ES2199986T3

ES2199986T3 - Identificacion de aminoacidos mediante espectrometria de masas.

Info

Publication number: ES2199986T3
Application number: ES95914051T
Authority: ES
Inventors: John R. Yates, Iii.; James K. Eng; Andrew J. Link
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-14
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2015-03-14
Also published as: EP0750747A4; EP0750747B1; US6017693A; DK0750747T3; EP1239288A1; US5538897A; DE69530915D1; EP0750747A1; DE69530915T2; CA2185574C; JPH09510780A; ATE241809T1; CA2185574A1; JP3195358B2; WO1995025281A1

Abstract

SE SUMINISTRA UN METODO PARA CORRELACIONAR UN FRAGMENTO PEPTIDO DE ESPECTRO DE MASA CON SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DERIVADAS DE UNA BASE DE DATOS. UN PEPTIDO SE ANALIZA POR UN DOBLE ESPECTROMETRO DE MASA PARA PRODUCIR UN FRAGMENTO PEPTIDO DE ESPECTRO DE MASA. UNA BASE DE DATOS DE SECUENCIA DE PROTEINAS O UNA BASE DE DATOS DE SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS SE USA PARA PREDECIR UNO O MAS FRAGMENTOS DE ESPECTROS PARA SU COMPARACION CON EL FRAGMENTO DE ESPECTRO DERIVADO DEL EXPERIMENTO. EN UNA VERSION, SUB-SECUENCIAS DE LAS SECUENCIAS ENCONTRADAS EN LA BASE DE DATOS QUE DEFINE UN PEPTIDO CON UNA MASA SUBSTANCIALMENTE IGUAL A LA MASA DEL PEPTIDO ANALIZADO POR EL DOBLE ESPECTROMETRO DE MASA SE IDENTIFICAN COMO SECUENCIAS CANDIDATAS. PARA CADA SECUENCIA CANDIDATA, UNA VARIEDAD DE FRAGMENTOS DE LA SECUENCIA SON IDENTIFICADOS Y LAS MASAS Y LOS INDICES M/Z DE LOS FRAGMENTOS SE PREDICEN Y SON UTILIZADOS PARA FORMAR UN ESPECTRO DE MASA PREDECIDO. LOS VARIOS ESPECTROS DE MASA PREDECIDOS SON COMPARADOS A LOS FRAGMENTOS DE ESPECTROS DERIVADOS DEL EXPERIMENTO USANDO UNA MEDIDA DE CIERRE DE AJUSTE, PREFERIBLEMENTE CALCULADA MEDIANTE UN PROCESO DE DOS PASOS, INCLUYENDO UN CALCULO DE PUNTUACION PRELIMINAR FINAL, PARA LOS ESPECTROS DE MAYOR PUNTUACION, CALCULO DE UNA FUNCION DE CORRELACION.

Description

Identificación de aminoácidos mediante espectrometría de masas.

En el pasado, se han utilizado diversas aproximaciones para aplicar el poder analítico de la espectrometría de masas en los péptidos. Las técnicas de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) han sido especialmente de gran utilidad. En la espectrometría de masas en tándem, el péptido u otra molécula (generalmente obtenida por cromatografía) se aplica a un primer espectrofotómetro de masas que sirve para seleccionar, a partir de una mezcla de péptidos, un péptido diana de una masa determinada. A continuación, se activa o se fragmenta el péptido diana para producir una mezcla de la "diana" o péptido parental y diversos fragmentos de los componentes, característicamente péptidos de masa inferior. Esta mezcla se transmite luego a un segundo espectrómetro de masas que registra un espectro de fragmentos. Dicho espectro de fragmentos se expresará típicamente en la forma de un diagrama de barras con diversos picos, indicando cada uno de los picos la proporción de la masa respecto a la carga (m/z) de un fragmento detectado y con un valor de intensidad.

Aunque el espectro del fragmento determinado puede tener cierto interés, a menudo es deseable utilizar el espectro del fragmento para identificar el péptido (o la proteína parental) que resulta en la mezcla de fragmentación. Las aproximaciones anteriores han implicado la utilización del espectro de fragmentos como base para plantear la hipótesis de una o más secuencias aminoacídicas candidatas. Este procedimiento implica generalmente análisis de interpretación realizados por individuos expertos en la materia, aunque por lo menos se ha descrito un procedimiento automatizado. John Yates, III y col., "Computer Aided Interpretation of Low Energy MS/MS Mass Espectra of Peptides" Techniques in Protein Chemistry II (1991), pp. 477-485.

Las secuencias candidatas se pueden, en consecuencia, comparar con las secuencias aminoacídicas conocidas de diversas proteínas en las librerías de secuencias proteicas.

El procedimiento que implica el plantear una hipótesis de las secuencias aminoacídicas candidatas basadas en los espectros de fragmentos es útil en diversos contextos, pero presenta también ciertas dificultades. La interpretación del espectro de fragmentos para producir secuencias aminoacídicas candidatas requiere mucho tiempo, a menudo es poco exacta, de tecnología complicada y en general solo es posible realizarla por unos pocos laboratorios con amplia experiencia en la espectrometría de masas. Su dependencia de la interpretación humana significa que a menudo el análisis es relativamente lento y carece de objetividad estricta. Las aproximaciones basadas en el mapeo de masas peptídicas se limitan a las masas peptídicas derivadas de una proteína homogénea intacta, generada por un corte proteolítico específico y conocido y en consecuencia no se pueden aplicar generalmente a las mezclas de proteínas.

Hunt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:6233-6237 describen la determinación de las secuencias aminoacídicas por la espectrometría de masas en tándem, que implican el corte enzimático y/o químico de la proteína y el fraccionamiento de los péptidos resultantes por cromatografía líquida de alta resolución.

Henzel y col., Proc. Natl. Acad. (1993) 90:5011-5015 describen la identificación de proteínas separadas por electroforesis en geles de dos dimensiones y búsqueda en el banco de datos de secuencias proteicas, utilizando el programa de correspondencias con las masas moleculares de los fragmentos peptídicos con múltiples péptidos de proteínas individuales. Yates III y col., describen la utilización de un algoritmo para la búsqueda informática con el fin de identificar secuencias en el banco de datos Protein Information Resource con la información de las masas peptídicas de las moléculas de digestión proteolítica, analizadas mediante espectrometría de masas de ionización por electrovaporizador acoplada a cromatografía líquida de alta resolución microcapilar.

Según ello, sería útil proporcionar un sistema para la correlación del espectro de fragmentos con las secuencias proteicas conocidas, siempre que se elimine el retraso y/o subjetividad implicada en el planteamiento de una hipótesis sobre o en la deducción de las secuencias aminoacídicas candidatas a partir de los espectros de fragmentos.

De acuerdo con la presente invención, las secuencias aminoacídicas conocidas, p.ej., en una librería de secuencias de proteínas, se utilizan para calcular o predecir uno o más de un espectro de fragmentos candidatos. Los espectros de fragmentos predichos se comparan con un espectro de fragmentos derivados experimentalmente con el fin de determinar el mejor o mejores ajustes. Preferentemente, el péptido parental, del que se derivó el espectro de fragmentos, tiene una masa conocida. Se analizan las sub-secuencias de las diversas secuencias en la librería de secuencias proteicas, con el fin de identificar aquellas sub-secuencias que corresponden con una masa molecular peptídica igual (o dentro de una tolerancia dada) a la masa del péptido parental en el espectro de fragmentos. Para cada sub-secuencia con su propia masa, se puede calcular un espectro de fragmentos predichos, p.ej., calculando las masas de los diversos subgrupos de aminoácidos del péptido candidato. El resultado será una diversidad de péptidos candidatos, cada uno con un espectro de fragmentos predicho. A continuación, se pueden comparar los espectros de fragmentos predichos con el espectro de fragmentos obtenido por el espectrómetro de masas en tándem, para identificar una o más proteínas cuyas sub-secuencias sean casi idénticas a la secuencia del péptido obtenido en el espectro de fragmentos derivados experimentalmente.

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Descripción resumida de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama de bloques que muestra los procedimientos previos para correlacionar los resultados del espectrómetro de masas en tándem con las secuencias de una librería de secuencias proteicas;

La Fig. 2 es un diagrama de bloques que muestra un procedimiento para correlacionar los resultados del espectrómetro de masas en tándem con las secuencias de una librería de proteínas de acuerdo con una realización de la presente invención;

La Fig. 3 es un diagrama de flujo que muestra las etapas para correlacionar los resultados de la espectrometría de masas en tándem con las secuencias aminoacídicas, de acuerdo con una realización de la presente invención;

La Fig. 4 es un diagrama de flujo que muestra los detalles de un procedimiento para la etapa de identificación de sub-secuencias candidatas de la Fig.3;

La Fig. 5 es un espectro de masas de fragmentos para un péptido de una clase que puede utilizarse en conexión con la presente invención; y

Las Fig. 6A-6D son diagramas de flujo que muestran un procedimiento de análisis de acuerdo con una realización de la presente invención.

