES2198744T3 - Metodo homogeneo para la deteccion y/o la determinacion de la actividad fosforilante de un material biologico. - Google Patents
Metodo homogeneo para la deteccion y/o la determinacion de la actividad fosforilante de un material biologico.Info
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Abstract
Método homogéneo para la detección y/o la determinación de la actividad fosforilante de un material biológico con respecto a un substrato que contiene tirosina y/o serina y/o treonina, caracterizado porque dicho material biológico se pone en contacto con una pluralidad de péptidos o de polipéptidos que contienen tirosina y/o serina y/o treonina, idénticos o diferentes, unidos de manera covalente a una molécula portadora, en presencia de una fuente de fosfato no marcado radiológicamente y de los receptores específicos de dichos péptidos o polipéptidos fosforilados, y porque la detección y/o la determinación de la actividad fosforilante se efectúan por medición de una señal de emisión, resultando dicha señal de emisión de una interacción entre dicha molécula portadora constituida por una molécula luminiscente o una molécula no luminiscente unida a por lo menos un marcador luminiscente o un modulador de la señal de emisión y dichos receptores específicos unidos a por lo menos un marcador luminiscente o un modulador de la señal de emisión.
Description
Método homogéneo para la detección y/o la
determinación de la actividad fosforilante de un material
biológico.
El invento se refiere a un nuevo método homogéneo
para la detección y/o la determinación de la actividad de
fosforilación (o actividad fosforilante) de un material biológico
frente a un substrato que contiene tirosina y/o serina y/o
treonina, así como a un estuche para la puesta en práctica de este
método.
La fosforilación de moléculas biológicas tales
como péptidos o proteínas por las cinasas es un mecanismo
biológico principal de regulación del metabolismo celular.
La mayor parte de las enzimas que poseen una
actividad de fosforilación tienen una Km (constante de Michaelis)
muy elevada (comprendida generalmente entre 10^{-3} y 10^{-5}
M) y un rendimiento de conversión muy pequeño (entre 5% y 0,001% de
los sitios activos del substrato están fosforilados).
En estas condiciones, la detección de la
fosforilación de un substrato no es posible más que si los sitios
activos están presentes en un gran exceso durante la reacción. Este
gran exceso de sitios activos se puede obtener ya sea utilizando
concentraciones elevadas de un substrato (si éste tiene pocos
sitios activos) ya sea escogiendo un substrato que posea numerosos
sitios de fosforilación.
Los mecanismos de fosforilación se han estudiado
hasta ahora mediante métodos de detección heterogéneos radiativos
o enzimáticos.
En este tipo de métodos, la detección de las
fosforilación del substrato fijado sobre una fase sólida se efectúa
ya sea por la medición de la incorporación de ^{32}P en el
substrato enzimático, ya sea por la utilización de un anticuerpo
marcado (trazador isotópico, enzimático o fluorescente) dirigido
contra el sitio de fosforilación.
Este tipo de ensayo permite la fijación de una
gran cantidad de substrato sobre la fase sólida y por lo tanto la
detección de la propia fosforilación incluso cuando el substrato no
posee más que un pequeño número de sitios activos, pero presenta a
pesar de todo inconvenientes principales, a saber:
- la utilización frecuente de marcadores
isotópicos,
- la necesidad de un proceso de separación entre
las diferentes etapas del ensayo para eliminar los reactivos en
exceso, y
- la necesidad de dominar los procesos de
``captura'' del substrato (como por ejemplo cuando se utiliza una
placa que comprende avidina con un substrato de biotina).
En el caso de un método homogéneo, con frecuencia
es necesario que la concentración del substrato sea elevada para
generar una suficiente cantidad de substrato fosforilado a detectar.
Entonces se hace difícil capturar la totalidad del substrato,
puesto que esto necesitaría una cantidad importante de reactivo, lo
cual, si el reactivo es fluorescente, presenta el inconveniente de
generar un ruido de fondo específico elevado.
Se ha encontrado ahora que era posible detectar
la fosforilación de un substrato con la ayuda de un método
homogéneo en el que se utiliza una molécula portadora luminiscente,
a la que están acoplados de manera covalente una pluralidad de
substratos. Después de la reacción enzimática de fosforilación, la
cantidad de substrato fosforilado es revelada por la medición de la
señal emitida por la molécula portadora luminiscente y generada por
transferencia de energía de un receptor específico del substrato
fosforilado marcado por una molécula luminiscente.
Este método es particularmente útil para medir la
fosforilación de moléculas de interés biológico, tales como por
ejemplo péptidos, polipéptidos, proteínas o nucleótidos, en procesos
naturales o patológicos, o en el curso de procedimientos de
síntesis tales como por ejemplo la síntesis de ácidos nucleicos o
de proteínas.
