ES2199355T3 - Aparato analizador. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN APARATO DE RESONANCIA DE PLASMONES EN SUPERFICIE, PARA DETECTAR UN ANALITO SOLUBLE (UNA PROTEINA, POR EJEMPLO) O UN ANALITO PARTICULAR (UNA CELULA, POR EJEMPLO). EL APARATO COMPRENDE A) UN BLOQUE DE DETECCION ADAPTADO PARA RECIBIR UN DETECTOR, TENIENDO DICHO DETECTOR (UNA MICROPLAQUETA DE ANALISIS, POR EJEMPLO) UNA SUPERFICIE DE DETECCION METALIZADA CAPAZ DE FIJAR EL ANALITO; B) UNA FUENTE LUMINOSA QUE PUEDE GENERAR UNA ONDA EVANESCENTE A LA SUPERFICIE DE DETECCION DE UNA MICROPLAQUETA DE ANALISIS PRESENTE EN EL BLOQUE A DETECTAR; C) UN PRIMER DETECTOR CAPAZ DE DETECTAR LA LUZ PROCEDENTE DE LA FUENTE LUMINOSA QUE SE REFLEJA INTERIORMENTE DESDE LA SUPERFICIE DE DETECCION Y D) UN SEGUNDO DETECTOR (UNA CAMARA DE VIDEO, POR EJEMPLO) QUE ES CAPAZ DE DETECTAR LA LUZ DIFUNDIDA O EMITIDA POR UN ANALITO FIJADO EN DICHA SUPERFICIE DE DETECCION. EVENTUALMENTE, EL APARATO COMPRENDE ADEMAS UNA SEGUNDA FUENTE LUMINOSA PARA AUMENTAR LA INTENSIDAD DE LA LUZ DIFUNDIDA OEMITIDA POR UN ANALITO FIJADO EN LA SUPERFICIE DE DETECCION, ESTANDO LA SEGUNDA FUENTE LUMINOSA PREFERENTEMENTE DISPUESTA DE MANERA QUE LIMITE AL MINIMO LA CANTIDAD DE LUZ EMITIDA POR EL ANALITO Y DETECTADA POR EL PRIMER DETECTOR. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A DETECTORES DISEÑADOS PARA UTILIZARSE EN EL APARATO Y A LOS PROCEDIMIENTOS QUE PERMITEN DETECTAR ANALITOS EN LAS MUESTRAS Y QUE CONSISTEN EN PONER DICHAS MUESTRAS EN CONTACTO CON LA SUPERFICIE DE DETECCION DEL APARATO.

Description

Aparato analizador.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en sentido amplio, a aparatos para la detección de analitos. La invención se refiere además a métodos que emplean tales aparatos.

Antecedentes

El uso de resonancia de plasmones superficiales, SPR (del inglés, Surface Plasmon Resonance) para la detección de pequeños analitos solubles de una solución es bien conocido (véase, por ejemplo, ``Advances in Biosensors - A Research Annual Vol 1. 1991'' Red. A P F Turner, Pub. Jai Press Ltd, Londres).

Brevemente, un aparato SPR comprende, generalmente, una fuente de luz para generar luz polarizada; un sensor, cuyo exterior está revestido de metal y puede estar en contacto con una solución de muestra, y medios para detectar la luz que se refleja internamente desde la superficie interior del sensor.

En ausencia de analito fijado, la luz se refleja internamente de modo total bajo un ángulo incidente característico del índice de refracción (RI) del sensor y de la solución de muestra. Bajo un ángulo incidente (el ``ángulo SPR'') particular, la interacción del metal con la onda evanescente, constituida por reflexión interna de la luz polarizada, causa una caída en intensidad de la luz reflejada. Esta caída se puede observar usando el detector de luz.

La fijación de analito a la superficie del sensor, dentro de la zona de onda evanescente, modifica el RI del sensor y, esto, perturba el ángulo SPR. Esta perturbación se puede observar usando el sensor de luz y relacionar con la concentración superficial de analito.

La detección SPR en la literatura ha estado limitada, generalmente, al uso con analitos de tamaño molecular solubles, por ejemplo, biomoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos que se unen, específicamente, dentro de la zona evanescente usando ligandos apropiados.

El documento US-A-5.485.277 y el artículo ``Two-colour approach for determination of thickness and dielectric constant of thin films using surface plasmon resonance spectroscopy'' in Optics Communications, Vol. 130, Nº 4/06, de 1 de octubre de 1996, páginas 260-266, de Peterlinz et al., describe diversos tipos de aparato de resonancia de plasmones superficiales (SPR). La patente US-A-5.437.840 describe un aparato que determina la cantidad de un analito detectando cambios en el índice de refracción o cambios en la frecuencia de resonancia.

