ES2200059T3 - Produccion de construcciones inmunogenicas usando carbohidratos solubles activados mediante reactivos cianilados organicos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UN CONSTRUCTO INMUNOGENICO QUE INCLUYE ACTIVAR AL MENOS UN PRIMER RADICAL QUE CONTIENE UN CARBOHIDRATO, Y UNIR DE FORMA COVALENTE EL PRIMER RADICAL ACTIVADO CON UN SEGUNDO RADICAL. PREFERIBLEMENTE, EL PRIMER RADICAL ES UN POLISACARIDO Y EL SEGUNDO RADICAL ES UNA PROTEINA. SE PREPARAN CONSTRUCTOS INMUNOGENICOS MEDIANTE ESTE PROCEDIMIENTO UTILIZANDO CONJUGACION DIRECTA O INDIRECTA DEL PRIMER Y SEGUNDO RADICAL.

Description

Producción de construcciones inmunogénicas usando carbohidratos solubles activados mediante reactivos cianilados orgánicos.

Antecedentes de la invención

Ciertos agentes tales como la toxina del tétanos pueden disparar innatamente la respuesta inmune, y pueden administrarse en vacunas sin modificación. Sin embargo, otros agentes importantes no son inmunogénicos, y deben convertirse en construcciones o moléculas inmunogénicas antes de que puedan inducir la respuesta inmune.

Esta invención se refiere generalmente a métodos ventajosos para la fabricación de construcciones inmunogénicas. Esta invención también se refiere a las construcciones inmunogénicas resultantes y a las vacunas preparadas a partir de ellas, y al uso de tales construcciones inmunogénicas.

Más específicamente, la invención se refiere a métodos para activar antígenos que contienen carbohidratos para su uso en la preparación de construcciones inmunogénicas. Las construcciones inmunogénicas se preparan muy ventajosamente activando un resto que contiene carbohidrato con un agente cianilado orgánico tal como tetrafluoroborato de 1-ciano-3-(dimetilamino)-piridinio (CDAP).

Se conocen per se una diversidad de reactivos cianilados, por ejemplo, como reactivos para activar partículas insolubles para preparar geles para cromatografía de afinidad. Véase Wilcheck et al., Affinity Cromatography. Meth. Enzymol., 104C:3-55. Wakelsman et al., J.C.S. Chem. Comm., 1976: (1976), informaron que CDAP es un reactivo suave que puede usarse para modificar grupos de proteína cisteína. Kohn et al., Anal. Biochem, 115:375 (1981), compararon CDAP, tetrafluoroborato de N-cianotrietil-amonio (CTEA), y tetrafluoroborato de p-nitrofenilcianato (pNPC) como agentes de activación para la agarosa, una resina de polisacárido insoluble. Otros investigadores han usado CDAP para activar otros tipos de partículas insolubles, tales como Sepharose y vidrio poroso controlado por glicerilo. Véase, por ejemplo, Carpenter et al., Journal of Chromatography, 573:132-135 (1992).

La patente de Estados Unidos No. 3.788.948 de Kagedal et al. describe generalmente un método que usa compuestos de cianato orgánicos para unir compuestos orgánicos que contienen un grupo amino primario o secundario a polímeros que contienen uno o más grupos hidroxilo y/o grupos amino primarios y/o grupos amino secundarios, por ejemplo, para unir enzimas solubles en agua a polímeros insolubles en agua. Kagedal et al. describe un método usando ciertos compuestos de cianato orgánicos tales como pNPC que tienen ventajas sobre el bromuro cianógeno.

De forma similar, Andersson et al., International Journal of Cancer, 47:439-444 (1991), informan del uso de CDAP para activar un polisacárido soluble antes de la conjugación con la proteína. Ellos conjugaron directamente el factor de crecimiento epidérmico (EGF) a dextrano 40 kDa de bajo peso molecular activado con cianato, y usaron relaciones muy altas de dextrano a EGF de aproximadamente 50:1 (p/p.) para producir conjugados de dextrano-EGF y estudiaron la unión de este conjugado a células cultivadas.

Sin embargo, Kagedal et al. y Andersson et al., no se interesaron con construcciones inmunogénicas. De hecho, se ha descubierto que los conjugados de proteínas a dextranos de bajo peso molecular son poco o no inmunogénicos. T.E. Wileman, J. Pharm. Pharmacology, 38:264 (1985).

Por supuesto, el grado de inmunogenicidad, es una propiedad importante de las construcciones inmunogénicas para propósitos de vacunación. El proceso de vacunación emplea la capacidad innata del cuerpo para protegerse a si mismo contra agentes invasores inmunizando el cuerpo con antígenos que no causan la enfermedad, pero que estimulan la formación de anticuerpos, células, y otros factores que serán de protección contra la enfermedad. Por ejemplo, se inyectan organismos muertos para proteger contra enfermedades bacterianas tales como la fiebre tifoidea y la tos ferina, se inyectan toxinas para proteger contra tétanos y difteria, y se inyectan organismos atenuados para proteger contra enfermedades virales tales como poliomelitis y sarampión.

Sin embargo, no siempre es posible estimular la formación de anticuerpos simplemente por inyección del agente externo. La preparación de la vacuna debe ser inmunogénica, es decir, debe ser capaz de inducir una respuesta inmune. La respuesta inmune es una compleja serie de reacciones que pueden describirse generalmente como a continuación:

(i) El antígeno entra en el cuerpo y encuentra células que presentan antígenos que procesan el antígeno y retienen fragmentos del antígeno en sus superficies; (ii) los fragmentos de antígeno retenidos en las células que presentan antígenos son reconocidos por células T que proporcionan ayuda a las células B; y (iii) se estimulan las células B para que proliferen y se dividan en células que formen anticuerpos que segregan los anticuerpos contra el antígeno.

Se han mostrado anticuerpos a la mayoría de los polisacáridos bacteriales para proporcionar protección contra infección con bacterias encapsuladas. La incapacidad de neonatos y niños pequeños para generar respuestas vigorosas a antígenos independientes de células T (TI), como se ejemplifica con los polisacáridos, resulta en su extrema susceptibilidad a infecciones mortales con estos organismos. Esta respuesta inmune impedida a antígenos TI puede superarse conjugando epítopos de células T en los polisacáridos, convirtiéndolos de esta forma en antígenos dependientes de células T (TD).

Existen dos métodos usados generalmente para producir construcciones de polisacáridos inmunogénicas: (1) conjugación directa del carbohidrato y la proteína; y (2) conjugación indirecta de carbohidratos y proteína mediante un engarce bifuncional o un reactivo espaciador. Generalmente, tanto la conjugación directa como indirecta requieren activación química del resto carbohidrato antes de su derivatización.

La activación química se refiere a la conversión de un grupo funcional en un forma que pueda experimentar reacciones químicas adicionales, por ejemplo, la adición de un grupo funcional o de un resto grande tal como una proteína. La derivatización es la adición de un grupo(s) químico(s) funcional(es) o reactivo(s) espaciador(es) a una proteína.

Desafortunadamente, los expertos han encontrado problemas en la formación de construcciones inmunogénicas mediante conjugación usando métodos de activación. Por ejemplo, la producción de vacunas conjugadas ha sido un reto formidable, en parte, debido a la dificultad en activar el polisacárido y conjugar la proteína bajo condiciones que no conduzcan a su degradación o a la destrucción de sus epítopos inmunogénicos. En la preparación de construcciones inmunogénicas, el método usado debería ser suficientemente suave para retener los sitios antigénicos importantes, es decir, epítopos, en las moléculas. De esta forma, es deseable mantener la integridad de la estructura y preservar los epítopos en estos compuestos. Desafortunadamente, las etapas de preparación que se usan comúnmente en la técnica no son suaves normalmente y pueden destruir carbohidrato nativo y/o estructuras de proteína.

Además, muchas de las técnicas conocidas para la modificación de carbohidrato requieren condiciones anhidras. Sin embargo, desafortunadamente, los carbohidratos no son solubles normalmente en disolventes orgánicos. Marburg et al, J. Amer. Chem. Soc., 108:5282 (1986).

De esta forma, aunque hay un gran volumen de literatura química que describe la modificación de carbohidratos, mucho es inadecuado para su uso con antígenos basados en agua. Un acercamiento ha sido la modificación de polisacáridos para mejorar su solubilidad en disolventes orgánicos. Por ejemplo, reemplazando el hidrógeno ácido en ciertos polisacáridos ácidos con el contraión amonio tetrabutilo hidrófobo, Marbur et al., consiguieron solubilizar polisacáridos en disolventes orgánicos y activar hidroxilos con diimidazol carbonilo, un reactivo que debe usarse en disolvente seco.

Este método se usa con polisacáridos, tales como Haemophilus influenzae PRP y polisacáridos de pneumococo tipo 6B y 19F. El acoplamiento de proteínas también puede conseguirse mediante aminación reductora, usando el aldehído encontrado en el extremo reductor del polisacárido o creado por oxidación del carbohidrato. Cualquiera de estos dos acercamientos tiene limitaciones intrínsecas y, de esta forma, para polisacáridos de alto peso molecular, el acoplamiento a través del extremo reductor es normalmente lento e ineficiente y la oxidación resulta a menudo en la escisión de la cadena del polisacárido o afecta de otra manera al antígeno.

Ciertos carbohidratos contienen grupos, tales como amino o carboxilo, que pueden activarse más fácilmente o derivatizarse antes de la conjugación. Por ejemplo, los grupos amino en Pseudomonas Fisher Tipo I pueden derivatizarse fácilmente con grupos yodoacetilo y unidos a una proteína tiolada. Los grupos carboxilo en carbohidratos tales como De pneumococo tipo III pueden activarse fácilmente con carbodiimidas solubles en agua, tales como EDC, y entonces pueden acoplarse directamente a la proteína. Sin embargo, desafortunadamente, este grupo de carbohidratos es limitado.

Otros carbohidratos tienen grupos aldehído en el extremo reductor terminal que pueden utilizarse para derivatización y conjugación. También es posible crear grupos aldehído con reactivos oxidantes, por ejemplo, peryodato sódico. Los grupos aldehído pueden condensarse con grupos amino en proteínas o con un engarce bifuncional reactivo. Sin embargo, esta reacción de condensación, especialmente con el extremo terminal reductor de un polisacárido de alto peso molecular, a menudo progresa bastante lentamente e ineficazmente. Esto es exagerado cuando se conjugan directamente aldehídos de carbohidratos a proteínas. De esta forma, las producciones son a menudo muy bajas usando este método. Además, el peryodato sódico puede romper los carbohidratos en fragmentos más pequeños y/o romper epítopos, que puede no ser deseable.

La mayoría de los carbohidratos deben activarse antes de la conjugación, y el bromuro de cianógeno es frecuentemente el agente de activación elegido. Véase, por ejemplo, Chu et al., Inf. & Imm., 40:245 (1983), y Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), vol 10., 48 - 114 (1989). La primera vacuna conjugada con licencia se preparó con CNBr para activar HIB PRP, que después se derivatizó con dihidrazida ácida y se acopló a la toxina del tétanos usando una carbodiimida soluble en agua.

Para resumir brevemente el método de activación con CNBr, el bromuro cianógeno se hace reaccionar con el carbohidrato a un pH alto, típicamente un pH de 10 a 12. A este pH alto, se forman ésteres de cianato con los grupos hidroxilos del carbohidrato. Éstos, a su vez, reaccionan con un reactivo bifuncional, normalmente una diamina o una dihidrazida. Después, estos carbohidratos derivatizados pueden conjugarse mediante el grupo bifuncional. En ciertos casos limitados, los ésteres de cianato pueden hacerse reaccionar directamente a proteínas.

El pH alto es necesario para ionizar el grupo hidroxilo porque al reacción requiere el ataque nucleófilo del ion hidroxilo en el ion cianato (CN^{-}). Como resultado, el bromuro de cianato produce muchas reacciones secundarias, algunas de las cuales añaden neoantígenos a los polisacáridos. M. Wilcheck et al., Affinity Chromatography. Meth. Enzymol., 104C:3-55. Más importante, muchos carbohidratos o restos tales como HIB PRP y Pn6 pueden hidrolizarse o dañarse por el alto pH necesario para realizar la activación del bromuro de cianógeno.

Otro problema con el método de activación con CNBr es que el éster cianato formado es inestable a pH alto y se hidroliza rápidamente, reduciendo la producción de carbohidrato derivatizado y, por tanto, la producción total de carbohidrato conjugado a la proteína. Muchas otras reacciones secundarias no productivas, tales como las que producen carbamatos e imidocarbonatos lineales, se promueven por el pH alto. Kohn et al., Anal. Biochem, 115:375 (1981). Además, el bromuro de cianógeno por sí mismo es altamente inestable y se hidroliza espontáneamente a pH alto, reduciendo adicionalmente la producción total.

Además, la activación del bromuro de cianógeno es difícil de realizar y no es fiable. El bromuro de cianógeno es altamente tóxico y potencialmente explosivo. Se debe tener una precaución extrema cuando se trabaja con grandes cantidades como las usadas en la fabricación. Todas las operaciones deben realizarse en una campana extractora adecuada. Los experimentados en la técnica conocen también que la activación no es reproducible fácilmente ya que algunos lotes de bromuro de cianógeno funcionan bien y otros no. El bromuro de cianógeno es además poco soluble en agua, haciendo difícil controlar la cantidad de bromuro de cianógeno disponible para reaccionar con el carbohidrato. Incluso el uso del mismo lote de bromuro de cianógeno y condiciones de reacción aparentemente idénticas no siempre conducen a resultados idénticos.

Además de estas desventajas, es muy difícil controlar el grado de activación del carbohidrato conseguido usando bromuro de cianógeno. También es muy difícil conseguir un nivel alto de activación de carbohidrato usando este método. Incrementar la cantidad de bromuro de cianógeno presente es ineficaz y solo conduce a más reacciones secundarias sin un incremento en la activación. Kohn et al., Applied Biochemn and Biotech, 9:285 (1984).

De esta forma, mientras que el bromuro de cianógeno ha demostrado ser un reactivo muy útil, tiene un número de limitaciones. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno requiere un algo pH (10-12) para hacer los hidroxilos suficientemente nucleófilos para reaccionar con el ion cianato. Sin embargo, ni el CNBr ni el éster de cianato son estables a pH altos, y en consecuencia la mayoría de los reactivos se hidrolizan o experimentan secundarias reacciones no productivas o no deseadas. De esta forma, la eficacia de la activación del polisacárido es baja. Además, el alto pH requerido para la activación puede hidrolizar o dañar muchos polisacáridos sensibles al pH. Además, CNBr es tóxico y es difícil trabajar con el en pequeñas cantidades.

Además, como se ha denotado anteriormente, otros métodos de conjugación tienen varias desventajas. Por ejemplo, auque polisacáridos tales como Cryptococcus neoformans y polisacárico pneumocócico tipo 3 y Antígeno VI tienen grupos carboxilos que pueden activarse con carbodiimidas en la preparación para el acoplamiento a una proteína, y los polisacáridos tales como Pseudomonas Fisher tipo III tienen grupos amino que pueden usarse convenientemente, estos antígenos forman un grupo relativamente limitado de todos los polisacáridos. Por lo tanto, se necesitan otros acercamientos para activar o funcionalizar la mayoría de los polisacáridos.

Una solución propuesta es el método de aminación reductora en el cual se producen un número limitado de aldehídos reductores y se acoplan a aminas. Véase P. Anderson, Infection. Immun., 39, 233 - 238 (1983). Otra solución es la heterounión, por ejemplo, el método de espaciador bigenérico de Marburg et al. que usó un enlace tiol-éter que produjo un aminoácido único en la hidrólisis. Véase Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc., 108, 5282 (1986). Sin embargo, este método requiere que el polisacárido sea soluble en disolventes orgánicos secos.

