ES2199943T3

ES2199943T3 - Enzima fosfatasa alcalina con una actividad especifica incrementada para utilizacion en reactivos indicadores.

Info

Publication number: ES2199943T3
Application number: ES93915503T
Authority: ES
Inventors: Wlodzimierz Mandecki; Mary Ann Shallcross; Susan J. Tomazic-Allen
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1992-07-07
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2013-07-01
Also published as: EP0651783A1; AU4546093A; WO1994001531A1; DE69333007D1; JPH07508884A; DE69333007T2; EP0651783B1; EP0651783A4; CA2138382A1; CA2138382C; JP3560972B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION INCLUYE LA CONSTRUCCION DE DIVERSAS MUTACIONES EN EL GEN DE FOSFATASA ALCALINA DE ESCHERICHIA COLI, QUE RESULTA EN LA PRODUCCION DE UNA ENZIMA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA MEJORADA. LAS ENZIMAS MUTANTES RESULTANTES ELEVAN LA ACTIVIDAD ESPECIFICA POR ENCIMA DE 1,5 A 36 VECES, MIENTRAS MANTIENEN UNA ESTABILIDAD DE TEMPERATURA QUE ES SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR QUE LA DE ENZIMAS DE FOSFATASA ACIDA DE MAMIFEROS. TAMBIEN SE DEMUESTRA LA UTILIDAD DE FOSFATASA ALCALINA MUTANTE DE E. COLI COMO UNA ETIQUETA DE ENZIMA EN ENSAYOS DE ENLACE.

Description

Enzima fosfatasa alcalina con una actividad específica incrementada para utilización en reactivos indicadores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la modificación de enzimas para mejorar sus propiedades biológicas. En particular, la invención se refiere al uso de una Escherichia coli (E. coli) genéticamente modificada para producir fosfatasa alcalina para usarla como una marca en ensayos de unión, en la que la enzima tiene una actividad específica aumentada y una alta estabilidad térmica.

Antecedentes de la invención

La fosfatasa alcalina se usa como una enzima marcadora fácilmente detectable en diversos ensayos de unión diagnósticos. Por ejemplo, se usa frecuentemente en ensayos de unión enzimáticos heterogéneos en los que puede estar acoplada, dependiendo del tipo de análisis, a un antígeno, anticuerpo u otro miembro específico de unión que se unirá al análito de interés. Después de que tenga lugar la unión, el complejo de unión recién formado puede separarse de la mezcla de reacción y detectarse observando la presencia o la cantidad de fosfatasa alcalina asociada con el complejo. La fosfatasa alcalina se detecta mediante la adición de un sustrato enzimático y observando la extensión de la reacción enzima / sustrato resultante.

Los criterios para elegir cualquier enzima en particular para usarla como una marca incluyen: una actividad específica alta (es decir, un ritmo alto de catálisis o una velocidad alta de la reacción enzimática); estabilidad a temperaturas altas (normalmente una temperatura de fusión mayor de 50 a 60ºC); estabilidad de la enzima después de la conjugación con el miembro específico de unión; disponibilidad de sustratos enzimáticos fácilmente cuantificables para usar en la reacción de detección de la enzima; disponibilidad de métodos de amplificación del producto de la reacción y realización adecuada del ensayo (por ejemplo, lecturas con un fondo bajo). La estabilidad térmica es una preocupación principal en muchas aplicaciones industriales de las enzimas. Las proteínas varían con respecto a su estabilidad térmica y las temperaturas de fusión (Tf) de las diferentes enzimas pueden variar desde menos de 40ºC hasta más de 100ºC.

La fosfatasa alcalina intestinal de ternera se usa frecuentemente como una enzima marcadora, mostrando tanto una alta actividad específica como una temperatura de fusión de aproximadamente 55ºC. La enzima y sus conjugados son útiles para usar en ensayos de unión y hay diversos métodos para amplificar el producto de la reacción de detección. Sin embargo, el uso como marca de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera todavía presenta algunas desventajas. Estas desventajas incluyen la inadecuada pureza de algunas preparaciones enzimáticas y la presencia de carbohidratos unidos covalentemente que se cree que contribuyen a lecturas con fondos altos cuando se produce el ensayo de determinación. Además, la fosfatasa alcalina intestinal de ternera tiene una pobre estabilidad térmica cuando se conjuga con un miembro específico de unión para usarla en un ensayo de unión. Debido a estas desventajas, se ha realizado mucha investigación implicando la búsqueda y el desarrollo de una nueva forma de fosfatasa alcalina que tenga tanto una actividad específica como una estabilidad térmica más adecuadas para los ensayos unión, especialmente para aquellos ensayos en los que se alcanzan temperaturas elevadas.

Un enfoque elegido para evitar las desventajas de la enzima de mamíferos cuenta con el uso de una fosfatasa alcalina de E. coli que tiene una estabilidad térmica extremadamente alta en comparación con las fosfatasas alcalinas de mamíferos. La fosfatasa alcalina de E. coli tiene una Tf de aproximadamente 95ºC. La fosfatasa alcalina también puede expresarse en cantidades elevadas a partir de E. coli, si están presentes numerosas copias del gen correspondiente por célula. Además, la enzima puede purificarse hasta homogeneidad en pocas etapas. Sin embargo, la fosfatasa alcalina de E. coli, tiene una actividad específica menor que la que tiene la fosfatasa alcalina intestinal de ternera. La velocidad máxima de la reacción catalítica (k_{cat}) de la fosfatasa alcalina de E. coli es 60 s^{-1}, aunque se ha observado una considerable variación. Compárese con una k_{cat} de aproximadamente 2000 s^{-1} de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera. Puesto que la fosfatasa alcalina de E. coli que se presenta naturalmente tiene una velocidad de catálisis menor que la de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera, sería ventajoso mejorar la actividad catalítica de la enzima fosfatasa alcalina de E. coli, conservándose simultáneamente su característica estabilidad térmica más favorable.

Los progresos recientes en el campo de la modificación proteínica, tales como la mutagénesis dirigida, el diseño molecular asistido por ordenador, la tecnología de expresión génica y la disponibilidad de estructuras cristalinas o de resonancia magnética nuclear, han hecho factible acometer proyectos con la finalidad de modificar una característica específica de una enzima. Las características modificables de un enzima pueden dividirse en dos clases generales: (1) aquellas características que dependen de las propiedades locales del sitio activo de la enzima, tales como especificidad de sustrato, velocidad de la reacción catalítica (k_{cat}), constante de Michaelis (K_{m}), etc. y (2) aquellas características que dependen de las propiedades globales de la estructura proteínica, tales como la estabilidad térmica, la resistencia a la proteólisis y la regulación alostérica del sitio activo. Típicamente, el sitio activo de una enzima está compuesto de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos. En general, los aminoácidos del sitio activo establecen el tratamiento que ocurre en el sitio activo. Por tanto, cambiando los residuos de aminoácidos que componen el sitio activo, pueden cambiarse los efectos catalíticos de la enzima.

Los primeros esfuerzos para modificar las propiedades de la fosfatasa alcalina contaron, principalmente, con la modificación química de la enzima. Por ejemplo, se sometía a la enzima a foto-oxidación o a tratamiento con mono- y dicloroacetil-\beta-glicerofosfato; 2,3-butanodiona; fenilglioxal y otros compuestos. Típicamente, estos tratamientos reducían o eliminaban la actividad catalítica de la enzima, proporcionando, de este modo, información sobre la función de la enzima [Coleman y Gettings, Adv. Enzymol., volumen 55, página 351 (1983)]. Después del tratamiento de la enzima con tetranitrometano (para nitrar los residuos de tirosina), siguiéndose de reducción de los residuos nitrados a aminotirosina, la actividad fosfohidrolasa de la enzima se eleva hasta 130% de la actividad de la proteína no modificada, mientras que la actividad fosfotransferasa fue 350% del valor normal [Christen y col., Biochemistry, volumen 10, página 1377 (1971)]. Estos experimentos demuestran que ciertas propiedades enzimáticas de la fosfatasa alcalina podrían mejorarse mediante modificación química de la enzima. Sin embargo, los procedimientos de modificación química están limitados en el sentido de que tienen una baja selectividad de los aminoácidos en la enzima que son modificados y, por tanto, puede afectarse un amplio espectro de residuos de aminoácidos.

Además, los cambios en el sitio activo o en el sitio de unión de una proteína también pueden ser más extensos que el cambio de un único aminoácido (es decir, mutación puntual). Por ejemplo, las proteínas que reprimen la expresión génica (represores) pueden convertirse en activadores cambiando varios de los residuos ácidos [Ma y Ptashne, Cell, volumen 48, páginas 847-853 (1987)]. La mayoría de las mutaciones reducen la Tf, tal como se pone en evidencia mediante el trabajo en la subunidad \alpha de la sintetasa del triptófano (Yutant y col., Nature, volumen 267, páginas 274-275 (1977)]. No obstante, el reemplazamiento de unos pocos aminoácidos de la secuencia de la enzima puede aumentar significativamente la Tf de la enzima, como muestran los resultados del trabajo en la proteasa neutra de Bacillus stearothermophilus (Imanaka y col., Nature, vol. 324, páginas 695-697 (1986)].

El advenimiento de la tecnología del ADN recombinante hizo posible modificar o cambiar un residuo de aminoácido específico (mutagénesis dirigida) mediante la modificación del gen que dirige la formación de la fosfatasa alcalina (gen phoA). En E. coli, el gen phoA es parte de una familia no continua de al menos 18 genes que están implicados en la regulación de la unión, transporte y metabolismo del fosfato. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del gen phoA de E. coli son bien conocidas por los expertos en la técnica (Chang, Gene, volumen 44, páginas 121-125 (1986)].

A través de modificación génica, las mutaciones de la serina^{102} en el sitio activo de la enzima fosfatasa alcalina dieron como resultado una reducción de 1000 veces de la actividad específica, demostrándose, de este modo, que este residuo de aminoácido es crítico para la actividad de la fosfatasa alcalina [J.E. Butler-Ransohoff y col., Abstracts of 1989 Alkaline pho sphatase Symposium, San Diego, CA (1989)]. Alternativamente, la sustitución de la serina por cisteína, que mantiene el grupo hidroxi, conduce a una leve reducción de la actividad [Ghosh y col., Science, volumen 231, página 145 (1986)]. El papel de la arginina^{166}, un residuo de la vecindad inmediata del sitio activo de la enzima, se investigó también mediante mutagénesis, dando como resultado una reducción de aproximadamente 50 veces de la eficacia catalítica en comparación con la enzima natural [Butler-Ransohoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volumen 85, página 4276 (1988) y Chaidaroglou y col., Biochemistry, volumen 27, página 8338 (1988)]. Se ha mostrado que la eliminación proteolítica de 10 a 40 residuos de aminoácidos del extremo N-terminal de la fosfatasa alcalina también da como resultado una estabilidad térmica reducida, mientras que la actividad específica de la enzima permanece sin cambio o sólo se reduce levemente [Chlebowski y col., J. Biol. Chem., volumen 264, página 4523 (1989)]. También se han documentado varias mutaciones silenciosas del gen phoA de aislados de E. coli natural [DuBose y col., Proc. Acad. Natl. Sci. USA, volumen 85, página 7036 (1988)]. Más recientemente, se ha investigado mediante mutagénesis dirigida la función del ácido aspártico^{101} del sitio activo de la fosfatasa alcalina de E. coli, reemplazándose dicho aminoácido por alanina [Chaidaroglou y col., Protein Engineering, volumen 3(2), páginas 127-132 (1989)]. La enzima mutante muestra una actividad aproximadamente 3 veces mayor que la enzima natural, pero la enzima mutante también muestra un descenso sustancial de su estabilidad térmica.

El documento EP-A-0441252 describe una enzima sintética caracterizada porque es una enzima fosfatasa alcalina producida por Escherichia coli, en la que dicha fosfatasa alcalina tiene al menos una mutación en un aminoácido y una actividad específica resultante elevada en comparación con la fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli. También se describen las secuencias modificadas de ADN usadas para producir las enzimas, los plásmidos que contienen las secuencias modificadas de ADN, los hospedadores que contienen los plásmidos y los ensayos que utilizan las enzimas en la forma de reactivos indicadores. En particular, el documento EP-A-0441252 describe ejemplos de cambios únicos de aminoácidos que son la sustitución de Val en lugar de Thr^{100}, Ile en lugar de Thr^{100}, Arg en lugar de Lys^{328}, Ala en lugar de Val^{99}, Asp en lugar de Ala^{103}, Cys en lugar de Ala^{103}, Val en lugar de Thr^{107} y Ser en lugar de Asp^{101}. Ejemplos de cambios duales de aminoácidos son Ala en lugar de Val^{99} y Arg en lugar de Lys^{328} o Ala en lugar de Val^{377} y Gly en lugar de Ser^{415}.

Sumario de la invención

La presente invención implica la construcción de genes sintéticos que controlan la producción de un mutante de una enzima fosfatasa alcalina producida por Escherichia coli, que tiene una actividad catalítica aumentada comparada con la enzima natural, caracterizándose porque la mutación consiste en el cambio de una Gly en lugar del Asp^{153}. La actividad enzimática de la enzima de la presente solicitud ha sido aumentada comparada con la enzima natural. Aunque la enzima de la presente solicitud tiene una estabilidad térmica menor comparada con la enzima natural, la estabilidad térmica se conserva en una extensión tal que la enzima es adecuada para uso en ensayos de unión, es decir, la enzima de la presente solicitud no se inactiva por calentamiento en las condiciones de un ensayo normal. Se describen una enzima, las secuencias de ADN usadas para producir la enzima, los plásmidos que contienen las secuencias modificadas de ADN, los hospedadores que contienen los plásmidos y los ensayos que utilizan la enzima en la forma de reactivos indicadores.

