ES2199815T3 - Mineralizacion y desarrollo celular supeerficial sobre biomateriales. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para generar una superficie mineralizada extendida sobre un material biocompatible, que comprende funcionalizar al menos una primera superficie de un material biocompatible para crear una pluralidad de grupos polares oxígeno en una superficie funcionalizada y poner en contacto dicha superficie funcionalizada in vitro con una cierta cantidad de una disolución que contiene un mineral eficaz para generar una mineralización extendida sobre al menos dicha primera superficie de dicho material biocompatible.

Description

Mineralización y desarrollo celular superficial sobre biomateriales.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a los diversos campos de la litografía, la química, los biomateriales y la ingeniería tisular. Más particularmente, concierne a la estructuración y/o la mineralización de los biopolímeros. Estos procedimientos proporcionados son particularmente adecuados para la generación de biomateriales tridimensionales modificados en superficie para su uso en cultivos celulares, transplantes e ingeniería tisular.

2. Descripción de la técnica relacionada

Muchos procedimientos biomédicos requieren la provisión de tejido sano para contrarrestar los procesos morbosos o el traumatismo que se está tratando. Este trabajo se entorpece a menudo por la tremenda escasez de tejidos disponibles para transplantes y/o injertos. La ingeniería tisular puede proporcionar últimamente alternativas al transplante de todo un órgano o tejido.

Con el fin de generar tejidos modificados, varias combinaciones de biomateriales y células vivas se están investigando actualmente. Aunque la atención se centra a menudo en los aspectos celulares de los procesos de ingeniería, las características de diseño de los biomateriales también constituyen un reto principal en este campo.

En los últimos años, la habilidad para regenerar tejidos y para controlar las propiedades del tejido regenerado se han investigado mediante el intento de ajustar las propiedades mecánicas o químicas del armazón biomaterial (Kim y col., 1997; Kohn y col., 1997). La mayoría de este trabajo ha implicado la incorporación de factores químicos dentro del material durante el procesamiento, o el ajuste de las propiedades mecánicas alterando los constituyentes del material.

Los procedimientos precedentes se han usado en un intento de utilizar las señales químicas o mecánicas para afectar los cambios en la proliferación y/o la diferenciación de las células durante la regeneración del tejido. A pesar de tales esfuerzos, permanece en la técnica una necesidad de biomateriales mejorados, particularmente aquellos con una capacidad mejor para dar soporte al completo crecimiento de tejido in vitro (en cultivo celular) e in vivo (tras la implantación).

El documento EP-A-0 891 783 revela un procedimiento para precalcificar un material poliéster biocompatible mediante incubación en una solución CaCl_{2}/Na_{2}HPO_{4}.

Sumario de la invención

La presente invención supera varios inconvenientes en la técnica proporcionando una serie de procedimientos mejorados, composiciones y dispositivos para su uso en cultivo celular, transplante celular e ingeniería tisular. Los procedimientos, composiciones y aparatos de la invención incluyen superficies biomateriales estructuradas y/o mineralizadas. Las técnicas y productos proporcionados son particularmente útiles para la generación de materiales de bioimplante tridimensionales o contorneados con propiedades de superficie modificadas y para la generación de biomateriales que incorporan factores bioactivos y/o células. Los diversos procedimientos para usar los biomateriales estructurados y/o mineralizados en ingeniería tisular, incluyen la ingeniería y vascularización del tejido óseo, proporcionando así control sobre los procesos biológicos.

La invención se define en las reivindicaciones.

La invención implica el tratamiento de superficie o funcionalización de un material biocompatible, preferiblemente un polímetro poroso y degradable, tal como una película o esponja, para estimular la nucleación y el crecimiento de una capa mineral extendida en la superficie. Tal tratamiento puede ser controlado para proporcionar una capa superficial mineral homogénea o una capa mineral estructurada, tal como islas de minerales. Cada una de tales capas minerales extendidas permite el crecimiento de capas minerales similares a hueso, incluso sobre las superficies internas de los poros de los armazones poliméricos.

Tales polímeros extensamente mineralizados, estructuradamente mineralizados y/o hipermineralizados, de la invención, tienen usos ventajosos en la ingeniería del tejido óseo y la regeneración y la vascularización tisular. La formación de islas minerales extendidas y/o de las sustancialmente homogéneas capas minerales "continuas", particularmente aquellas sobre las superficies internas de los poros de matrices tridimensionales, es ventajosa en la medida en que puede conseguirse de forma simple (una incubación de un paso), rápidamente (en aproximadamente 5 días), a temperatura ambiente, sin conducirnos a un descenso apreciable en la porosidad total del armazón o en el tamaño de los poros, y es flexible para una incorporación posterior de sustancias bioactivas.

La posterior incorporación de sustancias bioactivas se ejemplifica mediante la formación y el uso de polímeros, preferiblemente polímeros biodegradables, que son tanto mineralizados como proporcionados por la liberación sostenida de factores bioactivos, tales como los factores de crecimiento proteicos. En estos aspectos de la invención, la capa mineral puede controlarse mediante la alteración del peso molecular del polímero; la composición del polímero, la técnica de procesamiento (verificación del solvente, presión de calor, gas espumoso) usada para preparar el polímero; el tipo y/o densidad de los defectos sobre la superficie del polímero, y/o mediante la variación del tiempo de incubación.

El pretratamiento funcionalizado anterior a la mineralización puede involucrar un tratamiento estructurado de superficies biomateriales poliméricas usando un único proceso de "difracción litográfica". Los procedimientos litográficos anteriores de la estructuración de superficie se han limitado a superficies planas, bidimensionales, lo cual es una limitación significativa superada por los procedimientos proporcionados en este documento. La presente invención es así aplicable a la estructuración de superficie de biomateriales complejos tridimensionales con contornos de superficie.

Esto es particularmente sorpresivo en la medida en que esto proporciona patrones de suficiente resolución para ser útiles en realizaciones biológicas. Otras ventajas de la invención sobre los procedimientos de la técnica previa incluyen la incorporación preparada de componentes biológicamente activos dentro de los biomateriales estructurados y el riesgo reducido de contaminación. Otras características significativas de la invención son la efectividad de coste y la naturaleza ahorradora de trabajo de las técnicas.

Los varios biomateriales mejorados de la invención tienen usos ventajosos en el cultivo celular y tisular y en los procedimientos de ingeniería, tanto in vitro como in vivo. Siguiendo sólo el ejemplo, la presente invención proporciona procedimientos biomateriales y composiciones con superficies minerales estructuradas para su uso en la estructuración de la adhesión de las células óseas.

Por consiguiente, los procedimientos generales de la invención son aquellos adecuados para la modificación de superficie de al menos un primer material o dispositivo biocompatible, comprendiendo

la generación de una superficie mineralizada extendida sobre un material o dispositivo biocompatible mediante un procedimiento que incluye la funcionalización de al menos una primera superficie de un material o dispositivo biocompatible para crear una pluralidad de grupos polares de oxígeno en una superficie funcionalizada y poner en contacto la superficie funcionalizada con un incremento de una solución que contiene minerales, generándose así una mineralización extendida de al menos una primera superficie del material o dispositivo biocompatible.

El pretratamiento puede involucrar la generación de una superficie estructurada o de un material o dispositivo biocompatible mediante un procedimiento que incluye la irradiación de al menos una primera superficie fotosensible de un material o dispositivo biocompatible con una radiación electromagnética preestructurada, generándose así una estructura de al menos una primera superficie del material o dispositivo biocompatible.

Los procedimientos de irradiación, litográficos o la litografía de difracción generalmente incluyen la generación de una superficie estructurada sobre un material biocompatible mediante un procedimiento que incluye la funcionalización de al menos una primera superficie fotosensible de un material biocompatible mediante la irradiación de la superficie fotosensible con una cantidad de radiación electromagnética preestructurada efectiva para generar un material estructurado biocompatible que incluye una estructura sobre al menos una primera superficie del material biocompatible. En estos procedimientos, la superficie funcionalizada es funcionalizada para crear una pluralidad de grupos polares de oxígeno en la superficie, generalmente para que la superficie funcionalizada pueda ser modificada posteriormente, e.g., con minerales, células o similares.

Se notará así que los procedimientos para generar una superficie estructurada sobre un biomaterial o dispositivo, incluyen "directamente" la aplicación de radiación preestructurada sobre una superficie fotosensible de un material o dispositivo. La aplicación "directa" de la radiación preestructurada es una ventaja significativa sobre si esto ocurre sin la intervención de una "máscara", lo cual es una desventaja significativa en litografía de contacto. La presente invención proporciona así una litografía con "menos máscara" o "desnuda" para la estructuración biomaterial en la cual la radiación preestructurada está incidiendo directamente sobre una superficie fotosensible de un biomaterial en ausencia de una máscara intermedia.

La "radiación electromagnética", como se usa aquí, incluye todos los tipos de radiación que en origen son electromagnéticos, i.e., estando compuesta de campos eléctricos y magnéticos perpendiculares. La radiación preestructurada para usar en la invención es preferiblemente radiación electromagnética interferida constructiva o destructivamente.

La presente invención incluye el uso de toda la radiación interferida constructiva o destructivamente, tanto la interferencia constructiva o destructiva basada en la amplitud, como los hologramas de fase que dependen sólo de la interferencia constructiva o destructiva basada sólo en la fase. Una ventaja de los hologramas sólo de fase es que pasa mucha luz, y se puede formar un patrón más complejo. Sin embargo, el empleo de rejillas de difracción para proporcionar interferencia constructiva o destructiva basada en la amplitud es ventajosa en construcción y coste.

La radiación preestructurada puede ser interferida constructiva y destructivamente por una parte efectiva del espectro visible. La radiación constructiva y destructivamente interferida en los rayos ultravioleta, infrarrojos y del espectro visible son los ejemplos preferidos, con los espectros ultravioleta y visible como más preferidos.

La radiación preestructurada, interferida constructiva y destructivamente puede ser generada mediante la incidencia de radiación monocromática en un elemento óptico de difracción que convierte la radiación monocromática en radiación interferida constructiva y destructivamente.

La radiación monocromática puede ser generada desde cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, uno o más lásers o una o más lámparas de mercurio. La radiación monocromática puede ser generada primero desde una fuente de radiación electromagnética y entonces pasar a través de un filtro adecuado.

Un amplio rango de elementos ópticos de difracción pueden ser usados en la invención. "Elemento óptico de difracción" es un término que incluye rejillas de difracción, hologramas, y otros generadores de estructura. No hay virtualmente ninguna limitación a estos aspectos de la invención como algún componente del espectro pueda ser estructurado mediante algún tipo de elemento óptico mediante variación del diseño del elemento óptico. Por ejemplo, hay una relación bien definida entre la característica espaciamiento en un patrón de difracción, y el espaciamiento de las ranuras en el patrón de difracción más la longitud de onda de la radiación. Así, las anchuras de ranura pueden variarse para crear un patrón de espaciamiento con cualquier longitud de onda de radiación.

Por lo tanto, podemos usar en la invención una o más lentes de difracción, generadores con electrodos de desviación ordenados, lentes hemisféricas, kinoformas, rejillas de difracción, microlentes de Fresnel y/o un holograma sólo de fase. Aquellos que son hábiles con la técnica ordinaria entenderán que un "enrejado de difracción" actualmente produce un "patrón de interferencia", no un "patrón de difracción", lo cual es una razón de semántica resultante de la nomenclatura original de las "rejillas de difracción".

El/los elemento(s) óptico(s) difractivo(s) pueden fabricarse también a partir de cualquier material adecuado, tal como un polímero transparente o vidrio. Ejemplos de polímeros transparentes son aquellos seleccionados del grupo consistente en un poli(metil metacrilato), poli(estireno), y un poli(etileno) de alta densidad. Ejemplos de rejillas de difracción son aquellas fabricadas de metal sobre vidrio, metal sobre polímero o metal con aberturas de transmisión (ranuras u orificios). Otros elementos difractivos adecuados son aquellos fabricados a partir de sílice fundida o zafiro. La elección del elemento y la adecuación del elemento a las condiciones de procesamiento será rutina para aquellos que son hábiles con la técnica ordinaria.

Aquellos que son hábiles con la técnica ordinaria entenderán que la luz ultravioleta es menos adecuada para usarse con células. Cuando se usa luz visible, no se espera ningún compromiso de las funciones celulares. Solamente como una precaución, un límite superior puede ser aproximadamente de 6 W/cm^{2} (watios por centímetro cuadrado). Para la luz infrarroja, un límite superior de precaución puede ser de aproximadamente 2,2 MW/cm^{2} (megawatios por centímetro cuadrado).

Para usar con proteínas, un límite superior de precaución de rayos ultravioleta puede ser de aproximadamente 8 mW/cm^{2} (miliwatios por centímetro cuadrado). No es creíble que un límite superior de intensidad de luz visible limite la aplicación de la presente invención para su uso con proteínas. Para usar con proteínas y células, el calentamiento local durante la polimerización puede minimizarse fácilmente, e.g., mediante el empleo de resinas de alto peso molecular, y mediante el decrecimiento del tiempo total de polimerización.

La generación de una estructura con radiación electromagnética preestructurada incluye la generación directa de una superficie estructurada que sucede naturalmente como un resultado de la radiación electromagnética contactando con la superficie del biocompatible material. Por lo tanto, la "superficie fotosensible" del material biocompatible puede simplemente ser la superficie "sin modificar" del material biocompatible. La "generación de este modo" del procedimiento puede, por tanto, ser una característica inherente del procedimiento.

La "generación de este modo" puede por tanto incluir procedimientos donde la superficie fotosensible irradiada es "desarrollada" para proporcionar la superficie estructurada. Donde la superficie fotosensible no se ha cubierto por ningún material fotosensible en particular, la generación de la superficie estructurada después de la radiación incluye preferiblemente "el desarrollo" del biomaterial irradiado fotosensible para generar la superficie estructurada. "El desarrollo" en este sentido preferiblemente involucra el lavado o enjuagado en un líquido o solvente adecuado, tal como agua u otro solvente orgánico.

La invención incluye además más procedimientos indirectos de generar la superficie estructurada, i.e., donde la superficie fotosensible a irradiarse no es la superficie biomaterial sin modificar. En tales procedimientos, la superficie fotosensible se prepara mediante la aplicación de una composición fotosensible, mezcla, combinación, cobertura o capa al menos a una primera superficie del material biocompatible.

