ES2198780T3 - Un metodo para administrar adn in vivo usando un aparato sin agujas. - Google Patents

Abstract

La utilización de una solución que comprende una molécula de ADN no infecciosa capaz de expresarse en un vertebrado, un antígeno que es (a) específico de un microorganismo capaz de inducir una infección en un vertebrado o (b) asociado a un tumor, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de una infección o de una afección tumoral, que está previsto para ser entregado exclusivamente en la piel del vertebrado a fin de inducir contra el antígeno una respuesta inmune Th1/Th2 equilibrada; realizándose la entrega de dicho medicamento utilizando un aparato sin aguja que incorpora medios de presión que permiten propulsar el medicamento y cuya fuerza de presión está ajustada a fin de entregar el medicamento exclusivamente en la piel.

Description

Un método para administrar adn in vivo usando un aparato sin aguas.

La invención se refiere a un procedimiento de entrega de una molécula de ADN in vivo. Tal procedimiento tiene diversas aplicaciones, por ejemplo, vacunación, inmunoterapia del cáncer y terapia génica.

Está bien establecido actualmente que pueden entregarse in vivo a vertebrados moléculas de ADN no infecciosas tales como plásmidos, por ejemplo, a los tejidos y/o los órganos de mamífero y, como consecuencia de esto, las proteínas codificadas por las secuencias unidas de manera operacional a un promotor conveniente que están presentes en estas moléculas de ADN son expresadas bien localmente o bien en otra parte en el cuerpo del mamífero. La entrega puede realizarse utilizando diferentes vías de administración y la elección depende del fin perseguido; en efecto, la entrega de ADN in vivo posee aplicaciones extensas en varios dominios.

Más particularmente, se sabe igualmente que un vertebrado, por ejemplo, un mamífero, puede desarrollar una respuesta inmunitaria frente a una proteína antígena expresada en la entrega de ADN y que la respuesta inmunitaria puede ser protectora. Para inducir una respuesta inmunitaria frente a un antígeno particular, la molécula de ADN que codifica este antígeno se administra típicamente en la piel o los músculos, como se describe en la Patente de los EE.UU. nº 5.580.859. La elección de la vía de administración depende de un cierto número de criterios, entre ellos por ejemplo el tipo de respuesta inmunitaria buscada. En efecto, la respuesta inmunitaria puede no ser necesariamente idéntica por una u otra de las vías intramuscular, intraepidérmica e intradérmica. Además, ciertos inmunógenos pueden inducir una respuesta inmunitaria protectora por una vía únicamente. La entrega de ADN en la piel o los músculos puede utilizarse igualmente en terapia génica, de manera que una proteína terapéutica sea expresada en estos tejidos.

La administración puede realizarse utilizando una jeringa o un aparato sin aguja. Son conocidos en la técnica aparatos sin aguja. Algunos de ellos están concebidos para dirigirse a la capa de tejido subcutáneo de la piel con una dosis vaccínea líquida, por ejemplo, el sistema de inyección Imojet®/Imule® (Pasteur Merieux Connaught) cuya utilización se describe, por ejemplo, en la patente de Châtelet et al., Vaccine (1997) 15: 449. Otros son útiles para dirigirse a la piel humana, por ejemplo, el inyector Mesoflash® descrito en el documento FR 2.641.190 y fabricado para ser utilizado en mesoterapia por PROLITEC, calle Gustave Gresse 26400 Aouste sur Sye, Francia (correo electrónico: PROLITEC@Compuserve.com). En 1998, el nombre comercial ``Mesoflash'' se ha cambiado a Isajet®.

Los inyectores de chorro tales como Ped-O-Jet® (Furth et al., Anal.Biochem. (1992) 205: 365), un dermochorro de poca fuerza (Furth et al., Hybridoma (1995) 14: 149) y el Med-E-Jet® (Vahlsing et al., J. Immunol. Meth. (1994) 174: 11) se han utilizado con éxito en varios ensayos de transferencia de genes, entre ellos una experiencia de inmunización con ADN (Vahlsing et al.,). Sin embargo, ninguno de estos estudios pretendía utilizar tales dispositivos para la administración de ADN principalmente en la piel. Vahlsing et al., indican la administración por vía intramuscular, mientras que Furth et al. citan inyecciones cutánea y muscular combinadas.

Hasta el presente, las vacunas de ADN no infeccioso se han entregado en la piel utilizando (i) un dispositivo de inyección (llamado ``pistola de genes'') que está adaptado para propulsar directamente en las células de la dermis o la epidermis un polvo que contiene ADN depositado sobre micropartículas de oro o wolframio (se describe un dispositivo tal en las Patentes de los EE.UU. nº 4.945.050 y 5.015.580 y en el documento WO 94/24263); o (ii) una jeringa llena de solución de ADN. El principal razonamiento para la pistola de genes, que bombardea las células con partículas de oro revestidas con ADN, es que supera las barreras de las membranas y permite la entrega intracelular directa de ADN en las células de la piel, entre ellas las células de Langerhans que son CPA poderosas (Condon et al., Nature Med. (1996) 2: 1122). Se ha considerado hasta ahora que la pistola de genes tiene capacidades de entrega superiores y da una inmunización intradérmica apropiada. La obtención de resultados análogos con una inyección menos sofisticada de ADN en solución es muy sorprendente porque las membranas plásmicas constituyen barreras apretadas para las moléculas de ADN entregadas por vía extracelular.

En efecto, se ha encontrado ahora que una solución de ADN no infeccioso puede entregarse igualmente de manera eficaz en la piel utilizando un dispositivo sin aguja. Este procedimiento palia los inconvenientes asociados con la utilización de una jeringa y está particularmente adaptado, por ejemplo, a campañas de vacunación por ADN a gran escala. Como consecuencia, la invención prevé la utilización, según la reivindicación 1ª, de una solución que comprende una molécula de ADN no infecciosa, capaz de expresar en un vertebrado, por ejemplo, un mamífero, una proteína fisiológicamente activa, para la fabricación de un medicamento destinado a entregarse exclusivamente en la piel de un vertebrado utilizando un aparato sin aguja adaptado a este efecto.

Por ``molécula de ADN no infecciosa'' se entiende una molécula de ADN incapaz de replicarse en vertebrados, por ejemplo mamíferos, y/o incapaz de integrarse en el vertebrado, por ejemplo, el genoma de mamífero. Preferiblemente, la molécula de ADN es un plásmido. Típicamente, la molécula de ADN comprende una secuencia que codifica la proteína buscada (polipéptido es otra palabra para proteína) que está unida de manera operacional a un promotor (situada bajo control de un promotor) adaptado a la expresión en un vertebrado, por ejemplo, una célula de mamífero. El promotor puede funcionar de manera ubicua o puede ser específico de las células intradérmicas. Los ejemplos de promotores no específicos de tejido incluyen el promotor temprano de Citomegalovirus (CMV) (descrito en la Patente de los EE.UU. nº 4.168.062) y el promotor del virus de sarcoma de Rous (descrito en Norton & Coffin, Mol. Cell Biol. (1985) 5: 281). Más generalmente, se describen vectores útiles, entre otros, en el documento WO 94/21797 y Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7: 1205. Los promotores específicos de células de la piel incluyen el promotor de queratina (Lersch et al. Mol. Cell Biol. (1989) 9: 3685 y Leask et al., Genes Dev. 4: 1985) y el promotor de CD11c (López-Cabrera et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 1187), siendo específico este último de células dendríticas, entre otras las células de Langerhans de la piel.

