ES2199247T3 - Derivados de sulfonamida y su uso. - Google Patents
Derivados de sulfonamida y su uso.Info
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Abstract
SE MUESTRAN LIBRERIAS COMBINATORIAS REPRESENTADAS POR LA **FORMULA** (T`-L)q,Qs-C(O)-L`, EN LA CUAL S ES UN SOPORTE SOLIDO, T`-L UN RESIDUO IDENTIFICADOR; Y -L`- UN RESIDUO LIGANTE/ENLAZADOR. ESTAS LIBRERIAS CONTIENEN SULFONAMIDAS ARIL, DERIVADOS N-ACYL Y PIRROLIDINAS Y PIPERIDINAS N-SUSTITUIDAS DE LA FORMULA : Y-A-C-O-R1 QUE SON INHIBIDORES DE PROTEASAS DE SERINA E ISOZIMAS DE ANHIDRASA CARBONICA. SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE LOS TRASTORNOS DE HIPERCOAGULACION Y ENFERMEDADES OCULARES TALES COMO EL GLAUCOMA.
Description
Derivados de sulfonamida y su uso.
La presente invención se relaciona con soportes
sólidos para construir librerías combinatorias y en particular
librerías combinatorias no oligoméricas.
Existe interés en métodos para la síntesis de
grandes cantidades de compuestos diferentes que pueden ser
identificados para distintas actividades fisiológicas u otras
actividades posibles. Se han desarrollado técnicas en las cuales se
agregan unidades individuales de forma secuencial como parte de la
síntesis química para producir todos o una cantidad importante de
los compuestos posibles que pueden resultar de todas las posibles
elecciones en cada etapa secuencial de la síntesis. Para que estas
técnicas tengan éxito, es necesario que los compuestos se puedan
adaptar a los métodos por los cuales se puede determinar la
estructura de los compuestos realizados de esta manera. Brenner y
Lerner (PNAS USA 81: 5381-83 (1992)) y la patente
WO 93/20242, por ejemplo, describen la síntesis donde los
oligonucleótidos son producidos de forma paralela con, y están
químicamente unidos como etiqueta genética a, los oligopéptidos
como los compuestos de interés. La patente WO 93/06121 enseña
métodos para la síntesis basada en partículas de oligómeros
aleatorios donde las etiquetas de identificación en las partículas
son usadas para facilitar la identificación de la secuencia de
oligómero sintetizada. En Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90, 10922-10926, Dic. 1993, se describe un
sistema de etiquetado separable. En
WO-A-94/08051, se describe otro
sistema de etiquetado separable.
La presente invención está basada en el
inesperado hallazgo que el uso de perlas de poliestireno injertado
con polietilenglicol reticulado con divinilbenceno como soportes
sólidos en síntesis de fase sólida pueden originar ciertas
ventajas, en términos de producción, sobre los soportes sólidos de
poliestireno reticulado con divinilbenceno a los que les falta la
funcionalidad del PEG.
En consecuencia, de acuerdo con un primer
aspecto, la presente invención facilita el uso de perlas de
poliestireno injertado con polietilenglicol reticulado con
divinilbenceno como los soportes sólidos para construir librerías
combinatorias no oligoméricas.
En una realización, el ligando es separado de los
soportes sólidos por medio de fotólisis.
El poliestireno injertado con polietilenglicol
reticulado con divinilbenceno puede estar funcionalizado con grupos
amino, hidroxi, carboxi o halo, y en una realización de preferencia
está funcionalizado con grupos amino o hidroxi, más preferentemente
grupos amino.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención facilita una librería combinatoria no oligomérica en la
cual los soportes sólidos se encuentran en la forma de perlas de
poliestireno injertado con polietilenglicol reticulado con
divinilbenceno, como se definió en la presente anteriormente.
Las librerías combinatorias que pueden prepararse
usando los soportes sólidos de la presente invención se encuentran
representados en la Fórmula I:
(T'-L)_{q-}\code{S}-C(O)-L'-ITI
donde:
\code{S} es un soporte sólido;
T'-L- es un residuo de
identificación;
-L'-II' es un residuo de ligando
/ unión; y
q es 3-30.
Los compuestos de preferencia de la Fórmula I son
aquellos donde: T'-L- tiene la Fórmula:
donde n = 3-12 cuando Ar es
pentaclorofenilo
y
n = 4-6 cuando Ar es
2,4,6-triclorofenilo;
q es 3-13; y
-L'- es
donde la unión de la izquierda como se muestra es
el punto de conexión al soporte sólido y la unión de la derecha es
el punto de conexión al ligando, t B es O o NH, con la condición
que en (b) B es NH cuando se encuentra unido a un grupo carbonilo
en el
ligando.
Dependiendo de la elección de L' (ver Tabla 1),
los ligandos de la Fórmula II pueden ser separadas por medio de
técnicas fotolíticas, oxidativas, o otras técnicas de división. Por
ejemplo, cuando -L'- es (a) y B es O, la separación fotolítica
puede estar representada por:
donde L'' es el residuo de L' y II'BH es
II.
Por lo tanto, los compuestos que pueden
prepararse usando los soportes sólidos de la presente invención
también se encuentran representados en la Fórmula II:
Y-A-CO-R
^{1}II
donde:
R^{1} es
^{-}N(R^{6})^{-}(CH_{2})_{2-5}-Z-(CH2)
_{2-5}-R^{9},
-NH(CH2)_{2-5}-R^{9},
R^{2} es el residuo en el
\alpha-carbono de metionina,
O-t-butilserina, serina,
S-tritil-cisteína, cisteína, ácido
aspártico-(3-t-butil éster, ácido
aspártico, ácido
glutámico-y-t-butil
éster, ácido glutámico,
N^{im}-tritil-histidina,
histidina,
N^{\varepsilon}-Boc-lisina,
lisina, N^{9}-Mtr-arginina,
arginina,
N-\beta-tritil-asparagina,
asparagina,
N-y-tritil-glutamina,
glutamina, N^{in}-Boc-triptofán,
triptofán, isoleucina, fenilalanina, glicina, alanina, valina, o
leucina;
R^{3} es alquilo inferior o
-(CH_{2})_{m}-Q-X;
R^{4} es Q(R^{7},
R^{8})-SO_{2}NH_{2},
-(CH_{2})_{m},-R^{10}, con la condición que cuando m
= 0, R^{i0} no es OH, alquilo inferior, un anillo heterocíclico
aromático con 6 miembros que contiene 1 ó 2 átomos de N ,
heteroaril-alquilo inferior,
R^{5} es alquilo inferior, cicloalquilo
inferior, alquenilo, alquinilo, un sistema de anillo aromático
mono-o bi-cíclico de 6 a 10
miembros, o un sistema de anillo heteroaromático mono- o
bi-cíclico de 5 a 10 miembros que contiene 1 ó 2
átomos de N, cualquiera de los sistemas no sustituido o sustituido
con 1-2 sustituyentes seleccionados de halógeno,
alcoxi, alquilo, CF_{3}, CN, -N(alquilo
inferior)_{2}, y acilamino;
R^{6} es H o alquilo inferior;
R^{7}, R^{8} es cada uno independientemente
H, halógeno, alquilo inferior, alcoxi, CN, NO_{2},
-CO-alquilo inferior, -N(alquilo
inferior)_{2}, o
NH-CO-alquilo inferior;
R^{9} es OH, CONH_{2}, o COOH;
R^{10} es alcoxi, OH, o COOH;
m es 0-6;
A es -NH-CHR^{2}-,
-NH(CH_{2})_{2-12}-,
o el residuo descarboxi de un amino ácido
primario o
secundario;
Q es un anillo aromático o heteroaromático con 5
ó 6 miembros que contiene 0-3 heteroátomos
seleccionados de O, N, y S, o un sistema de anillo aromático o
heteroaromático bi-cíclico con 9 ó 10 miembros que
contiene 0-3 heteroátomos seleccionados de O, N, y
S;
X es H, alquilo inferior, halógeno, alcoxi,
CF_{3}, CN, -NO_{2}, -CO-alquilo inferior,
-N(alquilo inferior)_{2},
NH-CO-alquilo inferior, o COOH;
Y es -SO_{2}R^{3}, -COR^{4},
-CO-CH(R^{2})-NHSO_{2}R^{3},
-CO-CH(R^{2})-NHCOR^{4},
-CO-NHR^{5}, o -COOR^{5};
Z es -O-, -S-, o -N(alquilo
inferior)-;
o su sal aceptable desde el punto de vista
farmacéutico.