También se ha propuesto la derivatización limitada de la proteína por adición de un número limitado de grupos espaciadores, tales como hexanodiamina o dihidrazida adípica. Éstos pueden añadirse entonces, por ejemplo, mediante el método del bromuro de cianógeno. En este método, los carboxilos de proteína se activan con carbodiimidas y
reaccionan con la amina o la hidrazida. Sin embargo, este método produce reticulación masiva de proteína y polisacárido y polimerización de la proteína.

WO 95/08348 (Lees et al.) es un solicitud anterior de los presentes inventores y se refiere a construcciones inmunogénicas. El método para preparar construcciones inmunogénicas en WO 95/08348 no describe derivatizar un segundo resto.

WO 93/15763 (Mond et al.) es también una solicitud anterior de los presentes inventores y describe la activación de un primer resto con agentes reactivos de tiol tales como malimida y yodoacetato en una primera etapa del proceso (página 18, primer párrafo completo, ejemplo 10, página 44-46)

\newpage

EP 0428486 (Handley et al.) se refiere a la preparación de conjugados de polímero de poliximina solubles en agua en donde el polímero es un polisacárido tal como dextrano. El conjugado del documento EP 0428486 se prepara activando el dextrano con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-(dietilamino)-piridinio (CDAP) antes de acoplar el dextrano a la poliximina. El documento EP 0428486 no comprende la derivatización del segundo resto (poliximina) con tiol o un grupo hidrazida nucleófilo en una segunda etapa del proceso.

El documento US 3,788,948 describe la preparación de un derivado de peroxidasa soluble en agua por acoplamiento de un resto carbohidrato a la peroxidasa para su uso en reactivos diagnóstico (columna 1, líneas 8-15). El acoplamiento se realiza oxidando la peroxidasa con, por ejemplo, ácido peryódico y reaccionando la enzima oxidada resultante con un polímero tal como un polisacárido.

De esta forma, existe una necesidad en la técnica de un método para producir estructuras inmunogénicas que sea suave, mantenga la integridad de la estructura de los carbohidratos y las proteínas, preserve los epítopos en los compuestos, sea fácil de realizar, fiable, sea fácil de realizar a escala, y funcione con una amplia diversidad de polisacáridos.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención es conseguir un método suave para producir construcciones inmunogénicas. Otro objeto es conseguir un método para fabricar construcciones inmunogénicas que mantienen la integridad de la estructura de los carbohidratos y proteínas, y preserva los epítopos en los compuestos. Un objeto adicional de la invención en conseguir un método de fabricación de construcciones inmunogénicas que sea fácil de realizar, fiable, y reproducible fácilmente. Un objeto adicional es desarrollar un método para fabricar construcciones inmunogénicas que pueda usarse con una diversidad de polisacáridos. Un objeto adicional es obtener un método conveniente para fabricar vacunas conjugadas solubles. Otro objeto es conseguir un método que sea fácilmente realizable a escala. Éstos y otros objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada a continuación.

La presente invención se refiere a los objetos descritos anteriormente, por lo que supera los problemas y desventajas de los métodos conocidos para producir construcciones inmunogénicas, mediante un proceso de conjugación que emplea un método de activación del carbohidrato que es seguro, fácil, barato, y suave con los carbohidratos. Además, el método emplea ventajosamente una reacción homogénea.

Un aspecto de la presente invención es un método para producir un construcción inmunogénica, que comprende activar al menos un primer resto que contiene carbohidratos seleccionado entre el grupo compuesto por polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos con un reactivo cianilado orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por tetrafluoroborato de 1-ciano-4- (dimetilamino)-piridinio, tetrafluoroborato de N-cianotrietilamonio, y p- nitrofenilcianato, para formar un carbohidrato activado, derivatizando además un segundo resto seleccionado entre el grupo compuesto por proteínas, péptidos, y haptenos con un tiol o un grupo nucleófilo hidrazida, y acoplando dicho carbohidrato activado directa o indirectamente al segundo resto derivatizado para formar una construcción inmunogénica capaz de estimular una respuesta inmune. En una realización preferida, dicho reactivo cianilado orgánico es tetrafluoroborato de 1-ciano-4-(dimetilamino)-piridinio. Más preferiblemente, dichos primero y segundo restos son solubles en agua. También se prefiere una realización en la que dicha activación se realiza en presencia de trietilamina.

Otra realización preferida de la presente invención proporciona un método como se ha descrito anteriormente, en donde el acoplamiento se hace indirectamente uniendo covalentemente el primer resto a un reactivo espaciador bifuncional o heterofuncional, y uniendo covalentemente el segundo resto derivatizado al reactivo espaciador. Más preferida es una realización en donde dicho reactivo espaciador se selecciona entre un grupo compuesto por etilendiamina,
1,6-hexano diamina, dihidrazida adípica, cistamina, glicina y lisina.

Una realización preferida de la presente invención proporciona un método como se ha descrito anteriormente, donde el primer resto en un polisacárido y el segundo resto en una proteína. Más preferiblemente, el polisacárido se selecciona entre un grupo compuesto por dextrano, polisacárico pneumocócico, polisacárido Haemophilus influenzae, polisacárico estreptocócico de Grupo A, polisacárico estreptocócico de Grupo B, y polisacárido de N. meningitidis.

También se prefiere un método como se ha descrito anteriormente, donde el primer resto en un polisacárido vírico o bacteriano soluble en agua. Otra realización preferida en un método como se ha descrito anteriormente, donde el segundo resto en una proteína soluble en agua.

Además, la presente invención proporciona un método como se ha descrito anteriormente, donde el segundo resto se selecciona entres un grupo compuesto por albúmina de suero bovino, toxina pertussis, toxina del tétanos, péptido derivado de la malaria, un anticuerpo, una toxina, y una lipoproteína.

Otra realización preferida de acuerdo con la presente invención es un método como se ha descrito anteriormente, donde la construcción inmunogénica es un conjugado seleccionado entre el grupo compuesto por Pt-Pn, PT-PRP,
lT- Pn, anticuerpo-dextrano, y péptido-TT-Pn.

Una realización preferida es también un método como se ha descrito anteriormente, donde dicho grupo nucleófilo es un grupo hidrazida.

Otra realización preferida es un método como se ha descrito anteriormente, donde dicho acoplamiento se realiza con un pH de menos de aproximadamente 8.

El método de la presente invención usa ventajosamente un reactivo cianilante orgánico, más preferiblemente tetrafluoroborato de 1-ciano-4-(dimetilamino)-piridinio (CDAP), para activar restos que contienen carbohidratos. Usando el método de la invención, se modifica un conjugado de un polisacárido, haciendo posible recuperar la proteína. Además, puede prepararse fácilmente un conjugado de restos solubles en agua y/o soluble en tensioactivo de acuerdo con la invención.

En una realización preferida, la invención comprende conjugar directamente en resto activado que contiene carbohidrato a un segundo resto, tal como una proteína soluble en agua. En otra realización preferida, el método de la invención comprende unir covalentemente un reactivo funcional (bifuncional o heterofuncional) al resto activado que contiene carbohidrato, y además reaccionar el reactivo funcional con el segundo resto, por ejemplo, un antígeno
T-dependiente, para formar una construcción inmunogénica conjugada, donde los restos que contienen carbohidratos y TD se unen con el espaciador o engarce formado por el reactivo funcional.

En otra realización preferida, la construcción inmunogénica es una construcción de soporte dual. Soportes primarios ejemplares para tales construcciones incluyen De pneumococo tipo 14 (Pn14) y polímeros de ADN.

En otra realización preferida, la invención comprende conjugar el resto activado que contiene carbohidrato a un segundo resto, tal como una proteína, que se ha derivatizado para formar un nucleófilo con un pKa bajo. Nucleófilos ejemplares para tale derivatización incluyen hidrazinas y tioles.

La invención se aplica ventajosamente a una amplia diversidad de restos solubles que contienen carbohidratos, que después de la activación con CDAP pueden estar conjugados directamente a proteínas o conjugados indirectamente a proteínas a través de un espaciador o un engarce. La invención permite a otros producir construcciones inmunogénicas más eficaces más eficazmente y de una forma menos cara que las construcciones inmunogénicas preparadas usando los métodos conocidos.

Además, debido a que CDAP y las condiciones de reacción son tan suaves, el riesgo de destrucción de la estructura de carbohidrato y, por tanto, destrucción de los epítopos de ocurrencia natural, disminuye en gran medida. Además, el método tiene las ventajas resumidas en la Tabla 1 a continuación en comparación con el método usado en la actualidad empleando bromuro de cianógeno.

TABLA 1 Comparación de activación de carbohidrato en la síntesis de conjugados

CNBr	CDAP
pH alto (10-12)	pH casi neutro o ligeramente básico (por
	ejemplo 7-9)
Destruye muchos epítopos	Pequeña o nula alteración de epítopos CHO
CHO
Alta toxicidad (se requiere	Baja toxicidad
campana de extracción)
Peligroso en grandes	Seguro en grandes cantidades
cantidades
Bajas producciones	Altas producciones
Múltiples reacciones	Reacciones secundarias mínimas o nulas.
secundarias
No permite fácilmente	Permite conjugación directa con proteína y
conjugación directa con	posibilita la recuperación de proteína no
proteína	conjugada
Variación de un lote a otro	Reproducible.

Más ventajas adicionales de usar CDAP son que puede preparase por adelantado y almacenarse en una solución durante varios meses, y que la concentración de agente activo puede determinarse fácilmente a partir absorbencia a 301 nm (Kohn et al., Anal. Biochem, 115:375 (1981). Esto hace posible estandarizar la concentración de reactivo y hace la derivatización del carbohidrato más reproducible, lo cual es importante para su uso en preparación de vacunas.

\newpage

Otras ventajas de la invención incluyen el acoplamiento selectivo o preferencial de carbohidratos y proteínas por control de pH. Como muchos de los grupos nucleófilos comunes que se encuentran en proteínas y péptidos tienen pKa relativamente altos, es posible conjugar selectivamente grupos con pKa'a bajos a pH bajo con carbohidratos activados en presencia de estos otros grupos.

El acoplamiento selectivo o preferencial a pH bajo tiene una diversidad de ventajas adicionales. Los carbohidratos activados pueden ser más estables a pH bajo, resultando en menos hidrólisis. Además, a pH bajo, los grupos hidroxilo carbohidrato son menos nucleófilos (reactivos), minimizando la formación de intermedios cíclicos e inter e intra reticulación en cadena con el éster cianato. Menos hidrólisis y menos reacciones secundarias incrementan la eficacia de la reacción de acoplamiento total, necesitando menos reactivo para la activación del carbohidrato y por lo tanto menos modificación, incrementando de esta forma la antigenicidad e inmunogenicidad.

Además, las proteínas pueden derivatizarse fácilmente con un número limitado de nucleófilos con pKa bajo y así mismamente modificados. Acoplar la proteína derivatizada a carbohidrato activado a pH bajo reduce el número de enlaces proteína-polisacárido debido al bajo número de grupos reactivos en la proteína derivatizada a pH bajo.

Además, la derivatización de la proteína con hidrazida tiene ventajas adicionales incluyendo la facilidad de caracterización del intermedio hidrazina (por ejemplo, TNBS, pruebas radioactivas, etc). Esto permite la fácil determinación del alcance de la derivatización antes del acoplamiento así como el alcance de la modificación de la antigenicidad e inmunogenicidad, proporcionando mejor control de calidad y oportunidades para optimizar la derivatización. Además, midiendo el número de hidrazidas libres antes y después del acoplamiento, puede determinarse el número de enlaces proteína-polisacárido. Adicionalmente, puede mejorarse el control de calidad porque pueden controlarse los aumentos en el número de hidrazidas libres, indicando que los enlaces en el conjugado se están hidrolizando.

Más ventajas incluyen el gran número de métodos conocidos para introducir hidrazinas en proteínas, incluyendo modificación selectiva de grupos carboxilo o grupos amino. De esta forma, este método puede ser particularmente ventajoso para el acoplamiento de toxinas que tienen relativamente pocas aminas y generalmente se acoplan de forma pobre. Además, el producto de reacción de las hidrazidas y ésteres de cianato está descargado a pH fisiológico, mientras que el producto de reacción de aminas y ésteres de cianato está cargado.

Las ventajas mencionadas anteriormente se aplican a la conjugación directa de proteínas a carbohidratos y a la conjugación indirecta mediante un espaciador. Objetos adicionales y ventajas de la invención se harán aparentes a partir de la descripción detallada y las figuras.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un ejemplo de un esquema generalizado para la activación del carbohidrato usando reactivos cianilados orgánicos.

La Figura 2 muestra un esquema ejemplar para la conjugación de un carbohidrato activado a una proteína, mostrando la conjugación directa en la esquina inferior izquierda y la conjugación indirecta usando un reactivo bifuncional en la esquina inferior derecha.

La Figura 3 muestra un modelo de una construcción inmunogénica.

La Figura 4 ilustra la incorporación de grupos NH_{2} en dextrano por moles de CDAP añadidos por mol de dextrano a 10 mg/ml de dextrano.

La Figura 5 ilustra el perfil de elución de un conjugado ^{3}H-BSA- dextrano a partir de una columna de filtración de gel S400SF.

La Figura 6 ilustra la absorbencia OD280 de construcciones inmunogénicas preparadas de acuerdo con el método de la invención, eluidas en una columna de filtración de gel S400SF.

La Figura 7 ilustra el perfil de elución de H\delta^{a}/1-(CDAP)- dextrano en una columna de filtración de gel S400SF.

La Figura 8 ilustra los valores OD280 y OD340 de muestras en columna eluidas en una columna de filtración de gel S400SF cargada con H\delta^{a}/NH_{2}-(CDAP)-dextrano.

La Figura 9 ilustra la inmunorreactividad de construcciones inmunogénicas preparadas usando los métodos de la invención.

La Figura 10 muestra los resultados de la derivatización de dextrano (dex) con hexanodiamina con CDAP (NH_{2}/100 kDa dex frente a mg CDAP/mg dex) a 1,6 mg/ml dextrano.

La Figura 11 es un gráfico de la eficacia de activación CDAP frente a la concentración de polisacárido.

\newpage

La Figura 12 muestra la conjugación directa de BSA a dextrano para varias relaciones CDAP:polisacárido para la activación CDAP.

La Figura 13 en un dibujo de la relación BSA/dextrano frente al tiempo de adición de proteína a dextrano activado con CDAP.

La Figura 14 muestra la estabilidad de CDAP en agua.

La Figura 15 ilustra la cinética del acoplamiento de proteína a polisacárido activado con CDAP.

La Figura 16 muestra el efecto del pH en la activación CDAP.

La Figura 17 en un gráfico de barras que muestra el efecto del pH y varias soluciones tampón en el acoplamiento de BSA a dextrano activado con CDAP.

Descripción detallada y realizaciones preferidas

En la Figura 1 se muestra un esquema generalizado para la activación de carbohidratos usando reactivos cianilados orgánicos (que pueden representarse generalmente por la fórmula R-CN o {R^{+}-CN}X^{-}, donde R es un resto orgánicos y X es un contraión). La Figura 2 ilustra la conjugación de un carbohidrato activado a una proteína.