La presente invención incluye una secuencia de ADN, adecuada para la inserción dentro de un vector, que implica una serie de codones que codifican una enzima fosfatasa alcalina, en la que la fosfatasa alcalina tiene al menos una mutación en un aminoácido comparada con la fosfatasa alcalina natural de E. coli y en la que la fosfatasa alcalina tiene una actividad específica aumentada comparada con la fosfatasa alcalina natural de E. coli, caracterizándose porque la mutación consiste en el cambio de una Gly en lugar del Asp^{153}. También se describen los plásmidos que contienen dicha secuencia de ADN, así como las células hospedadoras que contienen dichos plásmidos. Se usan hospedadores unicelulares y típicamente se seleccionan de cepas bacterianas y fúngicas tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, células de mamífero, levadura y otros hongos. La elección no es crítica para la presente invención, aunque no todos los hospedadores son igualmente eficaces.

Además, la presente invención implica el uso de dicha fosfatasa alcalina como enzima marcadora en ensayos de unión. Se pueden hacer reactivos indicadores, útiles para determinar la presencia o la cantidad de un análito en una muestra de ensayo, uniendo un miembro específico de unión directa o indirectamente a la nueva enzima. Los reactivos indicadores resultantes son adecuados para uso en los formatos de ensayo que incluyen, pero no están limitados a, ensayos en sándwich, ensayos competitivos y formatos de ensayos directos e indirectos.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1(a)-(c) muestran los oligonucleótidos sintéticos usados para construir el gen de la fosfatasa alcalina.

La figura 2 muestra el mapa de restricción del plásmido pMA100.

Las figuras 3(a)-(b) muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las fosfatasas alcalinas sintética y natural de E. coli.

La figura 4 muestra los resultados de un ensayo de unión para la detección de la \alpha-fetoproteína, usando un reactivo indicador de referencia del documento EP-A-0441252.

La figura 5 muestra los resultados de un ensayo de unión para la detección de un antígeno canceroso, usando un reactivo indicador de referencia del documento EP-A-0441252.

La figura 6 muestra la cinética de la inactivación térmica irreversible de los conjugados que contienen fosfatasa alcalina intestinal de ternera y fosfatasa alcalina mutante de E. coli del documento EP-A-0441252.

La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos del plásmido sintético pWM520.

Se usan los siguientes símbolos y abreviaturas para representar los códigos de bases y los aminoácidos:

Códigos de bases

Símbolo	Nucleótido
A	Adenosina
C	Citosina
G	Guanina
T	Timina

Abreviaturas de tres letras de los aminoácidos

Abreviatura	Nombre del	Abreviatura	Nombre del
	aminoácido		aminoácido
Ala	Alanina	Leu	Leucina
Arg	Arginina	Lys	Lisina
Asn	Asparagina	Met	Metionina
Asp	Ácido aspártico	Phe	Fenilalanina
	(aspartato)
Cys	Cisteína	Pro	Prolina
Gln	Glutamina	Ser	Serina
Glu	Ácido glutámico	Thr	Treonina
	(glutamato)
Gly	Glicina	Trp	Triptófano
His	Histidina	Tyr	Tirosina
Ile	Isoleucina	Val	Valina

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una enzima fosfatasa alcalina que tiene una actividad específica aumentada, mientras se conserva la deseable estabilidad térmica característica de la enzima natural. La enzima de la presente invención es un mutante de una enzima fosfatasa alcalina producida por Escherichia coli, en la que dicho mutante de la fosfatasa alcalina tiene una mutación en un aminoácido comparada con la fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli que consiste en el cambio de Gly en lugar de Asp^{153}. Con el fin de entender y llevar a cabo la invención, se incluyen también descripciones que se refieren a las enzimas genéticamente modificadas mencionadas anteriormente del documento EP-A-0441252, y que se incluyen en la presente memoria más adelante como ejemplos de referencia (véase tabla 1).

Las enzimas genéticamente modificadas son más estables desde el punto de vista térmico que la fosfatasa alcalina intestinal de ternera, mostrando una semivida mínima de cinco minutos a 75ºC (pH 7,5). Además, dependiendo de las condiciones del ensayo, la actividad enzimática de las enzimas ha sido aumentada de 1,5 a 36 veces con respecto a la mostrada por la enzima natural. El mayor aumento en la actividad específica se observa cuando las actividades enzimáticas se miden en presencia de concentraciones bajas de o bien Tris (0,05 M) o bien dietanolamina (0,05 M). La actividad específica aumentada se ha logrado por medio de una combinación de modelado molecular, ingeniería genética y mutagénesis dirigida.

Típicamente, los sitios diana de las mutaciones en la fosfatasa alcalina se predeterminaron en base a la estructura cristalina de la enzima (Sowadski y col., J. Mol. Biol., volumen 186, págs. 417-433 (1985). El criterio para la selección de un aminoácido dado como sitio diana fue la proximidad del aminoácido al sitio activo de la molécula enzimática, en particular su proximidad al residuo catalítico, Ser^{102}.

Para producir un cambio de un aminoácido definido en un sitio dado de la enzima, se insertó la secuencia de un codón apropiado que codifica ese aminoácido en el gen phoA. También se realizaron cambios aleatorios de aminoácidos insertando la secuencia del codón NNN en la secuencia de ADN, en la que N es cualquiera de los cuatro nucleótidos. Uno de los mutantes construidos portaba fortuitamente dos mutaciones puntuales, es decir, dos cambios de aminoácidos, que se cree que fue un resultado de la modificación química de los oligonucleótidos sintéticos usados en la síntesis génica.

Construcción de los plásmidos

Una vez que se obtuvo el conjunto inicial de moléculas de ADN adecuadamente mutadas, se usaron dos estrategias de diseño de proteínas para producir las enzimas mutantes. Primero, se introdujeron diferentes subsecuencias de ADN modificado en un gen único y se seleccionaron los clones resultantes en base a la producción de enzimas mutantes que tenían una actividad específica alta. Segundo, se usó una molécula de ADN mutante como fondo genético en una segunda vuelta de mutagénesis.

La primera estrategia implica el diseño y la construcción de un gen totalmente sintético que codifica la fosfatasa alcalina. El gen phoA sintético fue sintetizado usando el método FokI tal como se describe en Mandecki y Bolling, Gene, volumen 68, páginas 101-107 (1988).

Se diseñaron y se clonaron individualmente en un vector plasmídico diseñado habitual (pWM500) veintiún oligonucleótidos sintéticos [figuras 1(a)- (c)]. Seguidamente, cada oligonucleótido sintético se extrajo del vector usando la endonucleasa de restricción FokI. Los fragmentos de ADN resultantes se diseñaron de tal forma que, después del corte del vector, los extremos protuberantes de cada fragmento tenían secuencias únicas que permitían la ligación de todos los 21 fragmentos en una reacción para producir un gen phoA sintético de aproximadamente 1600 pares de bases.

El gen sintético incluía el sitio de unión a ribosoma de phoA para el inicio de la traducción (el mecanismo por el cual la secuencia de bases de un gen se traduce en una secuencia de aminoácidos de una cadena de polipéptido) así como la secuencia del sitio de terminación de la transcripción (en la que se termina la síntesis de la cadena de ARNm complementario del gen). El gen sintético se clonó en un vector plasmídico sintético, pWM518, cuya construcción se describe más adelante (ejemplo 11). El vector se diseñó para tener un número limitado de sitios de restricción para facilitar los procedimientos tales como la clonación, expresión y mutagénesis. Los niveles de expresión de la fosfatasa alcalina a partir del plásmido que llevaba el gen phoA sintético (pMA100) se acercaban a 10 mg de proteína por litro de células crecidas hasta una densidad óptica de 1,5 a 550 nm. Se usó en la transformación una cepa de E. coli deficiente en el gen cromosómico de la fosfatasa alcalina y en la fermentación subsecuente para producir las enzimas descritas en la presente memoria. Tal cepa incluye la cepa de E. coli MZ13b (F- lacX74, \Delta(brnQ^{R}, phoA-, phoB-, proC-)_{24} tsxR, trp_{am}, str^{R}, F80D (proC+, proB+)_{xpw3}, F80) que se describe en Inouye y col., J. Mol. Biol., volumen 110, páginas 75-87 (1977), que se incorpora como referencia en la presente memoria.

Se usó un ensayo biológico para seleccionar los organismos mutantes de E. coli resultantes para determinar que clones producían una fosfatasa alcalina que tenía una actividad específica aumentada. Los clones se crecieron en medios que contenían el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato (BCIP). Las colonias que producían una fosfatasa alcalina que tenía una actividad específica alta se detectaron por la aparición de un color azul alrededor de las colonias debido a la reacción de la enzima con el sustrato.

Los niveles altos de expresión de fosfatasa alcalina por las células hospedadoras fueron perjudiciales para la selección por color de las colonias en las placas indicadoras (los pequeños aumentos en el nivel de expresión no se manifestaban en sí mismos como cambios de color hacia un azul más intenso). Por tanto, para ayudar a distinguir las enzimas mutantes de las enzimas similares a las naturales, se redujeron los niveles de expresión de la fosfatasa alcalina de los plásmidos remplazando el sitio de unión a ribosoma del lacZ natural con una secuencia que era homóloga al sitio de unión a ribosoma natural pero que era menos eficaz en la iniciación de la traducción. El plásmido resultante se designó pMA101. El gen phoA incluye un grupo de cinco nucleótidos aleatorios cadena arriba del codón iniciador ATG. Como resultado, la expresión de la enzima se redujo sustancialmente y sólo una enzima mutante con una alta actividad específica mostraría el color azul oscuro con el sustrato BCIP. Se generó una genoteca de clones que contenía aproximadamente 1000 clones que expresaban diferentes niveles de la actividad fosfatasa alcalina. Se seleccionó un clon (pMA101) que expresaba una actividad fosfatasa alcalina apropiada para la selección por color para los estudios adicionales de mutagénesis.

Mutagénesis dirigida

Se usó un método de reparación de roturas de la doble cadena dirigida por oligonucleótidos (es decir, mutagénesis en puente) para construir un vector plasmídico sintético tal como se describe en Mandecki y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volumen 83, páginas 7177-7181 (1986). Sin embargo, el uso de este método en particular no es crítico para la presente invención. El método implica la introducción de mutaciones mediante la cotransformación de células de E. coli competentes con un plásmido lineal desnaturalizado y una secuencia de un oligonucleótido sintético que codifica una mutación adecuada y que tiene dos "brazos" que son homólogos a las secuencias de ADN plasmídicas de la vecindad del punto de rotura del plásmido. Como sólo se usa para la mutagénesis una secuencia de oligonucleótido de cadena única, el método es especialmente ventajoso para la introducción de secuencias degeneradas en el ADN plasmídico.

En el procedimiento, una subsecuencia de un oligonucleótido sintético, que codifica una mutación en una subsecuencia del gen de la fosfatasa alcalina, se clona en el gen phoA del vector plasmídico para modificar más bien que reemplazar el gen phoA. Las subsecuencias del oligonucleótido sintético se diseñaron para llevar en el sitio diana o bien una secuencia codón definida o una aleatoria que correspondía típicamente a una cadena de 20 aminoácidos. Para introducir una subsecuencia, el plásmido de E. coli que contenía el gen phoA se cortó o bien al lado del sitio diana para la mutagénesis (es decir, se cortó con una endonucleasa de restricción que cortaba al plásmido sólo una vez, habiendo 25 de tales sitios dentro del gen phoA), o bien el plásmido se cortaba con dos enzimas para liberar un fragmento de restricción que solapaba con el sitio a ser mutado. Las células hospedadoras se transformaron combinando las células con el plásmido cortado, el oligonucleótido sintético y la ADN ligasa. Se obtenían 200 colonias de una transformación única.

Basándose en la selección por color, que se siguió de secuenciación de ADN y análisis de la proteína purificada, se obtuvieron 10 mutantes de cepas de E. coli que llevaban genes que expresaban una fosfatasa alcalina que tenía una actividad específica aumentada. Los mutantes fueron: Thr^{100} > Val (es decir, la treonina de la posición 100 se reemplazó por valina); Thr^{100} > Ile; Lys^{328} > Arg; Va^{199} > Ala; Asp^{101} > Ser; Ala^{103} > Asp; Ala^{103} > Cys; Thr^{107} > Val; un doble mutante Lys^{328} > Arg y Va^{199} > Ala; y un doble mutante fortuito ValV^{377} > Ala y Ser^{415} > Gly.

Se pueden usar métodos alternativos para preparar vehículos de clonación plasmídicos que incluyen tales mutaciones genéticas, tales como los descritos por Polisky y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volumen 73 (11), páginas 3900- 3904 (1976); la patente de Estados Unidos Nº 4.375.514 y la patente de Estados Unidos Nº 4.704.362.

Análisis de los mutantes de fosfatasa alcalina

Los análisis de la actividad específica y de la estabilidad térmica se realizaron con material proteínico altamente purificado. Brevemente, el procedimiento de purificación implica la liberación de la proteína periplásmica mediante la formación de esferoplastos, la precipitación con sulfato amónico y la cromatografía por enfoque cromatográfico. Las medidas de la actividad específica y de la constante de Michaelis contaron con el control de la cinética de la conversión de un sustrato de la enzima (por ejemplo, p-nitrofenilfosfato) para formar un producto cromogénico. La estabilidad térmica se midió controlando la caída de la actividad enzimática a diferentes temperaturas.

Las enzimas resultantes y sus propiedades se presentan en la tabla 1. Todo los mutantes de las cepas de E. coli expresaban enzimas de fosfatasa alcalina que tenían actividades específicas mayores que la de la enzima natural (representada por pMA100). Aunque cada una de las enzimas mutantes fue menos estable a la temperatura que la enzima natural, todas fueron significativamente más estables a la temperatura que la enzima de mamífero, fosfatasa alcalina intestinal de ternera.