Pueden utilizarse las técnicas estándares de la biología molecular para la preparación y purificación de ADN en la preparación de moléculas de ADN destinadas a ser utilizadas en la invención. En la preparación soluble, las moléculas de ADN pueden formularse según diferentes procedimientos.

En primer lugar, puede utilizarse un polinucleótido en forma descubierta, desprovisto de cualquier vehículo de entrega tal como liposomas aniónicos, lípidos catiónicos, micropartículas, por ejemplo, micropartículas de oro, agentes de precipitación, por ejemplo, fosfato cálcico, o cualquier otro agente que facilite la transfección. En este caso, el polinucleótido puede estar simplemente diluido en una solución aceptable fisiológicamente, tal como suero fisiológico estéril o suero fisiológico tamponado estéril, preferiblemente isotónico, escasamente hipertónico o hipertónico, y que presente una fuerza iónica relativamente débil, como la provista por una solución de sacarosa, por ejemplo, una solución que contenga 20% de sacarosa.

De manera alternativa, puede asociarse un polinucleótido a agentes que favorezcan la captura nuclear. Puede estar entre otros encapsulado en liposomas, o asociado con lípidos catiónicos. Los liposomas aniónicos y neutros son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990), para una descripción detallada de los procedimientos de fabricación de liposomas) y son útiles para entregar una gran gama de productos, entre ellos polinucleótidos. Los lípidos catiónicos son igualmente conocidos en la técnica y se utilizan comúnmente para la entrega de genes. Tales lípidos incluyen DOTMA (cloruro de N[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio), DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano), DDAB (bromuro de dimetildioctadecilamonio), DOGS (dioctadecilamidologlicilespermina) y derivados de colesterol tales como DC-col (3-beta-(N-(N',N'-dimetilaminometano)carbamoil)colesterol). Se puede encontrar una descripción de estos lípidos catiónicos en los documentos EP 187.702, WO 90/11092, la Patente de los EE.UU. nº 5.283.185, los documentos WO 91/15501, WO 95/26356 y la Patente de los EE.UU. nº 5.527.928. Los lípidos catiónicos destinados a la entrega de genes se utilizan preferiblemente en asociación con un lípido neutro tal como DOPE (dioeleilfosfatidiletanolamina) como se describe, por ejemplo, en el documento WO 90/11092. Por ejemplo, el reactivo de transfección comercial Lipofectin® es una mezcla de DOTMA/DOPE.

Pueden añadirse otros compuestos que facilitan la transfección a una formulación que contenga liposomas catiónicos. Se describe un cierto número de ellos en, por ejemplo, los documentos WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 y WO 95/2397. Incluyen entre otros derivados de espermina útiles para facilitar el transporte de ADN a través de la membrana nuclear (ver por ejemplo el documento WO 93/18759) y compuestos que permeabilizan la membrana tales como GALA, Gramicidina S y sales biliares catiónicas (ver por ejemplo el documento WO 93/19768). Además, los polímeros catiónicos y los policationes constituyen una gran clase importante de agentes de transfección que pueden utilizarse en la presente invención.

La proteína fisiológicamente activa cuya expresión in vivo se busca puede ser una proteína de mamífero susceptible de tratar un defecto genético, por ejemplo, el factor XIII o IX; o una citoquina. La proteína puede ser igualmente un antígeno que (a) es específico de un microorganismo susceptible de inducir una infección en un mamífero o (b) está asociado a tumores, con la intención de tratar o prevenir una infección o un trastorno tumoral. El microorganismo puede ser, por ejemplo, un virus, una bacteria, un hongo o un parásito.

Un ejemplo de antígeno asociado a tumores es el producto del gen supresor de tumor p53. Se trata de un antígeno interesante para inmunoterapia del cáncer porque se expresa en niveles muy bajos en células normales, pero está sobreexpresado en aproximadamente el 50% de todos los cánceres humanos en razón de las mutaciones de falso sentido que aumentan significativamente la vida media de la proteína. Se ha encontrado ahora que la inmunización de ratones con un plásmido que codifica p53 natural humano induce una protección total contra una prueba con un fibroblasto de ratón transfectado con p53 mutante humano y una protección parcial, pero significativa, contra un mastocitoma transfectado. Más generalmente, la invención considera la utilización de una molécula de ADN que codifica p53 natural o mutante, de longitud total o de fragmentos, y preferiblemente de origen humano.

La cantidad de ADN por dosis a administrar a un receptor depende, por ejemplo, de la fuerza del promotor utilizado en la construcción de ADN, de la actividad biológica del producto de gen expresado, del estado del mamífero previsto para la administración (por ejemplo, peso, edad y estado de salud general del mamífero), del modo de administración y del tipo de formulación. En general, se puede administrar a adultos humanos una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz de alrededor de 10 \mug a aproximadamente 1 mg, preferiblemente de alrededor de 100 \mug a aproximadamente 1 mg y más preferiblemente de alrededor de 250 \mug a aproximadamente 800 \mug. La administración puede realizarse en dosis unitaria o repetida a intervalos. El ADN debe administrarse a una cualquiera de las capas de la piel, entre ellas la epidermis y la dermis. La administración se realiza estrictamente por vía intraepidérmica o intradérmica, entregándose trazas de ADN o incluso nada de ADN en el exterior de la piel (por ejemplo, en las grasas, los músculos o la capa subcutánea).

Para una utilización en la presente invención, se puede utilizar un dispositivo sin aguja, entre otros uno cualquiera de los ya disponibles a condición de ajustarles para administrar una solución esencialmente en la piel. Preferiblemente, no raspa la piel y la solución se propulsa en la piel gracias a una fuente de energía mecánica, por ejemplo, un gas o un resorte. Por ejemplo, se puede utilizar el aparato Mesoflash® M40 (llamado ahora ISA40®) para la administración por vía intradérmica a los primates, es decir al mono y al hombre, mientras que el modelo M10 (llamado ahora ISA10®) se utilizará en el ratón y los animales vertebrados pequeños. En los inyectores sin aguja, una fuerza de presión actúa habitualmente como medio de propulsión de la solución. Para dirigirse a la piel, la fuerza de presión puede regularse de diferentes maneras según las características particulares del dispositivo utilizado.

Se ha encontrado igualmente que el hecho de cambiar la vía y el modo de administración de vacunas de ADN puede afectar a la naturaleza de la respuesta inmunitaria inducida. En efecto, se ha indicado que los anticuerpos, entre otros los anticuerpos anti-hemaglutinina inducidos por ADN inyectado por vía intramuscular (IM) eran mayoritariamente del isótopo IgG2a, con proporciones relativamente más pequeñas de anticuerpos IgG1, lo que sugiere que se ha engendrado una respuesta en células T auxiliares Th1 (Deck et al., Vaccine (1997) 15: 71). Estos resultados se han confirmado ahora y se ha indicado además que la inmunización por chorro intradérmico (ID) induce proporciones de IgG1 más elevadas y así un equilibrio mayor con relación a la inmunización por vía IM. Cuando la administración de vacuna de HA-ADN en la piel se realiza utilizando una pistola de genes, los anticuerpos inducidos son principalmente del subtipo IgG1 y el equilibrio isotípico está en gran medida a favor de una respuesta en células T auxiliares Th2 predominantes (Feltquate et al., J. Immunol. (1997) 158: 2278). Esto es por lo que la presente invención está particularmente adaptada cuando se busca una respuesta inmunitaria del tipo auxiliar Th1/Th2 equilibrada.