"construcción inmunogénica", como se utiliza en este documento, se refiere a una entidad que puede estimular la respuesta inmune. La construcción inmunogénica comprende al menos un primer resto conjugado con al menos un segundo resto. Un "resto", como se utiliza en este documento, es cualquier sustancia que puede usarse para estimular el sistema inmune por sí misma o por acoplamiento, y que se selecciona entre restos que incluyen carbohidratos, proteínas y glicoproteínas, péptidos, otros antígenos, haptenos, y combinaciones y derivados de los mismos. Haptenos se refiere a moléculas pequeñas, tales como productos químicos, polvo, y alergenos, que por sí solos no son capaces de provocar una respuesta de anticuerpos, pero si pueden una vez que se han acoplado a un soporte, por ejemplo TNP. Un antígeno es cualquier molécula que, bajo las condiciones adecuadas, puede inducir la formación de anticuerpos. Estos haptenos y antígenos pueden derivar (sin estar limitados) de rickettsiae, hongos, virus, parásitos, medicamentos o productos químicos. Estos pueden incluir, por ejemplo, moléculas pequeñas tales como péptidos, oligosacáridos (por ejemplo, los oligómeros polirribosil-ribitol-fosfato de H. influenzae), oligómeros de ADN, lípidos, toxinas, endotoxinas, etc. Los restos preferidos son solubles en agua o solubilizados en tensioactivo.

En una realización preferida, el primer resto es un resto que contiene carbohidrato. Como se usa en este documento, "carbohidrato" significa cualquier monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacárido soluble. Preferiblemente, el primer resto en un polisacárido, más preferiblemente un polisacárido soluble en agua. Polisacáridos preferidos incluyen los listados en la tabla a continuación de vacunas ejemplares.

El resto que contiene carbohidrato es preferiblemente una molécula de gran peso molecular de ocurrencia natural, semisintética, o totalmente sintética. En una realización preferida, al menos un resto que contiene carbohidrato se selecciona entre polisacáridos de E. coli, polisacáridos de S. aureus, dextrano, celulosa de carboximetilo, agarosa, polisacáridos de pneumococo (Pn), Ficoll, Cryptococcus neoformans, Haemophilus influenzae PRP, P. aeroginosa, S. pneumoniae, lipopolisacáridos, estreptococcus de Grupo A y B, N. meningitidis, y combinaciones de las mismas.

En una realización preferida especialmente, el resto que contiene carbohidrato es dextrano. Como se utiliza en este documento, "dextrano" (dex) se refiere a un polisacárido compuesto de un único azúcar, que puede obtenerse de cualquier número de fuentes (por ejemplo, Pharmacia). Otro resto que contiene carbohidrato preferido es Ficoll, que es un polímero inerte, semisintético, no ionizado de alto peso molecular.

El resto que contiene carbohidrato se activa usando un reactivo cianilado orgánico. Reactivos cianilados orgánicos preferidos con tetrafluoroborato de 1- ciano-4-(dimetilamino)-piridinio (CDAP), tetrafluoroborato de N- cianotrietilamonio (CTEA), y p-nitrofenilcianato (pNPC). De estos reactivos, CDAP es el más preferido. Pueden usarse otros complejos orgánicos con el grupo cianato, opcionalmente con una diversidad de contraiones. Son reactivos cianilados orgánicos preferidos particularmente aquellos con contraiones no nucleófilos tales como tetrafluoroborato.

Después de la activación mediante el reactivo cianilado orgánico, el primer resto se conjuga con el segundo resto. Preferiblemente, el segundo resto es una proteína, que puede seleccionarse entre proteínas víricas, bacterianas, de parásitos, animal y de hongos. Los segundos restos especialmente preferidos incluyen lipoproteínas, albúmina de suero bovino (BSA), toxina del tétanos (TT), toxina pertussis (PT), toxina de la difteria (DT), proteína de choque cardiaco, superantígenos de células T, y proteínas bacterianas de la membrana exterior, todas las cuales pueden obtenerse de compañías de suministros farmacéuticos o bioquímicos o prepararse mediante métodos estándar (véase, por ejemplo, J.M. Cruse & R.R. Lewis, (eds), Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Inmunology, vol. 10 (1989). Pueden seleccionarse otras proteínas adecuadas por los expertos en la técnica.

Otras realizaciones preferidas del segundo resto son albúmina, una toxina, un péptido, un adyuvante de células T o células B, o cualquier otro compuesto capaz de activar y reclutar ayuda de las células T. El segundo resto puede ser un antígeno T-dependiente como se representa en la Figura 3.

Los segundos restos de la invención son capaces de conjugarse con al menos un resto que contiene carbohidrato. Los segundos restos puede contener grupos funcionales que pueden reaccionar con el resto que contiene carbohidrato o pueden ser manipulados químicamente para ser capaces de reaccionar con el resto que contiene carbohidrato.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, el segundo resto se derivatiza para formar un nucleófilo que tiene un pKa suficientemente bajo para el acoplamiento selectivo. Como se usa en este documento, el término "pKa suficientemente bajo" quiere decir que el pKa del nucleófilo es más bajo que los pKa de otros grupos reactivos (por ejemplo, aminas alfa y épsilon) en la proteína o péptido con un alcance tal, que cuando reacciona al pH seleccionado para el acoplamiento, el nucleófilo no tiene protones pero los otros grupos reactivos sí. En otras palabras, el nucleófilo se selecciona de tal forma que haga reacción (es decir, no protonado) a un pH particular al cual otros grupos en la proteína o péptidos es menos probable que reaccionen (es decir, sustancialmente protonados). De esta forma, el pH apropiado para el acoplamiento basándose en, entre otros factores, el nucleófilo particular empleado. Preferiblemente, el pH seleccionado es menor de aproximadamente 8. Ejemplos ilustrativos de nucleófilos adecuados incluyen hidrazidas y tioles.

En una realización preferida especialmente, un grupo funcional de un proteína o un péptido se derivatiza para formar una hidrazida. Pueden añadirse hidrazidas a proteínas o péptidos de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, pueden activarse uno o más grupos carboxilos en un polipéptido con una carbodiimida tal como EDAC en presencia de una alta concentración de una bis hidrazida tal como hidrazida adípica. Las reacciones secundarias pueden suprimirse con la adición de metilimidazol y/o NHS. El grado de derivatización puede controlarse por la relación molar de carbodiimida con polipéptido.

De forma similar, las aminas en una proteína pueden tiolarse usando un reactivo de Traut, SPDP o SATA (seguido de desprotección) y después reaccionando con un reactivo heterobifuncional tal como EMCH ( un bifuncional que contiene una maleimida de reactivo de tiol y una hidrazida). El grado de derivatización se control con la tiolación inicial. Alternativamente, la proteína puede derivatizarse con un grupo reactivo tiol (un reactivo electrófilo tal como maleimida o yodoacetilo) usando técnicas estándar de heterounión y después reaccionando una hidrazida de tiol. Las aminas también pueden hacerse reaccionar con una diversidad de reactivos que contienen grupos hidroxi vecinos. El producto resultante puede escindirse con peryodato sódico y hacerse reaccionar con una bis hidrazida.

Las proteínas glicosiladas, tales como anticuerpos, pueden oxidarse usando un reactivo adecuado tal como peryodato sódico a pH 5. El producto oxidado puede reaccionarse con una bis hidrazida para formar el derivado deseado para su uso en la presente invención.

Los nucleófilos tales como hidrazidas y tioles pueden incorporarse en proteínas, péptidos, oligonucleótidos y muchos medicamentos durante su síntesis. Las hidrazinas también pueden añadirse colocando un residuo de cisteína en la posición deseada y reaccionando posteriormente con EMCH. De forma similar, pueden añadirse hidrazidas sintetizando primero un péptido que contiene un grupo cetona \alpha-halo en la posición deseada. Después, este grupo puede convertirse en una hidrazida reaccionando con una hidrazida de tiol. Véase B. Ivanov et al., Bioconjugate Chemistry, 6, 269 (1995).

Después de la activación, el primer resto se conjuga con el segundo resto. Pueden conjugarse numerosas copias de segundos restos específicos así como una diversidad de segundos restos con el resto que contiene carbohidrato. El acoplamiento de múltiples copias del segundo resto con el primer resto aumenta significativamente la producción de anticuerpos al segundo resto.

El proceso de la invención permite controlar ventajosamente las propiedades físicas y químicas de la construcción inmunogénica. De acuerdo con la invención, el experto puede de una forma ventajosa: modificar la carga en el primer y segundo resto (una venta con la evidencia de que las proteínas cationizadas pueden ser más inmunogénicas); controlar el tamaño de la construcción variando el tamaño del resto que contiene carbohidrato; seleccionar el grado de reticulación de la construcción inter- e intra- cadena (para obtener variaciones de tamaño y de la matriz tridimensional); controlar el número de copias del segundo resto conjugadas con restos que contienen carbohidratos; y dirigirse a poblaciones de células seleccionadas (tales como macrófagos para mejorar la presentación de antígenos). Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.) vol. 10, 48-114 (1989).

La respuesta inmune a la construcción de la invención puede ser mejorada adicionalmente por adición de inmunomoduladores y/o restos seleccionadores de células. Estas entidades incluyen, por ejemplo, (1) lipopolisacáridos destoxificados o derivados, (2) dipéptidos de muramilo, (3) carbohidratos, lípidos, y péptidos que pueden interaccionar con determinantes de superficie celular para dirigir la construcción a células inmunológicamente relevantes, (4) interleuquinas, (5) anticuerpos, y (6) oligómeros de ADN.

De esta forma, en realizaciones alternativas, pueden conjugarse restos terceros con uno o más de los restos primero y/o segundo usando métodos tales como activación por CDAP como se ha descrito en este documento o otras técnicas conocidas. Los expertos en la técnica conocen ciertas técnicas para conjugar varios restos con el primer o el segundo resto, por ejemplo las que implican acoplar a través de grupos funcionales disponibles (tales como grupos amino, carboxilo, tio, y aldehído). Véase S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991), and Brenkeley et al., "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens, and Cross- Linking agents," Bioconjugate Chemistry, 3:1 (Ene. 1992). De esta forma, pueden usarse reactivos monofuncionales como restos terceros, por ejemplo, para modificar la carga, cambiar la hidrofobia, marcar la construcción, etc.

En el método de la invención, el resto que contiene carbohidrato se activa usando un reactivo cianilado orgánico. El reactivo cianilado orgánico es preferiblemente CDAP, lo que incrementa la electrofilia del cianato y, cuando reacciona con restos que contienen carbohidratos, transfiere un grupo ciano a los grupos hidroxilo del carbohidrato, preparándolo de esta manera para una reacción posterior, es decir, conjugación directa o indirecta con la proteína. La reacción de activación puede realizarse a un pH neutro o bajo condiciones ligeramente básicas (por ejemplo, un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10), lo que mejora la estabilidad e integridad del polisacárido y el intermedio activo.

El uso de CDAP es ventajoso por que es altamente estable y relativamente seguro. CDAP es un reactivo cianilado orgánico soluble en agua en el que se incrementa la electrofilia del grupo ciano, permitiendo realizar ventajosamente la reacción de cianilación bajo condiciones suaves. Además, CDAP puede usarse para activar una amplia diversidad de polisacáridos, que pueden funcionalizarse con diaminas o dihidrazidas. Los altos niveles de activación y las suaves condiciones de la reacción de cianilación con CDAP permite a las proteínas conjugarse directamente con polisacáridos en una reacción de una etapa, simplificando por lo tanto la preparación de vacunas conjugadas que inducen respuestas de anticuerpos en los componentes de polisacárido y proteína, incluso en ausencia de una molécula espaciadora. La facilidad de uso de CDAP facilita la preparación de vacunas conjugadas proteína-polisacárido en una diversidad de condiciones, haciendo posible de esta forma el estudio de parámetros importantes de la inmunogenicidad de las vacunas conjugadas. Además, los polisacáridos activados con CDAP pueden usarse para preparar una diversidad de otros reactivos inmunológicos útiles, por ejemplo, polisacáridos biotinilados y dextranos unidos con anticuerpos, tales como H\delta^{1}/1.

La activación se realiza preferiblemente a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, más preferiblemente de aproximadamente 9 a aproximadamente 10. El pH puede ajustarse mediante varias técnicas (por ejemplo, usando un tampón, añadiendo NaOH, etc), para ajustarse a la construcción particular que se está preparando. Por ejemplo, la activación puede realizarse en una diversidad de disolventes usando uno o más de una diversidad de tampones no nucleófilos adecuados conocidos en la técnica. Disolventes adecuados incluyen solución salina, agua, y algunos disolventes orgánicos. Ejemplo de soluciones tampón no nucleófilas adecuadas incluyen trietil amina (TEA), ácido sulfónico 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etano (HEPES), fosfato, carbonato, y borato. Preferiblemente, se usa trietilamina (TEA) como tampón.

En una realización preferida de la invención, se disuelve CDAP en una solución madre a una concentración de 100 mg/ml en acetonitrilo seco o hasta 75 mg/ml en agua. Dependiendo de la naturaleza del resto que contiene carbohidrato y del grado de activación deseado, varias cantidades de CDAP pueden ser óptimas.

En una realización preferida, la concentración del resto que contiene carbohidrato es de 1 a 20 mg/ml, más preferiblemente de 1 a 15 mg/ml. La reacción de activación puede realizarse satisfactoriamente con concentraciones de resto que contiene carbohidrato de hasta aproximadamente 100 mg/ml.

Preferiblemente, la relación de CDAP con resto que contiene carbohidrato para la conjugación directa de la proteína es de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 500:1 moles de CDAP por 100 kDa de resto que contiene carbohidrato. En otra realización preferida, la relación de CDAP con resto que contiene carbohidrato para la conjugación indirecta de la proteína usando un espaciador es de 10:1 a 500:1 moles de CDAP por 100 kDa de resto que contiene carbohidrato. Dependiendo de la naturaleza de los restos y las condiciones utilizadas, pueden ser óptimas diferentes relaciones entres los restos.

El CDAP sin reaccionar y los subproductos de la reacción pueden retirarse antes de la derivatización o del acoplamiento con la proteína usando una técnica de purificación adecuada, preferiblemente en condiciones ácidas, tales como diálisis, ultrafiltración, o absorción a perlas apropiadas de bioprocesamiento tales como perlas SM4 (BioRad). También pueden prepararse polisacáridos purificados activados por precipitación, por ejemplo, con etanol frío.

En una realización preferida, un resto que contiene carbohidrato que se ha activado usando CDAP se conjuga directamente con el segundo resto para producir una construcción inmunogénica. En otra realización preferida de la invención, el resto que contiene carbohidrato que se ha activado se une covalentemente a un reactivo bifuncional o heterofuncional adecuado. Ejemplos de tales reactivos funcionales incluyen etilendiamina, 1,6-hexano diamina, dihidrazida adípica, cistamina, lisina, ácido glutámico, hidrazidas de tiol, y aminas de tiol, protegidas adecuadamente si es necesario. Véase Wong et al., "Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking," CRC Press (1991). Después, el segundo resto se une covalentemente al reactivo funcional, que ya se ha unido covalentemente en su otro extremo al resto que contiene carbohidrato.

Un intervalo preferido de pH para la reacción de acoplamiento es de aproximadamente 7 a aproximadamente 9, más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5. Para conjugar un polisacárido tal como dextrano, el pH es preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 8. Cuando el segundo resto se derivatiza para formar un nucleófilo tal como una hidrazida, el pH para la reacción de acoplamiento es preferiblemente menor de aproximadamente 8, más preferiblemente menor de aproximadamente 7.

Un polisacárido se conjuga con una proteína en una relación en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1, por ejemplo 1:1, usando CDAP en una realización preferida. Para resultados óptimos, se evitan concentraciones de polisacárido altas. Las construcciones preferidas incluyen tétanos conjugada con un polisacárido de pneumococo y tétanos conjugada con Haemophilus influenzae PRP. Otros conjugados preferidos preparados de acuerdo con la invención incluyen TT-PRP, Pn14-TT, Pn23-TT, péptido-Pn14 derivado de la malaria, DT-Pn14, Pn6-TT, Pn19-TT, y péptido TT-Pn.

