ES2199964T3 - Composiciones relativas a canales de calcio humanos y procedimientos de uso. - Google Patents
Composiciones relativas a canales de calcio humanos y procedimientos de uso.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN ADN AISLADO QUE CODIFICA CADA UNA DE LAS SUBUNIDADES {AL}{SUB,1}, {AL}{SUB,2}, {BE} Y {GA} DE UN CANAL DE CALCIO HUMANO, INCLUIDAS LAS SUBUNIDADES QUE SURGEN A MODO DE VARIANTES DE UNION DE TRANSCRIPCIONES PRIMARIAS. EN PARTICULAR SE PRESENTAN CLONAS DE ADN QUE CODIFICAN CADA UNA DE LAS SUBUNIDADES {AL}{SUB,1A-1}, {AL}{SUB,1A-2}, {AL}{SUB,1E-1}, {AL}{SUB,1C-2}, {AL}{SUB,1E-3}, {BE}{SUB,3-1}, {BE}{SUB,2C}, {BE}{SUB,2D}, {BE}{SUB,2E Y {BE}{SUB,4} DE LOS CANALES DE CALCIO HUMANOS. TAMBIEN SE PRESENTAN LAS CELULAS Y VECTORES QUE CONTIENEN EL ADN, ANTICUERPOS ESPECIFICOS A LAS SUBUNIDADES, Y SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS Y METODOS PARA IDENTIFICAR LOS COMPUESTOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE LOS CANALES DE CALCIO HUMANOS.
Description
Composiciones relativas a canales de calcio
humanos y procedimientos de uso.
La presente invención se refiere a biología
molecular y farmacología. Más particularmente, la invención se
refiere a las composiciones de canales de calcio y procedimientos
de preparación y uso de los mismos.
Los canales de calcio son proteínas de múltiples
subunidades pertenecientes a las membranas que permiten la entrada
controlada de iones Ca^{2+} en el interior de las células desde
el fluido extracelular. Las células del reino animal y al menos
algunas bacterias, hongos y células de plantas, poseen uno o más
tipos de canal de calcio.
El tipo más común de canal de calcio es
dependiente de voltaje. "La apertura" de un canal dependiente
de voltaje que permite una afluencia de iones Ca^{+2} en el
interior de las células requiere una despolarización hasta un
cierto nivel de diferencia de potencial entre el interior de la
célula que soporta el canal y el medio extracelular que baña la
célula. La velocidad de afluencia de Ca^{+2} en el interior de
las célula depende de esta diferencia de potencial. Todas las
células "excitables" en animales, tales como las neuronas del
sistema nervioso central (abreviadamente SNC), las células
nerviosas periféricas y las células musculares incluyendo las de los
músculos esqueléticos, músculos cardíacos y músculos lisos de las
venas y arterias tienen canales de calcio dependiente de
voltaje.
Se han identificado múltiples tipos de canales de
calcio en células de mamíferos de diversos tejidos, incluyendo el
músculo esquelético, el músculo cardíaco y el cerebro [véase, por
ejemplo, Bean, B. P. (1989) Ann. Rev. Physiol. 51:
367-384 y Hess, P. (1990) Ann. Rev. Neurosci. 56:
337].Se han catalogado ampliamente los diferentes tipos de canales
de calcio en cuatro clases, tipo L-, T-, N- y P- distinguidos por la
cinética de corriente que mantiene una sensibilidad al potencial y
sensibilidad a los agonistas y antagonistas de los canales de
calcio.
Los canales de calcio son proteínas de múltiples
subunidades que contienen dos grandes subunidades, designadas
\alpha_{1} y \alpha_{2}, que tienen pesos moleculares entre
aproximadamente 130 y aproximadamente 200 kilodaltons
(abreviadamente "kD"), y de una a tres subunidades más pequeñas
de menos de aproximadamente 60kD de peso molecular. Al menos una de
las subunidades mayores y posiblemente alguna de las subunidades más
pequeñas están glicosiladas. Algunas de las subunidades son capaces
de estar fosforiladas. La subunidad \alpha_{1} tiene un peso
molecular entre aproximadamente 150 y aproximadamente 170 kD cuando
se analiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
(abreviadamente PAGE) con dodecilsulfato sódico (abreviadamente SDS)
después del aislamiento a partir de tejido muscular de mamíferos y
tiene sitios de unión específicos para diversas
1,4-dihidropiridinas (abreviadamente DHPs) y
fenilalquilaminas. En condiciones no reductoras (en presencia de
N-etimaleimida) la subunidad \alpha_{2} migra en
SDS-PAGE en forma de una banda que corresponde a un
peso molecular de aproximadamente 160-190 kD. En
condiciones de reducción, se liberan un gran fragmento y fragmentos
más pequeños. La subunidad \beta en el canal de calcio del músculo
esquelético de conejo es una proteína fosforilada que tiene un peso
molecular de 52-65 kD según se determina mediante
análisis SDS-PAGE. Esta subunidad es insensible a
las condiciones de reducción. La subunidad \gamma del canal de
calcio, que no se observa en todas las preparaciones purificadas,
parece ser una glicoproteína con un peso molecular aparente de
30-33 kD, según se determina mediante análisis
SDS-PAGE.
Con el fin de estudiar la estructura y función de
los canales de calcio, se necesitan grandes cantidades de proteínas
puras de los canales de calcio. Debido a la naturaleza compleja de
esta proteínas de múltiples subunidades, las concentraciones
variables de canales de calcio en estas fuentes de tejidos de la
proteína, la presencia de poblaciones mezcladas de canales de calcio
en los tejidos, las dificultades para la obtención de tejidos de
interés y las modificaciones de la proteína nativa que se puede
producir durante el procedimiento de aislamiento, es extremadamente
difícil obtener grandes cantidades de proteína de canales de calcio
altamente purificada y completamente intacta.
La caracterización de un tipo particular del
canal de calcio mediante el análisis de las células enteras se
restringe drásticamente debido a la presencia de las poblaciones
mezcladas de los diferentes tipos de los canales de calcio en la
mayoría de las células. Los procedimientos de registro de canales
únicos que se usan para examinar los canales de calcio individuales
no revelan ninguna información referente a la estructura molecular
de la composición bioquímica del canal. Además, al realizar este
tipo de análisis, el canal se aísla de otros constituyentes
celulares que pueden ser importantes para las funciones naturales e
interacciones farmacológicas.
La caracterización del gen o los genes que
codifican los canales de calcio proporcionan otros medios de
caracterización de los diferentes tipos de canales de calcio. La
secuencia de aminoácidos determinada a partir de una secuencia de
nucleótidos completa de la región codificadora de una proteína de
los canales de calcio representa la estructura primaria de la
proteína. Además, la estructura secundaria de la proteína de los
canales de calcio y la relación de la proteína a la membrana se
puede predecir en función de los análisis de la estructura
primaria. Por ejemplo, los estudios hidropáticos de la subunidad
\alpha_{1} de la proteína del canal de calcio del músculo
esquelético de conejo indican que contiene cuatro repeticiones
internas, conteniendo cada una seis regiones que teóricamente son
transmembrana [Tanabe, T y col., (1987) Nature 328: 313].
Debido a que los canales de calcio están
presentes en diversos tejidos y tienen un papel central en la
regulación de los iones de calcio intracelulares están implicados
en numerosos procesos vitales, que incluyen la liberación de
neurotransmisores, contracción muscular, actividad de marcapasos y
secreción de hormonas y otras sustancias. Estos procesos parecen
estar implicados en numerosos trastornos del ser humano, tales como
enfermedades del SNC y cardiovasculares. Se creía que numerosos
compuestos útiles para tratar diversas enfermedades cardiovasculares
en animales, incluyendo los seres humanos, que ejercen sus efectos
beneficiosos para modular las funciones de los canales de calcio
dependientes de voltaje presentes en el músculo liso cardíaco y/o
vascular. Muchos de estos compuestos se unen a los canales de calcio
y bloquean, o reducen la velocidad de, afluencia de Ca^{+2} en el
interior de las células en respuesta a la despolarización de la
membrana celular.
Los resultados de los estudios de expresión
recombinante de los clones de cDNA que codifican la subunidad
\alpha_{1} de los canales de calcio en conejo y transcriptos de
los clones de cDNA indican que la subunidad \alpha_{1} forma el
poro a través del cual entra el calcio en las células. La
relevancia de las corrientes de bario generadas en estas células
recombinantes a la corriente real generada por los canales de calcio
que contienen como un componente las respectivas subunidades
\alpha_{1} in vivo no es clara. Sin embargo, con el fin de
caracterizar completa y exactamente, y evaluar los tipos diferentes
de canales de calcio es esencial examinar las propiedades
funcionales de los canales recombinantes que contienen todas las
subunidades como se encontraron in vivo.
Con el fin de llevar a cabo este examen y
entender completamente la estructura y función de los canales de
calcio, es crítico identificar y caracterizar tantas canales de los
canales de calcio como sean posibles. También, con el fin de
preparar las células recombinantes para uso en la identificación de
los compuestos que interactúan con los canales de calcio es
necesario poder producir células que expresan poblaciones uniformes
de los canales de calcio que contienen las subunidades
definidas.
La comprensión de la farmacología de los
compuestos que interactúan con los canales de calcio en otros
sistemas de órganos, tales como el SNC, puede ayudar en el diseño
racional de los compuestos que interactúan específicamente con los
subtipos de los canales de calcio humanos que tienen los efectos
terapéuticos deseados, tales como en el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos y cardiovasculares. Dicho entendimiento y la
capacidad de diseñar racionalmente los compuestos eficaces
terapéuticamente, sin embargo, se han obstaculizado por la
incapacidad de determinar independientemente los tipos de canales de
calcio humanos y la naturaleza molecular de los subtipos
individuales, particularmente en el SNC y mediante la
indisponibilidad de las preparaciones puras de los subtipos de
canales específicos para uso en la evaluación de la especificidad de
los compuestos que llevan a cabo los canales de calcio. De este
modo, la identificación de DNA que codifica las subunidades de los
canales de calcio humanos y el uso de dicho DNA para la expresión de
las subunidades de los canales de calcio y de los canales de calcio
funcionales ayudaría en la selección y diseño de los compuestos
terapéuticamente eficaces.
Por lo tanto, un objeto de esta memoria
descriptiva, proporcionar DNA que codifica las subunidades de
canales de calcio específicos y proporcionar las células
eucarióticas que soporten los canales de tejidos específicos o de
subtipos específicos. También es un objeto proporcionar ensayos para
la identificación de compuestos potencialmente terapéuticos que
actúan como antagonistas y agonistas de los canales de calcio.
Se proporcionan los fragmentos de ácidos
nucleicos aislados y purificados que codifican las subunidades de
los canales de calcio. Se proporcionan el DNA que codifica las
subunidades \alpha_{1} de un canal de calcio humano y RNA que
codifica dichas subunidades se preparan tras la transcripción de
dicho DNA. Se proporcionan los fragmentos de DNA que codifican las
subunidades \alpha_{1} de los canales de calcio humanos
dependientes de voltaje (abreviadamente VDCC) de tipo A, tipo B
(también llamadas VDCC IV), tipo C (también llamadas VDCC II), tipo
D (también llamadas VDCC III) y tipo E.
Se proporciona el DNA que codifica las
subunidades \alpha_{1A}, \alpha_{1B}, \alpha_{1C},
\alpha_{1D} y \alpha_{1E} se proporciona el DNA que codifica
una subunidad \alpha_{1D} que incluye los aminoácidos expuestos
como los residuos 10-2161 de la SEC ID Nº 1. También
se proporciona el DNA que codifica una subunidad \alpha_{1D} que
incluye los aminoácidos expuestos como los aminoácidos
1-34 de la SEC ID Nº 2 en lugar de los aminoácidos
373-406 de la SEC ID Nº 1. También se proporciona el
DNA que codifica una subunidad \alpha_{1C} que incluye los
aminoácidos expuestos sustancialmente en la SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº
6 y DNA que codifica una subunidad \alpha_{1B} que incluye una
secuencia de aminoácidos sustancialmente expuestos en la SEC ID Nº 7
o SEC ID Nº 8.
También se proporciona las subunidades que
codifican las subunidades \alpha_{1A}. Dicho DNA incluye DNA que
codifica una subunidad \alpha_{1A} que tiene sustancialmente la
misma secuencia de aminoácidos como la codificada por el DNA
expuestos en la SEC ID Nº 22 o Nº 23 u otras variantes de esplicing
de \alpha_{1A} que incluye toda o parte de la secuencia expuesta
en la SEC ID Nº 22 ó 23. La secuencia expuesta en la SEC ID Nº 22 es
una variable de esplicing denominada
\alpha_{1A-1}; y la secuencia expuesta en la SEC
ID Nº 23 es una variable de esplicing denominada
\alpha_{1A-2}. El DNA que codifica las
subunidades \alpha_{1A} también incluye DNA que codifica
subunidades que pueden aislarse usando toda o una porción del DNA
que tiene la SEC ID Nº 21, 22 ó 23 o DNA obtenida del lisado de
fago de un hospedador de E. coli que contiene DNA que
codifica una subunidad \alpha_{1A} que se ha depositado en la
Colección Americana de Cultivos tipo, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852 Estados Unidos con el número de acceso
75293 según el tratado de Budapest. El DNA en dicho fago incluye un
fragmento de DNA que tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 21.
Este fragmento se hibridiza selectivamente en condiciones de alta
rigurosidad al DNA que codifica \alpha_{1A} pero no al DNA que
codifica \alpha_{1B} y, de este modo, se puede usar para aislar
el DNA que codifica las subunidades \alpha_{1A}.
También se proporciona el DNA que codifica las
subunidades \alpha_{1E} de un canal de calcio humano. Este DNA
incluye DNA que codifica una variante de esplicing de \alpha_{1E}
designada \alpha_{1E-1} codificada por el DNA
expuesto en la SEC ID Nº 24 y una variante designada
\alpha_{1E-3} codificada por la SEC ID Nº 25.
Este DNA también incluye otras variantes de esplicing del mismo que
codifica las secuencias de aminoácidos codificados por toda una
porción de las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEC ID Nº
24 y 25 y DNA que se hibridiza en condiciones de alta rigurosidad al
DNA de la SEC ID Nº 24 ó 25 y que codifica una variante de esplicing
\alpha_{1E}.
Se proporcionan el DNA que codifica las
subunidades \alpha_{2} de un canal de calcio humano y el RNA que
codifica dichas subunidades, realizadas tras la transcripción de
dicho DNA. También se proporciona el DNA que codifica las variantes
de esplicing de la subunidad \alpha_{2}, incluyendo las variantes
de esplicing de tejido específico. En particular, se proporciona el
DNA que codifica los subtipos de las subunidades
\alpha_{2a}-\alpha_{2e}. En las realizaciones
particularmente preferidas, se proporciona el DNA que codifica la
subunidad \alpha_{2} que se produce mediante un procedimiento
alternativo de un transcripto primario que incluye DNA que codifica
los aminoácidos expuestos en la SEC ID Nº 11 y el DNA de la SEC ID
Nº13 insertados entre los nucleótidos 1624 y 1625 de la SEC ID Nº
11. El DNA y las secuencias de aminoácidos de
\alpha_{2a}-\alpha_{2e} se exponen en la SEC IN
números 11 (\alpha_{2a}), 29 (\alpha_{2a}) y 30 a 32
(\alpha_{2c}-\alpha_{2c}) respectivamente.
Se proporcionan los fragmentos de DNA aislados y
purificados que codifican las subunidades \beta de los canales de
calcio que incluyen DNA que codifica las subunidades \beta_{1},
\beta_{2}, \beta_{3} y \beta_{4} y las variantes de las
subunidades \beta. También se proporciona el RNA que codifica las
subunidades \beta, realizadas tras la transcripción del DNA.
También se proporciona el DNA que codifica la
subunidad \beta_{1} que se produce mediante procedimientos
alternativos de una transcripción primaria que incluye el DNA que
codifica los aminoácidos expuestos en la SEC ID Nº 9, pero que
incluye el DNA expuesto en la SEC ID Nº 12 insertado en lugar de los
nucleótidos 615-781 de la SEC ID Nº 9. También se
proporcionan el DNA que codifica las subunidades \beta_{1} que se
codifican por los transcritos que tienen la secuencia expuesta en
la SEC ID Nº 9 incluyendo el DNA expuesto en la SEC ID Nº 12
insertado en lugar de los nucleótidos 615-781 de la
SEC ID Nº 9, pero carece de uno o más de las siguientes secuencias
de nucleótidos: los nucleótidos 14-34 de la SEC ID
Nº 12, los nucleótidos 35-55 de la SEC ID Nº 12, los
nucleótidos 56-190 de la SEC ID Nº 12 y nucleótidos
191-271 de la SEC ID Nº 12. En particular, se
proporcionan las variantes
\beta_{1-1}-\beta_{1-5}
de esplicing de la subunidad \beta_{1} (véase la SEC ID números
9, 10 y 33-35) descritas más adelante.
Se proporcionan las variantes
\beta_{2c}-\beta_{2e} de esplicing de la
subunidad \beta_{2} que incluyen toda o una porción de las SEC ID
números 26, 37 y 38; se proporcionan las variantes de esplicing de
la subunidad \beta_{3} que incluyen las variante de esplicing de
la subunidad \beta_{3} que tienen las secuencias expuestas en las
SEC ID números 19 y 20, y se proporcionan el DNA que codifica la
subunidad \beta_{4} que incluye el DNA que tiene la secuencia
expuesta en la SEC ID Nº 27 y la secuencia de aminoácidos expuesta
en la SEC IN Nº 28.
También las células hospedadoras de
Escherichia coli (abreviadamente E. coli) que albergan
plásmidos que contienen DNA que codifican \beta_{3} se han
depositado de acuerdo al tratado de Budapest con el número de acceso
69048 en la Colección Americana de Cultivos Tipo. El clon depositado
comprende los nucleótidos 122c-457 en la SEC ID Nº
19 y 107-443 en la SEC ID Nº 20.
El DNA que codifica las subunidades \beta que
se producen mediante un procedimiento alternativo de un transcrito
primario que codifica una subunidad \beta, incluyendo un
transcrito que incluye un DNA que codifica los aminoácidos
expuestos en la SEC ID Nº 9 o que incluye un transcrito primario que
codifica \beta_{3} depositado en ATCC con el número de acceso
69048, pero careciendo de e incluyendo exones alternativos se
proporcionan o se pueden construir a partir del DNA proporcionado
en esta memoria descriptiva.
Se proporcionan los clones de DNA de longitud
completa y los correspondientes tanscritos de RNA que codifican
\alpha_{1}, incluyendo las variantes de esplicing de
\alpha_{1a}, \alpha_{1D}, \alpha_{1B}, \alpha_{1C} y
\alpha_{1E}, subunidades \alpha_{2} y \beta, que incluyen
\beta_{1-1}-\beta_{1-5},
\beta_{2C}, \beta_{2D}, \beta_{2E},
\beta_{3-1} y \beta_{4} de canales de calcio
humanos. También se proporcionan los clones de DNA que codifican
las porciones sustanciales de las subunidades del subtipo
\alpha_{1C} y subunidades \gamma de los canales de calcio
humanos dependientes de voltaje para la preparación de clones de DNA
de longitud completa que codifican las subunidades de longitud
completa correspondientes. Los clones de longitud completa se
pueden obtener fácilmente usando el DNA descrito como una sonda
como se describe en esta memoria descriptiva.
La subunidad \alpha_{1A}, la subunidad
\alpha_{1C}, la subunidad \alpha_{1E} y variantes de esplicing
de las mismas, las subunidades \beta_{2D}, \beta_{2C} y
\beta_{2E} y \beta_{4} y ácidos nucleicos que codifican estas
subunidades son de particular interés en esta memoria
descriptiva.
Se proporcionan las células eucarióticas que
contienen DNA heterólogo que codifican una o más subunidades de los
canales de calcio, particularmente subunidades de los canales de
calcio humanos, o que contienen los transcritos de RNA de clones de
DNA que codifican una o más de las subunidades. Una sola subunidad
\alpha_{1} puede formar un canal. La combinación de requisitos de
las subunidades para la formación de canales activos se selecciona
de células, sin embargo, se puede determinar empíricamente
utilizando los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva.
Por ejemplo, si un subtipo o variante de \alpha_{1} seleccionado
no forma un canal activo en una línea celular seleccionada, se
puede añadir una subunidad o subunidades adicionales hasta que se
forme un canal activo.
En las realizaciones preferidas las células
contienen DNA o RNA que codifican una subunidad
\alpha_{1E-3} humana. En realizaciones más
preferidas, las células contienen DNA o RNA que codifican las
subunidades heterólogas adicionales, que incluyen al menos una
subunidad \beta o \alpha_{2}. En dichas realizaciones, se
proporcionan las células eucarióticas transfectadas establemente o
temporalmente con cualquier combinación de uno, dos, tres o cuatro
de los clones de DNA que codifican las subunidades, tales como DNA
que codifica cualquiera de \alpha_{1}, \alpha_{1} + \beta,
\alpha_{1} + \beta + \alpha_{2}.
Las células eucarióticas proporcionadas en esta
memoria descriptiva contienen DNA heterólogo que codifica una
subunidad \alpha_{1} o DNA heterólogo que codifica una subunidad
\alpha_{1} y DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta.
Al menos una subunidad seleccionada es una subunidad
\alpha_{1E-3}, \beta_{2C}, \beta_{2D},
\beta_{2E} o una \beta_{4}. En las realizaciones preferidas las
células expresan dichos canales de calcio heterólogos e incluyen
una o más de las subunidades en los canales de calcio heterólogos
que pertenecen a las membranas. En las realizaciones más
preferidas, las células eucarióticas expresan los canales de calcio
funcionales y heterólogos que son capaces de activar la puerta del
paso de los iones selectivos de los canales de calcio y/o
compuestos de unión que, a concentraciones fisiológicas, modulan la
actividad del canal de calcio heterólogo. En ciertas realizaciones,
los canales de calcio heterólogos incluyen al menos una subunidad
de los canales de calcio heterólogos. En las realizaciones más
preferidas, los canales de calcio que se expresan en la superficie
de células eucarióticas se componen sustancialmente o completamente
de subunidades codificadas por DNA o RNA heterólogos. En las
realizaciones preferidas, los canales de calcio heterólogos de
dichas células se distinguen de cualquiera de los canales de calcio
endógenos de la célula hospedadora. Dichas células proporcionan un
medio para obtener poblaciones homogéneas de los canales de calcio.
Típicamente, las células contienen el canal de calcio seleccionado
en forma de solamente los canales de iones heterólogos expresados
por la célula.
En ciertas realizaciones las células eucarióticas
recombinantes que contienen los DNA heterólogos que codifican las
subunidades de los canales de calcio se producen mediante la
transfección con DNA que codifica una o más de las subunidades o se
inyectan con transcritos de RNA de DNA que codifica una o más de las
subunidades de los canales de calcio. El DNA se puede introducir en
forma de un fragmento lineal o se puede incluir en un vector de
expresión para la expresión estable o temporal de del DNA que
codifica la subunidad. También se proporcionan los vectores que
contienen DNA que codifica las subunidades de los canales de
calcio.
Las células eucarióticas que expresan los canales
de calcio heterólogos se pueden usar en ensayos para la función de
los canales de calcio o, en el caso de las células transformadas con
menos ácido nucleicos codificadores de las subunidades que los
necesarios para constituir un canal de calcio humano recombinante y
funcional, dichas células se pueden usar para valorar los efectos de
las subunidades adicionales en la actividad de los canales de
calcio. Las subunidades adicionales se pueden proporcionar mediante
la transfección posterior de dicha célula con uno o más clones o
transcritos de RNA que codifican las subunidades de los canales de
calcio de humanos.
Las células eucarióticas recombinantes que
expresan los canales de calcio heterólogos pertenecientes a la
membrana se pueden usar en los procedimientos para identificar
compuestos que modulan la actividad de los canales de calcio. En
particular, las células se usan en ensayos que identifican los
agonistas y antagonistas de la actividad de los canales de calcio en
seres humanos y/o la valoración de la contribución de las diversas
subunidades de los canales de calcio para el transporte y
regulación del transporte de los iones de calcio. Debido a que las
células constituyen poblaciones homogéneas de los canales de
calcio, proporcionan un medio de identificar los agonistas y
antagonistas de la actividad de los canales de calcio que son
específicos para cada una de dichas poblaciones.
También se proporcionan los ensayos que usan las
células eucarióticas para identificar compuestos que modulan la
actividad de los canales de calcio. En la práctica de estos ensayos
las célula eucariótica que expresa un canal de calcio heterólogo,
que contiene al menos una subunidad codificada por el DNa
proporcionado en esta memoria descriptiva, está en una solución que
contiene un compuesto de ensayo y un ión selectivo de los canales de
calcio, la membrana celular se desmoraliza y se detecta la
intensidad de corriente en la célula. Si el compuesto de ensayo es
uno que modula la actividad de los canales de calcio, la corriente
que se detecta es diferente de la producida mediante la
despolarización de la misma célula o sustancialmente idéntica en
presencia del mismo ión selectivo de los canales de calcio pero en
ausencia del compuesto. En las realizaciones preferidas, antes de la
etapa de despolarización, la célula se mantiene a un potencial de
mantenimiento que inactiva sustancialmente los canales de calcio que
son endógenos a la célula. También en realizaciones preferidas, las
células son células de mamíferos que, más preferiblemente células
HEK o células de anfibios.
Se proporcionan las sondas de ácidos nucleicos,
marcadas típicamente para la detección, que contienen al menos
aproximadamente 14, preferiblemente 16, o, si se desea, 20 ó 30 o
más nucleótidos contiguos del DNA que codifica las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{1C}, \alpha_{1B}, \alpha_{1A} y
\alpha_{1E}, \alpha_{2}, \beta, incluyendo las variantes de
esplicing \beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3} y \beta_{4} y
\gamma. También se proporcionan los procedimientos que usan las
sondas para el aislamiento y clonación del DNA que codifica las
subunidades de los canales de calcio, que incluyen las variantes de
esplicing en las variantes de los tejidos en intertejidos.
Se proporcionan las subunidades de los canales de
calcio humanos purificados y los canales de calcio humanos
purificados. Las subunidades y los canales se pueden aislar a partir
de una célula eucariótica transfectada con DNA que codifica la
subunidad.
En otra realización, se proporcionan las
inmunoglobulinas o anticuerpos obtenidos del suero de un animal
inmunizado con una preparación sustancialmente pura de un canal de
calcio humano, subunidad de los canales de calcio humanos o un
fragmento que contiene epítopos de una subunidad de un canal de
calcio humano. También se proporcionan los anticuerpos monoclonales
producidos usando un canal de calcio humano, subunidad de los
canales de calcio humanos o fragmento de la misma que contiene
epítopos en forma de un inmunógeno. Las proteínas de fusión de E.
coli que incluyen un fragmento de una subunidad de los canales
de calcio humanos también se pueden usar como inmunógeno. Dichas
proteínas de fusión pueden contener una proteína bacteriana o
porción de la misma, tal como la proteína E. coli TrpE,
fusionada a un péptido de las subunidades de los canales de calcio.
Las inmunoglobulinas que se producen usando las subunidades de los
canales de calcio o canales de calcio purificados como inmunógenos
tienen, entre otras propiedades, la capacidad de unirse específica
y/o preferentemente producir la inmunoprecipitación de un canal de
calcio humano o una subunidad del mismo que puede estar presente en
una muestra biológica o una solución derivada de dicha muestra
biológica. Dichos anticuerpos también se pueden usar para aislar
selectivamente células que expresan canales de calcio que contienen
la subunidad para las que son específicos los anticuerpos.
También se proporcionan los procedimientos para
modular la actividad de los canales iónicos mediante la puesta en
contacto de los canales de calcio con una cantidad eficaz de los
anticuerpos descritos anteriormente.
También se proporciona un procedimiento de
diagnóstico para determinar la presencia del síndrome de Lambert
Eaton (abreviadamente LES) en un ser humano a base de reactividad
inmunológica de inmunoglobulina G (abreviadamente IgG) de LES con
una subunidad de los canales de calcio humanos o una célula
eucariótica que expresa un canal de calcio recombinante humano o una
subunidad del mismo. En particular, se proporciona un procedimiento
de inmunoensayo para diagnosticar el síndrome de Lambert Eaton en
una persona mediante la combinación de suero o una fracción de IgG
de la persona (suero de ensayo) con las proteínas de los canales de
ensayo que incluyen las subunidades \alpha y \beta y determinar
si los anticuerpos en el suero de ensayo reaccionan con una o más
de las subunidades o una célula recombinante que expresa una o más
de las unidades hasta un mayor grado que los anticuerpos en el suero
de control, obtenido de una persona o grupo de personar conocidas
que no tienen el síndrome. Se puede emplear en el procedimiento
cualquier procedimiento de inmunoensayo conocido en la técnica para
detectar anticuerpos contra un antígeno dado en suero.
A no ser que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos usados en esta memoria descriptivas
tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un
experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las
patentes y publicaciones referidas en esta memoria descriptiva se
incorporan como referencia en esta memoria descriptiva.
La referencia a cada una de las subunidades de
los canales de calcio que se describen específicamente en esta
memoria descriptiva y las subunidades de los canales de calcio
codificados por el DNA que se puede aislar mediante el uso del DNA
descrito como sondas y la selección de un cDNA humano adecuado o
biblioteca genómica a al menos baja rigurosidad. Dicho DNA también
incluye DNA que codifica las proteínas que tienen un 40% de
homología con cualquiera de las subunidades de proteínas descritas
en esta memoria descriptiva o DNA que se hibridiza en condiciones de
al menos baja rigurosidad al DNA proporcionado en esta memoria
descriptiva y la proteína codificada por dicho DNA exhibe
características de identificación adicionales tal como la función o
el peso molecular.
Se entiende que las subunidades que se codifican
por los transcritos que representan las variantes de esplicing de
las subunidades descritas pueden exhibir menos del 40% de la
homología total de cualquier subunidad única, pero incluirá regiones
de dicha homología a una o más de dichas subunidades. También se
entiende que el 40% de homología se refiere a las proteínas que
comparten el 40% de sus aminoácidos en común por lo tanto la
actividad de la proteína no se altera sustancialmente.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva los
tipos de las subunidades \alpha_{1} codificadas por diferentes
genes se designan como tipo \alpha_{1A}, \alpha_{1B},
\alpha_{1C}, \alpha_{1D} y \alpha_{1E}. Estos tipos también
se han referido como VDCC IV para \alpha_{1B}, VDCC II para
\alpha_{1C} y VDCC III para \alpha_{1D}. Los subtipos de las
subunidades, que son variantes de esplicing se denominan, por
ejemplo, \alpha_{1B-1},
\alpha_{1B-2}, \alpha_{1C-1},
etc.
De este modo, como se utiliza en esta memoria
descriptiva, el DNA que codifica la subunidad \alpha_{1} se
refiere al DNA que se hibridiza al DNA proporcionado en esta
memoria descriptiva en condiciones de al menos baja rigurosidad o
codifica una subunidad que tiene al menos aproximadamente 40% de
homología con la proteína codificada por el DNA descrito en esta
memoria descriptiva que codifica una subunidad \alpha_{1} de un
canal de calcio humano. Se puede identificar una la subunidad
\alpha_{1} mediante esta capacidad para formar un canal de
calcio. Típicamente, las subunidades \alpha_{1} tienen masas
moleculares mayores que al menos aproximadamente 120 kD. También
los estudios hidropáticos de las secuencia de los aminoácidos de la
subunidad \alpha_{1} deducida indican que las subunidades
\alpha_{1} contienen cuatro repeticiones internas, conteniendo
cada una seis dominios putativos transmembrana.
La actividad de un canal de calcio se puede
valorar in vitro mediante los procedimientos conocidos por
los expertos en la técnica, que incluyen los procedimientos
electrofisiológicos y otros descritos en esta memoria descriptiva.
Típicamente, las subunidades \alpha_{1} incluyen regiones con las
que interactúan directa o indirectamente uno o más moduladores de la
actividad de los canales de calcio tal como un
1,4-DHP o \omega-CgTx.G Los tipos
de las subunidades \alpha_{1} se pueden distinguir mediante
cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica que
se incluyen en función de su especificad de unión. Por ejemplo, se
ha encontrado en esta memoria descriptiva que las subunidades
\alpha_{1B} participan en la formación de canales que se han
mencionado anteriormente como los canales de tipo N, las
subunidades \alpha_{1D} participan en la formación de canales que
se habían mencionado anteriormente como canales de tipo L y las
subunidades \alpha_{1A} parece que participan en la formación de
canales que exhiben características típicas de canales que se
habían previamente denominado tipo P. De este modo, por ejemplo, la
actividad de los canales que contienen la subunidad \alpha_{1B}
son insensibles a los 1,4-DHP; mientras que la
actividad de los canales que contienen la subunidad \alpha_{1D} se
modulan o se alteran mediante 1,4-DHP. Actualmente
se prefiere aludir a los canales de calcio en función de las
características farmacológicas y cinética y evitar designaciones
históricas. Los tipos y subtipos de las subunidades \alpha_{1} se
pueden caracterizar en función de los efectos de dichos moduladores
en la subunidad o un canal que contiene la subunidad así como
diferencias en corrientes y cinética de la corriente producida por
los canales de calcio que contienen la subunidad.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, una
subunidad \alpha_{1} se codifica mediante un DNA que se hibridiza
a un DNA proporcionado en esta memoria descriptiva en condiciones de
baja rigurosidad o codifica una proteína que tiene al menos
aproximadamente 40% de homología con la descrita en esta memoria
descriptiva. Dicho DNA codifica una proteína que típicamente tiene
una masa molecular mayor que aproximadamente 120 kD pero no forma un
canal de calcio en ausencia de una subunidad \alpha_{1} y puede
alterar la actividad de un canal de calcio que contiene una
subunidad \alpha_{1}. Los subtipos de la subunidad \alpha_{2}
que aparecen como variantes de esplicing se designan con letra
minúscula, tales como \alpha_{2a}, . . . \alpha_{2e}. Además,
la subunidad \alpha_{2} y el fragmento grande producido cuando la
proteína se somete la condiciones reductoras parece que se
glicosilan con al menos azúcares unidos a N y no se unen
específicamente a los 1,4-DHP y fenilalquilaminas
que se unen específicamente a la subunidad \alpha_{1}. El
fragmento más pequeño, el fragmento del terminal C, se denomina la
subunidad \delta e incluye los aminoácidos desde aproximadamente
946 (SEC ID Nº 11) hasta cerca del extremo C. este fragmento puede
disociarse de la porción restante de \alpha_{2} cuando la
subunidad \alpha_{2} se expone a condiciones reductoras.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva una
subunidad \beta se codifica mediante el DNA que se hibridiza al
DNA proporcionado en esta memoria descriptiva en condiciones de baja
rigurosidad o codifica una proteína que tiene al menos
aproximadamente 40% de homología con la descrita en esta memoria
descriptiva y es una proteína que típicamente tiene una masa
molecular inferior que las subunidades \alpha se y del orden de
aproximadamente 50-80 kD no forma un canal de calcio
detectable en ausencia de una subunidad \alpha_{1}, pero puede
alterar la actividad de un canal de calcio que contiene una
subunidad \alpha_{1} o que contiene una subunidad \alpha_{1} y
\alpha_{2}.