TABLA 1 Mutantes construidos*

plásmido	Mutación	Actividad	Km	Estabilidad térmica
		específica	(\muM)	(semivida)
		(\mumoles/mg
		min)
pMA100	Natural	60	30	6 min a 95ºC
pMA110	Val^{377} > Ala	90	23	7 min a 80ºC
	Ser^{415} > Gly
pMA111	Thr^{100} > Val	123	20	21 min a 85ºC
pMA112	Thr^{100} > Ile	123	20	10 min a 85ºC
pMA113	Lys^{328} > Arg	220	94	10 min a 85ºC
pMA114	Val^{99} > Ala	205	22	15 min a 80ºC
				3 min a 85ºC
pMA115	Asp^{101} > Ser	290	56	14 min a 80ºC
				2 min a 85ºC
pMA116	Lys^{328} > Arg	190	74	5 min a 75ºC
	Val^{99} > Ala			<1 min a 85ºC
pMA117	Ala^{103} > Asp	133	144	22 min a 85ºC
pMA118	Ala^{103} > Cys	105	75	29 min a 85ºC
pMA119	Thr^{107} > Val	240	102	7 min a 85ºC
Fosfatasa alcalina intestinal de ternera	1800	10	9 min a 65ºC
*descritos en el documento EP-A-0441252

\newpage

Ensayos de unión usando marcas de fosfatasa alcalina

Antes de seguir más adelante con la descripción del uso de la fosfatasa alcalina como marca en ensayos de unión, se definirán diversos términos. También se describe una diversidad de técnicas de ensayos en los que las nuevas marcas se usan de una forma ventajosa.

"Miembro específico de unión" se refiere a un miembro de un par de unión específico, es decir, dos moléculas diferentes en las que una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula por medios químicos o físicos. Además de los pares de unión específicos de antígeno y anticuerpo, se incluyen otros pares de unión específicos, de acuerdo con los ejemplos sin limitación, biotina y avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias (como en las reacciones de hibridación de ADN), secuencias de péptidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores enzimáticos y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas, una secuencia de péptidos y un anticuerpo específico para la secuencia o la proteína entera, ácidos poliméricos y bases, colorantes y proteínas ligantes, péptidos y proteínas ligantes específicas (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y proteína de la ribonucleasa S) y similares. Además, los pares de unión específicos pueden incluir miembros que son análogos del miembro específico de unión original como por ejemplo un análogo del análito. Si el miembro específico de unión es un inmunoreactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antígeno, hapteno o complejo de los mismos y si se usa un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante, una mezcla de dos o más anticuerpos, un fragmento de anticuerpo o mezclas de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros específicos de unión. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos y su adecuación para uso como miembros específicos de unión son bien conocidos por los expertos en la técnica.

"Análito" se refiere al compuesto o composición a ser detectado o medido en el ensayo. El análito puede ser cualquier sustancia para la que existe un miembro específico de unión al análito que se presenta naturalmente o para la que se puede preparar un miembro específico de unión al análito. Los análitos incluyen, pero no están limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptido, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (que incluyen aquellos administrados con fines terapéuticos así como aquellos administrados con fines ilícitos) y metabolitos o anticuerpos de cualquiera de las sustancias anteriores. El término "análito" también incluye cualquier sustancia antigénica, haptenos, anticuerpos y combinaciones de los mismos que son de interés en los inmunoensayos. Los reactivos y métodos de la presente invención también pueden diseñarse para determinar productos alimentarios y análitos ambientales de interés.

"Reactivo indicador" se refiere a un miembro específico de unión unido a una marca. El reactivo indicador produce una señal detectable que se relaciona con la cantidad de análito de la muestra de ensayo. En general, el reactivo indicador se detecta o se mide después de ser inmovilizado sobre un material en fase sólida, pero también se puede detectar o medir el reactivo indicador libre o no unido para determinar el resultado de un ensayo. El miembro específico de unión del reactivo indicador puede ser un miembro de cualquier par específico de unión como se describió anteriormente. En la presente invención, el componente marcador del reactivo indicador es una fosfatasa alcalina sintética que tiene una actividad específica aumentada. La enzima marcadora se usa para convertir un sustrato enzimático en un producto detectable. El producto puede detectarse por medios visuales o instrumentales. También se puede obtener la amplificación de la señal detectable haciendo reaccionar la enzima con uno o más sustratos o enzimas adicionales para producir un producto detectable de la reacción.

"Miembro de unión de captura" se refiere a un miembro específico de unión que puede unirse directa o indirectamente al análito o al reactivo indicador y que típicamente se une o es capaz de unirse a una fase sólida, mediante mecanismos covalentes, no covalentes, adsorción o no específicos, o es capaz de precipitar de tal forma que el miembro de unión de captura puede separarse de la muestra de ensayo y de otros reactivos del ensayo.

"Reactivo de captura" se refiere a un miembro de unión de captura que se une directa o indirectamente a un material en fase sólida para permitir la separación del miembro de unión de captura y del análito o del reactivo indicador que está unido al mismo, del análito no unido y los reactivos del ensayo. Típicamente, la unión del miembro de unión de captura a la fase sólida es sustancialmente irreversible y puede incluir mecanismos covalentes. Sin embargo, el reactivo de captura de la presente invención, no está limitado a un miembro de unión de captura unido a un material en fase sólida insoluble. En un ensayo de aglutinación, el reactivo de captura puede incluir un miembro de unión de captura unido a un vehículo soluble tal como seroalbúmina bovina y similares.

"Material en fase sólida" se refiere a cualquier material cromatográfico, absorbente, poroso o capilar u otro material sólido convencional, bien conocidos por los expertos en la técnica, usado para inmovilizar a los miembros específicos de unión. En la presente invención, el material en fase sólida puede incluir una capa de fibra de vidrio, celulosa o nailon en un dispositivo de ensayo en flujo que tiene una o más capas conteniendo uno o más de los reactivos de ensayo; una varilla para ensayos de mojar y leer; una tira reactiva para técnicas cromatográficas (por ejemplo, fibra de papel o de vidrio) o de capa fina (por ejemplo, nitrocelulosa) en las que uno o todos los reactivos están contenidos en zonas separadas de una tira reactiva única de material en fase sólida; o un material absorbente bien conocido por aquellos expertos en la técnica. El material de la fase sólida también puede incluir, sin limitación, perlas de poliacrilamida, perlas o tubos de poliestireno, perlas magnéticas, una placa de microtitulación o tubos de ensayo de vidrio o de plástico.

Las sustancias naturales, sintéticas o que se presentan naturalmente y se modifican sintéticamente pueden usarse como material de la fase sólida, incluyendo polisacáridos, por ejemplo, material de celulosa tal como papel y derivados de la celulosa tales como diazobenciloximetilcelulosa, nitrocelulosa, 2-aminofeniltioetercelulosa y acetato de celulosa; sílice; partículas de silicio; sustancias inorgánicas tales como alúmina desactivada u otra sustancia inorgánica finamente dividida y uniformemente dispersada en una matriz polimérica porosa, con polímeros tales como cloruro de vinilo, polímeros de cloruro de vinilo con propileno y polímeros de cloruro de vinilo con acetato de vinilo; material textil, tanto el que se presenta naturalmente (por ejemplo, algodón) como el sintético (por ejemplo, nailon); geles porosos tales como el gel de sílice, agarosa, dextrano y gelatina; películas poliméricas tales como poliacrilatos; membranas de unión de proteína y similares. El material de la fase sólida debe tener una resistencia razonable o la resistencia puede proporcionarse por medio de un soporte que no debe interferir con la producción de una señal detectable.

Opcionalmente, el miembro de unión de captura del reactivo de captura puede fijarse a partículas, por ejemplo, micropartículas. Estas micropartículas pueden servir como material de la fase sólida y ser retenidas en una columna, suspendidas en una mezcla de los reactivos solubles y la muestra de ensayo o retenidas e inmovilizadas mediante otro material base de la fase sólida. "Retenido e inmovilizado" significa que las micropartículas, asociadas con el material base de la fase sólida, no son capaces de moverse sustancialmente a otras posiciones dentro de ese material. Las micropartículas pueden ser seleccionadas por un experto en la técnica a partir de cualquier tipo de material particulado adecuado, incluyendo aquellos compuestos de poliestireno, polimetilacrilato, polipropileno, politetrafluoroetileno, poliacrilonitrilo, policarbonato o sustancias similares. El tamaño de las micropartículas no es crítico, aunque se prefiere que el diámetro medio sea menor que el tamaño de poro medio del material base de la fase sólida si éste se usa.

La presente invención también incluye un reactivo de captura que implica un miembro de unión de captura que inicialmente no está unido al material de la fase sólida. Una vez que sucede la formación del complejo entre los componentes del ensayo, la fase sólida puede usarse como mecanismo de separación. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede ponerse en contacto con el material de la fase sólida y el complejo o complejos nuevos formados en la reacción son retenidos por el material de la fase sólida. Se pueden usar métodos alternativos para realizar esta etapa de separación, tales como el uso de una fase sólida que se una por sí misma al miembro de unión de captura; fijación de un miembro de unión que es específico del miembro de unión de captura a la fase sólida; o fijación de un agente, tal como una sustancia cargada, a la fase sólida, el cual atraerá y unirá una sustancia cargada opuesta que se haya unido al miembro de unión de captura.

"Miembro específico de unión auxiliar" se refiere a un miembro específico de unión usado junto con los miembros específicos de unión del miembro de unión de captura y del reactivo indicador que se convierte en parte del complejo de unión detectable. Se pueden usar en un ensayo uno o más miembros específicos de unión auxiliares. Por ejemplo, se puede usar un miembro específico de unión auxiliar en un ensayo en el que el reactivo indicador es capaz de unirse al miembro específico de unión auxiliar que a su vez es capaz de unirse al análito.

"Muestra de ensayo" se refiere típicamente a un medio líquido de ensayo que se presenta naturalmente o se forma artificialmente y que se sospecha que contiene el análito de interés. La muestra de ensayo es generalmente un fluido biológico o una dilución del mismo. Los fluidos biológicos a partir de los que se puede determinar un análito incluyen suero, sangre completa, plasma, orina, saliva, fluidos amnióticos y cerebroespinales y similares. La muestra de ensayo también puede incluir un material sólido (por ejemplo, pelo, tejido, etc.) que ha sido modificado para formar un medio líquido de ensayo.

Los expertos en la técnica apreciarán que la selección de cualquier miembro de unión dado, miembro de unión auxiliar o material de la fase sólida, generalmente, no es crítica para la presente invención. Las sustancias se elegirán para optimizar los resultados del ensayo para un análito o muestra de ensayo dados.

Las nuevas enzimas de la presente invención se usan ventajosamente en ensayos de unión homogéneos, incluyendo los formatos de ensayos de unión competitiva y en ensayos de unión heterogéneos, incluyendo tanto los formatos de ensayos en sándwich como los de unión competitiva. Las técnicas de ensayos de unión heterogéneos implican el uso de un material en fase sólida al que se une un miembro de la reacción de unión. Antes de detectar la marca que indica la presencia o la cantidad del análito en la muestra de ensayo, el componente de la reacción inmovilizado se separa del exceso de la muestra y de los reactivos del ensayo eliminando la fase sólida de la mezcla de reacción.

En un ensayo en sándwich con fase sólida, el reactivo de captura implica típicamente un miembro de unión de captura que se ha unido al material de la fase sólida. Por ejemplo, el miembro específico de unión puede ser un anticuerpo inmovilizado que se unirá a un análito-antígeno de la muestra de ensayo o el miembro específico de unión puede ser un antígeno inmovilizado que se unirá al análito-anticuerpo de la muestra de ensayo. El reactivo de captura se pone en contacto con una muestra de ensayo, que se sospecha que contiene el análito, y con un reactivo indicador que comprende un segundo miembro específico de unión que ha sido marcado; por ejemplo, un anticuerpo anti-análito marcado. Los reactivos pueden mezclarse simultáneamente o añadirse secuencialmente o bien separadamente o en combinación. La reacción de unión da como resultado la formación de un complejo: reactivo de captura / análito / reactivo indicador. El ensayo también puede comprender la etapa de separación del complejo resultante del exceso de reactivos y de la muestra de ensayo. El complejo retenido en el material de la fase sólida se detecta examinando el reactivo indicador de la fase sólida. Si el análito está presente en la muestra entonces la marca estará presente sobre el material de la fase sólida. La cantidad de marca que se asocia con la fase sólida es directamente proporcional a la cantidad del análito de la muestra.

Los ensayos de la presente invención pueden llevarse a cabo usando cualquier formato de ensayo en sándwich, incluyendo técnicas directas, inversas y simultáneas. Típicamente, un ensayo directo implica el contacto de la muestra de ensayo con el reactivo de captura durante un período de incubación que a su vez es seguido de la adición del reactivo indicador. Un ensayo inverso implica la adición del reactivo indicador a la muestra de ensayo seguido de la adición del reactivo de captura tras un período de incubación. Un ensayo simultáneo implica una única etapa de incubación en la que el reactivo de captura y el reactivo indicador se ponen ambos en contacto con la muestra de ensayo al mismo tiempo.

Además, las nuevas enzimas de la presente invención pueden usarse en un ensayo en sándwich indirecto con la formación de un complejo: reactivo de captura / análito / análito-miembro específico de unión / reactivo indicador. En este caso, el miembro específico de unión auxiliar es el análito-miembro específico de unión adicional.

Los ensayos competitivos también pueden llevarse a cabo usando las nuevas enzimas de la presente invención. En un ensayo competitivo en fase sólida, el reactivo de captura implica típicamente de nuevo un miembro de unión de captura que se ha fijado al material de la fase sólida y que se pone en contacto tanto con la muestra de ensayo como con el reactivo indicador. El reactivo indicador, sin embargo, puede formarse de un análito o de un análogo de un análito que ha sido conjugado con una marca. La reacción de unión tiene lugar y da como resultado la formación de los complejos: (1) complejo del reactivo de captura inmovilizado / análito y (2) complejo del reactivo de captura inmovilizado / reactivo indicador. Alternativamente, el miembro específico de unión inmovilizado puede ser una análito o un análogo de un análito con el que el análito de la muestra de ensayo compite por unirse con el reactivo indicador. En el ensayo competitivo, la cantidad de marca que se asocia con la fase sólida está inversamente relacionada con la cantidad del análito en la muestra. De este modo, una muestra de ensayo positiva generará un descenso de la señal.

En estos ensayos de unión, la presencia o la cantidad del análito en la muestra de ensayo se determina normalmente detectando la presencia o la cantidad de la marca que se ha asociado con la fase sólida, aunque el reactivo indicador libre o no unido también puede ser detectado. En el ensayo competitivo, cuanto más análito haya presente en la muestra de ensayo menor será la cantidad de marca presente en la fase sólida. En el ensayo en sándwich, cuanto más análito haya presente en la muestra mayor será la cantidad de marca presente en la fase sólida.