La composición fotosensible puede ser aplicada al menos a una primera superficie del material biocompatible mediante la puesta en contacto del material biocompatible con una formulación de la composición fotosensible en un solvente volátil y la evaporación del solvente para cubrir la composición fotosensible sobre al menos una primera superficie. La composición fotosensible puede también aplicarse a al menos una primera superficie del material biocompatible poniendo en contacto el material biocompatible con una formulación de la composición fotosensible en una solución acuosa o coloidal para adsorber la composición fotosensible sobre al menos una primera superficie.

Un pretratamiento funcionalizado puede, por lo tanto, incluir alternativamente los pasos de:

Alternativa I

(a)

aplicación de una capa fotosensible en al menos una primera superficie de un material;

(b)

creación de una radiación preestructurada;

(c)

irradiación de la capa fotosensible con la solución preestructurada para formar una capa irradiada; y

(d)

desarrollo de la capa irradiada para generar una estructura sobre al menos una primera superficie del biomaterial.

Alternativa II

(a)

aplicación de una capa fotosensible en al menos una primera superficie de un material;

(b)

obtención de una fuente de radiación monocromática;

(c)

incidencia de la radiación monocromática sobre un elemento que convierte la radiación monocromática en radiación estructurada;

(d)

irradiación de la capa fotosensible con la solución preestructurada para formar una capa irradiada; y

(e)

desarrollo de la capa irradiada para generar una estructura sobre al menos una primera superficie del biomaterial.

Alternativa III

(a)

aplicación de una capa fotosensible en al menos una primera superficie de un material;

(b)

obtención de una fuente de radiación monocromática;

(c)

transmisión de la fuente de radiación monocromática a través de un elemento que transforma la radiación monocromática en radiación estructurada;

(d)

incidencia de la radiación monocromática sobre la capa fotosensible del biomaterial para formar una capa irradiada; y

(e)

desarrollo de la capa irradiada para generar una estructura sobre al menos una primera superficie del biomaterial.

Puede usarse cualquiera de la amplia variedad de composiciones fotosensibles. Tales composiciones generalmente incluyen una cantidad efectiva combinada de al menos un primer fotoiniciador y al menos un primer componente polimerizable.

Las composiciones fotosensitivas adecuadas pueden incluir una cantidad iniciadora de polimerización de al menos un primer fotoiniciador excitable por radiación ultravioleta, tal como un fotoiniciador excitable por radiación ultravioleta seleccionado del grupo consistente en un derivado de benzoína, bencilcetal, hidroxialquilfenona, alfaaminocetona, óxido de acilfosfina, derivado de benzofenona y derivado de tioxantona.

Otras composiciones fotosensitivas pueden incluir una cantidad iniciadora de polimerización de al menos un primer fotoiniciador excitable por luz visible, tal como un fotoiniciador excitable por luz visible seleccionado del grupo consistente en eosina, azul de metileno, rosa de Bengala, butiltrifenilborato de dialquilfenacilsulfonio, un diariltitanoceno fluorinado, una cianina, un borato de cianina, una cetocomarina y un tinte de fluorona. Estas composiciones fotosensibles pueden incluir también una cantidad coiniciadora de al menos un primer coiniciador o acelerador, tal como un coiniciador o acelerador seleccionado del grupo consistente en una amina terciaria, peróxido, compuesto organoestannico, sal de borato y un imidazol.

La elección de componentes para usar en las composiciones fotosensibles será sencilla para aquellos que son hábiles con la técnica. Esencialmente, cualquier sistema fotoiniciador o iniciador y cualquier "resina" (tipos de componentes o monómeros para polimerizarse) pueden combinarse. La elección de resina es, por tanto, amplia. Por ejemplo, un "acrilato multifuncional" adecuado es cualquier monómero que pueda acrilarse.

Los componentes de tipo resina se usan en cantidades fotopolimerizables, tales como cantidades fotopolimerizables de al menos un primer componente polimerizable monomérico, oligomérico o polimérico. Los monómeros polimerizables adecuados incluyen aquellos seleccionados del grupo consistente en un poliéster insaturado de ácido fumárico, poliéster de ácido maleico, estireno, un monómero multifuncional de acrilato, un epóxido y un éter de vinilo.

Una composición fotosensitiva actualmente preferida incluye una cantidad efectiva combinada de un fotoiniciador de eosina, un componente polimerizable de diacrilato de poli(etilenglicol) y un acelerador de trietanolamina.

Los pretratamientos de la invención producen estructuras con una resolución de entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 500 \mum; de entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 100 \mum; o de entre aproximadamente 10 \mum y aproximadamente 100 \mum; o de entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 10 \mum; o de entre aproximadamente 10 \mum y aproximadamente 20 \mum. Estos son altamente adecuados para realizaciones biomédicas, aunque sustancialmente inadecuados para realizaciones microelectrónicas, al estar una sola célula en el rango de 10 \mum a 20 \mum. Los patrones con una resolución de aproximadamente 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o aproximadamente 600 \mum o similar pueden producirse y usarse con ventaja.

Una ventaja de la invención es que los procesos completos pueden llevarse a cabo a temperaturas biocompatibles. Por ejemplo, un material biocompatible puede mantenerse sobre un soporte de temperatura controlada durante la irradiación.

A los materiales biocompatibles, ya sea antes, durante, o después de la estructuración, se les pone en contacto con una cantidad de una solución que contiene minerales efectiva para generar alguna, moderada o, preferiblemente, extendida mineralización sobre al menos una primera superficie del material biocompatible. Tales procedimientos enlazan con los procedimientos de mineralización e incluyen el contacto anterior con una solución que contenga minerales.

Preferiblemente, al material biocompatible se le pone en contacto con la solución que contiene minerales durante o inmediatamente después de la generación de la superficie estructurada, formándose de este modo un material biocompatible mineralizado que incluye una estructura de minerales al menos en una primera superficie. Además, al menos una primera célula biológica mineral-adherente puede unirse subsiguientemente al material biocompatible mineralizado, para formar un patrón de células biológicas sobre al menos una primera superficie del material biocompatible.

Tanto la adherencia a minerales como la adherencia a células puede llevarse a cabo mediante la exposición del material biocompatible y/o del material biocompatible mineralizado a una población de minerales y/o células o bien in vitro o in vivo. Se puede usar una exposición secuencial o simultánea.

En los procedimientos de mineralización de la invención, uno de ellos genera una superficie mineralizada extendida sobre un material biocompatible mediante un procedimiento que incluye la funcionalización de al menos una primera superficie de un material biocompatible para crear una multiplicidad de grupos polares de oxígeno en una superficie funcionalizada y la puesta en contacto de una superficie funcionalizada con una cantidad, efectiva para generar mineralización extendida sobre al menos una primera superficie del material biocompatible, de una solución que contiene minerales.

Los métodos pueden incluir la generación de la superficie funcionalizada mediante la exposición de al menos una primera superficie de un material biocompatible a un pretratamiento de funcionalización anterior al contacto con la solución que contiene minerales. Los pretratamientos de funcionalización efectivos incluyen la exposición a una cantidad efectiva de radiación electromagnética, tal como radiación ultravioleta; exposición a una cantidad efectiva irradiación con rayo de electrones (rayos e); y exposición a productos químicos de funcionalización biocompatibles, tales como cantidades efectivas de una solución de NaOH.

Los procedimientos también incluyen procedimientos de un solo paso, en los cuales la superficie funcionarizada se genera durante el contacto con la solución que contiene minerales. Tales procedimientos de un solo paso para formar un biomaterial mineralizado que incluye una cobertura mineral extendida en una superficie del biomaterial, incluyen la incubación de un biomaterial mineralizable con una cantidad de una solución que contiene minerales, tal como una disolución acuosa de minerales, efectiva para generar una superficie biomaterial funcionalizada sobre la cual se forma una cobertura mineral extendida durante la incubación. Estos métodos se prefieren para usar con biomateriales poliméricos o copoliméricos, tales como biomateriales de polímero de ácido poliláctico (PLA), polímero de ácido poliglicólico (PGA) o copolímero de ácido poliláctico co-glicólico (PLG).

Cualquier procedimiento de mineralización, ya sea o no preestructurado, puede usar una solución que contiene minerales que incluya calcio, en la que la mineralización resultante, o mineralización extendida, incluye una cobertura extendida de calcio. Las soluciones que contiene minerales pueden también al menos un primer y un segundo minerales, en los cuales la mineralización resultante, o mineralización extendida, incluye una mezcla de los minerales primero y segundo. Más aún, las soluciones que contienen minerales pueden también incluir una pluralidad de minerales diferentes, en la cual la mineralización resultante, o mineralización extendida, incluye una cobertura heterogénea polimineralizada.

Los procedimientos son controlables para dar lugar a mineralización, mineralización extendida, mineralización estructurada, mineralización estructurada extendida, coberturas minerales sustancialmente homogéneas, porciones o regiones hipermineralizadas, superficies internas de poro de materiales porosos en los cuales una superficie mineral o una superficie mineral extendida se genera sobre la superficie interior del poro, y/o pluralidades de islas minerales discretas.

Los procedimientos para controlar la mineralización de superficie de polímeros biomateriales incluye la alteración del peso molecular, la composición del polímero, la razón de componentes dentro del polímero, la técnica de fabricación o las propiedades de superficie del polímero biomaterial con anterioridad a llevar a cabo al menos un primer procedimiento de mineralización de superficie. Los procedimientos permiten el control del tipo de mineralización de superficie y el grado de la mineralización de superficie, ejemplificada por el número o tamaño de islas minerales en la superficie del polímero biomaterial.

En un ejemplo, el polímero biomaterial es un copolímero biomaterial de ácido poliláctico co-glicólico, y la razón de los componentes de lactina y glicolina dentro de la composición del copolímero es alterada. En otro ejemplo, se altera al menos una primera propiedad de superficie de la composición del polímero. Más aún, el control de los defectos de superficie puede proporcionarse a la composición del polímero para proporcionar una nucleación controlada de las islas minerales discretas en la superficie del polímero biomaterial. La densidad de tales defectos de superficie puede ser alterada.

El periodo de tiempo de la mineralización de superficie puede alterarse también. Por ejemplo, el tiempo de los procesos de la mineralización de superficie puede extenderse hasta las islas minerales discretas en la superficie del polímero biomaterial expandiéndose para formar una cobertura mineral sustancialmente homogénea en la superficie del polímero biomaterial.

En todos esos métodos, la solución que contiene minerales puede ser un cuerpo fluido o un medio sintético que imita a un cuerpo fluido. El material biocompatible puede estar en contacto con la solución que contiene minerales mediante exposición a una solución que contiene minerales natural o sintética in vitro o mediante un fluido corporal conteniendo minerales in vivo.

Cualquiera de los procedimientos precedentes, ya sea para estructuración o para mineralización o para ambas, es adecuada para el uso directo con, o para adaptación para el uso con, virtualmente, cualquier material o dispositivo biocompatible. Por ejemplo, los materiales biocompatibles pueden incluir, al menos, una primera porción que es biodegradable, no biodegradable, tridimensional, similar a un armazón, sustancialmente bidimensional, bidimensional o similar a una película. Los materiales biocompatibles pueden incluir al menos una primera porción que tiene una estructura de poros interconectada o abierta.

Los materiales biocompatibles pueden además incluir al menos una primera porción que esté fabricada de metal, bioglass, aluminato, biomineral, biocerámica, titanio, titanio recubierto de biomineral, hidroxiapatita, hidroxiapatita carbonatada, carbonato cálcico, o de una porción de polímero presente en la naturaleza o sintética. Los polímeros pueden seleccionarse de colágeno, arginato, fibrina, matrigel, alginato modificado, elastina, quitosano, gelatina, poli(vinilalcohol), poli(etilenglicol), plurónico, poli(vinilpirrolidona), hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, poli(etilentereftalato), polianhidro, poli(propilenfumarato), un polímero enriquecido en grupos ácidos carboxílicos, polímero de ácido poliláctico (PLA), polímero de ácido poliglicólico (PGA), copolímero de ácido poliláctico co-glicólico (PLG), y copolímeros PLG que tienen una razón de aproximadamente un 85 por ciento de lactina frente a aproximadamente un 15 por ciento de glicolina.

Los materiales biocompatibles pueden además incluir al menos una primera porción que se prepara mediante un proceso que incluye espumación por gas y lixiviación de partículas, en los cuales, opcionalmente, al menos una primera sustancia bioactiva está operativamente asociada con el material biocompatible durante el proceso de espumación por gas y lixiviación de partículas.

El proceso de espumación por gas y lixiviación de partículas puede incluir los pasos de:

a)

preparación de una mezcla que incluye al menos un material particulado lixiviable y partículas capaces de formar un biomaterial polimérico poroso, degradable;

b)

someter la muestra a un proceso de espumación por gas para crear un biomaterial polimérico poroso, degradable, que incluye el material particulado lixiviable; y

c)

someter al biomaterial polimérico poroso, degradable, a un proceso de lixiviación que se lleva las el material particulado lixiviable del biomaterial polimérico poroso, degradable, del cual crea una porosidad adicional.

El proceso de lixiviación puede incluir la puesta en contacto del biomaterial polimérico poroso, degradable, con un mineral que contiene material lixiviado.

Los materiales biocompatibles pueden además incluir al menos una primera porción que es una superficie sustancialmente nivelada o una superficie contorneada. Como tal, el material biocompatible puede ser fabricado como al menos una porción de un dispositivo implantable.

Los procedimientos anteriores y los materiales biocompatibles y dispositivos resultantes pueden además incluir una cantidad biológicamente efectiva de al menos una primera sustancia bioactiva, fármaco bioactivo o célula biológica, dos de tales sustancias bioactivas, drogas o células biológicas o una pluralidad de sustancias bioactivas, drogas o células biológicas.

Los materiales bioactivos estructurados pueden así ser expuestos a al menos un primer mineral capaz de formar uniones, sustancia bioactiva o célula biológica, de lo cual se forma un material biocompatible que incluye un mineral, sustancia bioactiva o célula biológica unido en una estructura a al menos una primera superficie de ella. Cualquiera de los materiales biocompatibles mineralizados estructurados resultantes puede exponerse a al menos una primera célula mineral-adherente, la cual forma un material mineralizado biocompatible que incluye al menos una primera célula unida en una estructura a al menos una primera superficie de dicho material biocompatible.

Los factores de crecimiento y/o los ligandos de adhesión pueden ser usados para formar materiales biocompatibles recubiertos de un factor de crecimiento o ligando de adhesión comprendiendo al menos un primer factor de crecimiento o ligando de adhesión unido en una estructura a al menos una primera superficie de dicho material biocompatible. Tal material biocompatible recubierto de un factor de crecimiento o ligando de adhesión puede exponerse a al menos una primera célula adherente a factor de crecimiento o ligando de adhesión, de la cual se forma un material biocompatible mineralizado que incluye al menos una primera célula unida en una estructura a al menos una primera superficie de dicho material biocompatible.