Los tipos de la subunidad \beta que se que se
codifican mediante genes diferentes se designan con subscritos tales
como \beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3} y \beta_{4}. Los
subtipos de las subunidades \beta que aparecen como variantes de
esplicing de un tipo particular se designan con un subscrito
numérico que se refiere al tipo y a la variante. Dichos subtipos
incluyen, pero no se limitan a las variantes de esplicing
\beta_{1}, incluyendo las variantes
\beta_{1-1}-\beta_{1-5}
y \beta_{2}, incluyendo
\beta_{2C}-\beta_{2E}.
De este modo, un experto en la técnica a la luz
de lo descrito en esta memoria descriptiva se puede identificar el
DNA que codifica las subunidades de los canales de calcio
\alpha_{1} y \alpha_{2}, incluyendo los tipos codificados
mediante genes diferentes y subtipos que representan las variantes
de esplicing. Por ejemplo, las sondas de DNA a base del DNA descrito
en esta memoria descriptiva se pueden usar para seleccionar una
biblioteca adecuada incluyendo una biblioteca genómica o de cDNA
para la hibridación a la sonda y obtener DNA en uno o más clones
que incluye un fragmento de lectura abierto que codifica una
proteína completa. Posteriormente a la selección de una biblioteca
adecuada con el DNA descrito en esta memoria descriptiva, el DNA
aislado se puede examinar para la presencia de una fase de lectura
abierta a partir de la que la secuencia de la proteína codificada
se puede deducir. La determinación del peso molecular y la
comparación con las secuencias de esta memoria descriptiva deben
revelar la identidad de la subunidad como una subunidad
\alpha_{1}, \alpha_{2} etc. Los ensayos funcionales pueden, si
es necesario, usarse para determinar si la subunidad es una
subunidad \alpha_{1}, \alpha_{2} o la subunidad \beta.
Por ejemplo, el DNA que codifica una subunidad
\alpha_{1A} se puede aislar mediante la selección de una
biblioteca adecuada con DNA que codifica toda o una porción de la
subunidad \alpha_{1A} humana. Dicho DNA incluye el DNA en el fago
depositado en la ATCC con el número 75293 que codifica una porción
de una subunidad \alpha_{1}. El DNA que codifica una subunidad
\alpha_{1A} se puede obtener de una biblioteca adecuada mediante
la selección con un oligonucleótido que tiene toda o una porción de
la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 21, 22 y/o 23 o con el DNA en
el fago depositado. Alternativamente, dicho DNA puede tener una
secuencia que codifica una subunidad \alpha_{1A} que se codifica
mediante la SEC ID Nº 22 ó 23.
De manera similar, el DNA que codifica
\beta_{3} se puede aislar mediante la selección de una biblioteca
de cDNA con sondas de DNA preparadas a partir del plásmido
\beta_{1.42} depositada con el número de acceso 69048 en la ATCC o
se puede obtener a partir de una biblioteca adecuada usando sondas
que tienen secuencias preparadas según las secuencias expuestas en
las SEC ID números 19 y/o 20. También, el DNA que codifica
\beta_{4} se puede aislar mediante la selección de una biblioteca
de cDNA humano con sondas de DNA preparadas según el DNA expuesto
en la SEC IN Nº 27, que expone la secuencia de DNA de un clon que
codifica la subunidad \beta_{4}. La secuencia de aminoácidos se
expone en la SEC ID Nº 28. Se puede usar cualquier procedimiento
conocido por los expertos en la técnica para el aislamiento e
identificación de DNA y la preparación de clones genómicos o de
cDNA, que incluyen los procedimientos ejemplificados en esta
memoria descriptiva. El DNA que codifica la subunidad codificada por
el DNA aislado se puede identificar por comparación con el DNA y las
secuencias de aminoácidos de las subunidades proporcionadas en esta
memoria descriptiva. Las variantes de esplicing comparten las
regiones de extensión de homología, pero incluyen regiones no
homólogas, las subunidades codificadas por genes diferentes
comparten una distribución uniforme de secuencias no homólogas.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, una
variante de esplicing se refiere a una variante que producida
mediante un procedimiento diferencial de un transcrito primario de
DNA genómico que da como resultado más de un tipo de mRNA. Las
variantes de esplicing se pueden producir en un tipo de tejido único
o entre tejidos (variantes de tejido específico). De este modo, los
clones de cDNA que codifican los subtipos de las unidades de los
canales de calcio que tienen regiones de aminoácidos idénticos y
regiones de secuencias de aminoácidos diferentes se denominan
"variantes de esplicing".
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, un
"ión selectivo de los canales de calcio" es un ión que es capaz
de fluir a través de, o que está bloqueado de fluir a través de, un
canal de calcio que pertenece a una membrana celular en condiciones
que permitirían sustancialmente de manera similar o bloquear el
flujo de Ca^{2+}. El Ba^{2+} es un ejemplo de un ión que es un
ión selectivo de los canales de calcio.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva un
compuesto que modula la actividad de los canales de calcio es uno
que afecta a la capacidad del canal de calcio para pasar los iones
selectivos de los canales de calcio o afecta a otras características
detectables de los canales de calcio tales como la cinética de la
corriente. Tales compuestos incluyen los antagonistas y agonistas de
los canales de calcio y los compuestos que ejercen su efecto en la
actividad del canl de calcio directa o indirectamente.
Como se utilizan en esta memoria descriptiva, una
subunidad o proteína "sustancialmente pura" es una subunidad o
proteína que está suficientemente libre de otros contaminantes de
polipéptidos que parecen homogéneos mediante
SDS-PAGE o ser secuenciada con claridad.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva que
se hibridiza selectivamente significa que un fragmento de DNA se
hibridiza a un segundo fragmento con una especificidad suficiente
para permitir que el segundo fragmento se identifique o se aísle
entre una pluralidad de fragmentos. En general, las hibridación
selectiva se produce en condiciones altamente restrictivas.
DNA y RNA heterólogos o extraños se utilizan
intercambiablemente y se denominan DNA o RNA que no se producen de
manera natural como parte del genoma en el que está presente o que
se encuentra en una localización o localizaciones en el genoma que
difieren de la que se produce en la naturaleza. Es un DNA o RNA que
no es endógeno a la célula y se ha introducido artificialmente en la
célula. Los ejemplos de DNA heterólogos incluyen , pero no se
limitan a, DNA que codifica una subunidad de los canales de calcio y
DNA que codifica RNA o proteínas que median o alteran la expresión
de DNA endógeno mediante la influencia en la transcripción,
traducción u otros procedimientos bioquímicos regulables. La célula
que expresa el DNA heterólogo tal como una subunidad de los canales
de calcio, pueden contener DNA que codifica las mismas diferentes
subunidades de canales de calcio. El DNA heterologo no necesita
expresarse y se puede introducir de tal manera que se integra en el
genoma de las células hospedadoras o se mantiene episomalmente.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, la
unión operativa de DNA heterólogo a las secuencias reguladoras y
efectoras de nucleótidos, tales como promotores, potenciadores,
sitios de transcripción y de traducción y otras secuencias señal, se
refiere a la relación funcional entre dicho DNA y dichas secuencias
de nucleótidos. Por ejemplo, la unión operativa de DNA heterólogo a
un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el DNA
y el promotor de tal forma que la trascripción de dicho DNA se
inicia a partir del promotor mediante una RNApolimerasa que
reconoce específicamente, se une a y transcribe el DNA en la fase de
lectura.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, DNA
aislado sustancialmente puro se refiere a los fragmentos de DNA
purificados según las técnicas estándar empleadas por los expertos
en la técnica [véase, por ejemplo, Maniatis y col., (1982) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY].
Como se utiliza en esta memoria descriptiva,
expresión se refiere al procedimiento mediante el que el ácido
nucleico se transcribe en mRNA y se traduce en péptidos,
polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva del DNA
genómico, la expresión puede, si una célula hospedadora eucariótica
u organismo adecuado se selecciona, incluyen el esplicing del
mRNA.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva,
vector o plásmido se refiere a elementos discretos que se utilizan
para introducir DNA heterólogo en las células bien para su expresión
de DNA heterólogo o para replicación de DNA heterólogo clonado. La
selección y uso de tales vectores y plásmidos están dentro del
nivel de los expertos en la técnica.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, el
vector de expresión incluye los vectores capaces de expresar los
fragmentos de DNA que se unen operativamente con secuencias
reguladoras, tales como las regiones promotoras, que son capaces de
efectuar la expresión de dichos fragmentos de DNA. De este modo, un
vector de expresión se refiere a una construcción de DNA o RNA
recombinante, tales como un plásmido, un fago, un virus u otro
vector recombinante que, tras la introducción en una célula
hospedadora adecuada da como resultado la expresión del DNA clonado.
Los expertos en la técnica conocen bien los vectores de expresión
adecuados e incluyen los que son replicables en células eucarióticas
y/o células procarióticas y los que permanecen episomal o se pueden
integrar en el genoma de la célula hospedadora.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, una
región promotora se refiere a la porción de DNA de un gen que
controla la transcripción del DNA al que está unido operativamente.
La región promotora incluye secuencias específicas de DNA que son
suficientes para el reconocimiento, unión e iniciación de la
transcripción de la RNApolimerasa. Esta porción de la región
promotora se denomina promotor. Además, la región promotora incluye
secuencias que modulan este reconocimiento, unión y actividad de
iniciación de la transcripción de la RNApolimerasa. Estas
secuencias pueden ser de actuación cis o puede ser
responsable de los factores de actuación trans. Los
promotores, que dependen de la naturaleza de la regulación pueden
ser constitutivos o regulados.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, una
célula eucariótica recombinante es una célula eucariótica que
contiene DNA o RNA heterólogo.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, un
canal de calcio recombinante o heterólogo se refiere a un canal de
calcio que contiene una o más subunidades que se codifican mediante
DNA heterólogo que se ha introducido en y expresado en una célula
eucariótica que expresa el canal de calcio recombinante. Un canal de
calcio recombinante puede también incluir las subunidades que se
producen mediante DNA endógeno a la célula. En ciertas
realizaciones, el canal de calcio recombinante o heterólogo puede
contener solamente las subunidades que se codifican mediante DNA
heterólogo.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva,
"funcional" con respecto a un canal de calcio recombinante o
heterólogo significa que el canal es capaz de proporcionar y regular
la entrada de iones selectivos de los canales de calcio, que
incluye, pero no se limita a Ca^{2+} o Ba^{2+}, en respuesta a
un estímulo y/o ligandos de unión con afinidad para el canal.
Preferiblemente dicha actividad de los canales de calcio es
distinguible, tal como medios electrofisiológicos, farmacológicos y
otros conocidos por los expertos en la técnica, a partir de
cualquier actividad de los canales de calcio endógenos que está en
la célula hospedadora.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, un
péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone
sustancialmente en una secuencia particular SEC IN Nº incluye los
péptidos que tienen la misma función pero puede incluir variaciones
menores en la secuencia, tal como cambios conservadores de
aminoácidos o deleciones menores o inserciones que no alteran la
actividad del péptido. La actividad de un péptido de las subunidades
de los receptores de los canales de calcio se refiere a su
capacidad para formar canales de calcio funcionales con otras de
dichas subunidades.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, una
concentración fisiológica de un compuesto es la que es necesaria y
suficiente para que se produzca un proceso biológico. Por ejemplo,
una concentración fisiológica de un ión selectivo de los canales de
calcio es una concentración del ión selectivo de los canales de
calcio necesaria y suficiente para proporcionar una corriente
interna cuando se abre el canal.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, la
actividad de un canal de calcio se refiere al movimiento de un ión
selectivo de los canales de calcio mediante un canal de calcio.
Dicha actividad se puede medir mediante cualquier procedimiento
conocido por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se
limitan a la medición de la cantidad de corriente que fluye a través
del canal recombinante en respuesta a un estímulo.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, un
"ensayo funcional" se refiere a un ensayo que identifica los
canales de calcio funcionales. De este modo un ensayo funcional es
un ensayo para valorar la función.
Como entienden los expertos en la técnica, los
procedimientos de ensayo para identificar compuestos, tales como los
antagonistas y los agonistas que modulan la actividad de los canales
de calcio, requieren en general la comparación con un control. Un
tipo de una célula "control" o cultivo de "control" es
una célula o cultivo que se trata sustancialmente lo mismo que la
célula o cultivo expuesto al compuesto de ensayo excepto que el
cultivo de control no se expone al compuesto de ensayo. Otro tipo
de una célula "control" o cultivo de "control" puede ser
una célula o cultivo de células que son idénticos a las células
transfectadas excepto las células empleadas para el cultivo de
control no expresa los canales de calcio funcionales. En esta
situación, la respuesta de la célula de ensayo al compuesto de
ensayo se compara con la respuesta (o carece de respuesta) de la
célula negativa de los canales de calcio al compuesto de ensayo,
cuando las células o cultivos de cada tipo de célula se exponen
sustancialmente a las mismas condiciones de reacción en presencia
del compuesto que se está ensayando. Por ejemplo, en los
procedimientos que usan los procedimientos electrofisiológicos de
pinzamiento zonal (en inglés patch clamp), se puede ensayar la misma
célula en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, cambiando la
solución externa que baña la célula como se conoce en la
técnica.
También se entiende que cada una de las
subunidades descritas en esta memoria descriptiva se pueden
modificar realizando sustituciones conservadoras de aminoácidos y
las sustituciones modificadas resultantes se contemplan en esta
memoria descriptiva. Las sustituciones conservadoras adecuadas de
los aminoácidos las conocen los expertos en esta técnica y se pueden
realizar generalmente sin alterar la actividad biológica de la
molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en
general, las sustituciones únicas de aminoácidos en las regiones no
esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad
biológica (véase, por ejemplo, Watson y col., Molecular Biology of
the Gene, edición 4ª, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. Co., p. 224).
Dichas sustituciones se realizan preferiblemente, aunque no
exclusivamente, de acuerdo con las expuestas en la tabla 1 como
sigue:
| Residuo original | \hskip-1cm Sustitución conservadora |
| Ala (A) | Gly; Ser |
| Arg (R) | Lys |
| Asn (N) | Gln; His |
| Cys (C) | Ser |
| Gln (Q) | Asn |
| Glu (E) | Asp |
| Gly (G) | Ala; Pro |
| His (H) | Asn; Gln |
| Ile (I) | Leu; Val |
| Leu (L) | Ile; Val |
| Lys (K) | Arg; Gln; Glu |
| Met (M) | Leu; Tyr; Ile |
| Phe (F) | Met; Leu; Tyr |
| Ser (S) | Thr |
| Thr (T) | Ser |
| Trp (W) | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp; Phe |
| Val (V) | Ile; Leu |
Se pueden permitir también otras sustituciones y
se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con sustituciones
conservadoras. Cualquiera de dichas modificaciones del polipéptido
se puede efectuar mediante cualquiera de los procedimientos
conocidos por los expertos en esta técnica., que incluyen la
mutagénesis de sitio específico o de sitio dirigido de DNA que
codifica la proteína y el uso de procedimientos de ampliación de
DNA que usan cebadores para introducir y ampliar las alteraciones en
el molde de DNA.
Se proporcionan los procedimientos para
identificar y aislar DNA que codifica las subunidades \alpha_{1},
\alpha_{2} y \beta de los canales de calcio humanos.
La identificación y aislamiento de dicho DNA se
puede llevar a cabo mediante hibridación, en condiciones apropiadas,
a menos rigurosidad baja en la que el DNA que codifica la subunidad
deseada, DNA humano digerido con enzimas de restricción con una
sonda marcada que tiene al menos 14, preferiblemente 16 o más
nucleótidos y derivados de cualquier porción contigua de DNA que
tiene una secuencia de nucleótidos expuestos en esta memoria
descriptiva mediante el número de identificación de la secuencia.
Una vez que el fragmento de hibridación se identifica en la reacción
de hibridación, se puede clonar empleando técnicas de clonación
estándar conocidas por los expertos en la técnica. Los clones de
longitud completa se pueden identificar mediante la presencia de una
fase de lectura abierta completa y la identidad de la proteína
codificada verificada mediante comparación de secuencias con las
subunidades proporcionadas en esta memoria descriptiva y mediante
ensayos funcionales para valorar la capacidad de formación de los
canales de calcio u otra función. Este procedimiento se puede
utilizar para identificar el DNA genómico que codifica la subunidad
o cDNA que codifica las variantes de esplicing de las subunidades de
los canales de calcio humanos generadas por esplicing alternativo
del trascrito primario del DNA de la subunidad genómica. Por
ejemplo, DNA, cDNA o DNA genómicoque codifica una subunidad de los
canales de calcio se puede identificar mediante hibridación a una
sonda de DNA y caracterizarse mediante los procedimientos conocidos
por los expertos en la técnica, tales como los de mapeo de
restricción y secuenciamiento de DNA y compararse con el DNA
proporcionado en esta memoria descriptiva con el fin de identificar
la heterogeneicidad o divergencia en las secuencia de DNA. Tales
diferencias de secuencias pueden indicar que los transcritos a
partir de los cuales se produjo cDNA se originan de un esplicing
alternativo de un transcrito primario, si las regiones no homólogas
y homólogas se agrupan, o de un gen diferente si las regiones no
homólogas se distribuyen por todo el DNA clonado.
Se puede usar cualquier procedimiento adecuado
para aislar los genes que utilizan el DNA proporcionado en esta
memoria descriptiva. Por ejemplo, los oligonucleótidos
correspondientes a las regiones de las diferencias de secuencias se
han usado para aislar, mediante hibridación, DNA que codifica la
variante de esplicing de longitud completa y se pueden usar para
aislar clones genómicos. Una sonda, a base de una secuencia de
nucleótidos descrita en esta memoria descriptiva que codifica al
menos una porción de una subunidad de un canal de calcio humano,
tal como un exón de tejido específico, se puede usar como sonda
para clonar el DNA relativo, para clonar un clon de cDNA o clon
genómico que codifica la subunidad de los canales de calcio
humanos.
Se proporcionan el marcado, incluyendo, pero no
limitado a, radiactivamente o enzimáticamente marcado, RNA o DNA de
hebra sencilla de al menos 14 bases contiguas sustancialmente,
preferiblemente 16 o más, generalmente al menos 30 bases contiguas
de un ácido nucleico que codifica al menos una porción de una
subunidad de los canales de calcio humanos, la secuencia de cuyo
ácido nucleico corresponde a un segmento de una secuencia de ácido
nucleico descrito en esta memoria descriptiva mediante la referencia
a una SEC ID Nº. Dichos segmentos de ácido nucleico se pueden usar
como sondas en los procedimientos proporcionados en esta memoria
descriptiva para clonar DNA que codifica las subunidades de los
canales de calcio. Véase, en general, Sambrook y col., (1989)
Molecular cloning: A Laboratory Manual, edición 2ª, Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Además, las técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos, que se conocen bien en la técnica, se pueden usar para
localizar las variantes de esplicing de las subunidades de los
canales de calcio mediante el empleo de los oligonucleótidos a base
de secuencias de DNA circundantes de los cebadores de las
secuencias divergentes para ampliar RNA humano o DNA genómico. Las
determinaciones del tamaño y secuencia de los productos de
ampliación pueden revelar las variantes de esplicing. Además, el
aislamiento de las secuencias de DNA genómicos humanos mediante
hibridación puede producir DNA que contiene múltiples exones,
separados por intrones, que corresponden a diferentes variantes de
esplicing de transcritos que codifican las subunidades de los
canales de calcio humanos.
El DNA que codifica tipos y subtipos de cada una
de las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta de los
canales de calcio humanos dependiente de voltaje se ha clonado en
esta memoria descriptiva mediante la ampliación de ácido nucleico
de cDNA de tejidos seleccionados o mediante la selección de
bibliotecas de cDNA humano preparadas de poli A+ mRNA aislado de
líneas celulares o tejido de origen humano tal como los canales de
calcio. Entre las fuentes de dichas células o tejidos para obtener
RNA están el tejido de cerebro humano o una línea celular humana de
origen neural, tal como una línea celular de neuroblastoma, músculo
esquelético humano o células de músculo liso y similares. Los
procedimientos para preparar bibliotecas de cDNA se conocen bien en
la técnica [véase en general Ausubel y col. (1987) Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience,
Nueva York; y Davis y col., (1986) Basic Methods in Molecular
Biology, Elsevier Science Publishing Co., Nueva York].
Las regiones preferidas a partir de las cuales se
construyen sondas incluyen las secuencias codificadoras de 5' y/o
3', las secuencias pronosticadas para codificar dominios
transmembrana, secuencias pronosticadas para codificar bucles
citoplásmicos, secuencias señal, sitios de unión a ligandos y otras
secuencias funcionalmente significativas (véase la tabla más
adelante). Tanto el DNA que codifica la subunidad de longitud
completa como los fragmentos del mismo se pueden usar como sondas,
preferiblemente marcado por medios de marcaje adecuados para la
pronta detección. Cuando los fragmentos se usan como sondas,
preferiblemente las secuencias de DNA serán típicamente de la
porción que codifica el extremo carboxi del DNA y más
preferiblemente incluirá porciones que codifican los dominios
transmembrana pronosticados a base de análisis hidropáticos de la
secuencia de aminoácidos deducida [véase, por ejemplo, Kyte y
Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 167: 105].
Se han preparado las ribosondas que son
específicas para los tipos o subtipos de las subunidades de los
canales de calcio humanos. Estas sondas son útiles para identificar
la expresión de las subunidades particulares en tejidos y células
seleccionadas. Las regiones a partir de las cuales se preparan las
sondas se identificaron comparando el DNA y las secuencias de
aminoácidos de todos los subtipos de las subunidades \alpha o
\beta conocidas. Se seleccionaron las regiones de menor
homología, preferiblemente las secuencias derivadas humanas y
generalmente aproximadamente 250 a aproximadamente 600 nucleótidos.
Se han preparado numerosas ribosondas para las subunidades \alpha
o \beta; algunas de éstas se enumeran en la siguiente tabla.
| Especificidad de la subunidad | Posición de nucleótidos | Nombre de la sonda | Tipo de sonda | Orientación |
| \alpha1A genérica | 3357-3840 | pGEM7Z \alpha1A* | ribosonda | nd |
| 761-790 | SE700 | oligo | antisentido | |
| 3440-3464 | SE718 | oligo | antisentido | |
| 3542-3565 | SE724 | oligo | sentido | |
| \alpha1B genérica | 3091-3463 | pGEM7Z \alpha1B_{cyt} | ribosonda | nd |
| 6635-6858 | pGEM7Z \alpha1B_{cooh} | ribosonda | nd | |
| \alpha1B-1 específica | 6490-6676 | pCRII/\alpha1B-1/187 | ribosonda | nd |
| Especificidad de la subunidad | Posición de nucleótidos | Nombre de la sonda | Tipo de sonda | Orientación |
| \alpha1E genérica | 3114-3462 | pGEM7Z \alpha1E | ribosonda | nd |
| \alpha 2b | 1321-1603 | pCRII\alpha2b | ribosonda | nd |
| \beta genérica (¿?) | 212-236 | SE300 | oligo | antisentido |
| \beta1 genérica | 1267-1291 | SE301 | oligo | antisentido |
| \beta 1-2 específica | 1333-1362 | SE17 | oligo | antisentido |
| 1682-1706 | SE23 | oligo | sentido | |
| 2742-2766 | SE43 | oligo | antisentido | |
| 27-56 | SE208 | oligo | antisentido | |
| 340-364 | SE274 | oligo | antisentido | |
| 340-364 | SE275 | oligo | sentido | |
| \beta3 específica | 1309-1509 | ribosonda | nd | |
| \beta4 específica | 1228-1560 | ribosonda | nd | |
| * La serie pGEM está disponible de Promega, Madison WI; véase también la patente de Estados Unidos Nº | ||||
| 4.766.072. |
Las regiones de nucleótidos indicadas
anteriormente son también útiles en las regiones de selección de la
proteína para la preparación de anticuerpos de la subunidad
específica descritos anteriormente.
De este modo los clones de DNA y fragmentos de
los mismos proporcionados en esta memoria descriptiva se pueden usar
para aislar clones genómicos que codifican cada subunidad y aislar
cualquier variante de esplicing mediante la selección de hibridación
de bibliotecas preparadas a partir de diferentes tejidos humanos.
Las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos, que se
conocen bien en la técnica, también se pueden usar para localizar
el DNA que codifica las variantes de esplicing de las subunidades de
los canales de calcio humanos. Esto se lleva acabo mediante el
empleo de oligonucleótidos a base de secuencias de DNA que rodean
la (s) secuencia (s) divergente (s) como cebadores para amplificar
RNA humano o DNA genómico. Las determinaciones del tamaño y
secuencia de los productos de amplificación pueden revelar la
existencia de variantes de esplicing. Además, el aislamiento de
secuencias de DNA genómico humano mediante hibridación puede
producir DNA que contiene múltiples exones, separados por intrones,
que corresponden a diferentes variantes de esplicing de transcritos
que codifican las subunidades de los canales de calcio humanos.
Una vez que se aísla el DNA que codifica una
subunidad de los canales de calcio se pueden emplear los ensayos de
protección de ribonucleasa (abreviadamente RNasa) para determinar
qué tejidos expresan el mRNA que codifica una subunidad de los
canales de calcio particular o una variante. Estos ensayos
proporcionan un medio sensible para detectar y cuantificar una
especie de RNA en una mezcla de complejos del RNA total celular. El
DNA de la subunidad se marca y se hibridiza con RNA celular. Si está
presente mRNA complementario en el RNA celular, se produce un
híbrido DNA-RNA. Después la muestra de RNA se trata
con RNasa, que se degrada a RNA de hebra sencilla. Cualquiera de
los híbridos RNA-DNA se protege de la degradación
con RNasa y se puede visualizar mediante electroforesis y
autorradiografía. Las técnicas de hibridación in situ se
pueden también usar para determinar qué tejidos expresan mRNA que
codifica una subunidad de los canales de calcio particular. Los DNA
de las subunidades marcado se hibridizan con diferentes esplicing
de tejidos diferentes para visualizar la expresión de mRNA de las
subunidades.
Con respecto a cada una de las subunidades
(\alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta o \gamma) de los canales de
calcio humanos, una vez el DNA que se ha identificado el DNA que
codifica la subunidad de los canales mediante un procedimiento de
selección de ácidos nucleicos, se usó el clon aislado para
selección adicional con el fin de identificar los clones de
superposición. Algunos de los fragmentos de DNA clonados pueden y
se han clonado en un vector apropiado tal comopIBI24/25 (IBI, New
Haven, CT), M13mp18/19, pGEM4, pGEM3, pGEM 7Z, pSP72 y otro de
tales vectores conocidos por los expertos en esta técnica y
caracterizados por secuenciación de DNA y mapeo con enzimas de
restricción. De este modo una serie secuencial de clones
superpuestos se pueden generar para cada una de las subunidades
hasta que se pueda preparar un clon de longitud completa mediante
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, que
incluye la identificación de los codones de iniciación de la
traducción (comienzo) y terminación de la traducción (parada). Para
la expresión del DNA clonado, la región no codificadora en 5' y
otras regiones de control de transcripción y traducción de dicho
clon se pueden reemplazar con un sitio de unión al ribosoma eficaz
y otras regiones reguladoras como se conoce en la técnica. Si se
considera necesario se pueden efectuar otras modificaciones el
extremo 5', conocidas por los expertos en la técnica, que se pueden
requerir para optimizar la eficacia de la traducción y la
transcripción.
Los ejemplos II-VIII más
adelante, describen en detalle la clonación de cada una de las
diversas unidades de un canal de calcio humano así como los subtipos
y variantes de esplicing, que incluyen las variantes de sus tejidos
específicos. En los pocos casos en que se describen las secuencias
parciales de una subunidad, esto lo conocen bien los expertos en la
técnica, en vista de lo enseñado en esta memoria descriptiva, para
obtener los clones correspondientes de longitud completa y su
secuencia que codifica su subunidad, subtipo o variante de
esplicing usando los procedimientos descritos anteriormente y
ejemplificados más abajo.
Se han identificado numerosos genes de la
subunidad \alpha_{1} de los canales de calcio de calcio
dependientes de voltaje que se expresan en el SNC humano y en otros
tejidos y se han designado como \alpha_{1A}, \alpha_{1B} o (VDCC
IV), \alpha_{1C} o (VDCC II), \alpha_{1D} o (VDCC III) y
\alpha_{1E}. Se ha aislado el DNA, aislado de una biblioteca de
cDNA neural humano, que codifica cada una de los tipos de las
subunidades. También se proporciona wel DNA que codifica los
subtipos de cada uno de los tipos que aparecen como variantes de
esplicing. Los subtipos se designan en esta memoria descriptiva,
por ejemplo, como \alpha_{1B-1},
\alpha_{1B-2}.
Los tipos de la subunidad \alpha_{1} A, B, C, D
y E de los canales de calcio dependientes de voltaje y subtipos de
los mismos se diferencian con respecto a la sensibilidad a las
clases conocidas de los agonistas y antagonistas de los canales de
calcio, tales como los DHP, las fenilalquilaminas, la conotoxina
omega (\omega-CgTx), la
\omega-agatoxina IV de la araña de tela en embudo
y las pirazonoilguanidinas. Estos tipos de subunidades también
parecen diferir en el potencial de agarre y en la cinética de las
corrientes producidas a partir de la despolarización de las
membranas celulares que contienen canales de calcio que incluyen
diferentes tipos de subunidades \alpha_{1}.
Se proporciona el DNA que codifica una subunidad
\alpha_{1} que se une a al menos un compuesto seleccionado de
entre dihidropiridinas, fenilalquilaminas,
\omega-CgTx, componentes de la toxina de la araña
de tela en embudo y pirazonoilguanidinas. Por ejemplo, la subunidad
\alpha_{1B} proporcionada en esta memoria descriptiva parece
interactuar específicamente con \omega-CgTx en
los canales de tipo N y la subunidad \alpha_{1D} proporcionada en
esta memoria descriptiva interactúa específicamente con los DHP en
los canales de tipo L.
El cDNA de la subunidad \alpha_{1D} se ha
aislado usando fragmentos del cDNA de la subunidad \alpha_{1} de
los canales de calcio de los músculos esqueléticos de conejo como
sonda para seleccionar una biblioteca de una línea celular de
neuroblastoma humano, IMR32, para obtener el clon \alpha1.36. Este
clon se utilizó como sonda para seleccionar las bibliotecas de cDNA
de las células IMR32 adicionales para obtener los clones de
superposición, que después se emplean para la selección hasta una
serie suficiente de clones para extenderse sobre la longitud de la
secuencia de nucleótidos que codifica la subunidad \alpha_{1D}
humana se obtuvo. Se construyeron los clones que codifican
\alpha_{1D} ligando las porciones de clones \alpha_{1D}
parciales como se describe en el ejemplo II. La SEC ID Nº 1 muestra
la secuencia de 7.635 nucleótidos del cDNA que codifica la subunidad
\alpha_{1D}. Hay una fase de lectura de la secuencia de 6.483
nucleótidos que codifica una secuencia de 2.161 aminoácidos (como
se expone en la SEC ID Nº 1).
La SEC ID Nº 2 proporciona la secuencia de un
exon alternativo que codifica el dominio transmembrana IS6 [véase
Tanabe, T., y col (1987) Nature 328: 313-318 para
una descripción de la terminología de los dominios transmembrana].
De la subunidad \alpha_{1D}.
La SEC ID Nº 1 también muestra la secuencia de
2.161 aminoácidos deducida del DNA de la subunidad \alpha_{1D} de
los canales de calcio neuronales humanos. Basándose en la secuencia
de aminoácidos, la proteína \alpha_{1D} tiene un valor de Mr
calculado de 245.163. La subunidad \alpha_{1D} del canal de
calcio contiene cuatro regiones de las secuencias repetidas
internas de tipo putativo. Cuatro las regiones repetidas
internamente representan 24 segmentos transmembrana de tipo
putativo y los extremos amino- y carboxi- se extienden
intracelularmente.
La subunidad \alpha_{1D} se ha mostrado que
media la actividad de los canales de calcio sensibles a DHP,
activados con alto voltaje, de larga duración. Se ha detectado esta
actividad de los canales de calcio cuando se inyectan oocitos con
transcriptos de RNA que codifican una \alpha_{1D} y las
subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-2}. Esta actividad se distingue de las
corrientes de Ba^{2+} detectadas cuando se inyectan los oocitos
con transcritos de RNA que codifican las subunidades
\beta_{1-2} \pm \alpha_{2b}. Estas corrientes
farmacológica y biofísicamente parecían corrientes de Ca^{2+}
descritas para los oocitos no inyectados.
El material biológico que contiene DNA que
codifica una porción de la subunidad \alpha_{1D} se ha depositado
en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852 Estados Unidos en los términos del
tratado de Budapest sobre reconocimiento internacional de depósitos
de microorganismos para los tratado de Budapest en el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y las regulaciones promulgadas
en este tratado. Las muestras del material depositado están y
estarán disponibles para las oficinas de la propiedad industrial y
otras personas tituladas legalmente para recibirlas en los términos
del tratado y regulaciones y de otra manera en cumplimiento con las
leyes y regulaciones de patentes de los Estados Unidos de América y
todas las otras naciones u organizaciones internacionales en las
que esta solicitud, o una solicitud que reivindica prioridad de esta
solicitud se presenta o en las que cualquier patente concedida o
cualquier solicitud se concede.
Una porción de una subunidad \alpha_{1A} se
codifica mediante una inserción de 3 kb en el fago \lambdagt10
llamado \alpha1.254 en la hospedadora E. coli cepa NM514.
Un lisado de fagos de este material se ha depositado con el número
de acceso 75293 en la Colección Americana de Cultivos Tipo como se
ha descrito anteriormente. El DNA que codifica \alpha_{1A} se
puede también identificar mediante la selección con una sonda
preparada a partir de DNA que tiene la SEC ID Nº 21.
5'
CTCAGTACCATCTCTGATACCAGCCCCA
3'.