Como se describe específicamente en los siguientes ejemplos, varias de las enzimas recombinantes se acoplaron químicamente a diferentes inmunoglobulinas para formar conjugados para usar en los inmunoensayos enzimáticos (EIA). Por ejemplo, las enzimas mutantes expresadas por los plásmidos pMA110, pMA111, pMA112, pMA113 y pMA115 se conjugaron mediante diversos reactivos de acoplamiento heterobifuncionales a un anticuerpo monoclonal anti-\alpha-fetoproteína (anticuerpo anti-AFP). Subsecuentemente, estos conjugados anticuerpo / enzima se usaron en un EIA como reactivos indicadores. Por ejemplo, se preparó una curva patrón de AFP en un ensayo usando un anticuerpo anti-AFP conjugado con la enzima fosfatasa alcalina del plásmido mutante pMA113. El reactivo indicador enzima pMA113 / anticuerpo produjo una curva patrón que es comparable con la generada por un reactivo indicador enzima de mamífero / anticuerpo en condiciones de ensayo similares. Se conoce bien el uso de los reactivos de acoplamiento heterobifuncionales en la técnica y no hay ningún reactivo de acoplamiento heterobifuncional específico esencial para los nuevos reactivos indicadores de la presente invención, como se define en la reivindicación 6.

Las enzimas fosfatasa alcalina descritas en la presente memoria también se han acoplado químicamente a otras varias proteínas tales como el antígeno canceroso 125 y los anticuerpos anti-antígeno carcinoembrionario, un fragmento Fab 19-9 antigénico canceroso y un anticuerpo contra la gonadotropina coriónica humana. Todos se han usado con éxito en ensayos EIA automáticos en los que la presencia de la fosfatasa alcalina se detecta tras la adición de un sustrato enzimático para producir un producto detectable y, de este modo, indicar la presencia o la cantidad de un componente de la reacción. Están disponibles muchos sustratos de la fosfatasa alcalina para uso en los ensayos de unión que emplean marcas de fosfatasa alcalina. Los sustratos usados comúnmente son p- nitrofenilfosfato (pNPP), 5-cloro-4-bromo-3-indolilfosfato (XP) y metilumbeliferilfosfato (MUP). Los sustratos MUP y pNPP se usan frecuentemente en los inmunoensayos. Como una realización alternativa del ensayo de unión, el reactivo indicador puede comprender un miembro específico de unión marcado con un sustrato enzimático y la enzima fosfatasa alcalina se añade para producir la señal detectable.

La construcción y las propiedades del mutante de la invención se describen en el ejemplo 12. Los ejemplos 1-11 son ejemplos de referencia descritos en el documento EP-A-0441252.

Ejemplo 1 Preparación de los genes phoA naturales mutante y sintético a. Síntesis de los oligonucleótidos

Aunque no es esencial para la producción de las enzimas descritas en la presente memoria, se construyó un gen phoA sintético para facilitar la mutagénesis del gen de la fosfatasa alcalina y la expresión de este gen. La estructura del gen sintético se basó en la secuencia del gen natural de la fosfatasa alcalina de E. coli descrita en Chang y col., Gene 44, 121-125 (1986).

El gen se modificó con un codón de preferencia de E. coli y sitios de restricción únicos a intervalos de aproximadamente 50-100 pares de bases. Para construir el gen phoA se usó el método FokI de síntesis génica, como se describe en Mandecki y col., Gene, 68, 101-107 (1988).

La secuencia del gen phoA se dividió en 21 subsecuencias de oligonucleótidos, cada una de 73 bases de longitud. Se añadieron a cada subsecuencia 30 bases adicionales que corresponden a los brazos FokI para que solaparan e hibridaran en cada lado del sitio de corte con el ADN plasmídico cortado.

Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador Applied Biosystem 380B (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando 5'-dimetoxitritilnucleósido \beta-cianoetilfosforamiditos. Los oligonucleótidos se purificaron usando electroforesis en gel (descrita también en Gene, 68, 101-107,1988) en geles de poliacrilamida 10% (poliacrilamida 10%, urea 7,0 M y TBE 1 x [Tris-borato 89 mM, ácido bórico 89 mM, ácido etilendiamintetracético (EDTA) 2,0 mM]). El ADN se visualizó mediante sombreado UV y la banda correspondiente a la subsecuencia de 103 pares de bases se extrajo del gel. El oligonucleótido se eluyó de la porción de gel escindido con un mililitro de tampón de elución de Maxam (acetato amónico 0,5 M y EDTA 1 mM) a 37ºC durante 16 horas. Para eliminar la poliacrilamida residual, el oligonucleótido eluido se pasó a través de un filtro (filtro Centrex de 0,2 \mum; Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH). El oligonucleótido purificado se precipitó con cinco volúmenes de etanol, se resuspendió en agua (50 \mu1) y se cuantificó usando un espectrofotómetro Beckman DU-7 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Las secuencias de los oligonucleótidos sintéticos se presentan en las figuras 1(a)-(c).

b. Clonación del ADN

La clonación de los oligonucleótidos sintéticos en un vector plasmídico se realizó mediante el protocolo de mutagénesis en puente como se describió anteriormente. Los plásmidos elegidos para la clonación fueron pWM500 y pWM501, como se describió anteriormente.

Los vectores de clonación se cortaron con la endonucleasa de restricción SmaI. El plásmido cortado (aproximadamente 50 ng) se mezcló con una subsecuencia de oligonucleótidos (20 pmoles) en 30 microlitros de tampón de desnaturalización (KCl 10 mM, Tris-HCl 5 mM pH 8,0, MgSO^{4} 5 mM y ditiotreitol 0,5 mM). Las muestras se calentaron a 100ºC durante tres minutos en un baño de agua hirviendo y, seguidamente, se dejó que se enfriaran hasta temperatura ambiente durante cinco minutos. Seguidamente, las muestras se mezclaron con células hospedadoras JM83 competentes frías (100 \mul: ara, \Delta[lac-proAB], strA, thi, F80d, lacZ\DeltaM15) como se describe en Vieira y col., Gene, volumen 19, páginas 259-268 (1982). Las células JM83 se prepararon mediante el procedimiento del CaCl2 como se describe por Mandel y col., en J. Mol. Biol., volumen 53, páginas 159-162 (1970).

La mezcla se enfrió en hielo durante cinco minutos, siguiéndose de un choque térmico de tres minutos a 37ºC. A la mezcla de transformación se le añadieron aproximadamente dos mililitros de medio de caldo de Luria (LB) (conteniendo por litro: bacto-triptona 10 g; extracto de bacto-levadura 5 g y NaCl 10 g; a pH 7,5) y la mezcla se incubó a 37ºC durante una hora. Seguidamente, las células transformadas se concentraron mediante centrifugación en una centrifugadora de mesa Sorvall GLC-2B (a 4000 rpm durante cinco minutos). Las células se resuspendieron en medio LB (100 \mul) y se sembraron en placas de LB que contenían 5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactósido (1,6 mg) y ampicilina (medio LB / ampicilina; 100 \mul a 25 mg / ml) para seleccionar las colonias con resistencia a la ampicilina, es decir, células bacterianas que contienen el plásmido. Las placas se incubaron a 37ºC durante 15 horas y los transformantes se calificaron mediante el ensayo por color de la \beta-galactosidasa.

Se picaron cuatro colonias individuales de células de cada uno de los 21 oligonucleótidos clonados. Las colonias únicas se inocularon en medio LB (0,5 ml) que contenía ampicilina (100 \mug / ml). Los cultivos se crecieron a 37ºC con agitación constante durante cinco horas. Seguidamente, veintiún cultivos individuales de células (es decir, un cultivo por cada subsecuencia de oligonucleótidos) se mezclaron y se añadieron a un litro de medio LB que contenía ampicilina y se crecieron durante 2,5 horas hasta una densidad óptica de 0,65 a 600 nm. Se hicieron cuatro cultivos separados de las subsecuencias mezcladas en un intento de evitar los subclones que contienen mutaciones adicionales que pueden surgir durante la síntesis de las subsecuencias de oligonucleótidos. Los cultivos se amplificaron con cloranfenicol (concentración final 25 mM) y se incubaron a 37ºC durante 16 horas como se describe en Frenkel y col., DNA, volumen 5, páginas 539-544 (1986).

c. Construcción de los insertos de fragmentos de ADN

Las células transformadas se recogieron mediante centrifugación (10.000 x g durante cinco minutos a 4ºC). Las células se lisaron y el ADN plasmídico se purificó en un gradiente de cloruro de cesio como se describe en Birnboim y col., Nucleic Acids Research, volumen 7, página 1513 (1979).

El plásmido de ADN purificado de las cuatro preparaciones mezcladas se digirió con FokI para obtener insertos de fragmentos de ADN. Se digirieron aproximadamente 250 microgramos de ADN plasmídico de las subsecuencias mezcladas con 200 unidades de FokI en 500 microlitros de una solución tamponada (KCl 20 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5 y MgCl_{2} 10 mM) durante 2,5 horas a 37ºC. Las digestiones se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida 6% y se escindió el fragmento correspondiente a una subsecuencia de oligonucleótido de 73 pares de bases. La elución del fragmento se realizó sustancialmente de acuerdo con el procedimiento usado en la purificación del oligonucleótido como se describió anteriormente en el ejemplo 1.a.

Los fragmentos FokI purificados se resuspendieron en agua (15 \mul). Una parte alícuota (0,5 \mul) de cada una de las cuatro muestras se sometió a electroforesis en un gel de agarosa 0,8% para determinar la concentración aproximada de ADN que se produjo. Basándose en las cuantificaciones estimadas, se obtuvieron 4,5 microgramos de fragmentos FokI mezclados de cada muestra.

d. Cepas de E. coli mutantes

Para producir una proteína fosfatasa alcalina funcional de alta expresión, los 21 insertos de fragmentos se ligaron con el plásmido sintético, pWM518. En este sistema de expresión, el gen phoA sintético se encuentra controlado por el promotor de la lactosa y por el sitio de unión a ribosoma del gen phoA natural. Se usaron 50 ng de cada fragmento para la ligación con 150 ng del vector cortado con BamHI / HindIII.

Para asegurarse de la obtención de un gen phoA sin mutaciones, designado pMA100, se combinaron partes alícuotas iguales de las cuatro preparaciones plasmídicas. El mapa de restricción del pMA100 se ilustra en la figura 2 y la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la fosfatasa alcalina de E. coli sintética y natural, que tiene sitios únicos de restricción, se ilustra en las figuras 3(a)-(b). La ligación de las subsecuencias de oligonucleótidos y el vector se realizó en una mezcla de ligación (10 \mul: Tris [pH 7,5] 60 mM; MgCl_{2} 5 mM; trifosfato de adenosina 0,4 mM y ditiotreitol 10 mM). Antes de la adición de la enzima ligasa (ADN ligasa T4), se incubaron las muestras a 42ºC durante 15 minutos y, seguidamente, se colocaron a 4ºC durante 1,5 horas. Después de la adición de la ligasa, las muestras se incubaron a 0ºC durante 16 horas. Se controló la conclusión de la reacción de ligación mediante análisis en gel de poliacrilamida 5% (1 / 50 bisacrilamida). La migración del material ligado reveló un fragmento de 3,5 kb que corresponde al gen phoA de longitud total en el pWM518, así como una escalera de fragmentos parcialmente ligados y no ligados. Seguidamente, se transformaron células hospedadoras SCS-1 (F-, recA1, gyrA96, thi, hsdR17, (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), supE44, relA1, I-: Stratagene, San Diego, CA) con la mezcla ligada. El procedimiento de transformación se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en Hanahan, J. Mol. Biol., volumen 166, páginas 557- 580 (1983). Las células SCS-1 (100 \mul) se descongelaron y se prepararon partes alícuotas en tubos de polipropileno precongelados (15 ml; Falcon 2059, Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Se añadió \beta-mercaptoetanol (1,4 M; 1,7 \mul) a las células, que fueron agitadas suavemente durante diez minutos a 0ºC. Se añadió un nanogramo de ADN plasmídico a las células para conseguir la eficacia de transformación más alta, es decir, el mayor número de células hospedadoras que contienen el plásmido replicado. Se estudiaron diferentes diluciones de la mezcla, como se presenta en la tabla 2. Las muestras se incubaron en hielo durante 30 minutos, se sometieron a un choque térmico en un baño de agua a 45ºC durante 45 segundos y se colocaron en el hielo durante dos minutos. Se añadió medio SOC (0,9 ml) y las muestras se incubaron (a 37ºC durante una hora mientras se agitaban a 225 rpm). El medio SOC contenía bacto-triptona 20 g, extracto de bacto-levadura 5 g, NaCl 10 mM y KCl 2,5 mM por litro, mezclado con una solución de Mg 2 M esterilizada por filtración [1 ml / 100 ml de SOC; MgCl_{2} 1 M con MgSO_{4} 1 M] y con una solución de glucosa 2 M esterilizada por filtración [1 ml / 100 ml de SOC]. Tras la incubación, las células se concentraron mediante centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos. El sedimento resultante se resuspendió en SOC (200 \mul) y se sembró en medio LB que contenía ampicilina (50 \mug / ml).

Las colonias que sintetizaban fosfatasa alcalina se identificaron por su color azul por medio del uso de BCIP y se resuspendieron en agua [100 \mul; 20 mg / ml]) que se añadió a cada placa. Las eficacias de transformación se enumeran en la tabla 2. También se transformaron células SCS-1 con el ADN plasmídico pUC9 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersberg, MD), un control usado de modo convencional, para la determinación cualitativa por comparación de las eficacias de transformación. La eficacia total de transformación de las células hospedadoras SCS-1 fue aproximadamente 2 x 10^{7} colonias / \mug de ADN pUC9. La eficacia tal como describe Stratagene es mayor de 1 x 10^{9} colonias / \mug de ADN.

