ES2199941T3 - Anticuerpos monoclonales contra el receptor de la interferona, con actividad neutralizadora contra el interferon de tipo j. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales contra el receptor de la interferona, con actividad neutralizadora contra el interferon de tipo j.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL DIRIGIDO CONTRA EL RECEPTOR DE LA INTERFERONA DE CLASE I HUMANA (IFN-R) QUE SE CARACTERIZA POR LAS SIGUIENTES PROPIEDADES: RECONOCE LA EXTENSION EXTRACELULAR DE LA IFN-R HUMANA Y TIENE UNA CAPACIDAD NEUTRALIZADORA CONTRA LAS PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LA IFN DE TIPO I HUMANA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A SU USO PARA DIAGNOSTICOS.
Description
Anticuerpos monoclonales contra el receptor de
interferón, con actividad neutralizadora contra el interferón de
\hbox{tipo I.}
Los interferones (IFN) constituyen un grupo de
proteínas secretadas que presentan una amplia serie de actividades
biológicas y que se caracterizan por su capacidad de inducir un
estado antiviral en células de vertebrados (I. Gresser y M.G. Tovey
Biochem Biophys. Acta 516:231, 1978). Hay tres clases
antigénicas de IFN: alfa (\alpha), beta (\beta) y gamma. El
IFN\alpha y el IFN\beta conjuntamente se conocen como
interferón de tipo I.
El interferón humano natural de tipo I comprende
12 o más proteínas muy relacionadas codificadas por distintos genes
con un alto grado de homología estructural (Weissmann y Weber,
Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 33:251, 1986).
El locus del IFN\alpha humano comprende dos
subfamilias. La primera subfamilia consta de 14 genes no alélicos y
4 pseudogenes que tienen al menos una homología del 80%. La segunda
subfamilia, \alphaII u omega (\omega), contiene 5 pseudogenes y
1 gen funcional que presenta una homología del 70% con los genes
del IFN\alpha (Weissmann y Weber 1986).
Los subtipos de IFN\alpha tienen diferentes
actividades específicas, pero poseen el mismo espectro biológico
(Streuli et al. PNAS-USA 78:2848, 1981) y
tienen el mismo receptor celular (Agnet M. et al. en "Interferon
5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press,
Londres 1983).
El interferón \beta (IFN\beta) se codifica
por un solo gen que tiene una homología de aproximadamente el 50%
con los genes del IFN\alpha.
Los subtipos del interferón \alpha y del
interferón \beta se unen al mismo receptor en la superficie
celular.
El interferón gamma (IFN gamma) también se
codifica por una sola copia, que tiene poca homología con los genes
del IFN\alpha y del IFN\beta El receptor para el IFN gamma es
distinto del receptor de los interferones \alpha y \beta.
Para el objeto de la presente invención, el
receptor de las clases \alpha y \beta de IFN se denominará
IFN-R. Representa el receptor natural de tipo I. El
grupo de proteínas que constituyen el interferón \alpha natural se
denominará IFN\alpha, y el IFN de tipo I representará el
IFN\alpha, el IFN\omega y el IFN\beta naturales.
A pesar del hecho de que el interferón es un
potente agente antiviral, existen indicios considerables que
sugieren que muchos de los síntomas característicos de ciertas
enfermedades víricas agudas tales como infecciones del tracto
respiratorio superior se deben a una sobreproducción de interferón
\alpha. Además, se ha demostrado que el IFN\alpha contribuye a
la patogénesis de ciertas infecciones víricas crónicas en animales
experimentales y los indicios disponibles sugieren que esto también
ocurre para ciertas enfermedades víricas crónicas humanas tales
como las debidas al virus del sarampión.
Los interferones \alpha también son moléculas
inmunorreguladoras potentes que estimulan la activación de células
B policlonales, aumentan la citotoxicidad de células NK, inhiben
las funciones de las células T y modulan la expresión de los
antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de
clase 1, estando implicados todos ellos en la inducción de
autoinmunidad y en el rechazo de injertos. La producción anormal de
interferón \alpha está asociada con varias enfermedades
autoinmunes y trastornos inflamatorios que incluyen lupus sistémico
eritematoso (SLE), diabetes de tipo I, psoriasis, artritis
reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Behçet, anemia
aplástica, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la
enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa. La presencia de
interferón \alpha en el suero de pacientes con lupus sistémico se
correlaciona con signos tanto clínicos como humorales de una mayor
actividad de la enfermedad. La producción de interferón \alpha en
sujetos VIH positivos también es muy predictiva de la evolución de
la enfermedad.
Se ha notificado que la administración de
interferón \alpha exacerba la enfermedad subyacente en pacientes
con psoriasis y esclerosis múltiple y que induce síntomas parecidos
a los del SLE en pacientes con una historia previa de enfermedad
autoinmune. También se ha demostrado que el interferón \alpha
induce la glomerulonefritis en ratones normales y que acelera la
aparición de la enfermedad autoinmune espontánea en ratones
NZB/W.
El interferón \alpha también se produce durante
el transcurso de la enfermedad del injerto contra el hospedador
(GVHD) en paralelo con el aumento de actividad de células NK
característico de la GVDH sistémica. El interferón \alpha es el
modulador principal de la citotoxicidad de las células NK y se ha
demostrado que la administración de interferón \alpha potencia las
consecuencias intestinales de la GVDH en ratones normales.
El objeto de la presente invención es
proporcionar nuevos antagonistas contra las actividades biológicas
del IFN de tipo I humano. Estos antagonistas podrían usarse para
fines terapéuticos, incluyendo para la profilaxis, en casos en los
que se produce anormalmente el IFN de tipo I (IFN \alpha/\beta)
y cuando esta producción anormal está asociada con síntomas
patológicos. Tales antagonistas también podrían usarse para el
diagnóstico de diversas enfermedades o para el estudio de la
evolución de tales enfermedades.
Para definir tales antagonistas, los inventores
han tenido en cuenta el hecho de que el IFN de tipo I natural
humano efectivamente consta de una mezcla de interferones
(subespecies) y el hecho de que la composición de esta asociación de
diferentes subtipos de interferones varía tanto cuantitativa como
cualitativamente.
Algunos interferones naturales, tales como los
secretados por células Namalwa (interferón Namalwa) o leucocitos
(interferón de leucocitos), se han estudiado con detalles (N.B.
Finter y K.H. Fautes, Interferon 2, 1980, p. 65-79
I. Gresser Editor Academic Press; K. Cantell et al, Interferon 1,
1979 p 2-25, I. Gresser Editor Academic Press) y se
usaron por los inventores para definir los interferones de tipo I
naturales.