La(s) sustancia(s) bioactiva(s) incluyen moléculas de DNA, moléculas de RNA, ácidos nucléicos antisentido, ribozimas, plásmidos, vectores de expresión, vectores virales, virus recombinantes, proteínas marcadoras, factores de transcripción o elongación, proteínas de control del ciclo celular, quinasas, fosfatasas, proteínas de reparación del DNA, oncogenes, supersores de tumores, proteínas angiogénicas, proteínas antiangiogénicas, receptores de la superficie celular, moléculas accesorias de señalización, proteínas transportadoras, enzimas, agentes antibacterianos, agentes antivirales, antígenos, inmunógenos, agentes inductores de apoptosis, agentes antiapoptóticos y citotoxinas.

La(s) sustancia(s) bioactiva(s) incluyen además hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, hormonas, receptores de neurotransmisores o de factores del crecimiento, interferonas, interleucinas, quimioquinas, citoquinas, factores estimuladores de colonia, factores quimiotácticos, componentes de la matriz extracelular, y moléculas de adhesión, ligandos y péptidos; tales como hormona del crecimiento, hormona paratiroidea (PTH), proteína ósea morfogenética (BMP), factor transformador del crecimiento \alpha (TGF-\alpha), TGF-\beta1, TGF-\beta2, factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), factor estimulador de colonia de granulocitos/macrófagos (GMCSF), factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de dispersión/factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), fibrina, colágeno, fibronectina, vitronectina, ácido hialurónico, un RGD que contiene péptido o polipéptido, una angiopoyetina y factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares (VEGF).

Las células biológicas incluyen células óseas progenitoras, fibroblastos, células endoteliales, precursores de las células endoteliales, células madre, macrófagos, fibroblastos, células vasculares, osteoblastos, condroblastos, osteoclastos y células recombinantes que expresan segmento(s) exógeno(s) de ácidos nucléicos, lo que produce productos transcripcionales o traducidos en la célula.

Los materiales biocompatibles pueden además incluir una cantidad biológicamente efectiva de al menos una primera sustancia bioactiva y al menos una primera célula biológica. Por ejemplo, una cantidad combinada biológicamente efectiva de al menos un primer factor de crecimiento osteotrópico o ácido nucléico de factor de crecimiento osteotrópico y una población celular que incluye células óseas progenitoras; o una cantidad biológicamente efectiva de VEGF o un ácido nucléico de VEGF y una población de células que los incluye.

La al menos primera sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica puede incorporarse dentro del material bicocompatible anteriormente a, durante, o seguidamente a, el proceso de modificación de superficie. La incorporación dentro de la(s) superficie(s) estructurada(s) es una ventaja puesto que la sustancia bioactiva, el fármaco o la célula biológica se une en una estructura a una superficie estructurada. El material biocompatible puede incluir al menos una primera superficie mineralizada, en la cual una sustancia bioactiva mineral-adherente, fármaco o célula biológica puede unirse a la superficie mineralizada.

La presente invención, además, cubre todos los materiales biocompatibles modificados en la superficie, equipos, estructuras, dispositivos y dispositivos médicos implantables con al menos una primera porción realizada mediante cualquiera de los procedimientos, métodos o medios precedentes y combinaciones de los mismos. Tales materiales biocompatibles modificados en la superficie pueden usarse en cultivos celulares, transplante celular, ingeniería tisular y/o regeneración tisular guiada y en la preparación de uno o más medicamentos o equipos terapéuticos para usar para el tratamiento de una situación médica que necesite transplante celular, ingeniería tisular y/o regeneración celular guiada.

Los procedimientos de la invención incluyen aquellos para el cultivo de células, incluyendo el crecimiento de una población celular en contacto con un material biocompatible modificado en la superficie en concordancia con la presente invención, La población celular puede mantenerse en contacto con el material biocompatible modificado en la superficie bajo condiciones efectivas y durante un periodo de tiempo efectivo para generar una estructura similar a un tejido bi o tridimensional, tal como un tejido similar al óseo o un tejido neovascularizado o vascularizado.

Tales métodos pueden ejecutarse in vitro o in vivo. Las células cultivadas pueden separarse de un material biocompatible modificado en la superficie y suministradas a un animal mientras permanezca en contacto con el material biocompatible modificado en la superficie.

Los usos médicos incluyen aquellos para el transplante de células dentro de un animal, incluyendo la aplicación a un lugar de un tejido de un animal una cantidad biológicamente efectiva de una composición de un material biocompatible con células que incluye una población celular en asociación operativa con un material biocompatible modificado en la superficie en concordancia con la presente invención.

Otros usos son aquellos para la ingeniería de tejidos en un animal, incluyendo la aplicación a un lugar de un tejido progenitor de un animal de una cantidad biológicamente efectiva de una composición de un material biocompatible que proporcione un armazón para el crecimiento tisular y que incluya un material biocompatible modificado en la superficie en concordancia con la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y están incluidos para demostrar aún más ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor mediante referencia a uno o más de esos dibujos en combinación con la descripción detallada de específicas realizaciones presentadas en ellos.

Fig. 1. Los espectros de FTIR muestran el desarrollo de los picos de fosfato (*) y carbonato (^) con el tiempo de incubación creciente en SBF. Los picos que representan copolímero de ácido poliláctico co-glicólico están también marcados (\medcirc). Los tiempos de incubación se dan a la derecha de cada espectro.

Fig. 2. El porcentaje de incremento de masa frente al tiempo de incubación de los armazones incubados en SBF (\medcirc), y (\sqbullet) muestras control incubadas en un tampón Tris (pH=7,4). La gráfica muestra una tendencia de incremento de masa de armazones incubados en SBF, culminando en un 11 +/- 2% de incremento de masa tras el día 16 de incubación.

Fig. 3. La masa de fosfato presente en los armazones frente al tiempo de incubación.

Fig. 4. Módulos compresivos frente a tiempo de incubación para armazones incubados en SBF (\medcirc), y armazones control incubados en un tampón Tris (pH=7,4) (\boxtimes).

Fig. 5. Incremento de masa en porcentaje frente a tiempo de incubación para armazones PLG incubados en un fluido corporal simulado (SBF). Los valores representan la desviación media y estándar (n=3).

Fig. 6. La masa de fosfato presente en los armazones frente al tiempo de incubación en SBF. Los valores representan la desviación media y estándar (n=3).

Fig. 7. La liberación acumulativa del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a partir de armazones mineralizados (X) y no mineralizados (v). Los valores representan la desviación media y estándar (n=5).

Fig. 8A. El efecto estimulatorio de la liberación de VEGF de los armazones mineralizados (v) y no mineralizados (\pi) en células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. Las cuentas celulares por cada intervalo temporal de liberación se dan como porcentajes del valor control (columna rayada) para ese intervalo. Los valores que son significativamente mayores que sus controles correspondientes se indican mediante ^{*1}s. Los valores representan la desviación media y standard (n=5).

Fig. 8B. La curva de muestra dosis-respuesta demuestra el efecto mitogénico de VEGF en células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. Los valores representan la desviación media y standard (n=5).

Fig. 9. La incorporación de VEGF dentro de armazones de PLG durante la incubación en SBF (\vardiamondsuit) y tampón Tris-HCl (\lambda).

Descripción de realizaciones ilustrativas

Las estrategias de ingeniería tisular ortopédica se han centrado a menudo en el uso de materiales degradables o armazones naturales o sintéticos para transplantes celulares (estrategias basadas en células) (Langer y Vacanti, 1993; Crane y col., 1995; Putnam and Money, 1996) o como un medio para guiar la regeneración mediante células osteogénicas nativas (estrategias conductivas) (Minabe, 1991). Las estrategias de transplante conductivas o basadas en células han sido algo efectivas en ingeniería tisular ósea (Ripamonti, 1992; Ishaug- Riley, 1997; Shea y col., "Formación de huesos a partir de pre-osteoblastos en armazones tridimensionales", presentado). El grado de éxito de estos procedimientos de ingeniería tisular depende de las propiedades del armazón.

Los requerimientos básicos del diseño del armazón incluyen degradabilidad, biocompatibilidad, una razón alta área superficial/volumen, osteoconductividad, e integridad mecánica. Un material biocompatible de armazón que es degradable en una escala controlada de tiempo en productos de degradación no tóxicos debe desaparecer de manera concertada con la formación de nuevo tejido, dejando un reemplazamiento de tejido natural. Una razón alta área superficial/volumen permite en transporte de masa entre las células dentro del armazón y el tejido circundante del hospedador, y proporciona espacio para el crecimiento interior del tejido fibrovascular.

La osteoconductividad es importante para la unión y la migración de células osteogénicas nativas y/o transplantadas. Se requiere integridad mecánica para aguantar las fuerzas de contracción celular durante el desarrollo tisular para asegurar el mantenimiento de la forma inicial del armazón (Kim y Mooney, 1998).

La degradabilidad, la biocompatibilidad, y la razón alta área superficial/volumen de los armazones puede lograrse mediante la elección apropiada de un material sintético o natural y el abordaje del procedimiento. El ácido poli(láctico), el ácido poli(glicólico), y sus copolímeros se han usado en aplicaciones de ingeniería tisular porque experimentan una degradación hidrolítica controlable en metabolitos naturales (Gilding, 1981; Li y col., 1990), y pueden procesarse en armazones altamente porosos mediante una variedad de procedimientos (Harris y col., 1988; Lo y col., 1995; Mikos y Thorsen, 1994).

Una limitación en la ingeniería de muchos tipos de tejidos, incluyendo el tejido óseo, es la falta de capacidad para inducir un rápido crecimiento vascular interno durante el desarrollo del tejido (Mooney y col., 1997). La viabilidad de las células transplantadas y/o de las células del hospedador que migran dentro del armazón desde el tejido nativo depende del transporte de nutrientes y productos de desecho entre las células y el tejido hospedador.

El transporte se debe inicialmente sólo a la difusión, y más de varios miles de micras de células procedentes de los vasos sanguíneos en el tejido circundante o fallan al implantarse o mueren rápidamente debido a la falta de oxígeno (Colton, 1995). Los estudios indican que los vasos sanguíneos se infiltrarán en un armazón de grandes poros para proporcionar un transporte mejorado hacia los tejidos manipulados, pero el proceso ocurre en un grado de menos de un milímetro por día, y típicamente se toma de una a dos semanas para la penetración completa del tejido vascular dentro de armazones relativamente finos (e.g., 3 mm de grosor) (Mikos y col., 1993, Money y col., 1994).

La presente invención proporciona biomateriales mejorados para su uso en ingeniería tisular. Varios de los inconvenientes anteriores se superan por las novedades de la invención. Ciertos materiales proporcionados son polímeros porosos biodegradables, con capas superficiales homogéneas de minerales y poros internos mineralizados. También se proporcionan los materiales polimericos porosos que tienen capas minerales continuas en combinación con factores bioactivos. Otros materiales provistos son materiales estructurados, a los cuales se puede unir cualquier componente mineral o biológico de una forma controlada espacialmente.

Los polímeros estructurados o mineralizados con factores bioactivos se proporcionan para dar mayor control sobre, o para aumentar, los procesos de formación y regeneración tisulares. Por ejemplo, los factores de crecimiento se pueden usar para inducir a las células a comportarse de una manera específica (Giannobile, 1996). Varios factores se han identificado que inducen quimiotaxis, proliferación, diferenciación, y síntesis de una matriz de tipos celulares específicos, cualquiera o más de los cuales pueden usarse en la presente invención.

Aunque ciertos sistemas se han propuesto como factores de desarrollo (Langer, 1990; Whang y col., 1998; Wheeler y col., 1998; Shea y col., 1999; Sheridan y col., J. Cont. Rel., In Press), las matrices de grandes poros de ingeniería tisular permanecen necesitadas de mejoras. Los inventores razonan que la inclusión de factores bioactivos dentro de un armazón permitirían un nivel más alto de control sobre la función celular tanto dentro como adyacente a una construcción tipo armazón, dirigiendo así las limitaciones específicas en procedimientos de ingeniería conductivos y basados en células.

Ciertos aspectos de la presente invención, por lo tanto, proporcionan armazones que combinan la degradabilidad, la biocompatibilidad y la osteoconductividad de armazones mineralizados con las propiedades titulares inductivas de polipéptidos bioactivos. La organización proporciona un grado de control adicional. La invención logra el crecimiento de mineral similar al del hueso en las superficies internas de poro de un armazón que contenga un factor de crecimiento sin comprometer la bioactividad del factor o la porosidad del armazón. El factor de crecimiento se ejemplifica mediante el factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF), un potente mitógeno para las células endoteliales micro y macrovasculares humanas, el cual no muestra efectos mitogénicos sobre otros tipos celulares (Leung y col., 1989).

Se consideran las matrices que contienen minerales y VEGF de la presente invención para su uso en la inducción de neovascularización concurrente con la ingeniería de tejido óseo. Una formación de tejido vascular aumentada durante el desarrollo tisular conducirá a una viabilidad mejorada de células osteogénicas nativas y/o transplantadas dentro de un armazón, permitiendo la síntesis de un volumen mayor de tejido óseo.

Otros factores bioactivos para uso en esta invención incluyen la hormona del crecimiento (GH); hormona paratiroidea (PTH, incluyendo PTH1-34); proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs), como por ejemplo BMP-2A, BMP-2B, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 y BMP-8; factor-\alpha de crecimiento transformante (TGF-\alpha); TGF-\beta1 y TGF-\beta2; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GMCSF); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); un factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) y el factor inhibidor de leucemia (LIF).

De hecho, virtualmente se puede emplear cualquier hormona, neurotransmisor, factor de crecimiento, receptor de factor de crecimiento, interferón, interleuquina, quimiocina, citoquina, factor estimulante de colonias y/o proteína o polipéptido con función de factor quimiotáctico. Ejemplos adicionales incluyen factores de transcripción o elongación, proteínas de control del ciclo celular, kinasas, fosfatasas, proteínas de reparación del ADN, oncogenes, supresores tumorales, proteínas angiogénicas, proteínas anti-angiogénicas, proteínas estimulantes de la respuesta inmune, receptores de la superficie celular, moléculas accesorias de señalización, proteínas de transporte, enzimas, proteínas o polipéptidos anti-bacterianos y/o anti-virales y similares, dependiendo del uso considerado de la composición final.