TABLA 2 Eficacias de transformación

Muestras	Mezcla de ligación	Concentración de	Número de
	(1,0 \mul)	ADN	colonias
Muestra 1	Sin diluir	120,0 ng	3 azules, 362 blancas
Muestra 2	Dilución 1:10	12,0 ng	3 azules, 124 blancas
Muestra 3	Dilución 1:25	4,8 ng	0 azules, 53 blancas
Muestra 4	Dilución 1:50	2,4 ng	0 azules, 16 blancas
Vector cortado ligado	Sin diluir	15,0 ng	68 blancas
pUC9		1,0 ng	\sim 20.000 blancas

\newpage

Puesto que sólo seis transformantes (seis colonias azules) mostraron la presencia de un gen phoA sintético funcional, se repitió el protocolo de transformación para obtener más clones que analizar con la secuencia natural. Se picaron un total de 16 colonias de las células SCS-1 transformadas y el ADN plasmídico se aisló mediante el procedimiento de minipreparaciones descrito en Birnboim y col., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979). Se digirió una parte alícuota de cada una de las muestras con EcoRI y HindIII y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa 0,8% con marcadores de peso molecular (fragmentos de ADN / HindIII, fragmentos de ADN FX174 RF / HaeIII y una escalera de una kilobase de ADN; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). De las 16 muestras digeridas, parece que todas contenían un inserto de un fragmento de 1,4 kb que corresponde en tamaño con el gen de la fosfatasa alcalina de longitud completa.

Se picaron cuatro clones de las 16 muestras y el ADN plasmídico se aisló individualmente y se purificó en un gradiente de CsCl como se describe en Radloff y col., Proc. Natl. Acad. Sci., volumen 57, páginas 1514-1521 (1967).

Las muestras se secuenciaron mediante el método didesoxi de Sanger usando múltiples cebadores de secuenciación que solapaban, tal como se describe en Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., volumen 74, páginas 5463- 5467 (1977).

Las cuatro muestras contenían las mismas mutaciones; C a T en 1191, T a C en 1220 y A a G en 1333. La primera mutación fue silenciosa, pero los cambios que quedaban dieron como resultado las mutaciones de Val^{377} > Ala y Ser^{415} > Gly. El clon resultante se designó pMA110.

e. Preparación de una cepa de E. coli sintética y natural

Se usó un gen phoA natural (pMA100) como base para las modificaciones de ADN subsecuentes que codificaba una fosfatasa alcalina que tenía una actividad específica aumentada. Además, la fosfatasa alcalina de un organismo sintético y natural es útil para la evaluación de las enzimas mutantes así como para su comparación con la fosfatasa alcalina de E. coli comercialmente disponible. Para producir el gen phoA sintético y natural se necesitaban reparar las mutaciones genéticas que existían en el plásmido pMA110. Se usaron oligonucleótidos sintéticos, sustancialmente hechos de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1.a., para reemplazar las secuencias mutadas con las secuencias naturales. Debido a la posición de las mutaciones, se necesitaba reemplazar un fragmento BglII / SphI correspondiente a 246 pares de bases.

El plásmido pMA110 (10 \mug aproximadamente) se digirió con BglII (75 unidades) en tampón salino medio 1 x (100 \mul; NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y MgCl_{2} 10 mM) durante 16 horas a 37ºC. Para comprobar la digestión completa, se sometió a electroforesis una parte alícuota en un gel de agarosa 0,8%. La concentración salina se incrementó hasta NaCl 150 mM y el ADN se digirió adicionalmente con SphI (60 unidades) a 37ºC durante 16 horas. El fragmento plasmídico de 3,2 kb resultante se purificó en un gel de poliacrilamida 5% (1 / 50 bisacrilamida) y el ADN se extrajo sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en 1.a.

El fragmento escindido BglII / SphI mutante se reemplazó por tres oligonucleótidos sintéticos complementarios que correspondían a la secuencia natural del fragmento BglII / SphI (cada uno de aproximadamente 80 bases de longitud), que comprendía 247 pares de bases. Se fosforilaron aproximadamente 4 pmoles de cada oligonucleótido sintético usando ADN quinasa T4 (3,0 unidades; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) a 37ºC durante 30 minutos en tampón de ligación 1 x (15 \mul; Tris-HCl 60 mM pH 7,5; MgCl_{2} 5 mM, ATP 0,4 mM) tal como se describe en Richardson y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 2,815 (1971).

Los oligonucleótidos complementarios se hibridaron por medio de incubación a 70ºC durante cinco minutos y enfriamiento lento hasta 4ºC durante 1,5 horas. Seguidamente, los oligonucleótidos hibridados se ligaron con el plásmido sintético purificado de 3,2 kb. Los procedimientos de ligación, transformación e incubación se realizaron sustancialmente de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, con la excepción de que los plásmidos sintéticos resultantes se clonaron en las células hospedadoras MZ13b.

Se obtuvieron aproximadamente 200 colonias azules y 120 colonias blancas. Se seleccionaron cuatro colonias azules y se preparó el ADN de las minipreparaciones de acuerdo sustancialmente con los procedimientos descritos anteriormente. La región correspondiente a la subsecuencia de oligonucleótidos reemplazada o reparada se secuenció mediante el método didesoxi de Sanger de acuerdo sustancialmente con los procedimientos descritos anteriormente. Todos los clones secuenciados contenían la secuencia phoA natural. Comparando la intensidad del color de las colonias obtenidas de fosfatasa alcalina natural y mutante, las colonias mutantes tenían un color azul más oscuro que las colonias naturales.

Ejemplo 2 Expresión modificada de phoA natural para la selección de mutantes

La selección de alta sensibilidad por color de aquellos mutantes de fosfatasa alcalina que tienen una actividad específica aumentada fue difícil debido a la intensidad del color mostrada por la fosfatasa alcalina natural. Para distinguir los mutantes de la fosfatasa alcalina natural fue necesario disminuir la expresión del phoA natural (es decir, fue necesario obtener una colonia natural de color azul claro). Los niveles de expresión de fosfatasa alcalina se redujeron mediante reemplazamiento de la secuencia Shine-Delgarno (GGAGA) del phoA con una secuencia degenerada y selección de colonias de color azul tenue usando el sustrato BCIP.

Para eliminar el sitio de unión a ribosoma natural, el pMA100 (15 \mug, del ejemplo 1.e.) se digirió en tampón salino medio 1 x con 75 unidades de BamHI a 37ºC durante 16 horas. La concentración salina se incrementó hasta NaCl 150 mM y el ADN se digirió adicionalmente con 75 unidades de SalI a 37ºC durante 16 horas. El sitio de unión a ribosoma se reemplazó mediante mutagénesis en puente tal como se describió en el ejemplo 1, proporcionándose un oligonucleótido que llevaba una secuencia degenerada en la posición apropiada. Se obtuvieron aproximadamente 1000 clones, que expresaban diversos niveles de actividad fosfatasa alcalina.

Se aislaron tres colonias, que variaban desde un color azul muy claro a azul medio, y el ADN plasmídico se preparó sustancialmente de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1. Para determinar la estructura del sitio de unión a ribosoma mutado generado en cada muestra, se usó de nuevo la secuenciación didesoxi de Sanger sustancialmente de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1. Los resultados de la secuenciación muestran que los transformantes que se secuenciaron tenían o bien 1) una deleción total del sitio de unión a ribosoma o bien 2) un sitio de unión a ribosoma que tenía la secuencia ATGGC o CAATA. La muestra que correspondían al sitio de unión a ribosoma ATGGC mostraba el color azul más tenue y se le dio la designación pMA101. Seguidamente, se realizó mutagénesis adicional del gen phoA para incrementar la actividad específica y se analizó usando el vector plasmídico sintético pMA101 que contenía el phoA natural con un sitio de unión a ribosoma mutado.

Ejemplo 3 Mutagénesis que la fosfatasa alcalina natural

Para aumentar la actividad específica de la fosfatasa alcalina, la mutagénesis de la enzima se dirigió contra la región activa de la enzima o contra un área entre aproximadamente 10 \ring{A} y aproximadamente 20 \ring{A} del residuo catalítico Ser^{102}. Los aminoácidos diana para la mutagénesis fueron Val^{99}, Thr^{100}, Asp^{101}, Ala^{103}, Thr^{107} y Lys^{328}. Los aminoácidos Val^{99}, Thr^{100}, Asp^{101}, Ala^{103} y Thr^{107} tuvieron un interés particular para la mutagénesis debido a su proximidad al residuo catalítico Ser^{102}. También tuvo interés la Lys^{328}, que lleva una carga positiva y está en la vecindad inmediata del sitio activo de la enzima.

La mutagénesis de los aminoácidos Val^{99}, Thr^{100} y Asp^{101} se realizó mediante mutagénesis en puente en el sitio de restricción SnaBI del pMA101 y en el sitio de restricción ClaI para la Lys^{328}. Para la Ala^{103} y Thr^{107}, la mutagénesis en puente se realizó tras la digestión del plásmido pMA101 con SnaBI y EcoRV. Los oligonucleótidos sintéticos se hicieron como se describió en el ejemplo 1, en el que cada oligonucleótido sintético contenía una secuencia degenerada para el aminoácido a ser mutado.

El procedimiento estándar de mutagénesis en puente sufrió un aumento de escala de cinco veces para producir una genoteca de clones que contenían todas las posibles sustituciones de aminoácidos para cada residuo mutado. El vector pMA101 (250 ng, del ejemplo 2) se digirió completamente o bien con SnaBI (para las mutaciones en 99, 100 y 101), con ClaI (para la mutación en 328) o bien con SnaI y EcoRV (para las mutaciones en 103 y 107). Se mezclaron el vector digerido y uno de los oligonucleótidos sintéticos (100 pmoles) y se calentaron durante tres minutos a 100ºC. La muestra se enfrió durante cinco minutos y se añadió a células JM83 competentes (500 \mul). Las mezclas de transformación se incubaron en hielo durante cinco minutos y, seguidamente, se sometieron a choque térmico a 37ºC durante tres minutos. Se añadió medio LB (2,0 ml) a cada muestra y las muestras se incubaron a 37ºC durante 60 minutos. Las células se sedimentaron mediante centrifugación, se resuspendieron en medio LB (100 \mul) y se extendieron sobre placas LB (que contenían ampicilina 100 \mug / ml y BCIP 1,0 \mug / ml). Las placas se incubaron durante 16 horas a 37ºC. Debido a la expresión disminuida del phoA provocada por la mutación en el sitio de unión a ribosoma, las placas se incubaron durante seis horas adicionales a temperatura ambiente. Se calificaron como mutantes del phoA que tenían una actividad específica aumentada, las colonias con un color azul oscuro e intenso, comparando con el fondo.

Se seleccionaron colonias azules y se preparó el ADN de las minipreparaciones para la secuenciación didesoxi de Sanger de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Los resultados de la mutación se presentan en la tabla 3. Para obtener datos precisos acerca de la actividad específica de los mutantes, comparando con la fosfatasa alcalina natural, fue necesario obtener proteína purificada de cada muestra.

TABLA 3 Resultados de la mutagénesis

Aminoácido mutado	Número de colonias	Codones
pMA114	260 azules oscuras	GCA; GCT
Val^{99} > Ala	380 azules claras
	3680 blancas
pMA111 y 112	23 azules oscuras	GTA; ATC
Thr^{100} > Val	316 azules claras
Thr^{100} > Ile	76 blancas
pMA115	130 azules oscuras	TCA; TCC
Asp^{101} > Ser	260 azules claras
	4200 blancas
pMA113	11 azules oscuras	CGA; AGA; CGT
Lys^{328} > Arg	320 azules claras
	16 blancas
pMA116	270 azules oscuras	GCT
Lys^{328} > Arg	490 azules claras
Val^{99} > Ala	1340 blancas
pMA117 y 118	23 azules oscuras	GAT; TGT
Ala^{103} > Asp	141 azules claras
Ala^{103} > Cys	180 blancas
pMA119	15 azules oscuras	GTG
Thr^{107} > Val	87 azules claras
	166 blancas

La tabla 3 presenta las eficacias de transformación para aquellas mutaciones de aminoácidos que dan como resultado enzimas de fosfatasa alcalina mutantes que tienen una actividad específica aumentada. Las colonias azules oscuras representan a aquellos mutantes de fosfatasa alcalina que tienen una actividad específica aumentada, las colonias azules claras fueron mutantes con una actividad específica comparable a la fosfatasa alcalina natural y las colonias blancas fueron mutantes con una actividad específica disminuida. Puesto que el pMA113 (Lys^{328} > Arg) tuvo una actividad específica alta, se usó para la mutagénesis subsecuente, por ejemplo el pMA116 se produjo mediante cambio adicional de Val99 a Ala en el plásmido pMA113. Los codones obtenidos de cada sustitución de aminoácidos se determinaron mediante secuenciación didesoxi de Sanger.

Ejemplo 4 Purificación de la fosfatasa alcalina

Para determinar la cinética enzimática de las enzimas natural y mutante de fosfatasa alcalina, se debe tener cantidades suficientes de las enzimas. Se realizó para cada muestra, un procedimiento de fermentación en matraz con dos litros en agitación. El cultivo iniciador fue un cultivo de toda una noche de una colonia única en medio LB con ampicilina (40 ml) que contenía glucosa 20 mM. La adición de glucosa reprime la expresión de la fosfatasa alcalina del organismo que, en el sistema de expresión de la presente invención, se controla mediante el promotor lac (Magasanik B, The lactose Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 189-219,1970). El cultivo se creció en un matraz (250 ml) toda una noche a 37ºC con agitación vigorosa. El cultivo se centrifugó (4000 x g) durante diez minutos, se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en medio LB con ampicilina (40 ml). Un matraz de seis litros, que contenía dos litros de medio LB con ampicilina, se inoculó con el cultivo de toda una noche y se incubó durante aproximadamente seis horas a 37ºC con agitación vigorosa.

La purificación de la fosfatasa alcalina se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento siguiente. Tras alcanzar una densidad óptica de 1,3 a 1,4 a 600 nm, las células transformadas se recogieron mediante centrifugación (4800 rpm durante 20 minutos a 4ºC). Para extraer la fosfatasa alcalina, las células que derivaban de los dos litros de caldo de cultivo se resuspendieron en tampón frío Tris-HCl 0,15 M, pH 6,6 (80 ml; que contenía NaCl 0,9% y polimixina B 6 mg / ml) tal como se describe en Evans y col., Journal of Infectious Diseases, volumen 133, páginas S97-S102 (1976). Después de incubarlas durante siete a diez minutos en un baño de agua a 37ºC, se eliminaron las células mediante centrifugación (8000 x g durante cinco minutos a 4ºC).