En un primer aspecto, el invento tiene por
objeto, por lo tanto, un método homogéneo para la detección y/o la
determinación de la actividad fosforilante de un material biológico
frente a un substrato que contiene tirosina y/o serina y/o
treonina, caracterizado porque dicho material biológico se pone en
contacto con una pluralidad de péptidos o de polipéptidos que
contienen tirosina y/o serina y/o treonina, idénticos o diferentes,
unidos de manera covalente a una molécula portadora, en presencia
de una fuente de fósforo no marcado radiológicamente y de los
receptores específicos de dichos péptidos o polipéptidos
fosforilados, y porque la detección y/o la determinación de la
actividad fosforilante se efectúan por medición de una señal de
emisión, resultando dicha señal de emisión de una interacción entre
dicha molécula portadora constituida por una molécula luminiscente
o una molécula no luminiscente unida a por lo menos un marcador
luminiscente o un modulador de la señal de emisión y dichos
receptores específicos unidos a por lo menos un marcador
luminiscente o un modulador de la señal de emisión.
Por ``marcador luminiscente'' se entiende una
molécula luminiscente utilizada para detectar la interacción entre
la molécula portadora y el receptor específico.
Por ``modulador de la señal de emisión'' se
entiende una molécula que, cuando está presente en la proximidad de
una molécula luminiscente, modifica las características de la
señal de emisión de ésta.
Dependiendo de las moléculas utilizadas
respectivamente como molécula portadora y como receptor específico
y dependiendo del mecanismo de su interacción, un mismo compuesto
luminiscente puede desempeñar el cometido de un marcador
luminiscente o de un modulador de la señal de emisión.
Dicho modulador puede ser una molécula
luminiscente, por ejemplo una molécula luminiscente donante o
aceptora, o una molécula no luminiscente, por ejemplo un átomo de
número atómico elevado o una molécula que contenga tal átomo, como
se describe por ejemplo en el documento de solicitud de patente
europea EP 0.232.348, o también compuestos marcadores de espín.
La molécula portadora puede ser:
- ya sea una molécula luminiscente que tiene un
peso molecular elevado, del orden de varias decenas de
kilodaltones, tal como por ejemplo una molécula fluorescente tal
como aloficocianina o C ficocianina;
- ya sea una molécula no luminiscente, tal como
por ejemplo tiroglobulina, unida a por lo menos un marcador
luminiscente o a por lo menos un modulador de la señal de
emisión;
- ya sea un material sólido dispersado
luminiscente que tiene una superficie suficiente para fijar una
pluralidad de substratos de péptidos o polipéptidos;
- ya sea un material sólido dispersado no
luminiscente que tiene una superficie suficiente para fijar una
pluralidad de substratos de péptidos o polipéptidos, unido a por
lo menos un marcador luminiscente o a por lo menos un modulador de
la señal de emisión.
La molécula portadora puede ser, por lo tanto, ya
sea una molécula luminiscente aceptora, ya sea una molécula no
luminiscente unida a por lo menos un marcador luminiscente o a por
lo menos un modulador de la señal de emisión.
En lo que sigue de la memoria descriptiva se
emplearán sin distinción los términos de ``molécula'' o
``compuesto'' para cualificar a los marcadores luminiscentes o a
los moduladores unidos a la molécula portadora o al receptor
específico.
En un aspecto ventajoso, la molécula portadora es
ya sea una molécula fluorescente aceptora, ya sea una molécula
fluorescente donante, ya sea una molécula no fluorescente unida a
por lo menos un compuesto fluorescente aceptor, o a por lo menos un
compuesto fluorescente donante.
Ventajosamente, el marcador luminiscente o el
modulador de la señal de emisión, unido a cada uno de los
receptores específicos del o de los péptido(s) o
polipéptido(s) fosforilado(s), puede ser una molécula
fluorescente donante o aceptora.
En un aspecto preferido, la detección y/o la
determinación de la actividad de fosforilación se efectúan por
medición de la señal de emisión que resulta de la transferencia de
energía no radiativa entre la molécula portadora y los marcadores
luminiscentes o los moduladores de la señal de emisión unidos a los
receptores específicos de los péptidos o polipéptidos
fosforilados.
Así, la señal de emisión luminosa que permite la
detección y/o la determinación de la actividad fosforilante
buscada, se puede generar ya sea por transferencia de energía no
radiativa de los marcadores luminiscentes o de los moduladores de
la señal de emisión unidos a los receptores específicos de la
molécula portadora, ya sea inversamente por transferencia de
energía no radiativa de los marcadores luminiscentes o de los
moduladores de la señal de emisión de la molécula portadora a los
marcadores luminiscentes unidos a los receptores específicos.