Antes de describir las realizaciones de la presente invención, sería útil describir con mayor detalle un procedimiento previo. Tal como se describe en la Fig. 1, el procedimiento anterior se utiliza para el análisis de un péptido desconocido (bloque 12). Por regla general, el péptido se obtiene de una columna de cromatografía que se ha utilizado para separar una proteína parcialmente fraccionada. La proteína se puede fraccionar mediante, por ejemplo, cromatografía de filtración en gel y/o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La muestra del bloque 12 se introduce en un espectrómetro de masas (bloque 14) gracias a un procedimiento de ionización como la ionización por electrovaporizador (ES). En el primer espectrómetro de masas, se selecciona un ión peptídico, de modo que un componente diana de masa específica se separa del resto de la muestra del bloque 14a. El componente diana se activa o descompone a continuación. En el caso de un péptido, el resultado será una mezcla del péptido parental ionizado ("ión precursor") y de los péptidos componentes de masa inferior que se ionizaron en diversos estados. Se pueden utilizar diversos procedimientos de activación, incluyendo las colisiones con gases neutros (también denominada como disolución inducida por colisión). El péptido parental y sus fragmentos se introducen en un segundo espectrómetro de masas del bloque 14c, que imprime una intensidad y m/z para cada uno de los muchos fragmentos de la mezcla. Esta información se puede traducir como un espectro de masas de fragmentos (bloque 16). La Fig. 5 proporciona un ejemplo de dicho espectro (bloque 16). En el espectro del bloque 16, cada ión del fragmento se representa como un diagrama de barras cuyos valores en abscisas indican la proporción de la masa respecto a la carga (m/z) y cuyos valores en ordenadas representan la intensidad. De acuerdo con diversos procedimientos, con el fin de correlacionar un espectro de fragmentos con las secuencias de una librería de secuencias proteicas, se convirtió una secuencia de un fragmento en una o más secuencias aminoacídicas que se estimaron correspondían con el espectro del fragmento. En una estrategia, se sustrajo el peso de cada uno de los aminoácidos del peso molecular del ión parental para determinar cuál podía haber sido el peso molecular de un fragmento, asumiendo, respectivamente, que cada aminoácido se halla en la posición terminal. Se determinó si la masa del fragmento se hallaba en el espectro de fragmentos cuantificados realmente. Para cada uno de los aminoácidos, se asignó una puntuación y se ordenaron para generar una lista de secuencias parciales para el siguiente ciclo de sustracción. Los ciclos continuaron hasta que la sustracción de la masa de un aminoácido consiguió una diferencia inferior a 0,5 y superior a -0,5. El resultado es una o más secuencias aminoacídicas candidatas (bloque 18). Este procedimiento puede automatizarse tal como se describió, por ejemplo, por Yates III (1991) supra. A continuación, se puede comparar una o más de una secuencia candidata con la valoración mayor (bloque 21) con secuencias en una librería de secuencias proteicas (bloque 20) para intentar identificar una proteína, que tenga una sub-secuencia similar o idéntica a la secuencia que se cree corresponde con el péptido que genera el espectro de fragmentos (bloque 16).

La Fig. 2 muestra una visión global de un proceso de acuerdo con la presente invención. Según el proceso de la Fig. 2, un espectro de fragmentos (bloque 16) se obtiene de forma similar a la descrita anteriormente por el espectro de fragmentos que se muestra en la Fig. 1. Específicamente, la muestra del bloque 12 se dispone en un espectrómetro de masas en tándem (bloque 14). Los procedimientos que se describen más adelante utilizan un proceso de dos etapas para conseguir los resultados de ms/ms. Sin embargo, la presente invención puede también utilizarse junto con las aproximaciones de espectrometría de masas que se desarrollan actualmente, las cuales incorporan la adquisición de resultados ms/ms en una sola etapa. En una realización, se puede lograr un espectro de ms/ms para cada masa. El primer ms separaría los iones mediante la relación entre la masa y la carga y el segundo registraría el espectro ms/ms. La segunda etapa de ms/ms proporcionaría, p.ej., de 5 a 10 espectros para cada masa transformada por el primer ms.

Se pueden utilizar diversos espectrómetros de masa, incluyendo un espectrómetro de masas triple-cuádruple, un espectrómetro de masas de resonancia por ciclotrón de transformación de Fournier, un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo en tándem y un espectrómetro de masas de trampa de iones cuádruple. En el proceso de la Fig. 2, no es necesario utilizar el espectro de fragmentos como base para planear una hipótesis sobre una o más secuencias aminoacídicas. En el proceso de la Fig. 2, las sub-secuencias contenidas en la librería (bloque 20) se utilizan como base para la predicción de muchos espectros de masas (bloque 22), p.ej., utilizando las técnicas de predicción descritas con mayor detalle más adelante.

Se pueden utilizar diversas librerías de secuencias, incluyendo, por ejemplo, el banco de datos Genpept, el GenBank (descrito por Burks y col., "GenBank:Current status and future directions in Methods in Enzymology", 183:3 (1990)), la librería de datos EMBL (descrita por Kahn y col., "EMBL Data Library", Methods in Enzymology, 183:23 (1990), el Protein Sequence Database (descrita en Barker y col., "Protein Sequence Database", Methods in Enzymology, 198:31 (1990); Swiss-Prot (descrita por Baroch y col., "The SWISS-PROT protein data bank, recent developments", Nucleic Acids Res., 21:3093-3096 (1993)) y PIR-International (descrita en "Index of the Protein Sequence Database of the International Association of Protein Sequence Databanks (PIR-International)" Protein Seq. Data Anal. 5:67-192 (1993).

Los espectros de masas predichos (bloque 22) se compararon con (bloque 24) el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16) para identificar uno o más de un espectro de masas predicho que concordara lo más estrechamente posible con el espectro de fragmentos derivado experimentalmente (bloque 16). Preferentemente, la comparación se realiza automáticamente calculando el mejor ajuste para cada uno de los diversos espectros de masas predichos (bloque 22) (comparado con el espectro de fragmentos derivados experimentalmente, bloque 16). Se cree que, en general, existe una elevada probabilidad de que el péptido analizado por espectrometría de masas en tándem tenga una secuencia aminoacídica idéntica a una de las sub-secuencias, originarias de la librería de secuencias de proteína del bloque 20, lo que da como resultado un espectro de masas (bloque 22) que presenta el mejor ajuste en relación con el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16). Además, si el péptido analizado por el espectrómetro de masas en tándem (bloque 14) procede de una proteína, se cree que existe una elevada probabilidad de que la proteína parental sea idéntica o similar a la proteína cuya secuencia, en la librería de secuencias (bloque 20), incluye una sub-secuencia que resulta en un espectro de masas predicho (bloque 22) que se ajusta estrechamente con el espectro de fragmentos (bloque 16). Preferentemente, el procedimiento completo puede realizarse automáticamente utilizando, p.ej., un ordenador para calcular los espectros de masa predichos (bloque 22) y/o para realizar la comparación (bloque 24) de los espectros de masa predichos (bloque 22) con el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16).

La Fig. 3 es un diagrama de flujo que muestra uno de los procedimientos para la predicción de los espectros de masa (bloque 22) y para la realización de la comparación (bloque 24). De acuerdo con el procedimiento de la Fig. 3, se normaliza en primer lugar (bloque 32) el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16). De acuerdo con un procedimiento de normalización, el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16) se convierte en una lista de masas e intensidades. Los valores para el ión precursor se extraen de dicho archivo. Se calcula la raíz cuadrada de todos los valores de intensidad y se normaliza a una intensidad máxima de 100. Los 200 iones más intensos se dividen en 10 regiones de masas y la intensidad máxima se normaliza a 100 dentro de cada región. A cada ión que se halle a unos 3,0 daltons de diferencia respecto a su vecino por cada lado se le da el mayor valor de intensidad, si una intensidad vecina es superior a su propia intensidad. Desde luego, otros procedimientos de normalización se pueden utilizar y es posible realizar análisis sin necesidad de normalizar, aunque, generalmente, es preferible la normalización. Por ejemplo, es posible utilizar intensidades máximas con una valor superior o inferior a 100. Es posible seleccionar más o algo menos de los 200 iones más intensos. Es posible dividir en más, o unas pocas menos, de 10 regiones de masa. Es posible generar la ventana para asumir que el valor de intensidad de las proximidades es superior o inferior a 3,0 daltons.

Con el fin de generar los espectros de masa predichos a partir de una librería de secuencias de proteínas, de acuerdo con el proceso de la Fig. 3, se identifican las sub-secuencias dentro de cada secuencia de proteína si su masa se halla dentro de la cantidad tolerada de la masa del péptido desconocido. Como se indicó anteriormente, la masa del péptido desconocido se conoce gracias al espectrómetro de masas en tándem (bloque 34). La identificación de las sub-secuencias candidatas (bloque 34) se muestra con mayor detalle en la Fig. 4. En general, el proceso de identificación de sub-secuencias candidatas implica adicionar las masas de las secuencias aminoacídicas lineales hasta que la suma se halle dentro de la masa de tolerancia del péptido desconocido (la masa "diana"), o exceda la masa diana (tolerancia plus). Si la masa de la secuencia se halla dentro de la tolerancia de la masa diana, la secuencia se marca como candidata. Si la masa de la secuencia lineal excede la masa del péptido desconocido, entonces se repite el algoritmo, empezando con la siguiente posición aminoacídica en la secuencia.