En algunos casos patológicos, tales como el SIDA,
se han descrito interferones que tienen algunas propiedades
especiales (O. T. Preble et al, Annals of New-York
Academy of Sciences p. 65-75). Sin embargo, este
interferón implicado en casos patológicos tales como el SIDA se une
al mismo receptor, como se ha descrito anteriormente.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un antagonista del IFN de tipo I, que pueda inhibir o
neutralizar, en un grado determinado, las propiedades biológicas del
IFN de tipo I humano, es decir, neutralizar in vivo una
mezcla de subespecies \alpha, \beta o \omega.
Por consiguiente, los inventores han definido
anticuerpos, específicamente anticuerpos monoclonales, que tienen
la propiedad de ser antagonistas del IFN de tipo I. Estos
anticuerpos se dirigen contra el receptor IFN de tipo I humano.
El receptor del interferón de clase I humano
(IFN-R) y su ADNc se describen en el documento
WO-A-91/05862. El objetivo principal
de esta solicitud de patente es usar dicho receptor para
identificar antagonistas de IFN-\alpha humano.
Este documento también indica que pueden inducirse anticuerpos
contra el receptor del interferón humano de clase I. Sin embargo, no
se indican los medios para obtener tales anticuerpos ni sus
propiedades.
La publicación de Yonehara, S. et al.
(1986 - Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, Holanda, páginas
167-171) describe un anticuerpo monoclonal
anti-idiotipo, que se ha inducido contra
anticuerpos anti-IFN-\alpha humano
obtenidos después de la inmunización de ratones Balb/c con
IFN-\alpha y la purificación de IgG
anti-IFN-\alpha. Este anticuerpo
compite con el IFN-\alpha en la unión a la
superficie de las células humanas e inhibe la actividad antiviral
del IFN-\alpha in vitro. Sin embargo, de
D2 no puede deducirse que este anticuerpo pueda neutralizar las
propiedades biológicas de una mezcla de interferones \alpha,
\beta y \omega.
Otro documento describe la obtención de tres
anticuerpos monoclonales (mAB) que reconocen una de las subunidades
del receptor de IFN-\alpha (Colamonci, O.R. et
al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.87, pág.:
7230-7234). Estos mAB se han seleccionado por su
capacidad de unirse a los complejos de IFN\alpha/receptor de
IFN\alpha. Después se demostró que estos anticuerpos
inmunoprecipitaban una banda de 110 kDa que correspondía a una
subunidad del receptor de IFN-\alpha (no
complejada con IFN\alpha). El hecho de que los anticuerpos
descritos inmunoprecipiten tanto una subunidad del receptor de
IFN-\alpha como complejos de
IFN-\alpha/receptor de IFN\alpha sugieren que se
unen a un epítopo del receptor distinto del sitio de unión de
INF-\alpha al receptor de
INF-\alpha. Además, los autores indican que los
anticuerpos descritos no pueden bloquear la unión de IFN\alpha a
sus receptores.
En el documento
WO-A-93/04699 se sugiere la idea de
prevenir la IDDM por medio del uso de antagonistas de
IFN-\alpha. Entre estos antagonistas, los
inventores mencionan anticuerpos capaces de unirse a un receptor de
IFN\alpha y capaces de neutralizar la actividad biológica de
\alpha-IFN. Sin embargo, en esta solicitud de
patente, los inventores no describen de forma alguna cómo obtener
tales anticuerpos. Por el contrario, sólo mencionan las
características deseadas de estos anticuerpos, y mencionan como
ejemplos polipéptidos identificados en los documentos EP 369.877, WO
91/05862 y Colamonici et al., PNAS 87:
7230-7234.
De esta manera, la invención también se refiere
al uso de anticuerpos monoclonales para la preparación de
composiciones farmacéuticas, útiles para el tratamiento de síntomas
asociados con la producción anormal de IFN de tipo I. Estos
anticuerpos monoclonales también son apropiados para la preparación
de reactivos de diagnóstico.
Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
presente invención se dirige contra el receptor del interferón de
tipo I humano (IFN-R) y se caracteriza por las
siguientes propiedades:
- -
- reconoce el dominio extracelular del IFN-R humano y
- -
- tiene capacidad neutralizadora contra las propiedades biológicas del IFN de tipo I humano.
La capacidad de neutralizar las propiedades
biológicas del IFN de tipo I puede estimarse como una función de la
capacidad del anticuerpo monoclonal de neutralizar la actividad
antiviral del IFN de tipo I. Tal ensayo es relevante para determinar
si el anticuerpo ensayado se incluye dentro del alcance de la
invención, aunque está claro que las propiedades biológicas del IFN
de tipo I no se limitan a sus propiedades antivirales. En los
ejemplos se proporcionan procedimientos detallados para permitir la
realización de tal ensayo de la actividad antiviral. Las células
ensayadas ventajosamente pueden ser células Daudi, cuya afinidad
por el IFN de tipo I es bien conocida. Las etapas principales de tal
ensayo consistirían en:
\newpage
- -
- incubar una concentración determinada de células humanas que responden al IFN de tipo I humano, con IFN de tipo I humano en presencia de una concentración determinada de anticuerpos monoclonales a ensayar, durante un período de tiempo suficiente como para permitir la formación de un complejo entre los anticuerpos monoclonales y el IFN-R de las células humanas y/o entre el IFN de tipo I y el IFN-R de las células humanas;
- -
- infectar las células incubadas con un virus determinado, en una concentración determinada,
- -
- lavar las células,
- -
- resuspender las células en medio de cultivo,
- -
- incubar durante un tiempo suficiente como para permitir la replicación del virus;
- -
- lisar las células;
- -
- medir la replicación del virus o medir la inhibición del efecto citopático.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales de
la invención de neutralizar las propiedades biológicas del IFN de
tipo I humano puede modularse en función de la dosis de anticuerpos
usada. Por consiguiente, puede obtenerse una inhibición del 100% de
las propiedades biológicas o una inhibición parcial.
De acuerdo con otra realización de la presente
invención, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
receptor de IFN de tipo I humano se caracterizan adicionalmente por
el hecho de que pueden inhibir la unión de un IFN de tipo I humano
al IFN-R humano.