El compuesto de la Fórmula II puede ser, por
ejemplo, un compuesto donde:
\newpage
Y es
n-BuSO_{2}-,
(CH_{3})_{2}CHSO_{2}-,
o
donde R^{11} es CH_{3},
(CH_{3})_{3}C-, o
CI;
A es -NH-CHR^{2}-,
-NH(CH_{2})_{2-12}-,
o el residuo descarboxi de un amino ácido
primario o secundario;
y
R^{1} es
El compuesto de la Fórmula II puede ser también
un compuesto donde: Y es
La librería combinatoria de la Fórmula puede ser
usada en evaluaciones para descubrir compuestos biológicamente
activos (ligandos) de la Fórmula II. En consecuencia, se facilita
un método para identificar un compuesto que tiene una
característica deseada la cual comprende sintetizar una librería
combinatoria de la Fórmula I y probar los compuestos de la Fórmula
I y los ligandos de la Fórmula II, ya estén unidos al soporte
sólido o separados de él, en una evaluación que identifica
compuestos que tienen la estructura característica deseada de
cualquier compuesto identificado de esta manera.
La presente invención facilita el uso de perlas
de poliestireno injertado con polietilenglicol reticulado con
divinilbenceno funcionalizado opcionalmente con grupos amino (por
ejemplo, TentaGel® S NH_{2}, Rapp Polymere) como los soportes
sólidos para construir librerías combinatorias. El uso de estas
perlas mejora notablemente la producción de ligandos, por ej.,
compuestos de la Fórmula II, separados de sus soportes sólidos. Las
producciones de ligandos a partir de los soportes tales como
poliestireno reticulado con DVB son relativamente bajas(< 10%).
El uso de poliestireno injertado con PEG reticulado con DVB da una
producción del > 60%.
Las abreviaturas siguientes tienen el significado
que se indica:
| c- = | ciclo |
| DEAD = | dietilazodicarboxilato |
| DCM = | diclorometano = cloruro de metileno |
| DIC = | diisopropilcarbodiimida |
| DMAP = | 4-N,N-dimetilaminopiridina |
| DMF = | N,N-dimetilformamida |
| DVB = | 1,4-divinilbenceno |
| EDT = | etano ditiol |
| FACS = | separación de células activada por fluorescencia (del inglés "fluorescence activated cell sorting") |
| Fmoc = | 9-fluorenilmetoxicarbonilo |
| GC = | cromatografía gaseosa (del inglés "gas chromatography") |
| HOBt = | N-hidroxibenzotriazol |
| im = | imidazol |
| in = | indol |
| m- = | meta |
| Me = | metilo |
| Mtr = | 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo |
| PEG = | polietilenglicol |
| Ph = | fenilo (del inglés "phenyl") |
| r.t. = | temperatura ambiente (del inglés "room temperature") |
| sat'd = | saturado |
| s- = | secundario |
| t- = | terciario |
| TFA = | ácido trifluoroacético |
| THF= | tetrahidrofurán |
Se pretende que el alquiloincluya estructuras
lineales, ramificadas, o cíclicas y sus combinaciones. El
"alquilo inferior" incluye grupos alquilo de 1 a 8 átomos de
carbono. Los ejemplos de grupos alquilo inferior incluyen metilo,
etilo, propilo, isopropilo, butilo, s- y t-butilo,
pentilo, hexilo, octilo, y similares. El "cicloalquilo
inferior" incluye grupos cicloalquilo de 3 a 8 átomos de
carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquilo inferior incluyen
c-propilo, c-butilo,
c-pentilo, 2-metilciclopropilo,
ciclopropilmetilo, adamantilo, y similares.
El "alquenilo" es
C_{3}-C_{6} alquenilo de una configuración de
(C_{5}-C_{6}) lineal, ramificada, o cíclica y
sus combinaciones. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen
alilo, isopropenilo, pentenilo, hexenilo,
c-hexenilo, 1-propenilo,
2-butenilo,
2-metilo-2-butenilo,
y similares.
El "alquenilo" es
C_{3}-C_{6} alquinilo de una configuración
lineal o ramificada y sus combinaciones. Los ejemplos de grupos
alquenilo incluyen propino, butino, pentino,
3-metil-1-butino,
3,3-dimetil-1-butino,
y similares.
"Alcoxi" significa grupos alcoxi de 1 a 6
átomos de carbono de configuración recta, ramificada, o cíclica.
Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen metoxi, etoxi, propoxi,
isopropoxi, ciclopropiloxi, ciclohexiloxi, y similares.
"Acilamino" significa grupos acilamino de 1
a 6 átomos de carbono de configuración recta, ramificada, o
cíclica. Los ejemplos de grupos acilamino son acetilamino,
butilamino, ciclohexilamino, y similares.
Los halógenos incluyen F, Cl, Br, y I.
R^{2} esta hecho especialmente para que incluya
racematos y todos los isómeros ópticos. Los residuos aminoácidos de
R^{2} son, por ejemplo, metil (alanina), hidroximetil (serina),
fenilmetil (fenilalanina), tiometil (cisteína), carboxietil (ácido
glutámico), etc.
En R^{4}, "heteroarilo" significa un
sistema de anillo heterocíclico aromático mono o
bi-cíclico de 5 a 10 miembros que contiene 1 ó 2
átomos de N, cualquiera de los sistemas no sustituido o sustituido
con 1-2 sustituyentes seleccionados de halógeno,
alcoxi, alquilo, CF_{3}, CN, -N(alquilo
inferior)_{2}, y acilamino;
En R^{5}, los anillos carbocíclicos aromáticos
de 6 a 10 miembros incluyen benceno y naftaleno y los anillos
heterocíclicos aromáticos de 5 a 10 miembros incluyen imidazol,
piridina, e indol.