De acuerdo con el procedimiento de la Fig.4, una variable m, que indica el aminoácido de inicio en la secuencia, se inicia en 0 y se incrementa de uno en uno (bloques 36, 38). La suma, que representa la masa acumulativa, y una variable n, que representa el número de aminoácidos así calculados en la suma, se ajustan inicialmente a 0 (bloque 40), incrementándose la variable n (bloque 42). El peso molecular de un péptido, que corresponde a una sub-secuencia de una secuencia de proteínas, se calcula de forma iterativa en las etapas 44 y 46. En cada repetición, la suma se incrementa por el peso molecular del aminoácido siguiente (aminoácido n) en la secuencia (bloque 44). Los valores de la suma en el bloque 44 pueden guardarse para calcular las masas de los fragmentos a utilizar en la predicción de un espectro de masas de fragmentos, tal como se describe más adelante. Si la suma resultante es inferior a la masa diana reducida por una tolerancia (bloque 46), el valor de n se incrementa (bloque 42) y el proceso se repite (bloque 44). Se pueden utilizar diversos valores. En una realización, se utilizó un valor de tolerancia del \pm0,05% de la masa del péptido desconocido. Si la nueva suma no es menor que una cantidad de tolerancia por debajo de la masa diana, se determina entonces si la nueva suma es mayor que la masa diana más la cantidad de tolerancia. Si la nueva suma excede la cantidad de tolerancia de la masa diana, la secuencia particular no se considera una secuencia candidata y el proceso se inicia de nuevo, comenzando a partir de un nuevo punto de inicio en la secuencia (incrementando el valor del punto de inicio m (bloque 38)). Si, sin embargo, la suma no es superior a la masa diana más la cantidad de tolerancia, se sabe que la suma se halla dentro de una cantidad de tolerancia de una masa diana y, en consecuencia, que la sub-secuencia que se inicia con el aminoácido m y se prolonga al aminoácido (m+n) de la secuencia es la secuencia candidata. La secuencia candidata se marca, p.ej., guardando los valores de m y n para definir esta sub-secuencia.

De retorno a la Fig.3, una vez identificadas diversas sub-secuencias candidatas, se predice un espectro de masas de fragmentos para cada una de las secuencias candidatas (bloque 52). El espectro de masas de fragmentos se predice calculando las masas iónicas de los fragmentos para los iones del tipo b- e y- para la secuencia aminoacídica. Cuando un péptido se fragmenta y la carga se retiene en el fragmento de corte N-terminal, el ión resultante se marca como un ión de tipo b. Si la carga se retiene en el fragmento C-terminal, entonces el ión se marca como de tipo y. Las masas para los iones de tipo -b se calculan sumando las masas aminoacídicas y añadiendo la masa de un protón. Los iones de tipo -y se calcularon sumando, desde el extremo C-terminal, las masas de los aminoácidos y añadiendo la masa del agua y un protón al aminoácido inicial. De este modo, es posible calcular un cociente m/z para cada fragmento. Sin embargo, con el fin de proporcionar un espectro de masas predicho, también es necesario asignar un valor de intensidad para cada fragmento. Puede ser posible predecir, sobre una base teórica, el valor de la intensidad para cada fragmento. Sin embargo, este proceso es difícil. Se ha demostrado que es útil asignar intensidades de la manera siguiente. El valor 50,0 se asigna a cada ión -b e -y. A las masas de una diferencia de 1 dalton por cada lado del ión del fragmento, se asigna una intensidad de 25,0. Las intensidades de los picos son de 10,0, 17,0 y 18,0 daltons por debajo del m/z para cada localización de los iones b e y (para la pérdida de NH_{3} y H_{2}O) y las intensidades de los picos son de 10,0 y 28,0 amus para cada localización de iones de tipo b (para iones de tipo a).

De retorno a la Fig.3, después de calcular los valores de m/z predichos y de asignar las intensidades, es preferible calcular una medida de mejor ajuste entre los espectros de masa predichos (bloque 22) y el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16). Para el cálculo del mejor ajuste, están disponibles diversos procedimientos. En la realización mostrada en la Fig. 3, se utilizó un procedimiento en dos etapas (bloque 54). Dicho procedimiento incluye el cálculo de una valoración de mejor ajuste preliminar, denominada S_{p} (bloque 56) para las secuencias aminoacídicas con mayor S_{p}, cálculo de una función de correlación (bloque 58). De acuerdo con una realización, S_{p} se calcula utilizando la siguiente fórmula:

S_{p} = (\Sigma i_{m})*n_{i}*(1+\beta)*(1-\rho)/n_{t}(1)

en donde i_{m} = intensidades similares, n_{i} = número de iones de fragmentos similares, \beta = ión de tipo b e y, \rho = presencia de iones imonio y de sus respectivos aminoácidos en la secuencia predicha, n_{t} = número total de iones de fragmentos. El factor \beta evalúa la continuidad de una serie de iones de fragmentos. Si hubiera un ión de fragmentos que encajara con el ión inmediatamente anterior al ión actual de tipo b o y, \beta se incrementaría por 0,075 (a partir de un valor inicial de 0,0). Esto incrementa la valoración preliminar para aquellos péptidos que encajan con series sucesivas de iones de tipo b e y, ya que dichas series amplias de iones del mismo tipo se observan a menudo en los espectros MS/MS. El factor \rho evalúa la presencia de iones imonio en el extremo de baja masa del espectro de masas. Los iones imonio son diagnósticos para la presencia de algunos tipos de aminoácidos en la secuencia. Si los iones imonio están presentes a 110,0, 120,0 ó 136,0 Da (\pm1,0 Da) en el archivo de datos procesados del péptido desconocido con las intensidades normalizadas superiores a 40,0, es indicativo de la presencia de histidina, fenilalanina y tirosina, respectivamente. En consecuencia, se analiza la secuencia de evaluación para demostrar la presencia del aminoácido indicado por el ión imonio. La evaluación preliminar, S_{p}, para el péptido se aumenta o reduce por un factor de (1-\rho), en donde \rho es la suma de las penalizaciones para cada uno de los tres aminoácidos cuya presencia se indica en la 15 región de masa baja. Cada \rho individual puede tomar el valor de -0,15 si existiera un pico de masa baja correspondiente y el aminoácido no estuviera en la secuencia, +0,15 si existiera un pico de masa baja correspondiente y el aminoácido estuviera presente en la secuencia, o de 0,0 si el pico de masa baja no estuviera presente. La penalización total puede variar desde -0,45 (los tres picos de masa baja están presentes en el espectro aunque ninguno de los 3 aminoácidos se halle en la secuencia) a +0,45 (los tres picos de masa baja están presentes en el espectro y los 3 aminoácidos se hallan en la secuencia).

Después de calcular la valoración S_{p} de mejor ajuste preliminar, se seleccionaron los espectro de masas predichos candidatos con las evaluaciones S_{p} mayores para posteriores análisis, utilizando la función de correlación (bloque 58). El número de espectros de masa predichos y candidatos, que se seleccionaron para el análisis posterior, depende en gran parte de los recursos informáticos y de la disponibilidad temporal. En una realización, se seleccionaron 300 secuencias de péptidos candidatos con la valoración preliminar mayor.

Para los propósitos del cálculo de la función de correlación (bloque 58), el espectro de fragmentos experimentales se pre-procesa de modo distinto al del pre-procesamiento (bloque 32) utilizado antes del cálculo de S_{p}. Para los propósitos de la función de correlación, el ión precursor se eliminó del espectro y éste se dividió en 10 secciones. A continuación, se normalizaron los iones en cada sección a 50,0. Los espectros normalizados de las secciones (bloque 60) se utilizaron para calcular la función de correlación. De acuerdo con una realización, la correlación discreta entre dos funciones se calcula de la manera siguiente:

R_{\tau} = \sum\limits^{n-1}_{i-0} x_{i}y_{i} + \tau(2)

en donde r es un valor de retraso. El teorema de correlación discreta expone que la correlación discreta de dos funciones reales x e y es un miembro de la pareja de transformación discreta de Fourier

R_{\tau} \leftrightarrow X_{\tau} Y^{*}\tau(3)

en donde, X(t) e Y(t) son la pareja de transformación discreta de Fourier y la Y* hace referencia a la conjugación compleja. Por lo tanto, las correlaciones cruzadas se pueden guardar en formato informático mediante la transformación de Fourier de los dos grupos de resultados, utilizando el algoritmo de transformación rápida de Fourier (FFT), la multiplicación de un transformante por el conjugado complejo del otro, y la transformación inversa del producto resultante. En una realización, todos los espectros predichos, así como el espectro desconocido pre-procesado se ajustaron a cero en los 4096 puntos de resultados ya que los espectros MS/MS no eran periódicos (tal como se intentó mediante el teorema de la correlación) y el algoritmo FFT necesita N para tener una potencia entera de dos, de modo que los efectos finales resultantes no necesitan considerarse. La valoración final atribuida a cada secuencia de péptido candidata es R(0) menos la media de la función de correlación cruzada en el intervalo -75<t<75. Este "parámetro de correlación" modificado descrito en Powell y Heiftje, Anal. Chim. Acta. vol. 100, pp. 313-327 (1978) muestra mejor discriminación sobre el coeficiente de correlación espectral R(0). Las valoraciones brutas se normalizaron a 1,0. En una realización, el rendimiento (bloque 62) incluye la valoración bruta normalizada, la masa del péptido candidato, el coeficiente de correlación no normalizado, la valoración preliminar, la continuidad \beta del ión del fragmento, el factor \rho del ión imonio, el número de iones de tipo de banda y que encajan con el número total de iones de fragmentos, sus intensidades de similitud, los números de acceso de la proteína y la secuencia del péptido candidato.

Si se desea, la función de correlación (bloque 58) se puede utilizar para seleccionar automáticamente uno de los espectros de masa predichos (bloque 22), correspondientes con el espectro de fragmentos derivados experimentalmente (bloque 16). Aunque es preferible, obtener varias secuencias de la librería del bloque 20 y realizar una selección final de una única secuencia por un operario experto.

Además de los espectros de masas predichos de las librerías de secuencia de proteínas, la presente invención también incluye la predicción de los espectros de masas basados en los bancos de datos de nucleótidos. El procedimiento implica la misma aproximación algorítmica de ciclado a través de la secuencia nucleotídica. Los codones de 3 bases se convertirán en una secuencia proteica y la masa de los aminoácidos se sumará de modo similar a la suma descrita en la Fig. 4. Para ciclar a través de la secuencia nucleotídica, se utilizará un incremento de 1 base por cada ciclo. Esto permitirá determinar la secuencia aminoacídica para cada uno de los tres marcos de lectura en un bloque. Los procedimientos de valoración y de edición para la búsqueda pueden ser los mismos descritos anteriormente para la base de datos de secuencias de proteínas.