No obstante, estos aparatos y técnicas no han sido adecuados para detectar con precisión materiales de muestra con analitos tanto solubles como insolubles en ellos. En particular, debido al modo más limitado en el que (por ejemplo) células aproximadamente esféricas de diámetro de varios mm interactúan con la zona evanescente, se han detectado sólo concentraciones bastante altas (por ejemplo, de 107-108 ml) usando SPR. Por consiguiente, a fin de detectar células, en oposición a (por ejemplo) antígenos de proteínas, se han requerido aparatos adicionales, y por consiguiente más coste, tiempo y experimentación. Por ejemplo, se han detectado frecuentemente células usando técnicas de cultivo seguidas por detección específica.

El documento WO-A-9005295 describe, también, un aparato SPR y sugiere además la medición de luz dispersada por analito. La intensidad de luz recogida se usa como una medida de analito total presente.

Según la presente invención, un aparato de resonancia de plasmones superficiales para detectar un analito soluble o en partículas comprende las propiedades establecidas en la reivindicación 1.

Preferiblemente, el primer detector que está situado en el lado de la superficie del sensor opuesto a aquél sobre el que es incidente luz de la fuente que genera la onda evanescente. Sensores adecuados son portaobjetos.

Analitos posibles pueden incluir aquellos analitos en partículas o insolubles que contienen o consisten en biomoléculas, por ejemplo bacterias u otras células, esporas, virus o viriones, etc., o las propias biomoléculas, tales como proteínas o polinucleótidos. Objetivos bacterianos posibles incluyen criptosporidio, E. coli, salmonela, etc.

El aparato se puede usar, así, con una amplia variedad de muestras de las que se sospecha o se sabe que contienen analitos. Por ejemplo, muestras medioambientales tales como agua, o muestras biológicas.

Hablando en sentido amplio, el aparato funciona como sigue: en uso, el segundo detector detecta la fijación de analitos solubles a la superficie del sensor detectando los cambios en la intensidad de luz internamente reflejada desde la superficie del sensor, mientras que el primer detector detecta analitos en partículas fijados a la superficie del sensor detectando la luz dispersada desde ella. El aparato de la presente invención es capaz, por lo tanto, de la detección sensible de analitos tanto solubles como en partículas, y puede proporcionar, así, una alternativa más rápida, más barata o más sensible a los métodos y aparatos actualmente usados en la técnica.

Es importante subrayar las diferentes funciones de los detectores en el aparato. El segundo detector debe estar dispuesto para detectar luz internamente reflejada desde la superficie del sensor, siendo la intensidad de esta luz dependiente de los efectos SPR que se presentan, como analitos (especialmente los solubles) que se unen a la superficie del sensor modificando el índice de refracción de la interfase sensor/muestra. El detector puede ser un detector de agrupaciones en 2-D, como se describe con mayor detalle en los ejemplos que siguen.

En contraste con esto, el primer detector detecta luz que es dispersada por analitos (especialmente los que están en partículas) que interactúan con el campo evanescente en la superficie del sensor. Esto puede proporcionar una sensibilidad para detectar analitos en grandes partículas de varios órdenes de magnitud superiores que los que se podrían obtener usando SPR puro. Claramente, la naturaleza del primer detector usado determinará la sensibilidad y agudeza de la detección, pero en realizaciones preferidas, células únicas fijadas dentro de la zona evanescente se pueden detectar y resolver usando el primer detector, mientras que los efectos de fijación a granel de moléculas solubles se pueden detectar usando el segundo.

En una realización, el primer detector está situado en el mismo lado de la superficie que la fuente de luz, tal como para ser capaz de detectar luz que se dispersa hacia atrás cuando un analito se une a ella.

La expresión ``fuente de luz'', como se usa en esta memoria, significa cualquier fuente de radiación de luz, incluyendo, cuando sea apropiado, la punta de una fibra óptica que está fijada a una fuente de radiación alejada.

En una realización diferente, el primer detector está situado en el lado opuesto de la superficie, como el detector de fuente de luz, tal como para ser capaz de detectar luz que se dispersa cuando un analito está fijado a ella.

En cualquier caso, puede ser deseable que el primer detector esté situado como para ser capaz de detectar luz dispersada bajo un ángulo predeterminado, por ejemplo sustancialmente normal, a la superficie del sensor. Esto minimizará la interferencia de la luz que se está reflejando internamente en su totalidad desde la superficie.

