ES2200153T3

ES2200153T3 - Control de fermentacion.

Info

Publication number: ES2200153T3
Application number: ES97906306T
Authority: ES
Inventors: David John Delta Biotechnology Ltd. MEAD; Hendrik Delta Biotechnology Ltd. VAN URK
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2017-03-12
Also published as: EP0889949B1; ATE241695T1; KR19990087465A; DE69722391D1; AU702567B2; AU2104397A; DE69722391T2; CA2242323C; PT889949E; JP2000506387A; EP0889949A1; DK0889949T3; KR100447374B1; CA2242323A1; US6150133A; WO1997033973A1; JP4318751B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE CULTIVO DE UN MICROORGANISMO EN UN MEDIO DE CULTIVO, EN EL CUAL SE CONTROLA LA ADICION DE MEDIO DE ALIMENTACION UTILIZANDO LA PRODUCCION DE UN SUBPRODUCTO COMO MEDIDA DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO. DICHO SUBPRODUCTO ES UN METABOLITO CARGADO ELECTRICAMENTE, PRODUCIDO POR EL MICROORGANISMO Y LA PRODUCCION DEL MISMO SE MIDE A TRAVES DE LA MEDICION DE LA CONDUCTANCIA DEL MEDIO DE CULTIVO. EL METABOLITO PUEDE SE ACETATO, Y EL MICROORGANISMO PUEDE SER LEVADURA, QUE SE TRANSFORMA MEDIANTE INGENIERIA GENETICA PARA PRODUCIR UN POLIPEPTIDO DESEADO.

Description

Control de fermentación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al control de los procesos de fermentación con alimentación por lotes o continuada. En los procesos de fermentación en los que se requiere una biomasa máxima o la acumulación de ácidos como el ácido acético podría ser tóxica o perjudicial para el producto, la presencia de dichos ácidos no es deseable.

Antecedentes y técnica anterior

El control correcto de la velocidad de adición del medio a los procesos de fermentación en los que la acumulación de metabolitos se debe prevenir es un objetivo primordial. Algunos microorganismos producen metabolitos no deseados cuando se alimentan a una velocidad de adición demasiado alta o media. Como ejemplos se citan la levadura de Baker y Escherichia coli (De Deken, 1966; Doelle, 1981). La levadura de Baker producirá productos de fermentación como etanol y acetato cuando se añade demasiado azúcar (Fiechter y cols., 1981). Durante la producción de la levadura de Baker se producirá por este mecanismo una pérdida de células y del rendimiento de la producción (Fiechter y cols., 1981). La bacteria E. coli producirá ácidos como ácido acético en presencia de un exceso de azúcar (Doelle, 1981). Tampoco es deseable la formación de estos metabolitos cuando se usan los microorganismos para la producción de productos heterólogos, en especial cuando tienen un efecto tóxico o inhibitorio. Acetato, etanol y los ácidos orgánicos en general pueden ser tóxicos para el metabolismo celular (Moon, 1983; Pampulha y Loureiro-Dias, 1989). Este efecto será particularmente evidente cuando crezcan cepas mutantes, que a menudo son menos robustas que las cepas de tipo salvaje. Por lo tanto, es deseable un buen control de la velocidad de adición del alimento en el proceso de fermentación con alimentación por lotes o continuada.

Son posibles muchos tipos de control informático en línea. Por ejemplo, a menudo se analizan en línea las velocidades de evolución del CO_{2} y de consumo de O_{2} para calcular el llamado Cociente Respiratorio (CR) (Wang y cols., 1977). El CR es la velocidad de evolución del CO_{2} dividida por la velocidad del consumo de O_{2}. En condiciones en que se limite el azúcar, el CR será aproximadamente 1,0 a 1,1, dependiendo su valor exacto de cada cepa. No obstante, cuando un cultivo de levadura de Baker se alimenta con una velocidad de adición de azúcar demasiado alta se producirá etanol y el valor de CR será en ese caso significativamente mayor de 1,1 (Wang y cols., 1977; Fiechter y cols., 1981). Este mecanismo se puede usar para cambiar la velocidad de alimentación de forma que disminuya el CR (Wang y cols., 1977).

En la patente EP 283 726 (Hitachi) y Turner y cols. (1994) revelan el control de fermentaciones monitorizando las concentraciones de acetato, pero se pudo conseguir el control tomando muestras del medio y usando HPLC o métodos discontinuos similares. También se ha usado HPLC para medir las concentraciones de glucosa para controlar la acumulación de acetato (Sakamoto y cols., 1994).