Dependiendo de los recursos informáticos y del tiempo disponibles, puede ser ventajoso utilizar técnicas de reducción de datos. Preferentemente, estas técnicas enfatizarán los iones más informativos en el espectro, sin afectar de forma indebida a la velocidad de búsqueda. Una técnica implica considerar únicamente algunos de los iones de fragmentos en el espectro MS/MS. Un espectro para un péptido puede contener como mucho 3000 iones de fragmentos. De acuerdo con una estrategia de reducción de datos, los iones se clasifican por intensidad y una fracción de los iones más intensos (p.ej., los 200 iones más intensos) se utiliza para la comparación. Otra aproximación implica la subdivisión del espectro en, p.ej., 4 ó 5 regiones y la utilización de los 50 iones más intensos en cada región como parte del grupo de resultados. En otra aproximación, se seleccionan los iones basándose en la probabilidad de que dichos iones sean iones de secuencia. Por ejemplo, se podrían seleccionar los iones que existen en la ventana de masas de 57 a 186 daltons (el intervalo de masas incrementa para los 20 aminoácidos comunes desde GLY a TRP) que contienen características diagnósticas de iones de tipo b o y, como la pérdida de 17 ó 18 daltons (NH_{3} o H_{2}O) o una pérdida de 28 daltons (CO).

Las técnicas descritas anteriormente son, en general, aplicables a los espectros de péptidos con estados cargados de +1 ó +2, típicamente con una secuencia aminoacídica relativamente corta. Utilizando una secuencia aminoacídica más larga se incrementa la probabilidad de una sola similitud con una secuencia proteica. Sin embargo, las secuencias peptídicas más largas tienen una probabilidad mayor de contener más aminoácidos básicos y en consecuencia de producir iones de un estado de carga superior en condiciones de ionización por electro-vaporizador. De acuerdo con una realización de la invención, se proporcionan los algoritmos para buscar una base de datos con espectros MS/MS de péptidos altamente cargados (+3, +4, +5, etc.). De acuerdo con una aproximación, el programa de búsqueda incluirá un dato de entrada para el estado de carga (N) del ión precursor utilizado en el análisis MS/MS. Los iones de fragmentos predichos se generarán para cada estado de carga inferior a N. Así, para el péptido de +4, los estados de carga de +1, +2 y +3 se generarán para cada ión de fragmentos y se compararán con el espectro MS/MS.

La estrategia secundaria para utilizar con espectros de carga múltiple es la utilización de la desconvolución matemática para convertir iones de fragmentos de múltiples cargas en masas con una sola carga. El espectro de desconvolución contendrá los iones de fragmentos para los iones de fragmentos cargados y sus parejas cargadas de forma sencilla.

Para agilizar las búsquedas en las bases de datos, se puede utilizar una aproximación de búsqueda directa. En los casos en los que se realizan experimentos con organismos específicos o con tipos específicos de proteínas, no es necesario, en un primer bloque, buscar en la base de datos entera. En lugar de ello, se puede realizar en primer lugar una búsqueda de secuencias proteicas específicas para una especie o clase de proteínas. Si la búsqueda no proporciona respuestas razonables, entonces se buscará en toda la base de datos.

Se pueden utilizar diversos algoritmos de evaluación para determinar el mejor ajuste o correlación preliminar. Además para valorar basándose en el número de iones similares multiplicado por la suma de la intensidad, se puede utilizar la evaluación del porcentaje de cobertura de secuencia continua representado por los iones de secuencia en el espectro. Por ejemplo, un péptido de 10 residuos contendrá potencialmente 9 de cada uno de los iones de secuencia de tipo b e y. Si un grupo de iones se extiende desde B_{1} a B_{9}, entonces se le adjudica una valoración de 100, pero si se observa discontinuidad en el mitad de la secuencia, como la pérdida del ión B_{5}, se añade una penalización. La valoración máxima se adjudica a una secuencia aminoacídica que contenga una serie continua de iones tanto en la dirección b como en la y.

En el suceso, los procedimientos de valoración descritos no delimitan una respuesta. Para la comparación de espectros, en los que la base de datos se busca inicialmente con un valor de peso molecular y un grupo reducido de iones de fragmentos, se puede utilizar una técnica adicional. El filtrado inicial de la base de datos tiene lugar comparando los iones de secuencia y generando una puntuación con uno de los métodos descritos anteriormente. El grupo resultante de respuestas se someterá a continuación a un proceso de inspección más riguroso, utilizando un espectro MS/MS completo modificado. Para el análisis de la segunda etapa, se utiliza una de las diversas aproximaciones de comparación de espectros desarrollada para la búsqueda de librerías de espectros. Ello necesitará la generación de un "espectro de librerías" para la secuencia basada en los iones de secuencia predichos para la secuencia aminoacídica. Los valores de intensidad para los iones de secuencia del "espectro de librería" se obtendrán del espectro experimental. Si un ión de fragmentos se predice con un m/z=256, entonces se utilizará el valor de intensidad para el ión en el espectro experimental a m/z=256 como la intensidad del ión en el espectro predicho. Por ello, si el espectro predicho es idéntico al espectro "desconocido", se representará un espectro ideal. Los espectros se compararán utilizando una función de correlación. En general, se cree que la mayor parte del tiempo computacional del anterior procedimiento se gasta en el proceso de búsqueda iterativa. Realizando un análisis múltiple de espectros múltiples MS/MS en un bloque en la base de datos, se obtiene una mejora global en la eficiencia. Además, la tolerancia de masas utilizada en el pre-filtro puede afectar los tiempos de búsqueda al incrementar o reducir el número de secuencias a analizar en las etapas siguientes. Otra aproximación para agilizar las búsquedas implica un esquema de encriptación binaria, en donde el espectro de masas está codificado como pico/no pico en cada masa, dependiendo de que el pico presente un cierto valor de umbral. Si se contempla la utilización intensiva de una librería de secuencias proteicas, es posible calcular y guardar los valores de masas predichos de todas las sub-secuencias dentro de un intervalo predeterminado, de modo que por lo menos algunos análisis puedan realizarse mediante búsqueda en la tabla en lugar de volver a calcularlos.

Las Figs. 6A-6E son diagramas de flujo que muestran un procedimiento de análisis de acuerdo con una realización de la presente invención. Después de obtener los resultados del espectrómetro de masas en tándem, tal como se describió anteriormente (bloque 602), los resultados se guardan en un archivo y se convierten en formato ASCII (bloque 604). En este punto, se inicia un proceso de pre-procesamiento (bloque 606). El usuario entra la información correspondiente con la masa del péptido en el estado de ión precursor (bloque 608). Los valores de masa/intensidad se cargan desde el archivo ASCII, con los valores redondeados a unidades de masa (bloque 610). La contribución del ión precursor previamente identificado se extrae de este resultado (bloque 612). Los resultados restantes se normalizan a una intensidad máxima de 100614. En este punto, se pueden tomar diversas vías. En un caso, se observó la presencia de cualquier ión imonio (H, F e Y) y se almacenó la información del ión imonio y de su masa peptídica en un archivo de datos (bloque 618). En otra vía, se seleccionaron los 200 picos más intensos (bloque 620). Si dos picos se hallan dentro de una distancia predeterminada (p.ej., 2 amu) uno de otro, el pico de intensidad inferior se ajusta igual al de una intensidad superior (bloque 622). Después de este procedimiento, los resultados se guardan en un archivo de datos para la evaluación preliminar (bloque 624). En otra vía, los resultados se dividen en diversas ventanas, por ejemplo 10 ventanas (bloque 626). La normalización se realiza con cada ventana, por ejemplo, normalizando a una intensidad máxima de 50 (bloque 628). Este resultado se guarda en un archivo de datos para la evaluación de correlación final (bloque 630). Esto finaliza la fase se pre-procesamiento, de acuerdo con esta realización (bloque 632).

Se inicia la búsqueda de bases de datos (bloque 634), cargándose los parámetros de la búsqueda y los datos resultados obtenidos del proceso de pre-procesamiento (Fig. 6A) (bloque 636). Un primer lote de secuencias de la base de datos se carga (bloque 638) y se pone en funcionamiento un proceso de búsqueda de una proteína en particular (bloque 640). El procedimiento de búsqueda se detalla en la Fig. 6C. Mientras no se llega al final del lote, el índice se incrementa (bloque 642) y se repite la rutina de búsqueda (bloque 640). Una vez se ha determinado que se ha llegado al final del lote (bloque 644), mientras no se ha llegado al final del banco de datos, el segundo índice (bloque 646) se incrementa y se carga un nuevo lote de secuencias de la base de datos (bloque 638). Una vez alcanzado el final de la base de datos (bloque 628), se realiza un análisis de correlación (bloque 630) (tal como se detalla en la Fig. 6E), los resultados se imprimen (bloque 632) y el proceso finaliza (bloque 634).