Los biomateriales de la invención con superficies estructuradas en tres dimensiones permiten una mineralización de localización controlada y la deposición celular. Los biomateriales de superficie estructurada tridimensionales de la presente invención son "biomateriales inteligentes", los cuales se unen preferentemente a moléculas biológicas y células en sitios específicos. Las propiedades de la superficie específicas de región permiten el control sobre la localización y la actividad de las células que se unen al biomaterial, cuando se usan en cultivos celulares y en implantación in vivo.

Estos aspectos de la invención representan un importante avance, ya que el control sobre las "localizaciones" de la deposición y actividad celular se prevé que es al menos tan importante como controlar las "características" de la actividad celular. De hecho se puede probar que controlar la localización de las células activas en la superficie de un biomaterial es el determinante más importante en la regeneración tisular. Las técnicas de la presente invención son particularmente ventajosas ya que proporcionan la capacidad de controlar las localizaciones de presencia y actividad celular en la superficie de un material en una escala de micras.

A. Formación mineral extendida

Ciertos aspectos de la presente invención son procedimientos para alterar un biomaterial haciendo crecer una capa mineral extendida u homogénea en la superficie. Se prefieren biomateriales poliméricos porosos y degradables para tales procedimientos, por ejemplo, ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y ácido poliláctico-co-poliglicólico (PLGA).

El fundamento de los inventores acerca de revestir estos materiales con minerales es que los revestimientos de tipo mineral son importantes para el crecimiento óseo en un material poroso y/o para la adhesión a un sustrato. La base para este procedimiento está en la observación de que en la naturaleza, los organismos usan varias macromoléculas para controlar la nucleación y crecimiento de fases minerales (Campbell y col., 1996; Lowenstein and Weiner, 1989). Estas macromoléculas contienen generalmente grupos funcionales que están cargados negativamente al pH de cristalización (Weiner, 1986). Existen hipótesis de que estos grupos quelan especies iónicas presentes en el medio que les rodea, estimulando la nucleación del cristal (Campbell y col., 1996).

Las observaciones en los procedimientos de mineralización natural no se han adaptado previamente para su uso en conexión con procedimientos de ingeniería de biomateriales o tejidos. Sin embargo, los presentes inventores se dieron cuenta de que se podía funcionalizar en el laboratorio un sustrato de biomaterial para permitir la inducción de la deposición del mineral.

Los inventores se dieron cuenta además de que la presencia de una capa mineral extendida u homogénea en la superficie de un biomaterial ayudará en la capacidad de regenerar eficazmente el tejido óseo. En esta memoria descriptiva se describen varios procedimientos para alcanzar tal mineralización de una superficie extendida u homogénea. Sin embargo, la mineralización de superficies estructuradas (u homogéneas) se contempla también para su uso en ciertas realizaciones y se puede alcanzar ventajosamente por las técnicas de estructuración descritas en esta memoria descriptiva.

B. Control de localizaciones de actividad celular

Avances recientes en el control de los procedimientos celulares han mostrado la utilidad de controlar las características de la actividad celular. Sin embargo, tal trabajo no ha tratado el control específico de localizaciones de adhesión celular a un biomaterial. Los presentes inventores prevén que el control sobre las "localizaciones" de la actividad celular es tan importante como el control de las características de la actividad celular.

Específicamente, en el área de regeneración de tejido óseo, es un pre-requisito para la unión de biomateriales al hueso vivo, la formación de una capa mineral similar al hueso en el biomaterial en el cuerpo. Esta observación sugirió a los inventores que la presencia o ausencia del mineral puede determinar si las células óseas se adherirán o no y posteriormente actuarán en el biomaterial. De esta forma, razonaron que un control específico sobre la localización del mineral sobre la superficie del biomaterial permitirá tener un control sobre las localizaciones de actividad de células óseas. La estructuración de minerales en la superficie de un biomaterial debería tener por lo tanto un profundo efecto en las propiedades del tejido óseo regenerado.

Para controlar las localizaciones de adhesión celular a una superficie polimérica tridimensional, la presente invención proporciona además varios nuevos procedimientos para tratar biopolímeros antes de la siembra celular. En un procedimiento sorprendentemente simple, tratando solamente ciertas regiones o subsecciones de materiales biopoliméricos, matrices o armazones con soluciones acuosas que contienen minerales, da lugar a una mineralización localizada solamente en aquellas áreas en contacto con la solución de mineralización. El tratamiento de lo biomateriales poliméricos en una escala de del orden de micras se lleva a cabo preferiblemente usando uno o dos procedimientos diferentes: fotólisis de superficie y/o electrólisis de superficie.

Los procedimientos de fotólisis y electrólisis estructurados de la presente invención son adecuados para uso con armazones poliméricos porosos y biodegradables. Los procedimientos de manipulación de la superficie de la presente invención resultan sorprendentes en el aspecto de que la adaptación de los inventores de las técnicas a partir del campo de litografía de rayo de electrones ha permitido, por primera vez, aplicaciones de estructuración en biomatrices tridimensionales, mejor que limitándose a dos dimensiones. Las matrices tridimensionales son generalmente más efectivas para crear un armazón de biomaterial para su uso en regeneración tisular.

Las diferentes técnicas de estructuración de la invención proporcionan por lo tanto la capacidad para controlar localizaciones para células óseas específicamente (estructuración mineral), y para todos los tipos de células en general (tratamiento de superficie polimérica sin formación de mineral). Las diferencias en el procesamiento para el control de las células óseas frente al control de otros tipos celulares se describen en esta memoria descriptiva.

Tal y como se describe también en los Ejemplos Detallados, todos los procedimientos de la presente invención son procedimientos a temperatura ambiente. Por lo tanto, sustancias bioactivas específicas, fármacos y proteínas, como por ejemplo moléculas de adhesión, citoquinas, factores de crecimiento y similares se pueden incorporar en el procedimiento de estructuración y en el biomaterial resultante. Las proteínas se pueden incorporar también en el medio de cultivo celular, estructurando de esta forma la superficie del material y provocando la unión de células específicas.

C. Fotólisis

Ciertos procedimientos de la invención para funcionalizar la superficie de un biomaterial permitiendo la mineralización y/ o control de la localización celular se basan en procedimientos de radiación (con o sin estructuración). Para alcanzar una capa mineral homogénea en una superficie de biomaterial, se usan los procedimientos de radiación sin estructuración. Para alcanzar un control de localización celular o mineralización, se usan los procedimientos de radiación estructurada.

El tratamiento de biomateriales poliméricos con radiación electromagnética (EM) provoca degradación de la superficie a través de una reacción de fotólisis. La radiación adecuada incluye todas las longitudes de onda de radiación EM, incluyendo ultravioleta, visible, infrarrojo, etc. Esta forma de degradación de la superficie, como aquella que se alcanza con NaOH, provoca un aumento en la cantidad de grupos funcionales polares con oxígeno en la superficie del material.

Al interpretar los resultados a partir de estudios diferentes en polímeros de unión a huesos (Li y col. 1997), los inventores razonaron que los grupos polares con oxígeno formados estimularían la nucleación del mineral en la superficie el biomaterial cuando se dispone en un fluido corporal. De esta forma, los inventores se dieron cuenta de que la capacidad para estructurar grupos funcionales de la superficie tridimensional daría lugar a la capacidad para estructurar la formación del mineral y adhesión celular en la superficie de un biomaterial.

Desafortunadamente, las técnicas de radiación EM anteriormente disponibles, se limitaban todas a aplicaciones con objetos bidimensionales. Las técnicas de litografía óptica "por contacto" convencionales están así limitadas (a dos dimensiones) debido al requerimiento de un contacto íntimo entre una máscara o rejilla de contacto y el objeto que se va a estructurar. De esta forma, previo a la presente invención, no había ningún mecanismo para producir estructuras superficiales del tipo tridimensional, materiales de superficie contorneada que son de uso mayoritario en ingeniería de tejidos.

Las técnicas litográficas se basan en el paso de radiación EM monocromática a través de una rejilla óptica para producir estructuras de radiación en una pantalla que está en el lado opuesto de la rejilla a partir de la fuente de radiación EM. La estructura formada puede ser tan simple como franjas igualmente espaciadas formadas por una rejilla que contiene aberturas igualmente espaciadas, o tan complicado como un holograma complejo.

La presente invención facilita significativamente la técnica de ingeniería tisular proporcionando procedimientos para usar radiación EM para estructurar biopolímeros tridimensionales. En los procedimientos de la inventiva, la "pantalla" es el biomaterial polimérico. Este sistema equivale a una aproximación de "litografía de difracción", pero el procedimiento difiere del de la litografía óptica "de contacto" convencional en que la rejilla no actúa como una máscara para el polímero, de modo que no es necesario un contacto íntimo entre la rejilla y el polímero.

En los procedimientos presentes, la rejilla produce una estructura de interferencia constructiva y destructiva en la superficie del polímero. Como la rejilla no se requiere que esté en un contacto íntimo con el material durante el tratamiento, este procedimiento de litografía de difracción se puede usar para tratar materiales con contornos de superficie tridimensionales complejos. Esto es también una aplicación sorprendente de tecnología previa en que la técnica ahora empleada sacrificaría anchura de línea cuando se ha usado en realizaciones previas, así que, la ausencia de intuición particular de los inventores al considerar la estructuración matricial tridimensional, no habría motivación para desarrollar esta metodología. Además, no se necesita retirar la "máscara de contacto", mejorando la naturaleza estéril de la biotécnica.

Ciertos tipos de biomatrices tridimensionales previstos para estructuración usando esta invención son matrices microesféricas y cilíndricas. Aunque una motivación para desarrollar la presente invención fue el objetivo de los inventores de desarrollar un procedimiento para una estructuración tridimensionales y con contorno, ahora que se ha desarrollado el procedimiento, es igualmente adecuado para uso con polímeros bidimensionales.

D. Electrólisis

El tratamiento de biomateriales poliméricos con irradiación por rayo de electrones (rayo-e) se puede usar también para provocar degradación de la superficie a través de una reacción de electrólisis. La degradación de la superficie provoca un aumento en la cantidad de grupos funcionales polares con oxígeno en la superficie del material, lo cual tiene las mismas cualidades ventajosas descritas en esta memoria descriptiva para las reacciones de hidrólisis y fotólisis.

La electrólisis de la superficie se puede estructurar en una superficie polimérica usando un microscopio electrónico de barrido con capacidades básicas de litografía de rayo-e. Tal y como se ha mostrado en los Ejemplos Detallados, este procedimiento se puede usar también para tratar materiales con superficies lisas o con contornos superficiales tridimensionales complejos.

E. Hidrólisis química

Otros procedimientos para funcionalizar la superficie de un biomaterial para permitir la deposición del mineral utilizan un pretratamiento químico para alcanzar la hidrólisis de la superficie, por ejemplo, usando una solución de NaOH. La degradación superficial por esta técnica provoca un incremento en la cantidad de grupos funcionales polares con oxígeno en la superficie del material. La superficie funcionalizada se incuba entonces en una solución que contiene minerales. Los inventores han usado tales técnicas de funcionalización para permitir la generación de un revestimiento mineral o "hipermineralización".

Gao y col. (1998) informó recientemente sobre la hidrólisis de la superficie de mallas de ácido poliglicólico para aumentar la densidad de sembrado y mejorar la unión de las células de músculo liso vascular. Aunque su procedimiento se basaba también en la hidrólisis de PGA en NaOH, el armazón polimérico se desarrolló entonces directamente hacia los experimentos de siembra celular (Gao y col., 1998). La presente invención expone en su lugar el biopolímero de superficie hidrolizada a una solución rica en calcio para inducir mineralización de la superficie.

F. Hidrólisis química combinada y mineralización

En un desarrollo inesperado de los procedimientos de funcionalización de la superficie, los inventores descubrieron sorprendentemente que se podía alcanzar una deposición del mineral eficaz en superficies de biomaterial sin pretratamiento químico. En estos procedimientos, se produce un grado suficiente de hidrólisis de la superficie simplemente empapando el biomaterial en un medio acuoso de mineralización. Aunque el pretratamiento, como por ejemplo por exposición a una solución de NaOH, todavía se puede utilizar o incluso preferir en ciertas realizaciones, los procedimientos de mineralización en una etapa tienen la ventaja de la simplicidad y se prefieren en ciertas realizaciones.

Los procedimientos de mineralización en una etapa utilizan el mismo tipo de soluciones acuosas que contienen el mineral que el descrito anteriormente, como por ejemplo fluidos corporales y medios sintéticos que imitan a los fluidos corporales. A la funcionalización le sigue la mineralización in situ sin manipulación externa. Aunque estos procedimientos son adecuados para su uso con un amplio intervalo de biopolímeros, las preferencias actuales son para uso junto con copolímeros de PLG con relaciones de 85:15 de copolímeros de PLG, y con armazones de biomaterial preparados por procedimientos de espumación por gas/lixiviación de partículas. Se prefiere particularmente el uso de armazones de copolímeros de PLG 85:15 preparados por espumación por gas/lixiviación de partículas.

El uso de copolímeros de PLG 85:15 es ventajoso ya que se cree que una disminución en la relación de láctido/glicólido del copolímero aumenta la relación de hidrólisis de la superficie. Sin embargo, previo a la presente invención, se desaprobó el uso de copolímeros de PLG 85:15 ya que la integridad mecánica del polímero disminuye con el incremento del contenido de glicólido. Esta invención muestra que los copolímeros de PLG 85:15 se pueden usar eficazmente ya que la hidrólisis rápida de la superficie permite una formación de mineral suficiente para compensar el potencial para la disminución de la integridad, dando lugar a una fuerza total suficiente o incluso aumentada del material compuesto.

Los éxitos de los presentes procedimientos de mineralización en una etapa (Ejemplo V), incluso sin la espumación/lixiviación de partículas, están en marcado contraste frente a intentos previos para crecer minerales en superficies de poliéster. Los primeros procedimientos no dan lugar a un crecimiento capas minerales continuas similares a hueso, incluso después de una incubación de 6 días en fluidos con concentraciones iónicas un 50% más altas que las que se usan actualmente (Tanahashi y col., 1995). Igualmente, una incubación de 15 días esencialmente en el mismo medio fluido que el usado actualmente, no produjo continuidad de micropartículas minerales (Zhang and Ma, 1999).