Se han obtenido las variantes de esplicing de
\alpha_{1A}. Las secuencias las variantes de esplicing de
\alpha_{1A}, \alpha_{1a-1} y
\alpha_{1a-2} se exponen en las SEC IN números 22
y 23. Se pueden obtener otras variantes de esplicing mediante la
selección de una biblioteca humana como se ha descrito
anteriormente o usando toda o una porción de las secuencias
expuestas en las SEC ID números 22 y 23.
Se aisló DNA que codifica la subunidad
\alpha_{1B} se aisló mediante la selección de una biblioteca de
cDNA de ganglios basales humanos con los fragmentos de cDNA que
codifica la subunidad \alpha_{1} de los canales de calcio de
músculos esqueléticos de conejo. Una porción de uno de los clones
positivos se usó para seleccionar una biblioteca de cDNA de células
IMR32. Los clones que se hibridaron a la sonda de DNA de los
ganglios basales se utilizaron para seleccionar adicionalmente una
biblioteca de cDNA de células IMR32 para identificar los clones
superpuestos que a su vez se utilizaron para seleccionar una
biblioteca de cDNA del hipocampo humano. De esta forma, se obtiene
una serie suficiente de clones que se extiende próximamente a la
longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifican la
subunidad \alpha_{1B}. La ampliación del ácido nucleico de
regiones específicas de los segmentos adicionales de mRNA de
\alpha_{1B} de células IMR32 de la secuencia de codificación de
\alpha_{1B}.
Se construyó un clon de DNA de \alpha_{1B} de
longitud completa mediante la ligación de porciones de los clones de
cDNA parcial como se describe en el ejemplo III.C. Las SEC ID
números 7 y 8 muestran las secuencias de nucleótidos de los clones
de DNA que codifican la subunidad \alpha_{1B} así como las
secuencias de aminoácidos deducidas. La subunidad \alpha_{1B}
codificada por la SEC ID Nº 7 se refiere como la subunidad
\alpha_{1B-1} para distinguirla de otra subunidad
\alpha_{1B}, \alpha_{1B-2}, codificada por la
secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID Nº 8, que se deriva
del esplicing alternativo del transcrito de la subunidad
\alpha_{1B}.
La ampliación del ácido nucleico de mRNA de las
células IMR32 que usa los cebadores de oligonucleótidos designados
según las secuencias de nucleótidos dentro del DNA que codifica
\alpha_{1B-1} ha identificado las variantes del
transcrito \alpha_{1B} que parecen ser variantes de esplicing
debido a que contienen secuencias codificadoras divergentes.
Se aislaron numerosos clones de DNA específico de
\alpha_{1C}. La caracterización de las secuencias revelaron que
la secuencia que codifica \alpha_{1C}, la secuencia de iniciación
y traducción de \alpha_{1C} y una región de esplicing alternativo
de \alpha_{1C}. Alternativamente se han identificado las
variantes de esplicing de la subunidad \alpha_{1C}. La SEC ID Nº
3 expone el DNA que codifica una porción sustancial de una subunidad
\alpha_{1C}. Las secuencias de DNA expuestas en la SEC ID Nº 4 y
Nº 5 codifican dos posibles extremos del terminal amino de la
proteína \alpha_{1C}. La SEC ID Nº 6 codifica un exón alternativo
para el dominio transmembrana IV S3. Las secuencias de las
porciones sustanciales de dos variantes de esplicing \alpha_{1C},
designadas \alpha_{1C-1} y
\alpha_{1C-2} se exponen en las SEC ID números 3 y
36 respectivamente.
El aislamiento e identificación de los clones de
DNA que codifican las porciones de la subunidad \alpha_{1C} se
describe en detalle en el ejemplo II.
El DNA que codifica las subunidades de los
canales de calcio \alpha_{1E} se han aislado a partir de una
biblioteca de hipocampo humano cebado con oligo dT. Los clones
resultantes, que son las variantes de esplicing, se designaron
\alpha_{1E}-1, y \alpha_{1E-3}.
La subunidad designada \alpha_{1E-1} tiene la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24 y una subunidad
\alpha_{1E-3} tiene la secuencia de aminoácidos
expuesta en la SEC ID Nº 25. Estas variantes de esplicing se
diferencian en virtud de una inserción de 57 pares de bases entre
los nucleótidos 2405 y 2406 de la SEC ID Nº 24.
Las subunidades \alpha_{1E} proporcionadas en
esta memoria descriptiva parecen participar en la formación de los
canales de calcio que tienen las propiedades de los canales de
calcio activados por alto voltaje y los canales activados por bajo
voltaje. Estos canales se inactivan rápidamente comparados con
otros canales de calcio activados por alto voltaje. Además estos
canales muestran perfiles farmacológicos que son similares a los
canales activados por voltaje, pero son también sensibles a los DHP
y \omega-Aga-IVA, que bloquean
ciertos canales activados por voltaje. Los detalles adicionales con
relación a la electrofisiología y farmacología de los canales que
contienen las subunidades \alpha_{1E} se proporciona en el
ejemplo VII.F.
El DNA que codifica las subunidades \alpha_{1}
adicionales se pueden aislar e identificar usando el DNA
proporcionado en esta memoria descriptiva como se describe para las
subunidades \alpha_{1A}, \alpha_{1B}, \alpha_{1C},
\alpha_{1D} y \alpha_{1E} o usando otros procedimientos
conocidos por los expertos en la técnica. En particular, el DNA
proporcionado en esta memoria descriptiva se puede usar para
seleccionar bibliotecas adecuadas para aislar el DNA relacionado.
Los clones de longitud completa se pueden construir usando
procedimientos, tales como los descritos en esta memoria descriptiva
y las subunidades resultantes caracterizadas por comparación de sus
secuencias y las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas
con las subunidades ejemplificadas en esta memoria descriptiva.
Para aislar el DNA que codifica la subunidad
\beta_{1}, se seleccionó una biblioteca de cDNA del hipocampo
humano mediante hibridación a un fragmento de DNA que codifica una
subunidad \beta de los canales de calcio de los músculos
esqueléticos de conejo. Se seleccionó un clon de hibridación y a su
vez se utilizó para aislar los clones superpuestos hasta que se
aislaron y se secuenciaron los clones superpuestos que comprendían
el DNA que codifica la subunidad completa \beta de los canales de
calcio humanos.
Alternativamente se han identificado cinco formas
de esplicing de la subunidad \beta_{1} de los canales de calcio
humanos y se ha aislado el DNA que codifica numerosas formas. Estas
formas se designan \beta_{1-1}, expresadas en el
músculo esquelético, \beta_{1}-2, expresadas en el
sistema nervioso central, \beta_{1}-3, también
expresada en el sistema nervioso central,
\beta_{1-4}, expresadas en el tejido de la aorta y
en las células HEK 293, y \beta_{1-5}, expresadas
en las células HEK 293. Se han identificado los clones de DNA de
longitud completa que codifican las subunidades
\beta_{1-2} y \beta_{1-3}. Se
han identificado las subunidades \beta_{1-1},
\beta_{1-2}, \beta_{1-3} y
\beta_{1-5} mediante el análisis de ampliación de
ácidos nucleicos, como forman esplicing alternativamente de la
subunidad \beta. Las secuencias de las variantes de esplicing de
\beta_{1} se exponen en las SEC ID números 9, 10 y
33-35.
Se ha obtenido el DNA que codifica las variantes
de esplicing de \beta_{1}. Estas variantes de esplicing incluyen
\beta_{2C}-\beta_{2E}. Las variantes de
esplicing \beta_{2C}-\beta_{2E} incluyen toda la
secuencia expuesta en la SEC ID Nº 26, excepto para la porción en
el extremo 5' (hasta el nucleótido 182), que se diferencia de las
variantes de esplicing. La secuencia expuesta en la SEC ID Nº 26
codifica \beta_{2D}. Las variantes de esplicing adicionales se
pueden aislar usando los procedimientos descritos en esta memoria
descriptiva y los oligonucleótidos que incluyen todo o porciones
del DNA expuesto en la SEC ID Nº 26 o se pueden preparar u obtener
como se describe en los ejemplos. Las secuencia de las variantes de
esplicing de \beta_{2}, \beta_{2C} y \beta_{2E} se exponen en
las SEC ID números 37 y 38 respectivamente.
El DNA que codifica la subunidad \beta_{3} y
cualquiera de las variantes de esplicing se puede aislar
seleccionando una biblioteca, como se ha descrito anteriormente para
la subunidad \beta_{1}, usando las sondas de DNA preparadas según
las SEC ID números 19, 20 o usando todo o una porción del plásmido
\beta1.42 del clon de \beta_{3} depositado (número de acceso
69048 de ATCC).
El hospedador E. coli que contiene el
plásmido \beta1.42 que incluye DNA que codifica una subunidad de
\beta_{3d} se ha depositado como número de acceso 69048 de ATCC
en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852 Estados Unidos en los términos del tratado
de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de
microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes
y las regulaciones promulgadas en este tratado. Las muestras del
material depositado están y estarán disponibles para las oficinas de
la propiedad industrial y otras personas tituladas legalmente para
recibirlas en los términos del tratado y regulaciones y de otra
manera en cumplimiento con las leyes y regulaciones de patentes de
los Estados Unidos de América y todas las otras naciones u
organizaciones internacionales en las que esta solicitud, o una
solicitud que reivindica prioridad de esta solicitud se presenta o
en las que cualquier patente concedida o cualquier solicitud se
concede.
El plásmido que codifica \beta_{3} se designa
\beta1.42. El plásmido contiene un fragmento EcoRI de 2,5
kb que codifica \beta_{3} insertado en el vector pGem*7zF (+) y
se ha depositado en el hospedador E. coli cepa DH5\alpha.
Las secuencias de las variantes de esplicing de \beta_{3},
designadas \beta_{3-1} y
\beta_{3-2} se exponen en las SEC ID números 19 y
20, respectivamente.
El DNA que codifica una subunidad \alpha_{2} de
los canales de calcio neural humanos se aisló de una manera
sustancialmente similar a la usada para aislar DNA que codifica una
subunidad de \alpha_{1}, excepto que una biblioteca de DNA
genómico humano se sindó en condiciones de baja y alta rigurosidad
con un fragmento de DNA que codifica la subunidad \alpha_{2} de
los canales de calcio de los músculos esqueléticos de conejos. El
fragmento incluía nucleótidos que tienen una secuencia
correspondiente a la secuencia de nucleótidos entre los nucleótidos
43 y 272 inclusive en cDNA de la subunidad \alpha_{2} de los
canales de calcio de los músculos esqueléticos de conejo como se
describe en la publicación de la solicitud de patente internacional
PCT Nº WO 89/09834.
El ejemplo IV describe el aislamiento de clones
de DNA que codifican las subunidades \alpha_{2} de un canal de
calcio humano a partir de una biblioteca de DNA que usa DNA
genómico y clones de cDNA, identificados mediante la hibridación al
DNA genómico como sondas.
Las SEC ID números 11 y 29-32
muestran la secuencia de DNA que codifican las subunidades de
\alpha_{2}. Como se describe en el ejemplo V, el análisis de
amplificación de ácidos nucleicos de RNA de músculo esquelético,
tejido cerebral y aorta que usa cebadores de oligonucleótidos
específicos para una región del cDNA de las subunidades \alpha_{2}
neuronales humanas que diverge de las variantes de esplicing
identificadas de cDNA de la subunidad \alpha_{2} de los canales
de calcio de los músculos esqueléticos de conejos del transcrito de
la subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio humanos.
Los anticuerpos, monoclonales o policlonales,
específicos de los subtipos de las subunidades de los canales de
calcio o para los tipos de los canales de calcio se pueden preparar
empleando técnicas estándar, conocidas por los expertos en la
técnica que usan las proteínas de las sunidades o porciones de las
mismas como antígenos. Se pueden usar los anticuerpos de la las
proteínas antipéptido y antifusión [véase, por ejemplo, Bahouth y
col., (1991) Trneds Pharmacol. Sci. 12: 338-343;
Current Protocols in Molecular Bilogy (Ausbel y col., eds.) John
Wiley y Sons, Nueva York (1984)]. Las factores a considerar en la
selección de las porciones de las subunidades de los canales de
calcio para uso como inmunógenos (bien en forma de un péptido
sintético o en forma de una proteína de fusión bacteriana producida
por recombinación) incluyen la accesibilidad antigénica (es decir,
dominios extracelulares y citoplásmicos), singularidad a la
subunidad particular y otros factores conocidos por los expertos en
esta técnica.
La disponibilidad de los anticuerpos específicos
de las subunidades hace posible la aplicación de la técnica de
inmunohistoquímica para controlar la distribución y la densidad de
la expresión de diversas subunidades (por ejemplo, en tejido de
cerebro normal frente a enfermo). Dichos anticuerpos se podrían
también emplear en diagnostico, tales como la diagnosis LES y
aplicaciones terapéuticas, tales como usando los anticuerpos que
modulan las actividades de los canales de calcio.
Los anticuerpos se pueden administrar a un sujeto
empleando procedimientos estándar, tales como por ejemplo, mediante
inyección intraperitoneal, intramuscular, intravenosa o subcutánea,
implante o formas transdérmicas de administración y los similares.
Un experto en la técnica puede determinar empíricamente las formas
de dosis, regímenes de tratamiento, etc., dependiendo de la forma de
administración empleada.
Se han preparado los anticuerpos monoclonales
específicos de subunidades y antisueros policlonales. Las regiones
de las que los antígenos venían se identificaron comparando las
secuencias del DNA y de aminoácidos de todos los subtipos de las
subunidadaes \alpha o \beta conocidas. Se seleccionaron las
regiones de menos homología, preferiblemente las secuencias
derivadas de seres humanos. Las regiones o proteínas de fusión
seleccionadas que contenían las regiones seleccionadas se utilizaron
como inmunógenos. También se realizaron los análisis de
hidrofobicidad de los residuos en las regiones proteicas
seleccionadas y proteínas de fusión; se evitan las regiones de alta
hidrofobicidad. También, y más importante, cuando se preparan las
proteínas de fusión en hospedadores bacterianos, se evitan los
codones raros. En particular, se evita la inclusión de 3 o más
codones raros sucesivos en un hospedador seleccionado. Se han
preparado numerosos anticuerpos, policlonales y monoclonales,
específicos para los tipos o subtipos de las subunidades \alpha o
\beta; algunos de éstos se enumeran en la tabla siguiente. Los
ejemplos de anticuerpos ejemplares y antígenos de péptidos usados
para preparar los anticuerpos se exponen en la siguiente tabla:
(Tabla 3 pasa a página
siguiente)
| Especificidad | Número de aminoácidos | Nombre del antígeno | Tipo de anticuerpo |
| \alpha1 genérico | 112-140 | Péptido 1A#1 | policlonal |
| \alpha1 genérico | 1420-1447 | Péptido 1A#2 | policlonal |
| \alpha1A genérico | 1048-1208 | Fusión* de \alpha1A # | policlonal |
| 2 (b) GST | monoclonal | ||
| \alpha1B genérico | 983-1106 | Fusión de \alpha1A # | policlonal |
| 2 (b) GST | monoclonal | ||
| \alpha1B-1 | 2164-2339 | Fusión de \alpha1B # 3 (b) GST | policlonal |
| \alpha1B-2 | 2164-2237 | Fusión de \alpha1B # 4 (b) GST | policlonal |
| \alpha1E-genérico | 985-1004 (\alpha1E-3) | Fusión de \alpha1E # 2 (a) GST | policlonal |
* El sistema de fusión de tipo génico
GST está disponible de Pharmacia; véase también, Smith y col.
(1988) Gene 67: 31. El sistema proporciona los plásmidos pGEX que se
designan para la expresión inducible de alto nivel de los genes o
fragmentos de genes como fusiones como fusiones con GST de
Schistosoma japonicum. Tras la expresión en un hospedador de
bacterias, las proteínas de fusión resultantes se purifican a
partir de lisados de bacterias mediante cromatografía de
afinidad.
Las proteínas de fusión de GST son cada una
específica para la región debucle citoplásmica
IIS6-IIS1, que es una región de homología de
subtipos baja para todos los subtipos, incluyendo \alpha_{1C} y
\alpha_{1D}, para las que se preparan fusiones similares y
antisueros.
El DNA que codifica una o más de las subunidades
de los canales de calcio o una porción de una subunidad de los
canales de calcio se puede introducir en una célula hospedadora para
la expresión o replicación del DNA. Dicho DNA se puede introducir
usando los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos o
usando los procedimientos bien conocidos por los expertos en la
técnica. Se conoce bien en la técnica la incorporación de DNA
clonado en un vector de expresión adecuado, la transfección de
células eucarióticas con un vector de plásmidos o una combinación de
vectores de plásmidos, que codifican cada uno de ellos uno o más
genes distintos o con DNA lineal, y la selección de células
transfectadas [véase por ejemplo, Sambrook y col., (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold
Spring Harbor Laboratiry Press]. El DNA clonado de longitud completa
que codifica cualquiera de las subunidades de un canal de calcio
humano se puede introducir en un vector plásmido para la expresión
en una célula eucariótica. Dicho DNA puede ser DNA genómico o cDNA.
Las células hospedadoras se pueden transfectar con uno o una
combinación de los plásmidos, cada uno de los cuales codifica al
menos una subunidad de los canales de calcio. Alternativamente, las
células hospedadoras se pueden transfectar con DNA lineal utilizando
procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Mientras que el DNA proporcionado en esta memoria
descriptiva se puede expresar en cualquier célula eucariótica,
incluyendo las células de levaduras tales como P. pastoris
[véase, por ejemplo, Cregg y col., (1987) Bio/Technology 5: 479],
se prefieren los sistemas de expresión de mamíferos para la
expresión del DNA que codifica las subunidades de los canales de
calcio humanos proporcionado en esta memoria descriptiva.
El DNA heterólogo se puede introducir mediante
cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica, tal
como una transfección con un vector que codifica el DNA heterólogo.
Los vectores particularmente preferidos para la transfección de
células de mamíferos son los vectores de expresión pSV2dhfr, que
contienen el promotor temprano SV40, gen dhfr de ratón, sitios de
poliadenilación y esplicing y las secuencias necesarias para
mantener el vector en las bacterias, vectores a base de promotores
de citomegalovirus (abreviadamente CNV) tales como pCDNA1, o
pcDNA-amp y vectores a base de promotores de MMTV.
El DNA que codifica las subunidades de los canales de calcio humanos
se han insertado en el vector pCDNA1 en una porción inmediatamente
siguiente al promotor de CMV. Actualmente se prefiere el vector
pCDNA1.
Las células de mamíferos transfectadas temporal o
establemente se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en
la técnica transfectando las células con un vector de expresión que
tiene un gen marcador seleccionable tal como el gen para
timidinaquinasa, dihidrofolatorreductasa, resistencia a la neomicina
o los similares y, para transfección temporal, desarrollando las
células transfectadas en condiciones selectivas para las células que
expresan el gen marcador. Los canales de calcio funcionales
dependientes de voltaje se han producido en las células HEK 293
transfectadas con un derivado del vector pCDNA1 que contiene el DNA
que codifica una subunidad de los canales de calcio humanos.
El DNA heterólogo se puede mantener en las
células como un elemento episomal o se pueden integrar en DNA
cromosómico de la célula. Después las células recombinantes
resultantes se pueden cultivar o subcultivar (o multiplicadas por
cultivo, en el caso de células de mamíferos) a partir de dicho
cultivo o un subcultivo del mismo. Los procedimientos para la
transfección, inyección y cultivo de células recombinantes los
conocen bien los expertos en la técnica. Las células eucarióticas
en las que se puede introducir DNA o RNA incluyen todas las células
que se pueden trnafectar mediante dichos DNA o RNA o en las que
dicho DNA se puede inyecyar. Virtualmente cualquier célula
eucariótica puede servir como vehículo para el DNA heterólogo. Las
células preferidas son las que también pueden expresar en DNA y RNA
y las células más preferidas son las que pueden formar canales de
calcio recombinantes o heterólogos que incluyen una o más
subunidades codificadas por el DNA heterólogo. Dichas células se
pueden identificar empíricamente o seleccionarse de entre las
conocidas que son fácilmente transfectadas o inyectadas. Las células
preferidas para introducir DNA incluyen las que se pueden
transfectar temporal o establemente e incluyen, pero no se limitan
a, las células de origen mamífero, tales como las células COS,
células L de ratón, células CHO, células de riñón embrionario
humano, células de mono verde africano y otras de dichas células
conocidas por los expertos en la técnica, células de anfibios, tales
como oocitos de Xenopus lavéis o las de levaduras tales como
Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris .Las
células preferidas para expresar transcritos de RNA inyectado o cDNA
incluyen oocitos de Xenopus lavéis. Las células que se
prefieren para la trasnfección de DNA son las que se pueden
transfectar fácil y eficazmente. Dichas células las conocen los
expertos en la técnica o se pueden identificar empíricamente. Las
células preferidas incluyen células DG44 y células HEK 293,
particularmente las células HEK 293 que se pueden congelar en
nitrógeno líquido y después descongelarse y volverse a desarrollar.
Dichas células HEK 293 se describen, por ejemplo en la patente de
Estados Unidos Nº 5.024.939 de Gorman [véase también Stillman y col.
(1985) Mol. Cell. Biol. 5: 2051-2060].
Las células se pueden usar como vehículos para
replicar DNA heterólogo introducido en ellas o para expresar o para
expresar el DNA introducido en ellas. En ciertas realizaciones, las
células se usan como vehículos para expresar el DNA heterólogo como
medio para producir sustancialmente subunidades de los canales de
calcio humanos o los canales de calcio heterólogos. Las células
hospedadoras que contienen el DNA heterólogo se pueden cultivar en
condiciones en las que se expresan los canales de calcio. Las
subunidades de los canales de calcio se pueden purificar usando los
procedimientos de purificación de proteínas conocidos por los
expertos en la técnica. Por ejemplo se pueden usar, los
anticuerpos, tales como los proporcionados en esta memoria
descriptiva, que se unen específicamente a uno o más de las
subunidades para purificación de afinidad de la subunidad o los
canales de calcio que contienen las subunidades.
Sustancialmente se proporcionan las subunidades
puras de las subunidades \alpha_{1} de los canales de calcio de un
canal de calcio humano, las subunidades \alpha_{2} de los canales
de calcio de un canal de calcio humano y las subunidades \beta de
los canales de calcio de un canal de calcio humano. Sustancialmente
también se proporcionan los canales de calcio puros aislados que
contienen al menos una de las subunidades de los canales de calcio
humanos. Sustancialmente también se proporcionan los canales de
calcio puros que contienen una mezcla de una o más subunidades
codificadas por la células hospedadora y una o más subunidades
codificadas por DNA o RNA heterólogos que se han introducido en la
célula. Sustancialmente también se proporcionan los canales de
calcio de un tipo específico de tejido.
En otras realizaciones se proporcionan las
células eucarióticas que contienen DNA heterólogo que codifica al
menos una subunidad \alpha_{1} de un canal de calcio humano, una
subunidad \alpha_{2} de un canal de calcio humano y una subunidad
\beta de un canal de calcio humano. De acuerdo con una
realización preferida, el DNA heterólogo se expresa en la célula
eucariótica y codifica preferentemente una subunidad \alpha_{1} de
los canales de calcio humanos.
Los expertos en la técnica conocen los
procedimientos electrofisiológicos para medir la actividad de los
canales de calcio y se ejemplifican en esta memoria descriptiva.
Cualquiera de dichos procedimientos se puede usar con el fin de
detectar la formación de canales de calcio funcionales y
caracterizar la cinética y otras características de las corrientes
resultantes. Los estudios farmacológicos se pueden combinar con las
mediciones electrofisiológicas con el fin de caracterizar
posteriormente los canales de calcio.
Con respecto a las mediciones de la actividad de
los canales de calcio heterólogos funcionales, preferiblemente, la
actividad de los canales iónicos endógenos y, si se desea, la
actividad de los canales heterólogos de los canales que no contienen
las subunidades deseadas de una célula hospedadora se pueden inhibir
en un grado significativo mediante medios químicos, farmacológicos y
electrofisiológicos, que incluyen el uso del potencial de
mantenimiento diferencial para incrementar la relación S/R
(señal/ruido) de la actividad medida de los canales de calcio
heterólogos.
Así que, las diversas combinaciones de las
subunidades codificadas por el DNA proporcionado en esta memoria
descriptiva se introducen en las células eucarióticas. Las células
resultantes se pueden examinar para averiguar si los canales
funcionales se expresan y para determinar las propiedades de los
canales. En los aspectos particularmente preferidos, la célula
eucariótica que contiene el DNA heterólogo los expresa y forma una
actividad de los canales de calcio funcionales recombinantes. En los
aspectos más preferidos, la actividad de los canales de calcio
recombinantes se detecta fácilmente debido a que es un tipo que
falta en la célula hospedadora transfectada o es de una magnitud y/o
propiedades farmacológicas o exhibe propiedades biofísicas no
mostradas en la célula transfectada.
Las células eucarióticas se pueden transfectar
con diversas combinaciones de los subtipos de subunidades
proporcionadas en esta memoria descriptiva. Las células resultantes
proporcionaran una población uniforme de los canales de calcio para
estudio de la actividad de los canales de calcio y para uso en los
ensayos de análisis de fármacos proporcionados en esta memoria
descriptiva. Los experimentos que se han realizado han demostrado la
inadecuación de los esquemas de clasificación anteriores.
Entre las células transfectadas preferidas está
una célula eucariótica recombinante con un canal de calcio
heterólogo funcional. La célula recombinante se puede producir
mediante la introducción expresión de transcritos de DNA o RNA
heterólogos que codifican una subunidad \alpha_{1} de un canal de
calcio humano, más preferiblemente expresando también un DNA
heterólogo que codifica una subunidad \beta de un canal de calcio
humano y /o DNA heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{2}
de un canal de calcio humano. Se prefiere especialmente la expresión
en dicha célula recombinante de cada una de las subunidades
\alpha_{1}, \beta y \alpha_{2} codificadas por dichos
transcritos de DNA o RNA heterólogos. Los canales de calcio
funcionales preferiblemente pueden incluir al menos una subunidad
\alpha_{1} y una subunidad \beta de un canal de calcio humano.
Las células eucarióticas que expresan estas dos subunidades y
también las células que expresan subunidades adicionales se han
preparado mediante transfección de DNA y mediante inyección de
transcritos de RNA. Dichas células han exhibido la actividad de los
canales de calcio dependientes de voltaje atribuibles a los canales
de calcio que contienen una o más de las subunidades de los canales
de calcio heterólogos humanos. Por ejemplo, las células eucarióticas
que expresan los canales de calcio heterólogos conteniendo una
subunidad \alpha_{2} además de la subunidad \alpha_{1} y una
subunidad \beta han mostrado que exhiben un flujo aumentado de
iones selectivos de calcio a través de la membrana celular en
respuesta a la despolarización, que indica que la subunidad
\alpha_{2} puede potenciar la función de los canales de calcio.
Las células se han cotransfectado con relaciones crecientes de
\alpha_{2} a \alpha_{1} y se ha medido la actividad de los
canales de calcio resultantes. Los resultados indican que el
incremento de la cantidad de DNA que codifica \alpha_{2} relativo
a las otras subunidades transfectadas incrementa la actividad de los
canales de calcio.
Se prefieren las células eucarióticas que
expresan los canales de calcio heterólogos que contienen al menos
una subunidad \alpha_{2} humana, una subunidad \beta y una
subunidad \alpha_{2} humana. Las células eucarióticas
trasformadas con una composición que contiene cDNA o un transcrito
de RNA que codifica una subunidad \alpha_{1} sola o en combinación
con una subunidad \beta y/o \alpha_{2} se pueden producir para
producir las células que expresan los canales de calcio
funcionales. Ya que las células recombinantes que expresan los
canales de calcio humanos que contienen todas las subunidades
humanas codificadas por los cDNA o RNA heterólogos son las que se
prefieren especialmente, es deseable inyectar o transferir dichas
células hospedadoras con una concentración suficiente de los ácidos
nucleicos que codifican las subunidades para formar los canales de
calcio que contienen las subunidades humanas codificadas por DNA o
RNA heterólogos. Las cantidades y relaciones precisas de DNA y RNA
que codifican las subunidades se pueden determinar empíricamente y
optimizarse para una combinación particular de subunidades, células
y condiciones de ensayo.
En particular, las células de mamíferos se han
transfectado temporal y establemente con DNA que codifica una o más
subunidades de los canales de calcio humanos. Dichas células
expresan los canales de calcio heterólogos que exhiben propiedades
farmacológicas y electrofisiológicas que se pueden atribuir a los
canales de calcio humanos. Sin embargo, dichas células representan
poblaciones homogéneas y los datos farmacológicos y
electrofisiológicos proporcionan la adquisición de una nueva
percepción de la actividad de los canales de calcio humanos hasta
ahora irrealizable. Por ejemplo, las células HEK que se han
transfectado temporalmente con DNA que codifica las subunidades
\beta y una subunidad \alpha_{1E-1},
\alpha_{2b} y \beta_{1-3}. Las células
temporales expresan temporalmente estas subunidades, que forman
canales de calcio que tienen propiedades que parecen ser una clase
farmacológicamente distinta de los canales de calcio activados con
voltaje distintas de las de los acanales de tipo L-, N- T- y P-.
Las corrientes de \alpha_{1E} observadas eran insensibles a los
fármacos y toxinas previamente usadas para definir otras clases de
canales de calcio activados con voltaje.
En ciertas realizaciones, la célula eucariótica
con un canal de calcio heterólogo se produce mediante la
introducción de una primera composición en la célula que contiene al
menos un transcrito de RNA que se traduce en la célula en una
subunidad de un canal de calcio humano. En realizaciones preferidas,
las unidades que se traducen incluyen una subunidad \alpha_{1} de
un canal de calcio humano. Más preferiblemente, la composición que
se introduce contiene un transcrito de RNA que codifica una
subunidad de \alpha_{1} de un canal de calcio humano y también
contiene (1) un transcrito de RNA que codifica una subunidad \beta
de un canal de calcio humano y/o (2) un transcrito de RNA que
codifica una subunidad de \alpha_{2} de un canal de calcio
humano. Se prefiere especialmente la introducción de un RNA que
codifica una subunidad de \alpha_{1}, una de \beta y una de
\alpha_{e} de canales de calcio humano. Los procedimientos para la
transcripción in vitro de un DNA clonado y la inyección del
RNA resultante en células eucarióticas se conocen bien en la
técnica. Los transcritos de cualquier DNA de longitud completa que
codifica cualquiera de las subunidades de un canal de calcio humano
se puede inyectar solo o en combinación con otros transcritos en
células eucarióticas para la expresión en las células. Se prefieren
particularmente los oocitos de anfibios para la expresión de los
transcritos in vivo de los clones de cDNA de las subunidades
de los canales de calcio humanos proporcionados en esta memoria
descriptiva. Los oocitos de anfibios que expresan los canales de
calcio heterólogos funcionales se han producido mediante este
procedimiento.
Entre los usos para las células eucarióticas que
expresan de una forma recombinante una o más de las subunidades son
ensayos para determinar si un compuesto de ensayo tiene actividad
agonista o antagonista de los canales de calcio. Estas células
eucarióticas también se pueden usar para seleccionar a partir de
agonistas y antagonistas de los canales de calcio conocidos los que
exhiben una especificidad de los subtipos de los canales de calcio
particulares y por lo tanto seleccionar los compuestos que tienen
potencial como agentes terapéuticos de enfermedad o tejido
específico.
Se proporcionan los procedimientos in
vitro para identificar compuestos, tales como agonista y
antagonistas de los canales de calcio, que modulan la actividad de
los canales de calcio que usan células eucarióticas que expresan
los canales de calcio heterólogos humanos.
En particular, los ensayos usan células
eucarióticas que expresan subunidades de canales de calcio
heterólogos de calcio humano codificados por DNA heterólogo
proporcionado en esta memoria descriptiva, para seleccionar los
agonistas y los antagonistas potenciales de los canales de calcio
que son específicos para los canales de calcio humano y
particularmente para seleccionar los compuestos que son específicos
para los subtipos de los canales de calcio humanos particulares.
Dichos ensayos se pueden usar junto con los procedimientos de diseño
de fármaco racional para seleccionar entre agonistas y antagonistas
que se diferencian ligeramente en estructura, los que son
particularmente útiles para modular la actividad de los canales de
calcio humano y diseñar o seleccionar los compuestos que muestran
actividades de agonistas y antagonistas de los canales de calcio de
subtipos o tejidos específicos. Estos ensayos deben predecir
exactamente la eficacia terapéutica relativa de un compuesto para el
tratamiento de ciertos trastornos en seres humanos. Además, se
proporcionan las subunidades de los canales de calcio específicas de
subtipos y tejidos, las células con canales de calcio recombinantes
específicos de subtipos y tejidos se pueden preparar y utilizar en
ensayos para la identificación de fármacos de subtipos y tejidos
específicos de los canales de calcio humanos.
Deseablemente, la célula hospedadora para la
expresión de las subunidades de los canales de calcio endógenas del
tipo o en una cantidad que sustancialmente interfiere con la
detección de las subunidades de los canales de calcio heterólogos en
ensayos de unón de ligandos o detección de la función de de los
canales de calcio heterólogos tal como la generación de la corriente
de calcinen ensayos funcionales. También, las células hospedadoras
preferiblemente no deben producir canales de calcio endógenos que
interactúan de maneta detectable con los compuestos que tienen a
concentraciones fisiológicas (generalmente nanomolares o
picomolares) afinidad por los canales de calcio que contienen una o
todas las subunidades de los canales de calcio humanos
proporcionados en esta memoria descriptiva.
Con respecto a los ensayos de ligandos para
identificar un compuesto que tiene una afinidad para los canales de
calcio, se emplean las células que expresan, preferiblemente, al
menos una subunidad de \alpha_{1} heteróloga. Las células
eucarióticas transfectadas que expresan al menos una subunidad de
\alpha_{1} se pueden usar para determinar la capacidad de un
compuesto de ensayo para unirse específicamente a los canales de
calcio heterólogos mediante, por ejemplo, la evaluación de la
capacidad del compuesto de ensayo para inhibir la interacción de un
compuesto marcado conocido para interactuar específicamente con los
canales de calcio. Dichos ensayos de unión de ligandos se pueden
realizar sobre células transfectadas o membranas preparadas de las
mismas.