El extracto con polimixina B se llevó a saturación del 85% mediante la adición lenta de sulfato amónico sólido a 4ºC y, seguidamente, se agitó lentamente durante 24 horas a 4ºC. El precipitado resultante se recogió mediante centrifugación (8000 x g durante cinco minutos a 4ºC) y se resuspendió en tampón Tris-HCl 0,02 M (pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1 mM). La diálisis de la muestra se llevó a cabo frente a 8 a 12 litros de tampón Tris-HCl 0,02 M (pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1 mM) a 4ºC. Subsecuentemente, las muestras se concentraron de 5 a 10 veces usando una célula de ultrafiltración (Amicon, Model 8050, Danvers, MA).

El enfoque cromatográfico de las fosfatasas alcalinas se realizó en un sistema de cromatografía líquida rápida (Pharmacia, Piscataway, NJ) usando una columna Mono P HR 5 / 5 y los poli-tampones 74 y 96 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). La columna se equilibró con bis-Tris-CH_{3}COOH 0,025 M (pH 6,9, que contenía MgCl_{2} 1 mM). La proteína se eluyó de la columna con una solución de poli-tampón-CH^{3}COOH (pH 5,5; que contenía poli-tampón 96 al 6% (vol. / vol.), poli-tampón 74 al 6% (vol. / vol.) y MgCl_{2} 1 mM). Estas condiciones proporcionaron un gradiente de pH lineal desde 6,5 a 5,5 en el que la proteína activa eluía a un pH entre 6,3 y 6,1.El poli-tampón se eliminó de las muestras mediante cromatografía de filtración en gel en Sephadex G-75 equilibrado con Tris 20 mM (pH 8,0, que contenía MgCl2 1 mM). Seguidamente, las muestras de enzima resultantes se concentraron de 3 a 6 veces usando microconcentradores Amicon Centricon-30.

Ejemplo 5 Análisis de la fosfatasa alcalina purificada

La caracterización de las proteínas purificadas incluyó la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico como se describe en Laemmli, U.K., Nature, volumen 277, página 680 (1970).

La electroforesis mostró una banda única principal que representaba más del 98% de la proteína total teñida y que correspondía a un peso molecular de 46.000 daltons, el tamaño esperado de un monómero de fosfatasa alcalina. La movilidad electroforética en estas condiciones de cada una de las fosfatasas alcalinas modificadas genéticamente fue idéntica a la de la fosfatasa alcalina de E. coli comercialmente disponible (Sigma).

Las constantes cinéticas (v_{max} y K_{m}) de las enzimas mutantes resultantes se midieron usando los sustratos enzimáticos pNPP (Sigma) y 4-metilumbeliferilfosfato (4-MUP; Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) en tampón Tris-HCl 1 M (pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1 mM) a 25ºC. La conversión del sustrato pNPP en p-nitrofenol se controló siguiendo el cambio de absorción a 410 nm (e = 1,62 x 10^{4} M^{-1} cm^{-1}), usando un espectrofotómetro Hewlett-Packard 9153A UV. La liberación de metilumbeliferona del sustrato 4-MUP se controló por fluorometría (excitación \lambda = 341 m; emisión \lambda = 465 nm; e = 5,9 x 10^{9} M^{-1} cm^{-1}). Las velocidades iniciales se determinaron gráficamente a partir del 5 al 10% inicial de la reacción (r > 0,997). Los valores de k_{cat} y K_{m} se obtuvieron de las representaciones de Lineweaver-Burk de seis a ocho puntos.

Los resultados obtenidos para cada enzima se recogen en la tabla 4. Todas las enzimas mutantes poseen una actividad específica mayor que la de la fosfatasa alcalina natural, usando como sustratos o bien pNPP o bien MUP. En las determinaciones hechas con pNPP, el incremento de la actividad específica de la enzima varía de 1,6 a 3,9 veces. El aumento más notable del valor K_{m} es para la enzima producida por el plásmido mutante pMA113, mientras que para el resto o no cambia relativamente o mejora levemente. De este modo, los mutantes poseen una actividad específica aumentada y aceptable y, si no, cambios beneficiosos en la K_{m}.

TABLA 4 Constantes cinéticas de las enzimas mutantes

	Sustrato pNPP	Sustrato 4-MUP
Fosfatasa alcalina	V_{max} (\mumol mg^{-1} min^{-1})	K_{m} (\muM)	V_{max} (\mumol mg^{-1} min^{-1})	K_{m} (\muM)
pMA100	56	30,1	106	9, ¿
natural
pMA110	90	23	182	14,4
Val^{377} > Ala
Ser^{415} > Gly
pMA111	123	19,8	190	10,1
Thr^{100} > Val

TABLA 4 (continuación)

	Sustrato pNPP	Sustrato 4-MUP
Fosfatasa alcalina	V_{max} (\mumol mg^{-1} min^{-1})	K_{m} (\muM)	V_{max} (\mumol mg^{-1} min^{-1})	K_{m} (\muM)
pMA112	133	20,2	229	10,2
Thr^{100} > Ile
pMA113	220	94,4	217	47,7
Lys^{328} > Arg

La estabilidad térmica de las enzimas se midió de acuerdo con el siguiente procedimiento. La cinética de inactivación térmica irreversible de cada fosfatasa alcalina se midió mediante incubación de una solución de la enzima (20 \mug / ml, preparada en Tris-HCl 0,02 M, pH 7,5 a la temperatura de calentamiento, que contenía MgCl_{2} 1 mM) en un bloque de calentamiento a temperatura constante y extrayendo periódicamente muestras para analizarlas a 25ºC. Las constantes de velocidad de primer orden y las semividas de la inactivación térmica irreversible se determinaron mediante regresión lineal en coordenadas semilogarítmicas, obteniéndose en todos los casos coeficientes de correlación de al menos 0,97. Ejemplos de las cinéticas de inactivación térmica irreversible de diversas fosfatasas alcalinas, a 85ºC y pH 7,5, se muestran una tabla 5.

TABLA 5 Cinéticas de inactivación térmica irreversible

Tiempo	Actividad residual %
(min)	pMA100	pMA111	pMA112
0	100	100	100
3	102	91	78
6	102	82	60
9	96	76	53
12	97	69	44
15	96	63	39

Los resultados de estudios similares para cada una de las enzimas mutantes se presentan en la tabla 6. Todas las enzimas mutantes sufrieron una inactivación térmica irreversible a una velocidad mayor que la de la fosfatasa alcalina natural. Sin embargo, la estabilidad térmica de las enzimas mutantes permaneció superior a la estabilidad térmica de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera que tenía una semivida de seis minutos a solamente 70ºC en condiciones de ensayo similares.

TABLA 6 Estabilidad térmica de las enzimas mutantes

Fosfatasa alcalina	Temperatura	Velocidad	Semivida
	(^{0}C)	(min^{-1})	(min)
pMA100	95	0,126	5,5
natural
pMA110	80	0,100	6,9
Val^{377} > Ala
Ser^{415} > Gly

TABLA 6 (continuación)

Fosfatasa alcalina	Temperatura	Velocidad	Semivida
	(^{0}C)	(min^{-1})	(min)
pMA111	85	0,031	22,6
Thr^{100} > Val
pMA112	85	0,062	11,1
Thr^{100} > Ile
pMA113	85	0,064	10,8
Lys^{328} > Arg
pMA114	80	0,040	17,3
Val^{99} > Ala
pMA115	80	0,051	13,6
Asp^{101} > Ser
pMA116	75	0,138	5,0
Gly^{328} > Arg
Val^{99} > Ala

Ejemplo 6 Efecto del pH en las constantes cinéticas de las fosfatasas alcalinas

Se determinaron los efectos del pH en las constantes cinéticas (K_{m} y V_{max}) de tanto la enzima mutante pMA115 (Asp^{101} > Ser) como la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Las medidas se hicieron a 25ºC usando como sustrato el 4-MUP. La liberación de metilumbeliferona del sustrato se controló siguiendo el aumento de absorción a 360 nm (los coeficientes de extinción se determinaron experimentalmente usando metilumbeliferona y se muestran en la tabla 7) usando un espectrofotómetro Hewlett-Packard 9153A UV. Se usaron tampones de baja fuerza iónica (I = 200) que contenían Tris 50 mM (pH 8-9,5) o dietanolamina 50 mM (Sigma) (pH 9-11) y NaCl (Sigma). Las velocidades iniciales se determinaron gráficamente a partir del 5 al 10% inicial de la reacción (r > 0,995). Los valores de vmax y Km se obtuvieron de las representaciones de Lineweaver-Burk de 6 a 7 puntos. La conversión de V_{max} en k_{cat} se realizó usando los pesos moleculares de 150.000 daltons y 94.000 daltons de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera y de la pMA115, respectivamente, así como usando dos sitios activos por dímero para ambas enzimas. Los resultados se muestran en la tabla 7.

TABLA 7 Efecto del pH en las constantes cinéticas de las fosfatasas alcalinas usando como sustrato el 4-MUP

		Fosfatasa alcalina
	Coeficiente	pMA115	Intestinal de ternera
	de extinción
pH	(M^{-1} cm^{-1})	K_{m}	V_{max}	K_{cat}	K_{m}	V_{max}	K_{cat}
		(\muM)	(\muM /min)	(s^{-1})	(\muM)	(\muM /min)	(s^{-1})
8,0	1,09 x 10^{4}	3,1	11,4	30	7,9	48,4	303
8,5	1,4 x 10^{4}	6,7	26,5	69	18,2	58,7	367
9,0	1,62 x 10^{4}	50,3	66,2	173	43,9	91,9	574
9,5	1,65 x 10^{4}	410	176	459	111	140	875

TABLA 7 (continuación)

		Fosfatasa alcalina
	Coeficiente	pMA115	Intestinal de ternera
	de extinción
pH	(M^{-1} cm^{-1})	K_{m}	V_{max}	K_{cat}	K_{m}	V_{max}	K_{cat}
		(\muM)	(\muM /min)	(s^{-1})	(\muM)	(\muM /min)	(s^{-1})
10,0	1,67 x 10^{4}	1660	262	684	348	181	1130
10,5	1,68 x 10^{4}	3520	284	741	4762	632	3950
11,0	1,69 x 10^{4}	3630	239	623	16.600	1116	6980

Los valores de K_{m} y k_{cat} aumentan con el pH en ambas enzimas a lo largo de casi todo el intervalo de pH estudiado. La diferencia más pequeña en la k_{cat} entre la fosfatasa alcalina mutante de E. coli y la fosfatasa alcalina intestinal de ternera se da a pH 10,0. A este pH, la enzima intestinal de ternera solamente es 1,65 veces más rápida que la enzima de E. coli mutante. Incluso con el aumento del valor K_{m} a pH 10,0, las nuevas enzimas son adecuadas para uso como marcas en ensayos. Se realizaron experimentos similares para estas enzimas, así como para la fosfatasa alcalina natural de E. coli (pMA100), usando como sustrato el pNPP. La conversión del sustrato pNPP en p-nitrofenol se controló siguiéndose el cambio en la absorción a 410 nm (e = 1,62 x 10^{4} M^{-1} cm^{-1}) usando el espectrofotómetro Hewlett-Packard 9153A UV. El efecto del pH en la k_{cat} de estas enzimas se muestra en la tabla 8. La k_{cat} de la enzima pMA115 fue cerca de 36 veces mayor que la de la fosfatasa alcalina natural de E. coli a pH 10,0.

TABLA 8 Efecto del pH en la k_{cat} de las fosfatasas alcalinas usando como sustrato el pNPP

	K_{cat} de las fosfatasas alcalinas
pH	pMA100	pMA115	Intestinal de ternera
8,0	8	35	345
8,5	10	78	480
9,0	12	154	760
9,5	13	255	1004
10,0	30	1068	2113
10,5	33	947	4675
11,0	28	927	7175

La tendencia observada con el pNPP es similar a aquella obtenida con el 4-MUP: la k_{cat} aumenta desde el pH 8 al 10 y la diferencia mínima en la k_{cat} entre las fosfatasas alcalinas pMA115 e intestinal de ternera se da a pH 10,0 (existe una diferencia de dos veces). Existe una gran diferencia entre la k_{cat} de la fosfatasa alcalina natural de E. coli (pMA100) y la fosfatasa alcalina intestinal de ternera a lo largo del intervalo de pH en el que, incluso a pH 10,0, hay una diferencia en la k_{cat} de 70 veces. Los datos demuestran claramente que la fosfatasa alcalina pMA115 es superior a la fosfatasa alcalina natural de E. coli porque, en comparación con la enzima intestinal de ternera, la diferencia en la k_{cat} a pH 10,0 se reduce de 70 veces a meramente dos veces.

Ejemplo 7 Uso de la fosfatasa alcalina mutante en un EIA en sándwich de la \alpha-feto proteína

Se preparó un anticuerpo anti-AFP marcado con una enzima, tratando primeramente la enzima mutante (fosfatasa alcalina del pMA113, preparada como se describió en el ejemplo 3) y el anticuerpo anti-AFP monoclonal separadamente, tal como sigue. Se añadió un exceso molar de 50 veces de éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (SMCC) en N,N-dimetilformamida (DMF) a una solución de fosfatasa alcalina 0,6 mg / ml en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 1 mM; con una concentración final de DMF del 5%). La reacción se llevó cabo durante tres horas a 25ºC, después de lo cual la enzima tratada con SMCC se dializó frente a tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 1 mM) a 4ºC durante 18 horas.

Una solución del anticuerpo anti-AFP de 5,8 mg / ml en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 1 mM) se trató con un exceso molar de 500 veces de 2-iminotiolano durante una hora a 25ºC. Seguidamente, la muestra tiosilada se dializó durante 18 horas a 4ºC frente a un tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 1 mM).

Se añadió la enzima tratada con SMCC al anticuerpo anti-AFP tiosilado en una relación molar 2:1 (respectivamente) y a una concentración total de proteína de 1 mg / ml. La reacción se paró después de cuatro horas a 4ºC mediante la adición de N-etilmaleimida (concentración final de 0,3 mM) durante 30 minutos a 4ºC, siguiéndose de adición de 2-mercaptoetanol (concentración final de 1,0 mM), de nuevo durante 30 minutos a 4ºC. Seguidamente, la solución se dializó durante 18 horas a 4ºC frente a tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1,0 mM).