En una realización preferida, se usa trietilamina (TEA) para facilitar la reacción de cianilación, que progresa mediante la formación de un complejo de Von Braun intermedio. La TEA puede reemplazarse por otras aminas terciarias capaces de formar un complejo de Von Braun. J. Von Braun, Chem. Ber., 33:1439 (1900).

Para ciertas reacciones de conjugación, pueden usarse glicina, etanol de amina, u otros reactivos que contienen amino para desactivar la reacción. Tales reactivos de desactivación pueden usarse también como una forma de modificar la carga neta del conjugado.

En otra realización, la invención se refiere a un método para preparar vacunas que están compuestas por una construcción inmunogénica junto con un medio farmacéuticamente aceptable o un vehículo de entrega. Tales vacunas contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción inmunogénica junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para una administración apropiada al paciente. Estas vacunas pueden comprender alumbre u otros adyuvantes.

Son medios o vehículos ejemplares farmacéuticamente aceptables líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, los de origen sintético animal o vegetal, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Un vehículo preferido es una solución salina cuando la composición farmacéutica se administra de forma intravenosa. También pueden emplearse soluciones de dextrosa acuosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, incorporado en este documento específicamente como referencia.

Las vacunas que pueden prepararse de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación, las presentadas en la tabla a continuación:

TABLA

Vacuna de la difteria

Vacuna de Pertussis (subunidad)

Vacuna del tétanos

H. influenzae tupo b (fosfato de polirribosa)

S. pneumoniae, todos los serotipos

E. coli, endotoxina o antígeno J5 (LPS, Lípido A y Gentabiosa)

E. coli, polisacáridos O (específico del serotipo)

Klebsiella, polisacáridos (específico del serotipo)

S. aureus, tipos 5 y 8 (específicos del serotipo y antígenos protectores comunes)

S. epidermis, polisacárido de serotipo I, II, y III (y antígenos protectores comunes)

N. meningitidis, específico del serotipo o antígenos de la proteína

Vacuna de la polio

Vacunas de paperas, sarampión y rubeola

virus sincitial respiratorio

Rabia

Hepatitis A, B, C y otras

Virus de la Inmunodeficiencia humana I y II (GP120, GP41, GP160, p24, otros)

Herpes simplex tipos 1 y 2

CMV (citomegalovirus)

EBV (virus de Epstein-Barr)

Varicela / Zoster

Malaria

Tuberculosis

Candida albicans, otras candida

Pneumocystis carinii

Mycoplasma

Streptococcus Grupo A

Streptococcus Grupo B, serotipos, Ia, Ib, II, y III

Pseudomonas aeroginosa (específicos del serotipo)

Rhinovirus

Parainfluenzae, tipos 1, 2, y 3

Coronavirus

Salmonella

Shigella

Rotavirus

Enterovirus

Chlamydia trachomatis y pneumoniae (TWAR)

Cryptococcus neoformans

El término "paciente" se refiere a cualquier sujeto para el cual el tratamiento puede ser beneficioso, e incluye mamíferos, especialmente humanos, caballos, vacas, perros, y gatos, así como otros animales, tales como gallinas. Una "cantidad inmunoestimuladora" se refiere a la cantidad de vacuna que es capaz de estimular la respuesta inmune del paciente para la prevención, mejora, o tratamiento de enfermedades. La vacuna de la invención puede administrarse por cualquier vía adecuada, pero se administra preferiblemente mediante inyección intravenosa, intramuscular, intranasal, o subcutánea.

La invención también se refiere a un método para preparar un agente inmunoterapéutico contra infecciones causadas por bacterias, virus, parásitos, hongos o productos químicos mediante la inmunización del paciente con la vacuna descrita anteriormente de tal manera que el paciente produce anticuerpos dirigidos contra la vacuna. Los anticuerpos puede aislarse o pueden obtenerse células B para fusionarse posteriormente con células de mieloma para hacer anticuerpos monoclonales. La fabricación de anticuerpos monoclonales se conoce normalmente en la técnica (véase Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), incorporado específicamente en este documento por referencia). Como se utiliza en este documento, "agente inmunoterapéutico" se refiere a una composición de anticuerpos que se dirigen contra inmunógenos específicos para su uso en el tratamiento pasivo de pacientes. Un donante de plasma es cualquier sujeto al que se le inyecta una vacuna para la producción de anticuerpos contra los inmunógenos contenidos en la vacuna.

\newpage

Ejemplo 1 Derivatización de un resto que contiene carbohidrato con un espaciador Materiales

Se compraron CDAP, piridina, hexanodiamina, borato sódico, HEPES, y trietilamina (TEA) de Aldrich (Milwaukee, Wisconsin). El resto que contiene carbohidrato, T2000 dextrano con un peso molecular medio de 2000 kDa, se obtuvo en Pharmacia (Piscataway, New Jersey).

Se almacenó una solución madre de CDAP en acetonitrilo seco a 100 mg/ml a –20ºC y se mantuvo en hielo durante su uso. Se preparó T2000 dextrano a 10,5 mg/ml en solución salina más 0,02% azida. Se preparó una solución madre de trietilamina acuosa a 0,2 M y se mantuvo en hielo durante su uso.

Se preparó hexanodiamina a 0,5 M en borato sódico 0,1 M.

Se realizó la determinación del grupo amino usando sulfonato de trinitrobeceno (TNBS) y un coeficiente de extinción de 11.000 m^{-1} a 366 nm. Franci et al., J. Imm. Methods., 86:155 (1986).

Se ensayó el carbohidrato por el método de M. Monsigny et al., Anal. Chem., 175:525 (1988), usando T2000 dextrano como patrón.

Reacciones de control

Los siguientes experimentos demuestran la importancia de los componentes usados en la reacción de derivatización de la invención. Los resultados muestran que los grupos amino en el conjugado final están unidos covalentemente al carbohidrato y su presencia no se debe al artefacto o al "desplazamiento" de reactivo en el producto final. Las reacciones se realizaron en hielo. Para las pruebas realizadas, la omisión o sustitución de reactivos fue como se indica en la Tabla 2.

En el método que usa todos los reactivos (línea 1 de la Tabla 2), se añadió CDAP a una solución agitada vorticialmente de 300 \mul de dextrano (3,1 mg) y se devolvió al cubo de hielo. Treinta segundos después, se añadió la TEA a la solución agitada vorticialmente. Dos minutos después de añadir la CDAP, se añadieron 200 \mul de la diamina y se mantuvo la solución en hielo durante otra hora. Las muestras se dializaron durante una noche, se filtraron con un filtro Millex GV, y se desalificaron adicionalmente en una columna P6DG 1 x 15 cm (BioRad).

Como se muestra en la Tabla 2 a continuación, los grupos amino se incorporaron óptimamente en el dextrano en presencia de dextrano, CDAP, TEA, y hexanodiamina. Los datos en la Tabla 2 demuestran además que los grupos amino detectados no se deben al desplazamiento del reactivos sin conjugar en los productos finales. Aunque estos resultados muestran que no es necesaria la TEA para la derivatización, muestran menos derivatización cuando no hay TEA presente (probablemente debido al bajo pH, como se explica más tarde).

No.	Solución	Dextrano	CDAP 100	TEA 0,2	Hexanodiamina	Borato	NH_{2} /
	salina		mg/ml	M	0,5 M	0,1 M	Dextrano
1	0	300 \mul	15 \mul		300 \mul	0	64
2	300 \mul	0	15 \mul		300 \mul	0	0
3	0	300 \mul	15 \mul		300 \mul	--	0
4	0	300 \mul	0		300 \mul	--	2,1
5	0	300 \mul	15 \mul		0	300 \mul	0
6	300 \mul	0	0		0	0	0
* Moles de NH_{2} por 100 kDa de dextrano

Derivatización de T2000 dextrano con hexano 1,5-diamina

Este experimento demuestra que CDAP puede usarse para derivatizar carbohidratos para introducir grupos amino en relaciones altas y bajas. Se usó Dextran T2000 como carbohidrato modelo. Dextrano es un polímero compuesto por monómeros de glucosa.

La primera etapa en la preparación de muchas vacunas conjugadas es la adición de un espaciador (Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48 - 114 (1989)). Esta serie de experimentos, resumidos en la Tabla 3, enfatiza la facilidad con la que se añade un espaciador a polisacáridos.

\newpage

No.	Dextran	CDAP	TEA	Diamina	10^{-3} mol	NH_{2}/ *	%	%
	(\mul)	(\mul)	(\mul)	(\mul)	CDAP/	Dextran	Eficacia	Derivat.
					mol		NH_{2} /	***
					Dextran		CDAP)
							**
1	600	5	5	600	0,68	17	50,0	3,1
2	600	10	10	600	1,36	33	48,5	5,9
3	600	15	15	600	2,03	25	24,8	4,6
4	300	15	15	200	4,06	30	16,7	6,1
5	300	30	30	200	8,12	48	11,8	8,2
6	300	60	60	200	16,24	84	4,2	6,2
7	300	120	120	200	32,48	112	6,8	20,4
8	300	15	15	200	4,06	38	18,7	6,9 ****
9	300	30	30	200	8,12	62	15,3	11,3****
10	300	60	60	200	16,2	35	4,3	6,4 ****
11	600	15	15	600	2,03	19	18,8	3,5
*Moles de NH_{2} por 100 kDa de dextrano
**Para calcular este valor, se dividieron los valores de NH_{2}/Dextrano por los
valores de mol de CDAP/mol de dextrano y se multiplicó por 100%.
***Porcentaje de unidades de glucosa del dextrano unidas a un grupo NH_{2}.
****Experimento realizado a temperatura ambiente.

El experimento se realizó a dos temperaturas. En las tiradas resumidas en las líneas 1-7 y 11 de la Tabla 3, todos los reactivos estaban refrigerados en hielo, y en las tiradas resumidas en las líneas 8-10, los reactivos estaban a temperatura ambiente. Los métodos y los reactivos se usaron como se ha descrito anteriormente para el experimento resumido en la Tabla 2, y las cantidades de reactivo añadidas fueron las indicadas en la Tabla 3. En el ensayo representado por la línea 11, se añadió diamina en HEPES 0,15 M. La reacción fue ligeramente menos eficiente a pH más bajo. En otra realización, se preparó la hexanodiamina en borato 0,1 M, pH 9.

La eficacia se define como el número de moles de grupos espaciadores incorporados por mol de CDAP usado, expresado como porcentaje. La última columna (% derivatizado) es el porcentaje de las unidades monoméricas de glucosa del dextrano que se han modificado con un espaciador.

Los resultados se ilustran adicionalmente en la Figura 4, que muestra el número total de grupos amino (por ejemplo, el reactivo espaciador añadido) incorporados contra los moles de CDAP añadidos por mol de unidad de dextrano. Cuando estos datos se convierten en incorporación de NH_{2} frente a moles de CDAP/mol de dextrano, es evidente que una relación CDAP:glucosa menor de uno es suficiente para niveles altos de incorporación de NH_{2}. De esta forma, es necesaria una modificación mínima de polisacárido de dextrano para una alta incorporación de grupos NH_{2}.

Además, como se hidroliza una cantidad indeterminada de éster cianato activo sin añadir espaciador, la relación CDAP/glucosa es una sobrestimación del grado de modificación del polímero. De esta forma, el grado real de modificación es menor que la relación CDAP/glucosa calculada.

El grado de incorporación de grupos espaciadores a la dosis de reactivo más baja probada (línea 1), 3,1% es comparable a la usada para la síntesis de vacunas conjugadas (Chu et al., Inf & Imm., 40:245 (1983); Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10., pp. 48-114 (1989).

La tabla y la figura demuestran la alta eficacia de la reacción CDAP para añadir reactivos espaciadores. Optimizaciones adicionales de las condiciones de reacción pueden incrementar la eficacia. También se ilustra el muy alto nivel de incorporación de grupos espaciadores en el polisacárido que es posible usando CDAP. Cuando se añade la mayor cantidad de CDAP (línea 7), aproximadamente 1 de 5 unidades de glucosa se modificaron (20%) con un espaciador. No es posible obtener este grado de incorporación de espaciador con bromuro de cianógeno (Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25:1855 (1971)).

Durante las reacciones, no hubo precipitación evidente del polisacárido de dextrano. En contraste, la agregación y la precipitación del polisacárido pueden ser un problema con el método del bromuro de cianógeno (Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25:1855 (1971)).

Estas reacciones se realizaron en volúmenes pequeños (<1 ml), permitiendo de esta forma realizar muchos experimentos de prueba. Esto es importante cuando se optimiza un método sin desperdiciar valiosos carbohidratos y proteínas. De esta manera, a partir de los pequeños volúmenes de reactivos ejemplificados asó como la demás información contenida en este documento, el experto puede poner en práctica fácilmente la invención usando mayores cantidades si se desea en cualquier escala para uso comercial. Por otro lado, en difícil trabajar convenientemente con cantidades muy pequeñas de bromuro de cianógeno debido a su pobre solubilidad en agua, potencia incierta y toxicidad.

Además, comparando las líneas 8-10 de la Tabla 3 con las líneas 1-7 y 11, parece que el nivel de incorporación de grupos amino en dextrano fue aproximadamente igual cuando la reacción de acoplamiento se realizó a 0ºC y a temperatura ambiente.

Demostración de la Eficacia de la Reacción de Conjugación Usando CDAP y Verificación de la Conjugación Usando Proteína Radiomarcadas:

Como la reacción de conjugación usando CDAP causaba alguna absorbencia a 280 nm, -la longitud de onda usada normalmente para estimar las concentraciones de proteínas-, la proteína radiomarcada se conjugó directamente con dextrano. Esto permitió la determinación independiente de la concentración de proteína a partir de su actividad específica. Se determinaron las producciones y recuperaciones de proteína.

Se radiomarcó BSA ligeramente con N-hidroxisuccinimida (^{3}H-2,3)- propionato (Amersham), esencialmente como se describe en Brunswick et al., Journal of Immunol., 140:3364 (1988). La BSA radiomarcada se dializó exhaustivamente en PBS + 0,02% azida y se sometió a cromatografía de filtración de gel en una columna S100HR (Pharmacia) para retirar los agregados y se concentró por ultrafiltración usando un filtro YM = (Amicon). La concentración de BSA fue 21 mg/ml, determinado a partir de su coeficiente de extinción a 280 nm (44.000 M^{-1}). La actividad específica de la solución madre, determinada mediante recuento por centelleo líquido, fue 5,48 x 10^{12} cpm/mol.

Otros reactivos fueron los siguientes: Se disolvió dextrano T2000 (aproximadamente 2000 kDa) (Pharmacia) a 10,5 mg/ml en agua. Se preparó CDAP a 100 mg/ml en acetonitrilo seco, se preparó trietanolamina (TEA) a 0,2 M en agua. Se preparó glicina (pH 5,0) a 1 M en agua.

Protocolo: los reactivos se mantuvieron en hielo y todas las reacciones se realizaron en hielo. La mezcla de reacción se agitó vorticialmente durante cada adición. Se añadieron 25 \mul de CDAP a 0,5 ml de dextrano (5,25 mg) y se 30 segundos después se añadieron 25 \mul de TEA. Después de un total de 2,5 minutos, se añadieron 5,25 mg de BSA radioactiva. Treinta minutos después, la reacción se inactivó por la adición de 100 \mul de solución de glicina y se dejó durante una noche a 4ºC. Después, se filtró una fracción de 0,6 ml usando una membrana Spin-X (COSTAR). Una comparación de las fracciones radioactivas antes y después de la filtración demostró que esencialmente el 100% de la radioactividad se recuperó en el filtrado. Se aplicaron 500 \mul del filtrado a una columna de filtración de gel S400SF 1 x 57 cm (Pharmacia) que se equilibró con solución salina más 0,02 % azida a 2 ml/min. Se recogieron y se analizaron fracciones de 0,89 ml. Las concentraciones de dextrano se determinaron por el método de Monsigny et al. usando absorbencia a 480 nm. Se determinó la radioactividad de una fracción de 50 \mul cogida de cada tubo mediante recuento por centelleo líquido, y se calculó la concentración ^{3}H-BSA usando su actividad específica. La posición de la BSA sin conjugar en la columna de elución se determinó en una ejecución independiente de la columna.