La capacidad de un compuesto de ensayo para
unirse o interactuar de otra manera con las membranas que contienen
los canales de calcio heterólogos o subunidades de los mismos se
pueden determinar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como
los análisis de unión competitiva, tales como los estudios de
Scatchard, en los que la capacidad de unión de tales membranas se
determina en presencia y ausencia de una o más concentraciones de un
compuesto que tiene afinidad conocida para el canal de calcio. Donde
es necesario, los resultados, se pueden comparar a un experimento de
control diseñado de acuerdo a los procedimientos estándar conocidos
por los expertos en la técnica. Por ejemplo, como control negativo,
los resultados se pueden comparar a los de los ensayos de una
preparación de membranas tratada idénticamente a partir de células
hospedadoras que no se han transfectado con uno o más ácidos
nucleicos que codifican las subunidades.
Los ensayos implican poner en contacto la
membrana celular de una célula eucariótica recombinante que expresa
al menos una subunidad de un canal de calcio humano con un compuesto
de ensayo y midiendo la capacidad del compuesto de ensayo de unirse
específicamente a la membrana o alterar o modular la actividad de un
canal de calcio heterólogo en la membrana.
En las realizaciones preferidas, el ensayo
utiliza una célula recombinante que tiene un canal de calcio
recombinante que contiene una subunidad \alpha_{1E} de un canal
de calcio humano en combinación con una subunidad \beta de un
canal de calcio humano y/o una subunidad \alpha_{2} de un canal de
calcio humano.
En ciertas realizaciones, los ensayos para
identificar los compuestos que modulan la actividad de los canales
de calcio se ejercen mediante la medición de la actividad de los
canales de calcio de una célula eucariótica que tiene un canal de
calcio heterólogo funcional cuando dichas célula se expone a una
solución que contiene el compuesto de ensayo y un ión selectivo del
canal de calcio y comparando la actividad medida de los canales de
calcio con la actividad de los canales de calcio de la misma célula
o una célula de control idéntica sustancialmente en una solución que
no contiene el compuesto de ensayo. La célula se mantiene en una
solución que contiene una concentración de iones de de los canales
de calcio selectivos suficiente para proporcionar una corriente
interna cuando se abre el canal. Las células recombinantes que
expresan los canales de calcio que incluyen cada una de las
subunidades \alpha_{1}, \beta y \alpha_{2} se prefieren
especialmente para uso en dichos ensayos. Los expertos en la técnica
conocen los procedimientos para ejercer dichos ensayos. Por ejemplo,
para procedimientos similares aplicados con oocitos de Xenopus
laevis y receptores de acetilcolina, véase Mishina y col.,
[(1985) Nature] 313: 364 y con dicho oocitos y canales de
calcio [véase, Noda y col (1986) Nature 322: 826: 828]. Para
estudios similares que se han llevado a cabo con el receptor de
acetilcolina véase, por ejemplo, Claudio y col., [(1987)
Science 238: : 1688-1694].
Los canales de calcio recombinantes o heterólogos
funcionales se pueden identificar mediante cualquier procedimiento
conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar
los procedimientos electrofisiológicos para medir la corriente a
través de una membrana selectiva de iones de una célula que se
conocen bien. La cantidad y duración del flujo de iones de calcio
selectivos mediante los canales de calcio heterólogos de una célula
recombinante que contiene DNA que codifica una o más de las
subunidades proporcionadas en esta memoria descriptiva se han medido
usando un electrodo doble y las técnicas de pinzamiento zonal de las
célula completa. Con el fin de mejorar la sensibilidad de los
ensayos, se pueden utilizar los procedimientos conocidos para
eliminar o reducir las corrientes no de calcio y las corrientes de
calcio que se producen a partir de los canales de calcio endógenos,
cuando se miden las corrientes de calcio a través los canales
recombinantes.
Por ejemplo, el DHP Bay K 8644 potencia
específicamente la función de los canales de calcio de tipo L
mediante el incremento de la duración del estado abierto de los
canales [véase, por ejemplo, Hess, J. B. y col., (1984)
Nature 311: 538-534]. La apertura prolongada
de los canales da como resultado corrientes de calcio de magnitud y
duración aumentada. Las corrientes de cola se pueden observar tras
la repolarización de la membrana celular después de la activación de
los canales iónicos mediante un comando de voltaje de
despolarización. Los canales abiertos requieren un tiempo finito
para cerrarse o "desactivarse" después de la depolarización y
la corriente que fluye a través de durante este período se denomina
corriente de cola. Debido a que el Bay K 8644 prolonga los
acontecimientos de apertura en los canales de calcio, esto tiendo a
prolongar estas corrientes de cola y hacerlas más pronunciadas.
En la práctica de estos análisis, las
alteraciones de las células transfectadas estable o temporalmente o
las células inyectadas que expresan los canales de calcio humanos
dependientes de voltaje que contienen una o más de las subunidades
de un canal de calcio humano se pueden usar deseablemente en ensayos
para identificar agentes, tales como los agonistas y antagonistas de
los canales de calcio, que modulan la actividad de los canales de
calcio. El ensayo funcional de la actividad de los compuestos de
ensayo, que incluyen los compuestos que tienen una actividad
desconocida, de la actividad del agonista o antagonista para
determinar si el compuesto de ensayo potencia, inhibe o altera de
otra manera el flujo de los iones de calcio u otros iones a través
de un canal de calcio se pueden llevar a cabo mediante (a) mantener
una célula eucariótica que se transfecta o se inyecta para expresar
un canal de calcio heterólogo funcional capaz de regular el flujo de
los iones selectivos de los canales de calcio en la célula en un
medio que contiene iones selectivos de los canales de calcio (i) en
presencia de y (ii) en ausencia de un compuesto de ensayo; (b)
mantener la célula en condiciones tales que los canales de calcio
heterólogos están cerrados sustancialmente y los canales de calcio
endógenos de la célula están sustancialmente inhibidos (c)
despolarizar la membrana de la célula mantenida en la etapa (b) a un
grado y durante una duración de tiempo suficiente para ocasionar
(preferiblemente, solamente sustancialmente) los canales de calcio
heterólogos para hacerse permeables a los iones selectivos de los
canales de calcio; y (d) comparar la cantidad y duración del flujo
de corriente en la célula en presencia del compuesto de ensayo al
del flujo de corriente en la célula, o una célula sustancialmente
similar en ausencia del compuesto de ensayo.
Los ensayos que de esta manera usan células,
proporcionados en esta memoria descriptiva, que expresan los canales
de calcio heterólogos funcionales y miden funcionalmente, tal como
electrofisiológicamente, la capacidad de un compuesto de ensayo para
potenciar, antagonizar o de otra manera modular la magnitud y
duración del flujo de los iones selectivos de los canales de calcio,
tales como Ca^{++} o Ba^{++}, a través del canal heterólogo
funcional. La cantidad de corriente que fluye a través de los
canales de calcio recombinantes de una célula se puede determinar
directamente, tal como electrofisiológicamente, o mediante el
control de una reacción independiente que se produce
intracelularmente y que está directamente influenciada de una manera
dependiente del ión calcio (u otro). Se puede utilizar cualquier
procedimiento para valorar la actividad de un canal de calcio junto
con las células y ensayos proporcionados en esta memoria
descriptiva. Por ejemplo, en una realización del procedimiento para
ensayar un compuesto para su capacidad de modular la actividad de
los canales de calcio, la cantidad de corriente se mide por su
modulación de una reacción que es sensible a los iones de los iones
selectivos de los canales de calcio y utiliza una célula
eucariótica que expresa un canal de calcio heterólogo y también
contiene un elemento de control transcripcional unido operativamente
para la expresión a un gen estructural que codifica una proteína
indicadora. El elemento de control transcripcional usado para la
transcripción del gen indicador es sensible en la célula a un ión
selectivo de los canales de calcio, tales como Ca^{2+} y
Ba^{2+}. Los detalles de dichos ensayos fundamentados
transcripcionales se describen en el documento
WO-A-9202639, véase también el
documento WO-A-9313423.
El LES (Lupus Eritematoso Sistémico) es una
enfermedad autoinmune caracterizado por una liberación insuficiente
de acetilcolina de los terminales nerviosos motores que son
normalmente sensibles a los impulsos nerviosos. Las inmunoglobulinas
(abreviadamente IgG) de los pacientes con LES bloquean los canales
de calcio individuales dependientes de voltaje y de este modo
inhiben la actividad de los canales de calcio [Kim y Neher,
Science 239: 405-408 (1988)]. El ensayo de
diagnóstico para LES depende de la reactividad inmunológica de la
IgG de LES con los canales de calcio de humanos o las subunidades
particulares solas o en combinación o expresadas en la superficie de
las células recombinantes. Por ejemplo, dicho ensayo se puede basar
en la inmunoprecipitación de la IgG de LES mediante las subunidades
de los canales de calcio humanos y las células que expresan dichas
subunidades expresadas en esta memoria descriptiva.
En relación con el tratamiento terapéutico de
diversos estados patológicos, la disponibilidad del DNA que codifica
las subunidades de los canales de calcio humanos permite la
identificación de cualquier alteración en dichos genes (por ejemplo,
mutaciones) que pueden correlacionarse con la existencia de ciertos
estados patológicos. Además, se hace posible la creación de modelos
animales de dichos estados patológicos mediante la introducción
específica de dichas mutaciones en los fragmentos de DNA sintéticos
que después se pueden introducir en animales de laboratorio o en
sistemas de ensayo in vitro para determinar los efectos de
los mismos.
También, la selección genética se puede llevar a
cabo utilizando las secuencias de nucleótidos como sondas. De este
modo las muestras de ácidos nucleicos a partir de sujetos que tienen
estados patológicos sospechosos de implicar alteración/modificación
de una cualquiera o más de las subunidades de los canales de calcio
se puede seleccionar con sondas apropiadas para determinar si existe
cualquier anormalidad con respecto a cualquiera de los canales de
calcio endógenos. De manera similar los sujetos que tienen una
historia familiar de estados patológicos relativos a la disfunción
de los canales de calcio se puede seleccionar para determinar si
también ellos están predispuestos a dichos estados patológicos.
Los siguientes ejemplos se incluyen solamente con
propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la
invención.
Las células IMR32 se obtuvieron de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (abreviadamente ATCC, número de acceso
CCL127, Rockville, MD) y desarrolladas en DMEM 10% de suero bovino
fetal, 1% de penicilina/estreptomici-na (GIBCO,
Grand Island, NY) más dibutiril cAMP (abreviadamente dbcAPM) 1,0 mM
durante diez días. Se aisló el RNA total a partir de las células
según el procedimiento descrito por H. C. Birnboim [(1998)
Nucleic Acids Research 16:1487-1497]. Se
seleccionó poli (A^{+}) RNA según los procedimientos estándar
[véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning, A
Laboratory Manula, Cold spring Harbor Laboratory Press; pg.
7.26-7.29].
Tejido de tálamo humano (2,34 g), obtenido del
National Neurological Research Bank, Los Ángeles, CA que se había
congelado a –70ºC se pulverizó utilizando un mortero y almirez en
presencia de nitrógeno líquido y se lisaron las células en 12 ml de
tampón de lisis (isotiocianato de guanidinio 5 M, Tris 50 mM, pH
7,4, EDTA 10 mM, \beta-mercaptoetanol al 5%). Se
añadió el tampón de lisis al lisado para producir un volumen final
de 17 ml. Se añadieron N-laurilsarcosina y CsCl a la
mezcla para producir concentraciones finales de 4% y 0,01 g/ml
respectivamente en un volumen final de 18 ml.
Se centrifugó la muestra a 9.000 rpm en un rotor
Sorvall SS34 durante 10 minutos a temperatura ambiente para retirar
el material insoluble en forma de un sedimento. Se dividió el
sobrenadante en dos porciones iguales y cada una se separó en fases
en una almohadilla de 2 ml de una solución de CsCl 5,7 M, EDTA 0,1 M
contenido en tubos de centrífuga separados para producir
aproximadamente 9 ml por tubo. Se centrifugaron las muestras en un
rotor SW41 a 37.000 rpm durante 24 horas a 20ºC.
Después de la centrifugación, cada sedimento de
RNA se vuelve a suspender en 3 ml de ETS (TRIS 10 mM, pH 7,4, EDTA
10 mM, 0,2% de SDS) y NaCl 0,25 M y es combinado en un solo tubo. El
RNA es precipitado con una solución 0,25 M de NaCl y dos volúmenes
de etanol al 95%.
Se recogió el precipitado mediante centrifugación
y se volvió a suspender en 4 ml de tampón PK (TRIS 0,05 M, pH 8,4
NaCl 0,14 M, EDTA 0,01 M, 1% de SDS). Se añadió proteinasa K a la
muestra hasta una concentración final de 200 \mug/ml. Se incubó la
muestra a 22ºC durante una hora, seguido de la extracción con un
volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:48:2) dos
veces, seguido por una extracción con un volumen igual de
cloroformo:aochol isoamílico (24:1). Se precipitó en RNA con etanol
y NaCl. Se volvió a suspender el precipitado en 400 \mul de tampón
ETS. La producción de RNA total fue aproximadamente 1,0 mg. Se aisló
Poli A^{+} RNA (30 \mug) a partir de RNA total según los
procedimientos estándar establecidos en el ejemplo I.A.1.
Se sintetizó cDNA de doble hebra según los
procedimientos estándar [véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989)
en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Capítulo 8]. Se preparó cada biblioteca de
la misma manera sustancialmente excepto con las diferencias: 1) el
nucleótido usado para cebar la síntesis de la primera hebra de cDNA,
2) los adaptadores que se adjuntaron al cDNA de hebra doble, 3) el
procedimiento usado para retirar los adaptadores libres o no
utilizados y 4) el tamaño del cDNA fraccionado ligado en el vector
del fago \lambda.
El cDNA de hebra sencilla se sintetizó usando
poli (A^{+}) RNA de IMR32 (ejemplo I.A.1.) como molde y se cebaron
utilizando oligo (dT)_{12-18}
(Collaborative Research Inc, Bedford, MA). El cDNA de hebra sencilla
se convirtió a cDNA de doble hebra y la producción fue
aproximadamente 2\mug. Adaptadores EcoI:
5'-AATTCGGTACGTACACTCGAGC-3'
= 22 meros (SEC ID Nº
15)
3'-GCCATGCATGTGAGCTCG-5'
= 18 meros (SEC ID Nº
16)
que también contenía los sitios de restricción
SnaBI y XhoI se añadieron después al cDNA de doble
hebra según el procedimiento
siguiente.
Los 18 meros se fosforilaron utilizando
procedimientos estándar [véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989)
en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Capítulo 8] mediante la combinación en un
volumen total de 10 \mul los 18 meros (225 pmoles) con [^{32}P]
\lambda-ATP (7000 Ci/mmol9; 1,0 \mul) y quinasa
(2 U) e incubando a 37ºC durante 15 minutos. Después de la
incubación, se añadieron 1 \mul de ATP 10 mM y 2 U adicionales de
quinasa y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos.
Después la quinasa se inactivó mediante
ebullición durante 10 minutos.
Los 22 meros se hibridaron a los 18 meros
fosforilados mediante la adición de 225 pmoles de los 22 meros (más
agua para llegar a un volumen de 15 \mul) e incubación a 65ºC
durante 5 munutos. Después la reacción se dejó enfriar hasta
temperatura ambiente.
Los adaptadores estuvieron así presentes a una
concentración de 15 pmoles/\mul y se dispusieron para la ligación
a los adaptadores de cDNA.
Después de que los adaptadores EcoI,
SnaBI, XhoI se ligaron al cDNA usando un protocolo
estándar [véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989) en:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Capítulo 8], se inactivó la ligasa calentando la
mezcla hasta 72ºC durante 15 minutos. Se añadieron los siguientes
reactivos a la reacción de ligación y se calentaron hasta 37ºC
durante 30 minutos: la reacción de ligación de cDNA (20 \mul),
agua 24 \mul), tampón quinasa 10 x (3 \mul) ATP 10 mM (1 \mul)
y quinasa (2 \mul de 2 U/\mul). Se detuvo la reacción mediante
la adición de 2 \mul de EDTA 0,5 M, seguido de una extracción en
fenol/cloroformo y una extracción en cloroformo.
El cDNA de doble hebra con los adaptadores
EcoI, SnaBI, XhoI ligados se purificaron de
los adaptadores libres o no ligados usando una columna de 5 ml de
Sepharose CL-4B (Sigma, St. Louis, MO). Se
recogieron fracciones de 100 \mul y los que contenían el cDNA se
determinaron controlando la radiactividad, se reunieron, se
precipitaron con etanol, se volvieron a suspender en tampón TE y se
cargaron en un gel de agarora al 1%. Después de la electroforesis se
tiñó el gel con bromuro de etidio y la fracción de 1 a 3 kb se cortó
del gel. Se eluyó el gel embebido en la agarosa usando el
"Geneluter Electroelution System" (Invitrogen, San Diego, CA).
El cDNA eluido recogió mediante precipitación con etanol y se volvió
a suspender en tampón TE a 0,10 pmol/\mul. Se ligó el cDNA a 1
\mug de EcoRI digerido, \lambdagt11 desfosforilado en un
volumen de reacción de 5 \mul a una relación de exceso molar 2 a
4 veces de cDNA sobre el vector \lambdagt11. El \lambdagt11
ligado que contenía la inserción de cDNA se empaquetó dentro de los
viriones del fago \lambda in vitro utilizando el kit
Gigapack (Stratagene, La Jolla, CA). El fago empaquetado se sembró
en un césped de bacterias de E. coli Y1088 en preparación
para selección.
Esta biblioteca se preparó como se describe
(ejemplo I.B.1) con la excepción de que los fragmentos de cDNA de 3
a 9 kb se ligaron en el vector del fago \lambdagt11 en lugar de
los fragmentos de 1 a 3 kb.
Se utilizó el poli (A^{+}) RNA de las células
IMR32 (ejemplo I.A.1.) como molde para sintetizar el cDNA de hebra
sencilla. Los cebadores de la síntesis de la primera hebra de cDNA
fueron los cebadores aleatorios (hexadesoxinucleótidos
[pd(N)_{6}] Cat #5020-1, Clontech,
Palo Alto, CA). Se sintetizó el cDNA de doble hebra, se añadieron
los adaptadores EcoI, SnaBI, XhoI al cDNA, los
adaptadores no ligados se retiraron y el cDNA de doble hebra con los
adaptadores se fraccionó en un gel de agarosa como se describe en
el ejemplo I.B.1. La fracción de cDNA mayor que 1.8 kb se eluyó de
la agarosa, se ligó en \lambdagt11, se empaquetó y se sembró en
un césped de bacterias de Y1088 (como se describe en el ejemplo
I.B.1.).
Se utilizó el poli (A^{+}) RNA de las células
IMR32 (ejemplo I.A.1.) como molde para sintetizar el cDNA de hebra
sencilla. Los cebadores de la síntesis de la primera hebra de cDNA
fueron los oligonucleótidos: 89-365a específicos
para la secuencia codificadora de la subunidad \alpha_{1D} (VDCC
III) tipo \alpha_{1} (véase ejemplo II.A.) (la secuencia
complementaria del nucleótido 2927 al 2956, SEC ID Nº 1),
89-495 específicos para la secuencia codificadora
(la secuencia complementaria del nucleótido 852 al 873, SEC ID Nº
3), para de la subunidad \alpha_{1} del tipo \alpha_{1C} (VDCC
II) (véase el ejemplo II.B.) y 90-12 específicos
para la secuencia codificadora (la secuencia complementaria del
nucleótido 2496 al 2520, SEC ID Nº 3), para de la subunidad
\alpha_{1C}. Después la biblioteca de cDNA se construyó como se
describe (ejemplo I.B.3), excepto que la fracción del tamaño de cDNA
mayor que 1,5 kb se eluyó de la agarosa en lugar de la fracción
mayor que 1,8 kb.
Se construyó la biblioteca de cDNA como se ha
descrito (ejemplo I.B.3.) con la excepción de que la fracción del
tamaño mayor que 1,2 kb se eluyó de la agarosa en lugar de la
fracción mayor que 1,8 kb.
Se utilizó poli (A^{+}) RNA de tálamo humano
(ejemplo I.A.2.) como molde para sintetizar cDNA de hebra sencilla.
Oligo (dT) se utilizó para cebar la síntesis de la primera hebra
(Ejemplo I.B.1). El cDNA de doble hebra se sintetizó (ejemplo
I.B.1.) y los adaptadores EcoI, KpnI, Ncol de
la secuencia siguiente:
5' CCATGGTACCTTCGTTGACG 3' =
20 meros (SEC ID Nº
17)
3' GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA
5' = 24 meros (SEC ID Nº
18)
se ligaron al cDNA de doble hebra como se ha
descrito (ejemplo I.B.1.) reemplazando los 20 meros a los 18 meros y
los 24 meros reemplazando a los 22 meros. Se retiraron los
adaptadores no ligados pasando la mezcla
cDNA-adaptador a través de una columna de 1 ml Bio
Gel A-50 (Bio-Rad Laboratorios,
Richmond, CA). Se recogieron las fracciones (30 \mul) y 1 \mul
de cada fracción en el primer pico de radiactividad se sometió a
electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Después de la
electroforesis, se secó el gel en un secador de gel a vacío y se
expuso a una película de Rayos X. Las fracciones que contenían los
fragmentos de cDNA mayores que 600 pares de bases se reunieron, se
precipitaron con etanol y se ligaron en \lambdagt11 (ejemplo
I.B.1.). Se completó la construcción de la biblioteca de cDNA como
se ha descrito (ejemplo
I.B.1.).
La hibridación de los ácidos nucleicos marcados
radiactivamente a DNA inmovilizado con el propósito de seleccionar
bibliotecas de cDNA, transferencias de Southern de DNA, o
transferencias de Northern se realizaron rutinariamente en
condiciones de hibridación estándar [hibridación: formamida
desionizada al 50%, 200 \mug/ml de DNA de esperma de arenque
sonicado (Cat # 223646, Boehringer Mannheim Biochemicals,
Indianápolis, IN), SSPE 5 x, solución de Denhardt 5 x, 42ºC; lavado:
SSPE 0,2 x, SDS al 0,1%, 65ºC]. Las recetas para SSPE y la solución
de Denhardt y la preparación de formamida desionizada se describen
por ejemplo, en Sambrook y col., (1989) en: Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Capítulo
8]. In algunas hibridaciones, se utilizaron condiciones de menor
rigurosidad de manera que la formamida desionizada al 10% se
reemplazó por formamida desionizada al 50% descrito para las
condiciones de hibridación estándar.
Las condiciones de lavado para retirar la sonda
no específica de los filtros era bien de restrictividad alta, media
o baja como se describe más adelante:
- 1) restrictividad alta: SSPE 0,1 x, 0,1% de SDS, 65ºC
- 2) restrictividad media: SSPE 0,2 x, 0,1% de SDS, 50ºC
- 3) restrictividad baja: SSPE 1,0 x, 0,1% de SDS, 50ºC
Se entiende que se pueden lograr rigurosidades
equivalentes utilizando tampones, sales y temperaturas
alternativas.
Se aislaron numerosos clones de cDNA específicos
de \alpha_{1D} con el fin de caracterizar la secuencia
codificadora completa de \alpha_{1D} más las porciones de las
secuencias no traducidas de 5' y 3'. La SEC ID Nº 1 muestra la
secuencia codificadora completa de DNA de \alpha_{1D} más 510
nucleótidos del extremo 5' de la secuencia no traducida de
\alpha_{1D} en el nucleótido de guanidina adyacente al nucleótido
de adenina de la iniciación propuesta de traducción así como los 642
nucleótidos de la secuencia en 3' no traducida. También se muestra
en la SEC ID Nº 1 la secuencia de aminoácidos deducida. Más adelante
se muestra una lista de clones parciales de cDNA usados para
caracterizar la secuencia de \alpha_{1D} y la posición de los
nucleótidos de cada clon relativo a la secuencia de cDNA de
\alpha_{1D} de longitud completa, que se expone en la SEC ID Nº 1.
El aislamiento y caracterización de estos clones se describe más
adelante (Ejemplo II.A.2).
| IMR32 | 1,144 | nt 1 a 510 la secuencia de 5' no traducida de SEC ID Nº 1, |
| nt 511 a 2431, SEC ID Nº 1 | ||
| IMR32* | 1,136 | nt 1627 a 2988, SEC ID Nº 1 |
| nt 1 a 104 del exón adicional de la SEC ID Nº 2 | ||
| IMR32@ | 1,80 | nt 2083 a 6468, SEC ID Nº 1 |
| IMR32^{#} | 1,36 | nt 2857 a 4281, SEC ID Nº 1 |
| IMR32 | 1,163 | nt 5200 a 7635, SEC ID Nº 1 |
* 5' de nt 1627, IMR32 1,136 codifica un intrón y
un exón adicional descrito en el ejemplo II. A.2.d.
@ IMR32 1,80 contiene dos supresiones, nt 2984
a 3131 y nt 5303 a 5349 (SEC ID Nº 1). La supresión del nucleótido
148 (nt 2984 a 3131) se corrigió mediante la realización de una
reacción en cadena de la polimerasa descrita en el ejemplo II.
A.3.b.
# IMR32 1,36 contiene una supresión del nt 132
(nt 3081 a 3212).
Dos millones de recombinantes de la biblioteca #
de cDNA de IMR32 (ejemplo I.B.1.) se seleccionó por duplicado a una
densidad de aproximadamente 200.000 placas por placa de 150 mm
usando una mezcla de fragmentos marcados radiactivamente de la
región codificadora del cDNA de \alpha_{1} de los canales de
calcio del músculo esquelético de conejo [para la secuencia del
cDNA de la subunidad \alpha_{1} de los canales de calcio del
músculo esquelético de conejo, véase, Tanabe y col., (1987).
Nature 328:313-318]:
| Fragmento | Nucleótidos |
| KpnI-EcoRI | -78 a 1006 |
| EcoRI-XhoI | 1006 a 2653 |
| ApaI-ApaI | 3093-4182 |
| Bg1III-SacI | 4487-5310 |
Se realizó la hibridación utilizando condiciones
de hibridación de baja rigurosidad (ejemplo I.C.) y se lavaron los
filtros en baja rigurosidad (ejemplo I.C.). Solamente se identificó
un recombinante específico de \alpha_{1D} (IMR32 1,36) de los 2 x
10^{6} seleccionados. La IMR32 1,36 se purificó en placas mediante
procedimientos estándar (J. Sambrook y col., (1989) Molecular
cloning: A Laboratory Manual, edición 2ª, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, capítulo 8) se subclonó en pGEM3 (Promega,
Madison, WI) y se caracterizó mediante secuenciamiento de DNA.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca # 2 del cDNA de IMR32 (ejemplo
I.B.2.) por duplicado a una densidad de aproximadamente 100.000 por
placa de 150 mm usando el fragmento de cDNA de 1,36 de IMR32
(ejemplo II.A.1) como sonda. Se usaron las condiciones de
hibridación estándar y se lavaron los filtros en condiciones de alta
rigurosidad (ejemplo I.C.). Se identificaron tres placas positivas
una de las cuales era IMR32 1,80. La IMR32 1,80 se purificó en
placas mediante procedimientos estándar, se mapeó por restricción,
se subclonó y se caracterizó mediante secuenciamiento de DNA.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca # 3 del cDNA de IMR32 (ejemplo
I.B.3.) con el fragmento EcoRI-PvuII (nt 2083 a 2518,
SEC ID Nº 1) de IMR32 1,80. La hibridación se realizó utilizando
condiciones de hibridación estándar (ejemplo I.C.) y se lavaron los
filtros en condiciones de alta rigurosidad (ejemplo I.C.). Se
identificaron tres placas positivas una de las cuales era IMR32
1,144. La IMR32 1,144 se purificó en placas, se mapeó por
restricción, y la inserción de cDNA se subclonó en pGEM7Z (Promega,
Madison, WI) y se caracterizó mediante secuenciamiento de DNA. Esta
caracterización reveló la IMR32 1,144 tiene una serie de codones de
ATG que codifican siete metioninas iniciadoras posibles (nt 511 a
531, SEC ID Nº 1). El análisis de amplificación de ácidos nucleicos,
y la secuenciación del DNA de los productos del análisis de
amplificación de los ácidos nucleicos clonados que codifican estos
siete codones de ATG confirmó que esta secuencia está presente en el
transcrito de \alpha_{1} expresada en las células inducidas por
dbcAPM.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca # 4 del cDNA de IMR32 (ejemplo
I.B.4.) con el fragmento EcoRI-PvuII (nt 2083 a 2518,
SEC ID Nº 1) de IMR32 1,80 (ejemplo II.A.1.). La hibridación se
realizó utilizando condiciones de hibridación estándar (ejemplo
I.C.) y se lavaron los filtros en condiciones de alta rigurosidad
(ejemplo I.C.). Se identificaron seis placas positivas una de las
cuales era IMR32 1,136. La IMR32 1,136 se purificó en placas, se
mapeó por restricción, y la inserción de cDNA se subclonó en un
vector del plásmido estándar pSP72 (Promega, Madison, WI) y se
caracterizó mediante secuenciamiento de DNA. Esta caracterización
reveló que la IMR32 1,136 codifica un transcrito de \alpha_{1D}
espliceado incompletamente. El clon contiene los nucleótidos 1627 a
2988 de la SEC ID Nº 1 precedido de un intrón de aproximadamente 640
pares de bases. Este intrón está entonces precedido por un exón de
104 nt (SEC ID Nº 2) que es un exón alternativo que codifica el
dominio transmembrana IS6 [véase, por ejemplo, Tanabe y col., (1987)
Nature 328: 313-318 para una descripción de
la terminología transmembrana IS1 a IVS6] de la subunidad
\alpha_{1D} y puede reemplazar los nt 1627 a 173, SEC ID Nº 1,
para producir un transcrito de \alpha_{1D} y espliceado
completamente.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca # 3 del cDNA de IMR32 (ejemplo
I.B.3.) con el fragmento NcoI-XhoI de IMR32 1,80
(ejemplo II A.1.). La hibridación se realizó utilizando condiciones
de hibridación estándar (ejemplo I.C.) y se lavaron los filtros en
condiciones de alta rigurosidad (ejemplo I.C.). Se identificaron
tres placas positivas una de las cuales era IMR32 1,163. La IMR32
1,163 se purificó en placas, se mapeó por restricción, y la
inserción de cDNA se subclonó en un vector del plásmido estándar
pSP72 (Promega, Madison, WI) y se caracterizó mediante
secuenciamiento de DNA. Esta caracterización reveló que la IMR32
1,163 contiene el codón de terminación de \alpha_{1D}, los
nucleótidos 6994 a 6996 (SEC ID Nº 1).
Los clones de cDNA de \alpha_{1D} IMR32 1,144,
IMR32 1,136, IMR32 1,80 e IMR32 1,163 (ejemplo II.A.2.) se
superponen e incluyen la secuencia codificadora entera de
\alpha_{1D}, nt 511 a 6993 (SEC ID Nº 1) a excepción de una
supresión de 148 pares de bases, nt 2984 a 3131 (SEC ID Nº 1). Las
porciones de estos clones de cDNA parciales se ligaron para generar
un cDNA de \alpha_{1D} de longitud completa en un vector de
expresión eucariótico. El vector resultante se llamó pVDCIII (A). La
construcción de pVDCCIII (A) se realizó en cuatro etapas descritas
en detalle más adelante: (1) la construcción de pVDCCIII/5' usando
porciones de IMR32 1,144, IMR32 1,136 e IMR32 1,80, (2) la
construcción de pVDCCIII/5'.3 que corrige la supresión de 148 nt en
la porción de IMR32 1,80 de de pVDCCIII/5', (3) la construcción de
pVDCCIII/3'.1 usando porciones de IMR32 1,80 e IMR32 1,163 y (4) la
ligación de una porción de la inserción pVDCCIII/5'.3, la inserción
pVDCCIII/3'.1 y pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA) para formar de
pVDCCIII (A). El vector pcDNA1 es un vector de expresión eucariótico
que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV) que es un promotor
constitutivo reconocido por la RNA polimerasa II de las células
hospedadoras de mamíferos.
Cada uno de los fragmentos usados para preparar
la construcción de longitud completa se purificó mediante
electroforesis a través de un gel de agarosa en papel de filtro DE81
(Whatman, Clifton, NJ) y elusión del papel de filtro usando NaCl
1,0 M, TRIS 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM. Típicamente la ligación se
realizó en un volumen de reacción de 10 \mul con una relación
molar igual de fragmento de inserción y un exceso molar dos veces
de la inserción total relativa al vector. La cantidad de DNA usada
era normalmente aproximadamente 50 ng a 100 ng.
Para construir pVDCCIII/5', se digirió IM32 1,144
(ejemplo (II.A.2.c.) con XhoI y EcoRI y el fragmento
que contenía el vector (pGEM7Z), nt 1 a 510 de \alpha_{1D} (SEC
ID Nº 1) y nt 511 a 1732 de \alpha_{1D} (SEC ID Nº 1) se aisló
mediante electroforesis. Se aisló el fragmento
EcoRI-ApaI de nucleótidos 1733 a 2671 (SEC ID Nº 1)
de IMR32 1,136 (ejemplo II.A.2.d.) y se aisló el fragmento
ApaI-HindIII de IMR32 1,80 (ejemplo II.A.2.d.),
nucleótidos 2672 a 4492 (SEC ID Nº 1). Los tres clones de DNA se
ligaron para formar pVDCCIII/5' que contenía nt 1 a 510 (secuencia
no traducida de 5'; SEC ID Nº 1) y nt 511 a 4492 (SEC ID Nº 1).
La comparación de las secuencias de DNA IMR32
1,36 e IMR32 1,80 revelaron que estos dos clones de cDNA se
diferencian completamente en la secuencia que codifica
\alpha_{1D}, nucleótidos 2984 a 3212. El análisis de
amplificación de los ácidos nucleicos de IMR32 1,80 y de RNA
citoplasmático (aislado según Ausubel, F. M. y col., (Eds) (1988)
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,
Nueva York) de IMR32 (1,0 mM, 10 días) inducido por dbcAMP reveló
que la IMR32 1,80 tenía una deleción de 148 nt, nt 2984 a 3131 (SEC
ID Nº 1) y que IMR32 1,36 tenía una deleción de 132 nt, nt 3081 a
3212. Para realizar el análisis de amplificación de ácidos
nucleicos, se cebó la reacción de ampliación con los
oligonuceótidos 112 específicos de \alpha_{1D} (nt 2548 a 2572,
SEC ID Nº 1) y 311 (la secuencia complementaria de nt 3928 a 3957,
SEC ID Nº 1). Después estos productos se reampliaron usando los
oligonucleótidos 310 específicos de \alpha_{1D} (2573 a 2604, SEC
ID Nº 1) y 312 (la secuencia complementaria de nt 3883 a 3909). Este
producto reampliado se digirió con AccI y Bg1II y el
fragmento AccI-Bg1II, nt 2765 a 3890 (SEC ID Nº 1) se
clonó pVDCCIII/5' digerido con AccI-Bg1II para
reemplazar el fragmento AccI-Bg1II de pVDCCIII/5' que
tenía la deleción. Esta nueva construcción se llamó pVDCCIII/5'.3.