Generalmente, el bloque de sensores comprenderá un prisma o un semicilindro, tal como son conocidos por los expertos en la técnica de detección SPR. El bloque de sensores está adaptado para recibir el sensor desmontable que proporciona la superficie metalizada. La adaptación puede consistir, simplemente, en proporcionar un área general para montar el sensor como un portaobjetos, o el bloque puede estar especialmente conformado o configurado para recibirlo, por ejemplo, en una acanaladura o en un pocillo apropiadamente dimensionado.

El bloque y/o sensor puede, además, estar adaptado para formar toda o parte de una pared de un canal de flujo, a través del que puede circular una muestra de líquido en contacto de líquido con la superficie metalizada. Un aparato que comprende tal canal de flujo forma una realización del primer aspecto de la invención.

Preferiblemente, la superficie del sensor metalizada está adaptada o de otro modo funcionalizada tal como para facilitar la inmovilización de macromoléculas que son capaces de fijar específicamente biomoléculas a ellas. Por ejemplo, el sensor puede tener una superficie dextran hidrófila. Se pueden inmovilizar, entonces, anticuerpos a ella a fin de fijar, específicamente, analitos antigénicos. Alternativamente, una sonda de polinucleótidos se puede inmovilizar para fijar, específicamente, unos analitos de polinucleótidos.

Preferiblemente, los anticuerpos, por ejemplo, están fijados sólo a porciones discretas de superficie a fin de facilitar la luz de detección que se dispersa cuando un analito está fijado a ella.

Estas porciones, entonces, son visualizadas (y, posiblemente, resueltas además) por el primer detector, mientras se contrastan áreas de brillo discreto contra las porciones más oscuras de la superficie, que no tienen macromoléculas fijadas a ellas.

La superficie puede tener más de un tipo de macromolécula inmovilizado a ella para fijar, específicamente, más de un tipo de antígeno. Los diferentes tipos de, por ejemplo, anticuerpo pueden estar fijados en áreas discretas conocidas a fin de identificar fácilmente qué antígeno se está fijando específicamente.

En una realización adicional de la invención, el aparato incluye una segunda fuente de luz. Esta se puede usar para aumentar la intensidad de la luz dispersada desde la superficie del sensor cuando un analito se une a ella. Aunque esta realización requiere componentes adicionales, tiene la ventaja de que se puede optimizar la fuente de luz (por ejemplo, la longitud de onda, el ángulo de incidencia contra la superficie del sensor, la intensidad) para dispersión

\hbox{de luz.}

Puede ser deseable situar la segunda fuente de luz tal como para minimizar la cantidad de luz directa emitida desde ella, que es detectada por el segundo detector.

Esto se puede hacer situando la segunda fuente de luz, de manera que luz emitida desde ella se desplace a lo largo de la misma trayectoria de luz, pero en sentido opuesto a la luz de la primera fuente de luz que se refleja internamente desde la superficie del sensor hasta el segundo detector, como se muestra en las figuras que siguen.

La(s) fuente(s) de luz usada(s) se puede(n) seleccionar sin trabajo excesivo por los expertos en la técnica. A fin de maximizar la intensidad, y por consiguiente la sensibilidad, la o cada fuente de luz puede ser una fuente de luz láser o un diodo emisor de luz.

En un segundo aspecto de la invención, un método para detectar un analito soluble o en partículas comprende las etapas establecidas en la reivindicación 8.

Por ejemplo, se puede detectar un analito soluble en una muestra detectando los cambios en la intensidad de luz internamente reflejada desde la superficie del sensor. Se puede detectar un analito en partículas en una muestra detectando la luz dispersada desde los analitos fijados a la superficie del sensor. Preferiblemente, el aparato está dispuesto de manera que se puedan detectar, simultáneamente, analitos solubles o en partículas.

Los medios adaptados para asegurar el primer detector pueden comprender un soporte o una mordaza situada y/o dimensionada para recibir la cámara y la óptica asociada, de manera que se pueda detectar luz dispersada desde la superficie del sensor. El soporte o la mordaza puede ser desplazable de un modo predeterminado para facilitar la función del primer detector cuando está en su sitio, por ejemplo, para permitir enfoque.

Preferiblemente, los medios están adaptados para asegurar el primer detector, de manera que sea capaz de detectar luz dispersada bajo un ángulo predeterminado, por ejemplo sustancialmente normal, a la superficie del sensor.

El segundo detector del aparato puede estar adaptado, también, tal como para recibir una segunda fuente de luz. La adaptación puede ser tal que la segunda fuente de luz, cuando está en su sitio, se configura para minimizar interferencia con el segundo detector al ser dirigida lejos de él, como se ha descrito anteriormente.

