ES2199947T3 - Vacuna que contiene una tiolproteasa. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE TIOLPROTEASAS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD TIPO CATEPSINA L PARA LA FORMACION DE VACUNAS PARA COMBATIR PARASITOS DE HELMINTOS. PREFERENTEMENTE LA PROTEASA SE DERIVA DE UN TREMATODO TAL COMO LA FASCIOLA HEPATICA.

Description

Vacuna que contiene una tiol-proteasa.

La invención se refiere al uso de una clase de tiol-proteasas como antígenos protectores frente a parásitos helmínticos, especialmente las proteasas tipo catepsina-L frecuentemente liberadas como productos de excreción/secreción por tales parásitos.

Todas las especies de animales domésticos pueden ser parasitadas por varias especies diferentes de helmintos, un proceso que normalmente causa enfermedades. Por ejemplo el trematodo parásito Fasciola hepatica se sabe que es la causa de la enfermedad, importante económicamente, la fascioliasis en los rumiantes, tales como el ganado vacuno y las ovejas. El parásito entra en el mamífero hospedante penetrando la pared intestinal y pasa aproximadamente siete semanas alimentándose y excavando a través de la masa del hígado antes de migrar al conducto biliar. Después de la infección, el desarrollo de inmunidad en el hospedante es pobre y la resistencia a la reinfección en los hospedantes ya infectados es solamente parcial o inexistente. Otros trematodos parásitos incluyen la Fasciola gigantica y Dicrocoelium spp. y también Paramphistomum spp.

También existen problemas causados por los nematodos tales como los anquilostomas (por ejemplo, Necator, Ancylostoma, Uncinaria y Bunostomum spp.).

De los nematodos que se alimentan de sangre, el género Haemonchus infecta el revestimiento del abomaso de los rumiantes, causando anemia y pérdida de peso y si no se trata, con frecuencia lleva a la muerte. Los animales infectados con los nematodos relacionados Ostertagia que no se alimentan de sangre, tienen problemas similares de crecimiento y pueden morir si no se tratan.

Otros gusanos parásitos de importancia económica incluyen las diferentes especies de los siguientes géneros de helmintos: Trichostrongylus, Nematodirus, Dictyocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris y Strongylus. Aparte del ganado doméstico, también los animales de compañía y los seres humanos pueden ser infectados, con resultados fatales no infrecuentes, y las infecciones e infestaciones con helmintos constituyen por tanto un problema de considerable importancia en todo el mundo.

El control de los parásitos helmínticos del ganado de pastoreo normalmente recae principalmente en el uso de fármacos antihelmínticos combinados con el control de la pastura. Tales técnicas son a menudo insatisfactorias, en primer lugar porque es posible que los fármacos antihelmínticos se tengan que administrar frecuentemente, en segundo lugar porque la resistencia frente a los fármacos antihelmínticos se está extendiendo de modo creciente y en tercer lugar porque el apropiado control de la pastura a menudo no es posible en algunas granjas e incluso cuando lo es, puede tener limitaciones sobre el mejor uso de los pastos disponibles.

Se han hecho numerosos intentos para controlar los parásitos helmínticos de los animales domésticos por medios inmunológicos. Con muy pocas excepciones (por ejemplo el gusano del pulmón del ganado, Dictyocaulus viviparus) se ha demostrado que esto no es posible.

En el documento WO90/08819 se ha propuesto una vacuna frente a la F. hepatica que comprende como material antigénico una glutatión-S-transferasa procedente de la F. hepatica.

Bennett (patente del Reino Unido No. 2169606B) extrajo diferentes antígenos de los organismos Fasciola por un procedimiento que separa los antígenos específicos de la fase juvenil de los antígenos presentes a lo largo de las fases juvenil y adulta.

Es sabido que la F. hepatica cultivada in vitro libera enzimas proteasas que son capaces de escindir las inmunoglobulinas con una actividad tipo papaína o tipo catepsina B (Chapman and Mitchell, Vet. Parasitol. 11 (1982), p. 165-178). Se ha dado a entender que estas enzimas proteasas pueden ayudar a eludir la respuesta inmunitaria en combinación con la conocida capacidad de los gusanos de deshacerse del glucocáliz de superficie librándose de este modo del anticuerpo unido (Hanna, Exp. Parasitol 50 (1980), p. 155-70). Además los productos crudos de excreción/secreción in vitro pueden, en algunas circunstancias, conferir inmunidad a las ratas (Kajasekariah et al., Parasitol, 79 (1979), p. 193-400) quizá por suscitar anticuerpos frente a tales enzimas y de este modo inhibir a éstas. Sin embargo, la naturaleza exacta de las enzimas está lejos de ser clara.

Un estudio de las proteasas de excreción/secreción que incluye la electroforesis en gel de poliacrilamida con sustrato de gelatina (GS-PAGE) (Dalton and Heffernan, Mol. Biochem. Parasitol. 35 (1989), p. 161-166) mostró varias cisteína-proteasas con un amplio intervalo de pesos moleculares y que generalmente se dividen en dos grupos, a saber, de 27,5 kDa a 46 kDa activas a pH 4,5-8,0 y de 60 kDa a 88 kDa activas a pH 3,0-4,5. Se ha sugerido que el último grupo podría corresponder a las enzimas de Chapman y Mitchell que escinden la inmunoglobulina, y que la autolisis y/o agregación de una o más enzimas proteasas podría ocasionar la estructura de bandas múltiples.

Posteriormente se usó un procedimiento de HPLC y se resolvieron tres picos. Se encontró que la proteína del pico de 15 kDa tenía la capacidad de escindir la IgG a un pH óptimo de 4,5 (Heffernan et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) page 275).

Otro estudio que intenta caracterizar las enzimas proteasas de la F. hepatica adulta es el de Rege et al., (Mol. Biochem. Parasitol. 35 (1989), p. 89-96) en el cual una proteína de 14.500 Da se purificó por cromatografía de cambio iónico y HPLC de exclusión molecular. La hidrólisis máxima del sustrato CBZ-Phe-Arg-AFC se encontró a pH 6,0. Rege et al., usaron gusanos enteros liofilizados como la fuente de sus proteasas de modo que no está claro si sus proteasas eran excretadas o no. Ellos hicieron conjeturas sobre la posibilidad de que la proteasa pudiera estar implicada en la evasión de la respuesta inmunitaria o en la nutrición.