Como se muestra en la figura 5, una gran parte de la BSA, representado por el cpm, está en una forma de alto peso molecular que corre en la misma posición que el dextrano, representado por OD480. Hay un pequeño pico residual de BSA que representa proteína sin conjugar. La Tabla 4 contiene los datos de la purificación.

TABLA 4

Total de proteína recuperada	: 3,0 mg
Proteína aplicada a la columna	: 2,9 mg
Recuperación	: 103 %
Proteína en forma MW alta: (tubos 15-23)	: > 2,0 mg (68%)
Relación de BSA a DEXTRAN para	: 26
dextrano 2000 kDa

La columna no separaba claramente el conjugado de dextrano-BSA de la proteína sin conjugar. Esto no es normal ya que los polímeros de alto peso molecular normalmente causan la aparición de colas en columnas de filtración de gel. Además, como el dextrano T2000 no estaba fraccionado, contenía un espectro de tamaños. Para estimar la cantidad de BSA sin conjugar en la región donde se solapan BSA libres y unidas, se asumió una relación constante de BSA unida a dextrano. La BSA conjugada total, calculada multiplicando la relación BSA:dextrano por la cantidad molar total de dextrano, se determino como 2,55 mg. Esto indica que el 87% de la proteína se convirtió en la forma conjugada.

TABLA 5

Mol CDAP / mol glucosa	mol TEA CDAP / mol	BSA /dextrano	% BSA conjugada
0,39	1:2	26	87
0,39	2:1	10	34
0,16	1:2	9	28
0,16	5:1	1	3

Los resultados de este experimento BSA-dextrano se resumen en la Tabla 5 (línea 1) junto con otras tres pruebas usando diferentes cantidades de CDAP y TEA (líneas 2-4). La cantidad de TEA y la cantidad de CDAP ayudan a conseguir relaciones altas de proteína a polisacáridos mediante conjugación directa. Las cantidades óptimas de reactivo pueden determinarse fácilmente ya que el método permite experimentar convenientemente con cantidades pequeñas.

Debe enfatizarse que la reacción de conjugación directa no modifica la proteína no conjugada, al contrario que los métodos de acoplamiento por heterounión o carbodiimida, ni tampoco utiliza condiciones duras. De esta manera, se podría recuperar la proteína sin conjugar para uso posterior. Como muchos antígenos de proteínas son costosos, esta es una gran ventaja del método de conjugación directa.

Ejemplo 2A Preparación de conjugados PT-Pn14

El propósito de estos experimentos es: (1) demostrar que la transformación de la proteína de una forma de peso molecular bajo a una forma de alto peso molecular es un resultado de la conjugación directa de la proteína al carbohidrato; (2) determinar, bajo un conjunto de condiciones particulares, la cantidad mínima de reactivo cianilado que se necesita para conjugar la proteína; y (3) demostrar que los conjugados relevantes clínicamente pueden prepararse mediante el método de la invención.

Se disolvió toxina de Pertussis (PT) (de Mass. Public Health Biol. Labs, Boston, MA) a 0,289 mg/ml en NaCl 0,5 M, fosfato sódico 0,02 M, pH 8,8. Se añadió 0,1 ml de borato sódico 0,1 M pH 9,1, o HEPES 0,75 M, pH 7,5 por milímetro de PT. Se disolvió Pneumococo-tipo 14 (Pn14) (ATTC lot 83909) a 5 mg/ml en solución salina 0,15 M con 0,02% azida. Se disolvió trietilamina (TEA) a 0,2 M en agua. Se disolvió CDAP a 100 mg/ml o 10 mg/ml en acetonitrilo (preparado y almacenado a –20ºC). Se preparó glicina a 1,0 M, pH 5,0. El aminoetanol u otros reactivos de amino pueden sustituirse por glicina / HCl.

Experimento 1

Síntesis de construcciones de vacuna útiles con conjugación directa: PT-Pn14

Cada tubo contenía 250 \mug de Pn14 (50 \mul) en hielo. En tiempo cero, se añadieron varias cantidades de CDAP como se indica en la tabla, y 30 segundos después se añadieron 25 \mul de TEA. Dos minutos después se añadió 1 ml de PT. Después de aproximadamente 1 hora, se añadieron 100 \mul de solución de glicina.

Las muestras se mantuvieron a 4ºC durante una noche. Al siguiente día, se filtraron con un filtro giratorio de 0,45 micrómetros COSTAR y se pusieron en una columna HPLC de filtración de gel TSK en KCl 0,2 M. El porcentaje de HMW es el área del pico del conjugado OD280 de alto peso molecular frente al pico de OD280 que indica resto no conjugado. Se define por (porcentaje de área de volumen vacío) / (% área pico volumen vacío - % área de pico de resto no conjugado). Los porcentajes de áreas, obtenidos de las HPLC, son los siguientes:

TABLA 6 Conjugación Directa de Toxina de Pertussis a Pn14

No.	\mumoles CDAP/Pn14 100 kDa	% HMW
1	1720	100,0
2	520	52,3
3	172	32,8
4	51	31,0
5	17	28,1
6	0 (control PT)	22,0
7	0; no TEA, no PT, (control Pn14)	--
8	0; no TEA, no Pn14; PT sin borato	11,3

Como el control de PT tiene un HMW de 22%, puede haber una pequeña cantidad de agregación del PT causada por las condiciones de reacción. Este conjunto de datos también indica que cambiando la relación de CDAP con polisacárido (Ps), es posible controlar la relación de proteína a carbohidrato en el conjugado final.

Experimento 2

Conjugación de un monosacárido a PT

En esta serie, se sustituyó 150 \mul de una solución de 10 mg/ml de glucosa, que es monomérica, con el polisacárido Pn14. Se usaron condiciones similares a las del Experimento 1 excepto que el PT se preparó en tampón HEPES (pH 7,5, 0,075 M) en lugar de borato. También, se usaron 20 \mul en lugar de 25 \mul. Estas condiciones produjeron lo siguiente:

No.	Condición	Forma % HMW
1	Sólo PT, sin CDAP ni TEA	< 20%
2	CDAP, TEA (sin glucosa); + PT	\sim0
3	Glucosa, CDAP, TEA; + PT	\sim0

Los números 2 y 3 indican que CDAP no polimeriza la toxina de pertussis por sí mismo y que, por lo tanto, la conversión del PT a una forma de alto peso molecular es debida a su acoplamiento con el polisacárido de alto peso molecular y no debido a la polimerización de la proteína. Era evidente en la HPLC que la glucosa se conjugaba con PT porque había un ligero incremento en el peso molecular del PT.

Experimento 3

Síntesis de construcciones de vacunas útiles con un espaciador : PT-Pn14

Se preparó Pn14-derivatizado con hexanodiamina como se describe a continuación. Se añadieron 10 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) (193 moles CDAP por 100 kDa de polisacárido). Treinta segundos después se añadieron 20 \mul de TEA (0,2 M). Después de pasar un total de 2,5 minutos, se añadieron 300 \mul de hexanodiamina 0,5 M en borato sódico 0,1 M (pH 9,1). Después de una hora, la solución se dializó en agua, se filtró y se desalificó en solución salina en una columna P6DG (BioRad). El volumen vacío se reunió y se concentró con un dispositivo Centricon 30 (Amicon). Se determinó que tenía 33 grupos amino por 100 kDa de polisacárido Pn14.

La toxina de pertussis se conjugó con el amino-Pn14 usando química de heterounión (Brunswick et al.). Se añadieron 50 \mul de tampón HEPES 0,75 M a 0,44 ml de amino-Pn14. Se yodoacetiló con 10 \mul de N-hidroxi-succinimida de propionato de yodoacetilo 0,1 M (SIAP). La toxina de pertussis se tioló con un exceso 20 veces molar de SATA (Carbiochem, La Jolla, CA). Cada uno se desalificó en solución salina, se mezcló y se añadió 1/9 volumen de tampón que contenía HEPES 0,75 M, 10 mM EDTA, e hidroxilamina 0,5 M. El volumen final fue de 1,1 ml. Después de incubación durante una noche, la solución se hizo 0,2 mM en mercaptoetanol durante una hora y después 10 mM en yodoacetamida durante 10 minutos, después de lo cual se fraccionó en una columna de filtración de gel S400SF (Pharmacia) (véase Fig. 6). El pico de volumen vacío se juntó y se concentró por filtración a presión en una membrana PM10 (Amicon). Aproximadamente, se recuperó 50% de la toxina pertussis en forma conjugada. El conjugado final contenía 0,7 moles PT por 100 kDa de polisacárido Pn14. La concentración de proteína en el conjugado se determinó mediante ensayo de Bradford (BioRad) usando PT como patrón. La concentración de polisacárido se determinó mediante el método de Monsigny et al. usando Pn14 como el patrón.

Ejemplo 2B Conjugación directa de una proteína con Pn14 usando CTEA

CTEA ofrece la ventaja de tener menos reacciones secundarias que CDAP y conduce a productos más puros, como se describe en Kohn et al., Anal. Biochem., 115:375 (1981). Su desventaja es que es sensible a la humedad, debe pesarse en un recipiente cerrado, y no puede prepararse fácilmente como una solución madre.

Se mantiene 1 ml de polisacárido de pneumococo tipo 14 (Pn14) (5 mg/ml en solución salina) a 0ºC. Se almacena CTEA (disponible en Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) en una atmósfera de nitrógeno seco. Se pesan 2 mg en un recipiente cerrado para pesar y se añade al Pn14 mezclado vigorosamente, y refrigerado. Se añaden inmediatamente 20 \mul de TEA (0,2 M en agua) mientras se mezcla. 60 segundo después, se añaden 5 mg de toxina de pertussis (1,5 mg/ml) a la solución agitada. Media hora después, la reacción se inactiva con 200 \mul de glicina 1 M (pH 5,0). Después de una hora más, la solución se filtra y se pasa por una columna de filtración de gel S400SF, y se equilibra con solución salina. Se recoge el máximo volumen vació y se filtra de forma estéril. Se produce un conjugado 1:1.

Adición de un reactivo espaciador a polisacárido pneumocócico tipo 14 usando CTEA

Se mantiene 1 ml de Pn14 (5 mg/ml en solución salina) a 0ºC. Se almacena CTEA (disponible en Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) en una atmósfera de nitrógeno seco. Se pesan 2 mg en un recipiente cerrado para pesar y se añade al Pn14 mezclado vigorosamente, y refrigerado. Se añaden inmediatamente 20 \mul de TEA (0,2 M en agua) mientras se mezcla. 60 segundo después, se añaden 300 \mul de hexanodiamina 0,5 M en borato 0,1 M (pH 9) mientras se mezcla.. Después de una hora la solución se dializa exhaustivamente en solución salina y se filtra de forma estéril. Como se usa una relación de 187 moles de CTEA por 100 kDa de Pn14, se produce un conjugado con aproximadamente 18 aminas por 100 kDa de Pn14.

Ejemplo 3 Conjugación directa de toxina de pertussis con polisacárido de haemophilus influenzae (PRP)

Se obtuvo PRP, de media MW 350 kDa, de Massachusetts Public Health Biological Laboratory. La toxina de pertussis procedía de la misma fuente. Se añadieron 15 \mul de CDAP (100 mg/ml) a 100 \mul (2 mg) de PRP en hielo. Treinta segundos después, se añadieron 30 \mul de TEA. Esto representaba 319 moles de CDAP por 100 kDa de PRP. Después de dos minutos más, se añadieron 0,75 ml de toxina de pertussis (1,1 mg). 40 minutos después, se añadieron 200 \mul de glicina 1 M (pH 5,0) para inactivar la reacción. Después de una hora más, la solución se paso por una columna de filtración de gel S400SF, se equilibró con solución salina (véase Fig. 7). El volumen vacío se juntó y se filtró de forma estéril. Se determinó que el producto tenía 1,1 PT por 100 kDa de PRP con una producción total de 68%.

La vacuna preparada por Chu et al., Inf & Imm., 40:245 (1983), usaba 377 moles de bromuro de cianógeno por 100 kDa de PRP y tenía relaciones de 1,4 a 2,1 PT por 100 kDa de PRP con producciones menores del 50%. De esta forma, el método de conjugación directa de la invención produjo un conjugado similar pero con menos trabajo, mayores producciones, y sin usar un reactivo tóxico.

Como muchos protocolos publicados para preparar conjugados PRP empiezan con el PRP derivatizado con un espaciador (Chu et al., Schneerson et al., J. Exp. Med., 152:361 (1980); Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrtate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10., pp 48-114 (1989), se usó también CDAP para añadir un espaciador a PRP. Las condiciones usadas son las descritas anteriormente pero se añadieron 100 \mul de hexanodiamina 0,1 M en borato 0,1 M en lugar de la toxina de pertussis. El producto se dializó en solución salina. Se determinó que tenía 102 grupos amino por 100 kDa de PRP. Como es una relación más alta que la usada en métodos publicados, incluso se podría haber usado menos CDAP.

Ejemplo 4 Construcciones inmunogénicas útiles como vacunas preparadas usando química CDAP Conjugación usando CDAP y un reactivo bifuncional

En resumen, un péptido derivado de la malaria, p28 (CNIGKPNVQDDQNK), de la proteína de gameto específico pfs25, se conjugó con la toxina del tétanos (TT). Se ha demostrado que P28 induce la transmisión de la malaria bloqueando los anticuerpos. Se uso CDAP para acoplar p28-TT al polisacárido de pneumococo tipo 14 (Pn14).

Se dializó durante una noche toxina del tétanos aprobada por la FDA en un tampón HEPES y se hizo reaccionar con un exceso 30 veces molar del agente yodoacetilante (SIAP). Después de 3 horas, los reactivos se retiraron por ultrafiltración usando un Macrosep 30 (Filtron Technology) y se lavó en una solución tampón de HEPES fresco, 0,15 M, pH 7,5. Se añadió p28 marcado con tritio en forma sólida al TT derivatizado mientras se mezclaba suavemente. Después de reaccionar durante una noche a 4ºC, la mezcla se trató con mercaptoetanol 0,2 mM para bloquear cualquier grupo activo restante y después se desalificó en una columna P6DG, y se equilibró en una solución tampón HEPES. De la actividad específica del péptido, se determinó que el producto contenía 20 moles de péptidos p28 / mol de TT. El conjugado se dializó en solución salina y se filtró de forma estéril.

Conjugación directa usando CDAP

El Pn14 (obtenido de American Tissue Type Collection, ATTC) tiene un alto peso molecular (aprox.10^{6} daltons). El P28-TT se conjugó directamente con Pn14 como se describe a continuación. Se añadió CDAP (10 \mul de un solución madre 10 mg/ml en acetonitrilo) a Pn14 (1,1 mg en 150 \mul solución salina). Treinta segundos después, se añadieron 20 \mul de trietilamina (0,2 M). Dos minutos después, se añadieron 0,55 mg (en 0,8 ml solución salina) de p28-TT, y una hora después, la reacción se inactivó durante otra hora con 200 \mul de glicina 1,0 M (pH 5). El conjugado se pasó por una columna de filtración de gel S400SF equilibrada con solución salina y el volumen vacío que contenía el conjugado se juntó. La Figura 9 indica que se encontró prácticamente todo el p28-TT en el volumen vacío en forma conjugada.