La respuesta en Th1 con relación a la respuesta en Th2 puede estimarse comparando por ejemplo las proporciones de IgG2a y de IgG1 inducidas en el ratón, que son reveladoras respectivamente del empleo de las respuestas en Th1 y Th2. En efecto, la respuesta en Th1 que se busca está acompañada generalmente de una respuesta en Th2. Sin embargo, se considera que la respuesta en Th2 no debe ser significativamente predominante con relación a la respuesta en Th1. Las proporciones de IgG2a y de IgG1 inducidas en el ratón pueden estimarse de manera clásica utilizando un ensayo ELISA, con la condición de que los ensayos utilizados para cada uno de los dos subisótopos sean de la misma sensibilidad y en particular que los anticuerpos anti-IgG2 y anti-IgG1 sean de la misma afinidad.

Las cantidades de IgG2a y de IgG1 pueden medirse en particular utilizando un ensayo ELISA que es idéntico o análogo al descrito seguidamente. Se revisten los pocillos de una placa ELISA de policarbonato con 100 \mul de un antígeno apropiado, de aproximadamente 10 \mug/ml en tampón carbonato. La placa ELISA se incuba durante 2 horas a 37ºC y después durante una noche a 4ºC. La placa se lava con tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contiene 0,05% de Tween 20 (tampón PBS/Tween). Se saturan los pocillos con 250 \mul de PBS que contiene 1% de albúmina de suero de bovino de manera que se impida el enlace no específico de anticuerpos. Después de incubar durante una hora a 37ºC, se lava la placa con tampón PBS/Tween. El anti-suero recuperado de ratón, un cierto número de días después de que este último ha recibido la composición destinada a inducir una respuesta inmunitaria de tipo Th1, se diluye en serie en tampón PBS/Tween. Se añaden al pocillo 100 \mul de la dilución. La placa se incuba durante 90 minutos a 37ºC, se lava y evalúa según los procedimientos estándares. Se utiliza por ejemplo un anticuerpo de cabra anti-IgG2a o IgG1 de ratón, acoplado a una enzima tal como peroxidasa. Se prosigue la incubación en presencia de este anticuerpo durante 90 minutos a 37ºC. Se lava la placa, se revela después la reacción con el sustrato apropiado (por ejemplo, diclorhidrato de O-fenildiamina cuando la enzima utilizada es peroxidasa). Se evalúa la reacción por colorimetría (midiendo la absorbancia por espectrofotometría). El título de IgG2a o IgG1 del antisuero corresponde a la inversa de la dilución, dando una absorbancia de 1,5 a 490 nm.

La inducción de una respuesta en Th1 útil en el sentido de la presente invención es marcada por la relación de los títulos IgG2a:IgG1 en ELISA en el razón que debe ser del orden de 1. Cuando esta relación es del orden de 1, se dice que la respuesta en Th1/Th2 es mixta o equilibrada. Cuando la relación es superior o igual a 5, se dice entonces que la respuesta en Th1 es preponderante.

La producción de una respuesta en Th1 (o en Th2) en el ratón es reveladora de una respuesta en Th1 (o en Th2) en el hombre. Aunque sea más fácil evaluar el tipo de respuesta en el ratón, se puede hacer igualmente en el hombre midiendo las proporciones de las citoquinas específicas de la respuesta en Th1 por una parte y, por otra parte, de la respuesta en Th2, que son inducidas ulteriormente. Las respuestas en Th1 y en Th2 pueden evaluarse directamente en el hombre, una con relación a la otra, sobre la base de las proporciones de las citoquinas específicas de los dos tipos de respuesta sobre la base de la relación IFN-\gamma/IL-4.

La invención se ilustra seguidamente en referencia a las figuras siguientes:

Las Figuras 1A y 1B muestran la respuesta en CTL anti-p53 inducida por la administración intradérmica de ADN. Los ratones se inmunizaron por vía intradérmica a las 0, 3 y 6 semanas con pC53-SN_{3}, o el plásmido testigo, pUCneo (A), o por vía intramuscular a las 0, 3 y 6 semanas con pMP1406hup53, o un vector pVec, desprovisto del gen p53. Se midió la respuesta en CTL anti-p53 2 semanas después de la última inmunización en esplenocitos estimulados dos veces in vitro con esplenocitos simples infectados con vCP207 (A), o estimulados una vez in vitro con esplenocitos simples infectados con vP1101 (B). Se midió la lisis contra p815 y 2E4. Los valores en (A) son la media de dos grupos de dos ratones con desviaciones típicas representadas por las barras de error, mientras que los en (B) son de un solo grupo de dos ratones.

En la Figura 1A: - - corresponde a pC53-SN_{3} 1 \mug/2E4; - - corresponde a pC53-SN_{3} 10 \mug/2E4; - - corresponde a pC53-SN_{3} 100 \mug/2E4; - - corresponde a pUC 100 \mug/2E4; y - - corresponde a pC53-SN_{3} 100 \mug/p815.

En la Figura 1B: - - corresponde a pMPhup53/2E4; - - corresponde a pMPhup53/P815; - - corresponde a pVec/2E4; y - - corresponde a pVec/P815.

Las Figuras 2A a 2D muestran la protección contra una prueba tras la inmunización con pCP207 o pC53-SN_{3}. Los ratones (nueve por grupo) se inmunizaron a las 0, 3 y 6 semanas con 10^{7} TCID50 de vCP207 o ALVAC por vía intravenosa (A, B y D), o 100 \mug de pC53-SN_{3} o pUCneo por vía intradérmica (C y D) o con PBS. Se probaron los ratones por vía subcutánea 2 semanas después de la última inyección mediante 10^{7} células del clon 2 - 21 (A y C), 10^{7} células de BALB/3T12-3 no transfectadas (B) o 10^{4} células del clon 4D5 (D). Se utilizaron ratones BALB/c en (A, B y C) y ratones DBA/2 en (D).

En la Figura 2A: - - corresponde a solución salina tamponada con fosfato (PBS); - - corresponde a ALVAC; y - - corresponde a vCP207.

En la Figura 2B: - - corresponde a PBS; - - corresponde a ALVAC; y - - corresponde a vCP207.

En la Figura 2C: - - corresponde a PBS; -\triangle- corresponde a pUCneo; y - - corresponde a pC53-SN_{3}.

En la Figura 2D: - - corresponde a PBS; - - corresponde a ALVAC; - - corresponde a vCP207; -\triangle- corresponde a pUCneo; y - - corresponde a pC53-SN_{3}.

La Figura 3 muestra la comparación de las respuestas en anticuerpos en el ratón BALB/c después de inmunizar mediante chorro IM o ID (Mesoflash® M10) con pV1JHA. Se inmunizaron ratones BALB/c hembras (6 por grupo) tres veces (las semanas 0, 3 y 6) con 10 \mug de plásmido pV1JHA que codifica hemaglutinina del virus de la gripe A/PR8/34. Las inmunizaciones se realizaron inyectando el plásmido en 50 \mul de tampón Hepes 20 mM, pH 7,2, por vía IM en los cuadriceps izquierdos o inyectando el plásmido en 100 \mul del mismo tampón por vía ID utilizando el inyector Mesoflash® M10 (ver el Ejemplo 2A). Se midieron las inmunoglobilinas anti-influenza a las semanas 0 (preinmunes), 3, 6, 10, 12, 16 y 20 en los sueros de los ratones inmunizados por titulación ELISA comenzando con una dilución 1:25 de los sueros. Los títulos en anticuerpos están representados en función del tiempo en forma de media geométrica de los títulos en Ig a punto final sobre una escala de log2.