En A, se pretende que los amonoácidos primarios o
secundarios incluyan alanina, asparagina, ácido aspártico,
arginina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina,
isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina,
serina, treonina, triptofán, tirosina, valina, sarcosina,
L-alanina, hidrocloruro de
cloro-L-alanina, ácido
2-aminoisobutírico, ácido 2
(metilamino)isobutírico, ácido
DL-3-aminoisobutírico, ácido
DL-2-aminoisobutírico, ácido
(R)-(-)-2-aminoisobutírico,
(S)-(+)-2-aminoisobutírico,
D-t-leucina,
L-t-leucina,
D-norvalina, L-norvalina, ácido
L-2-amino-4-pentenoico,
Disoleucina, L-isoleucina,
D-norleucina, ácido
2,3-diaminopropionico monohidrocloruro,
L-norleucina, ácido
DL-2-aminocaprílico,
P-alanina, ácido DL-3
aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido
4-(metilamino)butírico hidrocloruro, ácido
5-aminovalérico, ácido
7-aminoheptanoico, ácido
8-aminocaprílico, ácido 11 aminodecanoico, ácido
12-aminododecanoico,
car-boximetoxilamina hemihidrato,
D-serina, D-homoserina, L
homoserina, L-(+)-canavaninesulfato homohidrato,
D-allotreonina, L-allotreonina,
D-treonina, L-treonina, ácido
DL-4-amino-3-hidroxibutírico,
DL-3-hidroxinorvalina,
(3S,4S)-(-)-statina,
5-hidroxi-DL-lisina
hidrocloruro, ácido 5-aminoleucínico hidrocloruro,
ácido
1-amino-l-ciclopropanocarboxílico,
ácido
1-amíno-l-ciclopentanocarboxílico,
ácido
1-amino-l-ciclohexanocarboxílico,
ácido
5-amino-1,3-ciclohexadieno
1-carboxílico hidrocloruro, ácido
2-amino-2 norbornanocarboxílico,
ácido (S)-(-)-2 azetidinacarboxílico,
cís-4-hidroxi-D-prolina,
cis-4-hidroxi-L-prolina,
traps-4-hidroxi-L-prolina,
3,4-dehidro-DL-prolina,
3,4-dehidro-L-prolina,
ácido D-pipecolínico, ácido
L-pipecolínico, mimosina, ácido 2,3
diaminopropionico monohidrobromuro, ácido
DL-2,4-di-aminobutírico
dihidrocloruro ácido (S)-(+)-diaminobutírico
hidrocloruro, hidrocloruro de D-ornitina,
hidrocloruro de L-ornitina, hidrocloruro de
2-metilornitina monohidrato, hidrocloruro de
N-E-metil-L-lisina,
ácido Nmetil-D-aspártico
monohidrato, ácido
DL-2-metilglutamico hemihidrato,
ácido DL-2-aminoadipico, ácido
D-2-aminoadipico, ácido
L-2-aminoadipico, ácido
(+/-)-3-aminoadipico, hidrocloruro
de D-cisteína monohidrato,
D-penicilamina, L-penicilamina,
DL-homocisteína,
S-metil-L-cisteína,
L-metionina, D-etionina,
L-etionina,
S-carboximetil-L-cisteína,
(S)-(+)2-fenilglicina,
(R)-(-)-2-fenilglicina,
N-fenilglicina,
N-(4-hidroxifenil)glicina,
D-fenilalanina, ácido
(S)-(-)indolina-2-carboxílico,
\alpha metil,DL-fenilalanina,
\beta-metil-DL-fenilalanina
hidrocloruro, D-homofenilalanina,
L-homofenilalanina, DL
2-fluorofenilglicina,
DL-2-fluorofenilalanina,
DL-3 fluorofenilalanina,
DL-4-fluorofenilalanina,
DL-4 clorofenilalanina,
L-4-clorofenilalanina,
4-bromo-DL fenilalanina,
4-iodo-D-fenilalanina,
3,3',5-triiodo-L-tironina,
(+)-3,3',5-triiodo-L-tironina
sal de sodio, D tironina, L-tironina,
DL-m-tirosina,
D-4-hi-droxifenilglicina,
D-tirosina, L-tirosina,
o-metil-L tirosina,
3-fluoro-DL-tirosina,
3-iodo-L-tirosina,
3-nitro-L-tirosina,
3,5-diiodo-L-tirosina
dihidrato, DL-dopa, L-dopa,
2,4,5-trihidroxifenil -DL-alanina,
3-amino-L tirosina dihidrocloruro
monohidrato,
4-amino-D-fenilalanina
hidrato,
4-amino-L-fenilalanina
hidrato, 4 amino-DL-fenilalanina
hidrato,
4-nitro-L-fenilalanina
monohidrato,
4-nitro-DL-fenilalanina,
3,5-dinitro-L tirosina monohidrato,
DL-\alpha-metiltirosina,
L-\alpha-metiltirosina,
(-)-3-(3,4-dihidroxifenil)-2-metil-L-alanina
sesquihidrato,
DL-treo-3-fenilserina
hidrato, y DL-DOPS.
Se pretende que Q incluya fenil, tienil,
furanil, tiadiazolil, piridil, y pirimidil.
L y L' se encuentran descriptas en la Tabla 1, la
cual también muestra los agentes reactivos de separación. Al
diseñara un esquema sintético, se elige L y L' de modo tal que sean
ortogonalmente reactivas, es decir, deben permitir la eliminación
de T ó II (donde T =T'OH) sin eliminar al otro, ya que la
separación simultánea de ambos, T y II, del soporte sólido es
desfavorable. En las estructuras que se muestran, la unión de la
izquierda es el punto de conexión al soporte sólido y la unión de
la derecha es el punto de conexión de T ó II.
Las etiquetas T, son entidades químicas que
poseen varias propiedades: deben ser separables de los soportes
sólidos, preferentemente por fotólisis u oxidación; deben ser
diferenciables individualmente, y preferentemente separables; deben
ser estables en condiciones sintéticas; deben ser capaces de ser
detectadas a concentraciones muy bajas, por ej., 10^{-18} a
10^{-9} mol; deben ser identificables con equipos fácilmente
disponibles que no requiera capacidad técnica sofisticada para su
operación; y deben ser relativamente económicas. Las etiquetas
pueden estar relacionadas o no relacionadas estructuralmente, por
ej., una serie homóloga, grupos funcionales repetitivos, miembros
relacionados de la Tabla Periódica, isótopos diferentes, sus
combinaciones, y similares. Al final de la síntesis combinatoria,
para cada soporte sólido, generalmente habrá unido por lo menos
0,01 femtomol, generalmente 0,001-50 pmol, de cada
etiqueta. Las etiquetas pueden ser alifáticas, alicíclicas,
aromáticas, heterocíclicas, o sus combinaciones. Pueden ser
características de distinción la cantidad de unidades repetitivas,
tales como grupos metileno en un resto alquilo; grupos alquilenoxi
en un resto polialquilenoxi; grupos halo en un compuesto polihalo;
grupos etileno \alpha- y/o \beta-substituidos
donde los sustituyentes pueden ser grupos alquilo, oxi, carboxi,
amino, halo, o similares; isótopos; etc.
Se pretende que las definiciones de cualquier
sustituyente o símbolo (por ej., R^{2}, R^{8}, m, etc.) en una
molécula en particular sea independiente de sus definiciones en
cualquier otro lugar de la molécula.
| Grupo enlazador | Reactivo de escisión |
| 1. |
TABLA
1(continuación)
| Grupo enlazador | Reactivo de escisión |
| 12. |
Algunos de los compuestos descritos en el
presente documento contienen uno o más centros asimétricos y por lo
tanto pueden dar origen a enantiómeros, diaestereómeros, y otras
formas estéreo-isométricas que pueden ser definidas
en términos de estéreo-química absoluta como (R) o
(S), o como (D) o (L) para aminoácidos. A menos que el contexto
indique lo contrario, se pretende que las referencias a dichos
compuestos abarquen todos los posibles diaestereómeros así como
también sus formas puras desde el punto de vista óptico y racémico.
Los isómeros (R) y (S), o (D y L) activos ópticamente, pueden ser
preparados usando sintones quirales o agentes reactivos quirales, o
resueltos mediante técnicas convencionales. Cuando los compuestos
descritos en el presente documento contienen uniones dobles
olefínicas, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende
que incluyan tanto isómeros geométricos E como Z.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un
compuesto de la Fórmula II como ingrediente activo o su sal
aceptable desde el punto de vista farmacéutico también pueden
contener un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico
y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El término
"sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico" se
refiere a las sales preparadas a partir de ácidos o bases no
tóxicas aceptables desde el punto de vista farmacéutico que
incluyen ácidos o bases orgánicas o inorgánicas.