Un anticuerpo monoclonal que tiene la capacidad
de reconocer el dominio extracelular del IFN-R
humano y capaz de inhibir la unión del IFN de tipo I humano a su
receptor, puede seleccionarse por las siguientes etapas:
- -
- preincubar una concentración determinada de anticuerpos monoclonales purificados o un sobrenadante de cultivo de hibridoma que contiene anticuerpos monoclonales a ensayar, con células humanas que pueden llevar IFN-R;
- -
- añadir IFN de tipo I humano marcado, en una concentración determinada, al medio preincubado anterior;
- -
- incubar el medio que contiene las células humanas, los anticuerpos monoclonales y el IFN de tipo I marcado durante un tiempo suficiente para permitir que se produzca un equilibrio entre los anticuerpos monoclonales por una parte y el IFN de tipo I por otra parte, con el IFN-R celular;
- -
- lavar las células; y
- -
- determinar la formación de un complejo de unión entre las células humanas y el IFN de tipo I marcado contando la cantidad de IFN de tipo I marcado unido.
Algunos de los anticuerpos monoclonales de la
invención tienen también la capacidad de neutralizar las
propiedades antiproliferativas del IFN de tipo I humano. Esta
propiedad también puede ensayarse en células Daudi, realizando las
siguientes etapas:
- -
- dejar que las células crezcan en presencia de IFN de tipo humano y una concentración determinada de mAB; y
- -
- contar las células para detectar la inhibición del efecto antiproliferativo del IFN de tipo I humano.
Una propiedad de un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la invención reside en su capacidad de reconocer el
dominio extracelular del receptor de INF humano. Esta propiedad del
anticuerpo monoclonal puede ensayarse en células humanas que llevan
el receptor humano natural, pero también en el dominio extracelular
de un IFN-R recombinante, tal como el expresado en
una célula procariota, por ejemplo en E. coli, o un
IFN-R recombinante tal como el expresado en una
célula eucariota, tal como una célula de mamífero, por ejemplo una
célula CHO.
De hecho, este receptor puede presentar
diferentes propiedades, dependiendo del hecho de que se produzca en
una célula procariota o eucariota y, por consiguiente, dependiendo
del hecho de que se produzca o no una maduración posterior a la
traducción. De forma interesante, los inventores demostraron que
pueden realizarse ensayos relevantes para evaluar la capacidad de un
anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención, por ejemplo, de
reconocer el
IFN-R celular, en un receptor recombinante expresado en células de mamífero. De hecho, tal receptor recombinante tiene las mismas propiedades que el receptor celular, por lo que respecta a su actividad de reconocimiento.
IFN-R celular, en un receptor recombinante expresado en células de mamífero. De hecho, tal receptor recombinante tiene las mismas propiedades que el receptor celular, por lo que respecta a su actividad de reconocimiento.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de la
invención contra diversas formas del receptor, incluyendo el
receptor completo, un dominio particular o un péptido
característico de la secuencia de aminoácidos del receptor
representado en la figura 3.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales de la
invención, por ejemplo, contra la forma soluble del receptor. En la
figura 2 se describe un polipéptido hidrosoluble que corresponde a
la forma soluble del INF-R. De acuerdo con la
presente invención, una forma soluble del IFN-R
corresponde a un péptido o un polipéptido, capaz de circular en el
cuerpo.
También pueden prepararse otros anticuerpos
monoclonales de acuerdo con la invención contra un péptido
comprendido en el dominio extracelular del receptor, como se
describe en la figura 2. Un péptido ventajoso corresponde, por
ejemplo, a la secuencia de aminoácidos comprendida entre el
aminoácido 1 y el aminoácido 229. De acuerdo con otra realización de
la invención, los anticuerpos pueden prepararse contra un
polipéptido modificado por sustitución de uno o más aminoácidos,
siempre que los anticuerpos dirigidos contra el dominio
extracelular no modificado del IFN-R reconozcan el
polipéptido o péptido modificado.
Son anticuerpos monoclonales preferidos de
acuerdo con la invención los que son de tipo IgG1.
Entre los anticuerpos de la invención, un
anticuerpo que tiene la capacidad de inhibir la unión del IFN de
tipo I a su receptor preferiblemente se caracteriza porque inhibe la
unión in vitro del IFN de tipo humano al
IFN-R celular humano cuando se
co-incuba con células que llevan el hu-
IFN-R, a una concentración de anticuerpos igual o
inferior a 100 \mug/ml, preferiblemente igual o inferior a 50
\mug/ml, ventajosamente inferior a 20 \mug/ml, y más
preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 2
\mug/ml.
Los inventores han demostrado que la capacidad de
unión de alta afinidad de un anticuerpo monoclonal no es suficiente
para asegurar que este anticuerpo pueda inhibir la actividad de
unión del IFN de tipo I humano al IFN-R. Sin
embargo, se necesita la capacidad de unión de alta afinidad del
anticuerpo monoclonal para investigar adicionalmente la capacidad
del anticuerpo de inhibir la unión del IFN de tipo I a su receptor
celular.
Otro anticuerpo monoclonal se caracteriza porque
neutraliza in vitro la actividad antiproliferativa de un IFN
de tipo I humano, en células que presentan una alta respuesta a este
IFN de tipo I humano, por ejemplo células Daudi, a una
concentración en el intervalo de 1 a 10 \mug/ml.
De acuerdo con otra realización, un anticuerpo
monoclonal también se caracteriza porque neutraliza in vitro
la actividad antiproliferativa del IFN de tipo humano, en células
que responden de forma deficiente a este INF humano, por ejemplo
células Ly28, a una concentración en un intervalo de 50 a 100
\mug/ml.
Un grupo particular de anticuerpos monoclonales
de acuerdo con la invención se caracteriza porque neutraliza la
actividad antiviral del IFN de tipo I humano en células que
presentan una alta respuesta a este IFN de tipo I humano, por
ejemplo células Daudi, a una concentración en un intervalo de 1 a
50 \mug/ml, preferiblemente de 1 a 20 \mug/ml, para una
concentración de IFN de tipo I en el intervalo de 1 a 1000 unidades
con respecto a la norma internacional
MRC 69/19.
MRC 69/19.
Ventajosamente, el anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la invención es tal que estos anticuerpos no se unen al
receptor humano para el IFN gamma.
Un anticuerpo particular que satisface los
requisitos de la invención, es tal que se dirige contra un epítopo
en la secuencia de aminoácidos comprendida entre el aminoácido 27 y
el aminoácido 427 del dominio extracelular del
IFN-R humano como se representa en la figura 2.
IFN-R humano como se representa en la figura 2.
Un anticuerpo monoclonal particularmente
interesante de acuerdo con la invención es el anticuerpo denominado
64G12 con el Nº 92022605 que se ha depositado en la ECACC (European
Collection of Animal Cell Cultures Porton Down Salisbury, Wiltshire
SP4 056, Reino Unido) el 26 de febrero de 1992.