Las Figuras 4A y 4B muestran la comparación de los subtipos de anticuerpos en ratones BALB/c después de inmunizar por vía IM o ID con pV1JHA. Se titularon las muestras de suero para los isótopos de IgG1 e IgG2 específicos por ELISA contra el virus A/PR/8/34 (ver el Ejemplo 2A). Los títulos en anticuerpos están representados en función del tiempo en forma de media geométrica de los títulos en IgG1 (Fig. 4A) y en IgG2a (Fig. 4B) a punto final sobre una escala de log2.

La Figura 5 muestra los anticuerpos HI generados por la vacuna de ADN del plásmido pV1JHA en el ratón BALB/c. Se dosificaron muestras de suero tomadas las semanas 0 (preinmunes), 3, 6, 12 y 20 para los títulos en anticuerpos HI como se describe en el Ejemplo 2A comenzando con una dilución 1:10 de los sueros. Los títulos en HI a punto final para cada animal individual están representados en función del tiempo. Los ratones inmunizados por vía IM están representados por los símbolos abiertos, y los ratones inmunizados por vía ID están representados por los símbolos cerrados.

Las Figuras 6A y 6B muestran la respuesta en linfocitos T citotóxicos generada por la vacuna de ADN del plásmido pV1JHA en el ratón BALB/c. Al final del estudio (semana 20), se sacrificaron los ratones y se tomaron los bazos para ensayar la presencia de CTL específicos de HA en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas (ver el Ejemplo 2A). Las células objetivo P815 se impulsaron con el epítope CTL del péptido HA de la influenza A/PR/8/34 (\triangle, ``objetivo HA'' para la medida de lisis específica) o con el epítope CTL del péptido NP ( , ``objetivo NP'' para la medida de lisis no específica). Los objetivos P815 no impulsados ( , ``objetivos vacíos'') se utilizaron como testigos negativos suplementarios en esta dosificación para confirmar la ausencia de lisis no específica. El porcentaje de lisis de célula objetivo se presenta en función de la relación de células efectoras sobre células objetivo (relación E:T) para un ratón representativo en el grupo IM (Fig. 6A) y para un ratón representativo del grupo ID (Fig. 6B).

La Figura 7 muestra la comparación de las respuestas en anticuerpos en macacos cinomorfos después de inmunizar con chorro IM o ID (Mesoflash® M40) con pV1JHA. Los macacos cinomorfos (2 machos y 2 hembras por grupo) se inmunizaron tres veces (las semanas 0, 6 y 19) por vía IM en los músculos de los cuadriceps con 50 \mug de plásmido pV1JHA en 500 \mul de NaCl al 9\textperthousand o por vía ID en la piel del muslo rasurada con 10, 50 o 250 \mug de plásmido pV1JHA en 100 \mul de NaCl al 9\textperthousand con ayuda del inyector Mesoflash® M40 (ver Ejemplo 3A). Se siguieron en función del tiempo los títulos en anticuerpo específico anti-HA (las inmunoglobulinas específicas totales) (0-preinmunes, 2, 4, 6, 10, 12, 16 y 24 semanas) por titulación ELISA como se ha descrito en el Ejemplo 2A comenzando con una dilución 1:25 de los sueros. Para cada régimen de inmunización (\triangle, 50 \mug IM; \medcirc, 10 \mug ID; \blacktriangle, 50 \mug ID; \Box, 250 \mug ID), la respuesta en inmunoglobulinas anti-HA está representada en función del tiempo en forma de una media geométrica de los títulos a punto final sobre una escala de log2.

La Figura 8 muestra los anticuerpos HI generados por la vacuna de ADN del plásmido pV1JHA en macacos cinomorfos (Ejemplo 3). Las muestras de suero de un estudio precedente, tomadas las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 y 24 se dosificaron para los títulos en anticuerpo HI como se describe en el Ejemplo 2A con una dilución 1:10 de los sueros. Los títulos en HI a punto final para cada mono individual están representados en función del tiempo. Los monos inmunizados por vía IM están representados por, \triangle, \Box, \bigbox; los otros símbolos son los monos inmunizados por vía ID. Las hembras están representadas por \bigbox, \bigbox, \bigbox, \bigbox, \bigbox, *; los otros símbolos son los machos.

Ejemplo 1 Vacunación por p53 1A - Materiales y métodos Plásmido y construcciones virales

El recombinante ALVAC que expresa p53 natural humano (vCP207) se ha descrito en Roth et al., PNAS (1996) 93; 4781. Se ha descrito vP1101, un recombinante NYVAC (virus de la viruela vacuna atenuado) que expresa p53 natural humano en Tartaglia et al. Virology (1992) 188: 217. vCP297 y el recombinante ALVAC que expresa luciferasa de Photinus pyralis se utiliza como testigo. Dos plásmidos que expresan p53 natural humano (pC53-SN_{3}) y p53 humano con una mutación de R en H en el aminoácido 273 (pC53-4.2N_{3}) se han construido de manera que las secuencias que codifican p53 estén situadas bajo el control del promotor/multiplicador del gen temprano inmediato del CMV humano. Los dos plásmidos que contienen igualmente el marcador neo^{R} permiten la selección con G418. El plásmido pMP1406hp53, que expresa igualmente p53 bajo el control del promotor/multiplicador del gen temprano inmediato del CMV humano, está desprovisto del gen neo^{R}.

Linajes de células transformadas

P815 es un linaje de mastocitomas de ratón de origen DBA/2. P815 HFR es otro aislador de este linaje. BALB/3T 12-3, un linaje de fibroblastos tumorígenos resultado de embriones de ratón BALB/c, se obtuvo de ATCC (nº CCL 164).

Las células se transfectaron con pC53-4.2N_{3}con ayuda de lipofectamina (GIBCO BRL) para P815 y con CaPO_{4} para BALB/3T12-3. Los transfectantes se seleccionaron y desarrollaron en presencia de 400 \mug/ml de G418, y se escogieron los clones que expresan p53 de manera estable. El clon 2E4 se obtuvo por transfección a partir de P815, el clon 4D5 a partir de P815 HFR y el clon 2-21 a partir de BALB/3T12-3.

Inmunización de ratones

Se inmunizaron ratones hembras BALB/c ByJ (IFFA-CREDO o Jackson Laboratories) o DBA/2 (IFFA-CREDO) de ocho semanas de edad con ayuda de una jeringa para administración por vía intravenosa (100 \mul en la vena caudal) y subcutánea o intramuscular (100 \mul). Para una administración intraesplénica directa, se anestesiaron y rasuraron los ratones, y se utilizó un aparato Mesoflash M10 (Prolitec) adaptado a la administración por vía intradérmica en el ratón para entregar 20 \mul a cada uno de cinco sitios distintos en el lomo. Se llenó una cámara de vidrio de 5 ml alojada en el inyector M10 de soluciones a inyectar. El inyector estaba equipado de un tubo que comprendía cinco orificios y estaba calibrado para entregar volúmenes fijos de 100 \mul por chorro. El ADN inyectable se purificó por lisis alcalina seguida de centrifugación en gradiente de equilibrio CsCl bromuro de etidio o cromatografía de columna Quiagen.