Una proteasa aislada de "Fasciola spp." ha sido descrita por Yamasaki et al. (Japan J. Parasitol., 38 (1989), p. 373-384). La proteasa que tenía un peso molecular de 27 kDa determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) era capaz de hidrolizar la hemoglobina y esta actividad de hidrólisis era inhibida por los inhibidores de la cisteína-proteasa. Los anticuerpos monoclonales específicos para la proteasa podrían inhibir también la hidrólisis de la hemoglobina.

Otros estudios relacionados con las proteasas liberadas por los parásitos helmínticos son los de Fagbemi and Hillyier, Vet. Parasitol. 40 (1991), p. 217-226 relacionados con Fasciola gigantica; Knox and Kennedy, Mol. Biochem. Parasitol. 28 (1988), p. 207-216 relacionados con Ascaris suum; y Yamakami and Hamajima, Comp. Biochem. Physiol. 87B (1987), p. 643-648 relacionados con Paragonimus westermani.

Se ha encontrado ahora que el grupo de las cisteína-proteasas descrito por Dalton y Heffernan como poseedor de pesos moleculares en el intervalo de 27,5-88 kDa determinados sobre PAGE con sustrato de gelatina (GS), se puede resolver de hecho como dos proteasas de 27 kDa y 29,5 por SDS-PAGE en condiciones reductoras; que estas proteínas tienen dos actividades marcadas tipo catepsina-L como se determina por la especificidad del sustrato, afinidad para columnas de cambio iónico y secuenciación N-terminal; que las proteasas tienen también la capacidad de escindir las inmunoglobulinas; que la inmunización de conejos con proteasas purificadas puede estimular la producción de anticuerpos capaces de neutralizar la actividad enzimática; y que este descubrimiento abre la posibilidad de una vacuna eficaz frente a los parásitos helmínticos y en particular frente a F. hepatica usando antígenos protectores purificados bien caracterizados y evitando los inconvenientes de toxicidad y efectos secundarios tales como inmunodepresión o dominancia que son inherentes al uso de los productos de excreción/secreción crudos sin resolver.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una vacuna para combatir una infestación parasitaria de Fasciola hepatica en un mamífero, en la que el material antigénico comprende la proteasa catepsina-L1 de Fasciola hepatica que tiene un peso molecular de 27 kDa determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio en condiciones reductoras y una secuencia N-terminal A V P D K I D P R E S G y/o la proteasa catepsina-L2 de Fasciola hepatica que tiene un peso molecular de 29,5 kDa determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio en condiciones reductoras y una secuencia N-terminal A V P D K I D R R E S G, en una forma al menos parcialmente purificada, o uno de sus fragmentos o epítopos antigénicos, junto con un vehículo y/o un adyuvante.

El mamífero es preferiblemente un rumiante, por ejemplo el ganado vacuno o las ovejas, pero la vacuna y el método de la invención también pueden encontrar aplicación en los seres humanos.

La actividad tipo catepsina-L incorporada en la vacuna según la invención está en una forma al menos parcialmente purificada. Preferiblemente la actividad tipo catepsina-L comprende al menos 75% de las proteínas totales de excreción/secreción presentes en la vacuna y más preferiblemente la catepsina-L tiene al menos 95% de pureza. Se podrá apreciar que una vez que se ha obtenido la catepsina-L con al menos 95% de pureza, se puede mezclar con una o más proteínas antigénicas purificadas adicionales, incluyendo una o más proteínas de excreción/secreción adicionales, para formar una vacuna polivalente.

La actividad tipo catepsina-L se puede demostrar por la capacidad para escindir el sustrato peptídico sintético Z-phe-arg-AMC (benciloxicarbonil-L-fenilalanil-L-arginil-7-amido-4-metil-cumarina) combinado con una incapacidad relativa para escindir los péptidos relacionados Z-arg-arg-AMC y Z-arg-AMC, distinguiendo de este modo la enzima, de la catepsina B y de la catepsina H. La confirmación de la proteasa como una catepsina-L se puede obtener también por comparación de la secuencia de aminoácidos en N-terminal con las secuencias de moléculas conocidas de catepsina-L.

Se ha demostrado que la catepsina-L del hígado de rata, una catepsina-L de mamíferos, existe como una proteína de dos cadenas (Ishidoh et al., FEBS Letters 223 (1987), pages 69-73). No está claro si una estructura similar está presente o no en la catepsina-L de los no mamíferos, aunque véanse los resultados de la secuencia de aminoácidos que se presenta más adelante.

Las vacunas según la invención se pueden formular con vehículos y/o adyuvantes convencionales y la invención proporciona también un procedimiento para la preparación de las vacunas que comprende poner en asociación una proteasa purificada que tiene actividad enzimática tipo catepsina-L o uno de sus fragmentos o epítopos antigénicos y uno o más adyuvantes o vehículos. Los adyuvantes adecuados incluyen hidróxido de aluminio, saponina (ISCOMs), dipéptido muramilo, aceites minerales y vegetales, dextrano DEAE, copolímeros de bloque no iónicos o liposomas tales como Novasomas (marca comercial de Micro Vesicular Systems Inc.), en presencia de uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los vehículos para las secuencias peptídicas que corresponden a epítopos de proteasa tipo catepsina-L según la invención, pueden ser proteínas tales como el antígeno del núcleo de la hepatitis B, péptido antigénico múltiple o lipopéptidos tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilserilserina (P_{3}CSS). Los diluyentes adecuados incluyen medios líquidos tales como solución salina, apropiados para uso como vehículos. Se pueden incluir también componentes adicionales tales como conservantes.

La administración de la vacuna a la especie hospedante se puede llevar a cabo por cualquiera de las vías convencionales, por ejemplo, oralmente o parenteralmente tal como por inyección intramuscular, opcionalmente a intervalos, por ejemplo, dos inyecciones en un intervalo de 7-35 días. Una dosis adecuada cuando se administra por inyección puede ser tal que proporcione una cantidad de proteína tipo catepsina-L dentro del intervalo de 10-500 \mug.

Aunque la proteasa tipo catepsina-L para uso en la vacuna según la invención puede ser preparada por aislamiento de los productos de excreción/secreción de los helmintos adultos y/o juveniles, puede ser conveniente también que sea preparada por técnicas de DNA recombinante con las ventajas conocidas que proporcionan tales técnicas en términos de pureza del producto, escalado de la producción y reproducibilidad.