Cuando un compuesto de la Fórmula II es acídico,
las sales pueden ser preparadas a partir de bases no tóxicas
aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Las sales que
derivan de todas las formas estables de bases inorgánicas incluyen
aluminio, amonio, calcio, cobre, hierro, litio, magnesio,
manganeso, cinc, etc. Siendo las sales de amonio, calcio,
magnesio, potasio y sodio las de especial preferencia. Las sales
derivadas de bases no tóxicas orgánicas aceptables desde el punto
de vista farmacéutico incluyen sales de aminas primarias,
secundarias, y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas
sustituidas que se producen naturalmente, aminas cíclicas y resinas
de intercambio iónico básicas tales como arginina, betaína,
cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina,
dietilamina, 2-dietilaminoetanol,
2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina,
N-etilmorfolina, N-etilpiperidina,
glucamina, glucosamina, histidina, isopropilamina, lisina,
metilglucosamina, morfolina, piperacina, piperidina, resinas
poliaminas, procaína, purina, teobromina, trietilamina,
trimetilamina, tripropilamina, etc.
Cuando un compuesto de la Fórmula II es básico,
las sales pueden ser preparadas a partir de ácidos no tóxicos
aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Tales ácidos
incluyen los ácidos acético, bencensulfónico, benzoico,
camforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico,
glutámico, hidrobrómico, hidroclórico, isetiónico, láctico,
maleico, mandélico, metanosulfónico, mucico, nítrico, pamoico,
pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico,
p-toluenosulfónico, etc. Siendo los ácidos cítrico,
hidrobrómico, maleico, fosfórico, sulfúrico y tartárico los de
especial preferencia.
La capacidad de los compuestos de la Fórmula II
para inhibir las proteasas de serina los hace útiles para prevenir
o revertir los síntomas inducidos por estas enzimas en un mamífero.
Esta inhibición de enzima indica que los compuestos son útiles para
tratar, prevenir, o mejorar la enfermedad de
hiper-coagulación en mamíferos, especialmente en
seres humanos, y son útiles en los tratamientos post infarto de
miocardio y post angioplastía.
La capacidad de los compuestos para inhibir las
metalo-proteasas tales como la enzima convertidora
de angiotensina los hace útiles para prevenir o revertir los
síntomas inducidos por estas enzimas en un mamífero. Esta
inhibición de enzima indica que los compuestos son útiles para
tratar, prevenir, o mejorar la hipertensión en mamíferos,
especialmente en seres humanos.
La capacidad de los compuestos de la Fórmula II
para inhibir las isoenzimas de anhidrasa carbónica los hace útiles
para prevenir o revertir los síntomas inducidos por estas enzimas
en un mamífero. Esta inhibición de enzima indica que los compuestos
son útiles para tratar, prevenir, o mejorar las enfermedades
oculares, en especial, el glaucoma en mamíferos, especialmente en
seres humanos.
Estos compuestos también pueden ser utilizados
como librerías para descubrir nuevas estructuras guía mediante la
evaluación a través de una serie de ensayos biológicos, que
incluyen el descubrimiento de patrones de inhibición selectiva en
las isoenzimas. Por lo tanto, estas librerías son herramientas para
el descubrimiento de drogas; es decir, como medio para descubrir
nuevos compuestos guía mediante el control sistemático de las
librerías frente a una variedad de objetivos biológicos y para
desarrollar relaciones de estructura / actividad en grandes
familias de compuestos relacionados. Las librerías pueden ser
probadas con los ligandos unidos a los soportes sólidos como se
describe en la Fórmula I o los compuestos individuales II pueden
ser separados antes de la evaluación. Con los compuestos de la
Fórmula I, se pueden usar los ensayos de control tales como los
ensayos de superficie de células y de separación FACS. Cuando un
compuesto se separa antes de la evaluación, se mantiene su relación
con el soporte sólido, por ejemplo, mediante la ubicación en la
cuadrícula de una placa estándar de 96 pocillos o mediante la
ubicación de la actividad en una superficie de células. El soporte
sólido asociado con la bioactividad o el soporte sólido relacionado
con el ligando separado puede entonces ser
de-codificado para revelar los antecedentes
sintéticos o estructurales del compuesto activo (Ohlmeyer et al.,
Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 90, 10922-10926, Dic.
1993).
Inhibición de Xantina Oxidasa - : Se
utilizan los siguientes materiales:
3,9 \muM de hipoxantina
0,3 mM de 4-aminoantipireno
2 mM de
3,5-dicloro-2-hidroxibencenosulfonato
50 mM de solución reguladora de fosfato de sodio,
pH 7,5
5 U/mL de peroxidasa de rábano (Sigma
P-6782, 5500 U/5 mg)
3 nM de inhibidor xantina oxidasa (suero de
leche, Sigma X-4500, 16 U/mL)
Se llevaron a cabo las reacciones en un volumen
total de 24 \muL en platos de microtitulación de polipropileno
con fondo en U de 96 pocillos (Costar) que contenían los
compuestos de la prueba. Se agregó en cada pocillo, 8 \muL de
solución reguladora de fosfato de sodio, pH 7,5. Se preparó una
mezcla de sustrato sobre hielo mezclando 0,53 mL de solución
reguladora de fosfato de sodio, 0,4 mL de
4-aminoantipireno (0,61 mg/mL), 0.4 mL de
3,5-dicloro-2-hidroxibencenosulfonato
(5,3 mg/mL), 4 \muL de peroxidasa de rábano (Sigma
P-6782, 5500 U/5 mg), y 128 \muL de hipoxantina
920 \mug/mL. Se incorporaron 8 \muL de la mezcla de sustrato en
cada pocillo mediante pipeta. Por último se agregaron 8 \muL de
xantina oxidasa (suero de leche, 9,0 nM, Sigma
X-4500,16 U/mL) en solución reguladora de fosfato
de sodio, pH 7,5 (o solución reguladora sola como control),
directamente en la mezcla de la reacción. Las placas fueron entonces
giradas por impulso durante un corto período en una centrífuga de
mesa antes de leer la capacidad de absorción. La capacidad de
absorción es medida usando un programa de cinética doble (490 menos
650 nm) durante 15 min a temperatura ambiente sin
auto-mezclado, en un lector de microplaca
(Molecular Devices Thermomax). Los índices iniciales son calculados
(programa Vmax)y comparados con aquellos de las reacciones
sin inhibidor.
Otros ensayos para evaluar los compuestos son
bien conocidos en la técnica. A continuación se enumeran los
ejemplos representativos de referencias que enseñan estos
ensayos:
Inhibición de ACE - Holmquist et al., "A
Continuous Spectrophotometric Assay for Angiotensin Converting
Enzyme", Biochem.,95, 540-548 (1979).
Inhibición de Trombina - Lottenberg et
al., "Assay of Coagulation Proteases Using Peptide Chromogenic
and Fluorogenic Substrates", Meth. in Enzymol.,
80,341-361, (1981).
Inhibición de Anhidrasa Carbónica - Maren
y Couto, "The Nature of Anion Inhibition of Human Red Cell
Carbonic Anhydrases", Archiv. of Biochem. and Biophy.,196, No.
2, Sept., 501-510 (1979).
Inhibición de Anhidrasa Carbónica -
Ponticello et al.,
"Thienothiopyran-2-sulfonamides: A
Novel Class of Water-Soluble Carbonic Anhydrase
Inhibitors", J. Med. Chem.,30, 591597 (1987).
\newpage
Las librerías de la presente invención pueden ser
preparadas de acuerdo con los métodos siguientes. En cada etapa de
la síntesis cada soporte sólido sobre el cual se sintetiza un
compuesto es etiquetado de forma única para definir el evento o
eventos químicos particulares que se producen durante dicha etapa.