Cuando se inicia el proceso de búsqueda (bloque 638) (Fig. 6C), se ajusta un índice I1 a cero (bloque 646) para indicar la posición de inicio del péptido candidato en el aminoácido buscado (bloque 640). Un segundo índice I2, que indica la posición final del péptido candidato en el aminoácido buscado, se ajusta inicialmente igual que el I1 y las variables Pmasa, que indican la masa acumulada del péptido candidato, se ajustan en el inicio a cero (bloque 648). Durante cada iteración en un péptido candidato dado (bloque 650), se añade la masa del aminoácido en la posición I2 a la Pmasa (bloque 652). A continuación, se determina si la masa así acumulada (Pmasa) es igual a la masa del dato de entrada (es decir, la masa del péptido) (bloque 654). En algunas realizaciones, este análisis puede realizarse con una tolerancia de más o de menos, en lugar de necesitar una igualdad estricta, tal como se indicó anteriormente. Si hubiera igualdad (opcionalmente dentro de una tolerancia), se iniciaría un análisis de rutina (bloque 656) (detallado en la Fig. 6D). Por otra parte, se determina si la Pmasa es inferior a la masa de entrada (opcionalmente dentro de una tolerancia). Si no, se incrementa el índice I2 (bloque 658) y se añade la masa del aminoácido en la siguiente posición (posición I2 incrementada) a la Pmasa (bloque 652). Si la Pmasa es superior a la masa de entrada (opcionalmente en más de una tolerancia, bloque 660), se determina si el índice I1 se halla en el extremo de una proteína (bloque 662). Si ello fuera así, se finaliza con la rutina de búsqueda (bloque 664). Por otra parte, el índice I1 se incrementa (bloque 666) de modo que la rutina puede iniciarse con una nueva posición de un péptido candidato y el procedimiento de búsqueda retorna al bloque 648.

Cuando se inicia el procedimiento de análisis (bloque 670) (Fig. 6D), se generan los datos indicativos de los iones b e y para los péptidos candidatos (bloque 672), tal como se describió anteriormente. Se determina si el pico se halla dentro de los 200 iones más ajustados (bloque 674). La intensidad del pico se suma y el índice de coincidencia fragmentada se incrementa (bloque 676). Si previamente se han hecho coincidir los iones b o y (bloque 678), el índice \beta se incrementa (bloque 680). Por otra parte, se determina si se han analizado todos los iones de 20 fragmentos. Si no fuera el caso, el índice de fragmentos se incrementa (bloque 684) y el proceso retorna al bloque 674). Por lo demás, se calcula una valoración preliminar como por ejemplo S_{p}, descrita anteriormente (bloque 686). Si la S_{p} calculada de nuevo es superior al valor inferior (bloque 688), la secuencia del péptido se guarda (bloque 690), salvo si la secuencia ya ha sido guardada, en cuyo caso el procedimiento finaliza (bloque 692).

En el inicio del análisis de correlación (Fig 6E), se selecciona un péptido candidato (bloque 693). Se crea un espectro teórico para el péptido candidato (bloque 694), se correlaciona con los resultados experimentales (bloque 695) y se obtiene un valor de correlación final (bloque 696), tal como se indicó anteriormente. El índice se incrementa (bloque 697) y se repite el proceso desde el bloque 693, salvo que todos los péptidos candidatos se hayan evaluado (bloque 698), en cuyo caso se finaliza el procedimiento de análisis de la correlación (bloque 699).

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ejemplo y no de limitación.

Experimental Ejemplo #1

Los complejos MHC se aislaron de células HS-EBV transformadas con HLA-DRB*0401 utilizando cromatografía de afinidad de anticuerpos. Los péptidos unidos se liberaron y aislaron mediante filtración con una columna de centrifugación Centricon 10. Se aisló la cadena pesada de glicosacáridos de los leucocitos humanos. Las digestiones proteolíticas se realizaron disolviendo la proteína en bicarbonato de amonio 50 mM con Ca^{++} 10 mM, pH 8,6. La tripsina se añadió a una proporción de 100/1 proteína/enzima.

El análisis de las mezclas de péptidos resultantes se realizó mediante LC-MS y LC-MS/MS. En resumen, los pesos moleculares de los péptidos se registraron mediante escáner Q3 o Q1 a una velocidad de 400 Da/s en un intervalo de masas de 300 a 1600 del gradiente HPLC. El análisis de secuencia de los péptidos se realizó durante un segundo análisis por HPLC, seleccionando el ión precursor con una ventana de amplitud de 6 amu (FWHH) en Q1 y pasando los iones a un celda de colisión con argón a una presión de 3-5 mtorr. Las energías de colisión fueron del orden de 20 a 50 eV. Los iones de fragmentos producidos en Q2 se transmitieron a Q3 y se escaneó un intervalo de masas de 50 Da, respecto al peso molecular del ión precursor a 500 Da/s, para obtener los registros de los iones de fragmentos. Se registraron y guardaron en el disco los espectros de baja energía de 36 péptidos. La base de datos genpept contiene secuencias de proteínas traducidas de secuencias nucleotídicas. Se realizó una búsqueda textual de la base de datos para determinar si las secuencias aminoacídicas del péptido utilizadas en el análisis estaban presentes en la base de datos. A continuación, se creó una segunda base de datos a partir de la base de datos completa anexando secuencias aminoacídicas de péptidos no incluidos.

Los resultados del espectro se convirtieron en una lista de masas e intensidades, extrayéndose los valores del ión precursor del archivo. Se calculó la raíz cuadrada de todos los valores de intensidad y se normalizó a una intensidad máxima de 100,0. Todos los iones, excepto los 200 más intensos, se eliminaron del archivo. Los iones restantes se dividieron en 10 regiones de masa y se normalizó la intensidad máxima a 100,0 en cada región. A cada ión con un peso aproximado de \pm3 daltons respecto al peso de sus vecinos por cada lado se le adjudicó el valor de intensidad mayor, si la intensidad del vecino fue superior que la suya propia. Estos datos procesados se guardaron para compararlos con las secuencias candidatas elegidas entre la búsqueda de bases de datos. Se modificó el espectro MS/MS de forma distinta para el cálculo de una función de correlación. El ión precursor se extrajo del espectro y el espectro se dividió en 10 secciones iguales. En cada sección, se normalizaron los iones a 50,0. Este espectro se utilizó para calcular el coeficiente de correlación contra un espectro MS/MS predicho para cada secuencia aminoacídica obtenida de la base de datos.

Las secuencias aminoacídicas de cada proteína se generaron sumando las masas, utilizando masas promedio para los aminoácidos de la secuencia lineal aminoacídica desde el extremo amino-terminal (n). Si la masa de la secuencia lineal excede la masa del péptido desconocido, entonces el algoritmo retorna al aminoácido amino-terminal e inicia la suma de masas aminoacídicas desde la posición n+1. Este proceso se repite hasta que cada combinación de secuencias aminoacídicas lineales se haya evaluado. Cuando la masa de la secuencia aminoacídica se halla dentro de un intervalo de \pm0,05% (mínimo \pm1 Da) de la masa del péptido desconocido, se generan los valores predichos m/z para los iones de tipo b e y, comparándose con los iones de fragmentos de la secuencia desconocida. Se realizó una puntuación preliminar (S_{p}) y se clasificaron y guardaron las 300 secuencias candidatas mejores con la valoración mayor. Se realizó un análisis final de las 300 secuencias aminoacídicas mejores candidatas con una función de correlación. Utilizando esta función, se comparó un espectro MS/MS teórico de la secuencia candidata con el espectro MS/MS experimental modificado. Los coeficientes de correlación se calcularon, se clasificaron y se registraron. Los resultados finales se clasificaron según el coeficiente de correlación normalizado.

El espectro que se muestra en la Fig. 5 se obtuvo mediante análisis LC-MS/MS de un enlace peptídico con un complejo de clase II DRB*0401MHC. Una búsqueda en la base de datos genpept proporcionó 74.938 secuencias de proteínas, que identificaban 384.398 péptidos con una tolerancia de masas de \pm0,05% (mínimo de \pm1Da) del peso molecular de este péptido. Comparando los patrones de iones predichos para cada una de estas secuencias aminoacídicas con los espectros MS/MS pre-procesados y calculando una valoración preliminar, el número de secuencias candidatas se limitó a 300. A continuación, se realizó un análisis de correlación con los espectros MS/MS predichos para cada una de estas secuencias y del espectro MS/MS experimental modificado. Los resultados de la búsqueda en la base de datos genpept con el espectro de la Fig. 5 se muestran en la Tabla 1. Dos péptidos de secuencia similar, DLRSWTAADAAQISK [SEC ID N°1], DLRSWTAADAAQISQ [SEC ID N°2], se identificaron como las secuencias de mayor puntuación (valores C_{n}). Los coeficientes de correlación son idénticos, por lo que sus clasificaciones de la Tabla 1 son arbitrarias. La secuencia aminoacídicas DLRSWTAADAAQISK [SEC ID N°1] se halló en 5 proteínas de la base de datos genpept, mientras que la secuencia DLRSWTAADAAQISQ [SEC ID N° 2] únicamente se halló en una. Las tres secuencias mejores se presentan en proteínas relacionadas inmunológicamente y el resto parece no tener correlación entre ellas. Una segunda búsqueda utilizando el mismo espectro MS/MS, se realizó con una subgrupo de Homo sapiens de la base de datos genepept para comparar los resultados. Estos resultados están representados en la Tabla 2. En ambas búsquedas, la secuencia correcta se vinculó con la posición mejor. Ambas secuencias aminoacídicas tuvieron coeficientes de correlación idénticos, C_{n}, aunque las secuencias difieren por la Lys y Gly en su extremo C-terminal. Estos dos aminoácidos tienen la misma masa nominal y se esperaría que produjeran espectros MS/MS similares. La suma de las intensidades de iones de fragmentos normalizados, I_{m}, para los iones de fragmentos similares para los dos péptidos son distintas, presentando una secuencia correcta de mayor valor. La secuencia correcta también tiene similitud con un ión de fragmento adicional en el procedimiento de valoración preliminar, que identificó el 70% de los iones de fragmentos predichos para esta secuencia aminoacídica en el espectro pre-procesado. Estas similitudes se determinan como parte de un proceso de valoración preliminar.