Por ``transferencia de energía entre la molécula
portadora y las moléculas luminiscentes marcadoras o los
moduladores de la señal de emisión unidos a los receptores
específicos de los péptidos o polipéptidos fosforilados'', se
entienden por lo tanto los 2 tipos de mecanismos señalados
anteriormente.
La transferencia de energía no radiativa, cuyo
principio se describe particularmente en la cita de G. Mathis y
colaboradores, Clin. Chem., 1993, 39, 1953-1959, se
realiza cuando se cumplen las condiciones siguientes:
- por una parte, el compuesto aceptor posee un
espectro de absorción que recubre por lo menos parcialmente el
espectro de emisión del donante y presenta una absorbencia molar
elevada en esta zona de recubrimiento, y un espectro de emisión en
una gama de longitudes de ondas en las que el donante presenta una
emisión intrínseca débil;
- por otra parte, el aceptor y el donante se
sitúan en proximidad uno de otro.
La cantidad de péptidos o de polipéptidos unidos
de manera covalente a la molécula luminiscente portadora puede ser
de aproximadamente 2 a 1.000 por molécula luminiscente
portadora.
Los receptores específicos de los péptidos o
polipéptidos fosforilados pueden escogerse por ejemplo entre los
anticuerpos monoclonales o policlonales.
En un aspecto preferido, el compuesto
luminiscente unido al receptor específico del o de los
péptido(s) o polipéptido(s) fosforilado(s) o a
la molécula portadora, en calidad de marcador luminiscente o de
modulador de la señal de emisión dependiendo del mecanismo de
interacción entre dicha molécula portadora y dicho receptor
específico, es un quelato, un criptato o un complejo macrocíclico
de un ion de un elemento de las tierras raras.
En lo que sigue de la memoria descriptiva, los
términos ``quelato'' y ``criptato'' así como la nomenclatura de los
compuestos macrocíclicos y policíclicos utilizables son tal como se
definen por J.M. Lehn en Struct. Bonding (Berlín), 16, 1, 1973 y en
Acc. Chem. Res. 11, 49 (1979).
Dicho compuesto fluorescente donante es con
preferencia un criptato de un elemento de las tierras raras,
escogido con preferencia entre los criptatos de terbio, de europio,
de samario, de disprosio o de neodimio.
De acuerdo con un aspecto preferido, dicho
criptato de un elemento de las tierras raras está constituido por
al menos una sal de un elemento de las tierras raras, convertida en
complejo por un compuesto macropolicíclico de fórmula
en la que Z es un átomo que tiene 3 ó 4
valencias, R es nada o representa hidrógeno, el grupo hidroxi, un
grupo amino o un radical hidrocarbilo, los radicales bivalentes
(A), (B) y (C) son, independientemente unos de otros, cadenas de
hidrocarbilo que contienen eventualmente uno o varios heteroátomos
y están eventualmente interrumpidas por un heteromacrociclo,
comprendiendo por lo menos unos de los radicales (A), (B) y (C),
además, por lo menos un motivo molecular o estando constituido
esencialmente por un motivo molecular, poseyendo dicho motivo
molecular una energía de triplete superior a la del nivel emisivo
del ion de un elemento de las tierras raras, convertido en
complejo.
Con preferencia, se trata de un criptato de
fórmula (I) anterior en el que el motivo molecular se escoge entre
fenantrolina, antraceno, benceno, naftaleno, bi- y
ter-fenilo, azobenceno, azopiridina, piridina,
bipiridinas, bisquinolinas y los compuestos de las fórmulas
siguientes:
- C_{2}H_{4} - X_{1} - C_{6}H_{4} -
X_{2} - C_{2}H_{4} -
- C_{2}H_{4} - X_{1} - CH_{2} -
C_{6}H_{4} - CH_{2} - X_{2} - C_{2}H_{4} -
X_{1} y X_{2}, que pueden idénticos o
diferentes, designan oxígeno, nitrógeno o azufre,
siendo X oxígeno o
hidrógeno.
En un aspecto ventajoso, el compuesto
fluorescente es un criptato de elemento de las tierras raras
constituido por el ion de terbio o de europio convertido en
complejo por uno de los compuestos macrocíclicos siguientes:
(22)fenantrolina; (22)fenantrolina
amida;
(22)antraceno; (22)antraceno amida;
(22)bi-isoquinolina;
(22)bifenil-bis-piridina;
(22)bipiridina;
(22)bipiridina amida; los macropoliciclos
tris-bipiridina, tris-fenantrolina,
fenantrolina-bis-bipiridina,
bi-isoquinolina-bis-bipiridina,
bis-bipiridina
difenil-bipiridina.
Un compuesto fluorescente particularmente
ventajoso es el criptato de europio Eu tris bipiridina.