El etiquetado se logra mediante el uso de identificadores tales
como aquellos en la Fórmula IV, que registran los eventos
secuenciales a los que se expone el soporte durante la síntesis,
facilitando de este modo antecedentes de la reacción para el
compuesto producido en cada soporte. Los identificadores son usados
en combinación entre sí para formar un esquema de codificación de
orden superior o binario que permite a una cantidad relativamente
pequeña de identificadores, codificar a una cantidad relativamente
grande de productos de reacción. Por ejemplo, cuando se usan en un
código binario, N identificadores pueden codificar hasta 2N
compuestos y/o condiciones diferentes. Los identificadores pueden
usarse para definir los antecedentes de la reacción de cada soporte
sólido, mediante la asociación de cada variable o combinación de
variables en cada etapa de la síntesis con una combinación de
identificadores que define de forma única las variables elegidas,
tales como el reactante, el agente de reacción, las condiciones de
reacción, o las combinaciones de estos.
Al llevar a cabo estas síntesis, se comienza con
por lo menos 10^{3}, preferentemente por lo menos 10^{4}, y
generalmente no excediendo 10^{15} de soportes sólidos.
Dependiendo del número pre-determinado de opciones
de R^{1} para la primera etapa, se dividen los soportes
adecuadamente en tantos recipientes como se sea necesario. Los
agentes reactivos y las condiciones de reacción adecuadas son
aplicadas para cada recipiente y se agrega y une la combinación de
identificadores que codifican para cada opción de R^{1}.
Dependiendo de la química concerniente, el etiquetado puede hacerse
antes de, concomitantemente con, o después de las reacciones que
comprenden cada opción. Como control, se pueden elegir soportes de
muestra en cualquier etapa y se puede separar y decodificar una
porción de sus etiquetas para verificar que las etiquetas correctas
estén unidas a los soportes de muestra. Si es necesario, las perlas
pueden ser lavadas para liberarlas de cualquier exceso de agentes
reactivos o sub-productos antes de continuar. Al
final de cada etapa, los soportes son combinados, mezclados, y
divididos nuevamente, esta vez, en tantos recipientes como esté
pre-determinado por la cantidad de opciones de A
para la segunda etapa de la síntesis. Este procedimiento de
dividir, reaccionar, etiquetar, y re-mezclar se
repite hasta que se completa la síntesis combinatoria.
Esquema
1
Los soportes funcionalizados tales como las
perlas de poliestireno injertadas con PEG que termina en hidroxi o
funcionalizadas amino son divididas en partes iguales en un número
pre-determinado de cubetas de reacción y son
reaccionadas con a) un elemento de unión / ligando separable que ha
sido pre-formado para generar 2 cuando el elemento
ligando separable termina en OH, o, b) un enlazador separable,
seguido de una reacción con un elemento ligando para generar 3 en
el caso que el elemento ligando separable termine en COOH. Los
compuestos 2 y 3 son entonces tratados con piperidina / DMF para
desproteger el grupo amino del elemento ligando R^{1} para
producir 4 (Esquema 1, etapa (c)). El etiquetado único de los
soportes en cada cubeta de reacción es logrado con las
combinaciones de identificadores codificados en un esquema
binario, por ej., como se describe en la Tabla 1-1
para siete opciones de R^{1}. Los identificadores se unen
mediante el agregado de una solución de identificadores (en un
índice de soporte sólido identificado de 5% peso / peso) a un lote
de soportes suspendidos en CH_{2}Cl_{2} y la agitación de la
mezcla durante 30 min. Se agrega a la mezcla una solución diluida
de atenuador de trifluoroacetato de rodio y se agita
inmediatamente. Se continúa agitando la mezcla durante la noche y
se lava en CH_{2}Cl_{2}.
Esquema
2
Los compuestos 4 son reunidos, mezclados y luego
divididos en una cantidad pre-determinada de cubetas
de reacción. Cada una de las cuales es tratada con un agente de
reacción correspondiente al elemento ligando A, en presencia de
HOBt/DMF para producir el compuesto 5. Las cubetas de reacción son
entonces tratadas con piperidina / DMF para
des-proteger el grupo amino terminal, y producir 6.
El etiquetado único de los soportes en cada cubeta de reacción es
logrado con las combinaciones de identificadores adicionales
codificados en un esquema binario, por ej., como se describe en la
Tabla 1-2 para 31 opciones de A.
Esquema
3
Los compuestos 6 son reunidos, mezclados y luego
divididos en una cantidad pre-determinada de cubetas
de reacción, cada una de las cuales es tratada con un agente de
reacción correspondiente al elemento ligando Y, en presencia de
solventes tales como CH_{2}Cl_{2} y DMF, y cuando sea necesario,
con agentes de reacción de condensación tales como DIC, agentes
catalizadores de acilación tales como DMAP, y bases tales como
trietilamina para producir el compuesto 7. El etiquetado único de
los soportes en cada cubeta de reacción es logrado con las
combinaciones de identificadores adicionales codificados en un
esquema binario, por ej., como se describe en la Tabla
1-3 para 31 opciones de Y. El compuesto 7 es
entonces expuesto a luz UV (\sim360 nm) en un alcanol inferior
tal como MeOH para separar la forma protegida de los compuestos de
la Fórmula II del complejo de soporte / unión o tratado primero con
TFA / tioanisol / EDT para eliminar los grupos de protección en las
cadenas laterales de R^{2} y luego expuesto a luz UV en un
alcanol inferior tal como MeOH para separar el compuesto II.
\newpage
ESQUEMA
1
Adición de
R^{1}
a. Restos unidos a carbonato
Agentes reactivos 1-4
\newpage
ESQUEMA 1
(continuación)
b. Restos unidos a éster
Agentes reactivos:
c. Desprotección de
Fmoc
\newpage
ESQUEMA
2
Adición de
A
(Prot) = opcional, no-Fmoc, grupo
de protección de cadena lateral estable básico.
ESQUEMA
3
Adición de
Y
\newpage
La Tabla 2 ilustra los compuestos representativos
de la Fórmula II.
Y-A-CO-R^{1}
| Y | A | R^{1} |
| 1 |
TABLA 2
(continuación)
| Y | A | R^{1} |
| 8 |
La Tabla 3 ilustra los compuestos adicionales de
la Fórmula II que son inhibidores de anhidrasa carbónica:
Y-A-CO-R^{1}
Compuestos
representativos
| Y | A | R^{1} |
| 1 |
| Y | A | R^{1} |
| 4 |
| Y | A | R^{1} |
| 11 |
| Y | A | R^{1} |
| 18 |
| Y | A | R^{1} |
| 26 |
| Y | A | R^{1} |
| 34 |
La presente invención es aún más definida,
mediante referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se
pretende sean ilustrativos y no limitadores.
Trece compuestos de la fórmula general:
donde:
n = 3-12 y Ar es
pentaclorofenilo, o
n = 4-6 y Ar es
2,4,6-triclorofenilo
fueron preparados de acuerdo con el Esquema 4 y
el siguiente ejemplo ilustrativo.
a) Se disolvieron metil vainillato (0,729 g, 4,0
mmol),
1-hidroxi-9-(2,3,4,5,6-pentaclorofenoxi)nonano
(1,634 g, 4,0 mmol) y trifenilfosfina (1,258 g, 4.8 mmol) en 20 mL
de tolueno seco bajo argón. Se agregó DEAD (0,76 mL, 0,836 g, 4,8
mmol) en forma de gotas y se agitó la mezcla a 25ºC durante una
hora. La solución fue concentrada a la mitad del volumen y
purificada mediante cromatografía de destello eluyendo con DMC para
dar 1,0 g (1,7 mmol, 43%) del producto como un sólido cristalino
blanco.
b) Se disolvió el metil éster de la Etapa (a)
(1,0 g, 1,7 mmol) en 50 mL de THF, se agregó 2 mL de agua, seguida
por LiOH (1,2 g, 50 mmol). La mezcla fue agitada a 25ºC durante una
hora, y después, refluida durante 5 horas. Después del enfriamiento
a 25ºC, la mezcla fue vertida en acetato de etilo (200 mL) y la
solución fue lavada con 1 M de HCI (3x 50 mL) luego NaCl sat'd
ac.(1 x 50 mL) y secada sobre sulfato de sodio. El solvente fue
eliminado y el ácido crudo fue azeotropado una vez con tolueno.