Aspectos adicionales de la invención relacionados con lo anterior incluyen las moléculas de DNA que codifican las proteasas tipo catepsina-L o sus fragmentos o epítopos antigénicos; los vectores que contienen una o más de dichas secuencias de DNA; las células hospedantes, por ejemplo bacterias tales como E. coli o más preferiblemente células eucarióticas, transformadas por tales vectores, por ejemplo por un vector de baculovirus; y los procedimientos para preparar las proteasas recombinantes tipo catepsina-L o sus fragmentos o epítopos antigénicos, que comprenden cultivar tales células hospedantes transformadas y aislar dichas proteasas tipo catepsina-L o sus fragmentos o epítopos de las células cultivadas. Puesto que la estructura terciaria de la proteasa tipo catepsina-L es importante en la respuesta de anticuerpos de un animal vacunado, se prefieren los sistemas de expresión eucariótica ya que la estructura terciaria será reproducida más fielmente.

Una formulación alternativa de vacuna viva o inactivada puede comprender un virus atenuado o virulento o una célula hospedante, por ejemplo un microorganismo tal como una bacteria, que tiene insertada una molécula de DNA según la invención para la estimulación de una respuesta inmunitaria dirigida frente a los polipéptidos codificados por la molécula de ácido nucleico insertada.

También pueden estar presentes en la vacuna materiales antigénicos adicionales, produciendo de este modo un mayor efecto protector frente al parásito helmíntico en cuestión o un efecto protector combinado frente a una o más infestaciones parasitarias adicionales.

La invención se ilustra por los siguientes ejemplos:

1) Purificación de la catepsina-L1

Se obtuvieron trematodos maduros de los hígados infectados de animales condenados al matadero. Los trematodos se lavaron, se cultivaron durante la noche, y el medio de cultivo se centrifugó como está descrito en Dalton and Heffernan, Mol. Biochem. Parasitol. 35 (1989), p. 161-166. Se concentraron 500 ml del medio de cultivo (E/S) hasta 10 ml por ultrafiltración con una membrana que excluye un peso molecular de 3.000 Da, y se aplicó la muestra a 4ºC a una columna de 120 ml de Sephacryl S-200 (1.9 x 42 cm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,3; se encontró que el volumen vacío de la columna era 110 ml. Se recogieron fracciones de un volumen de 5 ml (una vez que hubo eluido el volumen vacío), y se monitorizaron en cuanto al contenido en proteína a una O.D. de 280 nm, usando un monitor LKB Uvicord. La actividad enzimática tipo catepsina-L de las diferentes fracciones se ensayó usando el péptido fluorógeno sintético Z-Phe-Arg-AMC, del que se sabe que es específico para las enzimas catepsina-L. La liberación del grupo lábil fluorescente, 7-amino-4-metilcumarina (AMC) se monitorizó en un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin Elmer modelo LS 50, a longitudes de onda de excitación y emisión de 370 y 440 nm respectivamente (Figura 1A). Se reunieron las fracciones con actividad tipo catepsina-L y se aplicaron a una columna QAE Sephadex de 50 ml (Pharmacia, Uppsala, Sweden). La columna se preparó como sigue:

Se prehinchó la QAE Sephadex A-50 en Tris-HCl 0,1 M pH 7,0 suplementado con NaCl 1,0 M y se vertió a una columna de 50 ml. Se equilibró después la columna con Tris 0,1 M pH 7,0. El conjunto de la proteasa tipo catepsina-L se volvió a aplicar dos veces a 4ºC para asegurar la máxima unión de las proteínas no-catepsina-L presentes en los productos de excreción/secreción (E/S). El caudal de la columna fue aproximadamente 1 ml/min. A lo largo del experimento se recogió la fracción esto es la fracción que contiene las proteínas no adsorbidas por la QAE Sephadex (aproximadamente 50 ml) y se concentró hasta un volumen de 10 ml por ultrafiltración con una membrana que excluye un peso molecular de 3.000 Da, y se dializó frente a agua ultrapura y se liofilizó.

La actividad específica final de la proteinasa catepsina-L1 purificada fue 11,67 x 10^{3} unidades/mg de proteína (donde una unidad libera 1 \mumol de AMC/min).

Se recogieron las muestras después de la purificación y se cargaron sobre geles de poliacrilamida con GS, geles de poliacrilamida no reductores con SDS y geles de poliacrilamida reductores con SDS (10% de acrilamida, 0,1% de SDS) con el fin de evaluar la actividad de proteinasa y establecer la pureza de la catepsina-L1. El resultado se muestra en la Figura 1B en la cual las pistas 1 y 3 son los productos E/S totales sobre los geles con GS y sobre los geles no reductores con SDS, las pistas 2 y 4 son la catepsina-L1 purificada sobre los geles con GS y sobre los geles no reductores con SDS mientras que la pista 5 es la catepsina-L1 purificada sobre un gel de SDS en condiciones reductoras. El análisis por GS-PAGE demostró que la enzima catepsina-L1 purificada constaba de múltiples bandas de actividad de proteinasa en el intervalo de peso molecular de 60 kDa y más alto (Figura 1B, pista 2, véase Dalton & Heffernan mencionados antes), estas bandas corresponden a bandas de peso molecular similar sobre un gel no reductor con SDS mientras que sobre el gel reductor con SDS estas bandas múltiples se resolvieron en una banda de peso molecular de 27 kDa (Figura 1B, pista 5).

2) Determinación de la secuencia N-terminal

Para confirmar la clasificación de esta enzima purificada como una proteínasa tipo catepsina-L, se secuenció una muestra concentrada del conjunto de la catepsina-L1 procedente de la columna de filtración en gel usando un secuenciador de proteínas Applied Biosystems 477A. La secuencia de aminoácidos resultante se alineó con las secuencias previamente determinadas de moléculas conocidas de catepsina-L y con la secuencia de catepsina B de Schistosoma mansoni (Tabla 1 más adelante). Por las manchas se muestran residuos idénticos a los de la catepsina-L1 de F. hepatica. En los 19 primeros residuos de la secuencia N-terminal la catepsina-L del trematodo tiene 63% de identidad con las moléculas de catepsina-L procedentes tanto del hígado bovino como del hígado de pollo, 53, 59 y 53% de homología con las moléculas de catepsina-L procedentes de la rata, del ser humano y de Trypanosoma cruzi respectivamente, y 26% de homología con una catepsina-B procedente de S. mansoni.