La determinación de la secuencia de DNA de pVDCCIII/5'.3 mediante la
región ampliada confirmó la deleción de 148 nt en IMR32 1,80.
Para construir pVDCCIII/3'.1, se subclonó la
inserción de cDNA de IM32 1,163 (ejemplo (II.A.2.e.) en
pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) en forma de un fragmento XhoI. Los sitios XhoI en el fragmento de
pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) en forma de un fragmento XhoI. Los sitios XhoI en el fragmento de
\hbox{cDNA} se equiparon con los adaptadores usados
para construir la biblioteca de cDNA (ejemplo I.B.3.). La inserción
se orientó de manera que la orientación traduccional de la inserción
de IMR32 1,163 era opuesta a la del gen 1acZ presente en el
plásmido, como se confirmó mediante el análisis de las digestiones
por enzimas de restricción del plásmido resultante. Esto se realizó
para evitar la posibilidad de expresión de las secuencias
\alpha_{1D} en las células DH5\alpha transformadas con este
plásmido debido a la fusión con el gen 1acZ. Después el
plásmido se digirió con HindIII y Bg1II y el
fragmento HindIII-Bg1II (el sitio HindIII viene
del vector y el sitio Bg1II está en nt 6220, SEC ID Nº 1)
se eliminó, suprimiendo de esta manera nt 5200 a 6220 (SEC ID Nº 1)
del clon IMR32 1,163 y eliminando esta secuencia del resto del
plásmido que contenía el fragmento Bg1II-XhoI de3', nt
6221 a 7635 (SEC ID Nº 1). Después el pVDCCIII se fabricó mediante
el esplicing junto con el fragmento HindIII-PvuII de
IMR32 1,80 (nucleótidos 4493-5296, SEC ID Nº 1), el
fragmento PvuII-Bg1II de IMR32 1,163 (nucleótidos
5294-6220, SEC ID Nº 1), y el plásmido pBluescript
digerido con HindIII- Bg1II que contenía el fragmento
Bg1II/XhoI de IMR32 1,163 (nt 6221 a 7635, SEC ID Nº
1).
Para construir pVDCCIII (A), se aisló el
fragmento DraI-HindIII (secuencia no traducida 5' nt
330 a 510, SEC ID Nº 1 y la secuencia codificadora nt 511 a 4492,
SEC ID Nº 1) de pVDCCIII/5'.3 (ejemplo II.A.3.b); el fragmento
HindIII-XhoI de pVDCCIII/3'.1 (que contenía nt 4493 a
7635, SEC ID Nº 1, más el sitio XhoI del adaptador) (ejemplo
II.A.3.c.) se aisló; y el vector plásmido, pcDNA1, se digirió con
EcoRV y XhoI y se aisló en un fiel de agarosa. Los
tres fragmentos de DNA se ligaron y MC1061-P3
(Invitrogen, San Diego, CA) se transformaron. Se analizaron los
clones aislados mediante mapeo por restricción y secuenciamiento de
DNA y pVDCCIII (A) se identificó que tenía los fragmentos ligados
correctamente juntos: Dari-HindIII,
HindIII-XhoI, XhoI-EcoRV con el extremo
romo DraI y el sitio EcoRV que se ligan conjuntamente
para formar el plásmido circular.
El extremo amino de la subunidad \alpha_{1D} se
codifica mediante los siete codones consecutivos de metionina de 5'
(nt 511 a 531, SEC ID Nº 1). Esta porción 5' más los nt 532 a 537
que codifican dos residuos lisina se suprimieron de pVDCCIII (A) y
se reemplazaron con un sitio de unión ribosomal eficaz
(5'-ACCACC-3') para formar pVDCCIII.
RS (A). Los experimentos de expresión en los transcritos de esta
construcción se inyectaron en oocitos de Xenopus laevis no
dieron como resultado un engrandecimiento del nivel de expresión de
los canales de calcio dependientes de voltaje de tipo recombinante
relativo al nivel de expresión en oocitos inyectados con transcritos
de pVDCCIII (A).
Se aislaron numerosos clones de cDNA específico
de \alpha_{1C} con el fin de caracterizar la secuencia que
codifica \alpha_{1C}, la iniciación de \alpha_{1C} de
traducción y una región espliceada alternativamente de
\alpha_{1C}. La SEC ID Nº 3 expone una secuencia codificadora de
\alpha_{1C} (\alpha_{1C-1}) y la secuencia de
aminoácidos deducida; SEC ID Nº 36 expone otra variante de esplicing
denominada \alpha_{1C-2}. Las SEC ID Nº 4 y Nº 5
codifican dos extremos posibles del terminal amino de una variante
de esplicing de \alpha_{1C}. La SEC ID Nº 6 codifica un exón
alternativo para el dominio transmembrana IV S3. Se pueden construir
otras variantes de \alpha_{1C} seleccionando los extremos
terminales alternativos amino en lugar de los extremos en las SEC ID
Nº 3 ó 36 y/o insertando el exón alternativo (SEC ID Nº 6) en la
localización apropiada, tal como en la SEC ID Nº 3 en lugar de los
nucleótidos 3904-3987. Además, la secuencia de 75
nucleótidos (nucleótidos 1391-1465 en la SEC ID Nº
3) se puede suprimir o insertar para producir una variante de
esplicing de \alpha_{1C} alternativa.
Más adelante se muestra una lista de clones
usados para caracterizar la secuencia de esplicing de \alpha_{1C}
y la posición de nucleótidos de cada clon relativo a la secuencia
de \alpha_{1C} caracterizada (SEC ID Nº 3). El aislamiento y
caracterización de estos clones de cDNA se describen más adelante
(ejemplo II.B.2).
| IMR32 | 1,66 | nt 1 a 916, SEC ID Nº 3 |
| nt 1 a 132, SEC ID Nº 4 | ||
| IMR32 | 1,157 | nt 1 a 873, SEC ID Nº 3 |
| nt 1 a 89, SEC ID Nº 5 | ||
| *IMR32 | 1,86 | nt 1366 a 2583, SEC ID Nº 3 |
| ®1,16G | nt 758 a 867, SEC ID Nº 3 | |
| IMR32 | 1,37 | nt 2804 a 5904, SEC ID Nº 3 |
| CSN | 1,30 | nt 2199 a 3903, SEC ID Nº 3 |
| nt 1 a 84 de exón alternativo, SEC ID Nº 6 | ||
| IMR32 | 1,38 | nt 2448 a 4702, SEC ID Nº 3 |
| nt 1 a 84 de exón alternativo, SEC ID Nº 6 |
*IMR32 1,86tiene una deleción de 73 nt comprada
con la secuencia de cDNA de la subunidad \alpha_{1} de los canales
de calcio del músculo cardíaco de conejo.
®1,16G es un clon genómico de \alpha_{1C}.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca Nº 6 de cDNA de tálamo humano
(ejemplo I.B.6.) con fragmentos de cDNA de \alpha_{1} de los
canales de calcio de músculo esquelético de conejo como se describe
en el ejemplo II. A. 2. a. La hibridación se realizó usando las
condiciones de hibridación estándar (ejemplo I.C.) y se lavaron los
filtros en baja rigurosidad (ejemplo I.C.). Se identificaron seis
placas positivas una de las cuales era CNS 1,30. La CSN 1,30 se
purificó en placas, se mapeó por restricción, se subclonó y se
caracterizó mediante secuenciamiento de DNA. La CNS 1,30 codifica la
secuencia específica de \alpha_{1C}, nt 2199 a 3903 (SEC ID Nº 3)
seguido de nt 1 a 84 de uno de los dos exones alternativos
identificados de \alpha_{1C} (SEC ID Nº 6). 3' de la SEC ID Nº 6,
CNS 1,30 contiene un intrón y de este modo CNS 1,30 codifica un
transcrito de \alpha_{1C} parcialmente espliceado.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de una biblioteca de DNA genómico humano a base de
\lambdaEMBL3 (Cat # HL1006d Clontech Corp., Palo alto, CA) usando
un fragmento de cDNA de músculo esquelético de conejo (nt -78 a
1006, ejemplo II.A.2.a.). La hibridación se realizó usando las
condiciones de hibridación estándar (ejemplo I.C.) y se lavaron los
filtros en baja rigurosidad (ejemplo I.C.). Se identificaron catorce
placas positivas una de las cuales era 1,16G. El clon 1,16G se
purificó en placas, se mapeó por restricción, se subclonó y se
caracterizaron las porciones mediante secuenciamiento de DNA. El
secuenciamiento de DNA reveló que 1,16G codifica la secuencia
específica de \alpha_{1C} como se describe en el ejemplo II
B.1.
Se seleccionaron aproximadamente 1 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca de cDNA de IMR32 (ejemplo I.B.5.) con
un fragmento KpnI-Sacl de 1,16G (ejemplo II.B.2.b.)
que codifica la secuencia de \alpha_{1C} (nt 758 a 867, SEC ID Nº
3). La hibridación se realizó usando las condiciones de hibridación
estándar (ejemplo I.C.) Después se lavaron los filtros en SSPE 0,5 x
a 65ºC. De las placas positivas, se identificaron IMR32 1,66 e IMR32
1,67. Se purificaron las placas de hibridación, se mapearon por
restricción, se subclonaron y se caracterizaron mediante
secuenciamiento de DNA. Dos de estos clones, IMR 32 1,66 y 1,67
codifican las subunidades \alpha_{1C} como se describe en el
ejemplo II.B.1. Además, IMR32 1,66 codifica un transcrito de
\alpha_{1C} espliceado parcialmente marcado por un dinucleótido
donante de esplicing de GT que comienza en el nucleótido 3' del nt
916 (SEC ID Nº 3). La secuencia de intrones entre 1,66 es de 101 nt
de longitud. IMR32 1,66 codifica la iniciación de \alpha_{1C} de
la traducción, nt 1 a 3 (SEC ID Nº 3) y 132 nt de la secuencia no
traducida 5' (SEC ID Nº 4) preceden el codón de partida en IMR32
1,66.
Se seleccionaron aproximadamente 2 x 10^{6}
recombinantes de la biblioteca # 1 de cDNA de IMR32 (ejemplo I.B.1.)
con el fragmento de cDNA de CNS 1,30 (ejemplo II.B.2.a.) La
hibridación se realizó usando las condiciones de hibridación de baja
rigurosidad (ejemplo I.C.) y se lavaron los filtros en condiciones
de baja rigurosidad (ejemplo I.C.). Cuatro placas positivas se
identificaron, se purificaron en placas, se mapearon por
restricción, se subclonaron y se caracterizaron mediante
secuenciamiento de DNA. Dos de estos clones, IMR 32 1,37 e IMR32
1,38 codifican las subunidades específicas de \alpha_{1C} como se
describe en el ejemplo II.B.1.
La comparación de las secuencias de IMR32 1,37 e
IMR32 1,38 revelaron que el transcrito de \alpha_{1C} incluye dos
exones que codifican el dominio transmembrana IVS3. La IMR32 1,37
tiene un único exón, nt 3904 a 3987 (SEC ID Nº 3) e IMR32 1,38
parece que se esplicea anómalamente para contener ambos exones
yuxtapuestos, nt 3904 a 3987 (SEC ID Nº 3) seguido de nt 1 a 84 (SEC
ID Nº 6). El esplicing alternativo del transcrito de \alpha_{1C}
para contener cualquiera de los dos exones que codifican la región
IVS3 se confirmó mediante la comparación de la secuencia de CNS 1,30
con la secuencia de IMR32 1,37. La CNS 1,30 contiene nt 1 a 84 (SEC
ID Nº 6) precedidos de la secuencia idéntica contenida en IMR32 1,37
para los nt 2199 a 3903 (SEC ID Nº 3). Como se ha descrito en el
ejemplo II.B.2.a., un intrón sigue a los nt 1 a 84 (SEC ID Nº 6).
Dos exones alternativos se han espliceado adyacentes al nt 3903 (SEC
ID Nº 3) representado por la CNS 1,30 e IMR32 1,37.
Se seleccionó la biblioteca # 1 de cDNA de IMR32
(ejemplo I.B.1.) por duplicado utilizando las sondas de nucleótidos
90-9 (nt 1462 a 1491, SEC ID Nº 3) y
90-12 (nt 2496 a 2520, SEC ID Nº 3). Estas sondas de
oligonucleótidos se eligieron con el fin de aislar un clon que
codifique la subunidad \alpha_{1C} entre el extremo 3' de IMR32
1,67 (nt 1717, SEC ID Nº 3) y el extremo 5' de CNA 1,30 (nt 2199,
SEC ID Nº 3): Las condiciones de eran las condiciones de hibridación
estándar (ejemplo I.C.) con la excepción de que la formamida
desionizada al 50% se redujo al 20%. Se lavaron los filtros en
condiciones de baja rigurosidad (ejemplo I.C.). Tres placas
positivas se identificaron, una de las cuales era IMR32 1,86. La
IMR32 1,86 se purificó en placas, se subclonó y se caracterizaron
mediante mapeo de restricción y secuenciamiento de DNA. IMR32 1,86
codifica las secuencias de \alpha_{1C} como se describe en el
ejemplo II.B.1. La caracterización mediante secuenciamiento de DNA
reveló que IMR32 1,86 contiene una deleción de 73 nt comparada con
el DNA que codifica subunidad de \alpha_{1C} de los canales de
calcio del músculo cardíaco de conejo [Mikami y col., (1989)
Nature 340: 230], nt 2191 a 2263. Estos nucleótidos ausentes
corresponden a los nt 2176- 2248 de la SEC ID Nº 3. Debido a que el
extremo 5' de CNS 1,30 se superpone con el extremo 3' de IMR32 1,86,
alguno de estos nucleótidos ausentes, es decir, nt
2205-2248 de la SEC ID Nº 3, se dan cuenta mediante
CNS 1,30. Los nucleótidos ausentes restantes de la deleción de 73
nucleótidos en IMR 1,86 (es decir, nt 2176-2204, SEC
ID Nº 3) se determinaron mediante el análisis de amplificación de
nucleótidos de RNA de células IMR32 inducidas por dbcAPM. La
deleción de 73 nt es una mutación por desplazamiento de fase y, de
este modo, se necesita corregir. La secuencia humana exacta completa
de esta región, (que se ha determinado mediante la secuencia de DNA
de CNS 1,30 y análisis de ampliación de ácidos nucleicos del RNA de
las células IMR32) se puede insertar en IMR32 1,86 mediante
procedimientos estándar, por ejemplo, sustitución de un fragmento de
restricción o mutagénesis dirigida al sitio.
Se seleccionaron aproximadamente un millón de
recombinantes de la biblioteca # 4 de cDNA de IMR32 (ejemplo I.B.4.)
con un fragmento XhoI-EcoRI de IMR32 1,67 que
codifica \alpha_{1C}, nt 50 a 774 (SEC ID Nº 3). La hibridación
se realizó usando las condiciones de hibridación estándar (ejemplo
I.C.) Se lavaron los filtros en alta rigurosidad (ejemplo I.C.). Una
de las placas positivas era IMR32 1,157. Se purificó esta placa, la
inserción se mapeó por restricción y se subclonó a un vector de
plásmido estándar pGEM7Z (Promega, Madison, WI). Se caracterizó el
DNA mediante secuenciación. IMR32 1,157 parece que codifica una
porción alternativa de 5' de la secuencia de \alpha_{1C} que
comienza con los nt 1 a 89 (SEC ID Nº 5) y seguido de nt 1 a 873
(SEC ID Nº 3). El análisis de la secuencia de 5' de 1,66 y 1,157 se
describe más adelante (ejemplo II.B.3.).
Las porciones de las secuencias de IMR32 1,157
(nt 57 a 89, SEC ID Nº 5; nt 1 a 67, SEC ID Nº3), IMR32 1,66 (nt 100
a 132, SEC ID Nº 4; nt 1 a 67, SEC ID Nº 3) se compararon con la
secuencia de cDNA del receptor de CaCB de pulmón de conejo, nt -33 a
67 [Biel y col. (1990) FEBS Lett. 269: 409].Las secuencias
humanas son extremos alternativos posibles 5' del transcrito
\alpha_{1C} que codifica la región de iniciación de la traducción.
IMR32 1,66 se empareja estrechamente con la secuencia de cDNA del
receptor CaCB y diverge de la secuencia de cDNA del receptor CaCB en
la dirección 5' que comienza en el nt 122 (SEC ID Nº 4). El codón de
partida identificado en la secuencia de cDNA del receptor CaCB es el
mismo codón de partida utilizado para describir la secuencia que
codifica \alpha_{1C}, nt 1 a 3 (SEC ID Nº3).
Las secuencias de las variantes de esplicing de
\alpha_{1C}, denominadas \alpha_{1C-1} y
\alpha_{1C}-2 se exponen en las SEC ID números 3 y
36.
Se seleccionó una biblioteca de cDNA de los
ganglios basales humanos con los fragmentos de cDNA de las
subunidades de \alpha_{1} de los músculos esqueléticos de conejo
(véase el ejemplo II.A.2. a para la descripción de los fragmentos)
en condiciones de baja restrictividad. Uno de los clones de
hibridación se utilizó para seleccionar una biblioteca de cDNA de
las células IMR32 para obtener clones de cDNA parciales de
\alpha_{1B}, que se usaban a su vez para seleccionar
posteriormente una biblioteca de cDNA de cálulas IMR32 para clones
parciales de cDNA adicionales. Uno de los clones parciales de
\alpha_{1B} de IMR21 se utilizó para seleccionar una biblioteca
del hipocampo humano oara obtener un clon parcial de \alpha_{1B}
que codifica el extremo 3' de la secuencia codificadora de
\alpha_{1B}. La secuencia de alguna de las regiones de los clones
parciales de cDNA se comparó con la secuencia de los productos del
análisis de ampliación de ácidos nucleicos del RNA de las células
IMR32 para determinar la exactitud de las secuencias de cDNA.
El análisis de ampliación de los ácidos nucleicos
del RNA de las células IMR32 y DNA genómico que utiliza cebadores de
oligonucleótidos correspondientes a las secuencias localizadas en 5'
y 3' del codón de parada del DNA que codifica la subunidad
\alpha_{1B} revelaba un mRNA que codifica \alpha_{1B}
espliceado alternativamente en las células IMR32. Este segundo
producto de mRNA es el resultado de un esplicing diferencial de del
transcrito de las subunidades \alpha_{1B} para incluir otro exón
que no está presente en el mRNA correspondiente a la otra secuencia
de cDNA de \alpha_{1B} en 3' se aislaba inicialmente. Para
distinguir estas variantes de esplicing de la subunidad
\alpha_{1B}, la unidad codificada por una secuencia de DNA
correspondiente a la forma que contiene el exon adicional se
denomina \alpha_{1B-1} (SEC ID Nº 7), mientras que
la subunidad codificada por una secuencia de DNA correspondiente a
la forma que carece del exón adicional se denomina
\alpha_{1B-2} (SEC ID Nº 8). La secuencia de
\alpha_{1B-1} diverge de la de
\alpha_{1B-2} que comienza en el nt 6633 (SEC ID
Nº 7). Después de la secuencia del exón adicional en
\alpha_{1B-1} (nt 6633-6819; SEC
ID Nº 7), las secuencias \alpha_{1B-1} y
\alpha_{1B-2} y son idénticas (es decir, nt
6820-7362 en la SEC ID Nº 7 y nt
6633-7175 en la SEC ID Nº 8). La SEC ID Nº 7 y Nº 8
exponen 143 nt de la secuencia no traducida 5' (nt
1-143) así como 202 nt de la secuencia no traducida
3' (nt 7161-7362, SEC ID Nº 7) del DNA que codifica
\alpha_{1B-1} y 321 nt de la secuencia no
traducida 3' (nt 6855-7175, SEC ID Nº 8) del DNA que
codifica \alpha_{1B2}.
El análisis de ampliación de ácidos nucleicos de
la región IS6 del transcrito \alpha_{1B} y reveló que parecían ser
variantes de esplicing adicionales a base de múltiples tamaños de
fragmentos vistas en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
que contenía los productos de la reacción de ampliación.
Un clon de cDNA de
\alpha_{1B-1} de longitud completa denominado
pcDNA-\alpha_{1B-1} se preparó en
un procedimiento de ocho etapas como sigue.
El sitio de restricción SAcI de pGEM3
(Promega, Madison, WI) se destruyó mediante digestión en el sitio
SacI, produciendo extremos romos mediante tratamiento con
DNApolimerasa T4 y religación. El nuevo vector se denominó
pGEM\DeltaSac.
El fragmento 1 (HindIII/KpnI; nt
2337 a 4303 de la SEC ID Nº 7) se ligó en pGEM\DeltaSac digerido
con HindIII/KpnI para producir p\alpha1,177HK.
El fragmento 1 tiene una deleción de 2
nucleótidos (nt 3852 y 3853 de la SEC ID Nº 7). La deleción se
reparó insertando un fragmento ampliado (fragmento 2) de RNA de
IMR32 en p\alpha1,177HK. Así que, el fragmento 2
(NarI/KpnI; nt 3828 a 4303 de la SEC ID Nº 7) se insertó en p\alpha1,177HK digerido con Nar/KpnI reemplazando la porción NarI/KpnI del fragmento 1 y produciendo p\alpha1,177HK/PCR.
(NarI/KpnI; nt 3828 a 4303 de la SEC ID Nº 7) se insertó en p\alpha1,177HK digerido con Nar/KpnI reemplazando la porción NarI/KpnI del fragmento 1 y produciendo p\alpha1,177HK/PCR.
El fragmento 3 (KpnI/KpnI; nt 4303
a 5663 de la SEC ID Nº 7) se ligó en p\alpha1,177HK/PCR digerido
con KpnI para producir p\alpha1B5'K.
El fragmento 4 (EcoRI/HindIII;
adaptador EcoRI más nt 1 a 2337 de la SEC ID Nº 7) y el
fragmento 5 (fragmento HindIII/XhoI de
p\alpha1B5'K; nt 2337 a 5446 de la SEC ID Nº 7) se ligaron juntos
en pcDNA1 digerido con EcoRI/XhoI (Invitrogen, San
Diego, CA) para producir p\alpha1B5'.
\newpage
El fragmento 6 (EcoRI/ EcoRI; los
adaptadores EcoRI en ambos extremos más nt 5749 a 7362 de la
SEC ID Nº 7) se ligaron en pBluescript digerido con EcoRI
(Stratagen, La Jolla, CA) con el extremo 5' del fragmento proximal
al sitio KpnI en el poliengarce para producir
p\alpha1,230.
El fragmento 7 (KpnI/XhoI; nt 4303
a 5446 de la SEC ID Nº 7) y el fragmento 8 (XhoI/CspI;
nt 5446 a 6259 de la SEC ID Nº 7) se ligaron en p\alpha1,230
digerido con KpnI/CspI (retira nt 5749 a 6259 de la
SEC ID Nº 7 que se codificó en p\alpha1,230 y mantiene nt 6259 a
7362 de la SEC ID Nº 7) para producir p\alpha1B3'.
El fragmento 9 (Sphl/XhoI; nt 4993
a 5446 de la SEC ID Nº 7) y el fragmento 10 (XhoI/XbaI
de p\alpha1B3'; nt 5446 a 7319 de la SEC ID Nº 7) se ligaron en
p\alpha1B5' digerido con SphI/XbaI (retira nt 4993 a
5446 de la SEC ID Nº 7 que se codificó en p\alpha1B5' y mantiene
nt 1 a 4850 de la SEC ID Nº 7) para producir
pcDNA\alpha_{1B-1}.
La construcción resultante
pcDNA\alpha_{1B-1} contiene en pCDNA, una región
codificadora de longitud completa que codifica
\alpha_{1B-1} (nt 144-7362, SEC
ID Nº 7, más la secuencia no traducida 5' (nt 1-143,
SEC ID Nº 7) y la secuencia no traducida 3' (nt
7161-7319, SEC ID Nº 7) en el control
transcripcional del promotor de cMV.
Los clones de DNA que codifican las porciones de
las subunidades \alpha_{1A} de los canales de calcio humanos se
obtuvieron seleccionando la hibridación de bibliotecas de cDNA de
cerebelo humano y ampliación de ácidos nucleicos de RNA de cerebelo
humano. Los clones que corresponden al extremo 3' de la secuencia
codificadora de \alpha_{1A} de se aislaron seleccionando 1 x
10^{6} recombinantes de una biblioteca de cDNA de cerebelo cebado
aleatoriamente (seleccionado por tamaño para inserciones mayores de
2,8 kb en longitud) en condiciones de baja restricción (SSPE 6 X,
solución de Denhart 5 X, SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de DNA de
esperma de arenque sonicado, 42ºC) con el oligonucleótido 704 que
contenía nt 6190-6217 de la secuencia que codifica
\alpha_{1A} de rata [Star y col., (1992) Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos 88: 5621-5625]. Se
realizaron los lavados en condiciones de baja rigurosidad. Se
purificaron varios clones que se hibridaban a la sonda (clones
\alpha1.251-\alpha 1.259 y \alpha 1.244) y se
caracterizaron mediante mapeo por enzimas de restricción y análisis
de secuencia de DNA. Al menos dos de los clones \alpha 1.244 y
\alpha 1.254, contenían un codón de la rerminación de traducción.
Aunque los clones \alpha 1.244 y \alpha 1.254 son de longitudes
diferentes, ambos contienen una secuencia de nucleótidos que
corresponde al extremo 3' de la extremidad del transcrito
\alpha_{1A}, es decir, los dos clones se superponen. Estos dos
clones son idénticos en la región de superposición, excepto que el
clon \alpha 1.244 contiene una secuencia de 5 y una secuencia de
12 nucleótidos que no están presentes en \alpha 1.244.
Para obtener clones codificadores de
\alpha_{1A} adicionales, se seleccionaron 1 x 10^{6}
recombinantes de una biblioteca de cDNA de cerebelo cebado
aleatoriamente (seleccionado por tamaño para inserciones que varían
entre 1,0 y 2,8 kb de longitud) para hibridarse a tres
oligonucleótidos: el oligonucleótido 701 (que contiene los
nucleótidos 2288-2315 de la secuencia codificadora
de \alpha_{1A} de rata), oligonucleótido 702 (que contiene los
nucleótidos 3559-3585 de la secuencia codificadora
de \alpha_{1A} de rata) y el oligonucleótido 703 (que contiene
los nucleótidos 4798-4827 de la secuencia
codificadora de \alpha_{1A} de rata). La hibridación y los
lavados se llevaron a cabo usando las mismas condiciones que las
usadas para la primera selección con el oligonucleótido 704, excepto
que los lavados se llevaron a cabo a 45ºC. Veinte clones (clones
\alpha 1.269-\alpha 1.288) se hibridaron a la
sonda. Varios clones se purificaron en placas y se caracterizaron
mediante mapeo con enzimas de restricción y análisis de secuencia de
DNA. Un clon, \alpha 1.279, contenía una secuencia de
aproximadamente 170 nucleótidos que no está presente en otros
clones correspondientes a la misma región de la secuencia
codificadora. Esta región puede estar presente en otras variantes de
esplicing. Ninguno de los clones contenía un codón de iniciación de
la traducción.
Para obtener los clones correspondientes al
extremo 5' de la secuencia codificadora de \alpha_{1A} humana, se
preparó otra biblioteca de cDNA de cerebelo utilizando el
oligonucleótido 720 (que contiene los nucleótidos
2485-2510 de la SEC ID Nº 22) para cebar
específicamente la síntesis de la primera hebra de DNA. La
biblioteca (8 x 10^{5} recombinantes) se seleccionó para
hibridarse a tres oligonucleótidos: el oligonucleótido 701, el
oligonucleótido 726 (que contiene los nucleótidos
2333-2360 de la secuencia codificadora de
\alpha_{1A} de rata) y el oligonucleótido 700 (que contiene los
nucleótidos 767-2367960 de la secuencia codificadora
de \alpha_{1A} de rata) en condiciones de hibridación y lavado de
baja rigurosidad. Aproximadamente se hibridaron a la sonda 50
placas. Los clones de hibridación \alpha
1.381-\alpha 1.390 se purificaron en placa y se
caracterizaron mediante mapeo con enzimas de restricción y análisis
de secuencias de DNA. Al menos uno de los clones \alpha 1.381
contenía un codón de iniciación de traducción.
El alineamiento de las secuencias de los clones
purificados reveló que las secuencias superpuestas comprendían la
secuencia codificadora de \alpha_{1A} completa. Sin embargo, no
todas las secuencias superpuestas de los clones parciales contenían
sitios convenientes de restricción de enzimas para uso en la
ligación de clones parciales para construir una secuencia
codificadora de \alpha_{1A} de longitud completa. Para obtener
fragmentos de DNA que contienen sitios convenientes de enzimas de
restricción que se podrían usar en la construcción de un DNA de
\alpha_{1A} de longitud completa, cDNA se sintetizó a partir de
RNA aislado de tejido de cerebelo humano y sometido a ampliación de
ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos usados como cebadores
corresponden a la secuencia codificadora de \alpha_{1A} humana
localizada en 5' 1 3' de los sitios de las enzimas de restricción.
Así que, en la primera reacción de ampliación, los oligonucleótidos
753 (que contenía los nucleótidos 2368-2391 de la
SEC ID Nº 22) y 728 (que contenía los nucleótidos
3179-3202 de la SEC ID Nº 22) se usaron como el par
de cebadores. Para proporcionar una cantidad suficiente del
fragmento de DNA deseado, el producto de esta ampliación se volvió a
ampliar usando los nucleótidos 753 y 754 (que contenía los
nucleótidos 3112-3135 de la SEC ID Nº 22 como el par
de cebadores. El producto resultante tenía una longitud de 768 pares
de bases. En la segunda reacción de ampliación, los oligonucleótidos
719 (que contenía los nucleótidos 4950-4975 de la
SEC ID Nº 22) y 752 (que contenía los nucleótidos
5467-5670 de la SEC ID Nº 22) se utilizaron como el
par decebadores. Para proporcionar una cantidad suficiente del
segundo fragmento de DNA, se volvió a ampliar el producto de esta
ampliación utilizando los oligonucleótidos 756 (que contenía los
nucleótidos 5112-5135 de la SEC ID Nº 22) y 752 como
el par de cebadores. El producto resultante tenía una longitud de
559 pares de bases.
Las porciones del clon \alpha1.381, el producto
de ampliación del ácido nucleico de 768 pares de bases, el clon
\alpha1.278, el producto de ampliación del ácido nucleico y el
clon \alpha1.244 se ligaron en los sitios de restricción
convenientes para generar una secuencia de codificadora de
\alpha_{1A} de longitud completa denominada
\alpha_{1A-1}.
La comparación de los resultados del análisis de
secuencias de los clones \alpha1.244 y \alpha1.254 indicaban que
el transcrito primario del gen de la subunidad \alpha_{1A} sufre
esplicing alternativamente para producir al menos dos mRNA variantes
que codifican diferentes formas de la subunidad \alpha_{1A}. Una
forma, \alpha_{1A-1}, se codifica mediante la
secuencia mostrada la SEC ID Nº 22. La secuencia que codifica una
segunda forma, \alpha_{1A-2}, se diferencia de la
secuencia que codifica \alpha_{1A-1} en el
extremo 3' en que carece de una secuencia de 5 nt encontrada en el
clon \alpha1.244 (nucleótidos 7035 7039 de la SEC ID Nº 22). Esta
deleción desplaza la fase de lectura e introduce un codón de
terminación de la traducción que da como resultado una secuencia
codificadora de \alpha_{1A-2} que codifica una
subunidad más corta de \alpha_{1A} que la codificada por una
variante de esplicing de \alpha_{1A-1}.
Consecuentemente, una porción del extremo 3' de la secuencia
codificadora de \alpha_{1A-1} es realmente la
secuencia no traducida en el DNA de
\alpha_{1A-2}. La secuencia completa de
\alpha_{1A-2} que se puede construir ligando
porciones del clon \alpha1.381, el producto de ampliación de
ácido nucleico de 768 pares de bases, el clon \alpha1.278, el
producto de ampliación de ácido nucleico de 559 pares de bases y el
clon \alpha1.254 se exponen en la SEC ID Nº 23.
El DNA que codifica las subunidades \alpha_{1E}
de los canales de calcio humanos se aislaron de bibliotecas de
hipocampo humano. Se secuenciaron los clones. El análisis de las
secuencia de DNA de los clones de DNA que codifican la subunidad
\alpha_{1E} indicó que al menos dos formas espliceadas
alternativamente del mismo transcrito primario de las subunidades de
\alpha_{1E} se expresan. Una forma tiene la secuencia expuesta en
la SEC ID Nº 24 y se denominó \alpha_{1E-1} y la
otra se denominó \alpha_{1E}-3, que tiene la
secuencia obtenida insertando un fragmento de 57 pares de bases
entre los nucleótidos 2405 y 2406 de la SEC ID Nº 24. La secuencia
resultante se expone en la SEC ID Nº 25.
La subunidad denominada
\alpha_{1E-1} tiene un peso molecular calculado de
254.836 y la subunidad denominada \alpha_{1E-3}
tiene un peso molecular calculado de 257.348. La
\alpha_{1E-3} tiene una inserción de 19
aminoácidos (codificada por la SEC ID Nº 25) relativa a
\alpha_{1E-1} en la región que parece estar el
bucle citoplásmico entre los dominios transmembrana IIS6 y
IIIS1.
En una biblioteca de cDNA de hipocampo humano se
rastreó el fragmento de cDNA de la subunidad \beta_{1} de los
canales de calcio de los músculos esqueléticos de conejo (nt 441 a
1379) [para el aislamiento y la secuencia del cDNA de la subunidad
\beta_{1} de los canales de calcio de los músculos esqueléticos
de conejo, véase la patente de estados Unidos Nº 5386025 o Ruth y
col., (1989) Science 245: 1115] usando condiciones de
hibridación estándar (ejemplo I.C.). Una porción de uno de los
clones de hibridación se utilizó para volver a rastrear la
biblioteca del hipocampo para obtener los clones de cDNA
adicionales. Las inserciones de cDNA se los clones de hibridación se
caracterizaron mediante mapeo por restricción y secuenciamiento de
DNA y se compararon con la secuencia del cDNA de las subunidades
\beta_{1} de los canales de calcio de los músculos esqueléticos
de conejo.