Tales compuestos se describen por ejemplo en el
documento de patente europea EP 180.492.
Igualmente, se pueden utilizar compuestos
macrocíclicos que forman complejos con los iones de elementos de
las tierras raras, en los que el motivo molecular se escoge entre
las bipirazinas, las bipirimidinas y los heterociclos nitrogenados
que comprenden grupos de N-óxidos.
Compuestos macrocíclicos con unidades de
bipirazinas se describen en la cita de F.
Bodar-Houillon y colaboradores, New J. Chem., 1996,
20, 1041-1045.
Compuestos macrocíclicos con unidades de
bipirimidinas se describen en la cita de J.M. Lehn y colaboradores,
Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221.
Compuestos macrocíclicos que comprenden
heterociclos nitrogenados que comprenden grupos de N-óxidos, se
describen en la cita de J.M. Lehn y colaboradores, Helv. Chim.
Acta, 1991, 74, 572 y en el documento de patente EP 0.601.113.
El criptato de elemento de las tierras raras, que
se utiliza como compuesto fluorescente donante, puede estar
constituido igualmente por al menos una sal de un elemento de las
tierras raras, que ha sido convertida en complejo por un compuesto
macropolicíclico que responde a una de las fórmulas II ó III
siguientes:
en las
que:
- el ciclo de fórmula
es uno de los ciclos
siguientes:
- Y es un grupo o un brazo de espaciamiento que
está constituido por un radical orgánico bivalente, escogido entre
los grupos alquileno lineales o ramificados de C_{1} a C_{20}
que eventualmente contienen uno o varios dobles enlaces o triples
enlaces, y/o que eventualmente están interrumpidos por uno o varios
heteroátomos tales como oxígeno, nitrógeno, azufre o fósforo, entre
los grupos cicloalquileno de C_{5} a C_{8} o entre los grupos
arileno de C_{6} a C_{14}, estando dichos grupos alquileno,
cicloalquileno o arileno eventualmente sustituidos con grupos
alquilo, arilo o sulfonato;
- Z es un grupo funcional susceptible de unirse
de manera covalente con una sustancia biológica;
- R es un grupo metilo o representa el grupo
-Y-Z;
- R' es hidrógeno o un grupo -COOR`` en el que
R'' es un grupo alquilo de C_{1} a C_{10} y representa con
preferencia el grupo metilo, etilo o terc.-butilo o bien R' es un
grupo
-CO-NH-Y-Z.
Tales compuestos se describen por ejemplo en el
documento de patente EP 321.353.
En el método de acuerdo con el invento, dicho
compuesto fluorescente puede estar unido al receptor específico o
a la molécula portadora ya sea directamente, ya sea por intermedio
de un brazo de espaciamiento.
Este brazo de espaciamiento está constituido por
ejemplo por un radical orgánico bivalente, escogido entre los
grupos alquileno lineales o ramificados de
C_{1}-C_{20}, que eventualmente contienen uno o
varios dobles enlaces y/o están interrumpidos eventualmente por uno
o varios heteroátomos, tales como oxígeno, nitrógeno, azufre o
fósforo; los grupos carbamoílo y carboxamido; los grupos
cicloalquileno de C_{5}-C_{8} y los grupos
arileno de C_{6}-C_{14}, estando dichos grupos
alquileno, cicloalquileno o arileno eventualmente sustituidos con
grupos alquilo, arilo o sulfonato.
En un aspecto preferido, en calidad de compuesto
fluorescente donante unido al receptor específico se utilizará un
criptato de europio y, en calidad de molécula portadora o de
compuesto fluorescente aceptor unido a la molécula portadora,
aloficocianina, aloficocianina B, un derivado de aloficocianina
modificado químicamente, C ficocianina, R ficocianina y
cianinas.
En otro aspecto ventajoso, en calidad de
compuesto fluorescente donante unido al receptor específico se
utilizará un criptato de terbio y en calidad de molécula portadora
o de compuesto fluorescente aceptor unido a la molécula portadora,
se utilizarán rodaminas, tionina, R ficocianina, ficoeritrocianina,
C ficoeritrina, B ficoeritrina, R ficoeritrina y cianinas.
Compuestos fluorescentes utilizables igualmente
como compuestos aceptores son los complejos de ficobiliproteína y
péptido de unión que se describen en el documento de solicitud de
patente internacional WO 96/42016.
De acuerdo con otro de sus aspectos, el invento
concierne igualmente a un estuche para la detección y/o la
determinación de la actividad fosforilante de un material biológico
frente a un substrato que contiene tirosina y/o serina y/o
treonina, caracterizado porque contiene por lo menos una molécula
portadora a la que están fijados de manera covalente una pluralidad
de péptidos o de polipéptidos que contienen tirosina y/o serina y/o
treonina, idénticos o diferentes, y por lo menos un receptor
específico de dichos péptidos o polipéptidos fosforilados, estando
dicho receptor unido a por lo menos un marcador luminiscente o a un
modulador de la señal de emisión.