ELISA para la detección de anticuerpos de suero de ratón contra p53 humano

El antígeno de revestimiento era un extracto nuclear de células de insecto Sf9 infectadas por un baculovirus recombinante que expresa p53 natural humano. El contenido de p53 de este extracto era aproximadamente del 50% por electroforesis. Las placas de microtitulación (96 pocillos) (Dynatech) se revistieron durante una noche a 4ºC con 100 ng de p53 en 100 \mul/pocillo. Después de lavar con PBS-Tween 20 al 0,005% (PBS-T), se bloquearon las placas durante 1 h a 37ºC con PBS-T que contenía 1% de albúmina de suero de bovino (PBS-T-BSA) y se lavaron de nuevo. Se añadieron suero o, como testigo positivo, anticuerpo monoclonal DO1 (Santa Cruz), que reconocía p53 humano, y se incubaron las placas durante 1,4 h a 37ºC. Después de lavar, se añadió el anticuerpo secundario, anti-IgG de conejo, IgA, IgM de ratón (Zymed), con una dilución de 1/1.000 en PBS-T-BSA, y se continuó la incubación durante 1,5 h a 37ºC. Después de un lavado final, se añadió el sustrato p-nitrofenilfosfato disódico a razón de 1 mg/ml en dietanolamina 1 M, MgCl_{2} 0,3 mM, pH 9,8, y se revelaron las placas durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se detuvo con 50 \mul/pocillo de NaOH 2 N, y se leyeron las placas a 405 nm con ayuda de un lector de placas Molecular Devices.

Determinación de CTL específicos contra p53 humano

Los bazos de ratones inmunizados se disociaron en RPMI con suero de becerro fetal (SVF) al 2% y se prepararon los esplenocitos. Se infectaron estimuladores (ratones no inmunizados: preparados como antes) con una multiplicidad de infecciones de 2-10 con vP1101 o vCP207, como se ha indicado. Después de 1 h a 37ºC con CO_{2} al 5%, los estimuladores infectados se lavaron e irradiaron con 25 Gy (o en ciertas experiencias se utilizaron sin irradiación) y mezclaron con efectores en una relación de 1:2 o 1:5 en un frasco de 75 cm^{3} con una concentración final de 2 x 10^{6} células/ml. Se incubaron verticalmente los frascos durante 5 días en una estufa a 30ºC con CO_{2} al 5%. Si se realiza una segunda estimulación, se utiliza una relación estimulador:efector de 2:1, y se añaden 10 U/ml de interleuquina-2 (IL-2; Genzyme) de ratón. La reestimulación se realizó durante 5 días.

Para la dosificación de los CTL, se marcaron 10^{6} células P815 o 2E4 por 200 \muCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} (NEN, 40 mCi/ml) durante 1 h a 37ºC y se lavaron tres veces en RPMI con SVF al 10%. Se distribuyeron 5 x 10^{3}-10^{4} células objetivo en cada pocillo de una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron los efectores, se incubaron las placas durante 4 h a 37ºC y se recogió y contó después el sobrenadante. El porcentaje de lisis específica se calculó en 100 x (liberación de efector – liberación espontánea)/(liberación total - liberación espontánea).

1B - Resultados Experiencias preliminares con ayuda de un canarypox (vector ALVAC que codifica p53 natural humano (vCP207))

Se ha estudiado la respuesta inmunitaria (respuestas en anticuerpos y en CTL) frente a vCP207 entregado por diferentes vías, y los resultados son los siguientes.

La administración por vía intravenosa las semanas 0, 3 y 5 de 107 TCID_{50} del recombinante, pero nada de ALVAC progenitor, ha inducido una respuesta en IgG específica significativa en 11/12 ratones. Sin embargo, cuando se ha efectuado la misma vacunación por vía subcutánea, sólo han respondido tres de 12 ratones, e incluso esta última presentaba títulos apenas superiores al ruido de fondo. Se ha observado igualmente muy poca respuesta por vía intradérmica.

Se ha examinado igualmente la actividad de CTL específico de esplenocitos procedentes de ratones inmunizados después de estimular in vitro con esplenocitos simples infectados por un virus de la viruela vacuna recombinante muy atenuado, NYVAC, que expresa p53 natural humano (vP1101). Los esplenocitos de ratones inmunizados tres veces por vía intravenosa con vCP207 han presentado fuertes proporciones de lisis del clon 2E4, un linaje P815 transfectado por p53 mutante humano R273H. Se ha observado una actividad lítica clara incluso después de un ciclo de estimulación in vitro, aunque las proporciones hayan aumentado, especialmente con relaciones E:T pequeñas, después de un segundo ciclo de estimulación in vitro. La respuesta era específica de p53 porque sólo se han observado pequeñas proporciones de lisis de 2E4 después de inmunizar con vector ALVAC y pequeñas proporciones de lisis de P815 no transfectado. Contrariamente a los resultados por vía intravenosa, los esplenocitos de ratones inmunizados por vía subcutánea con el mismo vCP207 no han presentado ninguna prueba de la actividad de CTL, incluso después de dos ciclos de estimulación in vitro. La administración intradérmica no ha tenido igualmente éxito para inducir CTL anti-p53 específico cualquiera.

Finalmente, se ha considerado que la vía de administración sólo sería crítica para la sensibilización. Sin embargo, los ratones sensibilizados por vía intravenosa y que reciben a continuación una inyección de recuerdo por vía subcutánea no han presentado respuesta.

Se ha concluido que la vía intravenosa es la vía óptima para inducir una respuesta inmunitaria específica de p53 si se utiliza un canarypox recombinante como inmunógeno.

La respuesta inmunitaria (respuestas en anticuerpos y en CTL) frente a ADN no infeccioso que codifica p53 natural humano

Se ha examinado igualmente la respuesta frente a la inmunización con un plásmido que codifica p53 natural humano bajo el control del promotor de CMV (pC53-SN_{3}).

La administración por vía intradérmica de 100 \mug de este plásmido las semanas 0, 3 y 6 ha inducido una respuesta en anticuerpos específica en tres de ocho ratones, con relación a ningún ratón para el vector pUCneo. A pesar de esta respuesta en anticuerpos más bien variable, se ha observado una respuesta en CTL en todos los grupos de animales inmunizados con 100 \mug, pero no con 1 o 10 \mug de pC53-SN_{3} (Figura 1A). Como los inducidos por vCP207, los CTL inducidos por ADN de p53 eran específicos de p53, lo que muestra que no hay lisis de 2E4 después de inmunizar con ADN de vector pUCneo, ni lisis significativa cualquiera de P815 no transfectado. Se ha observado igualmente una respuesta neta en CTL después de inyectar por vía intramuscular 100 \mug de otro ADN que codifica p53 natural humano, pMP1406hp53 (Figura 1B).