Inmunoreactividad de las Construcciones Inmunogénicas

Se inmunizaron grupos de 5 ratones DBA/2 con i.v. con 10 \mug de p28-TT o conjugado (p28-TT)-Pn14 en solución salina, se extrajo sangre tres semanas después, y se analizó el suero mediante ELISA (análisis unido con enzimas inmunoabsorbente) para determinar la reactividad contra la proteína pfs25 recombinante. El péptido p28 se deriva de pfs25. Otro conjunto de ratones se inmunizó con los mismos antígenos precipitados con el adyuvante, alumbre (Imject, Pierce Chemical CO., Rockford, IL).

Consistente con las aplicaciones relacionadas, la Tabla 7 muestra que sólo el conjugado de alto peso molecular obtuvo buenas titulaciones anti-proteína.

TABLA 7 Titulaciones anti-pfs25 IgG1

Antígeno	i.v. (solución salina)	s.c. (alumbre)
(p28-TT)-Pn14	36	346
P28-TT	< 10	< 10

Esto demuestra que el método CDAP puede usarse para preparar construcciones de vacunas útiles. También ilustra la facilidad con la que pueden prepararse conjugados útiles.

Ejemplo 5 Construcciones de proteína multivalentes activas biológicamente preparadas usando CDAP

Para demostrar que los conjugados preparados usando CDAP para acoplar directamente proteínas a polisacáridos podrían producir un producto multivalente (como se describe en las solicitudes relacionadas tiene inmunogenicidad mejorada) y que el proceso podría ser lo suficientemente suave para preservar la actividad biológica, se prepararon varios conjugados de un anticuerpo monoclonal con dextrano. Estos experimentos usaron anticuerpo monoclonal H\delta^{a}/1 con un anticuerpo anti-IgD que reticula la membrana IgD en linfocitos B e induce la proliferación (Brunswick et al., Journal of Immunol., 140:3364 (1988)). Como se describe en Brunswick et al., la conjugación de múltiples copias de H\delta^{a}/1 con un polímero de alto peso molecular tal como dextrano 2000 kDa (H\delta^{a}/1/dextrano 1-AECM) indujo la proliferación de células B a concentraciones 1000 veces menores e indujo niveles mayores de proliferación que el H\delta^{a}/1 no conjugado. En Brunswick et al., se requería un método simple, directo pero de varios pasos, de varios días para preparar el conjugado. Se preparó primero dextrano de aminoetilcarboximetilo (dextrano AECM) como se describe en Brunswick et al. y después se utilizó química de heterounión para acoplar el H\delta^{a}/1 al carbohidrato.

Se preparó H\delta^{a}/1-dextrano por conjugación directa usando CDAP y por conjugación indirecta usando un espaciador y CDAP como se describe a continuación.

Conjugación directa: a una solución agitada vorticialmente de 3,2 mg de dextrano T2000 (Pharmacia) en 0,3 ml de solución salina, se le añadieron 15 \mul de CDAP (de una solución madre 100 mg/ml en acetonitrilo). Treinta segundos después, se añadieron 15 \mul de TEA 0,2 M mientras se agitaba. Después de 2 minutos más, se añadieron 6 mg de H\delta^{a}/1 (en 362 \mul de borato sódico 0,05 M y NaCl 0,075 M) mientras se agitaba suavemente. Después de 15 minutos, la mezcla de reacción se inactivó con la adición de 100 \mul de glicina 1,0 M, pH 5,0 y se pasó por una columna de filtración de gel S400SF (1 x 59 cm) equilibrada con solución salina. La elución de la columna se muestra en la
Figura 9. El pico de volumen vacío se llamó H\delta^{a}/1-(CDAP)-dextrano. Este método duró aproximadamente 3 horas.

Espaciador: El dextrano se activó con CDAP como se ha descrito anteriormente (31,5 mg de dextrano T2000 en 3 ml de solución salina y 25 \mul de CDAP seguido de 25 \mul de TEA; 1 mol CDAP / 0,06 mol de monómeros de glucosa). Se añadieron 3 ml de 1,6-diaminohexano 0,5 M en borato sódico 0,1 M. La solución se dializó exhaustivamente en agua y después se fraccionó en una columna de filtración de gel S400HR. El volumen vacío se reunió y se concentró. Se determinó que este amino-dextrano tenía 147 grupos amino por 2000 kDa dextrano. El producto se llamó NH_{2}-(CDAP)-dextrano. Incluyendo la diálisis, el método duró dos días. Por otro lado, se tarda normalmente una semana en preparar AECM-dextrano usando el método de Brunswick et al.

El H\delta^{a}/1 se conjugó con AECM-dextrano y NH_{2}-(CDAP)- dextrano usando las técnicas de heterounión descritas en Brunswick et al. Los conjugados se llamaron H\delta^{a}/1-AECM-dextrano y H\delta^{a}/1-NH_{2}-(CDAP)- dextrano, respectivamente. La conjugación usando ACEM-dextrano fue un método de dos días.

Los análisis de proliferación de células B, usando 10.000 células / pocillo, se realizaron como se describe en Brunswick et al. La Tabla 8 proporciona los resultados de esos análisis, indicando específicamente la incorporación de timidina tritiada en células B como recuentos por min / pocillo.

TABLA 8

	Concentración de H\delta^{a}/1 (\mug/ml)
Mitógeno	1	0,1	0,01
H\delta^{a}/1-AECM-dextrano (preparación 1)	16,045	25,774	25,850
H\delta^{a}/1-AECM-dextrano (preparación 2)	21,685	29,280	34,969
H\delta^{a}/1-(CDAP)-dextrano	16,497	23,654	19,779
H\delta^{a}/1-NH_{2}-(CDAP)-dextrano	19,353	28,343	25,879
Medio (control)	760	725	760

Como se informa en Brunswick et al., el H\delta^{a}/1 solo no provoca la incorporación a estas concentraciones. La máxima incorporación a 10-100 \mug/ml H\delta^{a}/1 es aproximadamente 3000 cpm.

Estos datos indican que los conjugados preparados usando CDAP con y sin espaciador, son esencialmente equivalentes a dextrano H\delta^{a}/1 - AECM en sus capacidades para inducir la proliferación. Como sólo los anticuerpos multivalentes inducen niveles de proliferación altos a bajas dosis, todos los conjugados deber ser multivalentes. De esta manera, la conjugación directa con CDAP no afectó la actividad biológica del anticuerpo. El método de conjugación directa fue notablemente más rápido de preparar que los conjugados preparados con un espaciador. Además, añadir el espaciador y conjugar usando CDAP fue mucho más rápido que preparar dextrano AECM.

De esta forma, este experimento ilustra (1) la alta producción de una construcción multivalente usando CDAP y (2) la facilidad y rapidez de preparación de conjugados, especialmente conjugados directos. La conjugación usando CDAP y un reactivo bifuncional duró menos de 48 horas y la conjugación directa duró menos de 3 horas.

Ejemplo 6

Si no se especifica lo contrario, el protocolo en estos experimentos fue generalmente como se indica a continuación. Se obtuvieron trietilamina (TEA), acetonitrilo, ácido sulfúrico (H_{2}SO_{4}), resorcinol, hexanodiamina, borato sódico y HEPES de Aldrich y eran de calidad reactiva o mejor. Se obtuvo tetrafluoroborato de N-ciano-4-dimetilaminopiridinio (CDAP) de Sigma o de Research Organics (Cleveland, Ohio). Se obtuvo ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS) de Kodak Chemicals. Los filtros Millex se obtuvieron en Millipore Corp.

El Dextrano T2000 se obtuvo en Pharmacia. El polisacárido de pneumococo tipo 14 se obtuvo en ATTC (Rocksville, Maryland). El amino etil carbonil dextrano se preparó como se describe en Brunswick et al. Se preparó BSA monomérica (albúmina de suero bovino) con fracción V de BSA de baja poca endotoxina de Cohen (catálogo Sigma #A9306) por filtración de gel en una columna S100HR (2,6 cm x 97 cm) (Pharmacia), equilibrada con solución salina más azida. Se demostró por HPLC analítica que el producto tenía menos de un 0,5% de dímero y menos de 0,1% de material de mayor masa en peso molecular. La BSA se comprobó periódicamente por HPLC para confirmar su estado monomérico. Se usó un coeficiente de extinción de 44.000 M^{-1} para la BSA.

El polisacárido se activó con CDAP como se describe a continuación. Se preparó CDAP a 100 mg/ml en acetonitrilo y se almacenó a –20ºC durante un mes. Se vertió el CDAP mediante una pipeta en una solución agitada vorticialmente de polisacárido en agua, y treinta segundos después, se añadió un volumen de TEA 0,2M igual al volumen de CDAP usado. A los 2,5 minutos, se añadió un quinto del volumen de hexanodiamina 0,5 M en borato sódico 0,1 M (pH 9,3). La reacción continuó durante una noche a 4ºC. El producto de reacción se desalificó en un cartucho P6DG o P6 (BioRad), equilibrado con solución salina, y después se dializó adicionalmente en solución salina. Algunas muestras se concentraron usando un dispositivo Centricon 30 (Amicon) y se desalificaron otra vez para confirmar la eliminación de la diamina libre. A continuación se indican variaciones de este método general. El alcance de la derivatización con hexanodiamina se determinó usando un análisis TNBS para aminas primarias. La absorbencia se midió a 366 nm, usando un coeficiente de extinción de 11.000 M^{-1} (Franci et al.). Se encontró que el dextrano activado con CDAP, derivatizado usando etanolamina en lugar de diamina, era TNBS negativo en este análisis, Las concentraciones de polisacárido se calcularon como se describe en Monsigny et al. Los resultados se expresan como moles de amina por 100 kDa de polisacárido a menos que se indique de otra forma.

La conjugación de proteína con amino-dextrano mediante un enlace tio-éter se realizó como se describe en Lees et al., Vaccine, 12(3):1160, 1994. La proteína se conjugó directamente con el polisacárido activando el polímero con CDAP como se ha descrito anteriormente para la derivatización con aminas. Se añadió proteína (10 mg/ml en HEPES 0,15 M, pH 7,5) rápidamente a una solución agitada vorticialmente suavemente 2 minutos y medio después de introducir el CDAP. Las reacciones se inactivaron con aproximadamente 1/5 volumen de etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M, pH 7,5, durante al menos una hora antes de la filtración con gel en una columna S300HR o S400HR (Pharmacia), equilibrada con solución salina. El tubo máximo del volumen vacío se analizó para proteínas con el método Bradford (reactivo BioRad) usando BSA como patrón. Las concentraciones de polisacáridos se calcularon por el método de Monsigny et al., usando dextrano como patrón. Los resultados, que se discuten a continuación, se expresan como mg de proteína por mg de polisacárido a menos que se indique de otra forma.

Activación de Polisacáridos Usando CDAP

Se realizaron experimentos para determinar si se puede usar la activación con CDAP de polisacáridos para preparar vacunas conjugadas en condiciones más rápidas, más suaves, más convenientes, y más seguras que los métodos presentados anteriormente. Como polisacárido prototipo, se activó dextrano de alto peso molecular (dextran T2000, Pharmacia) con CDAP bajo distintas condiciones experimentales.

De una solución madre 100 mg/ml, se vertió lentamente con una pipeta un volumen de CDAP en una solución de dextrano T2000 en agua (1,6 mg/ml como se muestra en la Figura 4, o 10 mg/ml como se muestra en la Figura 10). A los 30 segundos, se añadió un volumen de TEA 0,2 M igual al volumen de CDAP, y 120 segundos después, se añadió rápidamente un gran exceso de hexanodiamina en borato sódico (pH 9,3). Después de desalificar en una columna P6DG seguido de diálisis exhaustiva para retirar los reactivos no conjugados, se encontraron niveles altos de polisacáridos (véase Figuras 4 y 10). Siguiendo este mismo método, pero en ausencia de CDAP, dextrano o diamina respectivamente, no se detectaron aminas durante el análisis TNBS. Además, el dextrano activado con CDAP que había reaccionado con una monoamina (etanolamina) en lugar de la hexanodiamina, era TBNS negativo. Para asegurar adicionalmente que se había retirado todo el material de peso molecular bajo, se concentró el polisacárido derivatizado mediante ultrafiltración y se desalificó una segunda vez en una columna P6DG. La relación de amina no cambió tras este método.

El grado de derivatización dependía de la cantidad de CDAP. Incrementos en la relación CDAP - dextrano llevaron a incrementos en el número absoluto de grupos amino sustituidos en el polisacárido como se muestra en las Figuras 4 y 10. El alcance de la derivatización dependía de la concentración de polisacárido para la misma relación
molar CDAP - dextrano. De esta forma, a 1,6 mg/ml de dextrano, las eficacias estaban en el intervalo de 0,7 a 2,4 en porcentaje basado en los moles de aminas sustituidas por mol de CDAP, mientras que a 10 mg/ml de dextrano, se sustituyeron tantos como 0,2 moles de aminas por mol de CDAP (eficacia del 20%).

Para mejorar la eficacia de esta reacción biomolecular, la concentración de polisacárido se aumentó de 1 a 50 mg/ml, usando una cantidad fija de CDAP (véase Figura 11). En la mayor concentración de polisacárido usada, se añadieron más de 0,4 moles de amina por cada mol de CDAP usado. En contraste con el alto nivel de sustitución obtenido con la activación con CDAO, la activación con CNBr normalmente genera eficacias máximas de aproximadamente 1 a 2%.

En ausencia de TEA, la derivatización con aminas se redujo notablemente. Para determinar si la presencia de una amina terciaria tal como TEA es esencial para activar un polisacárido soluble con CDAP, se comparó la eficacia de activación usando TEA con la que usaba una solución tampón inorgánica o NaOH.

Se añadieron lentamente 100 \mul de una solución de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) a una solución agitada de 2 ml de dextrano T2000 (10 mg/ml en agua) a temperatura ambiente. Después de treinta segundos, se añadió lentamente NaOH 1 N para mantener el pH a aproximadamente 9. Después de un minuto y medio, se añadió 1 ml de BSA, 20 mg/ml en HEPES 0,5 M, pH 8,0. Después de dejar la reacción progresar durante 18 horas a 4ºC, se inactivó añadiendo 100 \mul de etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M, pH 7,5. Para el análisis, se filtraron en gel 300 \mul del producto en una columna de 1 cm x 50 cm S400HR equilibrada con solución salina y azida. El tubo máximo de volumen vacío se analizó para proteína usando el análisis BioRad y por polisacáridos usando el análisis de resorcinol, y se encontró que tenía 0,45 mg de BSA por mg de dextrano.

\newpage

Como se muestra en la Tabla 9 a continuación, la derivatización resultó con una diversidad de soluciones tampón. De hecho, se usó la adición con precaución de NaOH 1 N para elevar el pH a aproximadamente 9 y se produjeron buenos niveles de sustitución.

TABLA 9 Derivatización de dextrano con hexanodiamina usando distintas soluciones Tampón. (desalificado, dializado, concentrado y desalificado)

Solución tampón	NH_{2} / dex 100 kDa
TEA (0,2 M)	29
Borato (pH 8,8)	40
Carbonato	20
NaOH	36

Con dextrano, no hubo diferencias significativas en los niveles de derivatización sobre un intervalo de pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10, aunque se ha encontrado que otros polisacáridos son más dependientes del pH de activación (véase a continuación). Como se ha indicado anteriormente, si se omite la TEA y el pH no se aumenta, el dextrano aún está activo pero se derivatiza en mucho menor grado. De esta forma, la activación o acoplamiento con CDAP no depende de la presencia de TEA o una solución tampón-puede usarse cualquier medio apropiado para incrementar el pH de tal forma que la mezcla de reacción sea suficientemente alcalina.