Los inventores creen que la preparación de matrices a través de técnicas de espumación por gas/lixiviación de partículas dan lugar a más grupos de tipo ácido carboxílico en la superficie que la preparación matricial por otros procedimientos (por ejemplo, prueba del disolvente/lixiviación de partículas). Esta funcionalización mayor de la superficie se propone para contribuir a la nucleación y crecimiento más rápidos de mineral apatítico observado durante los procedimientos de mineralización en una etapa. También, las etapas de lixiviación de los procedimientos de espumación por gas/lixiviación de partículas emplean típicamente soluciones de minerales, como por ejemplo CaCl_{2} 0,1 M, las cuales puede favorecer además la quelación de Ca^{2+} y una nucleación de mineral similar a hueso más rápida.

Las técnicas de formación de la matriz por espumación por gas/lixiviación de partículas, con o sin agentes bioactivos adicionales, se describen en las siguientes solicitudes coposeídas, solicitud de la patente de EE.UU. de nº de serie 09/402.119, presentada el 20 de septiembre de 1999, la cual reivindica prioridad a la solicitud del PCT nº PCT/US98/06188 (WO 98/44027), presentada el 31 de marzo de 1998, la cual designa a los EE.UU. y reivindica prioridad a la solicitud provisional de los EE.UU. de nº de serie 60/042.198, presentada el 31 de marzo de 1997; y la solicitud de EE.UU. de nº de serie 09/310.802, presentada el 12 de mayo de 1999, la cual reclama prioridad a una segunda solicitud provisional de nº de serie 60/109.054, presentada el 19 de noviembre de 1998 y a una primera solicitud provisional de nº de serie 60/085.305, presentada el 13 de mayo de 1998.

Los estudios en el Ejemplo IX muestran que el mineral similar al hueso se puede formar ventajosamente en las superficies internas del poro de matrices preparadas por espumación por gas/lixiviación de partículas. Los armazones de PLG preparados por un procedimiento de espumación por gas/lixiviación de partículas se mineralizaron con éxito usando una incubación en una etapa en fluido corporal simulado (SBF) sin ningún descenso apreciable en la porosidad total del armazón.

Usando armazones de PLG espumados por gas/lixiviados de partículas, una incubación de 5 días en SBF es suficiente para un crecimiento continuo de mineral similar al hueso en las superficies internas del poro del armazón (Ejemplo IX). La cuantificación de la ganancia de masa en porcentaje y el contenido de fosfato sugiere que la mayor parte del crecimiento del mineral en estos aspectos de la invención se da entre el día 2 y el día 4 de la incubación. Estos resultados están incluso más avanzados durante los intentos previos para producir minerales similares al hueso en superficies de poliéster (Tanahashi y col., 1995; Zhang and Ma, 1999).

Como estos procedimientos de mineralización en una etapa son efectivos a temperaturas ambiente, su uso para preparar armazones poliméricos mineralizados o hipermineralizados se extiende a la preparación de materiales mineralizados que incluyen otras sustancias bioactivas. En esta memoria descriptiva se demuestra que tales procedimientos no son perjudiciales para la actividad de moléculas biológicas, como por ejemplo factores de crecimiento. La naturaleza de ahorro de tiempo y trabajo de estos procedimientos los hace por lo tanto ideales para preparar matrices para uso en muchos procedimientos biológicos, especialmente para estimular el crecimiento del hueso, donde los minerales y factores de crecimiento actúan en concierto. La fase, morfología y constitución del mineral depositado se pueden controlar variando el pH, concentraciones iónicas y/o temperaturas usadas en el procedimiento.

Estas técnicas de mineralización son particularmente adecuadas para su uso con materiales biodegradables. La capacidad para obtener una capa mineral continua similar al hueso, dentro de los poros de un armazón tridimensional, poroso y degradable representa un avance en el procesamiento del biomaterial. El crecimiento de tal capa mineral continua similar al hueso no es sólo importante para la siembra celular, sino que probablemente también aumentará la integridad mecánica de estas construcciones sintéticas a través de un mecanismo de refuerzo.

Las construcciones poliméricas usadas para aplicaciones de ingeniería tisular son generalmente altamente porosas y no poseen propiedades mecánicas del mismo orden que el hueso. El crear un revestimiento mineral interconectado sobre las superficies internas del poro de una construcción polimérica, según estos aspectos de la presente invención, es una ventaja clara. Estos procedimientos permiten la producción de un exoesqueleto duro y rígido, aumentando el módulo de un biomaterial y aumentando su resistencia frente a fuerzas contráctiles en la célula durante el desarrollo del tejido.

Los materiales del armazón mineralizado de la presente invención, por ejemplo, tal y como se producen en el Ejemplo V, tienen de hecho un módulo de compresión después del tratamiento mayor que aquellos de otros materiales de poli(ácido \alpha-hidroxi) usados para ingeniería de tejido del hueso y mayor que matrices de ácido poliglicólico (PGA) unido a PLLA que son adecuadas por resistencia de fuerzas celulares durante el desarrollo del tejido del músculo liso. Los materiales de esta invención muestran por lo tanto memoria de forma, un importante factor en la regeneración tisular. La presente invención proporciona también procedimientos para alcanzar incrementos en módulos compresivos sin disminuir notablemente la porosidad del armazón o el tamaño del poro, otra ventaja largamente buscada después del diseño que permite la migración celular y la infiltración vascular.

G. Mineralización y liberación del factor de crecimiento

Además de mostrar una mineralización exitosa usando una etapa, incubación de 5 días, los estudios del Ejemplo IX demuestran también el libramiento sostenido de un factor bioactivo (VEGF) a partir de los armazones de PLG mineralizados. Se fabricaron armazones porosos tridimensionales del copolímero de poli(láctido-co-glicólido) 80:15 incluyendo el factor de crecimiento en un procedimiento de espumación por gas/lixiviación de partículas. El armazón se mineralizó entonces a través de incubación en un fluido corporal simulado.

En resumen, el crecimiento de una película mineral similar al hueso en las superficies internas de los poros del armazón poroso se confirma por medidas de incremento de masa y cuantificación del contenido de fosfato entro de los armazones. Se siguió la liberación de VEGF marcado radiactivamente con ^{125}I durante un período de 15 días para determinar la cinética de liberación de los armazones mineralizados. Se alcanzó la liberación sostenida de los armazones mineralizados y el crecimiento de la película mineral alteró la cinética de liberación de los armazones atenuando el efecto inicial de estallido, y haciendo la curva de liberación más lineal. El VEGF liberado a partir de armazones mineralizados y no mineralizados fue superior a un 70% activo durante hasta 12 días después del tratamiento de mineralización, y el crecimiento del mineral tuvo un efecto pequeño en la porosidad total del armazón.

En más detalle, se muestra la presencia del mineral para disminuir la liberación del factor de crecimiento a partir del armazón, dando lugar a la liberación de una mayor cantidad de factor durante un período de crecimiento más largo (por ejemplo, de los días 3 al 10). Después de un estallido de liberación inicial de un 44 \pm 2% del factor incorporado en las primeras 36 horas, se mantuvo el perfil de liberación de las esponjas mineralizadas durante hasta 10 días en SBF (Fig. 7). En contraste, la liberación de los armazones no mineralizados muestra un estallido inicial relativamente largo de un 64 \pm 2% durante las primeras 60 horas, seguido de una liberación sostenida durante \sim 5 días.

La liberación del factor bioactivo a partir del armazón mineralizado es un resultado importante para la ingeniería tisular, particularmente ingeniería del tejido óseo, porque combina las cualidades osteoconductivas de un mineral similar al hueso con las cualidades inductivas de tejido de un factor bioactivo, como por ejemplo un factor de crecimiento de tipo proteína. La liberación de VEGF es especialmente útil en la inducción del crecimiento de tejido vascular para ingeniería tisular. Este sistema se podría usar también con varios factores de crecimiento inductivos de tipo proteína diferentes, fácilmente unidos a la célula y tipos de tejidos a los que se intenta estimular.

El Ejemplo IX sugiere que el crecimiento del mineral en la superficie de PLG poroso modula la liberación del factor. Existe una clara correlación entre el comienzo del crecimiento del mineral y la divergencia en los perfiles de liberación para las muestras incubadas en SBF y PBS (control). La primera ocurre entre el día 2 y el día 4 de incubación (Fig. 6) mientras que la última ocurre en el punto temporal del día 3 (Fig. 7). El efecto neto de la presencia del mineral es la atenuación de un estallido de liberación inicial del armazón, y una liberación sostenida de una cantidad de factor mayor durante un período de tiempo más largo.

El efecto de modulación de la liberación queda claro también en los datos de bioactividad (Fig. 8A). La liberación a partir de los armazones mineralizados tiene un efecto significativamente mayor en la proliferación celular que la liberación a partir de los armazones no mineralizados durante el intervalo de liberación del factor de 8 a 10 días. El examen de los perfiles de liberación (Fig. 7) indica que los armazones mineralizados liberan una cantidad de VEGF mayor que los armazones no mineralizados durante este período de tiempo.

Formulaciones de liberación controlada previas usando materiales de poli (ácido-\alpha-hidroxi) frecuentemente demuestran un estallido inicial medible en los primeros 1 a 5 días de liberación seguido por una liberación mínima en puntos temporales más tardíos (Cohen y col., 1991; Kwong y col., 1986). El alcanzar una liberación relativamente constante durante un período de tiempo más largo es un objetivo importante en el libramiento de fármacos poliméricos. Intentos previos para tratar el "efecto de estallido" han usado microesferas poliméricas de doble pared (Pekarek y col., 1994) y microesferas encapsuladas en membranas microporosas (Kreitz y col., 1997). El mineral similar al hueso en es te estudio alcanza un efecto funcional similar al de la capa externa en los sistemas de libramiento de fármacos poliméricos de doble membrana.

La formación de una capa de mineral dentro de los poros de armazones de PLG no perjudica notablemente la capacidad del factor de crecimiento liberado para estimular la proliferación de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. La posibilidad de desnaturalización de la proteína y agregación durante la exposición a humedad es un punto en la liberación controlada de proteínas a partir de ciertos sistemas poliméricos (Ishaug-Riley y col., 1998). En este caso, la proteína es claramente bioactiva durante once días después del tratamiento de mineralización (16 días después de la preparación de la muestra).

Se eligió la escala de tiempo de 11 días para el análisis en este estudio porque un porcentaje grande de células transplantadas no se injertan y mueren dentro de este período de tiempo sin el desarrollo de un soporte vascular para aumentar el transporte de masa (Mooney y col., 1997; Ishaug-Riley y col., 1998). Una liberación sostenida durante este período de tiempo induce el aumento de proliferación de células endoteliales, apoyando de esta forma la angiogénesis durante las etapas iniciales del desarrollo de tejido óseo in vivo.

La presente invención proporciona por lo tanto un sistema para la liberación sostenida de factores bioactivos, como por ejemplo polipéptidos, factores y hormonas de crecimiento, a partir de armazones de PLG mineralizados. Los complejos mineral-biofactor-armazón tiene usos particulares en ingeniería de tejidos ortopédicos. La presencia de un mineral similar al hueso es un requisito para la conducción de células osteogénicas en varias construcciones sintéticas porosas. (Hench, 1991; Kokubo, 1991), y de esta forma el mineral se asocia con una biorreactividad incrementada (LeGeros and Daculzi, 1990). El mineral crecido por los métodos de la presente invención proporciona de esta forma una osteoconductividad aumentada además del efecto inductivo (por ejemplo, angiogénico) de la liberación de la proteína. El crecimiento del mineral se lleva a cabo a través de una sorprendentemente simple etapa única, procedimiento a temperatura ambiente el cual, de manera importante, no compromete la biorreactividad del factor de crecimiento, o la porosidad total del armazón.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ciertas realizaciones preferidas de la invención.

Ejemplo 1 Mineralización homogénea de la superficie

Se trata un biomaterial polimérico poroso y degradable para una mineralización fundamentalmente homogénea pretratando para inducir hidrólisis de la superficie y exponiéndolo luego a una solución mineralizante (Ejemplos II a IV) o llevando a cabo una hidrólisis de superficie en una etapa y un procedimiento de mineralización (Ejemplo V).

El pretratamiento para producir una hidrólisis de superficie homogénea se puede alcanzar por empapamiento en una solución de NaOH (Ejemplo II) o por tratamiento con radiación electromagnética (EM) (Ejemplo III). El biomaterial tratado se incuba en un fluido, como por ejemplo un fluido corporal o medios sintéticos que imitan a un fluido corporal, rico en mineral, preferiblemente rico en calcio, para inducir la nucleación y crecimiento de una película mineral homogénea en la superficie (Ejemplo IV).

La funcionalización y mineralización concomitante se pueden alcanzar también simplemente empapando en soluciones acuosas que contienen mineral, preferiblemente en fluidos corporales o medios sintéticos que imitan a fluidos corporales. La preparación de los biomateriales poliméricos usando un procedimiento de espumación por gas/lixiviación de partículas se prefiere generalmente para tal mineralización en una etapa (Ejemplo V).

Una vez mineralizado, se siembran los precursores de células osteogénicas en el material in vitro en un medio de cultivo celular. In vivo, las células del hueso de unen al biomaterial cuando se implantan.

Ejemplo II Pretratamiento con NaOH para películas mineralizadas de superficie

Se prepararon películas de PLGA (\sim25 \mum de grosor) por una técnica de prueba de presión. Se cargaron en un molde sedimentos de polímero bruto y se colocaron en un horno de convección a 200ºC. Los moldes se calentaron bajo presión (\sim22 N) durante 30 segundos y luego se enfriaron a temperatura ambiente.

Para la creación de grupos funcionales en la superficie por tratamiento con NaOH, las películas se limpiaron y se sumergieron en una solución de NaOH 1,0 N para tiempos variables, hasta 10 minutos para crear grupos funcionales en la superficie. Después de la inmersión, se enjuagaron tres veces las muestras en agua destilada.

Ejemplo III Pretratamiento UV para películas mineralizadas de superficie

Se prepararon películas de PLGA (\sim25 \mum de grosor) por una técnica de prueba de presión. Se cargaron en un molde sedimentos de polímero bruto y se colocaron en un horno de convección a 200ºC. Los moldes se calentaron bajo presión (\sim22 N) durante 30 segundos y luego se enfriaron a temperatura ambiente.

Para la creación de grupos funcionales en la superficie por tratamiento UV (UltraVioleta), se expusieron las membranas hasta 8 horas de irradiación de la superficie.