El comportamiento del reactivo indicador enzima / anticuerpo se evaluó usando el protocolo y los reactivos de ensayo Abbott IMx®-AFP (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). El sustrato de los reactivos indicadores de la fosfatasa alcalina mutante de E. coli contenía 4-MUP 1,2 mM en tampón Tris-HCl 1,5 M (a pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1 mM). El reactivo indicador enzima / anticuerpo se diluyó hasta una concentración final de 1,3 \mug / ml con tampón diluyente del reactivo indicador del kit de ensayo y, seguidamente, se filtró (membrana de 0,2 \mum). El reactivo indicador se usó para generar la curva patrón mostrada en la figura 4. Incluida también en la figura 4 está la curva patrón obtenida usando un reactivo indicador anticuerpo anti-AFP marcado con fosfatasa alcalina intestinal de ternera. La correlación entre las curvas muestran que los reactivos indicadores enzima mutante / anticuerpo pueden usarse en un ensayo a concentraciones tan bajas como 1,3 \mug / ml en comparación con el reactivo indicador enzima de mamífero / anticuerpo usado a aproximadamente 0,8 \mug / ml.

Ejemplo 8 Uso de la fosfatasa alcalina mutante en un EIA en sándwich del antígeno canceroso

Se marcó un fragmento del anticuerpo anti-antígeno canceroso con una fosfatasa alcalina mutante de acuerdo con el procedimiento siguiente. Una solución de la fosfatasa alcalina mutante de pMA115 (0,6 mg / ml, en un tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 1,0 mM) se trató con un exceso molar de 450 veces de 2-iminotiolano durante 30 minutos a 25ºC en rotación suave. La muestra tiosilada se desaló en una columna de Sephadex G-25 (1 x 45 cm) equilibrada y se eluyó con un tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0, que contenía NaCl 0,1 M, MgCl_{2} 1,0 mM y ZnCl_{2} 0,1 mM).

El fragmento de anticuerpo se hizo reaccionar con un exceso molar de 50 veces de carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil-1-tricarpamida) ciclohexano (un engarce de 30 átomos), preparado en DMF (con una concentración final de DMF del 15%) durante 30 minutos a 25ºC con rotación suave. Seguidamente, esta muestra se desaló en una columna Sephadex G-25 (1 x 45 cm) equilibrada y se eluyó con un tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0, que contenía NaCl 0,1 M y EDTA 5 mM).

La fosfatasa alcalina mutante tiosilada se mezcló con el fragmento de anticuerpo activado en una relación molar de 1,5:1, respectivamente. La mezcla de reacción se hizo rotar suavemente durante 15 horas a 2-8ºC y la reacción se terminó mediante la adición de N-etilmaleimida (a una concentración final de 0,1 mM). Después de una hora a 25ºC, la muestra se dializó frente a tampón Tris-HCl (20 mM, pH 8,0, que contenía MgCl_{2} 1,0 mM) durante 18 horas a 4ºC.

El reactivo indicador enzima / fragmento de anticuerpo resultante se diluyó hasta una concentración final de 3,7 \mug / ml con tampón diluyente del reactivo indicador y se filtró, sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 7. El reactivo indicador se usó sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de ensayo descrito en el ejemplo 7, en un ensayo en sándwich para detectar el antígeno canceroso y generar la curva patrón mostrada en la figura 5. También se muestra en la figura 5 la curva patrón obtenida usando un reactivo indicador fosfatasa alcalina intestinal de ternera / fragmento de anticuerpo preparado de un modo similar a una concentración de ensayo de 1,64 \mug / ml. Considerando la diferencia en la concentración del reactivo indicador, el comportamiento del reactivo indicador enzima mutante / fragmento de anticuerpo es comparable al del reactivo indicador enzima de mamífero / fragmento de anticuerpo. Los resultados del ensayo demuestran que un reactivo indicador que usa la enzima mutante como marca puede usarse con éxito en un EIA.

Ejemplo 9 Estabilidad de los reactivos indicadores fosfatasa alcalina mutante / miembro de unión

Se preparó un anticuerpo anti-AFP marcado con una enzima sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 7, con las excepciones siguientes: (1) se trató una solución de fosfatasa alcalina mutante de pMA110 a 0,6 mg / ml (en tampón fosfato 0,1 M) durante dos horas a 25ºC con un exceso molar de 50 veces del engarce de treinta átomos disuelto en DMF (con una concentración final de DMF del 15%) y (2) se hicieron reaccionar la enzima activada y un anticuerpo tiosilado (preparado sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 7) a una relación molar de 1:1 durante ocho horas a 4ºC. El reactivo indicador resultante se diluyó hasta 15 \mug / ml con tampón diluyente del reactivo indicador (como se describió en el ejemplo 6) y se sometió a agresión térmica a 45ºC.

Para seguir la cinética de la inactivación térmica del reactivo indicador se extrajeron muestras calientes a lo largo de un período de 60 días y se midió el comportamiento del reactivo indicador de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 6. Los resultados del ensayo se presentan en la figura 6 que también ilustra la cinética de la inactivación térmica del reactivo indicador fosfatasa alcalina intestinal de ternera / anticuerpo anti-AFP. El reactivo indicador que contiene fosfatasa alcalina mutante de E. coli perdió menos del 30% de su señal inicial después de 60 días a 45ºC, mientras que el reactivo indicador enzima de mamífero / anticuerpo perdió más del 60% de su señal inicial en sólo 20 días a 45ºC. La estabilidad térmica del reactivo indicador enzima mutante de E. coli / anticuerpo fue muy superior a la de los reactivos indicadores de enzima del mamífero.

Ejemplo 10 Conjugación dirigida de la fosfatasa alcalina mutante y de miembros específicos de unión

Este experimento implica la preparación de una fosfatasa alcalina mutante de E. coli que muestra una alta actividad específica y contiene un residuo de cisteína de superficie por monómero. La presencia del residuo de cisteína reactivo permite la unión covalente dirigida de la enzima mutante a un miembro específico de unión por medio de un reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional. Este procedimiento de unión elimina la necesidad de introducir grupos tiol en la enzima por medio de una modificación química no específica, usando 2-iminotiolano, como se describió en los ejemplos 7 y 8. Los conjugados resultantes del miembro específico de unión / enzima tienen una estabilidad aumentada y una frecuencia menor de unión no especifica en un EIA.

La enzima se preparó sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3 y el residuo de cisteína se incorporó en la molécula de enzima, sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3, en una localización en la que no interfiere ni con el sitio activo de la enzima ni con la interfaz del monómero. Seguidamente, la enzima modificada se conjugó con un miembro específico de unión mediante un agente de entrecruzamiento heterobifuncional, tal como el éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida o carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil-1-tricarpamida) ciclohexano, sustancialmente de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos 7 y 8.

Ejemplo 11 Construcción de un plásmido sintético de E. coli con sitios de restricción únicos a. General

Un plásmido sintético de E. coli fue diseñado y construido y se mostró que era un vector de clonación funcional. Se usó el método FokI de síntesis génica (Mandecki y Bolling, Gene, 68, 101; 1988) para ensamblar el plásmido a partir de 30 oligonucleótidos. El plásmido contenía módulos sintéticos del gen de la \beta-lactamasa, del origen de replicación, del fragmento génico lacZ y del sitio de multiengarce, estando basado en los plásmidos del tipo pUC. Las diferencias incluyen la eliminación de cerca de 50% de los sitios de restricción presentes en los plásmidos pUC, la reducción del tamaño del plásmidos a 2050 pares de bases y la introducción de terminadores de la transcripción cadena abajo tanto del gen de la \beta-lactamasa como del fragmento lacZ. Estos cambios facilitan varias técnicas, tales como la clonación, mutagénesis, expresión y análisis de restricción.

b. Diseño del plásmido

El diseño total del plásmido sintético de E. coli se basó en las características necesarias o deseables de un vector de clonación y expresión. Un requerimiento era un peso molecular bajo para facilitar las manipulaciones y la purificación de fragmentos de restricción derivados del vector. Otra característica favorable era la exclusión de tantos sitios de restricción como fuera posible, introduciendo sitios de restricción únicos en localizaciones críticas. La experiencia pasada había mostrado que la subclonación subsecuente de un fragmento de ADN conlleva una desventaja distintiva cuando se clona en un vector con muy diversos sitios de restricción.

El plásmido sintético se dividió en tres módulos separados. Primero, se eligió el origen de replicación del pUC9 [Vieira y Messing, Gene, volumen 19, páginas 259-268 (1982)] como secuencia de ADN que constituiría la región ori del plásmido sintético. La secuencia contenía tanto la región del cebador de replicación ARN I como la ARN II, así como sus respectivos promotores (Polisky, Maximizing Gene Expression, W.S. Reznikoff, Ed., Butterworths, Boston, 1986).

Segundo, se eligió el gen de la \beta-lactamasa de los plásmidos pUC como marcador de selección. El gen incluía el promotor natural P3 [Brosius y col., J. Biol. Chem., volumen 257, páginas 9205-9210 (1982)] que se encuentra en el pUC9 y el fuerte terminador de la transcripción del gen VIII del fago fd [Beck y col., Nucleic Acids Res., volumen 5, páginas 4494-4510 (1978)]. Al contrario que la región ori, la secuencia de nucleótidos de la \beta-lactamasa se cambió para eliminar diversos sitios de restricción. En la mayoría de los casos (excepto Ile^{82} > Val y Val^{182} > Ala) permaneció la misma secuencia de aminoácidos. Aproximadamente el 60% de los sitios de restricción presentes naturalmente del gen bla se eliminaron.

Tercero, también fue deseable el fragmento génico lacZ del pUC para la \alpha-complementación debido a su utilidad como marcador de clonación y para la expresión de proteínas de fusión heterólogas, además de tener una región ori y un gen de resistencia a la ampicilina. La secuencia lacZ del pUC9 se cambió para reducir el número de sitios de restricción de un modo análogo a los cambios en el gen de la \beta-lactamasa. El sitio SmaI se mantuvo como sitio único de restricción para la inserción de cualquier otro sitio o sitios deseados.

c. Construcciones genéticas

Se sintetizaron un total de 25 oligonucleótidos para la construcción del pWM510 usando el método FokI de síntesis génica y los oligonucleótidos se clonaron en la serie pWM500 de plásmidos [Mandecki y Bolling, Gene, volumen 68, páginas 101-107 (1988)] como se describió anteriormente. Los plásmidos se purificaron y la secuencia se verificó antes de la escisión de los fragmentos individuales mediante corte con FokI. Todos los 25 fragmentos (que variaban en tamaño desde los 40 pares de bases hasta los 82 pares de bases) contenían protuberancias de complementariedad única de cuatro pares de bases las cuales, cuando hibridaban y ligaban, formaban un vector circular completo y cerrado. Los fragmentos se ligaron y las células competentes SCS-1 [F-, recA1, endAI, gyrA96, thi, hsdR17, (r_{k-}, m_{k}+), supE44, relA1, I-] se transformaron con ellos. Las células transformadas se sembraron en placas de LB que contenían ampicilina. Las células transformadas con éxito pueden sobrevivir y formar colonias sólo si llevan el plásmido intacto que contiene el origen de replicación funcional y el gen de la \beta-lactamasa.

La ligación se realizó usando una ligación a ciegas de todos los 25 fragmentos FokI. Se obtuvieron aproximadamente 38 transformantes por cada 10 mg de mezcla de ligación (la eficacia de transformación total de las células SCS-1 fue mayor de 5 x 10^{7} células / mg pBR322 superenrollado [como se describió en Bolivar y col., Gene, volumen 2, páginas 95-113 (1977)].

Se picaron un total de tres colonias de las placas. De los tres clones, dos tenían los patrones correctos de restricción AvaII. Se picó un clon y se aisló el ADN plasmídico en un gradiente de CsCl para secuenciar. Se usaron múltiples cebadores de secuenciación para la verificación de la secuencia de ADN de doble cadena. Entre un total de 1659 pares de bases, no se detectaron errores de secuencia en ningún clon FokI individual ni en ningún plásmido ensamblando. El plásmido sintético que contenía la región ori y el gen funcional de la \beta-lactamasa se designó pWM510.

En la segunda etapa de la ingeniería plasmídica, se clonó en el sitio EcoRI del pWM510 el módulo sintético lacZ [como se describió en Yanish-Perron y col., Gene, volumen 33, páginas 103-119 (1985)], usando los fragmentos FokI representados en la figura 2. El módulo comprendía el promotor lac, el fragmento génico lacZ que codifica 60 aminoácidos del extremo N-terminal de la \beta-galactosidasa, el terminador de la transcripción del trpA [Christie y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volumen 78, páginas 4180-4 1184 (1981)] y el sitio SmaI para la introducción de un sitio de clonación múltiple mediante mutagénesis en puente. La clonación proporcionó el plásmido pWM511. Aunque el módulo lacZ puede ligarse con el pWM510 cortado en EcoRI en las dos orientaciones, sólo se recuperan los clones que expresan la unidad de transcripción lacZ en la misma dirección que el ARNm de la \beta-lactamasa o que el ARN II (de los 20 clones analizados). La orientación del fragmento génico lacZ en el pWM511 es, por tanto, la misma que en los plásmidos del tipo pUC. El sitio FokI único localizado en el gen de la \beta-lactamasa también se eliminó para permitir el uso del plásmido sintético como vector de clonación en el método FokI de síntesis génica. Como este método en particular depende del principio de separar fragmentos génicos pequeños de un plásmido con FokI, la ausencia de sitios FokI en cualquier parte del plásmido facilita notablemente la purificación de los pequeños fragmentos FokI. La eliminación del sitio FokI se realizó por medio de mutagénesis en puente usando un oligonucleótido degenerado para alterar la secuencia de aminoácidos Trp-Met. La secuenciación subsecuente mostró que la secuencia se había cambiado por una secuencia de aminoácidos Trp-Leu. La secuencia Trp-Met corresponde a la región del ADN de los residuos 1060 a 1064 (figura 8). La secuencia del oligonucleótido usado para mutagénesis fue:

GGCAACAATTAATAGACTGGNNNGAAGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTACT

El plásmido pWM511 se linearizó con FokI y se usó el método de mutagénesis en puente para introducir el cambio de secuencia. Esta mutación conservadora de aminoácidos no provocó ningún cambio observable en la resistencia a la ampicilina. El plásmido construido sin el sitio FokI se denominó pWM515.