\newpage
c) Se disolvió el material crudo de la Etapa (b)
en 100 mL de tolueno, se agregó 10 mL (1,63 g, 14 mmol) de cloruro
de tionilo, y la mezcla fue refluida durante 90 minutos. El volumen
de la solución fue reducido a aproximadamente 30 mL por
destilación, y el tolueno restante fue eliminado por evaporación.
Se disolvió el cloruro ácido crudo en 20 mL de DCM seco y se enfrió
a -70ºC bajo argón y se agregó una solución de aproximadamente 10
mmol de diazometano en 50 mL de éter anhidro. La mezcla fue
calentada a r.t. y agitada durante 90 min. Se hizo bullir argón en
la solución durante 10 min., luego se eliminaron los solventes por
evaporación y el material crudo fue purificado mediante
cromatografía de destello, eluyendo con 10-20% de
acetato de etilo en hexano. Se obtuvo diazoquetona (0,85 g, 1,4
mmol, producción del 82% en las tres etapas) como un sólido de
color amarillo pálido.
Se hizo una mejora a la etapa final de
diazometilación, donde el cloruro ácido fue reaccionado con
(trimetilsilil)diazometano y trietilamina para dar el
identificador, el cual fue entonces usado sin más purificación.
Esta constituyó una mejora importante sobre la reacción original
con diazometano, ya que ahora, el identificador fue obtenido en
alta producción sin ningún sub-producto de
clorometilquetona. Además, la purificación mediante cromatografía de
destello no fue más necesaria, lo que en algunos casos había
resultado en una significativa descomposición del identificador,
catalizada por ácido.
Etapa Alternativa c) Se agrego a una solución del
cloruro de acilo (3,8 mmol, 1,00 eq.) y 1,85 mL (13,3 mmol, 3,50
eq.) de trietilamina en THF / acetonitrilo anhidro (1:1) a 0ºC bajo
argón, 5,7 mL (11,4 mmol, 3,00 eq.) de una solución de 2,0 M
(trimetilsilil)diazometano en hexanos. La solución de color
naranja resultante fue agitada a 0ºC durante 2 hora, después a 25ºC
durante 17 horas. (Si se formara un precipitado inmediatamente al
agregar el (trimetilsilil)diazometano, se agrega
CH_{2}Cl_{2} hasta que el precipitado se vuelva a disolver). Se
agregó EtOAc (250 mL), y la capa orgánica fue lavada con NaHCO_{3}
saturado ac.(100 mL) y H_{2}O (100 mL), y luego secada (MgSO_{4
}anhidro). La eliminación de los elementos volátiles al vacío
dieron un producto como cristales amarillos en una producción de
60-100%.
Los otros 12 identificadores de la Fórmula IV
fueron preparados por vías sintéticas análogas, etapas (a), (b), y
(c).
En la síntesis del Ejemplo 1, los 13
identificadores fueron usados para codificar la librería
combinatoria. En la Etapa 1, se usaron los identificadores de
pentaclorofenilo donde n = 10-12 (abreviados
C_{10}Cl_{5}, C_{11}Cl_{5}, y C_{12}Cl_{5}) en el
siguiente esquema de codificación binaria: 001 = (n = 12), 010 =
(n = 11) y 100 = (n = 10). En la Etapa 2, se usaron los
identificadores de pentaclorofenilo donde n = 5-9
(abreviados C_{5}Cl_{5}, C_{6}Cl_{5}, C_{7}Cl_{5},
C_{8}Cl_{5}, y C_{9}Cl_{5}) y se codificaron como se
describe a continuación: 00001 = (n = 9), 00010 = (n = 8), 00100 =
(n = 7), 01000 = (n = 6) y 10000 = (n = 5). En la Etapa 3, se
usaron los identificadores de pentaclorofenilo donde n =
3-4 (abreviados C_{3}Cl_{5} y C_{4}Cl_{5})
y se codificaron como se describe a continuación: 00001 = (n = 4),
00010 = (n = 3). También en la Etapa 3, se usaron los
identificadores de triclorofenilo donde n = 4-6
(abreviados C_{4}Cl_{3},C_{5}Cl_{3}, y C_{5}Cl_{3}) y
se codificaron como se describe a continuación: 00 100 = (n = 6),
01000 = (n = 5'), y 10000 = (n = 4).
En consecuencia, en la Etapa 1 el agente reactivo
3 (Tabla 1-1) está codificado "011" que
represente etiquetar esta opción en la síntesis con los dos
identificadores de pentaclorofenilo donde n = 11 y 12. Del mismo
modo, en la Etapa 3 el agente reactivo 52 (Tabla
1-3) está codificado "01110" que represente
etiquetar esta opción en la síntesis con el identificador de
pentaclorofenilo donde n = 3 y los dos identificadores de
triclorofenilo donde n = 5 y 6.
(Esquema pasa a la página
siguiente)
\newpage
ESQUEMA
4
Identificadores
Se preparó t-Butil
4-(acetoximetil)-3-nitrobenzoato
como lo describen Barany y Albericio, J Am. Chem. Soc. 1985,107,
4936-4942. Sin embargo, los intentos de seguir
también el procedimiento final de referencia para hidrazinolisis
del acetato mediante el uso de hidrato de hidracina en CHCl_{3} a
25ºC, produjo solamente cantidades vestigio del producto final
hidroximetilo deseado, que es el t-butil éster
pre-cursor del enlazador fotoseparable usado en el
presente documento. Se ha hallado en la actualidad que la
hidrazinolisis que usa hidrato de hidracina en MeOH o DMF a 25ºC
produce t-butil
4-(hidroximetilo)-3-nitrobenzoato en
alta producción pero que un sub-producto producido
en DMF por la reducción adicional de diimida de la funcionalidad
nitro de un grupo amino hace que este solvente no sea deseable.
Mediante el uso de MeOH como solvente, se obtuvo solamente el
producto final deseado en una producción casi cuantitativa.
Este nuevo procedimiento de hirazinolisis también
fue usado para producir el enlazador fotoseparable unido a la
resina NH_{2 }de TentaGel S.
T-Butil
4-(hidroximetil)-3-nitrobenzoato:
Se agregó a una solución de 14,1 g (47,7 mmol, 1,00 eq.) de
t-butil4-(acetoximetil)-3-nitrobenzoato
en MeOH (200 mL), 27,0 mL (477 mmol, 10,0 eq.) de hidrato de
hidrazina (55% hidrazina). La solución de color amarillo resultante
fue agitada a 25ºC durante 4 horas. Se agregaron EtOAc (250 mL) y
NaCl saturado ac.(85 mL), y se colecto la capa orgánica después de
ser agitados. La capa orgánica fue lavada aún más con NaCl saturado
ac. (2 x 85 mL), y después, secada (MgSO_{4}). La eliminación de
los elementos volátiles al vacío dio un producto en una producción
del 93% como cristales de color amarillo.
4-(hidroximetil)-3-nitrobenzamida
unido a NH_{2 }TentaGel S: Ver Ejemplo 1, Etapa 1 a.
La reacción se encuentra representada en el
Esquema 5.
ESQUEMA
5
Hidrazinolisis
Se suspendió TentaGel S NH_{2}, (10 g, 2,9
mmol, 0,29 mmol/g) en 60 mL de cloruro de metileno, ácido
4-acetoximetil-3-nitrobenzoico
(2,77 g, 11,6 mmol, 4 eq), DMAP (1.42 g, 11,6 mmol, 4 eq) y DIC
(1,81 mL, 1,46 g, 11,6 mmol, 4 eq) fue agregado en dicho orden. La
mezcla fue agitada a 25 ºC con un agitador manual durante 5 horas,
tiempo en el cual la resina dio una prueba Kaiser negativa. La
resina derivatizada fue lavada (cloruro de metileno 5 x 50 mL,
isopropanol 5 x 50 mL, después, cloruro de metileno 5 x 50 mL),
secada al vacío y almacenada en la oscuridad.