Figuras

La Fig. 1 muestra un diagrama esquemático de un aparato de resonancia de plasmones superficiales para detectar un analito soluble o en partículas, como se describe con más detalle en el Ejemplo 1.

La Fig. 2 muestra un diagrama de bloques del instrumento completo del Ejemplo 1.

La Fig. 3 muestra cómo se puede usar el aparato para detectar analitos múltiples. Las Figs. 3(a) y (b) muestran la fuente de luz, el semicilindro (más la superficie de detección) y el detector de agrupaciones de CCD esquemáticamente. La Fig. 3(c) muestra un detalle de la agrupación de CCD.

La Fig. 4 muestra partículas fijadas que dispersan luz de la superficie de detección metalizada de un sensor de semicilindro. La luz puede ser detectada por una cámara de vídeo (no mostrada).

La Fig. 5 muestra dispersión desde partículas bacterianas encima de una superficie de plata: los puntos de luz representan luz dispersada desde la Erwinia herbicola.

Ejemplos Ejemplo 1 Aparato de resonancia de plasmones superficiales para detectar un analito soluble o en partículas

La Fig. 1 muestra un diagrama esquemático de un aparato de resonancia de plasmones superficiales para detectar un analito soluble o en partículas, tal como podría ser construido (a la luz de la presente descripción) por los expertos en la técnica. Un diagrama de bloques de los componentes del aparato se muestra en la Fig. 2.

Este sistema se puede volver a disponer, si se desea, por ejemplo el polarizador se puede colocar después del semicilindro, si se requiere.

Considerando la Fig. 1, la trayectoria de luz hasta el segundo detector (``agrupación de CCD'') es desde la fuente de luz a la izquierda, a través del divisor de haz (que divide una porción hasta el detector de referencia), a través de un polarizador y de una lente de enfoque, fuera de la superficie interna del semicilindro, a través de una lente colimadora y hacia dentro de la agrupación de CCD.

La trayectoria de luz se muestra esquemáticamente en la Fig. 3(a). Una fuente colimada extendida se puede usar para iluminar la superficie del semicilindro continuamente con un intervalo de ángulos incidentes, como se muestra en la Fig. 3(b). La agrupación de CCD está compuesta por una agrupación pixelada de sensores de luz individuales, detectando cada uno un ángulo reflejado diferente o usándose para detectar un analito de muestra diferente (en este caso, 4 muestras diferentes) como se muestra en la Fig. 3(c). Esto permite la supervisión rápida sin partes móviles.

Considerando la Fig. 1, la trayectoria de luz hasta el primer detector (``cámara de CCD'') es desde la fuente de luz a la izquierda, a través del divisor de haz (que divide una porción hasta el detector de referencia), a través de un polarizador y de una lente de enfoque y sobre el semicilindro.

La intensidad está suplementada, en esta realización, por luz del diodo láser visible a la derecha, que se desplaza lejos de la agrupación de CCD y a través de la lente colimadora a la derecha, y sobre el semicilindro. El campo evanescente generado sobre la superficie superior metalizada del semicilindro hace que las partículas se unan en ella para dispersar luz, como se representa en la Fig. 4. La luz dispersada es enfocada a través de una lente y detectada por la cámara de CCD.

Se pueden construir dispositivos según el Ejemplo 1 basándose en máquinas SPR existentes, pero teniendo los componentes adicionales descritos anteriormente. Las máquinas y componentes pueden ser los disponibles comercialmente. Por ejemplo, la fuente de luz puede ser, ventajosamente, un LED emisor de borde, como se usa en comunicaciones por fibra óptica (por ejemplo, un S86018 de tipo EG & G). Un suministro de energía estabilizado se puede usar para minimizar los artefactos.

El sensor puede ser un portaobjetos de microscopio revestido de metal (o dieléctrico de grosor similar) que se iguala en índice sobre el semicilindro con fluido de índice de refracción similar. Una porción del semicilindro puede estar rebajado con muela para alojar el portaobjetos.

La agrupación de CCD (con ``píxeles'' de aproximadamente 20 \mum^{2}) puede ser de un tipo desarrollado para uso de vídeo. Se consiguió lectura del CCD transfiriendo una fila de áreas de muestra a un registrador de lecturas o de filas. Se puede usar muestreo doble correlacionado, CDS (del inglés, Correlated Double Sampling) para eliminar ruido. La salida analógica se puede hacer pasar a un procesador de señal digital a través de un ADC. Un procesador adecuado es un dispositivo analógico ADSP-2105. Éste puede estar comunicado con un PC central externo a través de un puerto paralelo bidireccional.

La cámara de vídeo de CCD puede ser una usual disponible comercialmente, por ejemplo, como la vendida por la firma Hamamatsu (de Japón).