Las porciones de los clones de cDNA de la
subunidad \beta_{1} parciales se ligaron para generar un clon de
longitud completa que codifica la subunidad \beta_{1} completa.
La SEC ID Nº 9 muestra la secuencia que codifica la subunidad
\beta_{1} (nt 1-1434) así como una porción de la
secuencia no traducida 3' (nt 1435-1546). La
secuencia de aminoácidos deducida también se proporciona en la SEC
ID Nº 9. Con el fin de realizar los experimentos de expresión, los
clones de cDNA de la subunidad \beta_{1} de longitud completa se
construyeron como sigue:
El fragmento 1 de DNA (\sim 800 pares de bases
de la secuencia no traducida 5' más nt 1-277 de la
SEC ID Nº 9) se ligó al fragmento 2 de DNA (nt
277-1456 de la SEC ID Nº 9 más 448 pares de bases de
la secuencia de intones y se clonó en pGEM7Z. El plásmido
resultante, p\beta_{1}-1,18, contenía un clon de
la subunidad \beta_{1} de longitud completa que incluía un intrón
de 448 pares de bases.
Para la secuencia no traducida 5' de
p\beta_{1}-1,18 con un sitio de unión a
ribosomas, se sintetizó un adaptador de doble hebra que contiene un
sitio EcoRI, la secuencia que codifica un sitio de unión a
ribosomas (5'-ACCACC- 3') y nt 1-25
de la SEC ID Nº 9. El adaptador se ligó al
p\beta_{1}-1,18 digerido con Smal y los
productos de la reacción de ligación se digirieron con
EcoRI.
El fragmento EcoRI de la etapa 2 que
contiene el adaptador EcoRI, el sitio de unión a ribosomas
eficaz y nt 1-1546 de la SEC ID Nº 9 más la
secuencia de intrones se clonó en un vector plásmido y se denominó
p\beta_{1}-1,18RBS. El fragmento EcoRI de
p\beta_{1}-1,18 RBS se subclonó en pcDNA1
digerido con EcoRI con el codón de iniciación proximal al
promotor de CMVpara formar pHBCaCH\beta_{1a}RBS (A).
Fase
4
Para generar un clon de longitud completa que
codifica la subunidad \beta_{1} carente de la secuencia de
intrones, el fragmento 3 de DNA (nt 69-1146 de le
SEC ID Nº 9 más 448 pares de bases de la secuencia de intrones
seguido de nt 1147-1546 de la SEC ID Nº 9), se
sometió a mutágenesis dirigida al sitio para suprimir la secuencia
de intrones, produciendo por lo tanto p\beta_{1} (-). El
fragmento EcoRI-XhoI de
p\beta_{1}-1,18RBS (que contenía el sitio de unión
a ribosomas y nt 1-277 de la SEC ID Nº 9) se ligó al
fragmento XhoI-EcoRI de p\beta_{1} (-) (que contenía
nt 277-1546 de la SEC ID Nº 9) y se clonó en pcDNA1
con la iniciación del proximal de traducción al promotor de CMV. El
plásmido de expresión resultante se denominó pHBCaCH\beta_{1b}RBS
(A).
El análisis de las secuencias de los clones de
DNA que codifican la subunidad \beta_{1} indicó que en la CNS se
expresan alternativamente al menos dos formas de esplicing del
mismo transcrito primario de las subunidad \beta_{1} humana. Una
forma se representa por la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 9 y se
denomina \beta_{1-2}. Las secuencias de
\beta_{1-2} y la forma alternativa
\beta_{1-3} divergen en el nt 1334 (SEC ID Nº 9).
La secuencia completa de \beta_{1-3} (nt
1-1851), que incluye la secuencia no traducida 3'
(nt 1795-1851) se expone en la SEC ID Nº 10.
La secuencia de codificación de \alpha_{2}
neuronal humano completo (nt 35-3310) más una
porción de la secuencia no traducida 5' (nt 1 a 34) así como una
porción de la secuencia no traducida 3' (nt
3311-3600) se expone en la SEC ID Nº 11.
Para aislar en DNA que codifica la subunidad de
\alpha_{2} neuronal humano, los clones genómicos de \alpha_{2}
humana primero se aislaron mediante sondeo de transferencias de
Southern genómicas humanas usando un fragmento de cDNA de la
subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio del músculo
esquelético de conejo [nt 43 a 272, Ellis y col., (1988)
Science 240: 1661]. El DNA genómico humano se digirió con
EcoRI, se sometió a electroforesis, se transfirió y se sondeó
con la sonda de múculo esquelético de conejo usando las condiciones
de hibridación de estándar (ejemplo I.C.) y condiciones de lavado de
baja rigurosidad (ejemplo I.C.). Se identificaron dos fragmentos de
restricción, 3,5 kb y 3,0 kb. Estos fragmentos de restricción
EcoRI se clonaron preparando una biblioteca de \lambdagt11
que contenía los fragmentos EcoRI genómicos humanos variando
entre 2,2 kb y4,3 kb. Se rastreó la biblioteca como se ha descrito
anteriormente usando la sonda de \alpha_{2} de conejo, los clones
de hibridación se aislaron y se caracterizaron mediante
secuenciación de DNA. HGCaCH\alpha2.20 contenía el fragmento de
3,5 kb y HGCaCH\alpha2.9 contenía el fragmento 3,0 kb.
El mapeo de restricción y el secuencia miento de
DNA reveló que HGCaCH\alpha2.20 contiene un exón de 82 pares de
bases (nt 130 a 211 de la secuencia codificadora de \alpha_{2}
humana, SEC ID Nº 11) en un fragmento de restricción de 650 pares
de bases Pstl-Xbal y que HGCaCH\alpha2.9 contiene
105 pares de bases de un exón (nt 212 a 316 de la secuencia
codificadora, SEC ID Nº 11) en un fragmento de restricción
Xbal-Bg1II de 750 pares de bases. Estas fragmentos de
restricción se utilizaron para rastrear la biblioteca de cDNA de
los ganglios basales humanos (ejemplo II.C.2.a). HBCaCH\alpha2.1
se aisló (nt 29 a 1163, SEC ID Nº 11) y se utilizó para rastrear una
biblioteca de cDNA de tronco cerebral (número de acceso de ATCC
37432) obtenida de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301
Parklawn Drive, rockville, MD. 20852. Se aislaron los clones,
HBCaCH\alpha2.5 8nt 1 a 1162, SEC ID Nº 11) y HBCaCH\alpha2.8
(nt 714 a 1562, SEC ID Nº 11, seguido de 1600 nt de la secuencia que
interviene). Un fragmento de 2400 pares de bases de
HBCaCH\alpha2.8 (que comienza en el nt 759 de la SEC ID Nº 11 y
que termina en el sitio SmaI en el intrón) se utilizó para
volver a rastrear la biblioteca del tronco cerebral y aislar
HBCaCH\alpha2.11 (nt 897 a 3600, SEC ID Nº 11). Los clones
HBCaCH\alpha2.5 y HBCaCH\alpha2.11 se superponen para codificar
una proteína completa de \alpha_{2} de cerebro humano.
Para construir pHBCaCH\alpha_{2}A que contiene
el DNA que codifica una subunidad \alpha_{2} de longitud completa
de los canales de calcio humanos, un fragmento
(EcoRI)-PvuII de HBCaCH\alpha2.5 (nt 1 a 1061, SEC
ID Nº 11, adaptador de EcoRI, digestión parcial con
PvuII) y el fragmento PvuII-PstI de
HBCaCH\alpha2.11 (nt 1061 a 2424 SEC ID Nº 1; digestión parcial
con PvuII) se ligaron en pIBI24 digerido con
EcoRI-PstI (Stratagene, La Jolla, CA). Posteriormente,
un fragmento (EcoRI)-PstII (nt 1 a 2424 SEC ID Nº 11)
se aisló y se ligó a un fragmento PstI-(EcoRI)(nt 2424
a 3600 SEC ID Nº 11) de HBCaCH\alpha2.11 en pIBI24 digerido con
EcoRI para producir DNA, HBCaCH\alpha_{2}, que codifica
una subunidad \alpha_{2} de longitud completa. La inserción
EcoRI de HBCaCH\alpha_{2} (nt (1 a 3600, SEC ID Nº 11) se
subclonó en pcDNA1 p(HBCaCH\alpha_{2}A) con el codón
iniciador de metionina proximal al promotor de CMV. La inserción
EcoRI de 3600 pares de bases de HBCaCH\alpha_{2} se
subclonó también en pSV2dHFR [Subramani y col., Mol. Cel
Biol. 1: 854-864] que contiene el promotor
temprano de SV40, el gen de la dihidrofolatorreductasa de ratón,
sitios de poliadenilación y esplicing de SV40 y las secuencias
requeridas para mantener el vector en las bacterias.
El análisis de amplificación de ácidos nucleicos
del transcrito \beta_{1} humano presente en el músculo
esquelético, aorta, hipocampo y ganglios basales y cálulas HEK 293
revelaron un procesamiento diferencial de la región correspondiente
a nt 615-781 de la SEC ID Nº 9 en cada uno de los
tejidos. Se identificaron cuatro secuencias diferentes que dan como
resultado cinco transcritos de \beta_{1} de diferente
procesamiento mediante esta región. Los transcritos de \beta_{1}
de los diferentes tejidos contenían diferentes combinaciones de las
cuatro secuencias, excepto para uno de los transcritos de
\beta_{1} expresados en las células HEK 293
(\beta_{1-5}) que carecían de las cuatro
secuencias.
Ninguna de los cuatro cinco transcritos de
\beta_{1} contenían ninguna de las cuatro secuencias; sin
embargo, para una fácil referencia las cuatro secuencias se exponen
de extremo a extremo en forma de una secuencia de longitud única en
la SEC ID nº 12. Las cuatro secuencias que se procesan
diferencialmente son la secuencia 1 (nt 14-34 en la
SEC ID Nº 12), la secuencia 2 (nt 35 - 55 en la SEC ID Nº 12), la
secuencia 3 (nt 56-190 en las EC ID Nº 12) y las
secuencia 4 (nt 191-271 en la SEC ID Nº 12). Las
formas del transcrito \beta_{1} que se han identificado incluyen:
(1) una forma que carece de la secuencia 1 llamada
\beta_{1-1} (expresada en el músculo esquelético),
(2) una forma que carece de las secuencias 2 y 3 llamada
\beta_{1-2} (expresada en CNS), (3) una forma que
carece de las secuencias 1, 2 y 3 llamada
\beta_{1-4} (expresada en la aorta y en las
células HEK) y (4) una forma que carece de las secuencias
1-4 llamada \beta_{1-5} (expresada
en las células HEK). Adicionalmente, la
\beta_{1-4} y \beta_{1-5}
contienen un nucleótido de guanidina (nt 13 en la SEC ID Nº 12) que
está ausente en las formas \beta_{1-1} y
\beta_{1-2}. Las secuencias de las variantes de
esplicing de \beta_{1} se exponen en la SEC ID números 9, 10 y
33-35.
La secuencia codificadora de \alpha_{2}
neuronal humana (nt 35-3370) más una porción de la
secuencia no traducida 5' (nt 1 a 34) así como una porción de la
secuencia no traducida 3' (nt 3308-3600) se expone
como la SEC ID Nº 11.
El análisis de amplificación de ácidos nucleicos
del transcrito \alpha_{2} humano presente en el músculo
esquelético, aorta, y CNS reveló el procesamiento diferencial de la
región correspondiente a nt 1596-1942 de la SEC ID
Nº 11 en cada uno de los tejidos.
El análisis indicó que el transcrito primariodel
DNA genómico que incluye los nucleótidos correspondientes a nt
1595-1942 también incluyen una secuencia adicional
SEC ID Nº 13: 5'
CTTATTGGTGTAGGTATACCAACAATTAATTTAAGAAAAAGGAGACCCAATATCCAG 3')
insertada entre nt 1624 y 1625 de la SEC ID Nº 11. Se han
identificado cinco transcritos variantes espliceados
alternativamente que difieren en la presencia o ausencia de una a
tres porciones diferentes de la región del transcrito primario que
incluye la región de nt 1595-1942 de la SEC ID Nº 11
más la SEC ID Nº 13 insertada entre nt 1624 y 1625. Los cinco
transcritos codificadores de \alpha_{2} de los tejidos diferentes
incluyen combinaciones diferentes de las tres secuencias, excepto
para uno de los transcritos de \alpha_{2} expresado en la aorta
que carece de las tres secuencias. Ninguno de los transcritos de
\alpha_{2} contenía ninguna de las tres secuencias. Las secuencias
de las tres regiones que se procesan diferencialmente son la
secuencia 1 (SEC ID Nº 13), la secuencia 2 (5' AACCCCAAATCTCAG 3',
que es nt 1625-1639 de la SEC ID Nº 11), y la
secuencia 3 (5' CAAAAAAGGGCAAAATGAAGG 3'que es nt
1908-1928 de la SEC ID Nº 11). Las cinco formas de
\alpha_{2} identificadas son (1) un a forma que carece de la
secuencia 3 llamada \alpha_{2a} (expresada en el músculo
esquelético), (2) una forma que carece de la secuencia 1 llamada
\alpha_{2b} (expresada en CNS), (3) una forma que carece de las
secuencias 1 y 2 llamada \alpha_{2c} (expresada en la aorta), (4)
una forma que carece de las secuencias 1, 2 y 3 llamada
\alpha_{2d} (expresada en la aorta) y (5) una forma que carece de
las secuencias 1 y 3 llamada \alpha_{2e} (expresada en la
aorta).
Las secuencias de
\alpha_{2a}-\alpha_{2c} se exponen en las SEC ID
números 11 (\alpha_{2b}), 29 (\alpha_{2a}) y 30 a 32
(\alpha_{2c}-\alpha_{2c}), respectivamente.
Aproximadamente 1 x 10^{6} de recombinantes de
una biblioteca de cDNA de hipocampo humano a base de \lambdagt11
(Clontech referencia de catálogo #HL1088b, Palo Alto, CA) se
rastrearon mediante hibridación a una secuencia de 484 de pares de
bases del cDNA de la subunidad \gamma de los canales de calcio de
los músculos esqueléticos de conejo (nucleótidos
621-626 de la secuencia codificadora más 438
nucleótidos de la secuencia no traducida 3') contenido en el vector
\gammaJ10 [Jay, S y col., (1990). Science 248:
490-492]. La hibridación se realizó usando
condiciones de rigurosidad moderrada (20% de formamida desionizada,
solución de Denhardt 5x, SSPE 6 x, 0,2% de SDS, 20 \mug/ml de DNA
de esperma de arenque, 42ºC) y se lavaron los filtros en rigurosidad
baja (véase ele ejemplo I.C.). Una palca que se hibrida a esta sonda
se purificó y el DNA de inserción se subclonó en pGEM7Z. Esta
inserción de cDNA se denominó \gamma1,4.
Se confirmó \gamma1,4 mediante hibridación de
DNA y se caracterizó mediante secuenciamiento de DNA. El fragmento
Sstl de 1500 pares de bases de \gamma1,4 se hibridó al
\gammaJ10 de cDNA de la subunidad \gamma de los canales de
calcio de los músculos esqueléticos de conejo en una transferencia
de Southern. El análisis de las SEC de este fragmento revelaron que
contiene aproximadamente 500 nt de la secuencia de DNA humano y
\sim 1000 nt de la secuencia \lambdagt11 (incluido debido a la
destrucción aparente de uno de los sitios de clonación de
EcoRI en \lambdagt11). La secuencia de DNA humano contiene
129 nt de la secuencia codificadora seguida inmediatamente de un
codón de parada traduccional y la secuencia no traducida 3' (SEC ID
Nº 14).
Para aislar la secuencia restante 5' del cDNA de
la subunidad \lambda humana, bibliotecas de cDNA de CNS humanas
y/o preparaciones de mRNA de tejidos de CNS humanos se puedan
ensayar primero mediante los procedimientos de análisis de
amplificación de ácidos nucleicos usando los cebadores de
oligonucleótidos a base de la secuencia de cDNA específico de
\gamma de \gamma1,4. El DNA que codifica la subunidad de
\gamma neuronal humana adicional se puede aislar de las
bibliotecas de cDNA que, basándose en los resultados del ensayo de
los análisis de amplificación de ácidos nucleicos, contienen cDNA
ampliable específico de \gamma.
La secuenciación de los clones aislados como se
describe en el ejemplo III reveló un clon que codifica una subunidad
\beta_{2} de los canales de calcio neuronales humanos (denominada
\beta_{2D} véase, la SEC ID Nº 26). Un oligonucleótido a base del
extremo 5' de este clon se utilizó para cebar uns biblioteca de cDNA
de hipocampo hunano. La biblioteca se rastreó con este clon
\beta_{2} de rigurosidad baja a media (lavado final SSPE 0,5 X,
50ºC). Varios clones de hibridación se aislaron y se secuenciaron.
Entre estos clones estaban los aque codifican \beta_{2C},
\beta_{2D} y \beta_{2E}. Por ejemplo, la secuencia de
\beta_{2C} se expone en la SEC ID Nº 37, y la secuencia de
\beta_{2E} se expone en la SEC ID Nº 38.
Después una biblioteca de hipocampo cebada
aleatoriamente se rastreó usando una combinación de los clones que
codifican \beta_{2D} y una porción del clon de \beta_{3}
depositado en la ATCC con el número de acceso 69048. Se aislaron
clones de hibridación múltiple. Entre estos estaban clones
denominados \beta101, \beta102 y \beta104. El \beta101
parece que codifica el extremo 5' de una variante de esplicing de
\beta_{2}, denominada \beta_{2E}. \beta_{102} y \beta_{104}
codifican las porciones del extremo 3' de \beta_{2}.
Parece que las variantes de esplicing de
\beta_{2} incluyen los nucleótidos 182-2294 de la
SEC ID Nº 26 y se difieren solamente en el codón de partida y los
nucleótidos que corresponden a 212 de la SEC ID Nº 26.
Un clon que contiene un codón de iniciación de
traducción y aproximadamente 60% de la secuencia codificadora de
\beta_{4} se obtuvo a partir de una biblioteca de cDNA de
cerebelo humano (véanse los nucleótidos 1-894 de la
SEC ID Nº 27). Para obtener DNA que codifica la porción 3' restante
de la secuencia codificadora de \beta_{4}, se rastreó una
biblioteca de cDNA de cerebelo humano para hibridación a un
producto de amplificación de ácidos nucleicos en condiciones de
hibridación y lavado de rigurosidad alta. Los clones de hibridación
se purificaron y se caracterizaron mediante mapeo con enzimas de
restricción y análisis de las secuencias de DNA para identificar las
que contienen las secuencias correspondientes al extremo 3' de la
secuencia codificadora de la subunidad \beta_{4} y un codón de
terminación. Los clones seleccionados se ligaron al clon que
contenía la mitad 5' de la secuencia codificadora de \beta_{4} en
los sitios de restricción convenientes para generar un cDNA de
longitud completa que codifica una subunidad \beta_{4}. La
secuencia de un clon de \beta_{4} de longitud completa se expone
en la SEC ID Nº 27; la secuencia de aminoácidos se expone en la SEC
ID Nº 28.
La secuenciación de los clones aislados como se
describe en el ejemplo III también revelaron un clon que codifica
una subunidad \beta_{3} de los canales de calcio neuronales
humanos. Este clon se ha depositado con el plásmido \beta1,42 (Nº
de acceso de ATCC 69048).
Para aislar un clon de cDNA de longitud completa
que codifica una subunidad de \beta_{3} completa, una biblioteca
de cDNA de hipocampo humano (Stratagene, La Jolla, CA) se rastreó
para hibridación a un fragmento EcoRI-PstI en 5' del
cDNA que codifica \beta_{1} usando condiciones de hibridación
(20% de formamida desionizada, 200 \mug/ml de DNA de esperma de
arenque sonicado, SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, 42ºC) y
condiciones de lavado de rigurosidad más baja. Uno de los clones de
hibridación contenía tanto los codones de iniciación y terminación
de la traducción y codifica una subunidad \beta_{3} completa
denominada \beta_{3-1} (SEC ID Nº 19). Los
transcritos in vitro del cDNA se prepararon y se inyectaron
en oocitos de Xenopus junto con los transcritos de los cDND
de \alpha_{1B-1} y \alpha_{2}b usando
procedimientos similares a los descritos en ele ejemplo IX.D. Los
registros de pinzamiento de voltaje de dos electrodos de los oocitos
revelaron corrientes de Ba^{2+} internas dependientes de
voltaje
Un clon adicional que codifica la subunidad
\beta_{3}, denominado \beta_{3-2} se obtuvo
mediante el rastreo de una biblioteca de cDNA de cerebelo humano
para la hibridación al producto de amplificación de ácidos nucleicos
referido en el ejemplo VIII.A en condiciones de hibridación (20% de
formamida desionizada, 200 \mug/ml de DNA de esperma de arenque
sonicado, SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, 42ºC) y condiciones de
lavado de rigurosidad más baja. Los extremos 5' de este clon (SEC ID
Nº 20, \beta_{3-2}) y la primera subunidad
\beta_{3}, denominada \beta_{3-1}, (SEC ID Nº
19) difieren en sus extremos 5' y son variantes de esplicing del
gen de \beta_{3}.
Las células DG44 [células de ovario de hámster
chino dhfr; véase, por ejemplo, Urlaub, G. y col., (1986) Som.
Cell Molec. Genet. 12: 555-566] obtenidas de
Lawrence Chasin en la Universidad de Columbia se transfectaron
establemente mediante los procedimientos de precipitación con CaPO4
[Wigler y col., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
76: 1373-1376] con el vector pSV2dhfr que contenía
el cDNA de la subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio
neuronales humanos (véase el ejemplo IV) para la expresión/selección
policistrónica en células transfectadas. Se desarrollaron los
transfectantes en medio DMEM al 10% sin hipoxantina o timidita con
el fin de seleccionar las células que habían incorporado el vector
de expresión. Se establecieron doce líneas celulares transfectantes
según indicaba su capacidad para sobrevivir en este medio.
Se extrajo el RNA según el procedimiento de
Birnboim [(1988) Nuc. Acids Res. 16:
1487-1497] a partir de cuatro líneas celulares de
DG44 que se habían transfectado establemente con pSV2dhfr que
contenía el cDNA de la subunidad \alpha_{2} de los canales de
calcio neuronales humanos. Se separó el RNA (\sim 15 \mug por
banda) en un gen de agarosa formaldehído, se transfirió a
nitrocelulosa y se hibridó al cDNA de \alpha_{2} de los canales de
calcio neuronales humanos cebado aleatoriamente (hibridación:
formamida al 50%, SSOE 5 x, solución de Denhardt 5 x, 42ºC; lavado:
SSPE 0,2 x, SDS al 0,1%, 65ºC.) El análisis de transferencia de
Northern del RNA total de cuatro de las líneas celulares de DG44
que se habían transfectado establemente con pSV2dhfr que contenía el
cDNA de la subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio
neuronales humanos reveló que una de las cuatro líneas celulares
contenía el tamaño de mRNA de hibridación esperado para el
transcrito del cDNA de la subunidad \alpha_{2}. (500 nt en función
del tamaño del cDNA) cuando se desarrolla en presencia de butirato
de sodio 10 mM durante dos días. El butirato induce no
específicamente la transcripción y a menudo se usa para inducir el
promotor temprano de SV40 [Gorman, C. y Howard, B. (1983) Nucleic
Acids Res. 11: 1631]. Esta línea celular,
44\alpha_{2}-9, también producía espacies de
mRNA más pequeñas (varias especies) y mayores (6800 nt) que el
tamaño esperado para el transcrito del DNA de \alpha_{2} de (5000
nt) que se hibridó a la sonda a base de cDNA de \alpha_{2}. Los
transcritos de 5000 y 6800 nt producidos mediante este
transfectantes ceben contener la subunidad \alpha_{2} entera que
codifica la secuencia y por lo tanto debe producir una proteína de
la subunidad \alpha_{2} de longitud completa. Un transcrito de
8000 nucleótidos que se hibrida débilmente estaba presente en las
células de DG44 no transfectadas y transfectadas. Aparentemente, las
células DG44 transcriben un gen de la subunidad de \alpha_{2} de
los canales de calcio o similar a niveles bajos. El nivel de
expresión de este transcrito de la subunidad \alpha_{2} endógeno
no parecía estar afectada mediante la exposición de las células al
butirato antes del aislamiento de rNA para análisis de northern.
Se extrajo la proteína total de tres de las
líneas celulares de DG44 que se habían transfectado establemente con
pSV2dhfrque contenía el cDNA de la subunidad \alpha_{2} de los
canales de calcio neuronales humanos. Aproximadamente se sonicaron
10^{7} células en 300 \mul de una solución que contenía HEPES 50
mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Un volumen igual de tinte de carga 2 x
[Laemmli, Reino Unido, (1970). Nature 227: 680] se añadió a
las muestras y se sometió la proteína a electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 8% y después se electrotransfirió a nitrocelulosa.
La nitrocelulosa se incubó con antisueros de cobayas policlonales
(dilución 1:200) dirigido contra la subunidad \alpha_{2} de los
canales de calcio de los músculos esqueléticos de conejo (obtenidos
de K. Campbell, Universidad de Iowa) seguido de la incubación con
proteína A-[^{125}I]. La transferencia se expuso a una película de
Rayos X a -70ºC. Las muestras reducidas de la proteína de las
células transfectadas así como de las células no transfectadas
contenían proteína inmunorreactiva del tamaño esperado para la
subunidad \alpha_{2} del canal de calcio neuronal humano
(130-150 kDa). El nivel de esta proteína
inmunorreactiva era más alto en las células
44\alpha_{2}-9 que se habían desarrollado en
presencia de butirato de sodio 10 mM que en las células
44\alpha_{2}-9 que se desarrollaron en auencia de
butirato de sodio. Estos datos se correlacionan bien con los
obtenidos en los análisis de northern del RNA total de las células
44\alpha_{2}-9 y DG44 transfectadas. La línea
celular 44\alpha_{2}-9 también producía una
proteína inmunorreactiva de 110 kd que bien puede ser un producto de
degradación proteolítica de la subunidad \alpha_{2} de longitud
completa o un producto de traducción de uno de los mRNA más cortos
(< 5000 nt) producido en esta línea celular que se hibridaza a la
sonda de cDNA de la subunidad \alpha_{2}.
Las células de riñón embrionarias humanas
(células HEK 293) se transfectaron temporal y establemente con el
DNA neuronal humano que codifica las subunidadaes de los canales de
calcio. Los transfectantes individuales se analizaron
electrofisiológicamente para la presencia de corrientes de bario
activadas por voltaje y los canales de calcio dependientes de
voltaje.
Los vectores de expresión separados que contienen
DNA que codifica las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y
\beta_{1} de los canales de calcio neuronales humanos, plásmidos
pVDCCIII (A), pHBCaCH\alpha_{2}A y pHBCaCH\beta_{1a}RBS (A),
respectivamente se construyeron como se describe en los ejemplos
II.A.3, IV.B y III.B.3 respectivamente. Estos tres vectores se
utilizaron para cotransfectar temporalmente las células HEK 293.
Para la transfección estable de las células HEK 293 se utilizó el
vector pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A) (ejemplo III.B.3.) en lugar de
pHBCaCH\beta_{1a}RBS (A) para introducir el DNA que codifica la
subunidad \beta_{1} en las células junto con pVDCCIII (A) y
pHBCaCH\alpha_{2}A.
Los vectores de expresión pVDCCIII (A),
pHBCaCH\alpha_{2}A y pHBCaCH\beta_{1a}RBS (A) se utilizaron en
dos conjuntos de transfecciones temporales de células HK 293 (Nº de
acceso de la ATCC CRL1573). En un procedimiento de transfección, las
células HEK 293 se cotransfectaron temporalmente con el plásmido de
expresión de cDNA de la subunidad \alpha_{1}, el plásmido de
expresión de cDNA de la subunidad \alpha_{2}, el plásmido de
expresión de cDNA de la subunidad \beta_{2} y el plásmido
pCMV\betagal (Clontech Laboratorios, Palo Alto, CA). El plásmido
pCMV\betagal contiene el gen lacZ (que codifica
\beta-galactosidasa de E. coli) fusionada
al promotor de citomegalovirus (abreviadamente CMV) y se incluyó
en esta transfección como gen marcador para controlar la eficacia de
la transfección. En el otro procedimiento de transfección. Las
células HEK 293 se cotransfectaron temporalmente con en plásmido
pVDCCIII de expresión de cDNA de la subunidad \alpha_{1} y
pCMV\betagal. En ambas transfecciones, 2-4 x
10^{6} células HEK 293 en placas de cultivo de tejidos de 10 cm
se cotransfectaron temporalmente con 5 \mug de cada uno de los
plásmidos incluidos en los experimentos según los procedimientos de
transfección de precipitación con CaPO4 (Wigler y col., (1979)
Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 76:
1373-1376). Se analizaron los transfectantes para la
expresión de \beta-galactosidasa mediante la
tinción directa del producto de una reacción que implica
\beta-galactosidasa y el sustrato de
X-gal [Jones, J. R. (1986) EMBO 5:
3133-3142] y mediante la medición de la actividad
de la \beta-galactosidasa [Millar, J. H. (1972)
Experiments in Molecular Genetics, pp. 352-355,
Cold Spring Harbor Press]. Para evaluar la expresión del cDNA de las
subunidades en estos transfectantes, se analizaron las células para
la producción de los transcritos de las subunidades (análisis de
northern), producción de las proteínas de inducción (análisis de
inmunotransferencia de lisados celulares) y expresión de los canales
de calcio funcionales (análisis electrofisiológico).
Se transfectaron células HEK 293 usando el
procedimiento de transfección de fosfato de calcio [Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Wiley Inter.-Science,
Supplement 14, Unit 9.1.1-9.1.9 (1990)]. Placas de
diez cm que contenía cada una entre uno y dos millones de células
HEK 293 se transfectaron con 1 ml de precipitado de DNA/fosfato de
calcio que contenía 5 \mug de pVDCCIII (A), 5 \mug de pVDCCIII
(A), 5 \mug de pHBCaCH\alpha_{2}A, 5 \mug de
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A), 5 \mug de pCMVBgal y 1 \mug de
pSV2neo (como marcador seleccionable). Después de
10-20 días se desarrollo en medio que contenía 500
\mug de G418, se habían formado las colonias y se aislaron usando
clindros de clonación.
Se ensayaron los transfectantes temporales para
la expresión de la \beta-galactosidasa mediante
ensayos de actividad de \beta-galactosidasa
(Miller, J. H., (1972) Experiments in Molecular Genetics, pp.
352-355, Cold Spring Harbor Press) de lisados de
células (preparados como se describe en el ejemplo VII.A.2) y la
tinción de las células fijadas (Jones, J. R. (1986) EMBO 5:
3133-3142). Los resultados de estos ensayos indican
que aproximadamente el 30% de las células HEK 293 se habían
transfectado.
Se aisló Poli A+ RNA usando el kit de Invitrogen
Fast Trak (Invitrogen, San Diego, CA) de células HEK 293
transfectadas temporalmente con DNA que codifica cada una de las
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen
lacZ o la subunidad \alpha_{1} y el gen lacZ. Se
sometió el RNA a electroforesis en un gel de agarosa y se transfirió
a nitrocelulosa. Después la nitrocelulosa se hibridó con una o más
de las siguientes sondas marcadas radiactivamente: el gen
lacZ, el cDNA que codifica la subunidad \alpha_{1D} de los
canales de calcio neuronales humanos, el cDNA que codifica la
subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio neuronales humanos
o el cDNA que codifica la subunidad \beta_{1} de los canales de
calcio neuronales humanos. Dos transcritos que se hibridaron con el
cDNA que codifica la subunidad \alpha_{1} se detectaron en las
células HEK 293 transfectadas con el DNA que codifica las
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen
lacZ así como en las células HEK 293 transfectadas con el
cDNA de la subunidad \alpha_{1} y el gen lacZ. Una especie
de mRNA tenía el tamaño esperado para el transcrito del cDNA de la
subunidad \alpha_{1} (8000 nucleótidos). La segunda especie de
RNA era más pequeña (4000 nucleótidos) que el tamaño esperado para
este transcrito. El RNA del tamaño esperado para el transcrito del
gen lacZ se detectó en las células transfectadas con el cDNA
que codifica las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y
\beta_{1} y el gen lacZ y en las células transfectadas con
el cDNA de la subunidad \alpha_{1} y el gen lacZ mediante
hibridación a la secuencia del gen lacZ.
El RNA de las células transfectadas con el cDNA
que codifica las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y
\beta_{1} y el gen lacZ también se hibridaron con las
sondas del cDNA de las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1}. Se
hibridaron dos especies de mRNA a la sonda de cDNA de la subunidad
\alpha_{2}. Una especie era del tamaño esperado para el
transcrito del cDNA de la subunidad \alpha_{2} (4000 nucleótidos).
Las otras especies eran mayores (6000 nucleótidos) que el tamaño
esperado de este transcrito. Múltiples especies de RNA en las
células cotransfectadas con el cDNA que codifica las subunidades
\alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen lacZ se
hibridaron a la sonda de cDNA de la subunidad \beta_{1}. Se
produjeron múltiples transcritos de la subunidad \beta de tamaños
variables ya que el vector de expresión del cDNA de la subunidad
\beta contiene dos sitios de adición de poli A^{+}
potenciales.
Las células HEK 293 individuales transfectadas
temporalmente se ensayaron para la presencia de corrientes de bario
dependientes de voltaje usando la variante de célula entera de la
técnica de pinzamiento zonal [Hamil y col., (1981). Pflugers
Arch. 391: 85-100]. Las células HEK 293
transfectadas temporalmente con pCMV\betagal se ensayaron
solamente para corrientes de bario como un control negativo en estos
experimentos. Se situaron las células en una solución de baño que
contenía iones de bario para servir como portador de corriente. Se
utilizó cloruro de colina en lugar de NaCl o KCl como el componente
principal de la sal de la solución del baño para eliminar las
corrientes a través de los canales de sodio y potasio. La solución
del baño contenía MgCl_{2} 1 mM y se tamponó a pH 7,3 con HEPES
10 mM (pH ajustado con hidróxido de sodio o de tetraetilamonio). Las
pipetas zonales se llenaron con una solución que contenía CsCl 135
mM, MgCl_{2} 1 mM, glucosa 10 mM, EGTA 10 mM, ATP 4 mM y HEPES 10
mM (pH ajustado hasta 7,3 con hidróxido de tetraetilamonio). Los
iones de cesio y tetraetilamonio bloquean la mayoría de los tipos de
los canales de potasio. Las pipetas se recubrieron con Sylgard
(Dow-Corning, Midland, MI) y tenían resistencias
entre 1 y 4 megohm. Las corrientes se midieron mediante un resistor
de headstage de 500 megohm con el amplificador Axopatch IC (Axon
Instruments, Foster City, CA), interconectada con un tablero de
adquisición de datos Labmaster (scientific Solutions, Solon, OH) en
un PC compatible IBM. Se utilizó PClamp (Axon instruments) para
generar los comandos de tensión y adquirir datos. Se analizaron los
datos con los programas pClamp o Quattro Professional (Borland
Internacional, scotts Valley, CA).