1

3) Producción de anticuerpos frente a la catepsina-L1

Se produjo antisuero policlonal frente a la catepsina-L1 en conejos blancos mediante una inyección subcutánea de 52 \mug de enzima purificada en adyuvante completo de Freund. La inmunización inicial fue seguida por dosis de refuerzo de 52 \mug de enzima en adyuvante incompleto a los 40 días, 90 días, 120 días y 150 días; 1 semana más tarde se desangraron los animales. El título de anticuerpos se determinó usando el ensayo ELISA. Las placas de microtitulación se recubrieron con 50 \mul de los productos E/S adultos y se dejaron destapadas a 37ºC durante la noche. Se purificaron las inmunoglobulinas IgG2a procedentes del antisuero usando una columna con proteína A.

4) Experimentos de transferencia Western

Se usó el inmunoanálisis de transferencia Western para determinar la especificidad y consecuentemente la reactividad cruzada de los anticuerpos de conejo producidos frente a la proteinasa purificada catepsina-L1 procedente de F. hepatica. Esto se llevó a cabo usando los productos E/S y la catepsina-L1 purificada. Se separaron las proteínas por SDS-PAGE y se transfirieron electroforéticamente a papel de nitrocelulosa usando un sistema de transferencia semiseca. Para bloquear todos los sitios de unión no específicos se usaron uno por ciento de suero fetal bovino (FCS) y 0,5% de Tween-20 en PBS. Se incubó la nitrocelulosa con anti-catepsina-L1 y se detectó la inmunoglobulina unida usando suero anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina. Como sustrato se usaron nitro-azul de tetrazolio y fosfato de 5-bromo-5-cloro-3-indolilo preparados en dimetilformamida.

Las inmunoglobulinas purificadas no mostraron ninguna reacción con otras proteínas presentes en los productos E/S y la totalidad de su especificidad de unión estuvo confinada a las bandas de proteínas (peso molecular 60 kDa y más alto sobre SDS-PAGE en condiciones no reductoras) de los productos E/S responsables de la actividad de proteinasa de la catepsina-L1 purificada. Una transferencia de SDS-PAGE realizada en condiciones reductoras, explorada con el antisuero anti-catepsina-L1, mostró una unión específica solamente con una banda proteínica de peso molecular 27 kDa tanto en los productos E/S como en la catepsina-L1 purificada, la cual guarda correlación con la única banda proteínica observada cuando se realiza el ensayo de la catepsina-L1 purificada sobre un gel reductor con SDS.

5) Inhibición de la actividad enzimática

Para determinar si los anticuerpos anti-catepsina-L1 producidos en el conejo inhibían la actividad de la catepsina-L1, se usaron anticuerpos purificados como sigue. La Figura 2A muestra un gel de poliacrilamida no reductor con sustrato de gelatina al 10%, cargado con catepsina-L1 y con cantidades crecientes de la IgG anti-catepsina-L1. Queda claro a partir de este gel que con concentraciones crecientes de IgG anti-catepsina-L1, la actividad de proteinasa de la enzima disminuye como se demuestra por la intensidad decreciente de las bandas claras sobre el fondo oscuro (pistas 1-7), mientras que concentraciones similares de IgG de conejo no inmune no tuvieron efecto sobre la actividad de proteinasa de la catepsina-L1 (pista 8 catepsina-L sola, pista 9 catepsina-L con IgG de conejo no inmune)

Una de las propiedades más llamativas de la catepsina-L1 de F. hepatica es su capacidad para escindir los anticuerpos en la región bisagra. Se mezcló la catepsina-L1 purificada con la IgG anti-catepsina-L1 o con la IgG control, se incubó a 37ºC, se tomaron muestras a diferentes intervalos de tiempo y las moléculas de anticuerpos de la mezcla de reacción se analizaron por SDS-PAGE. Los barridos densitométricos de estos geles demuestran que la unión de la anti-catepsina-L1 a la enzima evita que ésta acceda al sitio de escisión de la cadena pesada del anticuerpo; por ello, los picos que representan los fragmentos generados por la digestión de la cadena pesada (Figura 2, panel B, (ii)) son mucho más reducidos en comparación con los observados cuando la catepsina-L1 se incuba con la IgG control (Figura 2, panel B, (i)).

6) Caracterización de la enzima que escinde a la IgG en los productos E/S de trematodos adultos

Como un modelo de sustrato se usó un anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a obtenido por métodos conocidos. Se incubó el anticuerpo con una muestra de los productos E/S de F. hepatica adulta, o con la tiol-proteinasa papaína. El análisis por SDS-PAGE reveló que las proteinasas de los productos E/S escinden la cadena pesada de la IgG2a de ratón en dos fragmentos. Estos fragmentos eran similares en tamaño molecular a los fragmentos producidos por la papaína. Por tanto, los trematodos adultos segregan una enzima capaz de escindir la IgG2a cerca del sitio de escisión de la papaína, esto es, dentro de la región bisagra de la cadena pesada del anticuerpo. La enzima del trematodo no es específica para los anticuerpos IgG2a sino que también escindió la IgG2b y la IgG1a purificadas por cromatografía de afinidad con proteína A procedentes del ratón entero y del suero de conejo.

Los productos E/S del trematodo maduro se analizaron también por HPLC. Se concentraron los productos E/S diez veces por liofilización y se dializaron durante la noche frente a fosfato de potasio 0,1 M pH 7,0. Se filtró después el dializado a través de un filtro de membrana de 0,45 \muM (Gelman Sciences, Michigan, USA) y 100 \mug de muestra se sometieron a HPLC de exclusión molecular sobre una columna TSK3000SW (Waters, Milford, USA). La fase móvil era fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,0, el caudal era 0,3 ml/min y las proteínas eluidas se monitorizaron por la absorbancia a 280 nm usando un intervalo de sensibilidad de 0,05. Los tamaños moleculares de las proteínas se determinaron calibrando la columna con las siguientes proteínas: IgG2a (150 kDa), seroalbúmina bovina (67 kDa), peroxidasa de rábano (45 kDa) y lisozima (14,3 kDa).