La resina de acetoximetilo mencionada más arriba
fue lavada con metanol (1 x 150 mL), después fue suspendida en 150
mL 10% de hidrazina/metanol. La resina fue agitada a 25ºC durante
44 horas, filtrada, luego lavada (metanol, 5 x 100 mL, después
cloruro de metileno, 5 x 100 mL) y secada al vacío.
Se colocaron tres lotes de la resina de
hidroximetilo mencionada más arriba (3 g cada uno, 0,84 mmol, 4.28
mmol/g) en 100 mL cubetas de síntesis y cada uno fue suspendido en
60 mL de diclorometano. Se agrego uno de ácido
N-Fmoc isonipecótico (0,885 g, 2,52 mmol, 3 eq),
ácido N-Fmoc nipecótico (0,885 g, 2,52 mmol, 3 eq),
y ácido
N-Fmoc-E-amino
caproico (0,890 g, 2,52 mmol, 3 eq) a cada uno de los tres lotes.
Se agregaron DMAP (0,031 g, 0,252 mmol, 0,3 eq) y después DIC (0,4
mL, 0,318 g, 2,52 mmol, 3 eq) a cada uno y se agitaron los lotes de
resina a 25ºC durante 22 horas. Los lotes de resina fueron
filtrados, lavados (cloruro de metileno (5 x 50 mL) e isopropanol
(2 x 50 mL), después, cloruro de metileno (5 x 50 mL)), y secada al
vacío.
Se disolvió
N-Fmoc-2-hidroximetilpiperidina
(1,35 g, 4 mmol, 1 eq) en 20 mL cloruro de metileno y se enfrió a
0ºC. Se agregó fosgeno (8 mL, 2 M solución en tolueno, 16 mmol, 4
eq) seguido por 2,6-lutidina (1,86 mL, 1,71 g, 4
eq), después, la mezcla fue agitada durante 30 min. La mezcla fue
concentrada en un evaporador rotativo para dar un lechado viscoso y
este residuo fue re-disuelto en 30 mL de cloruro de
metileno (la solución contenía algunos sólidos no disueltos). Se
agregó 'butil
4-hidroximetil-3-nitrobenzoato
(0,51 g, 2 mmol, 0,5 eq) y la mezcla fue agitada a 25ºC durante 2
horas. La mezcla de reacción cruda fue vertida en 200 mL de acetato
de etilo y esta solución fue lavada con 1 M de HCl (2 x 100 mL),
NaHCO_{3} saturado ac. (2 x 100 mL) y NaCl saturado ac.(1 x 100
mL). La solución fue secada sobre sulfato de magnesio, filtrada, y
evaporada para dar el producto crudo. Esto fue purificado mediante
cromatografía de destello eluyendo con 10-30% de
acetato de etilo / hexano para dar el producto (1,22 g, 1,97 mmol,
99%) como un sólido de color amarillo pálido.
\newpage
Se disolvió el carbonato mencionado mas arriba en
cloruro de metileno, se agregó 10 mL de TFA y la mezcla fue agitada
a 25ºC durante 16 horas. La solución fue diluida con 50 mL de
tolueno y evaporada para dar el ácido carboxílico como un aceite
amarillo viscoso que fue azeopado una vez con tolueno, y después
secado al vacío.
Se disolvió el ácido preparado más arriba (-2
mmol, 2 eq) en 30 mL de cloruro de metileno y esta solución fue
agregada a Tenta Gel S NH_{2} (3 g, 0,32 mmol/g, \sim1 mmol, 1
eq). La resina fue suspendida por agitación, luego se agregaron
DMAP (40 mg, 0,3 mmol, 0.3 eq) y DIC (0,47 mL, 0,4 g, 3 eq) en ese
orden. La mezcla fue agitada a 25ºC durante 19 horas, tiempo en el
cual la resina dio una prueba Kaiser negativa. La resina fue
filtrada y lavada (cloruro de metileno 10 x 50 mL), y después,
secada al vacío.
Los tres otros lotes de resina unida a carbonato
fueron preparados de forma análoga usando los mismos agentes
reactivos de la Tabla 1-1.
Se colocaron lotes de un gramo de los siete lotes
de resina de las Etapas 1(a) y 1(b) con el amino
ácido o amino alcohol protegido con N-Fmoc unido
adecuadamente en siete cubetas de síntesis separadas y se suspendió
cada una de ellas en 20 mL de cloruro de metileno.
Se prepararon soluciones de caldo de 200 mg de
C_{12}Cl_{5}, C_{11}Cl_{5}, y C_{10}Cl_{5} - enlazador
- diazoquetona (Preparación 1) en 4 mL de cloruro de metileno. Se
usaron alícuotas (1 mL) de las soluciones de caldo para preparar
las mezclas de codificación binaria adecuadas para cada uno de los
siete lotes de resina. Se agregó la mezcla de codificación adecuada
a cada lote de resina y esta resina se agitó durante 1 hora. Se
agregó atenuador de trifluoroacetato de rodio (1 mL de una solución
de 1 mg/mL en cloruro de metileno) a cada una de las cubetas y la
resina fue agitada a 25ºC durante toda la noche. Cada lote de
resina fue lavado con cloruro de metileno (1 x 50 mL), después los
lotes fueron combinados y la librería completa (siete compuestos)
fue lavada con cloruro de metileno (10 x 50 mL).
Se eliminaron los grupos de protección
N-Fmoc mediante el lavado de la resina una vez con
DMF, se la filtró, después se la suspendió en 60 mL 50% de
piperidina / DMF y se la agitó a temperatura ambiente durante 30
min. La resina fue filtrada, lavada (DMF (5 x 50 mL) y cloruro de
metileno (10 x 50 mL)) y secada al vacío.
Se dividió la resina secada de la Etapa
1(d) en 31 lotes de 210 mg (\sim0,07 mmol), cada uno de
los cuales fue colocado en una cubeta de síntesis de 20 mL. Se
disolvió cada uno de los agentes reactivos (0,25 g, > 0,4 mmol,
> 6 eq) (Tabla 1-2) usados en la segunda etapa de
la síntesis (aminoácido N-Fmoc con protección de
cadena lateral lábil ácida en los casos que correspondiera) en 10
mL de cloruro de metileno. Se agregó HOBt (1 mL de 1 mg/mL en DMF)
y se agitaron brevemente las soluciones. Se agregó más DMF a
aquellos aminoácidos que no se habían disuelto por completo. Se
agregó cada solución de agente reactivo a uno de los 31 lotes de
resina. Se agregó DIC (0,2 mL, \sim1 mmol) a cada cubeta y se
agito la resina a 25ºC durante toda la noche. Se filtro cada uno de
los lotes de resina y se lavo separadamente (DMF (1 x 15 ml) y
cloruro de metileno (10 x 15 mL)). Se suspendió la resina en 10 mL
de cloruro de metileno.
Se prepararon soluciones de caldo de 160 mg de
C_{9}Cl_{5}, C_{8}Cl_{5}, C_{7}Cl_{5},
C_{6}Cl_{5}, y C_{5}Cl_{5}
-enlazador-diazoquetona (Preparación 1) en 16 mL de
cloruro de metileno. Se usaron alícuotas (1 mL) de las soluciones
de caldo para preparar las mezclas de codificación binaria
adecuadas para cada uno de los 31 lotes de resina (Tabla
1-2). Se agregó la mezcla de codificación adecuada
a cada uno de los lotes de resina y esta resina se agitó durante 30
min. Se agregó atenuador de trifluoroacetato de rodio (1 mL de una
solución de 1 mg/mL en cloruro de metileno) a cada una de las
cubetas y la resina fue agitada a 25ºC durante toda la noche. Se
filtro cada uno de los lotes de resina y se lavo separadamente con
cloruro de metileno (1 x 15 mL). Los lotes fueron combinados y la
librería completa (217 compuestos) fue lavada con cloruro de
metileno (5 x 50 mL).