Para aplicar los fármacos, se usaron pipetas de
"golpe de pistón" posicionadas dentro de varios micrómetros de
la célula en estudio para aplicar las soluciones mediante
aplicación a presión. El fármaco utilizado para la caracterización
farmacológica se disolvió en una solución idéntica a la solución
del baño. Las muestras de una solución madre 10 mM de Bay K 8644
(RBI, Natick, MA) que se había preparado en DMSO, se diluyeron hasta
una concentración final de 1 \muM en una sloción del baño que
contenía Ba^{2+} 15 mM antes de que se aplicaran.
Se analizaron veintiún controles negativos de
células HEK 293 (transfectadas temporalmente con el vector de
expresión pCMV\betagal del gen lacZ solamente mediante la
variante de la célula completa del procedimiento del pinzamiento
zonal para registrar las corrientes. Solamente una célula mostró una
corriente interna de bario discernible; esta corriente no se afectó
por la presencia de Bay K 8644 1 \muM. Además, la aplicación de
Bay K 8644 a cuatro células que no mostraron corrientes de Ba^{2+}
no producían la aparición de ninguna corriente.
\newpage
Dos días después de la transfección temporal de
las células HEK 293 con el cDNA que codifica las subunidades
\alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen lacZ, se
ensayaron los transfectantes individuales para las corrientes de
bario dependientes del voltaje. Las corrientes. Se registraron las
corrientes en nueve transfectantes. Debido a que la eficacia de la
transfección de una célula puede variar de la eficacia de
transfección de otra célula, el grado de expresión de las proteínas
heterólogas en los transfectantes individuales varía y algunas
células no incorporan o expresan el DNA extraño. Las corrientes de
bario internas se detectaron en dos de estos nueve transfectantes.
En estos ensayos el potencial de mantenimiento era de -90 mV. Se
despolarizó la membrana en una serie de etapas de voltaje a
diferentes potenciales de ensayo y se registró la corriente en
presencia y ausencia Bay K 8644 1 \muM. La corriente de bario
interna se potenció significativamente en magnitud mediante la
adición de Bay K 8644. La mayor corriente de bario interna (\sim
160 pA) se registró cuando la membrana se despolarizó hasta 0 mV en
presencia de Bay K 8644 1 \muM. Una comparación de las curvas
I-V, generadas mediante el trazado de la curva mayor
registrada después de cada despolarización frete a la tensión de
despolarización, correspondiente a los registros llevados a cabo en
ausencia y presencia de Bay K 8644 ilustraron el aumento de la
corriente activada por voltaje en presencia de Bay K 8644.
Las corrientes de cola pronunciadas se detectaron
en los trazados de las corrientes generadas en presencia de Bay K
8644 en las células HEK 293 transfectadas con el cDNA que codifica
las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen
lacZ, indicando que los canales de calcio recombinantes
responsables de las corrientes de bario activadas por voltaje
registradas en esta transfectada parecía ser sensible a DHP-
La segunda de las dos células transfectadas que
mostraba corrientes de bario internas expresaba una corriente de
\sim 50 pA cuando se despolarizaba la membrana desde -90 mV. Esta
corriente se bloqueaba casi completamente con cadmio 200 \muM, un
bloqueante de los canales de calcio establecido.
Diez células que se transfectaron temporalmente
con el DNA que codifica la subunidad \alpha_{1} y el gen
lacZ se analizaron mediante los procedimientos de
pinzamiento zonal de células enteras dios días después de la
transfección. Una de estas células mostró una corriente de bario
interna de 30 pA. Esta corriente amplificada dos veces en presencia
de Bay K 8644 1 \muM. además, se detectaron pequeñas corrientes de
cola en presencia de Bay K 8644. Estos datos indican que la
expresión del el cDNA que codifica las subunidades \alpha_{1D} de
los canales de calcio neuronales humanos en las células HEK 293
produce un canal de calcio funcional sensible a DHP.
Las células HEK 293 individuales transfectadas
establemente se ensayaron electrofisiológicamente para la presencia
de corrientes de bario dependientes del voltaje como se describe
para el análisis de electrofisiológicamente de células HEK 293
transfectadas temporalmente (véase el ejemplo VII.B.2c.). En un
esfuerzo para maximizar la actividad de los canales de calcio
mediante la fosforilación mediada por quinasas dependiente de AMP
cíclico [Pelzer y col., (1990) Rev. Physiol. Biochem.
Pharmacol 114: 107-207], se añadió cAMP (sal
sódica 250 \muM) a la solución de la pipeta y se añadió forskolin
(10 \muM) a la solución del baño en alguno de los registros. Se
obtuvieron resultados cualitativamente similares si estos compuestos
estaban presentes o no.
Se registraron corrientes de bario de las células
transfectadas establemente en ausencia y presencia de Bay K 8644 (1
\muM). Cuando se despolarizó la célula hasta -10mV desde un
potencial de mantenimiento de -90 mV en ausencia de Bay K 8644, se
registró una corriente de aproximadamente 35 pA con una corriente de
cola que se desactivaba rápidamente. Durante la aplicación de Bay K
8644, un protocolo despolarizante idéntico producía como respuesta
una corriente de aproximadamente 75 pA, acompañada de una corriente
de cola aumentada y prolongada. Se valoró la magnitud pico de las
corrientes registradas desde este mismo canal como función de una
serie de voltajes despolarizantes. Las respuestas en presencia de
Bay K 8644no solamente aumentaban, sino que la relación de la
tensión de la corriente entera se desplazaba aproximadamente -10mV.
Así que, se observaron tres típicos contrastes de acción de Bay K
8644, a saber magnitud de aumento de corriente, corrientes de cola
prolongadas y tensión de activación desplazada negativamente, que
indicaban claramente la expresión de un canal de calcio sensible a
DHP en estas células transfectadas establemente.. No se observaron
ninguno de dichos efectos en las células HEK 293 no transfectadas,
bien con o sin cAMP o forskolin.
Se construyeron vectores de expresión adicionales
usando pCMV. El cDNA de \alpha_{1D} de longitud completa de
pVDCCIII (A) (véase el ejemplo II.A.3.d), el cDNA de \alpha_{2} de
longitud completa contenido en un fragmento EcoRI de 3600
kp de HBCaCH \alpha_{2} (véase ele ejemplo IV. B) y un cDNA de la
subunidad \beta_{1} de longitud completa de
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A) (véase el ejemplo III.B.3) se
subclonaron separadamente en el plásmido pCMV\betagal. El plásmido
pCMV\betagal se digirió con NotI para retirar el gen
lacZ. La porción del vector restante del plásmido,
denominada pCMV, se despuntó en los sitios NotI. El DNA que
codifica \alpha_{2} de longitud completa y el DNA que codifica
\beta_{1}, contenidos los fragmentos EcoRI separados se
aislaron, se despuntaron y se ligaron separadamente al fragmento del
vector despuntado de pCMV que localizan los cDNA entre el promotor
de CMV y los sitios de poliadenilación de SV40 en pCMV. Para ligar
el cDNA que codifica \alpha_{1D} con pCMV, los sitios de
restricción en los poliengarces inmediatamente 5' del promotor de
CMV e inmediatamente 3' del sitio de poliadenilación SV40 se
retiraron de pCMV. Se añadió un poliengarce en el sitio NotI.
El polienengarce tenía la siguiente secuencia de los sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción:
Después el DNA que codifica \alpha_{1D} aislado
como un fragmento BamHI/XhoI de pVDCCIII (A) se ligó
a pCMV digerido con XbaII/Sa1I para situarlo entre el
promotor de CMV y el sitio de adenilación de SV40.
El plásmido pCMV contiene el promotor CMV lo
mismo que pcDNA1, pero difiere de pcDNA1 en la localización de los
sitios de donante de esplicing/aceptor de esplicing relativos al
DNA que codifica la subunidad insertada. Después de la inserción el
DNA que codifica la subunidad en pCMV los sitios de donante de
esplicing/aceptor de esplicing se localizan en 3' del promotor de
CMV y 5' del codón de partida de DNA que codifica la subunidad.
Después de la inserción del DNA que codifica la subunidad en pcDNA1,
los sitios de donante de esplicing/aceptor de esplicing se
localizan en 3' del codón de parada del cDNA de la subunidad.
Las células HEK 293 se cotransfectaron con el DNA
que codifica las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1} en pCMV o con el DNA que codifica las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta en pcDNA1 (vectores pVDCCIII
(A), pHBCaCH\alpha_{2}A y pHBCaCH\beta_{1b}
RBS (A), respectivamente, como se describe en el ejemplo VII.B.1.a. El plásmido pCMV\betagal se incluyó en cada transfección como una medida de la eficacia de transfección. Los resultados de los ensayos de \betagalactosidasa de los transfectantes (véase el ejemplo VII.B.2), indicaron que las células HEK 293 se transfectaron de manera igual eficazmente con plásmidos a base de pCMV- y pcDNA1. Sin embargo, los plásmidos, a base de pcDNA1 se prefieren actualmente para la expresión de los receptores de los canales de calcio.
RBS (A), respectivamente, como se describe en el ejemplo VII.B.1.a. El plásmido pCMV\betagal se incluyó en cada transfección como una medida de la eficacia de transfección. Los resultados de los ensayos de \betagalactosidasa de los transfectantes (véase el ejemplo VII.B.2), indicaron que las células HEK 293 se transfectaron de manera igual eficazmente con plásmidos a base de pCMV- y pcDNA1. Sin embargo, los plásmidos, a base de pcDNA1 se prefieren actualmente para la expresión de los receptores de los canales de calcio.
Se inyectaron diversas combinaciones de los
transcritos de DNA que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1} preparados in vitro en oocitos de
Xenopus laevis. Los inyectados con combinaciones que incluyen
\alpha_{1D} exhibían corrientes de bario activadas por
voltaje.
Los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} de los canales de calcio
neuronales humanos se sintetizaron según las instrucciones del kit
CAPPING de mRNA de mCAP (Stratagenem La Jolla, CA, número de
catálogo 200350). Los plásmidos pVDCC III. RBS (A), que contenía
pcDNA1 y el cDNA de \alpha_{1D} que comienza con un sitio de unión
a ribosomas y el codón octavo ATG de la secuencia codificadora
(véase el ejemplo III.A.3.d), el plásmido pHBCaCH\alpha_{1A} que
contiene pcDNA1 y un cDNA de la subunidad \alpha_{2} (véase el
ejemplo IV) y el plásmido pHBCaCH\beta_{1b}RSB (A) que contiene
pcDNA1 y el DNA de \beta_{1} carente de la secuencia de intrones
y que contiene un sitio de unión a ribosomas (véase el ejemplo III)
se linealizaron mediante digestión de restricción. Los plásmidos
que codifican la subunidad \alpha_{2} y el cDNA de \alpha_{1D}
se digirieron con XhoI y el plásmido que codifica la
subunidad \beta_{1} se digirió con EcoRV. La inserción de
DNA se transcribió con RNApolimerasa de T7.
Los oocitos de Xenopus laevis se aislaron
y se desfolicularon mediante tratamiento con colagenasa y se
mantuvieron a NaCl 100 mM, KCl 2 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, HEPES 5 mM,
pH7,6, 20 \mug/ml de estreptomicina a 19-25ºC
durante 2 a 5 días después de la inyección y altes de realizar los
registros. Para cada transcrito que se inyectó en el oocito, se
inyectó 6 ng del mRNA específico por célula en un volumen total de
50 nl.
Se examinaron los oocitos inyectados para las
corrientes de bario dependientes del voltaje usando los
procedimientos de pinzamiento de tensión de dos electrodos [Dascal,
N. (1987) CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 317]. Se utilizó el
paquete de software pClamp (Axon Instruments) junto con una
interconexión de adquisición de datos Labmaster de 125 kHz para
generar los comandos de tensión y adquirir y analizar los datos.
También se utilizó Quattro Professional en este análisis. Se
digitalizaron las señales de las corrientes a 1-5
kHz y se filtraron apropiadamente. La solución del baño contenía lo
siguiente: BaCl_{2} 40 mM, cloruro de tetraetilamonio 36 mM
(abreviadamente TEA-Cl), ClK 2 mM,
4-aminopiridina 5 mM, ácido niflúmico 0,15 mM, HEPES
5 mM, pH 7,6.
Se inyectaron los oocitos no inyectados mediante
los procedimientos de pinzamiento de tensión de dos electrodos y se
detectó una corriente interna de Ba^{2+} muy pequeña solamente en
una de las siete células analizadas.
Los oocitos coinyectados con los transcritos de
las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} de
expresaban corrientes de bario interna mantenidas tras la
despolarización de la membrana de un potencial de mantenimiento de
-90 mV a -50 mV (154\pm129 nA, n = 21). Estas corrientes mostraban
típicamente una inactivación pequeña cuando se administraron los
pulsos de prueba variando entre 140 y 700 mseg. La despolarización
de una serie de una serie de voltajes reveló corrientes que primero
aparecían a aproximadamente -30 mV y alcanzaron su punto máximo a
aproximadamente 0 mV.
La aplicación de la DHP Bay K 8644 incrementaba
la magnitud de las corrientes, prolongaba las corrientes de cola
presentes tras la repolarización de la célula e inducía un
desplazamiento hiperpolarizante en la actinación de la corriente. El
Bay K 8644 se preparó reciente a partir de una solución madre en
DMSO y se introdujo en forma de un concentrado 10x directamente en
los 60 \mul de baño mientras la bomba de perfusión se
desconectaba. La concentración de DMSO de las soluciones de los
fármacos diluidos en contacto con la célula nunca excedía de 0,1%.
Los experimentos de control mostraron que 0,1% de DMSO no tenían
ningún efecto sobre las corrientes de las membranas.
La aplicación de la nifedipina antagonista de DHP
(solución madre preparada en DMSO y aplicada a la célula como se ha
descrito para la aplicación de Bay K 8644) bloqueaba una fracción
sustancial (91 \pm 6%, n = 7) de la corriente interna de bario en
oocitos coinyectados con transcritos de las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}. Un componente
inactivador residual de la corriente interna de bario permanecía
típicamente después de la aplicación de la nifedipina. La corriente
interna de bario se bloqueó completamente mediante Cd^{2+} 50
\muM pero solamente aproximadamente un 15% mediante Ni^{2+} 100
\muM.
Se investigó el efecto de \omegaCgTX en las
corrientes de bario internas en los oocitos coinyectados con los
transcritos de las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1}. El \omegaCgTX (Bachem, Inc, Torrance CA) se preparó
en la solución de baño de BaCl_{2} 15 mM más 0,1% de citocromo C
(Sigma) para servir como proteína portadora. Los experimentos de
control mostraron que el citocromo C no tenía ningún efecto sobre
las corrientes. Una serie de pulsos de tensión entre un potencial de
mantenimiento de-90 mV a 0 mV se registró a
intervalos de 20 mseg. Para reducir la inhibición de unión a
\omegaCgTX por cationes divalentes, los registros se hicieron en
BaCl_{2} 15 mM, cloruro de tetraetilamonio 73,5 mM y el resto de
los ingredientes idénticos a la solución registradora de Ba^{2+}
40 mM. El Bay K 8644 se aplicó a la célula antes de la adición a
\omegaCgTXcon el fin de determinar el efecto de \omegaCgTX en
el componente de las corrientes sensibles a DHP que se distinguían
por las corrientes de cola prolongadas. La corriente de bario
interna se bloqueó débilmente (54 \pm 29%, n = 7) y
reversiblemente mediante concentraciones relativamente altas
(10-15 \muM) de \omegaCgTX. Las corrientes de
prueba y las corrientes de cola acompañantes se bloquearon
progresivamente en dos a tres minutos después de la aplicación de
\omegaCgTX pero ambas se recuperaban parcialmente a medida que el
\omegaCgTX fluía del baño.
La contribución de las subunidadaes \alpha_{2}
y \beta_{1} a la corriente de bario interna en oocitos inyectados
con los transcritos que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1} se valoraron para la expresión de la
subunidad \alpha_{1D} sola o en combinación bien con la subunidad
\beta_{1} o la subunidad \alpha_{2}. En los oocitos inyectados
solamente con el transcrito de un cDNA de \alpha_{1D}, no se
detectaron corrientes de Ba^{2+} (n = 3). En los oocitos
inyectados con los transcritos de los cDNA de \alpha_{1D} y
\beta_{1}, se detectaron pequeñas corrientes de Ba^{2+} (108
\pm 39 nA) tras la despolarización de la membrana de un potencial
de mantenimiento de-90 mV que se parece a las
corrientes observadas en las células inyectadas con los transcritos
de los cDNA de \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} aunque la
magnitud de la corriente era menor. En dos de los cuatro oocitos
inyectados con transcritos del DNA que codifica \alpha_{1D} y que
codifica \beta_{1}, las corrientes de Ba^{2+} exhibían una
sensibilidad a Bay K 8644 que era similar a la sensibilidad de Bay
K 8644 de las corrientes Ba^{2+} expresadas en los oocitos
inyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{1-},\alpha_{2-} y \beta_{1}.
Tres de los cinco oocitos inyectados con los
transcritos que codifican las subunidades \alpha_{1D} y
\alpha_{2} exhibían corrientes muy pequeñas de Ba^{2+}
(15-30 nA) tras la despolarización de la membrana de
un potencial de mantenimiento de -90 mV. Estas corrientes de bario
mostraron poca o ninguna respuesta a Bay K 8644.
Para evaluar la contribución de la subunidad de
\alpha, \alpha_{1D} a las corrientes de bario internas
detectadas en los oocitos coinyectados con los transcritos que
codifican las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}
de, los oocitos inyectados con los transcritos que codifican las
subunidades \alpha_{2} y/o \beta_{1} de los canales de calcio
neuronales humanos se ensayaron para las corrientes de bario. Los
oocitos inyectados con los transcritos que codifican la subunidad
\alpha_{2} no mostraba ninguna corriente de bario interna
detectable (n = 5). Los oocitos que inyectados con los transcritos
que codifican una subunidad \beta_{1} mostraba corrientes de bario
internan mensurables (54 \pm 23 nA, n = 5) tras la
despolarización y oocitos inyectados con los transcritos que
codifican las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} mostraron
corrientes internas de bario que eran aproximadamente 50% mayores
(80 \pm 61 nA, n = 18) que las detectadas en oocitos inyectados
con transcritos del DNA que codifica \beta_{1} solamente.
Las corrientes de bario internas en oocitos
inyectados con transcritos que codifican la subunidad \beta_{1} o
las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} se observaron primero
cuando la membrana estaba despolarizada hasta -30 mM de un potencial
de mantenimiento de -90 mV y maximizada cuando se despolarizaba la
membrana hasta 10 a 20 mV. Microscópicamente, las corrientes en los
oocitos inyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} o con transcritos que codifican la
subunidad \beta_{1} eran indistinguibles. En contraste a las
corrientes en oocitos coinyectados con los transcritos de los cDNA
de las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}, estas
corrientes mostraban una inactivación significativa durante el
pulso de prueba y una fuerte sensibilidad para el potencial de
mantenimiento. Las corrientes de bario internas en oocitos
coinyectados con transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} usualmente inactivados hasta
10-60% de la magnitud pico durante un pulso de 140
mseg. y eran significativamente más sensibles al potencial de
mantenimiento que las de en oocitos coinyectados con los transcritos
que codifican las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1}. cambiando el potencial de mantenimiento de las
membranas de oocitos coinyectados con los transcritos que codifican
las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} entre -90 y -50 mV daba
como resultado aproximadamente 81% (n = 11) de reducción en la
magnitud de la corriente de bario interna de estas células. En
contraste, la corriente de bario interna medida en oocitos
coinyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} se redujeron
aproximadamente 24% (n = 11) cuando el potencial de mantenimiento se
cambió de -90 a -50 mV.
Las corrientes de bario internas detectadas en
oocitos inyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} se distinguen farmacológicamente de las
observadas en oocitos coinyectados con transcritos que codifican las
subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}. Los oocitos
inyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} mostraban corrientes de bario internas
que eran insensibles a Bay K 8644 (n = 11). La sensibilidad a
nifedipina era difícil de medir debido a la sensibilidad al
potencial de mantenimiento de la nifedipina y la corriente observada
en los oocitos inyectados con los transcritos que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1}. En cualquier caso, dos
oocitos que se coinyectaron con los transcritos que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} mostraban corrientes de
bario internas (25 a 45 nA) cuando se desmoralizaban de un potencial
de mantenimiento de -50 mV. Estas corrientes eran insensibles a la
nifedipina (5 a 10 \muM). Las corrientes de bario internas en
oocitos inyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} mostraban la misma sensibilidad a los
metales pesados que las corrientes detectadas en oocitos inyectados
con los transcritos que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1}.
La corriente de bario interna detectada en
oocitos inyectados con los transcritos que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} tenían propiedades farmacológicas y
biofísicas que se parecen a las corrientes de calcio en oocitos de
Xenopus no inyectados. Debido a que los aminoácidos de esta
subunidad \beta_{1} de los canales de calcio neuronales humanos
carecen de segmentos hidrófobos capaces de formar dominios
transmembrana, es improbable que las subunidades recombinantes
\beta_{1} solo pueden formar un canal iónico. Es más probable que
una subunidad \alpha_{1} endógena homóloga existe en oocitos y que
la actividad mediada por tal subunidad \alpha_{1} se potencia
mediante la expresión de una subunidad \beta_{1} neuronal
humana.
La expresión temporal de las subunidades
\alpha_{1B-1}, \alpha_{2b} y
\beta-_{1-2} se estudiaron en
células HEK 293. Las células HEK 293 se desarrollaron en forma de un
cultivo de una capa en medio de medio de Eagle modificado por
Dulbecco (Gibco) que contenía 5% de suero de ternera bovino definido
complementado (Hyclone) más penicilina G (100 U/ml) y sulfato de
estreptomicina (100 \mug/ml). Las transfecciones de las células
HEH 293 se mediaron mediante fosfato cálcico como se ha descrito
anteriormente. Las células trasnfectadas se examinaron para las
corrientes internas de Ba^{2+} (I_{Ba}) mediadas por los canales
de Ca^{2+} dependiente de la tensión.
Se transfectaron las células (2 x 10^{6} por
placa recubierta de polilisina. Las transfecciones estándar (palca
de 10 cm) contenían 8 \mug de
pcDNA\alpha_{1B-1}, 5 \mug de
pHBCaCH\alpha_{2}A, 2 \mug de pHBCaCH\beta_{1b}RSB (A)
(véanse los ejemplos II.A.3., IV.B. y III) y 2\mug de CMV\beta
(Clontech) el plásmido de expresión de la
\beta-galactosidasa y pUC18 para mantener una masa
constante de 20 \mug/ml. Se analizaron las células 48 a 72 horas
después de la transfección. Las eficacias de las transfecciones
(\pm 10%), que se determinaron mediante la tinción histoquímica
in situ para la actividad de la
\beta-galactosidasa (Sanes y col., (1986) EMBO
J., 5: 3133), generalmente eran mayores que 50%.
Se estudiaron las propiedades de los canales de
Ca^{2+} expresados de manera recombinante mediante las técnicas de
pinzamiento zonal de las células enteras. Los registros se
realizaron sobre células HEK 293 transfectadas entre 2 y 3 días
después de la transfección. Las células se siembran entre 100.000 y
300.000 células por plca de cultivo de tejido de 35 mm recubierta de
polilisina (Falcon, Oxnard, CA) 24 horas antes de los registros. Las
células se prefusionaron con BaCl_{2} 15 mM, cloruro de cloro 125
mM, MgCl_{2} 1 mM y Hepes 10 mM (pH = 7,3) ajustado con hidróxido
de tetraetilamonio (solución de baño). Las pipetas se llenaron con
CsCl 135 mM, EGTA 10 mM, Hepes 10 mM, trifosfato de adenosina Mg 4
mM (pH = 7,5) ajustado con hidróxido de tetraetilamonio. Sylgard
(Dow-Corning, Midland, MI) revestida, pulido al
fuego y las pipetas llenas tenían resistencias de 1 a 2 megohm antes
de que los sellos de gigohm se establecieran en las células.
El Bay K 8644 y la nifepidina (Research
Biochemicals, Natick, MA) se prepararon a partir de las soluciones
medre (en dimetilsulfóxido) y se diluyó en la solución del baño. La
concentración de dimetilsulfóxido en las soluciones de los fármacos
finales en contacto las células nunca excedóan de 0,1%. Los
experimentos de control mostraron que el dimetilsulfóxido al 0,1% no
tenían ningún efecto en las corrientes de membranas. \omegaCgTX
(Bachem, Inc., Torrance CA) se preparó en la solución del baño de
BaCl_{2} 15 mM más citocromo C al 0,1% (Sigma, St. Louis MO) para
servir como una proteína portadora. Los experimentos de control
mostraron que el citocromo C no tenía ningún efecto en las
corrientes. Estos fármacos se disolvieron en la solución del baño y
se aplicaron de una manera continua mediante los medios de pipetas
de golpe de pistón como se requiere para un experimento dado. Los
registros se realizaron a temperatura ambiente (22ºC a 25ºC9. La
compensación de resistencias en serie (70 a 85%) se empleó para
minimizar el error de la tensión que se producía de la resistencia
de acceso de las pipetas, típicamente 2 a 3,5 megohm. Las señales de
las corrientes se filtraron (-3 dB, 4-pole Bessel) a
una frecuencia de 1/4 a 1/5 de la relación de muestreo que variaba
entre 0,5 y 3 kHz. Los comandos de la tensión se generaron y se
adquirieron los datos con CLAMPEX (pClamp, Axon Instrumentes, Foster
Cyti, CA): Todos los datos indicados se corrigieron para la pérdida
lineal componentes capacitivos. El ajuste exponencial de las
corrientes de realizó con CLAMPFIT (Axon Instruments, Foster City,
CA).
Los transfectantes se examinaron para las
corrientes de Ba^{2+} internas (I_{Ba}). Las células
cotrasfectadas con DNA que codifica las subunidades
\alpha_{1B-1}, \alpha_{2} y
\beta_{1-2} expresaban los canales de Ca^{2+}
activados por alta tensión. La I_{Ba} aparecía primero cuando la
membrana se despolarizó de un potencial de mantenimiento de -90 mV a
-20 mV y maximizada en magnitud a 10 mV. Treinta y nueve de 95
células (12 transfecciones independientes) e iba que varía entre 30
y 2700 pA, con una media de 433 pA. La densidad de corriente media
era 24 pA/pF y la densidad mayor era 150 pA/pF. La I_{Ba}
típicamente aumentaba 2 a 20 veces durante los primeros 5 minutos de
registro. Las despolarizaciones repetidas durante largos registros
revelaban a menudo que la parada de la I_{Ba} usualmente no
excedían el 20% en 10 minutos. La I_{Ba} típicamente activada en
10 ms e inactivada tanto con un tiempo rápido constante varía entre
46 y 105 ms como con un tiempo lento constante que varía entre 291 y
453 ms (N = 3). La inactivación mostró una dependencia de la tensión
compleja de tal manera que la I_{Ba} provocada \geq 20 mV se
inactivaba más lentamente que la I_{Ba} provocaba tensiones de
prueba inferiores, posiblemente un resultado de un incremento en la
magnitud de los componentes de inactivación lenta comparada con los
componentes de la inactivación rápida a tensiones de prueba
mayores.
Los canales \alpha_{1B-1},
\alpha_{2b} y \beta_{1-2} recombinantes eran
sensibles al potencial de mantenimiento. La inactividad de régimen
permanente de la I_{Ba} medida después de 30-60 s
que acondicionaba a diversos potenciales de mantenimiento será
aproximadamente 50% a un potencial de mantenimiento entre -60 y -70
mV y aproximadamente 90% a -40 mV. La recuperación de I_{Ba} a
partir de la incativación era usualmente incompleta, midiendo entre
55 y 75% de la magnitud original en 1 minuto después de potencial de
mantenimiento se retornó a potenciales más negativos, indicando
posiblemente alguna parada o una velocidad de recuperación
lenta.
Los canales \alpha_{1B-1},
\alpha_{2b} y \beta_{1-2} recombinantes también
se bloqueaban irreversiblemente mediante concentraciones de
\omega-CgTX que variaban entre 0,5 y 10 \muM
durante la escala de tiempos de los experimentos. La aplicación de
toxina 5 \muM (n = 7) bloqueaba la actividad completamente en 2
minutos y no se observó la recuperación de I_{Ba} después de
lavado con \omega-CgTX del baño durante hasta 15
minutos. El bloqueo de d^{+2} (50 \muM) era rápida, completa i
reversible; los DHP Bay K 8644 (1 \muM; n = 4) o nifedipina (5
\muM; n = 3) no tenía efecto discernible.
Las células cotransfectadas con DNA que codifica
las subunidades \alpha_{1B-1}, \alpha_{2}b y
\beta_{1}-2 mostraban predominantemente una clase
única de sitios de unión a \omega-CgTX de alta
afinidad. El valor de la constante de disociación (K_{d})
era 54,6 \pm 14,5 pM (n = 4). Las células transfectadas con el
vector que contenía el DNA que contenía solamente el DNA que
codifica la \beta-galactosidasa o el DNA que
codifica \alpha_{2b}\beta no mostraba ninguna unión específica.
La capacidad de unión (B_{max}) de las células transfectadas
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta era 28,710 \pm
11,950 sitios por célula (n = 4).
Estos resultados demuestran que las células
transfectadas
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-2}
expresan la actividad de los canales de Ca^{+2} inactivadores,
activados por alta tensión que está bloqueada irreversiblemente por
\omega-CgTX, insensibles a las DHP y sensibles al
potencial de mantenimiento. Las cinéticas de activación e
inactivación y sensibilidad a la tensión de los canales formados en
estas células son generalmente consistentes con las
caracterizaciones previas de los canales de Ca^{+2} de tipo N
neuronal.
No se detectaron corrientes significativas de
Ba^{+2} en las células HEK 293 no transfectadas. Además, las
células HEK 293 no expresan sitios detectables de unión a GVIA a
\omega-CgTX.
Con el fin de aproximar la expresión de una
población homogénea de los complejos de las proteínas triméricas
\alpha_{1B}, \alpha_{2b} y \beta_{1} en las células
transfectadas HEK 293, los niveles de expresión de \alpha_{1B},
\alpha_{2b} y \beta_{1} se alteraron. La eficacia de expresión
y ensamblaje de los complejos de los canales en la superficie
celular se optimizaron mediante el ajuste de la relación molar de
los plásmidos de expresión \alpha_{1B}, \alpha_{2b} y
\beta_{1} usados en las transfecciones. Los transfectantes se
analizaron para los niveles de mRNA, unión a
\omega-CgTX GVIA y densidad de corriente de los
canales Ca^{+2} con el fin de determinar la expresión de los
canales óptimos próximos en ausencia de los reactivos inmunológicos
para evaluar la expresión de las proteínas. Las relaciones molares
más elevadas de \alpha_{2b} parecían incrementar la actividad de
los canales de calcio.
Las células HEK 293 se mantuvieron en DMEM (Gibco
#320-1965AJ), 5,5% de suero de ternera bovino
definido complementado
(Hyclone-#A-2151-L), penicilna G
(100 U/ml) y estreptomicina 100 \mug/ml. Se realizaron las
transfecciones temporales a base de fosfato de Ca^{2+} y se
analizaron como se ha descrito anteriormente. Se cotransfectaron
las células bien con 8 \mug de
pcDNA1\alpha_{1B-1} (como se describe en el
ejemplo C), 5 \mug de pHBCaCH\alpha_{2}A (véase el ejemplo
IV.B.), 2 \mug de pHBCaCH\beta_{1b}RSB (A) (plásmido de
expresión de \beta_{1-2}; véanse los ejemplos
III.A. y IX.E.) y 2 \mug de pCMV\beta-gal
[Clontech, Palo Alto, CA] (relación molar 2:1,8:1 de los plásmidos
de expresión de las subunidades de los canales de Ca^{2+}) o con 3
\mug de pcDNA1\alpha_{1B-2}, 11,25 \mug de
pcDNA1\alpha_{2}A, 0,75 ó 1,0 \mug de pHBCaCH\beta_{1b}RSB (A)
o pcDNA1\beta_{1-3} y 2 \mug de
pCMV\beta-gal (relación molar 2:10,9:1 de los
plásmidos de expresión de las subunidades de los canales de
Ca^{2+}). El plásmido pCMV\beta-gal, un plásmido
de expresión de la pCMV\beta-galactosidasa, se
incluyó en las transfecciones como un marcador para permitir que la
eficacia de la transfección se estime mediante la tinción
histoquímica. Cuando se expresaron menos de tres subunidades,
pCMVPL2, un vector que contienen el promotor de pCMV que carece de
una inserción de cDNA se sustituyó para mantener moles iguales de
DNA a base de pCMV en la transfección. El DNA de pUC18 se utilizó
para mantener la masa total de DNA en la transfección a 20
\mug/placa.
El RNA de las células transfectadas se analizó
mediante el análisis de la transferencia de Northern para la
expresión del mRNA de las subunidades de los canales de calcio
usando sondas específicas de las subunidades cebadas marcadas con
^{32}P. Las células HEK 293 cotransfectadas con los plásmidos de
expresión \alpha_{1B-1}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-2} (8, 5 y 2 \mug, respectivamente;
relación molar = 2:1,8:1) no expresó niveles equivalentes de cada
mRNA de los canales de Ca^{2+}. Se expresaron niveles
relativamente altos de \alpha_{1B-1} y
\beta_{1-2}, pero se expresaron niveles
significativamente inferiores de mRNA de \alpha_{2b}. A base de
las exposiciones autorradiográficas requeridas para producir
señales equivalentes para los tres mRNA, los niveles del transcrito
de \alpha_{2}b se estimaron que eran de 5 a 10 veces inferiores a
los niveles de los transcritos de \alpha_{1B-1} y
\beta_{1-2}. Las células no transfectadas HEK 293
no expresaron niveles detectables de mRNA de
\alpha_{1B-1}, \alpha_{2b} o
\beta_{1-2}.