El análisis por GS-PAGE de las proteínas eluidas de la HPLC dio tres picos principales de proteínas de >150 kDa (pico I), de 45 kDa (pico II) y de 15 kDa (pico III), véase la Figura 3a. Se incubó una muestra de cada fracción con el anticuerpo monoclonal IgG2a y los productos de la reacción se sometieron a SDS-PAGE. La enzima que escinde la IgG2a se asoció con el tercer pico, de 15 kDa, véase la Figura 3b.

Cada fracción se ensayó también en cuanto actividad tipo catepsina-L usando el sustrato peptídico sintético Z-phe-arg-AMC. La actividad tipo catepsina-L se asoció con el pico de 15 kDa. El pH óptimo para la actividad tipo catepsina-L se determinó para la proteasa de 15 kDa usando Z-phe-arg-AMC, véase la Figura 3C.

El análisis por GS-PAGE se realizó entonces sobre las fracciones agrupadas de cada pico. Las bandas proteolíticas detectadas en los productos totales E/S del trematodo adulto usando GS-PAGE estuvieron presentes en cualquiera de los dos picos, 45 kDa o 15 kDa, no se asociaron proteinasas con el pico >150 kDa, el análisis por GS-PAGE del pico II de 45 kDa demostró que contenía varias proteinasas que variaban de 46 a 27,5 kDa; estas proteinasas guardan una correlación exacta con el grupo de 2 proteinasas descrito por Dalton and Heffernan, [Mol. Biochem. Parasitol. 35 (1989)] como poseedoras de una actividad óptima entre pH 4,5-8,0. El pico de 15 kDa constaba de varias proteinasas; estas enzimas mostraron tamaños moleculares aparentes sorprendentemente altos variando entre 60-90 kDa. Estas proteinasas guardan correlación con el grupo 1 de tiol-proteinasas descrito por Dalton and Heffernan, [íbidem] que tienen un pH óptimo para la actividad a pH 4,5.

Claramente, por tanto, la molécula de catepsina-L1, de la que se ha demostrado que tiene un peso molecular de 27 kDa por SDS-PAGE en condiciones reductoras, presenta diferentes pesos moleculares aberrantes dependiendo de la técnica usada, así por HPLC se observa un peso molecular anormalmente bajo mientras que por análisis por GS-PAGE autolisis y agregación parece dar varias bandas de peso molecular más alto.

7) Actividad tipo catepsina-L en los productos E/S de diferentes fases de la F. hepática

Las metacercarias de F. hepatica (cepa de Pfizer) enquistadas en celofán se separaron con una pipeta Pasteur y se añadieron a hipoclorito de sodio al 2%, se agitaron por vórtice y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Este procedimiento separa el cisto exterior de las metacercarias. Las metacercarias, ahora sólo con el cisto interior transparente, se colocaron en pocillos de microtitulación con una pipeta automática usando un estereomicroscopio y se lavaron con agua destilada. Se incubaron después en un medio preparado mezclando volúmenes iguales de HCl 0,05 M con una solución que contiene bicarbonato de sodio al 1%, NaCl al 0,8% y taurocolato de sodio al 0,2%. Después de 3 horas a 37ºC, 70-80% de los trematodos habían perdido el cisto y se movían activamente. Las formas juveniles desprovistas de cistos se separaron de los cistos interiores usando una pipeta automática de 20 \mul bajo un estereomicroscopio.

Se separaron los trematodos maduros de los conductos biliares de hígados bovinos obtenidos en un matadero. Los parásitos inmaduros se obtuvieron del hígado de ratas Wistar machos, tres y cinco semanas después de la infección con 20 metacercarias.

Las formas juveniles recientes sin cistos (NEJ), las de 3 semanas, las de 5 semanas y la F. hepatica madura se mantuvieron in vitro durante un periodo de 3 días. El medio de cultivo, cambiado diariamente, se ensayó entonces en cuanto a la actividad tipo catepsina-L usando el sustrato fluorógeno Z-phe-arg-AMC. La actividad tipo catepsina-L estaba presente en los productos E/S de todas las fases examinadas. Aunque la actividad tipo catepsina-L aumentó diariamente en los productos E/S de las formas NEJ, lo que indica un aumento de su secreción con el tiempo, la actividad de esta proteinasa en los E/S de todas las otras fases disminuyó en el mismo periodo de tiempo. La actividad de proteinasa en los E/S de cada fase del trematodo hepático se comparó usando tres sustratos peptídicos fluorógenos que contienen arginina. Estos sustratos se eligieron basándose en su afinidad por las enzimas catepsina lisosomiales; catepsina-L (Z-phe-arg-AMC), catepsina B (Z-arg-arg-AMC) y catepsina H (Z-arg-AMC). Solamente se detectó una actividad importante usando el sustrato Z-phe-arg-AMC y se obtuvieron resultados similares para todas las fases examinadas del trematodo hepático (Tabla 2 que sigue).

TABLA 2 Actividad específica frente a sustratos fluorógenos en los productos E/S de diferentes fases de desarrollo del trematodo hepático*

Sustrato	NEJ	3 semanas	5 semanas	Adultos
Z-phe-arg-AMC	25	29	90	1254
Z-arg-arg-AMC	0	0	2	21
Z-arg- AMC	1	3	5	63
* los valores representan la media de resultados duplicados en \mumol de AMC/min/mg

8) Actividad de escisión de los anticuerpos en los productos E/S

Como la IgG está implicada en la citotoxicidad celular, dependiente de los anticuerpos, frente a los parásitos helmínticos y ya que la catepsina-L1 de los trematodos adultos escinde la IgG2a de ratón [véase anteriormente], los productos E/S de los trematodos NEJ, de los trematodos de 3 semanas, de los trematodos de 5 semanas y de los trematodos adultos se ensayaron en cuanto a su actividad de escisión de los anticuerpos. Los productos E/S de todas las fases de F. hepatica examinados fueron capaces de escindir la IgG purificada en la región bisagra de la cadena pesada y de este modo liberar la porción Fc de las regiones de unión del anticuerpo. El inhibidor de la catepsina-L, Z-phe-ala-CHN_{2}, a una concentración final de 50 \muM inhibió completamente la actividad de escisión de la IgG en los productos E/S de los trematodos adultos y de los trematodos NEJ. El DMSO, a una concentración final de 1%, no inhibió la actividad de escisión de la IgG.