Estos anticuerpos pueden prepararse por métodos
convencionales que implican la preparación de células de hibridoma
por la fusión de células de mieloma y células de bazo de un animal
inmunizado de antemano con el antígeno peptídico, en tales
condiciones que el antígeno contra el cual se forman los
anticuerpos esté constituido por el dominio extracelular de
IFN-R o cualquier polipéptido o péptido de este
dominio.
Los hibridomas se construyen de acuerdo con el
protocolo de Kohler y Milstein (Nature, 1974, 256:
495-497). Por ejemplo, los hibridomas se obtienen
por la fusión de las células de bazo descritas anteriormente con
HGPRT de ratón NS1 (BalbC) como célula de mieloma.
Un segundo procedimiento para la producción de
anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención consiste en
realizar la fusión entre células B de sangre inmortalizadas con el
virus de Epstein/Barr y linfocitos B humanos puestos en contacto, de
antemano, con el dominio extracelular del IFN-R o
un fragmento del mismo, contra el cual se decide formar anticuerpos
monoclonales. Las células B, puestas en contacto, de antemano, con
el dominio extracelular de IFN-R o un fragmento del
mismo contra el que se decide formar anticuerpos monoclonales,
pueden obtenerse por cultivo in vitro en contacto con los
antígenos, estando precedida la recuperación de las células B
recubiertas con estos antígenos por uno o varios ciclos de
estimulación.
\newpage
De esta manera, la invención se refiere a
anticuerpos humanos como los obtenidos realizando el procedimiento
anterior, que tienen las propiedades definidas anteriormente.
La invención también pretende proporcionar un
anticuerpo monoclonal caracterizado porque las regiones variables o
determinantes de complementariedad de sus cadenas pesada y/o ligera
se injertan en las regiones estructurales y/o constantes de un
anticuerpo humano.
La invención proporciona además una composición
que tiene propiedades antagonistas para las propiedades biológicas
del IFN de tipo I humano, caracterizada porque comprende
anticuerpos monoclonales como los definidos anteriormente.
Por consiguiente, la invención proporciona una
composición farmacéutica caracterizada porque comprende anticuerpos
monoclonales como los definidos anteriormente, junto con un
vehículo farmacéutico apropiado.
La invención también se refiere al uso de un
anticuerpo monoclonal como se ha definido anteriormente, para la
fabricación de un fármaco para el tratamiento o profilaxis de un
estado patológico o los síntomas asociados con la superproducción
del IFN de tipo I.
De acuerdo con un primer ejemplo, los anticuerpos
pueden usarse en una composición farmacéutica para el tratamiento
del rechazo de aloinjertos.
De acuerdo con otro ejemplo, se usan anticuerpos
de la invención como principio activo en una composición
farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e
inflamatorias. Tales enfermedades incluyen lupus sistémico
eritematoso, diabetes de tipo 1, psoriasis, artritis reumatoide,
esclerosis múltiple, enfermedad de Behçet, anemia aplástica,
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y enfermedad de
inmunodeficiencia combinada severa.
Con los anticuerpos de la invención también puede
realizarse el tratamiento de enfermedades víricas agudas. Como
ejemplo, puede realizarse el tratamiento de infecciones del tracto
respiratorio superior e infecciones víricas crónicas tales como las
debidas al virus del sarampión.
Los anticuerpos de la invención también pueden
usarse para el diagnóstico in vitro de la presencia del
receptor de IFN de tipo I humano o células con tal receptor.
- Figura 1: unión de anticuerpos monoclonales
marcados con 125I 34F10 y 64G12 a:
- -
- A: Células Daudi
- -
- B: Células Ly28
En resumen, se incubaron 10^{6} células durante
2 horas a 4ºC en presencia de diferentes cantidades de los
anticuerpos marcados diluidos en medio RPMI que contenía un 10% de
suero de ternero fetal (FCS). Las células después se lavaron 4
veces en RPMI-FCS al 1% y se contó la radiactividad
unida. La unión no específica se midió por incubación con un exceso
de 100 veces de anticuerpos fríos y se restó del recuento
total.
- Figura 2: secuencia de nucleótidos y de
aminoácidos correspondiente del dominio extracelular del
IFN-R humano.
Se produjeron anticuerpos monoclonales contra
formas solubles recombinantes del receptor del interferón
alfa-beta humano (IFN-R)
sintetizadas en células procariotas (E. coli) o en un
sistema de células de mamífero (células Cos). Estas formas solubles
se basaron en la secuencia de ADN descrita en la figura 2.
- Figura 3: secuencia de nucleótidos y de
aminoácidos correspondiente del IFN-R humano.
Se clonó un fragmento de ADN que contenía la
secuencia que codificaba el dominio extracelular (aminoácidos 27 a
427) del IFN-R humano (figura 2), en el que se
introdujo una secuencia extra que codificaba 5 restos de histidilo
justo antes del codón de terminación, en los vectores de expresión
pKK233-2. Este fragmento se produjo por la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), y los plásmidos resultantes se
secuenciaron para confirmar tanto la inserción en fase con la
secuencia de Shine Dalgarno como la secuencia apropiada que
codificaba el receptor.
La cola de poli-histidilo
introducida en la proteína recombinante permite que se purifique
rápidamente por cromatografía de afinidad en un soporte de níquel
quelado (columna NTA) como se ha descrito previamente (Hochuli E. et
al, Bio/technology, 1988, 1321-1325).
El plásmido se introdujo en la cepa de E.
coli JM105, y la síntesis de proteínas se indujo por la adición
de IPTG al medio de cultivo (pKK233-2, promotor
tac).
Se extrajeron proteínas del sedimento bacteriano
y el receptor soluble se purificó hasta la homogeneidad por
cromatografía de afinidad como se describe más adelante. Este
procedimiento produjo una proteína que migra como 2 bandas alrededor
de 50 kDa en condiciones reductoras y 3 bandas en condiciones no
reductoras. La concentración máxima de la proteína obtenida por
diferentes procedimientos fue de aproximadamente 20 \mug/ml.