La molécula portadora es tal como se define más
arriba, es decir que puede ser luminiscente de manera intrínseca o
por unión a por lo menos un marcador luminiscente o un modulador de
la señal de emisión.
Ventajosamente, la molécula portadora y el
marcador luminiscente o el modulador de la señal de emisión unido
al receptor específico de este estuche, son compuestos
fluorescentes.
En un aspecto preferido, el compuesto
luminiscente (marcador luminiscente o modulador de la señal de
emisión) unido al receptor específico, y la molécula portadora, son
respectivamente unos compuestos fluorescentes donante y
aceptor.
El compuesto luminiscente unido al receptor
específico en el estuche de acuerdo con el invento puede ser el
criptato de europio Eu tris-bipiridina o el criptato
de terbio Tb tris-bipiridina.
Ventajosamente, el estuche de acuerdo con el
invento contiene además un medio tamponador apropiado, una fuente
de fosfato no marcado radiológicamente e instrucciones para la
puesta en práctica del método de detección y/o de la determinación
de la actividad fosforilante de un material biológico que se ha
descrito más arriba.
El invento se ilustra por medio del ejemplo que
aparece seguidamente.
El péptido SRC es un substrato de la tirosina
cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico,
denominado igualmente EGF por ``Epidermal Growth Factor''. Éste es
un péptido de 11 aminoácidos que contiene un sólo motivo de
tirosina y que presenta la estructura siguiente:
[H]-Leu-Ile-Glu-Asp-Ala-Glu-Tyr-Ala-Ala-Gly-[OH]
Las abreviaturas utilizadas seguidamente son las
siguientes:
DTT = ditiotreitol
EuTBP = criptato de europio Eu
tris-bipiridina diamina
BSA = albúmina de suero bovino
IgG = inmunoglobulina G
MHS =
maleimidohexanoíl-N-hidroxi-éster
succinimídico
SPDP =
3(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo
Sulfo-SMCC =
sulfo-succinimidil
4-N-(maleimidometil)-ciclohexano.
Se utiliza un derivado de aloficocianina
modificado químicamente (XL_{665}, Cis bio international) cuyo
peso molecular elevado permite su marcación por numerosos
péptidos, cada uno de los cuales posee un sitio de
fosforilación.
A 6 mg de XL_{665} a razón de 3,45 mg/ml en un
tampón de fosfato 100 mM de pH 7,0 se les añade una solución de 80
mM de SPDP en etanol absoluto, en una proporción de 60 moles de
activador por mol de XL_{665}.
Después de 30 minutos de activación a la
temperatura ambiente, se añade una solución de 200 mM de DTT en un
tampón de fosfato 100 mM de pH 7,0 en una proporción de 5 moles de
reductor por cada mol de activador.
Después de 15 minutos a la temperatura ambiente,
los productos de reacción indeseables se eliminan por
cromatografía de exclusión - difusión sobre una columna de gel G25
superfina en un tampón de fosfato 100 mM de pH 6,5, EDTA 5 mM.
El producto se conserva a 4ºC antes del
acoplamiento.
A 4 mg del péptido (2,6 pmoles) se les añade una
solución 220 mM de MHS en acetonitrilo en una proporción de 4 moles
de activador por mol de péptido.
Después de 30 minutos a la temperatura ambiente,
los productos de reacción indeseables se eliminan por
cromatografía de exclusión - difusión sobre una columna de gel
Superdex 30® (PHARMACIA) en un tampón de fosfato 100 mM de pH
7,0.
De una manera similar a la que se ha descrito más
arriba, se hacen reaccionar las funciones de maleimida con las
funciones de tiol fijadas a la XL_{665} en unas proporciones
molares de 100 péptidos por XL_{665}.
Después de incubación durante 18 horas a 40ºC y
de bloqueo de las agrupaciones de tiol (que eventualmente han
quedado libres) con
N-etil-maleimida, el péptido no
acoplado se elimina por cromatografía de exclusión - difusión sobre
una columna TSK 3000 SW (MERCK) en un tampón de fosfato 100 mM de
pH 7,0.
Se obtiene un conjugado que comprende entre 20 y
40 péptidos por molécula XL_{665}.
5 mg de IgG PY20 (Transduction Laboratories) a
razón de 10 mg/ml en un tampón de fosfato 100 mM, de pH 7,0, son
activados por la adición de una solución de SPDP (Pierce, EE.UU.) a
razón de 6,4 mM en dioxano en una relación molar de 7,5 SPDP por
cada IgG PY20.