Para lograr los niveles de expresión de expresión
de los mRNA de las subunidades de los canales de Ca^{2+}
equivalentes, se realizó una serie de transfecciones con diversas
cantidades de plásmidos de \alpha_{1B-1},
\alpha_{2b} o \beta_{1-2}. Debido a que los mRNA
de \alpha_{1B-1} y \beta_{1-2}
se expresaban a niveles muy altos comparados con \mu el mRNA de
\alpha_{2b}, la masa de los plásmidos de
\alpha_{1B-1} y \beta_{1-2} se
redujo y la masa del plásmido \alpha_{2b} se incrementó en los
experimentos de transfección. La cotransfección con 3, 11,25 y 0,75
\mug de los plásmidos de expresión de
\alpha_{1B-1} \alpha_{2b} y
\beta_{1-2}, respectivamente (relación molar =
2:10,9:1), aproximaba los niveles de expresión equivalentes de cada
mRNA de las subunidades de los canales de Ca^{2+}. La cantidad
molar relativa del plásmido de expresión de \alpha_{2b} a los
plásmidos de expresión de \alpha_{1B-1} y
\beta_{1-2} se incrementó 6 veces. La masa de los
plásmidos \alpha_{1B-1} y
\beta_{1-2} en la transfección disminuyó 2,67
veces y la masa del plásmido \alpha_{2b} aumentó 2,25 veces. El
incremento molar 6 veces de \alpha_{2b} relativo a
\alpha_{1B-1} y \beta_{1-2}
requerido para lograr niveles de mRNA aproximadamente iguales de
abundancia en consistencia con los previamente estimados de 5 a 10
veces más bajos estimados de abundancia relativa de mRNA de
\alpha_{2b}. La unión de \omega-CgTX GVIA a las
células transfectadas con diversas cantidades de los plásmidos
expresados indicaban que 3, 11,25 y 0,75 \mug de los plásmidos de
\alpha_{1B-1}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-2}, respectivamente, mejoraban el nivel
de expresión de la superficie celular de los complejos de los
canales. Además el incremento en la masa de los plásmidos de
expresión de \alpha_{2b} y \beta_{1-2} mientras
que \alpha_{1B-1} se mantenía constante y las
alteraciones en la masa del plásmido de expresión
\alpha_{1B-1} mientras que \alpha_{2b} y
\beta_{1-2} se mantenían constante indicaba que la
expresión de la superficie celular de los sitios de unión a
\omega-CgTX GVIA por célula era aproximadamente
óptimo. Todas las posteriores transfecciones se realizaron con 3,
11,25 y 0,75 \mug o 1,0 \mug de los plásmidos de expresión de
\alpha_{1B-1} o \alpha_{1B-2},
\alpha_{2b} y \beta_{1-2} o
\beta_{1-3} respectivamente.
El análisis estadístico de los valores de K_{d}
y B_{max} se realizó usando análisis de varianza de un factor
(ANOVA) seguido de la prueba de Tukeu Kramer para comparaciones
múltiples apareadas. (p \leq 0,05).
Las combinaciones de las subunidades de los
canales de Ca^{2+} dependientes de la tensión
\alpha_{1B-1}, \alpha_{1B-2},
\alpha_{2b}, \beta_{1-2},y
\beta_{1-3} se analizaron para unión de saturación
de ^{125}I-\omega-CgTX GVIA.
Aproximadamente se utilizaron 200.000 células por ensayo, excepto
para las combinaciones \alpha_{1B-1},
\alpha_{1B-2},
\alpha_{1B-1}\alpha_{2} y
\alpha_{1B-2}\alpha_{2b} que se ensayaron con 1
x 10^{6} células por tubo. Las células transfectadas una clase
única de sitios de unión de alta afinidad saturables. Se
determinaron los valores para las constantes de disociación
(K_{d}) y capacidades de unión (B_{max}) para las diferentes
combinaciones. Los resultados se resumen como sigue:
\newpage
| Combinación de subunidades | K_{d} (pM) | B_{max} (sitios/célula) |
| \alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-2} | 54.9 \pm 11.1 (n=4) | 45,324 \pm 15,606 |
| \alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3} | 53.2 \pm 3.6 (n=3) | 91,004 \pm 37,654 |
| \alpha_{1B-1}\beta_{1-2} | 17.9 \pm 1.9 (n=3) | 5,756 \pm 2,163 |
| \alpha_{1B-1}\beta_{1-3} | 17.9 \pm 1.6 (n=3) | 8,729 \pm 2,980 |
| \alpha_{1B-1}\alpha_{2b} | 84.6 \pm 15.3 (n=3) | 2,256 \pm 356 |
| \alpha_{1B-1} | 31.7 \pm 4.2 (n=3) | 757 \pm 128 |
| \alpha_{1B-2}\alpha_{2b}\beta_{1-2} | 53.0 \pm 4.8 (n=3) | 19,371 \pm 3,798 |
| \alpha_{1B-2}\alpha_{2b}\beta_{1-3} | 44.3 \pm 8.1 (n=3) | 37,652 \pm 8,129 |
| \alpha_{1B-2}\beta_{1-2} | 16.4 \pm 1.2 (n=3) | 2,126 \pm 412 |
| \alpha_{1B-2}\beta_{1-3} | 22.2 \pm 5.8 (n=3) | 2,944 \pm 1,168 |
| \alpha_{1B-2}\alpha_{2b} | N.D.* (n=3) | N.D. |
| \alpha_{1B-2} | N.D. | N.D. |
| *N.D. = No detectable |
Las células transfectadas con las combinaciones
de las subunidades que carecen bien de la
\alpha_{1B-1} o de la subunidad
\alpha_{1B-2} no mostraron unión detectable a
^{125}I-\omega-CgTx GVIA (\leq
600 sitios /célula).
^{125}I-\omega-CgTx GVIA que se
unen a las células HEK 293 transfectadas con
\alpha_{1B-2} solo o
\alpha_{1B-2}\alpha_{2}b era demasiado lento
para el análisis de Scatcharrd de los datos. La comparación de los
valores K_{d} y B_{max} revelaron varias relaciones entre las
combinaciones específicas de las subunidades y las afinidades de
unión y capacidades de las células transfectadas. En las células
transfectadas con las tres subunidades
(\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{-1-2}-,
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3}-,\alpha_{1B-}\alpha_{2b}
\beta_{1-2}-, o
\alpha_{1B-2}\alpha_{2b}
\beta_{1-3}-transfectantes) los
valores K_{d} eran indistinguibles (p >0,05), que varía entre
44,3 \pm 8,1 pM a 54,9 \pm 11,1 pM. En las células transfectadas
con combinaciones de dos subunidades que carecen de la subunidad
\alpha_{2b}
(\alpha_{1B-1}\beta_{-1-2},
\alpha_{1B}-\beta_{1-3},
\alpha_{1B-2}\beta_{1-2} o
\alpha_{1B-2}\beta_{1-3}) los
valores de K_{d} eran significativamente inferiores a las tres
combinaciones de las subunidades (p < 0,01), que varían entre
16,4 \pm 1,2 a 22,2 \pm 5,8 pM. Las células transfectadas
solamente con la subunidad \alpha_{1B-1} tenía un
valor de K_{d} de 31,7 \pm 4,2 pM, un valor que no era
diferente de las combinaciones de las dos subunidades que carecían
de \alpha_{2}b (p < 0,05). En comparación entre
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1} contra
\alpha_{1B}\beta_{1} cuando \alpha_{1B-1} se
coexpresó con \alpha_{2b} la K_{d} aumentaba significativamente
(p < 0,5) de 31,7 \pm 4,2 pM a 84,6 \pm 5,3 pM. Estos datos
demuestran que la coexpresión de la subunidad \alpha_{2b} con
\alpha_{1B-1},
\alpha_{1B-1}\beta_{-1-2},
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3},
\alpha_{1B-2}\beta_{1-2}-, o
\alpha_{1B-2}\beta_{1-3} da como
resultado afinidad de unión inferior de los receptores de la
superficie de la célula para
^{125}I-\omega-CgTx GVIA. Los
valores de B_{max} de las células transfectadas con diversas
combinaciones de subunidades también diferían considerablemente.
Las células transfectada con la subunidad
\alpha_{1B-1} sola expresaba un número de sistios
de unión inferior pero detectable (aproximadamente 750 sitios de
unión/célula). Cuando la subunidad \alpha_{1B-1}
se coexpresaba con la subunidad \alpha_{2b} la capacidad de unión
aumentaba aproximadamente tres veces mientras la coexpresión de la
subunidad \beta_{1-2} o
\beta_{1-3} con \alpha_{1B-1}
daba como resultado una expresión 8 a 10 veces más alta de la unión
superficial. Las células transfectadas con las tres subunidadades
expresaban en mayor número de los receptores superficiales
celulares. Las capacidades de unión de las células transfectadas
con las combinaciones
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{-1-3}
o
\alpha_{1B-2}\alpha_{2b}\beta_{1-3}
eran aproximadamente dos veces más altas que las combinaciones
correspondientes que contenían la subunidad \beta_{1}. De manera
similar las células transfectadas con las combinaciones
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-2}
o
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3}
expresaban aproximadamente 2,5 veces más sitios de unión por célula
que las combinaciones correspondientes que contenían
\alpha_{1B-2}. En todos los casos la coexpresión
de la subunidad \alpha_{2b} solamente con la correspondiente
\alpha_{1b} y \beta_{1};aproximadamente 8 veces para
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-2},
10 veces para
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3},
9 veces para
\alpha_{1B-2}\alpha_{2b}\beta_{1-2}
y 13 veces para
\alpha_{1B-2}\alpha_{2b}\beta_{1-3}.
De esta manera la comparación de los valores de B_{max} sugiere
que la subunidad de unión a toxina \alpha_{1B-1}
o \alpha_{1B-2}, se expresa más eficazmente y
ensamblada en la superficie de la célula cuando se coexpresan bien
con la subunidad \beta_{-1-2} o
\beta_{1-3} y más eficazmente expresada cuando
están presentes las subunidades \alpha_{2b} y \beta_{1}.
La expresión funcional de las combinaciones de
las subunidades
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-2}
y \alpha_{1B-1}\beta_{1-2} se
evaluó utilizando la técnica de registro de células completas. La
células transfectadas que no tenían contactos con las células
circundantes y la morfología sencilla se usaron aproximadamente 48
horas después de la transfección para registrar. La solución de
pipeta era (en mM) CsCl 135, EGTA 10, MgCl_{2} 1, HEPES 10 y
Mg-ATP 4 mM (pH 7,3, ajustado con
TEA-OH).La solución externa era (en mM) BaCl_{2}
15, cloro 125, MgCl_{2} 1 y HEPES 10 (pH 7,3, ajustado con
TEA-OH). \omega-CgTx GVIA (Bacem)
se preparó en la solución externa con citocromo C al 0,1% (Sigma)
para servir como portador. Los experimentos de control mostraron
que el citocromo C no tenía efecto sobre la corriente de
Ba^{2+}.
Las propiedades electrofisiológicas macroscópicas
de las corrientes de Ba^{2+} en las células transfectadas con
diversas cantidades del plásmido de expresión \alpha_{2b} con las
cantidades relativas de plásmidos \alpha_{1B-1} y
\beta_{1-2} se mantuvieron constantes durante el
exámen. Las amplitudes y las densidades de las corrientes de
Ba^{2+} (BaCl_{2} 15 mM) registradas de las células enteras
diferían drásticamente. Se determinaron las corrientes medias de 7
a 11 células de tres tipos de transfecciones (sin \alpha_{2b};
relación molar 2:1,8:1 de [\alpha_{1B-1}:
\alpha_{1B-1}: \beta_{1-2}]; y
la relación molar de 2:10,9:1 de [\alpha_{1B-1} :
\alpha_{1B-1}: \beta_{1-2}].
Las corrientes más pequeñas (intervalo: 10 a 205 pA) se registraron
cuando \alpha_{2b} no estaba incluida en la transfección y las
corrientes mayores (intervalo: 50 a 8300 pA) se registraron con la
relación 2:10,9:1 de los plásmidos \alpha_{1B-1}
\alpha_{2b} \beta_{1-2} la relación que daba
como resultado niveles de mRNA equivalentes para cada transcrito de
las
subunidades. Cuando la cantidad del plásmido \alpha_{2b} se ajustaba para producir aproximadamente una abundancia igual de mRNA de las subunidades, la corriente pico de Ba^{2+} aumentaba de 433 pA a 1.824 pA (4,2 veces) con un incremento correspondiente en la densidad de corriente media de 26 pA/pF a 127 pA/pF (4,9 veces). Este aumento es en presencia de una disminución 2,7 veces en la masa de los plásmidos de expresión \alpha_{1B-1} y \beta_{1-2} en las transfecciones. En todas las transfecciones las magnitudes de las corrientes de Ba^{2+} no seguían una distribución normal.
subunidades. Cuando la cantidad del plásmido \alpha_{2b} se ajustaba para producir aproximadamente una abundancia igual de mRNA de las subunidades, la corriente pico de Ba^{2+} aumentaba de 433 pA a 1.824 pA (4,2 veces) con un incremento correspondiente en la densidad de corriente media de 26 pA/pF a 127 pA/pF (4,9 veces). Este aumento es en presencia de una disminución 2,7 veces en la masa de los plásmidos de expresión \alpha_{1B-1} y \beta_{1-2} en las transfecciones. En todas las transfecciones las magnitudes de las corrientes de Ba^{2+} no seguían una distribución normal.
Para comparar las combinaciones de las
subunidades y determinar los efectos de \alpha_{2} se examinaron
las propiedades de la tensión de la corriente de las células
transfectadas con
\alpha_{1B-1}\beta_{1-2} o con
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}
\beta_{1-2} bien en la relación molar 2:1,8:1
(\alpha_{1B-1}: \alpha_{2b}:
\beta_{1-2}) o la relación molar 2:10,9:1
(\alpha_{1B-1} : \alpha_{2b}:
\beta_{1-2}) de transfectantes. Los ejemplos
extremos de sin \alpha_{2b} y 11,25 \mug de \alpha_{2b}
(relación molar 2:10,9:1) no mostró diferencias significativas en
el gráfico de la tensión de la corriente a potenciales entre 0 mV y
+ 40 mV (p < 0,05). Las ligeras diferencias observadas bien en
el lado de la región del pico del gráfico de la tensión de la
corriente eran probablemente debidas a la normalización. Las
corrientes muy pequeñas observadas en las células transfectadas de
\alpha_{1B-1} \beta_{1-2} tienen
un componente sustancialmente más alto de la pérdida residual
relativa a la corriente de bario que se activa por el pulso de
prueba. Cuando los gráficos de la tensión de la corriente se
normalizan, esta pérdida es un componente mucho mayor que en las
células transfectadas \alpha_{1B-1}\alpha_{2b}
\beta_{1-2} y como resultado aparece un gráfico de
la tensión de corriente más amplio. Esta es la explicación más
probable de las diferencias aparentes en los gráficos de la tensión
de corriente especialmente dado el hecho de que el gráfico de la
tensión de corriente para las células transfectadas de
\alpha_{1B-1} \beta_{1-2}
divergen en ambos lados del pico. Típicamente, cuando se desplaza la
activación de la dependencia de la tensión el gráfico de la tensión
de corriente entera se desplaza, lo cual no se observó. Para
comparar cualitativamente la cinética de cada una, las respuestas
medias de los pulsos de prueba entre -90 mV y 10 mV se normalizaron
y se trazó el gráfico. No se observaron diferencias significativas
en la cinética de activación o inactivación de las corrientes de
Ba^{2+} de células completas con cualquier combinación.
La expresión funcional de la
\alpha_{1E-3}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
y
\alpha_{1E-1}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
así como \alpha_{1E-} se evaluó usando la técnica de registros de
las células enteras.
Se realizaron los registros en las células HEK
293 transfectadas temporalmente dos días después de la transfección
de las células que no tenían contactos con las células circundantes
y que tenían morfología sencilla.
La solución interna usada para llener las pipetas
para registrar la corriente de bario de los canales de calcio
recombinantes era (en mM) CsCl 135, EGTA 10, MgCl_{2} 1, HEPES 10
y Mg-ATP 4 mM (pH 7,4-7,5, ajustado
con TEA-OH). La solución externa para el registro
de la corriente de bario era (en mM) BaCl_{2} 15, cloro 125,
MgCl_{2} 1 y HEPES 10 y TEA-OH (pH 7,3, ajustado
con TEA-OH). En los experimentos en los que
Ca^{2+} se sustituyó por Ba^{2+}, se utilizó una cámara de
flijo laminar con el fin de intercambiar completamente la solución
extracelular y evitar cualquier mezcla de Ba^{2+} y Ca^{2+}.
\omega-CgTx GVIA se preparó en la solución externa
con citocromo C al 0,1% para servir como portador, la toxina se
aplicó mediante una pipeta de golpe de pistón presurizada. La
resistencia en serie se compensó 70-85% y se
analizaron las corrientes solamente si el error de voltaje de la
resistencia en serir era inferior a 5 mV. La resistencia y
capacitancia de pérdida se corrigieron restando la corriente
escalad onservada con el protocolo P/-4 según implementó pClamp
(Axon Instruments).
Las células transfectadas con
\alpha_{1E-1}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
o
\alpha_{1E-3}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
mostraron fuertes corrientes de bario con los registros de
pinzamiento zonal de las células enteras. Las células que expresan
\alpha_{1E-1}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
tenían corrientes pico mayores que las que expresaban
\alpha_{1B-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3}.
Además, la cinética de activación e inactivación son claramente
sustancialmente más rápidas en las células que expresa. Los canales
de calcio \alpha_{1E}. Las células HEK 293 que expresan
\alpha_{1E-3} solas tienen un grado significativo
de los canales de calcio funcionales con propiedades similares a
las que expresan
\alpha_{1E}\alpha_{2B}\beta_{1}-3 pero con
corrientes de bario pico más pequeñas sustancialmente. De este modo
con \alpha_{1E}, las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} no se
requieren para la expresión funcional de los canales de calcio
mediados con \alpha_{1E}, pero incrementan sustancialmente el
número de canales de calcio funcionales.
El examen de las propiedades de la tensión de
corriente de las células que expresan
\alpha_{1E}\alpha_{2B}\beta_{1-3} indica que
\alpha_{1E}\alpha_{2B}\beta_{1-3} es un canal
de calcio activado de alta tensión y la corriente pico se alcanza a
un potencial solamente ligeramente inferior a los tros canales de
calcio neuronales que expresan también \alpha_{2b} y \beta_{1}
y \alpha_{1B} y \alpha_{1D}. Las propiedades de la tensión de
corriente de \alpha_{1E-1}
\alpha_{2b}\beta_{1-3} y
\alpha_{1E-3}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
son estadísticamente diferentes de las de
\alpha_{1B-1}
\alpha_{2B}\beta_{1-3}. Las curvas de la tensión
de corriente para el pico de
\alpha_{1E-1}\alpha_{2b}\beta_{1-3}
y
\alpha_{1E-3}\alpha_{2B}\beta_{1-3}
a aproximadamente + 5 mV, como hace la curva de tensión de corriente
para \alpha_{1E-3} sola.
Se examinó la cinética y dependencia de tensión
de la inactivación que usa tanto el prepulso (200 ms) como la
inactivación de estado constante. Los canales de calcio mediados con
\alpha_{1E} se inactivaron rápidamente para los canales de calcio
clonados previamente y otros canales de calcio activados por alta
tensión. Los canales de calcio mediados con
\alpha_{1E-3}\alpha_{2b}\beta_{1-3}
se inactivan rápidamente y de este modo son sensibles a los
prepulsos relativamente breves (200 ms) así como prepulsos largos
(inactivación de estado constante > 20 s), pero recuperan
rápidamente de la inactivación de estado constante. La cinética de
la inactivación rápida tiene dos componentes una con una constante
de tiempo de aproximadamente 25 ms y el otro de aproximadamente 400
ms.
Para determinar si los canales de calcio mediados
con \alpha_{1E} tienen propiedades de los canales de calcio
activados por alta tensión, los detalles de las corrientes de cola
activados por un pulso que varía entre -60 mV y 90 mV se midieron a
-60 mV. Las corrientes de cola registradas a -60 mV se deben ajustar
mediante una exponencial sencilla de 150 a 300 \mus; al menos un
orden de magnitud más rápido que las observadas típicamente con los
canales de calcio activados por voltaje.
Las células HEK 293 que expresan
\alpha_{1E-3}\alpha_{2b}\beta_{1-3}
y fluyen más corriente con Ba^{2+} que el portador de carga y las
corrientes transportadas por Ba^{2+} y Ca^{2+} tienen
diferentes propiedades de tensión de corriente. Además, el curso
del tiempo de inactivación es menor y la cantidad de inactivación
del prepulso menos con Ca^{2+} como portador de carga.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: THE SALK INSTITUTE BIOTECHNOLOLOGY/INDUSTRIAL ASSOCIATES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 505 COAST BLVD SOUTH, SUITE 300
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92037
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE LOS CANALES DE CALCIO HUMANOS.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 37
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA DE ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0 Versión #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/149.097
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de noviembre de 1993
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii) FECHA DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/105.536
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 11 de agosto de 1993
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7635 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 511..6996
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..510
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6994..7635
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 104 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..102
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-característica
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..104
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / nota = "exón alternativo de 104 nucleótidos de alfa-1D."
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6575 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..6492
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 133 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 89 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / nota = "un exón alternativo de alfa-1C."
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7362 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 144..7163
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..143
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7161..7362
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7175 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 144..6857
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..143
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6855..7175
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1546 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1437
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1435..1546
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1851 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1797
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / estándar_nombre = "Beta 1-3"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1795..1851
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3600 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35..3310
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / estándar_nombre = "Alfa-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..34
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3308..3600
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 323 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTATTGGTG TAGGTATACC AACAATTAAT TTAAGAAAAA GGAGACCCAA TATCCAG
\hfill57
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucéico
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTCGGTAC GTACACTCGA GC
\hfill22
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucéico
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTCGAGTGT ACGTACCG
\hfill18
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucéico
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCATGGTACC TTCGTTGACG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucéico
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTCGTCAA CGAAGGTACC ATGG
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2153 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
- i.
- NOMBRE/CLAVE: CDS
- ii.
- LOCALIZACIÓN: 53..1504
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / estándar_nombre = "Beta-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2144 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- iii.
- TIPO DE HEBRA: sencilla
- iv.
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 51..1492
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / producto = "Una subunidad Beta-3 de canal de calcio humano"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID nº 20
\newpage
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCAGTACCA TCTCTGATAC CAGCCCCA
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7808 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 237..7769
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /estándar_nombre = "Alfa-1A-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 23:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7791 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 237..7037
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /estándar_nombre = "Alfa-1A-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 24:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7032 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (J)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 166..6921
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /estándar_nombre = "Alfa-1E-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 25:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7089 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 166..6978
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /estándar_nombre = "Alfa-1E-3"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 26:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2634 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1983
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /estándar_nombre = "Beta-2d"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 27:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1823 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 69..1631
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /estándar_nombre = "Beta-4"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 28:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 520 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 29:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3636 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35..3346
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Alfa-2a"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..34
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3347..3636
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 30:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3585 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35..3295
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Alfa-2c"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..34
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3296..3585
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 31:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3654 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35..3374 (\Delta1625 a 1639 y \Delta1908 y \Delta1928)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Alfa-2d"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..34
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3375..3565
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 32:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3579 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35..3289
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Alfa-2e"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..34
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3289..3579
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 33:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1681 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1437
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Beta 1-1"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1435..1681
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 33:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 34:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1526 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..651
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Beta 1-4"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 35:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1393 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..660
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Beta 1-5"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 35:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 36:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6725 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 226..6642
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Alfa -1C-2"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 36:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 37:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2970 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 502..2316
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Beta-2C"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 37:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 38:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2712 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 223..2061
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: estándar_nombre = "Beta-2E"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xii)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 38:
Claims (50)
1. Un fragmento de DNA aislado que codifica una
subunidad \alpha_{1E-1} de un canal humano de
calcio que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC
ID Nº 24.
2. El fragmento de DNA de la reivindicación 1,
que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº
24 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº
24.
3. Un fragmento de DNA aislado que codifica una
subunidad \alpha_{1E-3} de un canal humano de
calcio que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC
ID Nº 25.
4. El fragmento DNA de la reivindicación 4 que
comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 25
que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº
25.
5. Un fragmento de DNA aislado que codifica una
variante \alpha_{1E} explica que hibrida en condiciones muy
rigurosas con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº
24 ó la SEC ID Nº25.
6. Una proteína aislada codificada por el
fragmento de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
7. Una proteína aislada que tiene la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24 o la SEC ID Nº25.
8. Un fragmento de DNA aislado que codifica una
subunidad \beta_{2} de un canal humano de calcio que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26 o la SEC ID Nº
37 o la SEC ID Nº 38.
9. El fragmento de DNA de la reivindicación 8, en
el que la subunidad es una subunidad \beta_{2C} que comprende la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 37.
10. El fragmento de DNA de la reivindicación 8,
en el que la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 37 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 37.
11. El fragmento de DNA de la reivindicación 8,
en el que la subunidad es una subunidad \beta_{2D} que comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26.
12. El fragmento de DNA de la reivindicación 11,
en el que la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26 que codifica la secuencia de
aminoácios expuesta en la SEC ID Nº 26.
13. El fragmento de DNA de la reivindicación 8,
en el que la subunidad es una subunidad \beta_{2E} que comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38.
14. El fragmento de DNA de la reivindicación 13,
en el que la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 38 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38.
15. Un fragmento de DNA aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene al
menos 40% de homología con la secuencia completa de una proteína
codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº
26, la SEC ID Nº 37 o la SEC ID Nº 38.
16. Una proteína aislada codificada por un
fragmento de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a
15.
17. Una proteína aislada que tiene la secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26, la SEC ID Nº 37 o la SEC
ID Nº 38.
18. Un fragmento de DNA aislado que codifica una
subunidad \beta_{4} de un canal humano de calcio que incluye la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
19. El fragmento de DNA de la reivindicación 18,
que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº
27 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº
27.
20. Un fragmento de DNA aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene al
menos 40% de homología con la secuencia completa de una proteína
codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº
27.
21. Una proteína aislada codificada por el
fragmento de DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a
20.
22. Una proteína aislada codificada por la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
23. Una célula eucariótica que comprende como DNA
heterólogo un fragmento de DNA de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, 8 a 15 ó 18 a 20.
24. Una célula eucariótica, que comprende DNA
heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal
humano de calcio y DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta
de un canal humano de calcio, en la que la subunidad \alpha_{1}
comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24 ó
en la SEC ID Nº 25 y la subunidad \beta comprende una secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 19.
25. La célula de la reivindicación 24, en la que
el DNA heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} comprende
la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 24 que codifica
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24.
26. La célula de la reivindicación 24, en la que
el DNA heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} comprende
la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 25 que codifica
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 25.
27. Una célula eucariótica, que comprende DNA
heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal
humano de calcio y DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta
de un canal humano de calcio, en la que la subunidad \alpha_{1}
comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 22,
la SEC. ID Nº 23 o en la SEC ID Nº 36 y la subunidad \beta
comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26,
la SEC ID Nº 27, la SEC ID Nº 37 o la SEC ID Nº 38.
28. La célula de la reivindicación 27, en la que
el DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta comprende la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26.
29. La célula de la reivindicación 27, en la que
el DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta comprende la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 27 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
30. La célula de la reivindicación 27, en la que
el DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta comprende la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 37 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 37.
31. La célula de la reivindicación 27 en la que
el DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta comprende la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 38 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38.
32. Una célula eucariótica que comprende DNA
heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal
humano de calcio y DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta
de un canal humano de calcio, en la que al menos una de las
subunidades se selecciona del grupo formado por una subunidad
\alpha_{1} que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEC ID Nº 24 o en la SEC ID Nº 25, y una subunidad \beta que
comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26,
en la SEC ID Nº 27, en la SEC ID Nº 37 o en la SEC ID Nº 38.
33. Una célula eucariótica que comprende DNA
heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal
humano de calcio y DNA heterólogo que codifica una subunidad \beta
de un canal humano de calcio, en la que el DNA heterólogo que
codifica al menos una de las subunidades comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo formado por la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 24 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24, la secuencia de nucleótidos
expuesta en la SEC ID Nº 25 que codifica la secuencia de aminoácidos
expuesta en la SEC ID Nº 25, la secuencia de nucleótidos expuesta en
la SEC ID Nº 37 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEC ID Nº 37, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID
Nº 26 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID
Nº 26, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 38 que
codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38 y
la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 27 que codifica
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
34.Una célula eucariótica con un canal de calcio
funcional heterólogo producido mediante un procedimiento que
comprende:
- introducir en la célula ácido nucleico heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal humano de calcio, en la que:
- la subunidad \alpha_{1} comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24 o la SEC ID Nº 25
- el canal de calcio heterólogo contiene al menos una subunidad codificada por el ácido nucleico heterólogo; y
- los únicos canales iónicos heterólogos son canales de calcio.
\newpage
35. La célula eucariótica de la reivindicación
34, en la que el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia
de nucleótidos seleccionada del grupo formado por la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 24 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 24 y la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 25 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 25.
36. La célula eucariótica de la reivindicación
34, en la que el ácido nucleico heterólogo es RNA codificado por un
fragmento de DNA que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta
en la SEC ID Nº 24 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta
en la SEC ID Nº 24 o la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC
ID Nº 25 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC
ID Nº 25.
37. Una célula eucariótica con un canal de calcio
funcional heterólogo producido mediante un procedimiento que
comprende:
- introducir en la célula ácido nucleico heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal humano de calcio e introducir en la célula ácido nucleico heterólogo que codifica una subunidad \beta de un canal de calcio humano, en la que:
- al menos una de las subunidades se selecciona del grupo formado por una subunidad \alpha_{1E}, \beta_{2} y \beta_{4};
- la al menos una subunidad incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID números 24, 25, 26, 27, 37 ó 38;
- el canal de calcio heterólogo contiene al menos una subunidad codificada por el ácido nucleico heterólogo; y
- los únicos canales iónicos heterólogos son canales de calcio.
38. La célula eucariótica de la reivindicación
37, en la que el ácido nucleico heterólogo que codifica al menos una
de las subunidades comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo formado por la secuencia de nucleótidos
expuesta en la SEC ID Nº 24 que codifica la secuencia de aminoácidos
expuesta en la SEC ID Nº 24, la secuencia de nucleótidos expuesta en
la SEC ID Nº 25 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEC ID Nº 25, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID
Nº 37 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID
Nº 37, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26 que
codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26, la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 38 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38 y la secuencia
de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 27 que codifica la secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
39. La célula eucariótica de la reivindicación
38, en la que el ácido nucleico heterólogo es RNA codificado por un
fragmento de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo formado por la secuencia de nucleótidos
expuesta en la SEC ID Nº 24 que codifica la secuencia de aminoácidos
expuesta en la SEC ID Nº 24, la secuencia de nucleótidos expuesta en
la SEC ID Nº 25 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEC ID Nº 25, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID
Nº 37 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID
Nº 37, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26 que
codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26, la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 38 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38 y la secuencia
de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 27 que codifica la secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
40. La célula eucariótica de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 39, en la que se ha introducido un ácido
nucleico heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{2} de un
canal humano de calcio.
41. La célula eucariótica de la reivindicación
40, en la que la subunidad \alpha_{2} comprende la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 11.
42. La célula eucariótica de la reivindicación
41, en la que la subunidad \alpha_{2} está codificada por un ácido
nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la
SEC ID Nº 11 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la
SEC ID Nº 11.
43. Un procedimiento para identificar un
compuesto que modula la actividad de un canal de calcio, que
comprende:
- suspensión de una célula eucariótica que tiene un canal de calcio funcional, heterólogo, en una solución que contiene el compuesto y un ion selectivo de canales de calcio;
- despolarización de la membrana celular de la célula; y
- detección de la corriente que fluye hacia la célula, en la que:
- el canal de calcio heterólogo incluye al menos una subunidad de canal humano de calcio codificada por un DNA o un RNA heterólogo a la célula;
- al menos una subunidad se selecciona del grupo formado por las subunidades \alpha_{1E-1}, \alpha_{1E-3}, \beta_{2} y \beta_{4} y comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID números 24, 25, 26, 27, 37 ó 38;
- la corriente que se detecta es diferente de la producida por la despolarización de la misma célula o de una célula idéntica en presencia del mismo ion selectivo de canales de calcio pero en ausencia del compuesto.
44. El procedimiento de la reivindicación 43, en
el que el DNA o el RNA heterólogo que codifica al menos una de las
subunidades, comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del
grupo formado por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID
Nº 24 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID
Nº 24, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 25 que
codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 25, la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 37 que codifica la
secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 37, la secuencia
de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 26 que codifica la secuencia
de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 26, la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 38 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 38 y la secuencia de
nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 27 que codifica la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 27.
45. Un anticuerpo específico de un subtipo de la
subunidad \alpha_{1} de un canal humano de calcio, en el que el
subtipo se selecciona del grupo formado por
\alpha_{1E-1} y \alpha_{1E-3} y
la subunidad comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la
SEC ID Nº 24 o la SEC ID Nº 25.
46. Un RNA o una sonda de DNA de cadena sencilla
con una longitud mínima de 30 bases, comprendiendo al menos 30 bases
contiguas de una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de
las SEC ID números 24, 25, 26, 27, 37 ó 38.
47. Un RNA o una sonda de DNA de cadena sencilla
de al menos 16 bases de longitud, que comprende al menos 16 bases
contiguas de una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de
las SEC ID números 24, 25, 26, 27, 37 ó 38.
48. Un procedimiento para identificar ácidos
nucleicos que codifican una subunidad de los canales humanos de
calcio, que comprende la hibridación en condiciones de al menos baja
rigurosidad, de una sonda de la reivindicación 46 o de la
reivindicación 47 con una genoteca de fragmentos de ácidos
nucleicos, y seleccionar los fragmentos de hibridación.
49. Un procedimiento para identificar células o
tejidos que expresan un ácido nucleico codificante de subunidades de
canales de calcio, que comprende la hibridación en condiciones de al
menos baja rigurosidad, de una sonda de la reivindicación 46 o de la
reivindicación 47, con mRNA expresado en las células o los tejidos o
cDNA producido del mRNA y, por tanto, identificar células o tejidos
que expresan mRNA que codifica la subunidad.
50. Una subunidad de los canales humanos de
calcio seleccionada entre \alpha_{1E-1},
\alpha_{1E-3}, \beta_{2} y \beta_{4}, en la
que la subunidad incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en
cualquiera de las SEC ID números 24, 25, 26, 27, 37 ó 38.
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