La secuencia N-terminal de las
dos proteínas detectadas por electroforesis en gel ha demostrado
que las dos proteínas son el fragmento esperado del receptor.
| Cultivo bacteriano (250 ml) | |||
| | | |||
| | | |||
| Inducción con IPTG 3 h | |||
| | | |||
| | | |||
| Sedimento celular | |||
| Clorhidrato de Guanidina 6 M pH 8 | |||
| | | |||
| | | |||
| Centrifugación | |||
| | | |||
| | | |||
| Columna NTA: | Lavados con | urea 8 M pH 8 | |
| urea 8 M pH 6,3 | |||
| urea 8 M pH 5,9 | |||
| | | |||
| | | |||
| Elución con urea 8 M pH 4 | |||
| | | |||
| | | |||
| replegamiento | dilución, diálisis | ||
| frente a Tris 0,1 M pH 9 | |||
| | | |||
| | | |||
| diálisis con PBS |
Usando la misma estrategia de PCR, también
construimos un vector de expresión que codificaba la secuencia de
aminoácidos del IFN-R 1-427, con 5
restos de histidilo adicionales en el extremo C, insertados en el
vector de expresión pXMT-3. También se confirmó la
secuencia de nucleótidos exacta del inserto.
El plásmido resultante se introdujo por
electroporación en células Cos7 para la expresión transitoria y la
proteína recombinante se purificó hasta la homogeneidad por
cromatografía de afinidad seguida de cromatografía de intercambio
iónico en mono-Q (Pharmacia) como se describe más
adelante.
\newpage
| electroporación preparativa de células cos | |
| 18 h | |
| | | |
| | | |
| medio sin suero | |
| | | |
| | | |
| sobrenadantes recogidos después de 48 h, 72 h y 96 h | |
| | | |
| | | |
| concentración | |
| | | |
| | | |
| columna NTA | |
| | | |
| | | Lavado con PBS |
| elución con NaOAc 0,1 M pH 5,5 | |
| | | |
| | | neutralización |
| concentración, límite 30.000 | |
| | | |
| | | |
| Mono Q (NaCl 0-0,5M) |
Esta purificación produjo una proteína de 76 kDa
cuya secuencia N- terminal corresponde a la secuencia del receptor
prevista con alguna heterogeneidad en el procesamiento de la
secuencia líder.
Se inmunizaron ratones por inyección del
interferón soluble recombinante (r sIFN-R)
purificado a partir de
E. coli o a partir de un sobrenadante de cultivo de células Cos7. Inicialmente, a los ratones se les inyectó, tanto por vía intraperitoneal como por vía subcutánea, la proteína purificada en adyuvante completo de Freund. Posteriormente, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal una vez por semana de las proteínas purificadas diluidas en solución salina tamponada. Cada vez se inyectaron diez microgramos de proteínas recombinantes.
E. coli o a partir de un sobrenadante de cultivo de células Cos7. Inicialmente, a los ratones se les inyectó, tanto por vía intraperitoneal como por vía subcutánea, la proteína purificada en adyuvante completo de Freund. Posteriormente, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal una vez por semana de las proteínas purificadas diluidas en solución salina tamponada. Cada vez se inyectaron diez microgramos de proteínas recombinantes.
Después de la cuarta inyección, se recogió sangre
y se ensayó la presencia de anticuerpos séricos específicos tanto
por ELISA como por transferencia de Western contra el receptor
recombinante. Los respondedores más fuertes después se reforzaron
con un total de 10 \mug de antígeno, administrándose la mitad por
vía intravenosa y la otra mitad por vía intraperitoneal.
Cuatro días después del refuerzo, se recogieron
células de bazo del animal inmunizado y se fusionaron a células de
mieloma HGPRT- de NS1 (ratón) (Balbc) de acuerdo con el método
descrito por S. Fazekas et al. (J. Immunol. Methods 35:
1-32, 1980). En resumen, se fusionaron 5x10^{7}
células de bazo a 3x10^{7} células de mieloma en 1 ml de solución
de polietilenglicol y se distribuyeron en cinco placas de 96
pocillos sobre una capa de alimentación de macrófagos peritoneales
en medio HAT (hipoxantina, aminoproteína y timidina). Este
procedimiento se repitió 4 veces, con lo que se obtuvieron
20x10^{7} células de bazo a partir del ratón inmunizado. La
selección de los hibridomas específicos se realizó cuando pudieron
detectarse colonias grandes en pocillos de cultivo.
Para la selección, la presencia de anticuerpos
específicos se determinó por un método ELISA directo:
- a)
- Se recubrieron placas ELISA durante una noche a 4ºC con sIFN-R expresado en células Cos7 o expresado en E. coli purificado diluido en PBS. Para detectar la unión no específica se usaron placas recubiertas con BSA,
- b)
- las placas se saturaron por incubación con BSA al 3% en PBS durante una hora a 37ºC,
- c)
- las placas se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente con sobrenadantes de hibridoma diluidos a 1 en 4 con PBS-Tween 20 al 0,05%,
- d)
- los anticuerpos unidos se detectaron por un procedimiento de dos etapas, que comprendía una primera incubación con inmunoglobulina de cabra anti-ratón biotinilada, seguido de complejo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (ambas de Amersham y diluidas 1/1000 en PBS-Tween 20 al 0,05%).
Los hibridomas de secreción de anticuerpos
positivos se pasaron en placas de 24 pocillos sobre una capa de
alimentación de células de bazo y su reactividad se comprobó de
nuevo por ELISA y transferencia de Western.
La reactividad de los anticuerpos monoclonales
(mAb) que reconocen el sIFN-R recombinante se
ensayó contra el receptor de clase I natural expresado en la
superficie de células Daudi, por inmunofluorescencia de membrana.
En resumen, se incubaron 5x10^{5} células Daudi en 100 \mul de
sobrenadante de cultivo de hibridomas elegidos durante 30 minutos a
4ºC. Las células después se lavaron cuatro veces en medio RPMI que
contenía un 1% de BSA y se incubaron adicionalmente con un
F(ab')_{2} de cabra anti-ratón marcado con
FITC diluido durante 30 minutos a 4ºC. Las células finalmente se
analizaron por citometría de flujo después del lavado. Se descubrió
que uno de los 35 anticuerpos ensayados producidos contra el
receptor recombinante de E. coli y 5 de los 6 anticuerpos
ensayados producidos contra el receptor recombinante de COS
reconocían el receptor natural en las células Daudi.
Después se realizó la clonación de estos
hibridomas por dilución limitante. El isotipo de estos mAb se
determinó por un método ELISA usando anticuerpos específicos de
isotipo. Se descubrió que los 6 mAb eran IgG1 con cadenas ligeras
kappa. En la tabla 1 se proporciona un resumen de la reactividad de
estos 6 mAb.