Protección contra una prueba por linajes celulares transfectados por p53 humano después de inmunizar con vCP207 o pc53-SN_{3}

Una vez que se han determinado medios óptimos para inducir respuestas inmunitarias anti-p53, se ha evaluado si serían protectoras frente a una prueba mediante linajes tumorales de ratón transfectados con p53 humano. En estas experiencias, se ha inmunizado las semanas 0, 3 y 6 y probado la semana 8. Se ha obtenido un linaje de prueba, el clon 2-21, por transfección de BALB/3T12-3, un aislador tumorígeno de BALB/c 3T3, con un plásmido que codifica p53 mutante humano (R273H). Los ratones BALB/c inmunizados testigos han desarrollado tumores, que se han extendido de manera progresiva, comenzando alrededor de 6 semanas después de la inyección subcutánea de 10^{7} células (Figura 2A). Una inmunización por vía intravenosa previa con vCP207 ha conferido una protección parcial, pero estadísticamente no significativa (P > 0,25 frente a PBS), con solamente un ratón de nueve que quedara sin tumor la semana 15. Este efecto es específico de p53 porque la inmunización con el vector ALVAC no era protectora y ha parecido en efecto acelerar ligeramente el crecimiento tumoral con relación al PBS. Además, VCP207 no ha conferido ninguna protección en absoluto contra el progenitor no transfectado BALB/ET12-3 (Figura 2B). Contrariamente a la protección parcial inducida por el virus recombinante, la inmunización intradérmica con ADN de pC53-SN_{3} ha inducido una protección total (P < 0,001 frente a la vez PBS y pUCneo; Figura 2C).

Otro modelo de prueba, el clon 4D5, que se obtuvo por transfección de células de mastocitomas P815 con p53 mutante humano R273H, forma tumores que aparecen alrededor de 3 semanas después de la inyección subcutánea de 10^{4} células en el ratón DBA2 (Figura 2D) y que se extienden rápidamente, conduciendo a la muerte en aproximadamente 6 semanas. En este modelo, vCP207 y pC53-SN_{3} a la vez inducen una protección parcial (Figura 2D), pero sólo el ADN era significativamente diferente del grupo testigo PBS (P < 0,1 para vCP207 y P < 0,01 para pC53-SN_{3}). Ni el ALVAC testigo ni el ADN testigo han inducido una protección significativa con relación a PBS (P < 0,25).

1C - Discusiones

Se han comparado las respuestas inmunitarias inducidas por la entrega del gen p53 natural de longitud total por mediación de un vector viral recombinante o de ADN plasmídico. En el caso de ALVAC recombinante, la vía de administración era crítica para la inducción de una respuesta inmunitaria óptima. Se han observado buenas respuestas inmunizando por vía intravenosa, como han indicado otros para el fowlpox. Sin embargo, la respuesta en anticuerpos era significativamente más pequeña por las vías subcutánea, intramuscular e intradérmica y no ha inducido CTL detectables.

Mientras que las proporciones de CTL generados por inmunización con ADN y el poxvirus recombinante han parecido similares, es difícil comparar las dosis utilizadas debido a la naturaleza diferente de los dos vectores. Sin embargo, mientras que 100 \mug de ADN y 10^{7} virus eran suficientes para inducir CTL, en los dos casos, una dosis 10 veces más pequeña no ha conseguido inducir CTL; es decir, ni 10 \mug de ADN (Figura 1A), ni 10^{6} vCP207 han inducido CTL detectables de manera reproducible. Conviene acordarse igualmente de que el ADN ha inducido CTL cuando es administrado por vía intradérmica o intramuscular, lo que es de manera inherente más práctico y menos susceptible de suscitar inquietudes de seguridad que la vía intravenosa que se utiliza con el virus recombinante.

A pesar de la generación de CTL, la inmunización por vía intravenosa con vCP207 sólo ha dado una protección parcial en los modelos 3T3 y P815 transfectados.

Brevemente, los datos de protección y de respuestas inmunitarias con p53 humano pueden resumirse como sigue.

Inmunización	Vía	Ac	CTL	Protección
vCP207	i.v.	++	+	+/-
ALVAC (testigo)	i.v.	-	-	-
phup53	i.m.	+/-	+	-
pvec (testigo)	i.m.	-	-	-
phup53	i.d. (Mesoflash)	+	+	+
pvec (testigo)	i.d. (Mesoflash)	-	-	-

Se evidencia inmediatamente que se obtienen resultados superiores por inmunización mediante ADN por vía intradérmica utilizando un inyector sin aguja.

Ejemplo 2 Vacunación antigripal en el ratón 2.A - Materiales y métodos Plásmidos

El plásmido pV1JHA, un plásmido procedente de pUC19, contiene el marcador del gen de resistencia a la ampicilina, el gen de la hemaglutinina (HA) clonado del virus de la gripe A/PR/8/34, el multiplicador, el promotor y el intrón A del gen 1E1 de hCMV y la secuencia señal poli(A) del gen de la hormona del crecimiento bovino (Montgomery et al., (1993) 12: 777).

Este plásmido se cultivó en una cepa XL1-azul de E. Coli, extraído por el procedimiento estándar de lisis alcalina, seguida de precipitación selectiva de los ARN por LiCl/etanol. El sobrenadante se digirió a continuación de manera secuencial por RnasaA (0,01-0,05 mg por mg de ADN) y la proteinasa K (0,04-0,2 mg por mg de ADN). El ADN resultante se extrajo con fenol/cloroformo. El ADN plasmídico se purificó aún en un gradiente de CsCl-BET. Se eliminó el BET por extracción con 1-butanol. Se precipitó el plásmido con EtOH, se volvió a poner en suspensión en agua destilada y se guardó con una concentración de 5 mg/ml a -20ºC. La concentración y la pureza de las preparaciones plasmídicas se determinaron por elctroforesis en gel de agarosa y por lecturas de DO 260/280. Las relaciones DO 260/280 eran de 1,8.

Inmunización de ratones

Se anestesiaron ratones BALB/c (Charles River Laboratories, Saint Aubin les Elbeuf, Francia) hembras de ocho semanas de edad mediante inyección por vía IP de una solución que contenía 8 mg/ml de cetamina (Imalgène 500, Rhône-Mérieux) y 1,6 mg/ml de xilazina (Rompun al 2%, Bayer) en un volumen total de 0,2 ml de líquido fisiológico. Se inmunizaron ratones BALB/c hembras (6 por grupo) tres veces (las semanas 0, 3 y 6) con 10 \mug de plásmido pV1JHA. Las inmunizaciones se realizaron como sigue:

Para las inyecciones por vía IM, se inyectaron 50 \mul de ADN en 9\textperthousand de NaCl en los músculos de los cuadriceps de un muslo rasurado al que se aplicó con escobillón etanol con ayuda de una jeringa de insulina Micro-Fine equipada de una aguja 29G1/2.

Para las inyecciones por vía ID, se inyectaron 100 \mul de ADN en 9\textperthousand de NaCl en cinco lugares de la piel dorsal rasurada a la que se aplicó el escobillón de etanol utilizando un inyector de chorro Mesoflash® M10 (serie Mesoflash®, Prolitec, Aouste/Sye, Francia). La cámara de vidrio de 5 ml del inyector M10 se llenó de soluciones a inyectar. Este inyector estaba equipado de un tubo rectangular que comprendía cinco orificios y estaba calibrado para entregar volúmenes fijos de aproximadamente 100 \mul por chorro.