(TABLA pasa a página siguente)

1

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TABLA 1 (continuación)

Masa = masa calculada del péptido candidato, C_{n} = coeficiente de correlación normalizado, C = coeficiente de correlación, S_{p} = puntuación preliminar, \beta = continuidad del ión de fragmentos, \rho = iones imonio, Iones = número de iones de tipo b e y, similares con el número total de iones de fragmentos de la secuencia candidata, I_{m} = intensidades de fragmentos similares, N° de acceso = número de acceso del genpept, y la secuencia peptídica candidata, masa = 1734,90, tolerancia de frag = 0,75, tolerancia de masa = 1,000.

(TABLA pasa a página siguente)

2

Ejemplo #2

Para examinar la complejidad de la mezcla de péptidos obtenidos por la proteolisis del total de proteínas de células de S. cerevisiae, se crecieron y cosecharon 10^{8} células. Después de la lisis, las proteínas totales estaban contenidas en 9 ml de solución. Se extrajeron alícuotas de 0,5 ml para la proteolisis con la enzima tripsina. De esta solución, se inyectaron directamente 2 \mul en una columna micro-LC (cromatografía líquida) para análisis de MS. En una mezcla compleja de péptidos es concebible que puedan existir múltiples iones peptídicos con el mismo m/z y contribuir a un fondo aumentado, lo que complica el análisis MS/MS y su interpretación. Para analizar la capacidad de obtener información de la secuencia por MS/MS a partir de estas mezclas complejas de péptidos, se seleccionaron iones de la mezcla con el análisis MS/MS en línea. En ningún caso se contaminaron los espectros con iones de fragmentos de otros péptidos. Una lista parcial de las secuencias identificadas se presenta en la Tabla 3.

TABLA 3

Proteínas de S. cerevisiae	SEC ID N°	Secuencia aminoacídica
enolasa	3	DPFAAEDDWEAWSH
hipusina que contiene la proteína HP2	4	APEGELGDSLQTAFDEGK
fosfoglicerato quinasa	5	TGGGASLELLEGK
producto del gen BMH1	6	QAFDDAIAELDTLSEESYK
piruvato quinasa	7	IPAGWGLDNGPSER
fosforglicerato quinasa	8	LPGTDVDLPALSEK
hexoquinasa	9	IEDDPFENLEDTDDDFQK
enolasa	10	EEALDLIVDAIK
enolasa	11	NPTVEVELTTEK

Los espectros de MS/MS presentados en la Tabla 1 se interpretan utilizando el procedimiento descrito de búsqueda en bases de datos. Este procedimiento sirve como un prefiltro de datos para comparar con los espectros MS/MS antes de hacerlo con las secuencias aminoacídicas determinadas. El prefiltrado de datos permite que los esfuerzos de interpretación se centren en las secuencias aminoacídicas desconocidas con anterioridad. Los resultados de algunos de estos espectros MS/MS se muestran en la Tabla 4. No se requiere ninguna pre-asignación de iones de secuencia ni interpretación manual antes de la búsqueda. Sin embargo, las secuencias deben existir en la base de datos. El algoritmo pre-procesa en primer lugar los resultados del MS/MS y luego los compara con todas las secuencias aminoacídicas en la base de datos con una tolerancia de masa de \pm1 amu de la masa del ión precursor del espectro MS/MS. Los patrones de fragmentación predichos de las secuencias aminoacídicas dentro de la tolerancia de masas se comparan con el espectro experimental. Cuando la secuencia aminoacídica se halla dentro de esta tolerancia de masa, se obtiene una medida final de mejor ajuste mediante la reconstrucción de los espectros MS/MS y la realización de un análisis de correlación con el espectro experimental. La Tabla 4 enumera los espectros utilizados para analizar la eficacia del algoritmo.

El programa informático descrito anteriormente se modificó para analizar los espectros MS/MS de los péptidos fosforilados. En este algoritmo, se consideran todos los tipos de fosforilación, como por ejemplo el de Thr, Ser y Tyr.

Las secuencias aminoacídicas se escanean en la base de datos para hallar tramos lineales de secuencia que sean múltiplos de 80 amu por debajo de la masa del péptido a analizar. En el análisis, se considera cada sitio putativo de fosforilación y se realizan intentos para ajustar un espectro MS/MS reconstruido con el espectro experimental.

TABLA 4 Lista de resultados obtenidos de la búsqueda en genpept y las bases de datos de especies específicas utilizando los espectro MS/MS para los péptidos respectivos.

13

^{1} No presentes en la base de datos genpept.

^{2} Secuencia anexada a la base de datos, no hallada originalmente en la base de datos humana.

^{3} Secuencias de aminoácidos añadidas a la base de datos.

^{(-)} no presente en las 100 mejores respuestas.

* péptido identificado de secuencia similar.

Ejemplo #3

Gran parte de la información generada por los proyectos genómicos estará en forma de secuencias nucleotídicas. Aquellos tramos de secuencia nucleotídica que se puedan correlacionar con un gen se traducirán a una secuencia de proteína y se guardarán en una base de datos específica (genpept). Las secuencias nucleotídicas no-traducidas representan una riqueza de datos que pueden ser relevantes para las secuencias proteicas. El procedimiento implicará la misma aproximación algorítmica de ciclado de la secuencia nucleotídica. El codón de tres bases se convertirá en una secuencia proteica y se sumará la masa de los aminoácidos. Ello permitirá la determinación de una secuencia aminoacídica para cada uno de los tres marcos de lectura en un paso. Por ejemplo, se genera un espectro MS/MS para la secuencia Asp-Leu-Arg-Ser-Trp-Thr-Ala[SEC ID N° 43] y el algoritmo ((M+H)+=848) buscará la secuencia nucleotídica de la siguiente manera:

\newpage

Secuencia nucleotídica de la base de datos	SEC
	ID N°
nucleótidos GCG AUC UCC GGU CUU GGA CUG CUC	44
Primer paso en la secuencia	Masa	44
nucleótidos GCG AUC UCC GGU CUU GGA CUG CUC
aminoácidos Ala Ile Ser Gly Leu Gly Leu Leu	743	45
Segundo paso en la secuencia
nucleótidos G CGA UCU CCG GUC GAC UGC UC	Masa	44
aminoácidos Arg Ser Pro Val Leu Gly Leu	741	46
Tercer paso en la secuencia
nucleótidos GC GAU CUC CGG UCU UGG ACU GCU C	Masa	44
aminoácidos Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala	848	43
Cuarto paso en la secuencia
nucleótidos GCG AUC UCC GGU CUU GGA CUG CUC	Masa	44
aminoácidos Ile Ser Gly Leu Gly Leu Leu	672	45

Ya que la secuencia de aminoácidos coincide con la masa de la secuencia predicha del péptido, se compararán los iones con el espectro MS/MS. A partir de este punto, la evaluación y realización de informes de los procedimientos para la búsqueda será idéntica a la búsqueda en una base de datos de proteínas.

De acuerdo con la descripción anterior, diversas ventajas serán evidentes en la presente invención. La presente invención permite correlacionar los espectros de masa de una proteína, péptido u oligonucleótido con una base de datos de secuencias de proteínas de forma relativamente exacta, rápida y capaz de realizarse de forma automática (es decir, operar sin necesidad de ejercer ningún juicio humano). La presente invención puede utilizarse para analizar los péptidos derivados de una mezcla de proteínas y por ello no se limita al análisis de proteínas homogéneas intactas, como las generadas mediante el corte proteolítico específico y conocido.

También, pueden utilizarse diversas variaciones y modificaciones de la presente invención. La invención puede utilizarse junto con fuentes diversas y distintas de proteínas o péptidos y se cree que es aplicable a cualquier análisis por espectrometría de masas de proteínas. Además de los ejemplos descritos anteriormente, la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, para controlar los procesos de fermentación mediante la recolección y lisis de las células para obtener las proteínas, la digestión de proteínas, p.ej., en un reactor enzimático y mediante el análisis por espectrometría de masas, tal como se indicó anteriormente. En este ejemplo, los resultados podrían interpretarse utilizando una búsqueda de la base de datos del organismo (p.ej., una base de datos de levaduras). En otro ejemplo, la invención podría utilizarse para determinar las especies del organismo de donde se obtiene una proteína. El análisis utilizaría un grupo de péptidos derivados de la digestión de las proteínas totales. De esta forma, se lisarían las células del organismo, se obtendrían sus proteínas y se digerirían. Se podrían obtener resultados de espectrometría de masas con la mayoría de los péptidos. Se utilizaría una colección de espectros (p.ej., de 5 a 10 espectros) para buscar en la base de datos completa. Y por último, los espectros permitirían encontrar similitudes con proteínas conocidas de las especies estudiadas. Dado que este procedimiento utilizaría las proteínas más abundantes en la célula, se cree que existe una probabilidad alta que ya estén secuenciadas y sus secuencias se hallen en la base de datos. En una realización, fue posible utilizar relativamente pocas células para el análisis (p.ej., del orden de 10^{4}-10^{5}).