Se eliminaron los grupos de protección
N-Fmoc mediante el lavado de la resina una vez con
DMF, se la filtró, después se la suspendió en 60 mL 50% de
piperidina / DMF y se la agitó a temperatura ambiente durante 30
min. La resina fue filtrada, lavada (DMF (5 x 50 mL) y cloruro de
metileno (10 x 50 mL)) y secada al vacío.
Se dividió la resina secada de la Etapa
2(c) en 31 lotes de 150 mg (\sim0,05 mmol), cada uno de
los cuales fue colocado en una cubeta de síntesis de 20 mL. Se
disolvió cada uno de los agentes reactivos (0,25 g, > 0,4 mmol,
> 8 eq) usados en la tercera etapa de la síntesis fue disuelto
en cloruro de metileno o DMF o una mezcla de ambos según
correspondiera (Tabla 1-3). Se agregó cada solución
de agente reactivo a uno de los 31 lotes de resina, después, se
agregó cualquier co-agente reactivo como fuera
necesario (ver tabla). Se agitaron los lotes de resina a 25ºC
durante toda la noche, y luego se lavaron separadamente (DMF (1 x
10 mL) y cloruro de metileno (10 x 10 mL)).
Se prepararon soluciones de caldo de 200 mg de
C_{4}Cl_{5} y C_{3}Cl_{5} -diazoquetona- enlazador
(Preparación 1) en 16 mL de cloruro de metileno. Se prepararon
soluciones de caldo de 600 mg de C_{6}Cl_{3}, C_{5}Cl_{3},
y C_{4}Cl_{3} -diazoquetona- enlazador (Preparación 1) en 16 mL
de cloruro de metileno. Se usaron alícuotas (1 mL) de las
soluciones de caldo para preparar las mezclas de codificación
binaria adecuadas para cada uno de los 31 lotes de resina (Tabla
1-3). Se agregó la mezcla de codificación adecuada
a cada uno de los lotes de resina y esta resina se agitó durante 30
min. Se agregó atenuador de trifluoroacetato de rodio (1 mL de una
solución de 1 mg/mL en cloruro de metileno) a cada una de las
cubetas y la resina fue agitada a 25ºC durante toda la noche. Se
filtro cada uno de los lotes de resina y se lavo separadamente con
cloruro de metileno (1 x 15 mL). Los lotes fueron combinados y la
librería completa (6727 compuestos) fue lavada con cloruro de
metileno (5 x 50 mL), y luego secada al vacío.
Se suspendieron las resinas combinadas de la
Etapa 3(b) (- 2 g) en 60 mL TFA / tioanisol / EDT (50150/5)
y se agitaron a temperatura ambiente durante todo la noche. La
resina fue filtrada, lavada (cloruro de metileno (10 x 50 mL)) y
secada al vacío.
Se coloca una perla en un capilar pirex de 13 mm
de diámetro con 2 \muL de acetonitrilo. Se agrega una solución de
nitrato de amonio cérico (2 \muL de una solución 0,1 M aq.) y
hexano (3 \muL) y se centrífuga brevemente la mezcla de dos
fases. El tubo se sella y se deja a 35 ºC durante 16 horas, y luego
se abre. La capa orgánica es removida con una jeringa y mezclada
con 1 \muL de N,
O-bis(trimetilsilil)acetamida. La
solución de etiqueta silada (1 \muL) es analizada mediante
cromatografía gaseosa con detección de captura de electrón (EC -
del inglés "electrón capture").
El análisis por GC es realizado con un
cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard 5890 plus. Se usa una
inyección de columna en un vacío de retención de 5 m, 032 mm
conectada a una columna de fenilmetilsilicona al 5% reticulada de
25 m, 0,2 mm. Los programas de temperatura y presión para el
análisis son 200-320ºC, 15ºC /min, después 320ºC
durante 10 min y 20-40 psi a 2 psi /min, después 40
psi durante 10 min. El detector de EC es mantenido a 400ºC y el gas
auxiliar es fijado a 35 psi.
TABLA
1-1
Residuos de R^{1} y esquema de
codificación
| Residuo de R^{1} | Código binario |
| 1 |
TABLA 1-1
(continuación)
| Residuo de R^{1} | Código binario |
| 3 |
TABLA
1-2
Agentes Reactivos de R^{2} y Esquema de
Codificación
| Agente Reactivo | Código binario |
| 8 |
\newpage
TABLA
1-2
| Agente Reactivo | Código binario |
| 11 |
TABLA 1-2
(continuación)
| Agente Reactivo | Código binario |
| 21 |
TABLA 1-2
(continuación)
| Agente Reactivo | Código binario |
| 29 |
Agentes reactivos de Y y esquema de
codificación
| Agente Reactivo Y | Solvente | Co-Agente(s) | Código | |
| Reactivos | Binario | |||
| 39 |
| Agente Reactivo Y | Solvente | Co-Agente(s) | Código | |
| Reactivos | Binario | |||
| 45 |
| Agente Reactivo Y | Solvente | Co-Agente(s) | Código | |
| Reactivos | Binario | |||
| 53 |
| Agente Reactivo Y | Solvente | Co-Agente(s) | Código | |
| Reactivos | Binario | |||
| 61 |
| Agente Reactivo Y | Solvente | Co-Agente(s) | Código | |
| Reactivos | Binario | |||
| 68 |
Un compuesto de la Fórmula II de la estructura
V:
fue sintetizado esencialmente como se describió
en el Ejemplo 1, pero sin el agregado de identificadores. La
síntesis fue llevada a cabo usando aproximadamente 100 \mum 1% de
perlas de poliestireno reticuladas con DVB y 130 \mum de perlas
de poliestireno, reticulado con DYB. Al final de cada etapa, el
ligando, o ligando intermedio, fue separado de una porción de las
perlas. Al final de la Etapa 3, se separó una porción del ligando
en el soporte injertado con PEG mientras permanecía protegida y
otra porción fue desprotegida antes de la separación. El ligando en
el soporte reticulado con DVB fue desprotegido antes de la
separación. La Tabla 2-1 presenta los datos de
producción para ambas síntesis. Las producciones fueron calculadas
basadas en las funcionalidades disponibles (\sim300 pmol) en cada
perla.
| Producciones comparativas | ||
| Poliestireno DVB (%) | Poliestireno PEG (%) | |
| Etapa 1 | 49 | 85 |
| Etapa 2 | 31 | 45 |
| Etapa 3 -- | ||
| \hskip9mm Protegida | 58 | |
| Desprotegida | 8 | 61 |
Claims (6)
1. El uso de perlas de poliestireno injertado con
polietilenglicol reticulado con divinilbenceno como soportes
sólidos para construir librerías combinatorias no oligoméricas.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el ligando es separado de los soportes sólidos por medio de
fotólisis.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
reivindicación 2, donde el poliestireno injertado con
polietilenglicol reticulado con divinilbenceno está funcionalizado
con grupos amino, hidroxi, carboxi o halo.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el poliestireno injertado con polietilenglicol reticulado con
divinilbenceno está funcionalizado con grupos amino o hidroxi.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4,
donde el poliestireno injertado con polietilenglicol reticulado con
divinilbenceno está funcionalizado con grupos amino.
6. Una librería combinatoria no oligomérica, en
la cual los soportes sólidos se encuentran en forma de perlas de
poliestireno injertado con polietilenglicol reticulado con
divinilbenceno, como se definió en una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
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