Las muestras de suero se tomaron las semanas 0 (pre-inmunes), 3, 6, 10, 12, 16 y 20. Se midieron las inmunoglobulinas anti-influenza por titulación ELISA comenzando con una dilución 1:25 de los sueros. Los sueros se titularon para isotipos de IgG1 y de IgG2a específicos para ELISA contra el virus A/PR/8/34 y se dosificaron para los títulos en anticuerpos HI, comenzando con una dilución 1:10 de los sueros. A la semana 20, se sacrificaron los ratones y se retiraron los bazos para ensayar la presencia de CTL específicos de HA en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas.

Ensayo ELISA

Todos los volúmenes utilizados en este ELISA eran de 100 \mul/pocillo, salvo indicación en contrario.

Se revistieron durante una noche a 4ºC placas Maxysorp de 96 pocillos (Nunc) con virus de la gripe completo (A/PR/8/34) a razón de 100 ng/100 \mul (proteínas totales) en tampón carbonato/bicarbonato 0,1 M, pH 9,6. Se lavaron dos veces las placas con PBS que contenía 0,05% v/v de Tween 20 (solución de lavado) y se bloquearon con PBS que contenía 0,05% v/v de Tween 20 y 1% p/v de leche desnatada (solución de bloqueo). Después de 1 h de incubación a 37ºC con agitación suave, se lavaron aún las placas dos veces. A continuación, se transfirieron sucesivamente a las placas los reactivos siguientes y se incubaron durante 1,5 h a 37ºC con agitación suave y lavado abundante (4 ciclos) entre cada incubación: i) muestras de suero diluidas 1/25-1/51200 por diluciones en serie de 2 en la solución de bloqueo, ii) anti-IgG de ratón de cordero biotinado (respectivamente anti-humano de cordero, en el ELISA de mono) (Amersham) diluido a 1/5000 en la solución de bloqueo, ii) complejo de estreptavidina-peroxidasa de rábano blanco biotinado (Amersham) diluido a 1/2000 en solución de bloqueo.

Para detectar los isótopos de inmunoglobulinas específicas en el ELISA de ratón, se utilizaron anti-IgG1 e IgG2a de ratón de cordero biotinado.

Para revelar el color, se añadió tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,6 que contenía 0,03% de peróxido de hidrógeno y 1 mg/ml de diclorhidrato de O-fenilendiamina (Sigma). La reacción coloreada se detuvo después de 30 min por adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M y se leyó la absorbancia a 490 nm con ayuda de un espectrofotómetro de haz vertical (Titertek, Flow Laboratories). Los títulos en anticuerpos se definieron como el inverso de la dilución de suero con un valor A490 de 0,5. Los títulos medios en anticuerpo de suero se expresaron en forma de media geométrica de los títulos (GMT) en una escala de log2.

Ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI)

Previamente al ensayo, se liberaron los sueros de inhibidores no específicos por la enzima de destrucción del receptor (RDE, Sigma) y de aglutininas frías por hemadsorción. Brevemente, se incubaron los sueros (25 \mul) durante una noche a 37ºC con 125 \mul de RDE (polvo liofilizado a partir de 5 ml de líquido de cultivo de Vibrio reconstituido con 2,5 ml de agua destilada) y se calentaron durante 1 h a 56ºC. Se preabsorben entonces las muestras tratadas (150 \mul) durante 30 min a temperatura ambiente con 125 \mul de glóbulos rojos de pollo con una concentración del 10% (p/v) en PBS y se eliminan las aglutininas frías con las células por una centrifugación de 10 min a 3.000 rpm. Estos tratamientos sucesivos han inducido una dilución de los sueros de aproximadamente 10 veces.

Se prepararon entonces diluciones de sueros en serie de dos (de 1/10 a 1/10240 en PBS) en placas de 96 pocillos (Greiner-Labor-Technik, 50 \mul/pocillo) y se añadieron a cada pocillo 50 \mul de PBS que contenía 4 unidades HA de virus de la gripe, y se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadieron durante 1 h 50 \mul de glóbulos rojos de pollo con una concentración del 0,5% (p/v) en PBS y se determinó la aglutinación por examen visual. El título HI se expresó como el inverso de la dilución más fuerte del suero que induce la inhibición de la hemaglutinación.

Ensayo de citotoxicidad

Se aislaron esplenocitos de ratones inmunizados (efectores) y se reestimularon in vitro por co-cultivo de 7 días con células esplénicas singeneicas (estimuladores) que estaban infectadas con el virus de la gripe A/Singapur/6/86 (cepa H1N1, 100 unidades de HA/10^{6} esplenocitos) y durante 4 días suplementarios con nuevas células esplénicas singeneicas infectadas por el virus de la gripe que se habían tratado con mitomicina (2,5 \mug/10^{6} esplenocitos). Se pusieron en contacto alrededor de 7,5 x 10^{7} efectores y estimuladores en frascos de 30 ml de medio RPMI 1640 que contenía 10% de SVF, 2-marcaptoetanol 50 \muM, glutamina (2 mM) y antibióticos (= medio de cultivo). Para la primera estimulación, la relación efector/estimulador era de 3:2 y, para la segunda estimulación, la relación efector/estimulador era de 1:4, y se añadió el recombinante IL-2 (Boehringer Mannheim) de ratón al medio de cultivo a razón de 10 unidades/ml.

Las actividades citotóxicas se midieron en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 h. Brevemente, las células efectoras estimuladas se lavaron por centrifugación y diluyeron en placas de 96 pocillos (Falcon) de 500.000 células/100 \mul a 18.500 células/100 \mul por diluciones en serie de 3. Las células de mastocitomas (objetivos) P815 (H-2K^{d}) se sensibilizaron por incubación con un péptido que comprendía el epítope A/PR/8/34 HA2 CTL en el haplotipo H-2K^{d} (13) (IYSTVASSLVL, 20 \mug/10^{6} células) o con el epítope A/PR/8/34 NP CTL (14) (TYQRTRALVTG, 20 \mug/10^{6} células = testigo negativo) y se cargaron de ^{51}Cr (300 \muCi/10^{6} células). Se añadieron a las células efectoras cinco mil células objetivo en 100 \mul de medio de cultivo en placas de 96 pocillos. Después de 4 h a 37ºC, se centrifugaron las placas a 1.400 rpm durante 3-4 min y se transfirieron 30 \mul de los sobrenadantes de cada pocillo al pocillo correspondiente de una Lumaplate de 96 pocillos (Packard) para contar la radioactividad con ayuda de un contador beta TopCount (Packard).

Los resultados se expresan en porcentaje de liberación de ^{51}Cr específico, calculado con ayuda de la fórmula:

\hbox{(a-c/b-c)}

x 100, en donde a = cpm liberadas en presencia de células efectoras, b = cpm liberadas en presencia de detergentes (liberación máxima) y c = cpm liberadas en los pocillos testigos sin células efectoras (liberación espontánea). 2B - Resultados

Las respuestas inmunitarias inducidas mediante inmunización con chorro por vía ID se compararon con las de la inyección estándar por vía IM del modelo influenza con pV1JHA que codifica hemaglutinina del virus de la gripe A/PR/8/34 (cepa H1N1). En los ratones BALB/c, era evidente una relación dosis-respuesta entre la dosis del plásmido pV1JHA y los anticuerpos anti-influenza generados tras la inyección con chorro por vía IM o ID (Mesoflash® M10) de pV1JHA, siendo la dosis inmunógena más pequeña 0,1 \mug en un método de dos inmunizaciones (no presentado). En este estudio dirigido a comparar las dos vías de administración en un método que comprende 3 inmunizaciones con 10 \mug de pV1JHA (intervalo de 3 semanas), la producción de anticuerpos (inmunoglobulinas totales) después de inyectar con chorro la vacuna de ADN en la piel era ligeramente superior (1-2 diluciones ELISA, 2-4 veces) a la inducida mediante inmunización por vía IM (Figura 3).