Ejemplo IV Mineralización de la superficie después del pretratamiento

Las membranas tratadas por tratamiento con NaOH o tratamiento UV se incubaron posteriormente a 37 grados centígrados en 50 ml de un fluido fisiológico simulado (FFS, Na: 142 mM, K: 5 mM, Ca. 2,5 mM, Mg: 1,5 mM, Cl: 148 mM, HCO_{3}^{-}: 4,2 mM, HPO_{4}^{2-}: 1 mM, SO_{4}^{2-}: 0,5 mM) tamponado a pH 7,4. Las soluciones se reemplazaban cada 48 horas para asegurar que había suficientes iones en la solución para inducir nucleación y crecimiento del mineral. Las muestras se secaron después de la inmersión durante períodos de 120 a 240 horas.

El análisis por IR de la transformada de Fourier (FTIR) indica la presencia de un apatito amorfo de superficie. Los espectros de FTIR de los armazones tratados durante 0, 2, 6, 10 y 16 días indican el crecimiento de un mineral de apatito carbonatado dentro del armazón (Fig. 1). Se produjeron también espectros equivalentes con las películas tratadas con UV. La banda ancha a 3570 cm^{-1} es indicativa de la vibración de alargamiento de iones hidroxilo en agua absorbida. El pico a 1454 cm^{-1} es indicativo de CO_{3}^{2-} \nu_{3}, mientras que el de 867 cm^{-1} representa CO_{3}^{2-} \nu_{2}. Los picos a 1097 cm^{-1} y a 555 cm^{-1} son indicativos de alargamiento anti-simétrico (\nu_{3}) e inclinación anti-simétrica (\nu_{4}) de PO_{4}^{3-}, respectivamente. El pico a 1382 cm^{-1} representa una banda de NO_{3}.

La presencia de OH-, CO_{3}^{2-} y PO_{4}^{3-} indica que se ha formado una capa apatítica. Otras bandas representativas de apatitos se enmascaran como consecuencia de la fuerte absorción del PLGA.

Los picos principales a 1755 cm^{-1} y a 1423 cm^{-1} representan PLGA, y el pico a 1134 cm^{-1} es indicativo de alargamiento C-O en el éster. Los picos a 756 cm^{-1} y a 956 cm^{-1} son indicativos de los dominios amorfos del polímero.

Los armazones demostraron un aumento de la masa sobre el tiempo, culminando en una ganancia de masa de un 11 \pm 2% al final de la incubación de 16 días (FIG 2). El ANOVA de los cambios en el porcentaje de masa de los armazones experimentales revelan una diferencia significativa en la masa del armazón sobre el tiempo (p < 0,05), mientras que el ANOVA de los cambios en el porcentaje de masa de los armazones control no muestran una diferencia significativa sobre el tiempo (p < 0,05). Los cambios en el porcentaje de masa de las muestras experimentales y de las muestras control eran significativamente diferentes para cada punto temporal más allá de 8 días (p < 0,05).

Para confirmar que el incremento en la masa fue provocado por la deposición de un mineral apatítico, la masa de fosfato en los armazones se analizó después. El contenido en fosfato en los armazones tratados aumentó también significativamente con el tiempo de tratatamiento (Fig. 3). La comparación de las masas de fosfato a través de un ANOVA muestran un incremento estadísticamente significativo sobre el tiempo (p < 0,05), y las diferencias en la masa de fosfato entre el día 8 y el día 12 (p < 0,05) y entre el día 12 y el 14 (p = 0,05) resultaron también estadísticamente significativas. Después de una incubación de 14 días la estimación de la masa de mineral en el armazón usando los datos de masa de fosfato da 0,76 mg de hidroxiapatito, mientras que el incremento de masa medida del armazón es 1,02 \pm 0,40 mg. El hecho de que el valor medido sea mayor que el valor estimado sugiere una significativa sustitución de carbonatos en el cristal del mineral.

El crecimiento de la capa de BLM aumentó significativamente el módulo de compresión de armazones de PLG 80:15 (Fig. 4) sin un descenso significativo en la porosidad del armazón. El módulo de compresión aumentó de 60 \pm 20 KPa antes del tratamiento a 320 \pm 60 KPa después de un tratamiento de 16 días, un incremento de 5 veces en módulo. El ANOVA de los cambios en el módulo de los armazones experimentales revela una diferencia significativa en el módulo del armazón sobre el tiempo (p < 0,05), mientras que el ANOVA de los datos del módulo control no muestran una diferencia significativa sobre el tiempo (p > 0,05). Las diferencias entre los módulos de armazones experimentales y módulos de armazones control resultaron estadísticamente significativas durante los tiempos de tratamiento de 10 días o más (p < 0,05). La porosidad de los armazones no disminuyó apreciablemente después de la incubación en SBF. Los armazones no tratados resultaron porosos en un 95,6 \pm 0,2%, mientras que los armazones incubados en SBF durante 16 días resultaron porosos en un 94,0 \pm 0,30% (n = 3). Esto está de acuerdo con las micrografías electrónicas, las cuales muestran solamente un revestimiento de mineral delgado (1-10 \mum), y de esta forma no se dan cambios significativos en el tamaño del poro debido al crecimiento del mineral.

Este ejemplo muestra el uso exitoso de este procedimiento a temperatura ambiente para dar una capa con superficie de apatito en una superficie polimérica tratada. La importancia del procesamiento a temperatura ambiente es que la unión de los factores biológicos se puede alcanzar fácilmente, sin preocupación por la desnaturalización.

Ejemplo V Mineralización en una etapa

Se pueden usar también procedimientos de incubación a temperatura ambiente en una etapa para provocar la nucleación y crecimiento de capas minerales en superficies poliméricas. Esto se alcanza incubando armazones poliméricos en soluciones acuosas que contienen el mineral, como por ejemplo fluidos corporales y medios sintéticos que imitan a los fluidos corporales. Estos procedimientos son capaces de hacer que crezcan minerales similares al hueso dentro de los armazones poliméricos en procedimientos sorprendentemente simples y baratos. La efectividad de estos procedimientos en condiciones de temperatura ambiente les proporciona conducente a la inclusión de proteínas bioactivas y otros materiales en el procesamiento de mineralización.

Un primer ejemplo de mineralización en una etapa se refiere a la deposición mineral en esponjas porosas de poli(láctido-co-glicólido) a través de incubación en un fluido corporal simulado. La técnica de incubación simple se usó para obtener nucleación y crecimiento de un mineral de apatito carbonatado continuo en las superficies interiores del poro de un armazón polimérico poroso y degradable.

Se fabricó un armazón poroso tridimensional de PLG 85:15 por un procedimiento de prueba de disolvente/lixiviación de partículas y se incubó en un fluido corporal simulado (SBF; NaCl-141 mM, KCl-4,0 mM, MgSO_{4}-0,5mM, MgCl_{2}-1,0 mM, NaHCO_{3}-4,2 mM, CaCl_{2}-2,5 mM y KH_{2}PO_{4}-1,0 mM en H_{2}O desionizada, tamponado a PH 7,4 con Trisma-HCl). Los análisis de espectroscopía de IR por transformada de Fourier y de SEM después de diferentes tiempos de incubación demostraron el crecimiento de una capa de apatito continua similar al hueso dentro de los poros del armazón polimérico.

La mayor parte del crecimiento del mineral ocurrió entre los días 8 y 12. El crecimiento del mineral en una capa continua probablemente ocurre a partir del día 12 y se completa hacia el día 16 o antes. El mineral crecido, siendo continuo, es de esta forma similar a aquel en huesos y en dientes.

Los armazones demostraron un incremento de la masa sobre el tiempo, con una ganancia de un 11 \pm 2% después de 16 días. El incremento en la masa es debido a la deposición de un material apatítico. La cuantificación de fosfato en el armazón reveló el crecimiento y desarrollo de la película mineral sobre el tiempo con una incorporación de 0,43 mg de fosfato (equivalente a 0,76 mg de hidroxiapatito) por armazón después de 14 días en SBF. El incremento de masa total medido del armazón fue 1,02 \pm 0,4 mg a los 14 días. Esto sugiere sustitución de carbonato en el cristal del mineral.

Los módulos de compresión de armazones poliméricos aumentó también cinco veces con formación de una película mineral después de un tiempo de incubación de 16 días, tal y como se opusieron a los armazones control. Esto se alcanzó sin una disminución significativa en la porosidad del armazón. El revestimiento fino de mineral es de esta forma funcionalmente importante, aunque la mineralización no cambia el tamaño de poro.

Tal y como se muestra en los estudios de mineralización y de factor de crecimiento del Ejemplo IX, los armazones de PLG 85:15 preparados por espumación por gas/lixiviación de partículas muestran una nucleación y un crecimiento del mineral apatítico incluso más rápidos. Los armazones de PLG 85:15 preparados por prueba del disolvente/lixiviación de partículas mostraron un incremento de un 3 \pm 1% en masa después de una incubación de 6 días en SBF. En comparación, los armazones de PLG 85:15 preparados por espumación por gas/lixiviación de partículas mostraron un incremento de un 6 \pm 1% en masa después de una incubación de 4 días en SBF.

Se cree que la nucleación y crecimiento del mineral de apatito incluso más rápidos en armazones de PLG 85:15 preparados por espumación por gas/lixiviación de partículas es debido al incremento en grupos de tipo ácido carboxílico provocados por el proceso de espumación por gas/lixiviación de partículas, es decir, a la mayor funcionalización de la superficie. La lixiviación con CaCl_{2} 0,1 M favorece probablemente también la quelación de iones Ca^{2+}, produciendo una nucleación del mineral similar al hueso más rápida.

Ejemplo VI Control de células de hueso

El biomaterial polimérico se trata para formar una biosuperficie estructurada, preferiblemente demandando radiación EM estructurada o irradiación por rayo de electrones. El biomaterial tratado se lava con agua destilada para eliminar monómeros residuales de la fotólisis o electrólisis de la superficie.

El biomaterial tratado se incuba en un fluido, como por ejemplo un fluido corporal o un medio sintético que imita a un fluido corporal, rico en mineral, preferiblemente rico en calcio, para iniciar la nucleación y crecimiento del mineral en las regiones tratadas del polímero. Esto da lugar a una estructura mineral en la superficie del polímero. Esta etapa se puede hacer in vitro, usando un fluido corporal o un fluido corporal simulado; o in vivo, donde el fluido corporal natural lleva a cabo su función.

Los precursores de células osteogénicas se siembran en el biomaterial in vitro en un medio de cultivo celular. In vivo, las células de hueso se unen al biomaterial cuando se implantan. En cada caso, las células se adhieren preferencialmente a las partes mineralizadas del sustrato.

Ejemplo VII Litografía de difracción

Estudios previos en el control de localizaciones de adhesión celular a una superficie de biomaterial han utilizado litografía de UV convencional para estructurar una superficie polimérica bidimensional (Pierschbacher & Ruoslahti, (1984); Ruoslahti & Pierschbacher (1987); Matsuda y col., (1990); Britland y col., (1992); Dulcey y col., (1991); Lom y col., (1993); Lopez y col., (1993); Healey y col., (1996)).

En las técnicas anteriores, la superficie de bidimensional se reviste con una capa fina de material fotoendurecible (FE), el FE se expone a través de una máscara de metal y el FE expuesto se retira en el disolvente, dejando una máscara de FE en la superficie de la muestra de biomaterial. La superficie del biomaterial polimérico se trata entonces químicamente o físicamente a través de la máscara de FE, y la máscara se retira por un disolvente después del tratamiento.

Los primeros procedimientos requieren un biomaterial bidimensional plano, lo que basta para estudiar los efectos del tratamiento de la superficie en actividad celular, pero no es suficiente para el tratamiento de biomateriales típicos, los cuales tienen contornos de superficie tridimensionales.

En los presentes procedimientos, adecuados para uso con polímeros tridimensionales, la rejilla produce una estructura de interferencia constructiva y destructiva en la superficie del polímero. Como la rejilla no se requiere que esté en contacto íntimo con el biomaterial durante el tratamiento, este procedimiento de litografía de difracción se puede usar para tratar materiales con contornos de superficie tridimensionales complejos. Sin embargo, el procedimiento es igualmente útil en conexión con biomateriales de dos dimensiones.

Ejemplo VIII Control de otros tipos celulares

El biomaterial polimérico se trata para formar una biosuperficie estructurada, preferiblemente usando radiación EM estructurada o irradiación de rayo de electrones. El biomaterial tratado se lava con agua destilada para eliminar monómeros residuales de la fotólisis o electrólisis de la superficie.

El biomaterial tratado se incuba en una solución que contiene moléculas bioactivas o proteínas, como por ejemplo factores de crecimiento, moléculas de adhesión, citokinas y similares, los cuales promocionan la adhesión de un tipo celular específico. Las células se siembran en el biomaterial in vitro en un medio de cultivo celular. In vivo, las células se unen al biomaterial cuando se implantan. En cada caso, las células se adhieren con preferencia a las partes tratadas del sustrato.

El uso de agentes específicos o proteínas, como por ejemplo factores de crecimiento, que promocionan la unión de ciertos tipos celulares, da el potencial para estructurar cualquier tipo celular en la superficie tridimensional del polímero, in vitro e in vivo.

Ejemplo IX Liberación de factores de crecimiento a partir de matrices mineralizadas A. Materiales y procedimientos 1. Espumación por gas-lixiviación de partículas

Se obtuvieron sedimentos de poli(láctido-co-glicólido) con una relación láctido:glicólido de 85:15 de Medisorb, Inc (I. V. = 0,78 dl/g) y se molieron a un tamaño de partícula entre 106 y 250 \mum. Las partículas de PLG molidas se combinaron entonces con 250 \mul de una solución de un 1% de alginato (MVM, ProNova; Oslo, Noruega) en ddH_{2}O y 3 \mug de factor de crecimiento de células del endotelio vascular (VEGF, Intergen; Purchase, NY), y se agitaron en vórtex. Se liofilizaron estas soluciones, se mezclaron con 100 mg de partículas de NaCl (250 \mum < d < 425 \mum) y se moldearon por compresión a 1,05 x 10^{7} Pa durante 1 minuto en un molde de 4,2 mm de diámetro. Esto dio discos gruesos de 2,8 mm con un diámetro de 4,2 mm.

Los discos se expusieron luego a gas CO_{2} a 1,42 x 10^{6} Pa en un recipiente de presión aislado y se dejó equilibrar durante 20 horas. Se disminuyó la presión a presión ambiente en 2 minutos, provocando inestabilidad termodinámica, y formación posterior de poros de gas en las partículas de polímero. Las partículas de polímero se expanden y conglomeran para formar un armazón continuo con alginato, VEGF y partículas de NaCl atrapados. Después de la espumación por gas, los discos se incubaron en CaCl_{2} 0,1 M durante 24 horas para lixiviar las partículas salinas e inducir la gelificación del alginato dentro de la matriz del polímero. El alginato se incluyó en los armazones porque ha mostrado minimizar la liberación de VEGF a partir de armazones de PLG (Wheeler y col., 1998).