Por ejemplo, se pueden utilizar procedimientos de la invención para identificar microorganismos, proteínas de la superficie celular y similares. Para la identificación de microorganismos, se puede utilizar el procedimiento de los espectros de masas en tándem obtenidos a partir de péptidos producidos por digestión proteolítica de las proteínas celulares. La mezcla compleja de péptidos producidos se somete a una separación por HPLC en línea con el espectrómetro de masas. A medida que se eluyen los péptidos de la columna, se obtienen los espectros de masas en tándem mediante la selección de un ión peptídico en el primer analizador de masas, enviándolo a una celda de colisión y registrando los cocientes masa/carga (m/z) de los iones de los fragmentos resultantes en el segundo analizador de masas. Este proceso se realiza durante el curso del análisis por HPLC y produce una gran colección de espectros (p. ej., de 10 a 200 o más). Cada espectro representa un péptido derivado del conjunto de proteínas (codificadas por genes) del microorganismo y por tanto dicha colección se puede utilizar para desarrollar uno o más marcadores específicos de familia, género, serotipo o de cepa de los microorganismos, según se desee.

La identificación de los microorganismos se realiza utilizando una o por lo menos tres técnicas relacionadas de soporte logístico. En una primera técnica, la búsqueda en una base de datos, se utilizan los espectros de masas en tándem para buscar las bases de datos de proteínas y nucleótidos con el fin de identificar una secuencia aminoacídica, que se representa por el espectro. La identificación del organismo se logra cuando una preponderancia de los espectros, obtenida en el análisis de espectrometría de masas, concuerda con las proteínas identificadas con anterioridad como procedentes de un organismo en particular. Estos métodos de búsqueda en las bases de datos son los descritos anteriormente.

En una segunda técnica, se puede realizar una búsqueda de una librería como si no se observaran concordancias, utilizando la búsqueda de bases de datos descrita anteriormente. En esta aproximación, el grupo de resultados se compara con una librería predefinida de espectros obtenidos de organismos conocidos. Con dicho fin, se crea inicialmente una librería de espectros de péptidos de microorganismos. La librería de espectros de masas en tándem de microorganismos se puede construir mediante cualquiera de los procedimientos que emplean LC- MS/MS. Los procedimientos se pueden utilizar para variar la localización celular de donde se obtienen las proteínas, así como para variar la cantidad de pre-purificación utilizada para la mezcla peptídica resultante antes del análisis por LC-MS/MS. Por ejemplo, las células intactas se pueden tratar con una enzima proteolítica como la tripsina, quimotripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C, pepsina, etc., para digerir las proteínas expuestas en la superficie celular. El pretratamiento de las células intactas con una o más glicosidasas puede utilizarse para eliminar las interferencias estéricas que se puedan crear por la presencia de carbohidratos en la superficie celular. Así, el pre-tratamiento con glicosidasas puede utilizarse para obtener rendimientos peptídicos mayores durante la etapa de proteolisis. Un segundo procedimiento para preparar péptidos implica la ruptura de las membranas celulares (p.ej., por sonicación, choque hipo-osmótico, congelación y descongelación, bolas de vidrio, etc.) y la recolección de las proteínas totales mediante precipitación, p.ej., utilizando acetona o similar. Las proteínas se resuspenden en un tampón de digestión y se tratan con una proteasa como la tripsina, quimotripsina, endoproteinasa glu-C, enodproteinasa lys-C, etc., para crear una mezcla de péptidos. La amplificación parcial de esta mezcla de péptidos, como por ejemplo el fraccionamiento de la mezcla en fracciones ácidas y básicas o mediante separación utilizando la cromatografía de intercambio catiónico, conduce a diversos grupos de péptidos, que pueden utilizarse en el proceso de espectrometría de masas. Las mezclas de péptidos se analizan por LC-MS/MS, creando un grupo amplio de espectros, representando cada uno un marcador peptídico único del organismo o del tipo celular.

Los resultados se guardan en la librería mediante cualquiera de los diversos procedimiento, pero convenientemente en tres secciones, en donde una sección es la masa peptídica determinada a partir del espectro, una segunda sección es la información relacionada con el organismo, especie, condiciones de crecimiento, etc., y una tercera sección contiene los datos de masa/intensidad. Los datos se pueden guardar en diversos formatos, convenientemente en formato ASCII o en formato binario.

Para realizar la búsqueda de librerías, se comparan los espectros, determinando en primer lugar que la masa del péptido se halle dentro de una tolerancia de masas (típicamente \pm1-3 amu) del espectro de la librería. Una función de correlación cruzada tal como se describió anteriormente se utiliza para obtener un valor cuantitativo de la similitud o del mejor ajuste de los dos espectros. El proceso es similar al algoritmo de búsqueda de bases de datos, excepto que para una secuencia aminoacídica no se reconstruye un espectro. Para proporcionar un grupo de espectros de comparación, se puede utilizar el espectro de masas en tándem para buscar una base de datos pequeña (p.ej., \sim100 secuencias de proteínas) generada aleatoriamente. Esto proporciona un fondo contra el que se compara la similitud y se puede generar una evaluación normalizada.

Una tercera técnica relacionada para identificar un microorganismo o célula implica la interpretación de novo para determinar un grupo de secuencias de aminoácidos que tengan la misma masa que el péptido representado por el espectro. El grupo de secuencias aminoacídicas se limita utilizando la ecuación 1 de pre-procesamiento espectral anterior para clasificar las secuencias. Este grupo de secuencias aminoacídicas sirve como una base de datos para utilizar en el procedimiento de búsqueda descrito anteriormente. Una secuencia aminoacídica deriva por lo tanto de un espectro de masas en tándem que no está contenido en la base de datos organizada. Utilizando el análisis filogenético de las secuencias aminoacídicas determinadas, éstas se pueden colocar dentro de una especie, género o familia y en consecuencia se puede lograr una clasificación del microorganismo.

La metodología descrita anteriormente tiene además aplicaciones en la identificación de microorganismos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la secuenciación de cDNAs utilizando medios convencionales para obtener secuencias parciales de genes expresados en líneas celulares, tipos de tejidos o microorganismos en particular. Esta información sirve como base de datos para los siguientes análisis. La aproximación descrita anteriormente, para la digestión de proteínas expuestas en la superficie celular mediante digestión enzimática, se puede utilizar para generar una colección de péptidos para el análisis por LC-MS/MS. Los espectros resultantes se utilizan para buscar las secuencias nucleotídicas en los 6 marcos de lectura con el fin de hacer concordar las secuencias aminoacídicas con los espectros MS/MS. Las secuencias aminoacídicas identificadas representan las regiones de las proteínas de superficie celular expuestas al espacio extracelular. Este procedimiento proporciona por lo menos dos piezas adicionales de información no obtenible directamente a partir de la secuenciación del DNA. En primer lugar, los espectros identifican las proteínas residentes en la membrana de las células. En segundo lugar, se obtiene información bilateral sobre el plegamiento de proteínas en la superficie celular. Las secuencias peptídicas concordantes con la información de la secuencia nucleotídica identifican aquellos segmentos de la secuencia proteica expuestos extracelularmente.

Los procedimientos también se pueden utilizar parainterpretar los espectros MS/MS de los carbohidratos. En este procedimiento, el carbohidrato(s) de interés se somete a una separación por HPLC en línea con un espectrómetro de masas en tándem, al igual que para los péptidos. Los carbohidratos se pueden obtener de una mezcla compleja de carbohidratos u obtenerse de proteínas celulares, etc., mediante liberación química o enzimática. Los espectros de masas en tándem se obtienen mediante selección de un ión carbohidrato en el primer analizador de iones de fragmentos, enviándolo a una celda de colisión y registrando los cocientes masa/carga (m/z) de los iones de fragmentos resultantes en el segundo analizador de masas. Este proceso se realiza durante el curso del análisis por HPLC y produce una gran colección de espectros (p.ej., de 10 a 200 o más). Los patrones de fragmentación de las estructuras de carbohidratos contenidas en la base de datos se pueden predecir y se puede comparar así una representación teórica de los espectros con el patrón en el espectro de masas en tándem, utilizando el procedimiento descrito anteriormente. En consecuencia, es posible identificar las estructuras de carbohidratos analizadas mediante espectrometría de masas en tándem. Estos procedimientos pueden utilizarse para la caracterización de las estructuras de carbohidratos halladas en las proteínas, superficies celulares, etc.

La presente invención se puede utilizar junto con aplicaciones diagnósticas, tal como se describió anteriormente y en el Ejemplo 2. Otro ejemplo implica la identificación de células infectadas por virus. El éxito de dicha aproximación parece ser que depende de la abundancia relativa de las proteínas virales respecto a las proteínas celulares, por lo menos utilizando el equipo presente. Si se produjera un anticuerpo contra una región específica de una proteína común a ciertos patógenos, la mezcla de proteínas podría fraccionarse de forma parcial haciendo pasar el material por una columna de afinidad. Y a continuación, las proteínas unidas se eluirían y digerirían. La espectrometría de masas genera los resultados para buscar una base de datos. Uno de los elementos importantes es el hallar un dispositivo general para sacar las proteínas de la célula. Esta aproximación podría también utilizarse para analizar proteínas de diagnóstico específicas. Por ejemplo, si se sabe que una determinada variante de proteína está presente en alguna forma de cáncer o enfermedad genética, se podría producir un anticuerpo contra una región inalterable de la proteína. Se podría construir una columna de inmunoafinidad con el anticuerpo para aislar la proteína del resto de proteínas de la célula. La proteína podría digerirse y analizarse mediante espectrometría de masas. La base de datos de todas las posibles mutaciones en la proteína podrían mantenerse y analizarse de nuevo los resultados de esta base de datos.