9) Efectos de los productos E/S y de la proteinasa catepsina-L1 sobre la adherencia de los eosinófilos

Usando un ensayo in vitro se examinó el posible papel de la catepsina-L1 de la F. hepatica en la prevención de la unión, mediada por anticuerpos, de los eosinófilos a las formas NEJ.

Veinte formas juveniles de F. hepatica recientes, privadas de los cistos, se añadieron a 100 \mul de una suspensión rica en eosinófilos de rata, en pocillos de microtitulación. De acuerdo con el experimento se añadieron alícuotas de 100 \mul o de suero inmune o de suero control con o sin los productos E/S o la catepsina-L1 purificada. En algunos experimentos se añadió el inhibidor de la cisteína-proteinasa, leupeptina a una concentración final de 5 \mug/ml. Todas las diluciones se hicieron en el Roswell Park Memorial Institute 1640 con 4% de suero fetal bovino inactivado por calor. Al final del experimento los trematodos juveniles se transfirieron cuidadosamente a un porta de microscopio y se examinaron microscópicamente con aumentos de 40X y 100X. Se examinaron los trematodos individuales y se contó el número de eosinófilos unidos. Aquellas formas NEJ con más de 20 células adheridas se consideraron positivas.

Cuando se añadieron poblaciones de células ricas en eosinófilos de rata a las formas NEJ en presencia de suero de rata inmune (IRS obtenido de ratas Wistar hembras infectadas oralmente con 30 metacercarias de F. hepatica; se recogió sangre después de 5 semanas de la infección; se agruparon los sueros obtenidos, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC hasta que fueron requeridos; el suero control se recogió de ratas no infectadas), la adherencia celular fue consistentemente alta (>90% positiva en las formas NEJ después de 2 horas, Fig. 4, panel A; la escala a lo largo de la base de la figura representa el porcentaje de formas NEJ positivas como se ha definido antes; las 5 barras representan los números a intervalos de 2 horas). Esta adherencia celular no fue observada en presencia de suero normal (Fig. 4, panel B) y por tanto se debe presumir que está mediada por los anticuerpos anti-NEJ. La máxima unión celular se registró después de 2 horas de incubación. La adición de productos E/S de trematodos NEJ o de trematodos maduros, junto con el suero inmune, dio como resultado una reducción > 70% del número de formas NEJ positivas en comparación con el suero inmune solo (Fig. 4, paneles C y D). Similarmente, la catepsina-L1 purificada evitó la adherencia de los eosinófilos (Fig. 4, panel E). Cuando se añadió el inhibidor de la cisteína-proteinasa, leupeptina, en presencia de suero inmune y o bien de los productos E/S de trematodos NEJ o de trematodos maduros o bien de la catepsina-L1 purificada, la adherencia de los eosinófilos fue similar a la obtenida usando suero inmune solo (Fig. 4, paneles A, F, G y H); por tanto la leupeptina inhibe el efecto de los productos E/S y de la catepsina-L1. La leupeptina añadida a las formas NEJ en cultivo no afectó a su viabilidad (no se muestran datos) aunque en presencia de suero inmune reduce ligeramente la velocidad a la que se pierden los eosinófilos de la superficie de las formas NEJ (Fig. 4, panel I). Cuando se añadió la catepsina-L1 purificada al ensayo 2 horas después de la adición de suero inmune, con lo que se había permitido que los eosinófilos se adhirieran inicialmente, estos eosinófilos adheridos fueron separados rápidamente de la superficie de las formas NEJ (Fig. 4, panel F, compárese con los paneles A y E).

10) Ensayos en ganado vacuno

Se mantuvieron dieciocho animales estabulados. Se dividieron los animales en 5 grupos, A, B, C, D y E, cada uno de tres o cuatro reses y se les dejó aclimatarse durante un periodo de 7 días. La inmunización primaria tuvo lugar el día 0. Los animales del grupo A eran testigos negativos y recibieron 150 \mug de ferritina de bazo de caballo, los grupos B, C, D y E, recibieron respectivamente 10, 50, 200 y 500 \mug de catepsina-L1 preparada como se ha descrito en el apartado (1) anterior, todas por inyección. Las inmunizaciones primarias fueron acompañadas de adyuvante completo de Freund (FCA). Veintiocho días más tarde todos los animales recibieron una inmunización secundaria y también una vacunación terciaria en el día 56. Estas vacunaciones fueron acompañadas de adyuvante incompleto de Freund (FIA). Los títulos de anticuerpos se monitorizaron a lo largo de este periodo,. El día 76 todos los animales recibieron 25 ml de levamisol después de que se encontraron huevos de nematodos en las muestras fecales de algunos de ellos.

El día 84 todos los grupos de ganado recibieron un enfrentamiento exógeno de aproximadamente 500 metacercarias de trematodos hepáticos administradas en cápsulas de gelatina mediante una pistola de dosificación (la F. hepatica provenía del Reino Unido). El progreso de la infección fue monitorizado por medio de los niveles de enzimas en la sangre y por el número de huevos fecales.

Sumario de los grupos de animales

ID del grupo	Número de animales	Vacunación
A	4	\hskip5mm 150 \mug ferritina de bazo de caballo
B	4	\hskip6mm 10 \mug Catepsina-L1
C	4	\hskip6mm 50 \mug Catepsina-L1
D	3	\hskip5mm 200 \mug Catepsina-L1
E	3	\hskip5mm 500 \mug Catepsina-L1

Todos los animales respondieron a la inmunización como se determinó por el ensayo ELISA - después del enfrentamiento todos los animales mostraron aumento en los niveles séricos de glutámico-deshidrogenasa y de glutamil-gammatransferasa, indicativos del daño causado por los trematodos hepáticos en el parénquima hepático y en el conducto biliar, respectivamente. Solamente los animales del grupo testigo mostraron huevos en las heces.