Ejemplo 2 Método para usar el aparato de resonancia de plasmones superficiales

En uso, a fin de corregir diferencias en la intensidad de la fuente a lo largo del haz colimado, se puede llevar a cabo una calibración antes del experimento. La superficie del sensor se expone entonces a la(s) muestra(s). El ordenador central selecciona ángulos de visualización usando reflectividad contra exploraciones de ángulo. Los datos son adquiridos entonces durante un periodo de tiempo fijado y presentados por el PC central.

Ejemplo 3 Detección de analito en partículas usando el segundo detector

A fin de ilustrar la técnica de dispersión de luz, un portaobjetos de vidrio de microscopio se revistió con plata para resonancia de plasmones superficiales óptima (48 nm). El portaobjetos se montó entonces sobre un prisma semicilíndrico de vidrio y se iluminó con un láser de helio-neón de 3 mW. El portaobjetos se cubrió con una película de bacterias (Erwinia herbicola) a 1 x 10^{6}/ml en solución salina tamponada con fosfato. Se permitió entonces a las bacterias adsorber sobre la superficie del portaobjetos de plata de microscopio.

La salida desde la agrupación de CCD encima de la superficie SPR es una salida normal de vídeo con 256 niveles de brillo. La observación sobre la superficie de plata mostró que, inicialmente, todos los píxeles en la cámara de CCD proporcionaban una lectura baja (1-20) y la superficie apareció oscura. A medida que las bacterias se aproximaban a la superficie, el brillo aumentó para aquellos píxeles específicamente alineados con las áreas en las que las bacterias estaban sobre la superficie. El nivel de brillo máximo grabado desde la luz dispersada por las bacterias en la superficie fue 230. El aspecto de la superficie fue el de un fondo oscuro con puntos brillantes asociados con las bacterias sobre la superficie (véase Figura 5).

Como un control, una película de solución salina tamponada con fosfato sin bacterias se usó para cubrir la superficie de plata de un portaobjetos de microscopio similar. Esta vez, no se observó dispersión desde la superficie.

Claims (9)

1. Un aparato de resonancia de plasmones superficiales para detectar un analito soluble o en partículas, comprendiendo el aparato:

un sensor que proporciona una superficie metalizada para fijar el analito;

una fuente de luz dispuesta para generar una onda evanescente en la superficie del sensor;

un primer detector dispuesto para detectar luz dispersada por partículas de analito fijadas a la superficie metalizada y

un segundo detector dispuesto para detectar luz de la onda evanescente que se refleja internamente desde la superficie metalizada:

caracterizado porque dicho primer detector es una cámara de CCD dispuesta para permitir visualización de la distribución del analito por la superficie del sensor a partir de la luz dispersada por ella.

2. Un aparato según la reivindicación 1, en el que dicho primer detector está situado en el lado de la superficie del sensor opuesto a aquél sobre el que es incidente luz de la fuente que genera la onda evanescente.

3. Un aparato según la reivindicación 1, en el que el primer detector incluye medios de enfoque óptico.

4. Un aparato según cualquier reivindicación precedente, en el que el primer detector está dispuesto para detectar luz dispersada bajo un ángulo predeterminado con la superficie del sensor.

5. Un aparato según cualquier reivindicación precedente, caracterizado además por una segunda fuente de luz para aumentar la intensidad de luz dispersada desde un analito fijado a la superficie del sensor.

6. Un aparato según la reivindicación 5, caracterizado además porque la segunda fuente de luz está dispuesta para transmitir luz a lo largo de la misma trayectoria de luz, pero en el sentido opuesto a la luz de la fuente de luz evanescente que se refleja internamente desde la superficie del sensor hasta el segundo detector.

7. Un aparato según la reivindicación 5 ó 6, en el que la segunda fuente de luz transmite luz de una longitud de onda diferente de la de la fuente de luz evanescente.

8. Un método para detectar un analito soluble o en partículas, que comprende:

(a) fijar el analito a una superficie metalizada comprendida en un sensor;

(b) generar una onda evanescente en la superficie del sensor;

(c) detectar luz dispersada por partículas de analito fijadas a la superficie metalizada usando un primer detector y

(d) detectar luz de la onda evanescente que se refleja internamente desde la superficie metalizada usando un segundo detector

caracterizado porque dicho primer detector es una cámara de CCD dispuesta para permitir visualización de la distribución del analito por la superficie del sensor a partir de la luz dispersada por ella.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que el analito se selecciona de la lista que comprende: una célula procariota; una célula eucariota; un virus o unas proteínas de virión y un ácido nucleico.