Teniendo en cuenta la pequeña proporción de expresión de plásmido en la piel, esta experiencia de inmunización sugiere que pueden generarse respuestas inmunitarias poderosas a partir de muy poco inmunógeno proteico si éste se produce o absorbe en células o tejidos apropiados.

Cuando se ha examinado el equilibrio IgG1/IgG2a, ha aparecido que sólo los títulos IgG1 eran afectados por la vía de inmunización. En efecto, la Figura 4 muestra que los ratones inmunizados con chorro por vía IM e ID presentaban títulos IgG2a muy similares, mientras que el título IgG1 medio en los ratones inmunizados con chorro por vía ID ha alcanzado un valor meseta máximo que es de aproximadamente 8 veces (3 diluciones ELISA) por encima del título medio observado en el grupo IM. Los títulos IgG1 más elevados obtenidos por inyección con chorro por vía ID han presentado una correlación positiva con los títulos de neutralización del virus más elevados medidos por ensayo de inhibición de hemaglutinación estándar en nuevos eritrocitos de pollo incubados con el virus de la gripe A/PR8/34. Los títulos HI eran ligeramente superiores en el grupo inmunizado con chorro por vía ID con relación al grupo IM (Figura 5).

Además de los títulos HI, la vacuna de ADN ha inducido igualmente respuestas CTL específicas anti-HA en los ratones BALB/c inmunizados. Se han detectado respuestas en CTL significativas cinco meses después de la inmunización primaria en 4 de los 6 ratones inmunizados por vía IM y en 3 de los 5 ratones inmunizados con chorro que se ensayaron. La Figura 6 muestra las respuestas en CTL específicas generadas en un respondedor representativo de cada uno de los dos grupos.

Ejemplo 3 Vacunación gripal en el mono 3A - Materiales y métodos

El plásmido es tal como el descrito en 2A.

Inmunización de monos

Se obtuvieron de Naforimex (Hochiminh Ville) macacos cinomorfos (Macaca fascicularis, 2,1-3,3 kg en el momento de la inmunización primaria) machos y hembras de dos años de edad, procedentes de Vietnam, y se les tuberculinó y puso en cuarentena inmediatamente después de la llegada a los establecimientos de cuidado de animales de los inventores. Antes de entrar en este estudio, los monos recibieron tres inyecciones de vacuna de polio inactivada (Pasteur Mérieux Connaught). Se alojaron los monos conforme a las directivas de las reglamentaciones europeas y recibieron agua de grifo ad libitum, frutas y alimento comercial de primates.

Se anestesiaron los monos mediante administración por vía IM en el muslo de 50 mg de cetamina (0,5 ml de Imalgene 1000, Rhône-Mérieux). El lugar de inyección se rasuró y se limpió con escobillón con etanol antes de la inyección. Se inmunizaron macacos cinomorfos (2 machos y 2 hembras por grupo) tres veces (las semanas 0, 6 y 19) como sigue:

Para las inyecciones por vía IM, se inyectaron en los músculos de los cuadriceps 50 \mug de plásmido pV1JHA en 500 \mul de NaCl al 9\textperthousand con ayuda de una jeringa de 3 ml equipada con una aguja de 26G3/8.

Para las inyecciones por vía ID, se inyectaron 10, 50 o 250 \mug de plásmido pV1JHA en 100 \mul de NaCl al 9\textperthousand en cinco lugares de la piel del muslo con ayuda de una pistola de chorro Mesoflash® M40 (serie Mesoflash®, Prolitec, Aouste/Sye, Francia). Se llenó de las soluciones a inyectar una jeringa que se adaptaba al inyector M40. Este inyector estaba equipado de un tubo circular que comprendía cinco orificios y estaba calibrado para entregar volúmenes fijos de aproximadamente 100 \mul por chorro.

Se tomaron muestras de suero las semanas 0 (pre-inmunes), 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 24. Los títulos en anticuerpos específicos anti-HA (inmunoglobulinas totales específicas) se siguieron en función del tiempo por titulación ELISA como se ha descrito en 2A, comenzando con una dilución 1:25 de los sueros. Las muestras de suero se han dosificado igualmente para los títulos en anticuerpos HI como se ha descrito en 2A, comenzando con una dilución 1:10 de los sueros.

3B - Resultados

Se ha comparado la inmunización por vía ID con pistola de chorro (Mesoflash® M40) con la inmunización vía IM en el mono. Para la inmunización con pistola de chorro, se ha realizado un estudio del tipo dosis-respuesta y se ha observado aún una correlación entre la cantidad de pV1JHA utilizada para la inmunización y el nivel de respuesta en anticuerpos ulterior. Se ha encontrado que la dosis de 50 \mug de pV1JHA ha inducido títulos ELISA y HI más fuertes que la dosis de 10 \mug, que no ha inducido ninguna respuesta. La proporción de respuesta en anticuerpos no podía mejorarse aumentando la dosis de pV1JHA de 50 \mug a 250 \mug, pero las respuestas parecían ser más homogéneas en el grupo de 250 \mug.

La comparación entre la inmunización por vía IM e ID con pistola de chorro con 50 \mug de pV1JHA no ha mostrado ninguna diferencia significativa en la respuesta en anticuerpos global. Sin embargo, el examen de los títulos individuales ha mostrado una seroconversión más rápida en dos de los monos IM. En los dos grupos, las respuestas han mejorado por inmunización de recuerdo realizada 3 meses después de la segunda administración.

Claims (7)

1. La utilización de una solución que comprende una molécula de ADN no infecciosa capaz de expresarse en un vertebrado, un antígeno que es (a) específico de un microorganismo capaz de inducir una infección en un vertebrado o (b) asociado a un tumor, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de una infección o de una afección tumoral, que está previsto para ser entregado exclusivamente en la piel del vertebrado a fin de inducir contra el antígeno una respuesta inmune Th1/Th2 equilibrada; realizándose la entrega de dicho medicamento utilizando un aparato sin aguja que incorpora medios de presión que permiten propulsar el medicamento y cuya fuerza de presión está ajustada a fin de entregar el medicamento exclusivamente en la piel.

2. Una utilización según la reivindicación 1ª, y según la cual el medicamento está previsto para ser entregado exclusivamente en la capa epidérmica de la piel.

3. Una utilización según la reivindicación 1ª, y según la cual el medicamento está previsto para ser entregado exclusivamente en la capa dérmica de la piel.

4. Una utilización según una de las reivindicaciones 1ª a 3ª, y según la cual la molécula de ADN es capaz de expresar el antígeno p53 asociado a un tumor.

5. Una utilización según la reivindicación 4ª, y según la cual el antígeno p53 es de origen humano.

6. Una utilización según las reivindicaciones 4ª ó 5ª, y según la cual el antígeno p53 es de tipo natural.

7. Una utilización según las reivindicaciones 4ª ó 5ª, y según la cual el antígeno p53 es un mutante p53.