La deleción de la región EcoRI se logró cortando el pWM515 con EcoRI / SmaI e incorporando un oligonucleótido dúplex sintético que contenían los cambios necesarios de bases. La construcción plasmídica sintética se designó pWM520 (véase la figura 7). Se usó la mutagénesis en puente para clonar los sitios múltiples de clonación del fago M13 mp18 [como se describió en Yanish-Perron y col., Gene, volumen 33, páginas 103-119 (1985)] en el sitio SmaI dentro del gen lacZ. Esto se hizo para ajustarse a los protocolos de clonación estándar establecidos para pUC18. La construcción que contenía el sitio de clonación múltiple mp18 se denominó pWM518. El sitio de clonación múltiple del pWM518 es como sigue:

GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

d. Caracterización del plásmido

La caracterización del plásmido sintético tuvo interés porque constituyó el primer replicón totalmente sintético. Es significativamente diferente de su prototipo, el plásmido del tipo pUC. Cuando se compara con los plásmidos del tipo pUC, el plásmido sintético contiene tres deleciones, siendo la longitud total de las mismas 636 pares de bases, así como 70 mutaciones puntuales. Cerca del 50% de los sitios de restricción presentes en los plásmidos pUC fue eliminado, lo que es ventajoso para los análisis de restricción o la purificación de ADN. En particular, el plásmido pWM519 contiene sólo siete sitios (incluidos tres sitios incorporados mediante diseño para facilitar las manipulaciones) para enzimas de restricción que reconocen secuencias no degeneradas de 6 pares de bases. Hay 24 de tales sitios en el plásmido pUC, sin incluir el sitio de clonación múltiple. El bajo número de tales sitios permite el uso para clonación de virtualmente cualquier enzima de restricción que tenga una especificidad de 6 pares de bases, así como para la mutagénesis de genes clonados mediante reemplazamiento de fragmentos de restricción con ADN sintético o mutagénesis en puente. El plásmido pWM520 no tiene sitios de corte para 75 enzimas de restricción. El plásmido sintético no incluye el promotor P1 del gen de la \beta-lactamasa. Contiene el origen de replicación de longitud mínima, dos terminadores de la transcripción introducidos de modo novedoso y el promotor lac modificado de mínima longitud.

Se ha mostrado que el plásmido puede propagarse establemente durante al menos 120 generaciones (cuatro pases sobre placas). Por lo tanto, el fragmento construido que contiene el origen de replicación (1349-1993 en la figura 7) fue completamente capaz de mantener la replicación estable. El número de copias del plásmido se evaluó mediante análisis de la densidad de las bandas de ADN plasmídico en un gel de agarosa, midiendo el rendimiento de ADN a partir de preparaciones de ADN grandes y mediante ensayo de los niveles de \beta-lactamasa [Jones y col., J. Clinic. Microbiol., volumen 15, páginas 677-683 (1982)]. Se encontró que el número de copias era de 3 a 4 veces inferior que el del pUC9 y equivalente al número de copias del pBR322. Esta observación fue coherente con el cambio de secuencia determinado recientemente en el origen de replicación de los plásmidos el tipo pUC comparado con el pBR322 [la G en 2990 en pBR322 cambia a una A en la región correspondiente de los plásmidos pUC; Milton y col., Focus, BRL-Gibco, vol. 10, página 56 (1988)], que parece conferir un número de copias mayor a los plásmidos pUC.

La secuencia del plásmido sintético se presenta en la figura 7. En la figura 7, se subrayan los terminadores de la transcripción, las regiones promotoras -35 y-10 y los tripletes ATG que codifican la fMet. Las flechas horizontales indican los sitios de inicio de la transcripción. Una flecha vertical indica el sitio de corte de la ribonucleasa H. Los apóstrofes indican los puntos de división y proporcionan las secuencias de los fragmentos FokI. Las secuencias de los oligonucleótidos sintéticos fueron: brazo 1 + la secuencia entre los puntos de división + región de solapamiento de cuatro residuos en el extremo 3' terminal + brazo 2. Los fragmentos FokI y los oligonucleótidos se numeran como se indica anteriormente a la secuencia. La secuencia del fragmento uno se compone de dos secuencias discontinuas. Los triángulos definen el módulo lacZ.

Todos los oligonucleótidos usados para la construcción del pWM510 se sintetizaron en un sintetizador 380A de Applied Biosystems usando 5'-dimetoxitritilnucleósido \beta-cianoetilfosforamiditos. La síntesis se llevó a cabo en un soporte sólido de vidrio de poro controlado de una escala de 0,2 \muM con un tamaño medio de poro de 1000 \ring{A}. Los oligonucleótidos se purificaron mediante electroforesis en gel.

La clonación de los oligonucleótidos sintéticos se realizó mediante el protocolo de mutagénesis en puente. Todos los cuatro vectores de clonación (pWM500, pWM501, pWM502 y pWM507) usados en el método FokI de síntesis génica se cortaron con SmaI. Se mezclaron aproximadamente 50 ng del vector linearizado con 20 picomoles del oligonucleótido en 30 microlitros de tampón de desnaturalización (KCl 10 mM, Tris-HCl 5,0 mM pH 8,0, MgSO_{4} 5,0 mM y ditiotreitol 0,5 mM) y la mezcla se calentó a 100ºC durante tres minutos en un baño de agua hirviendo. Las muestras se enfriaron hasta temperatura ambiente durante cinco minutos y se transfirieron a 200 \mul de células JM83 competentes frías (ara, \Delta[lac-proAB], strA, thi, F80, lacZ\DeltaM15). Las células competentes se prepararon mediante el procedimiento del CaCl_{2}. La mezcla de ADN y células se enfrió en hielo durante cinco minutos seguido de un choque térmico a 37ºC durante tres minutos. Se añadieron aproximadamente dos mililitros de medio LB a la mezcla de transformación, las células se incubaron a 37ºC durante una hora y, seguidamente, las células se sembraron.

Las construcciones plasmídicas que contenían los fragmentos FokI para el plásmido sintético se digirieron como sigue. Se cortaron aproximadamente 200 ng de cada plásmido con 90 unidades de FokI (New England BioLabs, Beverly, MA). Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 500 microlitros que contenían tampón FokI 1 x (KCl 20 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM y 2-mercaptoetanol 10 mM) a 37ºC durante 2,5 horas. Seguidamente, los fragmentos FokI que contenían el inserto se purificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

En el procedimiento de ligación, todos los 25 fragmentos FokI (100 ng de cada uno de ellos) se mezclaron juntos en una reacción única (véase anteriormente). Los tipos de los vectores de clonación usados fueron como sigue: pWM500 - para los fragmentos 2 a 14 y 26 a 29; pWM501 - para los fragmentos 15 a 18, 24 y 25; pWM502 - para los fragmentos 19 a 23 y pWM507- para el fragmento 30.

Ejemplo 12 Construcción y propiedades del mutante Asp^{153} > Gly

El mutante Asp^{153} > Gly se construyó introduciendo una mutación en el plásmido pMA101, cortándolo primero con las enzimas de restricción SpeI y PvuII para liberar el fragmento de ADN que lleva el codón natural del residuo del aminoácido 153. Seguidamente, el ADN cortado se usó en la mutagénesis en puente tal como se describió en el ejemplo 1(b) junto con un oligonucleótido que llevaba una secuencia de ADN aleatoria en la posición correspondiente a la mutación deseada. La secuencia del oligonucleótido fue:

AAATGGCAAAAGCAGCTGGTCTGGCGACCGGTAACGTTTCTACCGCAGAG

TTGCAGNNNGCCACACCCGCTGCGCTGGTGGCACATGTGACTAGTCGCAA

ATGCT

Las colonias resultantes se seleccionaron por k_{cat} alta usando el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato como sigue:

1.: Después de transformar las células de E. coli con el plásmido que contenía la mutación Asp^{153} > Gly como se describió anteriormente, se sembraron en filtros (Millipore Nº HATF 082 25) que habían sido colocados sobre placas de LB agar que contenían ampicilina y las células se incubaron toda una noche 37ºC con las placas tapadas.

2.: Las réplicas de los filtros en las placas de la etapa 1) se hicieron presionándolos contra filtros frescos (Millipore Nº HATF 082 25) entre dos libros pesados. Las células de los filtros originales y de las réplicas de filtros se colocaron en placas de LB agar separadas y se incubaron durante 2-3 horas a 37ºC con las placas tapadas.

3.: Las placas de la etapa 2) se incubaron sin tapar a 90ºC durante una hora y 45 minutos y, seguidamente, se permitió que se enfriaran hasta temperatura ambiente.

4.: Los filtros originales y las réplicas de los filtros de las placas incubadas de la etapa 3) se levantaron cuidadosamente del agar y se colocaron sobre una pieza de papel de transferencia Whatman que había sido humedecido previamente con 40 ml de Tris 50 mM (pH 10,0) y, seguidamente, se incubaron durante cinco minutos a temperatura ambiente.

5.: Los filtros originales y las réplicas de los filtros de la etapa 4) se transfirieron cuidadosamente y, seguidamente, se colocaron sobre otra hoja de papel de transferencia que había sido humedecido previamente con 40 ml de Tris 50 mM, 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato 0,2 mg / ml (pH 10,0) y se incubaron durante cinco minutos a temperatura ambiente.

6.: Los filtros originales y las réplicas de los filtros de la etapa 5) se trasladaron cuidadosamente a una hoja seca de papel de transferencia Whatman y las colonias que tenían el color azul más intenso en los filtros originales se hicieron coincidir con las colonias correspondientes en las réplicas de los filtros.

7.: Las colonias de los filtros originales que la etapa 6) se extrajeron y se crecieron cultivos toda una noche en 4,0 ml de caldo LB con ampicilina a 37ºC.

8.: Se dividieron en cuatro partes placas de LB agar, se hicieron estrías con muestras de los cultivos crecidos de la etapa 7) en las placas de agar y se incubaron toda una noche a 37ºC.

Se identificó un clon del procedimiento de selección que mostraba claramente un color azul muy oscuro tanto en el filtro original como en la réplica del filtro, en comparación con la cepa natural. El clon, pDG201, se caracterizó mediante secuenciación de ADN, que rindió la secuencia GGC en el codón 153 en vez de la secuencia GAC (secuencia natural). Este codón corresponde al residuo de glicina de la posición 153 del mutante. El gen mutante del plásmido pDG201 se expresó subsecuentemente en E. coli y la fosfatasa alcalina mutante se purificó como se describió en el ejemplo 4. La proteína mutante purificada se caracterizó mediante medida de su k^{cat}, su dependencia del pH y su K^{m} como se describió en el ejemplo 5. En Tris 1 M, pH 8,2, la k_{cat} del mutante fue 229 s^{-1} y la K_{m} fue 11,8 \muM. Los resultados muestran que el mutante Asp^{153} > Gly es casi tan activo catalíticamente como el mutante Asp^{101} > Ser en el intervalo de pH completo investigado y, por tanto, es un candidato excelente para varias aplicaciones, incluyendo su uso como enzima testigo en ensayos como se describió en la presente memoria.

Claims

1. Una enzima sintética que es un mutante de una enzima fosfatasa alcalina producida por Escherichia coli, teniendo dicha fosfatasa alcalina mutante al menos una mutación en un aminoácido comparada con la fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, caracterizándose porque dicha mutación consiste en una Gly en lugar del Asp^{153}.

2. Una secuencia de ADN modificada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima fosfatasa alcalina mutante, para la expresión en un hospedador unicelular, teniendo dicha fosfatasa alcalina al menos una mutación en un aminoácido comparada con la correspondiente fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, y teniendo dicha fosfatasa alcalina mutante una actividad específica aumentada comparada con la fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, caracterizándose porque dicha mutación consiste en una Gly en lugar del Asp^{153}.

3. Un plásmido que comprende una secuencia de ADN modificada que codifica una enzima fosfatasa alcalina mutante, para la expresión en un hospedador unicelular, teniendo dicha fosfatasa alcalina al menos una mutación en un aminoácido comparada con la correspondiente fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, y teniendo dicha fosfatasa alcalina mutante una actividad específica aumentada comparada con la fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, caracterizándose porque dicha mutación consiste en una Gly en lugar del Asp^{153}.

4. Un hospedador unicelular, comprendiendo un plásmido que comprende una secuencia de ADN modificada que codifica una enzima fosfatasa alcalina mutante, para la expresión en un hospedador unicelular, teniendo dicha fosfatasa alcalina al menos una mutación en un aminoácido comparada con la correspondiente fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, y teniendo dicha fosfatasa alcalina mutante una actividad específica aumentada comparada con la fosfatasa alcalina natural de Escherichia coli, caracterizándose porque dicha mutación consiste en una Gly en lugar del Asp^{153}.

5. Un método para determinar la presencia o la cantidad de un análito en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:

a.: Poner en contacto la muestra de ensayo secuencial o simultáneamente con un reactivo indicador y un miembro de unión de captura, comprendiendo dicho reactivo indicador una enzima fosfatasa alcalina de acuerdo con la reivindicación 1 unida di recta o indirectamente a un miembro específico de unión,

b.: Dejar que dicho reactivo indicador se una a un miembro seleccionado del grupo que consiste en el análito, dicho miembro de unión de captura y un miembro específico de unión auxiliar, formándose, de este modo, un complejo del reactivo indicador; y

c.: Hacer reaccionar dicho complejo del reactivo indicador o el reactivo indicador libre con un sustrato enzimático para producir una señal detectable y determinar, de este modo, la presencia o la cantidad del análito en la muestra de ensayo.

6. Un reactivo indicador, útil para determinar la presencia o la cantidad de un análito en una muestra de ensayo, que comprende:

a.: La enzima fosfatasa alcalina mutante de la reivindicación 1 y

b.: Un miembro específico de unión unido directa o indirectamente a dicha enzima.