La tabla 10 muestra la cinética de reacción de la activación usando CDAP. En el experimento, se añadieron 100 \mul de CDAP (100 mg/ml acetonitrilo) a 1 ml de dextrano (20 mg/ml) a los 30 segundos, se añadió 1 ml de borato sódico 0,1 M pH 8,8 y después de dos minutos, se añadieron 0,5 ml de hexanodiamina en HEPES 0,75 M. Las fracciones se desalificaron en los tiempos indicados en un cartucho P6 equilibrado con solución salina, y después se dializaron exhaustivamente en solución salina antes del análisis. A altas concentraciones de polisacárido y CDAP, las soluciones gelificaron. De esta forma, es más conveniente trabajar con soluciones de polisacáridos de 10 a 20 mg/ml.

TABLA 10 Cinética de reacción de dextrano activado con CDAP con Hexanodiamina

Tiempo de reacción	NH_{2} / dex 100 kDa
15 min.	42
1 hr.	46
3 hr.	47
24 hr.	48

Como se muestra en la Tabla 10, la reacción de derivatización fue rápida y prácticamente se completaba en 15 minutos. No se observó incremento en el grado de derivatización a las 3 o 24 horas.

Para comprobar la reproducibilidad, se activó polisacárido de pneumococo tipo 14 (Pn14) con CDAP y se derivatizó con hexanodiamina. A una solución agitada de 1 ml de Pn14 (10 mg/ml en agua) se le añadieron 30 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) (0,3 mg CDAP/mg Pn14). Después de treinta segundos, se añadieron 30 \mul de TEA (0,2 M en agua). A los dos minutos, se añadieron 0,5 ml de hexanodiamina (0,5 M en HEPES 0,75 M, pH 7,6). A la hora y media, el producto se desalificó con un cartucho P6, se concentró por ultrafiltración y se desalificó otra vez, y después se analizó por aminas con TNBS y por Pn14 con resorcinol / ácido sulfúrico. Como se muestra en la Tabla 11, se obtuvieron eficacias del 13 - 15%, basadas en moles de aminas detectados por mol de CDAP usado, en tres experimentos realizados sobre un periodo de un año.

TABLA 11

Experimento	NH_{2}/dex 100 kDa	Eficacia (mol NH_{2}/mol CDAP)
A	17,9	14,1%
B	19,8	15,5%
C	17,3	13,6%

\newpage

Los resultados presentados anteriormente indican la estabilidad del reactivo CDAP en el congelador, la reproducibilidad, y la alta eficacia. En comparación, la solución de CNBr no es estable, y la activación con CNBr es difícil de reproducir y tiene una eficacia de aproximadamente 2%.

Conjugación directa de proteína con Ps activado con CDAP

Al igual que con la derivatización de aminas, el alcance de la conjugación de proteínas con polisacáridos dependía de la cantidad de CDAP usado para activar el polisacárido. Como se muestra en la Figura 12, a una concentración de 10 mg/ml de dextrano, la relación CDAP:dextrano aumentaba linealmente con la relación BSA:dextrano del producto. se podrían observar relaciones similares de BSA:dextrano incluso a relaciones de CDAP:dextrano menores si se incrementaran las concentraciones de proteína y/o polisacárido.

Las reacciones de control realizadas en ausencia de dextrano y analizadas por filtración de gel indicaron que el CDAP por sí mismo no agregaba o polimerizaba la BSA (proteína). Se prepararon una muestra tratada con CDAP (0,5 ml agua + 25 \mul CDAP a 100 mg/ml en acetonitrilo + 50 \mul TEA 0,2 M + 0,5 ml BSA a 10 mg/ml en HEPES 0,5 M, pH 8,0) y una muestra de control (0,575 ml agua + 0,5 ml BSA (monomérica) a 10 mg/ml en HEPES 0,5 M, pH 8,0). Las muestras se dejaron reaccionar durante una noche y se inactivaron con 100 \mul de etanolamina 0,5 M en HEPES. Después de inactivar durante una hora, las muestras se introdujeron en una columna S400 1 cm x 50 cm en solución salina y azida a 0,75 ml / minuto. Se sumó el OD280 en la columna y se dividió por la suma de los OD280 en los tubos antes del máximo BSA. La muestra tratada con CDAP mostró 0,6% de BSA polimérica, y la muestra de control mostró 0,7% de BSA polimérica. De esta forma, la proteína de alto peso molecular no se debe a la auto-polimerización o agregación.

Además, bajo condiciones normales, CDAP no reticula el polisacárido. Esto se confirmó mediante el siguiente experimento HPLC en el que se activaron 70 kDa de dextrano y reaccionó con etanolamina y se introdujo en una columna de filtración de gel. Concretamente, se combinaron 2,5 mg de dextrano T70 (10 mg/ml) con 20 \mul de CDAP (100 mg/ml). A los treinta segundos, se añadieron 20 o 60 \mul de TEA 0,2 M, y a los dos minutos se añadieron 100 \mul de etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M, pH 7,6. Después de una hora, las muestras se introdujeron en una G4000 PWXL (Tosohaas) o una SEC3000 (Beckman) en NaCl 0,2 M y se detectaron por índice refractario (volumen vacío por cada columna fue aproximadamente 5 minutos, eluyendo sal a aproximadamente 10 minutos). No se observo evidencia de un cambio a mayor peso molecular.

Como muestra el siguiente experimento comparativo, deben evitarse condiciones extremas para prevenir la reticulación del polisacárido por parte del CDAP. Un ml de dextrano T2000 (10 mg/ml agua ) se combinó con 176 \mul de CDAP (100 mg/ml). Después de treinta segundos, se añadieron 176 \mul de TEA 0,2 M, que produjo un gel en menos de dos minutos.

Para determinar el tiempo óptimo de activación y para examinar la estabilidad del polisacárido activado con CDAP, se añadió proteína (BSA) 5-300 segundos después de la adición del CDAP y TEA, y se calculó la relación BSA:dextrano del producto. Los resultados mostrados en la Figura 13 sugiere que el tiempo óptimo de activación es aproximadamente 2 minutos y que el polisacárido activado es estable sobre este periodo de tiempo. Si la proteína se añade a la hora, la producción de la reacción disminuye aproximadamente un tercio.

Se ha encontrado que las mezclas acuosas de CDAP y polisacáridos son estables, como se refleja en la Figura 14. Se añadieron 60 \mul de CDAP (100 mg/ml) a ml de agua, y se combinaron fracciones de 100 \mul de esta solución de CDAP con 100 \mul de polisacárido (dextrano, 20 mg/ml) en varios momentos sobre un periodo de 10 - 300 segundos como se muestra en la Figura 14, seguido de combinación con 15 \mul de solución de TEA (0,2 M). Dos minutos después de combinarse con la TEA, se añadieron 100 \mul de BSA (30 mg/ml).

No se encontraron diferencias significativas en las relaciones finales de proteína - polisacáridos en todo el intervalo de valores para los tiempos de adición. Los resultados mostrados en la Figura 14 son coherentes con la estabilidad de CDAP en soluciones ácidas y la observación de que las soluciones de CDAP en agua se hacen ácidas. De esta forma, puede sustituirse el agua por el disolvente orgánico si la solución de reactivo se va a usar el mismo día. Alternativamente, puede añadirse CDAP en forma sólida a la solución del polisacárido. Trabajando con pequeñas cantidades de CDAP, se ha encontrado más práctico trabajar con soluciones que con el reactivo sólido. Además. aunque que la adición rápida de una solución de acetonitrilo de CDAP a veces precipita el polisacárido, puede evitarse la precipitación si se usa una solución acuosa de CDAP. Pueden prepararse soluciones madre acuosas de CDAP a concentraciones de hasta 75 mg/ml.

La Figura 15 muestra que la conjugación de proteína con el polisacárido fue relativamente rápida, y en tres horas se había alcanzado el 80% de la conjugación máxima. Incluso se podría conseguir un acoplamiento más rápido incrementando la concentración de proteína, la concentración de polisacárido, y/o la concentración de CDAP.

Como se indica en la Figura 16, el pH de la solución de la reacción durante la activación del polisacárido es otro parámetro importante en la activación del polisacárido con CDAP. Como se aumentó el pH de 7,0 a 8,3 durante la etapa de activación, hubo un incremento en la activación del polisacárido como se refleja mediante una subida notable en la eficacia del acoplamiento. La relación BSA:dextrano del conjugado aumentó 4 veces mientras el pH aumentaba de 7,0 a 8,3. A un pH mayor de 8,3 hubo poco o nulo incremento en la relación. La dependencia de pH de la activación por CDAP explica el bajo nivel de derivatización que se observó previamente con la ausencia de TEA, ya que el pH de una solución de CDAP en agua es casi neutro inicialmente y se vuelve más ácido.

Como se ha indicado anteriormente con respecto a la derivatización de los polisacáridos con aminas, no es necesaria una solución tampón de amina terciaria durante la activación del polisacárido para la conjugación directa de las proteínas. De esta forma, la conjugación directa de proteínas a polisacáridos puede hacerse, por ejemplo, usando un pH-estato o un triturador automático para aumentar el pH durante la etapa de activación. Esto podría ser ventajoso para preparar conjugados de vacunas.

La Figura 17 ilustra que el pH de la solución de la reacción durante el acoplamiento de la proteína al polisacárido activado es un parámetro importante en la conjugación directa de la proteína con CDAP. En el experimentos para el cual se dan los resultados en la Figura 17, se comprobaron varias soluciones tampón sobre un amplio intervalo de valores de pH y a bajas relaciones de proteína-polisacárido. El protocolo fue el siguiente:

A 4 ml de dextrano T2000 (10 mg/ml en agua) se le añadieron 133 \mul de una solución CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo, preparado recientemente) (0,33 mg CDAP / mg dex). Después de 30 segundos, se añadieron 266 \mul de TEA (de una solución madre 0,2 M), y el pH alcanzó un máximo de 9,6. Después de dos minutos y medio, el pH se ajustó a 5,0 usando 60 \mul de NaAc 1 M (acetato sódico). Se pasaron 300 \mul de dextrano activado a tubos que contenían 200 \mul de BSA (15 mg/ml) (0,8 mg BSA/ mg dex) y 100 \mul de una solución tampón (NaAc 1 M, pH 4,7, 5,7; HEPES 0,5 M, pH 6,94, 7,43, 8,15; NaPO_{4} 0,1 M, pH 8,0 8,67; borato sódico 50 mM, pH 9,0, 9,6) (fuerza iónica no controlada). Una hora después de la transferencia, se combinaron 350 \mul de la solución de un tuvo con 100 \mul de etanolamina 0,5 M preparada recientemente en HEPES 0,75 M (pH 7,5). Veinte horas después, se añadieron 100 \mul de etanolamina a la solución resultante. La solución se inactivó durante al menos dos horas y el producto se introdujo en columnas S300HR o S400HR equilibradas con solución salina más azida. El tubo de máximo volumen vacío se analizó para BSA usando el análisis BioRad y para polisacáridos usando el análisis resorcinol. Como se muestra en la figura 17, la mayoría de la proteína se acopló al polisacárido a un pH tan bajo como 7,4, una cantidad sustancial se acopló a un pH tan bajo como 6,9, y una cantidad pequeña pero significante se acopló a un pH tan bajo incluso como 5,7. Para las condiciones de este experimento, un pH de aproximadamente 8 parecía óptimo. Aunque los resultados muestran que el pH de la etapa de acoplamiento es importante, muestran que el acoplamiento puede realizarse sobre un amplio intervalo de pH. Sin embargo, como la reacción de acoplamiento es tan ineficaz a un pH de 5, se debería inactivar aproximadamente a un pH de 7 a 8.

Pueden obtenerse mayores cantidades de acoplamiento incluso a bajo pH incrementando la relación proteína-polisacárido, la concentración de polisacárido, y/o la cantidad de CDAP usada. Por ejemplo, usando más reactivo o más proteína, pueden obtenerse mayores producciones incluso a un pH de 7. De esta forma, el acoplamiento directo de proteína puede conseguirse a pH casi neutro usando CDAP para activar el polisacárido.

La Figura 17 indica que el fosfato es también un inhibidor de la reacción de acoplamiento, lo que puede deberse a interacciones iónicas o al carácter ligeramente nucleófilo del fosfato. Sin embargo, aumentar la cantidad de CDAP y el pH durante el acoplamiento, aumentará la relación/producción de la conjugación. Si el fosfato está presente durante la activación con CDAP, se inhibe la adición de la diamina.

Los fosfatos de PRP y Pn6 pueden provocar inhibición, como se muestra con el siguiente experimento. Se añadieron 20 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) a una solución agitada vorticialmente de 2 mg Pn6 (De pneumococo tipo 6, un polisacárido de fosfato de polirribitol) (10 mg/ml en agua). Treinta segundos después, se añadió una solución tampón (100 \mul de borato sódico 0,1 M o 40 \mul de TEA 0,2 M). A los dos minutos, se añadieron 100 \mul de BSA (20 mg/ml) en HEPES 0,5 M, pH 8. Después de incubar durante una noche a 4ºC, la reacción se inactivó con 100 \mul de etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M, pH 7,5, seguido de filtración con gel en una columna S400HR (Pharmacia) equilibrada con solución salina y azida al 0,02%. El tubo de máximo volumen vacío se analizó para proteínas y polisacárido. Para propósitos comparativos, en la prueba 4 el dextrano se derivatizó de la misma manera. Los resultados se muestran en la Tabla 12 a continuación.

TABLA 12

Prueba	Ps	Solución Tampón	BSA/Ps (mg/mg)
1	Pn6	TEA 0,2 M	0,06
2	Pn6	Borato sódico 0,1 M (pH 8,8)	0,16
3	Pn6	Borato sódico 0,1 M (pH 10)	0,31
4	dex	Borato sódico 0,1 M (pH 8,8)	0,77

Para Pn6 con la solución tampón de TEA (prueba 1), la producción fue muy baja. Según se aumentaba el pH con borato sódico (pruebas 2 y 3), la producción se incrementó. Las mismas condiciones dieron producciones mucho mayores para el dextrano (véase, por ejemplo, la prueba 4). De esta forma, los polisacáridos basados en fosfatos tales como el Pn6 necesitan ajuste en el pH y/o en la relación de CDAP para preparar conjugados con buenas producciones.

El siguiente experimento muestra que el enlace isourea formado por la activación CDAP es estable y robusto. En este experimento, se acopló \varepsilon-TNP-lisina a dextrano mediante CDAP. Las muestras 1-5 se prepararon como se indica a continuación:

1: 400 \mul de TNP/ CDAP/ dex+ 100 \mul solución salina (control)

2: 400 \mul de TNP/ CDAP/ dex+ 100 \mul NaCl 2 M

3: 400 \mul de TNP/ CDAP/ dex+ 100 \mul GuHCl 9 M

4: 400 \mul de TNP/ CDAP/ dex+ 100 \mul solución salina (reacción en incubador a 37ºC)

5: 400 \mul de TNP/ CDAP/ dex+ 100 \mul solución salina (control)

Las muestras se dejaron reaccionar durante una noche en la oscuridad, excepto la muestra 4, que reaccionó como se indica. Después, las muestras se desalificaron en un cartucho P6 en borato sódico 10 mM a 1,0 ml /minuto. Las fraccione se leyeron a OD366 y se analizó el tubo máximo de las fracciones vacías. Los resultados se proporcionan en la Tabla 13 a continuación.

TABLA 13

Muestra	TNP (\muM)	Dex (\muM)	TNP/100 kDa dex
1	96	9,7	10
2	134	12	11
3	127	11	12
4	137	13	11
5	107	10	11

No cambió la relación de TNP:dextrano para cada muestra, indicando que el enlace isourea era estable a las condiciones de la prueba.