Después de activación durante 35 min a la
temperatura ambiente, la IgG
piridina-2-tiona se purifica sobre
una columna de G25 superfino en un tampón de fosfato 100 mM, EDTA
5 mM, de pH 6,5.
Las proteínas se concentran y los grupos de
disulfuros de 2-piridilo se reducen mediante una
solución de DTT (Sigma, EE.UU.) que tiene una concentración final
de 19 mM durante 15 min a la temperatura ambiente. El DTT y la
piridina-2-tiona se eliminan por
purificación sobre una columna de G25 superfino en un tampón de
fosfato 100 mM, EDTA 5 mM, de pH 6,5. La concentración en
IgG-SH se determina a 280 nm con
\varepsilon_{280nm} de 210.000 M^{-1}cm^{-1}.
A 5 mg (5 x 10^{-6} moles) de Eu TBP (criptato
de europio Eu tris-bipiridina diamina,
preparado como se ha descrito en el documento de patente EP 321.353,
Ejemplos 3 y 4) se les añade una solución de 25 mM de
sulfo-SMCC, en un tampón fosfato 20 mM,
dimetilformamida al 10% (v/v de pH 7,0) en una proporción de 2,5
moles de activador por cada mol de Eu TBP.
Después de activación durante 45 min a la
temperatura ambiente, el medio de reacción se filtra a 0,8 \mum
con el fin de eliminar el precipitado eventualmente formado. Los
productos de reacción indeseables (sulfo-SMCC,
N-hidroxi-succinimida, ácido
(N-maleimidometil)carboxílico) se eliminan
por cromatografía con intercambio de iones sobre una columna Mono Q
(Pharmacia, Suecia) en un tampón fosfato 20 mM, dimetilformamida al
10% (v/v), de pH 7,0, mediando choque con NaCl. La concentración en
Eu TBP maleimida se determina a 307 nm con \varepsilon_{307nm} de
25.000 M^{-1}cm^{-1} así como con la relación
A_{307nm}/A_{280nm}.
De manera similar a la descrita más arriba, se
hacen reaccionar las funciones de maleimida con las funciones de
tiol fijadas sobre el anticuerpo, en unas proporciones molares que
varían de 10 a 30 Eu TBP maleimida por cada IgG
PY20-SH.
Después de incubación durante 18 horas a 4ºC y
bloqueo de las agrupaciones de tioles (que eventualmente han quedado
libres) por N-etil-maleimida, el Eu
TBP no acoplado se elimina por diálisis en un tampón de fosfato 100
mM de pH 7,0 a 4ºC hasta el agotamiento (más fluorescencia en los
baños de diálisis).
Las características del conjugado se determinan
por sus absorciones a 307 nm y a 280 nm utilizando los valores
siguientes teniendo en cuenta la absorción propia del criptato
determinada por la relación A_{307nm}/A_{280nm}.
Eu TBP-maleimida:
\varepsilon_{307nm} = 25.000
M^{-1}cm^{-1}
A_{307nm}/A_{280nm} = determinado
experimentalmente.
IgG PY20-SH:
\varepsilon_{280nm} = 210.000
M^{-1}cm^{-1}
Células A431 (SIGMA) que contiene un receptor del
EGF, son activadas previamente durante 10 min a la temperatura
ambiente por medio del EGF. El tampón de fosforilación es un tampón
de TRIS/MES 60 mM, de pH 7,4, que contiene 30 \muM de ATP, 50 mM
de Mg^{++} y 10 mM de Mn^{++}.
Se añaden sucesivamente en los pocillos de
``ensayo'' de una microplaca de 96 pocillos:
- 10 \mul de células A431 previamente
activadas,
- 10 \mul de un conjugado de XL_{665} -
péptidos SRC,
- 30 \mul de un tampón de fosforilación.
En los pocillos ``blancos'' que sirven como
testigos, se introducen 10 \mul de un conjugado de XL_{665} -
péptidos y 40 \mul de un tampón de fosforilación. Se incuba a
continuación durante 30 min a la temperatura ambiente.
Se añaden sucesivamente a cada pocillo de la
microplaca:
- 50 \mul de un
anticuerpo/anti-fosfotirosina marcado con criptato
de Eu tris-bipiridina
- 100 \mul de un tampón de fosfato 0,1 M; de pH
7; KF 0,4 M; BSA 0,1%.
Después de incubación durante 30 min a la
temperatura ambiente, la lectura de la fluorescencia se efectúa a
620 nm y a 665 nm con la ayuda de un fluorímetro con láser
prototipo, descrito seguidamente:
Un láser pulsado con nitrógeno (LASER SCIENCE
INC., modelo LS1-337ND) se utiliza como fuente de
excitación (longitud de onda a 337,1 nm). La duración de las
pulsaciones se especifica en 3 nanosegundos y se repite bajo una
frecuencia de 10 Hercios. El haz pasa a través de un filtro (de
CORNING) con el fin de eliminar cualquier luz parásita con una
excitación distinta de 337 nm.