11) Purificación de la catepsina-L2

Se lavaron los trematodos, se cultivaron y el medio de cultivo se centrifugó como se ha descrito antes para la catepsina-L1. Se descongelaron 500 ml de los productos E/S y se concentraron hasta un volumen de 10 ml en un concentrador Amicon 8400 (Amicon, W1, USA) usando una membrana Amicon YM3 (que excluye un peso molecular de 3.000 Da) y se aplicaron a una columna de filtración en gel que contenía resina Sephacryl S-200HR (1,9 cm x 42 cm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrada con Tris-HCl 0,1 M pH 7 a 4ºC. Se eluyó la columna con Tris-HCl 0,1 M pH 7 y se recogieron 70 fracciones de 5 ml. Se agruparon las fracciones que contienen actividad de catepsina-L2, ensayadas usando el sustrato fluorógeno Tos-Gly-Pro-Arg-AMC en glicina 0,1 M a pH 7, en un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin Elmer con una longitud de onda de excitación de 370 nm y un filtro de emisión fijado a 440 nm.

La fracción de Sephacryl S200 se aplicó a una columna de QAE Sephadex de 50 ml (2,5 cm x 10,0 cm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrada con Tris-HCl 0,1 M pH 7. La columna de QAE Sephadex se lavó con 300 ml de Tris-HCl 0,1 M pH 7 y 150 ml de NaCl 75 mM en Tris-HCl 0,1 M pH 7 y seguidamente se eluyó con 250 ml de NaCl 0,4 M en Tris-HCl 0,1 M pH 7. Se recogieron fracciones de 5 ml de cada lavado y de cada etapa de elución (180 fracciones en total). Se agruparon aquellas fracciones en las que se encontró que contenían actividad de escisión de Tos-Gly-Pro-Arg-AMC (fracción QAE400). La fracción QAE400 se concentró entonces hasta 20 ml en un concentrador Amicon 8400 usando una membrana YM3 y después se diluyó con agua destilada hasta un volumen de 100 ml. La fracción QAE400 diluida se concentró después hasta un volumen final de 10 ml que contenía una concentración de NaCl calculada como de aproximadamente 80 mM. La fracción QAE400 concentrada se almacenó en 10 alícuotas de 1 ml a -80ºC.

La homogeneidad de la catepsina-L2 purificada se determinó usando geles SDS-PAGE desnaturalizantes que contienen 12% de poliacrilamida. La catepsina-L2 purificada migra como una única banda de 29,5 kDa sobre un gel SDS-PAGE reductor (Figura 5C, pista 1 marcadores de peso molecular, pista 2 productos E/S de trematodos adultos, pista 3 catepsina-L2 purificada).

Se realizó la zimografía usando geles PAGE al 12% según el método de Dalton and Heffernan, Mol. Biochem. Parasitol. 35 (1989), p. 161-166, tanto en presencia como en ausencia de SDS. El análisis en presencia de SDS muestra que la enzima migra como 4 bandas que se observan también en los productos E/S totales de los trematodos adultos (Figura 5A, pista 1 productos E/S de trematodos adultos, pista 2 catepsina-L2 purificada). Sin embargo, la zimografía en ausencia de SDS muestra que la catepsina-L2 purificada migra como una única banda proteolítica (Figura 5B, pistas como en la Figura 5A).

12) Análisis de la secuencia amino-terminal

Un alícuota de 5,4 ml de los productos E/S (5 mg de proteínas aproximadamente) se concentró hasta 200 \mul por liofilización. Se aplicaron 40 \mul de muestra concentrada a un gel SDS-PAGE al 12% no desnaturalizante y se sometieron a electroforesis como se ha descrito antes. Después de la electroforesis se incubó el gel durante 30 minutos en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM y metanol al 10% (v/v)). Una tira de membrana (10 cm x 4,5 cm) de PVDF (Problott) se sumergió en metanol durante 10 segundos seguido por equilibración en tampón de transferencia durante 5 minutos. Las proteínas separadas se transfirieron a la membrana PVDF usando un aparato de electrotransferencia semiseca (Atto corp. Tokyo, Japan) según las instrucciones de los fabricantes. Se tiñó la membrana y se destiñó y se secó por aire y la bandas proteínicas de interés se cortaron y se secuenciaron en un secuenciador de proteínas Applied Biosystems 477A en la Universidad de Cambridge.

La secuencia N-terminal se da a continuación en la Tabla 3 alineada con las secuencias N-terminal determinadas para la catepsina-L1 de F. hepatica, la catepsina-L del hígado de pollo, rata y humano, la catepsina S de bazo bovino, una proteasa tipo catepsina-L de T. cruzi (cruzipaína) y la catepsina B de S. mansoni. Se puede ver que la catepsina-L1 tiene un 93% de homología con la catepsina-L2 (un aminoácido, arginina de la posición 7 en la catepsina-L2 reemplaza a la prolina de la posición 7 en la catepsina-L1). La catepsina-L2 tiene solamente 47% de homología con la catepsina-L de hígado de pollo, la catepsina-L de hígado de rata y la catepsina-L de hígado humano, 47% de homología con la catepsina S de bazo bovino, 40% de homología con la proteasa tipo catepsina-L de T. cruzi (cruzipaína) y 20% de homología con la catepsina B de S. mansoni.

Por contraste con la estructura de dos cadenas que se sabe que existe para la catepsina-L de los mamíferos, el hallazgo de una única secuencia de aminoácidos en N-terminal tanto para la catepsina-L1 como para la catepsina-L2 implica la presencia de una única cadena. Sin embargo es posible que esté presente una segunda cadena bloqueada en el N-terminal.