Mineralización

Se mineralizaron ciertos armazones a través de una incubación de 5 días en un fluido corporal simulado (SBF). El fluido corporal simulado (SBF) se preparó disolviendo los siguientes reactivos en agua desionizada: NaCl-141 mM, KCl-4,0 mM, MgSO_{4}-0,5mM, MgCl_{2}-1,0 mM, NaHCO_{3}-4,2 mM, CaCl_{2}-2,5 mM y KH_{2}PO_{4}-1,0 mM. El SBF resultante se tamponó a PH 7,4 con Trisma-HCl y se mantuvo a 37ºC durante los períodos de incubación. Las soluciones de SBF se cambiaban diariamente para asegurar concentraciones iónicas adecuadas para el crecimiento del mineral.

La porosidad de los armazones se calculó antes y después del tratamiento de mineralización usando la densidad conocida del polímero sólido, la densidad conocida del apatito carbonatado, la masa medida de mineral y polímero en los armazones y el volumen del armazón.

Caracterización del crecimiento del mineral

Para analizar el crecimiento del mineral en armazones de PLG espumados por gas, se incubaron grupos de tres armazones en SBF durante períodos que variaban de 0 a 10 días. Las muestras se retiraron de la solución y se analizaron después de períodos de incubación de 0, 2, 4, 8 y 10 días. Se midió la masa seca de cada armazón antes y después de la incubación en SBF, y los incrementos de porcentajes en masa se calcularon y compararon usando un ANOVA y un ensayo de t de Student para revelar diferencias significativas en masa para diferentes tiempos de incubación en SBF.

La cantidad de fosfato presente en los armazones después de los tiempos de incubación anteriormente mencionados se determinó usando un ensayo colorimétrico previamente descrito (Murphy y col., J. Biomed. Mat. Res., In Press). Los datos de masa de fosfato se compararon también usando un ANOVA y un ensayo de t de Student para revelar diferencias significativas en masa para diferentes tiempos de incubación en SBF.

Para estimar la cantidad de apatito en el armazón después de una incubación de 6 días, la masa de fosfato medida se multiplicó por la relación conocida de masa de hidroxiapatito [Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2}, f. w. = 1004,36 g] a la masa de fosfato en hidroxiapatito (569,58 g). Esta es una estimación conservativa, ya que asume que se incorpora todo el fosfato en el hidroxiapatito estequiométrico. Esta estimación de masa del mineral aumenta si uno asume una sustitución creciente de carbonato en el cristal del mineral.

4. Medidas de liberación de VEGF

Para determinar la eficacia de incorporación de VEGF en los armazones de PLG y rastrear la cinética de liberación de VEGF desde los armazones, se utilizó como trazador VEGF humano de tipo receptor marcado con ^{125}I (90 \muCi/\mug; Biomedical Technologies Inc.; Stoughton, MA). En lugar de los 3 \mug de VEGF de la preparación normal de la muestra, se añadieron 0,5 \muCi de VEGF radiomarcado a cada matriz. Para determinar la eficacia de incorporación de VEGF, se comparó la actividad total incorporada con la actividad de la muestra inicial de VEGF marcada con ^{125}I antes de incorporarla a los armazones.

Para determinar los efectos del desarrollo mineral sobre la liberación del factor, se midió la cinética de liberación tanto en SBF durante la formación del mineral como en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los armazones preparados con VEGF radiomarcado se introdujeron en 4 ml de SBF o PBS y se mantuvieron a 37ºC. En diversos momentos los armazones se retiraron de la disolución y se determinó su radioactividad usando un contador gamma. Después de cada análisis, las disoluciones se renovaron y los armazones se introdujeron de nuevo en disolución.

La cantidad de VEGF radiomarcado liberado de los armazones se determinó en cada tiempo comparando el VEGF marcado con ^{125}I restante con el que se cargó originalmente en cada armazón. Se comparó la liberación porcentual de VEGF de los armazones incubados en SBF con la de los armazones incubados en PBS en cada tiempo mediante un ensayo con t de Student que puso de manifiesto diferencias significativas en la liberación acumulativa.

5. Actividad biológica del VEGF liberado

Se determinó la actividad biológica del VEGF incorporado a, y que se libera de, matrices poliméricas ensayando su capacidad para estimular el desarrollo de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas cultivadas, aisladas de dermis neonatal (HMVEC(nd), Cascade Biologics; Portland, OR).

El HMVEC(nd) se cultivó hasta el estado 7 en el medio MCDB 131 (Cascade Biologics) suplementado con el suplemento de crecimiento microvascular de Cascade Biologics (5% de suero bovino fetal, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblasto humano, heparina, factor de crecimiento epidérmico humano y dibutirilAMP cíclico) antes de su utilización. Las células se colocaron en placas a una densidad de 5 x 10^{3} células/cm^{2} sobre platillos de cultivo tisular de 12 pocillos (Corning; Cambridge, MA) que se recubrieron previamente con 1 \mug/cm^{2} de fibronectina de plasma humano (Life Technologies, Grand Island, NY). Se dejó que las células se unieran durante 24 horas y después se sustituyó el medio de cada pocillo con 3 ml de un medio exento de suero (Cell Systems; Kirkland, WA) suplementado con 50 \mug/ml de gentamicina (Life Technologies).

Se colocó un pocillo de transferencia de 12 mm (diámetro de poro de 3 \mum, Coming) que contenía la matriz de liberación de VEGF mineralizado o no mineralizado, en cada pocillo experimental (n = 5 para cada grupo), mientras que las matrices mineralizadas que no contenían VEGF se colocaron en los pocillos de control (n = 5). Para determinar la dosis respuesta a concentraciones conocidas de VEGF, se suplementaron pocillos adicionales (n = 4 por concentración) con 40, 20, 10 y 5 ng/ml de VEGF soluble que no se había incorporado a las matrices.

Tras 72 horas se eliminaron todas las células en los pocillos experimentales y de control con una disolución de tripsina al 0,05%/EDTA 0,53 mM (Life Technologies) y se contaron usando un contador ZM Coulter (Coulter; Miami, FL). Los pocillos de transferencia que contenían las matrices se transfirieron inmediatamente a nuevos pocillos revestidos de fibronectina (1 \mug/cm^{2}) que se habían sembrado con células (5 x 10^{3} células/cm^{2}) 24 horas antes, y se dejó que incubaran durante otras 72 horas más antes de que las células se eliminaran y contaran. Se preparó conjuntamente un nuevo conjunto de pocillos de dosis respuesta de VEGF con lo transferido de los pocillos de transferencia. Los ciclos de 72 horas se continuaron durante 12 días.

Los conteos celulares en pocillos experimentales se compararon con los conteos celulares en los pocillos de control para cada intervalo de 72 horas usando un ensayo con t de Student que puso de manifiesto diferencias significativas en la proliferación de
HMVEC.

B. Resultados 1. Mineralización

La incubación de armazones de poli(lactida-co-glicólido) 85:15 espumados por gas que contienen VEGF dio como resultado un mineral similar al hueso sobre las superficies internas del poro. El análisis de varianza mostró que las diferencias en el porcentaje de ganancia de masa con el tiempo de incubación en SBF eran significativas (p<0,05). Los armazones mostraron un aumento de masa con el tiempo de incubación, con una ganancia de masa de 6 \pm 1% después de 4 días de incubación en SBF (Fig. 5). La masa del armazón posteriormente permaneció relativamente constante. El aumento de masa entre los tiempos de incubación de los días dos y cuatro fue significativo (p<0,05), mientras que no había una diferencia significativa en la ganancia porcentual de masa entre los tiempos de incubación entre el cuarto día y posteriores (p>0,05).

Para verificar que el aumento de masa estaba provocado por la deposición de un mineral apatítico, se analizó la masa de fosfato en los armazones. El contenido de fosfato en los armazones aumentó con el tiempo de incubación en SBF (Fig. 6). El análisis de varianza mostró que las diferencias en el contenido de fosfato con el tiempo de incubación en SBF eran significativas (p<0,05). La diferencia en el contenido de fosfato entre los tiempos de incubación entre los días segundo y sexto fue significativa (p<0,05), mientras que no se encontró una diferencia significativa entre la masa de fosfato del tiempo de incubación del sexto día y los tiempos de incubación mayores (p>0,05).

Los inventores habían demostrado previamente que el aumento de masa y del contenido de fosfato en estos armazones indica el crecimiento de una película mineral continua similar al hueso sobre las superficies internas de los poros (Murphy y col., J. Biomed. Mat. Res., Invención Press).

La porosidad total de los armazones después de una incubación de 10 días en SBF fue de 92 \pm 1%, que es similar a la porosidad inicial del armazón
(93 \pm 1%).

Después de una incubación de 6 días, la estimación de la masa de mineral sobre el armazón usando los datos de masa de fosfato da 0,10 mg de hidroxiapatita, mientras que el aumento de medida de la masa del armazón es de 0,39 \pm 0,03 mg. El hecho de que el valor medido sea mayor que el valor estimado sugiere una sustitución significativa de carbonato en el cristal mineral.

2. Liberación y actividad de VEGF

El factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) se incorporó a armazones PLG con una eficiencia del 44 \pm 9% y se liberó durante un periodo de 15 días en disoluciones de SBF y PBS. Se observó una liberación repentina inicial del factor de crecimiento incorporado durante las primeras 12-36 horas seguido de una liberación sostenida durante el resto del estudio (Fig. 7).

La liberación acumulativa de los armazones incubados en SBF se hizo significativamente menor que la liberación desde los armazones incubados en PBS después de 3 días y esta diferencia permaneció significativa durante 10 días de liberación (p<0,05). En los tiempos posteriores a 10 días no hay una diferencia significativa en la liberación acumulativa desde los armazones incubados en SBF y los incubados en PBS (p>0,05).

El VEGF liberado de armazones mineralizados y no mineralizados tuvo un efecto mitogénico sobre las células endoteliales microvasculares dérmicas humans (HMVEC).

Las células se desarrollaron en pocillos que contenían tres tipos de armazones diferentes: 1) armazones mineralizados que contenían VEGF (armazones MV); 2) armazones no mineralizados que contenían VEGF (armazones NV); y 3) armazones mineralizados de control sin VEGF (armazones MC). Las células que se cultivaron en pocillos que contenían armazones MV y NV demostraron un aumento de proliferación significativo cuando se compararon con las células cultivadas en pocillos que contenía armazones MC (Fig. 8A). Los conteos de células fueron significativamente mayores en los pocillos que contenían armazones MV y NV durante todos los intervalos de tiempo (p<0,05), excepto los pocillos que contenían armazones NV durante el intervalo de liberación del factor entre los días 14 y 16.

Durante el intervalo de liberación del factor entre los días 8 y 10, los armazones MV mostraron un efecto mitogénico significativamente mayor sobre las HMVEC que los armazones NV (p<0,05). No hubo una diferencia significativa en el efecto estimulador de los armazones MV frente a los armazones NV durante cualquier otro intervalo de tiempo (p>0,05).

Se usó una curva dosis-respuesta (Fig. 8B) generada por las HMVEC para calcular una concentración eficaz para el factor de crecimiento liberado. La comparación de esta concentración eficaz con la cantidad de VEGF que se sabe que se libera durante cada periodo de tiempo (Fig. 7) indica que el VEGF liberado es mayor del 70% activo para todos los intervalos de tiempo.

Ejemplo X Efectos de los factores de crecimiento sobre la mineralización A. Materiales y procedimientos

Se obtuvieron gránulos de poli(láctica-co-glicolida) con una proporción de lactida a glicolida de 85:15 de Medisorb, Inc. (V.I.=0,78 dl/g) y se molieron hasta un tamaño de partícula entre 106 y 250 \mum. Las partículas de PLG molidas se combinaron después con 250 \muL de una disolución de alginato al 1% (MVM, ProNova; Oslo, Norway) en ddH_{2}C, y se formó un remolino. Estas disoluciones se liofilizaron, se mezclaron con 100 mg de partículas de NaCl (250\mum<d<425\mum) y se moldearon por compresión a 102,04 atm (1500 psi) durante 1 minuto en una extrusora de 4,2 mm de diámetro. Esto dio como resultado discos de 2,8 mm de espesor con un diámetro de 5,0 mm.

Los discos se expusieron a 57,82 atm (850 psi) de CO_{2} gas en un tanque de presión aislado y se permitió que se equilibraran durante 20 horas. La presión se disminuyó hasta presión ambiente en 2 minutos, lo que provocó una inestabilidad termodinámica y la formación posterior de poros gaseosos en las partículas poliméricas. Las partículas poliméricas se expandieron y conglomeraron para formar un armazón continuo con partículas de alginato y NaCl atrapadas. Después de la espumación por gas, los discos se incubaron en CaCl_{2} 0,1M durante 24 horas para lixiviar las partículas de sal e inducir la gelificación del alginato en la matriz polimérica. Se incluyó alginato en los armazones porque se había usado en los estudios de liberación de VEGF para ayudar a remitir la liberación de VEGF de los armazones de PLG^{11}, y era necesario imitar con precisión las condiciones del armazón durante los estudios de liberación del factor.

La porosidad total de los armazones se calculó usando la densidad conocida del polímero sólido, la masa medida del polímero en el armazón y el volumen medido del armazón. Las micrografías de sección transversal con electrones se obtuvieron biseccionando los armazones mediante fractura en frío y reflejando las imágenes usando un microscopio de barrido electrónico Hitachi S3200N.

Para determinar el efecto del VEGF en disolución sobre el procedimiento de crecimiento mineral, los armazones se incubaron en SBF que contenía 0,2 \muCi de VEGF marcado con ^{125}I (VEGF humano de tipo receptor, 90 \muCi/\mug, Biomedical Technlogies Inc.; Stoughton, MA) (n=5). Las muestras se incubaron durante cinco días, pues este es el periodo de tiempo requerido para el crecimiento de una cantidad significativa del material similar al hueso en las superficies internas de los poros de armazones de PLG^{14} obtenidos por espumación por gas/lisiviación de partículas 85:15. Después de la incubación, los armazones se lavaron tres veces en ddH_{2}O y se determinó su radiactividad usando un contador gamma. Se calculó el porcentaje de incorporación de VEGF en los armazones de polímero (Conteo del armazón/conteo de la disolución * 100) y se dibujó frente al tiempo de incubación.