Actividad biológica de los conjugados

Para determinar si la activación con CDAP del polisacárido tiene algún efecto en detrimento de su capacidad para inducir respuestas de anticuerpos, se comprobó su actividad biológica in vitro. BSA se conjugó directamente a polisacárico pneumocócico de tipo 14 o se acopló al polisacárico pneumocócico de tipo 14 derivatizado con hexanodiamina seguido de yodoacetilación y reacción con proteína tiolada (Lees et al.). Cada conjugado tenía una relación de mg BSA / mg Pn14. Se inmunizaron de forma subcutánea dos ratones Inbred DBA con 50 \mug de BSA; libre o en forma de conjugado de polisacárido, en ausencia de adyuvantes. Se recogió el suero 14 y 28 días después, y se determinaron los titulaciones de anticuerpos anti-BSA y anti-Pn14 mediante ELISA.

Ni la BSA no conjugada ni el Pn14 no conjugado estimularon una respuesta primaria detectable. Por otro lado, los conjugados BSA-Pn14 estimularon respuestas de anticuerpos significantes a los componentes de proteína y polisacáridos, independientemente de si la proteína se acopló por conjugación indirecta usando un espaciador o por conjugación directa. Los ratones inmunizados con BSA-dextrano preparado usando un espaciador o acoplamiento directo al dextrano activado con CDAP dieron titulaciones comparables a los obtenidos cuando los conjugados se prepararon usando otros métodos químicos. Además, los conjugados TT-PRP preparados usando activación con CDAP han mostrado en ratas inmunizadas con los conjugados respuestas anti-PRP comparables a las mostradas en ratas inmunizadas con conjugados TT-PRP preparados usando activación con CNBr. Además, el tétanos conjugado directamente con Pn14 activado con CDA tenía respuestas de anticuerpos anti- tétanos y anti-Pn14 altas; análisis opsónicos indicaron que estos anticuerpos eran protectores.

Ejemplo 7 Acoplamiento de proteína derivatizada con hidrazida a polisacáridos activados con CDAP (proteína derivatizada en los grupos amino)

Se derivatizaron un número limitado de aminas en BSA con hidrazidas como se describe a continuación. Se hicieron reaccionar 20 mg de BSA (24 mg/ml en HEPES 75 mM, pH 5) con un exceso molar de 20-veces de SPDP (Prochem). Después de 8 horas, se añadieron 200 \mul de acetato sódico 1 M (pH 5), seguido de 25 \mul de DTT 1 M para desproteger el tiol. La solución se desalificó en 2 cartuchos P-6 en series, equilibrados con acetato sódico 10 mM, NaCl 0,1 M y EDTA 2 mM (pH 5) y la proteína de volumen vacío se concentró con un dispositivo Centricon 30 a un volumen de 1,05 ml. Usando un reactivo de Ellman se determinó que había 3,2 tioles libres por BSA. Se reservaron 5 mg de tiol-BSA y el resto se hizo pH 6 por adición de 50 \mul de HEPES 1 M (pH 6). Se añadieron 100 \mul de hidrazida-HCl de ácido E-maileimidocaproico 0,1 M (reactivo de maleimida-hidrazida heterofuncional: EMCH, Procehm, Rockford, Illinois) en dimetilformamida. Después de reaccionar durante una noche, la proteína se desalificó y se concentró otra vez. La concentración de proteína se calculo a partir de su absorbencia. Se usó un análisis TNBS para demostrar la presencia de grupos hidrazida libres (por ejemplo, había una absorbencia a 540 nm, no presente en la proteína nativa).

Como sólo había 4,2 tioles por BSA, teóricamente, el producto final podría contener no más de ese número de hidrazidas libres. La BSA tiene un total de 60 grupos amino; de esta forma, la BSA se ha modificado mínimamente. Este material se designó BSA-S-Hz.

Se hizo reaccionar BSA-S-Hz o BSA monomérico (comparativa; preparado por filtración de gel en una columna S100HR) con dextrano activado con CDAP como se describe a continuación. Se activaron 400 \mul de dextrano T2000 (10 mg/ml en agua) con la adición de 15 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo), seguido 30 segundos después de 30 \mul de TEA 0,2 M. A los dos minutos y medio, se añadieron 200 \mul de acetato sódico 1 M (pH 5) para ajustar el pH de la mezcla de reacción a 5. Después se añadieron 300 \mul del dextrano activado con CDAP a 2 mg de BSA-S-Hz o BSA monomérica (90 \mul a 22,3 mg/ml en una solución tampón de acetato sódico 10 mM). El pH final fue 5,1. Después de reaccionar durante una noche, las muestras se inactivaron con etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M (pH 7,5) y se fraccionaron por filtración de gel en una columna S300HR (1x50 cm, equilibrada con solución salina y azida). Los análisis de proteínas y polisacáridos mostraron que, a pH 5, BSA-S-Hz produjo un conjugado con 0,51 mg de BSA por mg de dextrano, mientras que la BSA monomérica no formó productos conjugados.

Conjugación de la toxina de la difteria (DT) derivatizada con hidrazida a De pneumococo tipo 14 (Pn14) activado con CDAP

DT derivatizada en grupos carboxilo: DT se derivatizó con ADH en grupos carboxilo como se describe a continuación. A 6,95 mg de 1-metilimidazol 0,5 M (pH 6 ) se le añadieron 0,5 ml de dihidrazida adípica 0,5 M en la misma solución tampón, seguido de 15 mg de clorhidrato de 1-etil-(e-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), con mezcla. Después de incubar durante una noche, la proteína se desalificó en 2 cartuchos P-6, en series, equilibradas con una solución tampón de acetato sódico 10 mM (pH 5) y concentradas con un dispositivo Centricon 50 a 17,1 mg/ml. Un análisis TNBS indicó la presencia de hidrazidas. Este material se designó DE/EDC/Hz.

Se fraccionó De pneumococo tipo 14 (obtenido de SmithKline Beecham) mediante filtración de gel en una columna S400HR (2,6x100 cm, equilibrada con fosfato potásico 0,1 M, pH 7,2). Las fracciones de pesos moleculares extremos superiores e inferiores se separaron y el corte central se concentró y se dializó en solución salina. Este material se designó Pn14(M).

Se activaron 250 \mul de Pn14(M) (10,1 mg/ml) con la adición de 15 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) seguido treinta segundos después de 30 \mul de TEA 0,2 M. A los 2,5 minutos, se añadieron 150 \mul de acetato sódico 1 M (pH 5) para reducir el pH y después se añadieron 150 \mul de DT/EDC/Hz (2,5 mg). Después de reaccionar durante una noche, la mezcla de reacción se inactivó con 100 \mul de etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M (pH 7,5), seguido de filtración con gel en una columna S300HR (1x50 cm, equilibrada con solución salina). Los análisis mostraron que el DT se había acoplado.

DT derivatizada en grupos amino: Se derivatizó DT de una forma similar a la de BSA-S-Hz. Se hizo reaccionar 5 mg de DT (13,9 mg/ml) con un exceso molar de 20-veces de DPFP, se desalificó, se concentró con un dispositivo Centricon 30, se trató con DTT 50 mM a pH 5 durante 1 hora y después se desalificó y se concentró otra vez. Los análisis con un reactivo de Ellman indicaron la presencia de grupos tiol libres. Después, la toxina tiolada se reaccionó con un gran exceso de EMCH, se desalificó y se concentró de nuevo. Un análisis TNBS indicó la presencia de hidrazidas. Este material se designó DT-S-Hz.

El DT-S-Hz se acopló a Pn14 fraccionado por tamaño como se describe a continuación. Se activaron 4 mg de Pn14(M) en NaCl 1,5 M con 20 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) seguido 30 segundos después de 40 \mul de TEA 0,2 M. Después de 2,5 minutos, se añadieron 50 \mul de acetato sódico 1 M (pH 5). Después, se añadieron 3,9 mg de DT-S-Hz (en acetato sódico 77 mM, pH 5); se usó un medidor de pH para calcular que el pH final era de 5,1. Después de reaccionar durante una noche a 4ºC, la reacción se inactivó por adición de 100 \mul de etanolamina 0,5 M en HEPES 0,75 M, seguido de filtración por gel en una columna S400HR (1x50 cm, equilibrada con solución salina y azida). Los análisis mostraron que el DT se había acoplado.

Reacción de hidrazidas frente a aminas a pH bajo

Se preparó polisacárido activado con CDAP añadiendo 5 mg de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) a 5 mg de Pn14 (10 mg/ml en agua). Treinta segundos después, se añadieron 300 \mul de TEA 0,2 M. A los dos minutos y medio, el pH se redujo a aproximadamente 5 añadiendo 100 \mul de NaAc, pH 5. Después el polisacárido activado con CDAP se añadió a ADH 0,2 M o a hexanodiamina, a un pH de aproximadamente 5. Después de reaccionar durante una noche, la solución se desalificó en una solución tampón de acetato (pH 5) y se analizó para aminas o hidrazidas usando TNBS. Solo la solución que contenía hidrazidas era TNBS positiva. Esta muestra se concentró en un dispositivo Centricon 50 y se desalificó en un cartucho P6 una segunda vez. La relación de hidrazida a dextrano no cambió, indicando que solo se habían retirado los reactivos sin reaccionar. El hecho de que la muestra de hexanodiamina fuera TNBS negativa indica que no había ocurrido derivatización.

Como control, se hizo reaccionar dextrano activado con CDAP con ADH o hexanodiamina en HEPES 0,75 M (pH 7,5). Ambas muestras fueron TNBS positivas.

Resumen

El método de la invención utilizando CDAP representa un enfoque reproducible que puede usarse para activar varios polisacáridos clínicamente relevantes, algunos de los cuales son sensibles al pH alto. La activación es rápida, por lo que se minimiza el tiempo transcurrido a pH alto. Este método produce conjugados de proteína-polisacáridos altamente inmunogénicos, que pueden estimular en ratones anticuerpos humorales a los componentes de proteína y polisacáridos incluso en ausencia de adyuvante.

Las variables que han demostrado influir profundamente en el alcance de la activación del polisacárido son las concentraciones de CDAP y polisacárido, y el pH. Un pH preferido para la conjugación es de aproximadamente 7 a aproximadamente 9, más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 8,0, que es el intervalo en el cual son estables la mayoría de los polisacáridos. Otros intervalos de pH, por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 10, pueden ser más adecuados para otros polisacáridos.

Manipulando las concentraciones de polisacárido y/o CDAP, la eficacia de la derivatización puede incrementarse al 50%, en comparación con el 1-2% encontrado con CNBr. Además, puede conseguirse un producto con más de 50 grupos NH_{2} por 100 kDa de polisacárido bajo las condiciones preferidas. El método de la invención no depende de la presencia de aminas terciarias, como se ha descrito por investigadores anteriores que han experimentado con CDAP. La activación del polisacárido es rápida. De forma similar, la conjugación de proteína con polisacárido activado es rápida.

La invención ofrece las ventajas de reproducibilidad, rápida reactividad, y quizás y más notablemente, la capacidad para manipular fácilmente relaciones de proteína:polisacáridos. Por ejemplo, pueden conseguirse conjugados con varias relaciones proteína:polisacárido alterando la concentración de CDAP y/o la concentración de polisacárido y/o la concentración de proteína. Esto puede proporcionar un acercamiento al estudio no sólo del rol de la relación proteína:polisacárido en la influencia de la magnitud de la respuesta de anticuerpos al conjugado, sino también del rol de la estructura tridimensional a una relación proteína:polisacárido dada.

La inmunogenicidad de los conjugados de proteína:polisacárido preparados usando CDAP es significativamente mayor que la respuesta mostrada por cualquiera de los componentes no conjugados. Además, el anticuerpo que se produce es reactivo con la proteína sin conjugar, y la respuesta puede dispararse usando la proteína no conjugada así como la proteína conjugada. Esto sugiere que cualquier alteración química de la proteína durante la conjugación no tiene ningún efecto en detrimento de su capacidad para estimular a los anticuerpos con reactividad a la proteína nativa, ni tampoco en su capacidad para estimular células B con reactividad a la proteína no conjugada.

Adicionalmente, los polisacáridos activados con CDAP pueden usarse en la preparación para la conjugación de anticuerpos anti-Ig. Los conjugados de anti-Ig-dextrano inducen aproximadamente activación de células B 100 a 1000 veces mayor en comparación con Ig no conjugado. Los conjugados de anti-Ig-dextrano preparados usando conjugación directa con dextrano activado con CDAP son reactivos estimulantes de células B tan eficaces como los conjugados preparados usando otro acoplamiento por heterounión al dextrano AECM.

El CDAP es útil para preparar una diversidad de reactivos inmunológicos, tales como polisacáridos biotinilados para ELISA y antígenos de spot ELISA y TNP-polisacáridos (por ejemplo, TNP-dex, TNP-Ficoll) para modelar antígenos Ti- 2.

De esta forma, el método de la invención, que emplea CDAP para producir construcciones inmunogénicas tales como conjugados basados en polisacáridos ofrece muchas ventajas a la tecnología disponible actualmente para preparar construcciones inmunogénicas.

Claims (17)

1. Un método para producir una construcción inmunogénica, que comprende:

(a) activar al menos un primer resto que contiene carbohidrato, seleccionado entre el grupo compuesto por polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos, con un reactivo cianilado orgánico seleccionado entre el grupo compuesto por tetrafluoroborato de 1-ciano-4-(dimetilamino)- piridinio, tetrafluoroborato de N-cianotrietilamionio, y p-nitrofenilcianato, para formar un carbohidrato activado

(b) derivatizar un segundo resto seleccionado entre el grupo compuesto por proteínas, péptidos, y haptenos con un tiol o un grupo nucleófilo de hidrazida, y

(c) acoplar dicho carbohidrato activado directa o indirectamente al segundo resto derivatizado para formar una construcción inmunogénica capaz de estimular una respuesta inmune.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho reactivo orgánico cianilado es tetrafluoroborato de 1-ciano-4-(dimetilamino-piridinio).

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho primer y segundo resto son solubles en agua.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicha activación se realiza a un pH de 8 a 10, y dicho acoplamiento se realiza a un pH de 7 a 9.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicha activación se realiza en presencia de trietilamina.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el acoplamiento se hace de forma indirecta uniendo covalentemente el primer resto a un reactivo espaciador bifuncional o heterofuncional, y uniendo covalentemente el segundo resto derivatizado al reactivo espaciador.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho reactivo espaciador se selecciona entre el grupo compuesto por: etilendiamina, 1,6-hexano diamina, dihidrazida adípica, cistamina, glicina, y lisina.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el primer resto es un polisacárido y el segundo resto es una proteína.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde el polisacárido se selecciona entre el grupo compuesto por dextrano, polisacárico pneumocócico, polisacárido de Haemophilus influenzae, polisacárico estreptocócico del Grupo A, polisacárico estreptocócico del Grupo B, y polisacárido de N. meningitidis.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde en primer resto es un polisacárido viral o bacteriano soluble en agua.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el segundo resto en una proteína soluble en agua.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el segundo resto se selecciona entre el grupo compuesto por albúmina de suero bovino, toxina pertussis, toxina del tétanos, péptido derivado de la malaria, un anticuerpo, una toxina, y una lipoproteína.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la construcción inmunogénica es un conjugado seleccionado entre el grupo compuesto por Pt-Pn, PT-PRP, lT-Pn, anticuerpo-dextrano, y péptido-TT-Pn.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho grupo nucleófilo es un grupo hidrazida.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho acoplamiento se realiza con un pH menor de aproximadamente 8.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho acoplamiento se realiza con un pH menor de aproximadamente 8.

\newpage

17. Un método para preparar una vacuna que comprende las etapas de producir una construcción inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y combinar la construcción obtenida con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar una forma para la administración correcta al paciente.