2

13) Estudios cinéticos

Las constantes cinéticas de las enzimas catepsinas L1 y L2 de F. hepatica se determinaron para 11 sustratos diferentes: Z-Phe-Arg-AMC, Bz-Phe-Val-Arg-AMC, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, H-Leu-Val-Tyr-AMC, Tos-Gly-Pro-Lys-AMC, Tos-Gly-Pro- Arg-AMC, Boc-Val-Pro-Arg-AMC, Z-Arg-Arg-AMC, Z-Arg-AMC, Suc-Ala-Phe-Lys-AMC y Boc-Val-Leu-Lys-AMC. Se disolvió 1 mg de sustrato fluorógeno en 100 \mul de dimetilformamida. Esta solución stock se diluyó en glicina 0,1 M pH 7,0 para alcanzar la concentración deseada de sustrato. Cada concentración de sustrato se preparó por triplicado y el volumen final de ensayo fue 1,0 ml. Incluidos en la alícuota de 1 ml había 20 \mul de enzima y 50 \mul de ditiotreitol 10 mM. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 30 minutos antes de parar la reacción con la adición de 200 \mul de ácido acético 1,7 M. Se ensayaron las muestras en cuanto a la 7-amino-metilcumarina liberada, como anteriormente. Las constantes cinéticas V_{max}4 y K_{m} se obtuvieron por regresión no lineal según el método de Barrett et al. (Biochem. J. 201, p. 189-198) excepto que 20 \mul de catepsina-L2 se incubaron con 20 \mul de E-64 de 1,0 \muM - 0,1 \muM en un volumen final de 80 \mul de glicina 0,1 M pH 7,0 durante 30 minutos a 37ºC. Se incubaron 20 \mul de catepsina-L1 1/10 con 20 \mul de E-64 de 5 \muM - 0,5 \muM en un volumen final de 80 \mul de glicina 0,1 M pH 7,0 durante 30 minutos a 37ºC. Todas las muestras incubadas se ensayaron para el sustrato fluorógeno Z-Phe-Arg-AMC como antes.

Los resultados de las constantes cinéticas se muestran en la Tabla 4. Los datos muestran que ambas enzimas prefieren el sustrato Boc-Val-Leu-Lys-AMC teniendo la catepsina-L2, 2,5 veces la afinidad (k_{cat}/K_{m}) para Boc-Val-Leu-Lys-AMC de la catepsina-L1. El segundo mejor sustrato fue Z-Phe-Arg-AMC teniendo la catepsina-L2, una afinidad 2 veces más alta para este sustrato que la catepsina-L1. La catepsina-L2 escinde los sustratos fluorógenos H-Leu-Val-Tyr-AMC, Bz-Phe-Val-Arg-AMC, Tos-Gly-Pro-Lys-AMC, Tos-Gly-Pro-Arg-AMC y Boc-Val-Pro-Arg-AMC con afinidades similares (k_{cat}/K_{m}= 38-113 10^{-3}M^{-1}.S^{-1}). La catepsina-L1 no escinde estos sustratos en un grado significativo (k_{cat}/K_{m}= 0,26-3,89 10^{-3}M^{-1}.S^{-1}).

TABLA 4 Estudios enzimáticos cinéticos de las catepsinas L1 y L2 de F. hepatica

Enzima	Sustrato	K_{M}	K_{cat}	K_{cat}/K_{M}
		(\muM)	(s^{-1})	(10^{3}s^{-1}.M^{-1})
Catepsina-L2	z- Arg-AMC	14,08	0,09	6,39
	z-Arg-Arg-AMC	9,07	0,02	2,21
	z-Phe-Arg-AMC	3,76	0,56	148,9
	Bz-Phe-Val-Arg-AMC	1,20	0,06	45,83
	H-Leu-Val-Tyr-AMC	3,75	0,21	55,47
	Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC	23,33	0,08	3,25
	Boc-Val-Pro-Arg-AMC	24,81	1,19	47,96
	Tos-Gly-Pro-Arg-AMC	17,06	1,93	113,3
	Tos-Gly-Pro-Lys-AMC	35,49	1,37	38,60
	Suc-Ala-Phe-Lys-AMC	41,15	0,14	3,40
	Boc-Val-Leu-Lys-AMC	7,34	3,75	510,9
Catepsina-L1	Z- Arg-AMC	20,36	0,04	2,16
	Z-Arg-Arg-AMC	65,60	0,002	0,03
	Z-Phe-Arg-AMC	14,68	1,08	73,57
	Bz-Phe-Val-Arg-AMC	9,25	0,03	3,03
	H-Leu-Val-Tyr-AMC	5,40	0,02	3,89
	Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC	38,48	0,01	0,34
	Boc-Val-Pro-Arg-AMC	43,60	0,02	0,46
	Tos-Gly-Pro-Arg-AMC	26,04	0,03	1,23
	Tos-Gly-Pro-Lys-AMC	106,9	0,03	0,26
	Suc-Ala-Phe-Lys-AMC	65,32	0,05	0,77
	Boc-Val-Leu-Lys-AMC	34,70	7,90	227,7

14) Secuencias de DNA de la catepsina-L de F. hepatica, genes de la catepsina-L en otros parásitos helmínticos

Las secuencias de DNA se obtuvieron por amplificación de cDNA de F. hepatica usando las técnicas convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias se muestran en las figuras 6-8 con los aminoácidos que ellas codifican. El DNA genómico de otros parásitos helmínticos se exploró con la secuencia JDCLONEC de F. hepatica que se muestra en la Figura 6, usando la técnica de transferencia Southern y condiciones de moderada astringencia. Se observaron bandas en los canales del gusano del corazón (Dirofilaria immitis) y del gusano barrenador (Lucilia cuprina) indicando respectivamente una fuerte y una débil hibridación.

La Figura 9 es una autorradigrafía de un experimento de este tipo en la cual la columna "A" son marcadores \lambda Hind, las columnas B, C y D son DNA genómicos de F. hepatica, Lucilia cuprina y Dirofilaria immitis; las columnas E, F y G son DNA genómicos bovinos, ovinos y caninos; y finalmente la columna H son marcadores \lambda Hind de nuevo.

Claims (4)

1. Una vacuna para combatir una infestación parasitaria de Fasciola hepatica en un mamífero, en la que el material antigénico comprende la proteasa catepsina-L1 de Fasciola hepatica que tiene un peso molecular de 27 kDa determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio en condiciones reductoras y una secuencia N-terminal A V P D K I D P R E S G y/o la proteasa catepsina-L2 de Fasciola hepatica que tiene un peso molecular de 29,5 kDa determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio en condiciones reductoras y una secuencia N-terminal A V P D K I D R R E S G, en una forma al menos parcialmente purificada, o uno de sus fragmentos o epítopos antigénicos, junto con un vehículo y/o adyuvante.

2. Una vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho material antigénico comprende de 75% a 100% de las proteínas totales de excreción/secreción del helminto, presentes.

3. Un procedimiento para la preparación de una vacuna según la reivindicación 1, que comprende poner en asociación dicho material antigénico y uno o más adyuvantes y/o vehículos.

4. El uso del material antigénico como se define en la reivindicación 1, en la fabricación de una vacuna para combatir una infestación parasitaria de Fasciola hepatica en un mamífero.