La incubación se realizó en tubos que se siliconaron usando sigmacota, después se preagitaron en una disolución de albúmina de suero bovino al 1% (BSA) durante 30 minutos para revestir la superficie del tubo con BSA y, de esta manera, reducir la unión del VEGF a la superficie interna de los tubos. Las disoluciones se sustituyeron diariamente para asegurar unas concentraciones iónicas suficientes para el crecimiento mineral y una concentración constante del factor de crecimiento yodado en la disolución.

Se preparó el fluido corporal simulado (SBF) diariamente, disolviendo los siguientes reactivos en H_{2}O desionizada: NaCl-141 mM, KCl-4,0 mM, MgSO_{4}-0,5 mM, MgCl_{2}-1,0 mM, NaHCO_{3}-4,2 mM, CaCl_{2}-2,5 mM y KH_{2}PO_{4}-1,0 mM. El SBF resultante se tamponó a pH=7,4 con Trisma-HCl y se mantuvo a 37ºC durante los periodos de incubación.

B. Resultados

Los armazones de poli(lactida-co-glicolida) 85:15 preparados mediante un procedimiento de espumación por gas/lixiviación de partículas eran porosos en un 93 \pm 1% y mostraron una estructura porosa abierta con un diámetro de poros de \sim200 \mum.

La incorporación de VEGF radiactivo en los armazones fue mayor para los armazones de control que para los armazones experimentales para todos los puntos temporales posteriores a 2 días (p<0,05). Los datos de control muestran también una tendencia a un aumento en la incorporación de VEGF al aumentar el tiempo de incubación (Fig. 9). Estos datos indican que el VEGF se está incorporando en los armazones de control más eficazmente de lo que se está incorporando en las muestras experimentales, y la cantidad de VEGF en los armazones experimentales no aumenta durante el tratamiento de mineralización.

Los datos muestran que el VEGF no se incorpora significativamente en los armazones de PLG durante la incubación en SBF. No hay tampoco una incorporación significativa del factor de crecimiento en el mineral durante las etapas iniciales del crecimiento mineral. Por lo tanto, la atenuación de la liberación de VEGF mostrada anteriormente desde los armazones de PLG durante el crecimiento mineral no se puede explicar por la incorporación de proteínas en la película mineral, unión de la proteína a la superficie del armazón o difusión de la proteína de vuelta hacia el armazón durante la liberación de proteína.

Las etapas postuladas en el procedimiento de crecimiento mineral sobre armazones de PLG son: 1) funcionalización superficial mediante reacción de hidrólisis; 2) quelación de iones Ca^{2+} mediante aniones carboxilato superficiales; 3) Nucleación y crecimiento de cristales minerales sobre la superficie del polímero. La falta de incorporación de VEGF en los armazones de PLG incubados en SBF indica que la proteína no compite con los iones calcio por los centros de unión sobre las superficies internas de los poros de los armazones o se difunde eficazmente de vuelta a los armazones después de la liberación.

En este caso, la cantidad de proteína incorporada en los armazones fue significativamente mayor para las muestras de control incubadas en tampón de Tris-HCl, y la incorporación aumentó con el tiempo. El aumento de la eficacia de incorporación de VEGF en las muestras de control puede deberse a una difusión más eficaz del factor en los armazones de control o a una unión potenciada del factor a las superficies internas de los armazones de control. Este resultado muestra que los efectos del crecimiento mineral sobre la liberación de VEGF desde los armazones de PLG no se puede explicar por la incorporación de VEGF de nuevo a los armazones de PLG después de la liberación, o por la unión de VEGF a las superficies internas de los poros de los armazones.

No hay una incorporación significativa de proteína en la película mineral durante las etapas iniciales del crecimiento mineral. Durante la incubación de armazones de PLG en SBF que contenía VEGF marcado con ^{125}I, la cantidad de VEGF medida en los armazones no cambió significativamente después de 2 días. El presente estudió limitó el marco temporal de incubación en SBF a 5 días, pues este era el periodo en el que se iniciaba el crecimiento mineral, y ocurrió un crecimiento mineral significativo en un estudio previo sobre armazones de PLG obtenidos por espumación por gas/lixiviación de partículas 85:15.

Los estudios previos sobre armazones de PLG mineralizados muestran que el crecimiento mineral continua durante al menos dos semanas in vitro y se considera que los factores bioactivos se pueden incorporar en la película mineral durante tiempos de incubación mayores. En particular, la atenuación de la liberación de VEGF de los armazones de PLG provocada por la formación mineral no se puede explicar por la incorporación de la proteína en la película mineral, pues esta atenuación ocurre mayoritariamente en los primeros 5 días de la incubación en SBF y no hay una incorporación significativa durante este periodo de tiempo.

Como la atenuación de la liberación del factor de crecimiento no se puede explicar por la incorporación de las proteínas de nuevo en los armazones después de la liberación o la incorporación de proteínas en los cristales minerales en crecimiento, es probable que la atenuación se deba simplemente a un efecto de barrera. Los cristales minerales en crecimiento sobre las superficies internas de los poros del armazón de PLG puede bloquear físicamente la liberación de proteínas de la matriz polimérica. Este efecto de barrera se ha estudiado ampliamente en aplicaciones de administración controlada de fármacos usando membranas de microesferas poliméricas laminadas y microesferas encapsuladas, y el crecimiento de un mineral similar al hueso representa un nuevo procedimiento para bloquear la difusión de proteínas hacia fuera de los materiales poliméricos.

Por lo tanto el factor de crecimiento endotelial vascular no se incorpora en la película mineral, o se incorpora significativamente en el armazón polimérico durante la incubación de PLG en SBF. El efecto observado anteriormente de crecimiento mineral sobre la liberación de VEGF de los armazones de PLG está causado, probablemente, porque el mineral actúa como barrera física a la difusión de proteínas fuera del armazón. Se contempla que este mecanismo es útil en aplicaciones de administración controlada de fármacos, pues el perfil de liberación desde estos materiales se puede controlar, de manera predecible, por el espesor y la densidad de la película mineral.

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Claims (55)

1. Un procedimiento para generar una superficie mineralizada extendida sobre un material biocompatible, que comprende funcionalizar al menos una primera superficie de un material biocompatible para crear una pluralidad de grupos polares oxígeno en una superficie funcionalizada y poner en contacto dicha superficie funcionalizada in vitro con una cierta cantidad de una disolución que contiene un mineral eficaz para generar una mineralización extendida sobre al menos dicha primera superficie de dicho material biocompatible.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha superficie funcionalizada se genera exponiendo al menos una primera superficie de dicho material biocompatible a un pretratamiento de funcionalización antes de ponerlo en contacto con dicha disolución que contiene el mineral.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho pretratamiento de funcionalización comprende la exposición a una cantidad eficaz de radiación electromagnética, radiación UV o radiación por haz de electrones (haz-e).

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho pretratamiento de funcionalización genera una superficie estructurada, funcionalizada.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho pretratamiento de funcionalización comprende la exposición a una cantidad eficaz de una disolución de NaOH.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha superficie funcionalizada se genera durante dicho contacto con dicha disolución que contiene el mineral.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución que contiene mineral comprende calcio y en el que dicha mineralización extendida comprende un revestimiento de calcio extendido.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución que contiene el mineral comprende al menos un primer y un segundo mineral y en el que dicha mineralización extendida comprende una mezcla de dicho primer y segundo minerales.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución que contiene el mineral comprende una pluralidad de minerales diferentes y en que dicha mineralización extendida comprende un revestimiento polimineralizado heterogéneo.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que dicha mineralización extendida comprende al menos una primera parte hipermineralizada.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que al menos dicha primera superficie de dicho material biocompatible es una superficie interna del poro de un material biocompatible poroso y en el que se genera un revestimiento mineral extendido sobre dicha superficie interna del poro.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mineralización extendida comprende un revestimiento mineral sustancialmente homogéneo.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha mineralización extendida comprende una pluralidad de islas minerales discretas.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución que contiene el mineral es un fluido corporal in vitro o un medio sintético que imita un fluido corporal.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte biodegradable, no biodegradable o armazón tridimensional o al menos una primera parte que tenga una estructura porosa abierta o interconectada.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte en forma de película de un biomaterial sustancialmente bidimensional.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos un una primera parte de metal, biocristal, aluminato, biomineral, biocerámico, titanio o titanio revestido de biomineral.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte que comprende un biomineral seleccionado del grupo constituido por hidroxiapatita, hidroxiapatita carbonatada y carbonato cálcico o en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte de superficie que está enriquecida en grupos ácido carboxílico.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte de polímero de origen natural o sintético.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte que comprende un polímero de origen natural seleccionado del grupo constituido por colágeno, alginato, fibrina, matrigel, alginato modificado, elastina, chitosano y gelatina; o un polímero sintético seleccionado del grupo constituido por un poli(vinilalcohol), poli(etilenglicol), plurónico, poli(vinilpirrolidona), hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, poli(etilentereftalato), poli(anhídrido) y poli(propilenfumarato).

21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte que comprende un polímero de ácido poliáctico (PLA), un polímero de ácido poliglicólico (PGA) o un copolímero de ácido poliáctico-co-glicólico (PLG).

22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera parte preparada mediante un procedimiento que comprende espumación por gas y lixiviación de partículas.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que al menos una primera sustancia bioactiva se asocia de manera operativa con dicho material biocompatible durante el procedimiento de espumación por gas y lixiviación de partículas.

24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicho material biocompatible se prepara mediante un procedimiento de espumación por gas y lixiviación de partículas que comprende las etapas de:

a)

preparación de una mezcla que comprende, al menos, un material lixiviable en forma de partículas y partículas capaces de formar un biomaterial polimérico degradable poroso;

b)

someter dicha mezcla a un procedimiento de espumación por gas para crear un biomaterial polimérico degradable, poroso que comprende dicho material lixiviable en forma de partículas; y

c)

someter dicho biomaterial polimérico degradable poroso a un procedimiento de lixiviación que elimina dicho material lixiviable en forma de partículas de dicho biomaterial polimérico degradable poroso, creando, de esa manera, porosidad adicional.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dicho procedimiento de lixiviación comprende poner en contacto dicho biomaterial polimérico degradable poroso con un material de lixiviación que contiene mineral.

26. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos dicha primera superficie de dicho material biocompatible es sustancialmente una superficie de nivel.

27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que al menos dicha superficie de dicho material biocompatible es una superficie de contorno.

28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible se fabrica como al menos una parte de un dispositivo implantable.

29. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una sustancia bioactiva, un fármaco bioactivo o una célula biológica.

30. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos dos sustancias bioactivas, fármacos o células biológicas.

31. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una sustancia bioactiva adherente a mineral, un fármaco bioactivo o una célula biológica.

32. El procedimiento de cualquiera de la reivindicación 31, en el que la generación de la superficie mineralizada extendida controla la liberación de dicha sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica de dicho material biocompatible.

33. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera molécula de ADN, una molécula de ARN, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un plásmido, un vector de expresión, un vector viral o un virus recombinante.

34. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera proteína marcadora, factor de transcripción o elongación, proteína de control del ciclo celular, quinasa, fosfatasa, proteína de reparación del ADN, oncogen, supresor de tumores, proteína angiogénica, proteína antiangiogénica, receptor de superficie celular, molécula accesoria de señalización, proteína de transporte, enzima, agente antibacteriano, agente antivírico, antígeno, inmunógeno, agente inductor de apoptosis, agente antiapoptosis o citotoxina.

35. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera hormona, neurotransmisor o receptor del factor de crecimiento, interferón, interleucina, quimioquina, citoquina, factor estimulante de colonias, factor quimiotáctico, componente extracelular de la matriz o una molécula de adhesión, ligando o péptido.

36. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de hormona del crecimiento, hormona paratiroidea (PTH), proteína ósea morfogenética (BMP), factor de crecimiento transformador \alpha (TGF- \alpha), TGF-\beta1, TGF-\beta2, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor estimulante de las colonias de granulocitos/macrófagos (GMCSF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento proveniente de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), fibrina, colágeno, fibronectina, vitronectina, ácido hialurónico, un péptido o polipéptido que contiene RGD, una angiopoyetina o factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF).

37. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una célula ósea progenitora, fibroblasto, célula endotelial, célula madre, macrófago, célula vascular, osteoblasto, condroblasto u osteoclasto.

38. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera célula recombinante que expresa al menos un primer segmento de ácido nucleico que produce un producto transcripcional o traducido en dicha célula.

39. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad combinada biológicamente eficaz de al menos una primera sustancia bioactiva y al menos una primera célula biológica.

40. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad combinada biológicamente eficaz de al menos un primer factor de crecimiento osteotrópico o un ácido nucleico del factor de crecimiento osteotrópico y una población celular que comprende células óseas progenitoras.

41. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende además una cantidad combinada biológicamente eficaz de VEGF o un ácido nucleico de VEGF y una población celular que comprende células endoteliales.

42. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos se incorpora una primera sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica en dicho material biocompatible antes del procedimiento de modificación celular.

43. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una primera sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica se incorpora en dicho material biocompatible durante o posteriormente al procedimiento de modificación superficial.

44. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material biocompatible comprende al menos una primera superficie estructurada y en el que al menos se une una primera sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica en una cierta estructura a dicha superficie estructurada.

45. Un material biocompatible modificado en superficie que comprende al menos una primera superficie modificada preparada mediante un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

46. Un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45 para usar en cultivo celular.

47. Un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45 para usar en transplante celular.

48. Un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45 para usar en ingeniería tisular o en la regeneración guiada del tejido.

49. Uso de un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45 en la preparación de un medicamento para tratar una afección médica que necesite transplante de células.

50. Uso de un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45 en la preparación de un medicamento para tratar una afección médica que necesite ingeniería tisular o regeneración guiada del tejido.

51. Un dispositivo de cultivo celular que comprende un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45.

52. Un dispositivo biomédico implantable que comprende un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45.

53. Un procedimiento para cultivas células, que comprende cultivar una población de células en contacto con un material biocompatible modificado en superficie según la reivindicación 45 in vitro.

54. El procedimiento de la reivindicación 53, en el que dicha población de células se mantiene en contacto con dicho material biocompatible modificado en superficie en unas condiciones y durante un periodo de tiempo eficaz para generar un tejido con estructura de tipo bi- o tridimensional.

55. El procedimiento de la reivindicación 53, en el que dicha población de células se mantiene en contacto con dicho material biocompatible modificado en superficie en unas condiciones y durante un periodo de tiempo eficaz para generar un tejido similar al hueso, tejido neovascularizado o vascularizado.