Después de haber vuelto a entrar en la cámara de
medición, el haz es reflejado por un filtro dicroico, colocado a 45
grados, que tiene la propiedad de reflejar los ultravioletas y de
poder transmitir la luz visible.
El haz reflejado por el filtro dicroico es
enfocado sobre el pocillo para medición de una microplaca, por una
lente de sílice fundido. La emisión de fluorescencia se recoge de
acuerdo con un ángulo sólido de 20 grados, colimatado por la misma
lente, y pasa directamente a través del filtro dicroico
(fluorescencia en luz visible).
Un filtro de interferencia de características
definidas dependiendo de la longitud de onda de fluorescencia que
se ha de detectar, permite desembarazarse de las luces que pueden
parasitizar a la señal, cuya intensidad se mide seguidamente por un
fotomultiplicador (HAMAMATSU R2949).
El contador de fotones que se utiliza es un
SR-400 (STANFORD RESEARCH SYSTEMS), cuyas
operaciones y cuya sincronización con el láser se controlan mediante
un ordenador del tipo IBM PC-AT a través de una
salida RS 232. Las pulsaciones que provienen del fotomultiplicador
se registran durante una ventana de tiempo (t_{g}) y después de un
retraso (t_{d}) determinado/a, a condición de que sean superiores
a un nivel discriminante seleccionado por el contador de fotones con
el fin de optimizar la relación de señal a ruido del
fotomultiplicador.
Una tabla X-Y, pilotada por el
IBM PC-AT, permite las diferentes colocaciones de la
microplaca de medición mediante motores de paso a paso, que incluyen
las maniobras de carga, de colocación bajo el haz excitador, de
lectura automática en secuencia de los 96 pocillos, y de salida.
La fluorescencia emitida por el conjugado de
XL_{665} -péptidos SRC se mide con la ayuda del fluorímetro
prototipo equipado con un filtro a 665 nm con una anchura de 10 nm a
mitad de la altura, durante 400 \mus (microsegundos) y con un
retraso de 50 \mus.
Los resultados se representan en el gráfico de la
figura 1, en el que el eje de las ordenadas da el grado de
fosforilación y el eje de las abscisas da la concentración de
conjugado XL_{665 }- péptidos SRC.
El grado de fosforilación se expresa por la
variable DR = R_{muestra}-R_{blanco}, siendo
R la relación de las señales de emisión a 665 nm y a 620
nm.
La concentración de conjugado de XL_{665} -
péptidos SRC se expresa en nM de XL_{665}.
Los resultados muestran que el aumento del grado
de fosforilación se correlaciona con el aumento de la concentración
de conjugado de XL_{665} - péptidos SRC.
Claims (21)
1. Método homogéneo para la detección y/o la
determinación de la actividad fosforilante de un material biológico
con respecto a un substrato que contiene tirosina y/o serina y/o
treonina, caracterizado porque dicho material biológico se
pone en contacto con una pluralidad de péptidos o de polipéptidos
que contienen tirosina y/o serina y/o treonina, idénticos o
diferentes, unidos de manera covalente a una molécula portadora, en
presencia de una fuente de fosfato no marcado radiológicamente y de
los receptores específicos de dichos péptidos o polipéptidos
fosforilados, y porque la detección y/o la determinación de la
actividad fosforilante se efectúan por medición de una señal de
emisión, resultando dicha señal de emisión de una interacción entre
dicha molécula portadora constituida por una molécula luminiscente o
una molécula no luminiscente unida a por lo menos un marcador
luminiscente o un modulador de la señal de emisión y dichos
receptores específicos unidos a por lo menos un marcador
luminiscente o un modulador de la señal de emisión.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la detección y/o la determinación de la
actividad fosforilante se efectúan por medición de la señal de
emisión que resulta de la transferencia de energía entre los
marcadores luminiscentes o los moduladores de la señal de emisión
unidos a los receptores específicos de los péptidos o polipéptidos
fosforilados y la molécula portadora.
3. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la molécula
portadora luminiscente es una molécula fluorescente o una molécula
no fluorescente unida a por lo menos un marcador fluorescente o a
por lo menos un modulador de la señal de emisión.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el marcador
luminiscente o el modulador de la señal de emisión unido al receptor
específico es un compuesto fluorescente.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el receptor
específico está unido a un compuesto fluorescente donante y la
molécula portadora es una molécula fluorescente aceptora o está
unida a un compuesto fluorescente aceptor.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el receptor
específico está unido a un compuesto fluorescente aceptor y la
molécula portadora luminiscente es una molécula fluorescente donante
o está unida a un compuesto fluorescente donante.
7. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la cantidad de
péptidos o polipéptidos unidos de manera covalente a la molécula
portadora luminiscente es de 2 a 1.000.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el receptor
específico está unido a un quelato, un criptato o un complejo
macrocíclico de un ion de un elemento de las tierras raras.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 8,
caracterizado porque el receptor específico está unido a un
quelato, un criptato o un complejo macrocíclico de europio, de
terbio, de disprosio, de samario o de neodimio.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 9,
caracterizado porque el receptor específico está unido a un
criptato de un elemento de las tierras raras, constituido por al
menos una sal de un elemento de las tierras raras convertida en
complejo por un compuesto macropolicíclico de fórmula
en la que Z es un átomo que tiene 3 ó 4
valencias, R es nada o representa hidrógeno, el grupo
hidroxi, un grupo amino o un radical hidrocarbilo, los radicales
bivalentes (A), (B) y (C) son, independientemente unos de otros,
cadenas de hidrocarbilo que contienen eventualmente uno o varios
heteroátomos y están eventualmente interrumpidas por un
heteromacrociclo, comprendiendo por lo menos unos de los radicales
(A), (B) y (C), además, por lo menos un motivo molecular o estando
constituido esencialmente por un motivo molecular, poseyendo dicho
motivo molecular una energía de triplete superior a la del nivel
emisivo del ion de un elemento de las tierras raras, convertido en
complejo.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 10,
caracterizado porque el compuesto fluorescente unido al
receptor específico es un criptato de un elemento de las tierras
raras constituido por el ion de terbio o europio convertido en
complejo por uno de los compuestos macrocíclicos siguientes:
(22)fenantrolina; (22)fenantrolina
amida;
(22)antraceno; (22)antraceno amida;
(22)bi-isoquinolina;
(22)bifenil-bis-piridina;
(22)bipiridina;
(22)bipiridina amida; los macropoliciclos
tris-bipiridina, tris-fenantrolina,
fenantrolina-bis-bipiridina,
bi-isoquinolina-bis-bipiridina,
bis-bipiridina
difenil-bipiridina.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizado porque dicho compuesto fluorescente es el
criptato de europio Eu tris-bipiridina.
13. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se utiliza un
criptato de europio en calidad de compuesto fluorescente donante
unido al receptor específico y, en calidad de molécula portadora o
de compuesto fluorescente aceptor unido a la molécula portadora,
aloficocianina, aloficocianina B, derivados de aloficocianina
modificados químicamente, C ficocianina, R ficocianina y
cianinas.
14. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se utiliza un
criptato de terbio en calidad de compuesto fluorescente donante
unido al receptor específico y, en calidad de molécula portadora o
de compuesto fluorescente aceptor unido a la molécula portadora,
rodaminas, tionina, R ficocianina, ficoeritrocianina, C
ficoeritrina, B ficoeritrina, R ficoeritrina y cianinas.
15. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el compuesto
fluorescente donante unido al receptor específico es el criptato de
europio Eu tris-bipiridina o el criptato de terbio
Tb tris-bipiridina.
16. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque los receptores
específicos se escogen entre los anticuerpos policlonales y
monoclonales.
17. Estuche para la detección y/o la
determinación de la actividad fosforilante de un material biológico
frente a un substrato que contiene tirosina y/o serina y/o treonina,
caracterizado porque contiene por lo menos una molécula
portadora constituida por una molécula luminiscente o una molécula
no luminiscente unida a por lo menos un marcador luminiscente o un
modulador de la señal de emisión, a la que están fijados de manera
covalente una pluralidad de péptidos o de polipéptidos que contienen
tirosina y/o serina y/o treonina, idénticos o diferentes, y por lo
menos un receptor específico de dichos péptidos o polipéptidos
fosforilados, estando dicho receptor unido a por lo menos un
marcador o un modulador de la señal de emisión.
18. Estuche de acuerdo con la reivindicación 17,
caracterizado porque la molécula portadora y la molécula
luminiscente marcadora del receptor específico son unas moléculas
fluorescentes.
19. Estuche de acuerdo con la reivindicación 18,
caracterizado porque el marcador luminiscente o el modulador
de la señal de emisión unido al receptor específico y la molécula
portadora son respectivamente unas moléculas fluorescentes donante y
aceptora.
20. Estuche de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque el compuesto
luminiscente unido al receptor específico es el criptato de europio
Eu tris-bipiridina o el criptato de terbio Tb
tris-bipiridina.
21. Estuche de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque contiene
igualmente un medio tampón apropiado, una fuente de fosfato no
marcada radiológicamente, e instrucciones para la puesta en práctica
del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
16.
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