Un ejemplo posible podría ser la fibrosis quística. La enfermedad se caracteriza por múltiples mutaciones en la proteína CFTR. Una mutación es responsable de aproximadamente el 70% de los casos y el 30% restante de los casos resulta de una gran variedad de mutaciones. Para analizar estas mutaciones mediante análisis genéticos, se necesitarían muchos y diferentes análisis y sondas. En el ensayo descrito anteriormente, se podría aislar la proteína y analizar mediante espectrometría de masas en tándem. Todas las mutaciones en la proteína podrían identificarse en un ensayo basado en la información estructural. La base de datos utilizada describiría preferentemente todas las mutaciones conocidas. La aplicación de esta aproximación se cree que implica dificultades significativas. La cantidad de proteína requerida podría ser tan amplia que sería imposible de obtener de un paciente. Este problema puede sobrellevarse si la sensibilidad de la espectrometría de masas mejora en el futuro. Una proteína como la CFTR es una proteína de membrana, que como todas las proteínas de membrana son generalmente muy difíciles de manipular y digerir. La aproximación descrita podría utilizarse para cualquier diagnóstico proteico. Los resultados serían muy específicos y el análisis de esos resultados debería ser esencialmente automatizado.

Se cree que la presente invención puede utilizarse con cualquier tamaño peptídico. El proceso requiere que los péptidos se fragmenten y para ello existen procedimientos para lograr la fragmentación de proteínas muy grandes. Algunas de estas técnicas se describen en Smith y col., "Collisional Activation and Collision-Activated Dissociation of Large Multiply Charged Polypeptides and Proteins Produced by Electrospray Ionization" J. Amer. Soc. Mass Spect. I:53-96 (1990). El procedimiento actual puede utilizarse para analizar los resultados derivados de proteínas intactas, ya que no existe un límite teórico o absoluto, en la práctica, en relación con el tamaño de los péptidos que pueden analizarse de acuerdo con esta invención. De acuerdo con la presente invención, se han realizado análisis de péptidos de por lo menos en un intervalo de tamaños de aproximadamente 400 amu (4 residuos) a aproximadamente 2500 amu (26 residuos).

En las realizaciones descritas, las sub-secuencias candidatas se identifican y se predicen los espectros de fragmentos según requisitos, en el momento de realizar el análisis. Si están disponibles suficientes fuentes computacionales y facilidades de almacenamiento para realizar algunos o todos los cálculos necesarios para la identificación de secuencias candidatas (como el cálculo de masas de sub-secuencias) y/o la predicción de espectros (como el cálculo de masas de fragmentos), se puede utilizar el almacenamiento de estos datos en una base de datos, de forma que algunos o todos estos elementos puedan buscarse en lugar de calcularse cada vez que se necesite.

Aunque la presente invención se ha descrito por medio de la realización preferida y de algunas variaciones y modificaciones, también se pueden utilizar otras variaciones y modificaciones de la presente invención.

Claims

1. Procedimiento para la identificación de fragmentos peptídicos, que comprende:

: almacenar los resultados representativos de un primer espectro de masas de una cantidad de fragmentos de por lo menos un primer péptido;

: calcular una cantidad de espectros de masas predichos de por lo menos una porción de una cantidad de secuencias aminoacídicas derivadas de una base de datos de secuencias; y

: calcular por lo menos una primera medida para cada uno de los espectros de dicha cantidad de espectros de masa predichos, siendo dicha primera medida un indicador del mejor ajuste entre dicho espectro de masas y cada uno de los espectros de masas de dicha cantidad, correlacionados de esta manera, los fragmentos peptídicos con las secuencias aminoacídicas derivadas de la base de datos de secuencias.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se proporciona dicho primer espectro de masas mediante un dispositivo de espectrometría de masas en tándem.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el espectrómetro de masas en tándem es un espectrómetro de masas triplecuádruple, un espectrómetro de masas de resonancia de ciclotrón de transformación de Fourier, un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo en tándem o un espectrómetro de masas de trampa de iones cuádruple.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha base de datos de secuencias es una base de datos de secuencias aminoacídicas de una cantidad de proteínas.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha base de datos de secuencias es una base de datos de nucleótidos.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además seleccionar una primera cantidad de sub-secuencias procedentes de dicha base de datos de secuencias, en donde dicha etapa de cálculo de una cantidad de espectros de masas predichos incluye el cálculo de por lo menos un espectro de masas predicho, para cada sub-secuencia de dicha primera cantidad seleccionada de sub-secuencias.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha etapa de cálculo de una primera medida incluye seleccionar aquellos valores del mencionado primer espectro de masas que tienen una intensidad superior al valor predeterminado.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende normalizar dicho primer espectro antes de la mencionada etapa de cálculo de por lo menos una medida.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mencionada etapa de cálculo de una cantidad de espectros de masas predichos incluye el cálculo de los espectros de masa predichos únicamente para una parte de la mencionada base de datos de secuencias.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho péptido deriva de una proteína que se obtiene de un primer organismo y en donde dicha proteína de la base de datos mencionada es la porción que contiene las secuencias de proteínas halladas en dicho primer organismo.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde se utiliza un primer espectrómetro de masas, de dicho itivo de espectrometría de masas en tándem, para separar un componente con una primera masa, se utiliza un dispositivo de activación, de dicho dispositivo de espectrometría de masas, para fragmentar dicho primer componente y se utiliza un segundo espectrómetro de masas, de dicho dispositivo de espectrometría de masas en tándem, para proporcionar dicho primer espectro de masas.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho primer péptido se aísla mediante cromatografía.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los mencionados resultados, que representan dicho primer espectro de masas, incluyen una cantidad de parejas de masa-carga.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha etapa de cálculo de espectros de masa predichos comprende:

: obtener una cantidad de masas de las porciones de dicha cantidad de secuencias, siendo cada masa igual a la masa de un fragmento peptídico que corresponde a una porción de una secuencia en la mencionada cantidad de secuencias;

: seleccionar aquellas masas, de entre dicha cantidad de masas, que se hallen dentro de una tolerancia de masas predeterminada de la masa de dicho primer péptido y guardar una indicación de la porción de secuencia de cada una de las masas seleccionadas correspondientes, para proporcionar una cantidad de porciones de secuencias candidatas; y

: calcular una cantidad de parejas masa-carga para cada una de dichas porciones de secuencias candidatas, teniendo cada una de dichas parejas de masa-carga una masa sustancialmente igual a la masa de un fragmento peptídico, correspondiente a una porción de una de las mencionadas porciones de secuencias candidatas.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha primera medida comprende un coeficiente de correlación.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha primera etapa de cálculo de una primera medida comprende:

: calcular la valoración preliminar para cada una de las porciones de secuencias de dicha cantidad candidatas;

: identificar una cantidad de primeras porciones candidatas que tengan una valoración preliminar superior a por lo menos una secuencia candidata, no identificada como una primera porción candidata; y

: calcular un coeficiente de correlación para cada una de dichas porciones candidatas primarias.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde cada uno de los espectros de masa de dicha cantidad y del mencionado primer espectro de masas incluye una cantidad de parejas de masa-carga, teniendo cada pareja de masa-carga un valor de intensidad; y comprendiendo, además, la etapa de identificar, para cada uno de los espectros de masa de la cantidad, de un grupo de fragmentos concordantes con menos de una diferencia predeterminada respecto a los fragmentos correspondientes en el citado primer espectro de masas; y

en donde dicha valoración preliminar es el número de fragmentos de un espectro de masas predicho, en dicho grupo de fragmentos concordantes, multiplicado por la suma de los valores de intensidad para las parejas de masa- carga que corresponden a los fragmentos concordantes.

18. Procedimiento para determinar si un péptido en una mezcla de proteínas es homólogo a una porción de cualquiera de las proteínas de una cantidad especificada por una secuencia de aminoácidos en una base de datos de secuencias, que comprende:

: utilizar un espectrómetro de masas en tándem para recibir una cantidad de péptidos obtenidos de dicha mezcla de proteínas, para seleccionar por lo menos un primer péptido de dicha mezcla de péptidos, para fragmentar dicho primer péptido y para generar un espectro de masas de fragmentos del péptido;

: guardar los datos que representan dicho primer espectro de masas; y

: correlacionar dicho espectro de masas con una secuencia aminoacídica en dicha base de datos de secuencias, para determinar la correspondencia entre una proteína específica en dicha base de datos de secuencia y una proteína en la mencionada mezcla de proteínas; incluyendo dicha etapa de correlación la predicción de por lo menos un espectro de masas de dicha secuencia aminoacídica.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la mezcla de proteínas se obtiene de una célula o microorganismo a identificar.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la mezcla o proteínas se obtiene mediante digestión proteolítica de proteínas celulares.

21. Procedimiento de la reivindicación 20, en donde las proteínas celulares son extracelulares.

22. Procedimiento para identificar un organismo de interés mediante la determinación de un espectro de masas de una cantidad de espectros de masas de péptidos obtenidos a partir del organismo, o de componentes de lo mismo, con el fin de identificar si concuerdan con proteínas de organismos conocidos en una librería de secuencias proteicas, comprendiendo dicho procedimiento:

: utilizar un espectrómetro de masas en tándem para recibir una cantidad de péptidos obtenidos a partir de una mezcla de proteínas procedentes de dicho organismo a identificar, para seleccionar por lo menos un primer péptido de dicha cantidad de péptidos, para fragmentar dicho primer péptido y generar un espectro de masas de fragmentos;

: guardar los resultados que representan dicho primer espectro de masas; generar dicho espectro de masas predicho de la mencionada librería de secuencias de proteínas, y:

: correlacionar dicho espectro de masas con los espectros de masas en la mencionada librería de secuencias de proteínas de organismos conocidos, para determinar la correspondencia entre dicho espectro y los espectros obtenidos de los péptidos obtenidos del organismo a identificar, identificándose en consecuencia dicho organismo.

23. Procedimiento de la reivindicación 22, en donde el organismo a identificar es una bacteria, hongo o virus.

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la mezcla de proteínas se obtiene mediante digestión enzimática de las proteínas del organismo.