Se purificaron anticuerpos monoclonales a partir
de los sobrenadantes de cultivo por cromatografía en proteína
G.
| Reactividad contra el receptor recombinante | Reactividad contra el receptor celular* | ||||
| E. Coli | COS | ||||
| ELISA | Western | ELISA | Western | Inmunofluorescencia | |
| 34F10 | + | + | + | + | + |
| 64G12 | + | + | + | + | + |
| 63F6 | |||||
| 64G2 | + | + | + | + | + |
| 64010 | débil | ||||
| 6508 | |||||
| * medido en células Daudi |
La inhibición de la unión del interferón a
células humanas se ensayó como se indica a continuación. Se
preincubaron 10^{6} células a 4ºC durante 30 minutos con diversas
diluciones de sobrenadantes de cultivo de hibridoma o mAb
purificados o con medio solo. Se añadió IFN alfa 8 o alfa 2 marcado
con ^{125}I a la concentración de 100 pM y las células se
incubaron durante 4 horas más a 4ºC. Estas incubaciones se
realizaron en medio RPMI que contenía KEPES
20 mM pH 7,4 y suero de ternero fetal (FCS) al 10%. Las células finalmente se lavaron 4 veces con RPMI-FCS al 1% y se contaron para determinar la radiactividad unida.
20 mM pH 7,4 y suero de ternero fetal (FCS) al 10%. Las células finalmente se lavaron 4 veces con RPMI-FCS al 1% y se contaron para determinar la radiactividad unida.
En este ensayo, se demostró que el mAb secretado
por la línea de hibridoma 64G12 (denominado finalmente mAb 64G12)
inhibía la unión del IFN marcado a las células de una manera
dependiente de la dosis. Se obtuvo una inhibición del 50% de la
unión a las células Daudi (Burkitt lymphoma cell line; Klein et
al., Cancer Researh, 28: 1300-1310, 1968) a
una concentración de mAb de 0,4 \mug/ml. Se obtuvo la misma
inhibición con células K562 (leucemia mielógena crónica, Lozzio y
Lozzio, Cell, 45: 321-334, 1975), pero se
obtuvo una inhibición del 50% a 11 \mug/ml para las células HL60
(Promyelocytic leukemia, Collins S.J. et al., Nature,
270:347-349, 1977) y 60 \mug/ml para las
células Ly28 (Klein G. et al. Int. J. Cancer,
10:44-57, 1972).
| La inhibición de la unión del IFN alfa 2 marcado a diversas líneas celulares por el mAB 64G12 | |
| Líneas celulares | Concentración de mAB que proporciona una inhibición de la unión del 50% |
| Daudi K562 | 0,4 \mug/ml |
| HL60 | 11 \mug/ml |
| Ly28 | 60 \mug/ml |
La diferencia en la concentración de mAB a la que
se obtiene el 50% de la inhibición de la unión de IFN se ha
investigado por unión directa de los mAB 64G12 y 34F10 marcados con
^{125}I a las mismas líneas celulares y por análisis de gráficos
de Scatchard de los resultados. En el intervalo de concentraciones
de 0,1 a 0,5 \mug/ml, se observó una unión de alta afinidad del
mAB 34F10 (\approx 10 nM) en todas las líneas celulares,
mientras que sólo se detectó una unión de alta afinidad del mAB
64G12 en las células Daudi y K562 (figura 1).
La inhibición funcional del interferón de tipo I
por el mAB 64G12 purificado se demostró en un ensayo antiviral en
células Daudi usando IFN alfa 2 recombinante, IFN beta e IFN omega,
o los interferones Namalwa y de leucocitos purificados, y en un
ensayo antiproliferativo con el IFN alfa 2 recombinante.
Se realizó un ensayo antiviral en células Daudi
como se ha descrito (M. Dron y M.G. Tovey, J. Gen. Virol.
64: 2641-2647, 1983). Se incubaron las
células (0,5 x 10^{6}/ml) durante 24 horas en presencia de
interferón y anticuerpos. Después se infectaron 106 células en un
recipiente de 1 ml durante 1 hora a 37ºC con el virus de la
estomatitis vesicular (VSV) y después se lavaron 3 veces, se
resuspendieron en medio de cultivo y se incubaron durante 18 horas a
37ºC. Las células después se lisaron por
congelación-descongelación y la replicación del
virus se midió por titulación de los sobrenadantes en células L929.
Se demostró una inhibición dependiente de la dosis de la actividad
antiviral de los diversos subtipos de IFN de tipo I para el mAB
64G12 purificado.
Para el ensayo antiviral con las células Wish,
las células se incubaron durante 24 horas con diversas
concentraciones de interferones en presencia de los mAB antes de la
exposición a VSV. En este ensayo, se demostró que el mAB 64G12
bloqueaba completamente la actividad antiviral del IFN de
leucocitos (50 U/ml), del IFN alfa 2 recombinante (50 U/ml) y del
interferón del suero de pacientes con SIDA (50, 75 y 150 U/ml).
Para el ensayo antiproliferativo, se sembraron
células Daudi a una concentración de 10^{5} células por ml en una
placa de 96 pocillos en presencia de interferón y anticuerpos de
control o inhibidores purificados. A continuación se contaron las
células después de 24, 48 y 72 horas con un contador Coulter y se
comprobó la viabilidad por exclusión con azul trípano. El mAB 64G12
purificado demostró una inhibición dependiente de la dosis de la
actividad antiproliferativa del interferón alfa 2.
Claims (31)
1. Anticuerpo monoclonal dirigido contra el
receptor del interferón de clase I (IFN-R) humano
caracterizado por las siguientes propiedades:
- -
- reconoce el dominio extracelular del IFN-R humano, y
- -
- tiene capacidad neutralizadora contra las propiedades biológicas de los interferones \alpha, \beta y \omega naturales humanos (IFN de tipo I).
2. Anticuerpo monoclonal dirigido contra el
IFN-R de tipo I humano de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por su capacidad de inhibir
la unión de un IFN de tipo I patológico humano al
IFN-R.
3. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que se puede obtener a partir de una célula
de hibridoma preparada por fusión de una célula de mieloma con
células de bazo de un animal previamente inmunizado con la forma
soluble del IFN-R humano.
4. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado
porque reconoce un epítopo en una forma soluble del
IFN-R celular humano o de un IFN-R
recombinante.
5. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque inhibe in vitro la unión del IFN de tipo I humano al
IFN-R celular humano cuando se
co-incuba con células que llevan el
hu-IFN-R, a una concentración de
anticuerpos igual o inferior a 100 \mug/ml.
6. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque inhibe in
vitro la unión del IFN de tipo I humano al IFN-R
celular humano cuando se co-incuba con células que
llevan el hu-IFN-R, a una
concentración de anticuerpos igual o inferior a 50 \mug/ml.
7. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque inhibe in
vitro la unión del IFN de tipo I humano al IFN-R
celular humano cuando se co-incuba con células que
llevan el hu-IFN-R, a una
concentración de anticuerpos igual o inferior a 20 \mug/ml.
8. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque inhibe in
vitro la unión del IFN de tipo I humano al IFN-R
celular humano cuando se co-incuba con células que
llevan el hu-IFN-R, a una
concentración de anticuerpos en el intervalo de 0,5 a 2
\mug/ml.
9. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado
porque neutraliza in vitro la actividad antiproliferativa
del IFN de tipo I humano en células que presentan una alta
respuesta a este IFN de tipo I humano, a una concentración en el
intervalo de 1 a 10 \mug/ml.
10. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado
porque neutraliza in vitro la actividad antiproliferativa
del IFN de tipo I humano en células con poca respuesta a este IFN
de tipo I humano, a una concentración en el intervalo de 50 a 100
\mug/ml.
11. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado
porque no se une al receptor humano del IFN gamma.
12. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado
porque reconoce un epítopo de la secuencia de aminoácidos 27 a 427
del IFN-R humano.
13. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado
porque neutraliza in vitro la actividad antiviral del IFN de
tipo I humano, en células que presentan una alta respuesta a este
IFN de tipo I humano, a una concentración en el intervalo de 1 a 10
\mug/ml.
14. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 9 o la reivindicación 13, donde dichas células que
presentan una alta respuesta a dicho IFN de tipo I humano son
células Daudi.
15. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado
porque neutraliza in vitro la actividad antiviral del IFN de
clase I humano, en células que presentan una baja respuesta a este
IFN humano, a una concentración en el intervalo de 50 a 100
\mug/ml.
16. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 10 o la reivindicación 15, donde dichas células que
responden de forma deficiente a dicho IFN de tipo I humano son
células Ly28.
17. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es
el anticuerpo 64G12, depositado en la ECACC el 26 de febrero de
1992 con el Nº 92022605.
18. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado
porque es un anticuerpo humanizado.
19. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 18, caracterizado porque las regiones
variables o determinantes de complementariedad de sus cadenas pesada
y ligera se injertan en las regiones estructurales y constantes de
un anticuerpo humano.
20. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado
porque es un anticuerpo humano.
21. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado
porque es un anticuerpo de tipo IgG1.
22. Célula de hibridoma, caracterizada
porque produce anticuerpos monoclonales de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 19.
23. Composición que tiene propiedades
antagonistas para el IFN de tipo I, caracterizada porque
comprende anticuerpos monoclonales de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 21.
24. Composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, junto con
un vehículo farmacéutico apropiado.
25. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para la
fabricación de un fármaco para el tratamiento o profilaxis de un
estado patológico asociado con la actividad de células
proliferativas y/o una infección vírica de células.
26. Proceso para la selección de un anticuerpo
monoclonal que tiene la capacidad de reconocer el dominio
extracelular del IFN-R humano y capaz de inhibir la
unión del IFN de tipo I humano al IFN-R,
caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- preincubar una concentración determinada de anticuerpos monoclonales purificados de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o un sobrenadante de cultivo de hibridoma que contiene anticuerpos monoclonales, con células humanas susceptibles de llevar IFN-R;
- -
- añadir IFN de tipo I humano marcado, en una concentración determinada, al medio preincubado anterior;
- -
- incubar el medio que contiene las células humanas, los anticuerpos monoclonales y el IFN de tipo I marcado durante un tiempo suficiente para permitir que se produzca un equilibrio entre los anticuerpos monoclonales por una parte y el IFN de tipo I por otra parte con el IFN-R celular;
- -
- lavar las células;
- -
- determinar la formación de un complejo de unión entre las células humanas y el IFN de tipo I contando la cantidad de IFN de tipo I marcado unido.
27. Proceso para la selección de un anticuerpo
monoclonal que tiene la capacidad de reconocer el dominio
extracelular del IFN-R humano y que tiene una
capacidad neutralizadora contra las actividades proliferativas del
IFN de tipo I, en células humanas, caracterizado por las
etapas de:
- -
- dejar que las células crezcan en presencia de IFN de tipo I humano y en presencia de una concentración determinada de anticuerpos monoclonales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21;
- -
- contar las células para detectar la inhibición del efecto antiproliferativo del IFN de tipo I.
28. Proceso para la selección de un anticuerpo
monoclonal que tiene la capacidad de reconocer el dominio
extracelular del IFN-R humano y que tiene una
capacidad neutralizadora contra las actividades antivirales del IFN
de tipo I natural, no patológico o patológico en células humanas,
caracterizado por las etapas de:
- -
- incubar células con IFN de tipo I y anticuerpos monoclonales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en concentraciones determinadas, durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo entre los anticuerpos monoclonales y el IFN-R de las células humanas y/o entre el IFN de tipo I y el IFN-R de las células humanas;
- -
- infectar las células incubadas anteriormente con una concentración determinada de un virus;
- -
- lavar las células;
- -
- resuspender las células en medio de cultivo;
- -
- incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir la replicación del virus;
- -
- lisar las células y;
- -
- medir la replicación del virus o medir la inhibición del efecto citopático.
29. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para la
fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o
profilaxis del rechazo de aloinjertos o de la enfermedad del injerto
contra el hospedador.
30. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para la
fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o
profilaxis de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
31. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo
con la reivindicación 30, para la fabricación de una composición
farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de la artritis
reumatoide.
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|---|---|---|---|
| EP92400902A EP0563487A1 (en) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | Monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type I interferon |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0725654A1 (en) * | 1993-09-17 | 1996-08-14 | Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. | Pharmaceutical composition comprising monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type i interferon |
| IL118096A0 (en) * | 1996-05-01 | 1996-09-12 | Yeda Res & Dev | Antibodies against interferon alpha/beta receptor |
| US6713609B1 (en) | 1996-07-16 | 2004-03-30 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies to type I interferon receptor |
| CN1068524C (zh) * | 1997-06-23 | 2001-07-18 | 叶庆炜 | 一种治疗顽症牛皮癣的药物 |
| US6376067B1 (en) * | 1998-12-21 | 2002-04-23 | Mitsubishi Polyester Film, Llc | Silicone coated film with back side slip control coating and method of controlling slip of such film |
| GB0001712D0 (en) * | 2000-01-25 | 2000-03-15 | Pharma Pacific Pty Ltd | Therapeutic peptides |
| AU2007202840B2 (en) * | 2001-01-09 | 2011-07-28 | Baylor Research Institute | Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays |
| AU2002246955B2 (en) * | 2001-01-09 | 2007-03-22 | Baylor Research Institute | Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays |
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| AU2007203559B2 (en) * | 2003-04-23 | 2010-09-02 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Compositions and methods for the therapy of inflammatory bowel disease |
| US7619070B2 (en) * | 2003-04-23 | 2009-11-17 | Medarex, Inc. | Humanized antibodies to interferon alpha receptor-1 (IFNAR-1) |
| CA2522957C (en) | 2003-04-23 | 2013-10-22 | Medarex, Inc. | Compositions and methods for the therapy of inflammatory bowel disease |
| KR101151477B1 (ko) | 2003-12-10 | 2012-06-22 | 메다렉스, 인코포레이티드 | 인터페론 알파 항체 및 그의 용도 |
| WO2005118647A2 (en) * | 2004-05-18 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | M13 virus major coat protein variants for c-terminal and bi-terminal display of a heterologous protein |
| JP5160887B2 (ja) | 2004-06-21 | 2013-03-13 | メダレックス インコーポレイテッド | インターフェロンアルファレセプター１抗体及びその使用法 |
| BRPI0516470A (pt) * | 2004-10-07 | 2008-09-09 | Universitot Zuerich | uso de um agente de bloqueio do interferon tipo i, e, método de prevenção e tratamento da psorìase |
| US7888481B2 (en) * | 2005-02-10 | 2011-02-15 | Baylor Research Institute | Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use |
| RU2431638C2 (ru) * | 2005-02-10 | 2011-10-20 | Бэйлор Рисерч Инститьют | Моноклональные антитела против интерферона-альфа и способы применения |
| US20070081995A1 (en) * | 2005-06-22 | 2007-04-12 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for targeting IFNAR2 |
| CN101678100A (zh) | 2006-12-06 | 2010-03-24 | 米迪缪尼有限公司 | 治疗系统性红斑狼疮的方法 |
| US8685400B2 (en) | 2007-07-30 | 2014-04-01 | University Of Miami | Modulating inflammasome activity and inflammation in the central nervous system |
| EP2250279B1 (en) | 2008-02-08 | 2016-04-13 | MedImmune, LLC | Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity |
| AU2009245792B2 (en) | 2008-05-07 | 2012-11-01 | Coimmune, Inc. | Humanized antibodies against human interferon-alpha |
| NZ602219A (en) * | 2010-03-01 | 2014-10-31 | Alexion Pharma Inc | Methods and compositions for treating degos’ disease |
| WO2013134146A1 (en) * | 2012-03-07 | 2013-09-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for treating viral infections by blocking type i interferon activity |
| JP7308034B2 (ja) | 2016-07-01 | 2023-07-13 | リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー | 最適化二重ヌクレアーゼ融合物および方法 |
| WO2018010140A1 (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-18 | 中国科学院生物物理研究所 | I型干扰素受体抗体及其用途 |
| WO2019040674A1 (en) | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Sanabio, Llc | SOLUBLE INTERFERON RECEPTORS AND USES THEREOF |
| US20220144957A1 (en) * | 2019-01-31 | 2022-05-12 | Immunecent Biotechnology, Inc. | Novel anti-ifnar1 antibodies |
| CN120463762A (zh) | 2021-08-26 | 2025-08-12 | 映恩生物科技(上海)有限公司 | 一种甾体化合物及其缀合物 |
| CN115028730B (zh) * | 2022-05-17 | 2022-11-08 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 一种成体干细胞衍生的类器官制备方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2953132A (en) | 1955-10-27 | 1960-09-20 | Baxter Laboratories Inc | Parenteral solution equipment |
| US3066671A (en) | 1959-10-27 | 1962-12-04 | Milton J Cohen | Disposable additive container |
| US3608550A (en) | 1969-05-07 | 1971-09-28 | Becton Dickinson Co | Transfer needle assembly |
| BE791340A (fr) | 1972-01-06 | 1973-03-01 | Becton Dickinson Co | Nouveaux procede et appareil de prelevement de culture et d'identification de micro-organismes des humeurs |
| US4024857A (en) | 1974-12-23 | 1977-05-24 | Becton, Dickinson And Company | Micro blood collection device |
| US4300404A (en) | 1977-12-01 | 1981-11-17 | Becton, Dickinson And Company | Liquid specimen container |
| US4116066A (en) | 1977-12-12 | 1978-09-26 | Becton, Dickinson And Company | Specimen sampler cup |
| US5516515A (en) * | 1986-02-05 | 1996-05-14 | Interferon Sciences, Inc. | Separation of alpha interferon receptor proteins and antibodies therefor |
| IL88377A (en) * | 1988-11-14 | 1996-09-12 | Yeda Res & Dev | Cloning and expression of a protein which modulates cellular response to type I interferon |
| FR2653445B1 (fr) * | 1989-10-20 | 1994-07-29 | Centre Nat Rech Scient | Fragment d'adnc codant pour le gene du recepteur de l'interferon alpha et procede de preparation d'une proteine correspondante. |
| US5889151A (en) * | 1989-10-20 | 1999-03-30 | Societe Leb-Tech | Purified human alpha interferon receptor |
| GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| FR2657881A1 (fr) * | 1990-02-05 | 1991-08-09 | Europ Biotechnologie Lab | Nouveaux polypeptides hydrosolubles, sequences d'adn, nouvelles cellules, procede de preparation, applications et compositions renfermant lesdits polypeptides. |
| IL99232A0 (en) * | 1990-08-20 | 1992-07-15 | Univ Columbia | Methods for producing rna viruses from cdna |
| CA2585487A1 (fr) * | 1991-04-17 | 1992-10-29 | Medarex Inc. | Polypeptides hydrosolubles ayant une haute affinite pour les interferons .alpha. et .beta. |
| EP0563487A1 (en) | 1992-03-31 | 1993-10-06 | Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. | Monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type I interferon |
| DE69332485T2 (de) * | 1992-08-11 | 2003-11-13 | The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge | Immunmodulierende peptide |
| DE69322289T2 (de) * | 1992-12-29 | 1999-05-20 | Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. | Behandlung von entzündlichen darmerkrankungen mit interferon-gamma-inhibitoren |
| ATE227133T1 (de) * | 1994-03-07 | 2002-11-15 | Imperial College | Verwendung von interferon-alpha 8 subtype zur herstellung von medikamenten zur behandlung von viralinfektionen der leber |
| IL118096A0 (en) * | 1996-05-01 | 1996-09-12 | Yeda Res & Dev | Antibodies against interferon alpha/beta receptor |
-
1992
- 1992-03-31 EP EP92400902A patent/EP0563487A1/en not_active Withdrawn
-
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