El problema que se soluciona con la presente invención es proporcionar un método alternativo y mejorado para controlar dichas fermentaciones.

Un aspecto de la presente invención proporciona un proceso para cultivar un microorganismo en un medio de cultivo en el que el proceso de adición del medio de alimentación se controla usando la producción de un subproducto como medición de las condiciones de cultivo, caracterizado por que el subproducto sea un metabolito no deseado cargado eléctricamente producido por el microorganismo, y en el que la producción del metabolito se monitoriza midiendo la conductancia del medio de cultivo.

La evolución de los metabolitos con carga eléctrica no se ha usado previamente para controlar la adición del medio de alimentación. El CR, por ejemplo, es de 1 (uno) cuando se produce acetato en una fermentación de azúcar, por lo que la medición del CR no es útil ya que su valor es cercano al obtenido durante el crecimiento con limitación de azúcar. Se ha utilizado la conductividad eléctrica para medir la formación de cantidades relativamente grandes de los ácidos orgánicos deseados, como lactato en los cultivos de yogur y otras fermentaciones de lactobacilus (Latrille y cols., 1992; Belfares y cols., 1993), la producción de ácido acético (SU-A-1 495 367) y el control del contenido de sal en los cultivos con fermentación (Soyez y cols., 1983). En este último caso se añadieron sales inorgánicas al medio y la técnica mide simplemente las sales añadidas artificialmente para mantener una concentración deseada de la sal. También se ha usado la conductividad para medir la densidad celular (JP-A-2 109 973), pero no se ha usado para prevenir y superar la acumulación de los ácidos no deseados como el acetato, del que incluso pequeñas cantidades son indicadoras de que la fermentación se está torciendo. Hemos descubierto que cuando no se desea la formación de los ácidos orgánicos como acetato, se puede medir el incremento de la conductividad eléctrica en línea y usarse para un sistema de retroalimentación que controle la velocidad de alimentación de forma similar que el CR. En esta invención se demuestra que el incremento de la señal de conductividad eléctrica en línea durante el proceso de fermentación es lo suficientemente indicadora de la formación de los ácidos no deseables como para usarse para corregir la velocidad de adición de alimento para prevenir y superar la acumulación de estos ácidos. En consecuencia, aunque durante muchos años se ha conocido que mide (en una determinación bioquímica en línea) la producción de acetato para ver si el control de la fermentación basado en otros parámetros (como la evolución del CO_{2}) se comporta de forma satisfactoria (véase EP 315 944, 1989), nadie había medido la evolución del acetato eléctricamente para controlar la fermentación.

Obviamente, es deseable el microorganismo y el medio de fermentación deberían ser tales que se produjera potencialmente un metabolito con carga eléctrica y la fermentación debería ser aquella en la que se controlase el medio de alimentación. Igualmente, la fermentación no debería ser una en la que se desea el producto de carga eléctrica, por ejemplo, la fermentación de ácido láctico. Los microorganismos para los que la presente invención es útil incluyen bacterias como E. coli o Bacilos y hongos como levaduras, por ejemplo Saccharomyces spp., especialmente S. cerevisiae u hongos filamentosos. No obstante, la invención es en principio aplicable también al cultivo de protozoos, células vegetales y células animales, por ejemplo células de insectos o células de mamíferos como las células CHO (Chinese Hamster Ovary).

El metabolito es típicamente un ácido orgánico como acetato, piruvato, lactato o un producto intermedio del ciclo del ácido cítrico como citrato, isocitrato, \alpha-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato u oxaloacetato.

El microorganismo se puede cultivar para producir biomasa, un metabolito deseado o un polipéptido que sea nativo o heterólogo para el microorganismo. En consecuencia, por ejemplo, el microorganismo puede ser una levadura que contenga y exprese un polinucleótido que codifica albúmina humana. Como ventaja, el polipéptido se segrega a partir de la levadura en el medio circundante desde el cual se recupera.

La medición de la conductividad es muy sensible y puede detectar las concentraciones de ácido tan bajas como
1 mM. Esto significa que es una alternativa útil, o añadida, al uso aceptado generalmente de las mediciones del CR en línea.

El control se puede conseguir usando una sonda capaz de medir la conductividad, insertado en un fermentador y uniendo la señal a un ordenador en línea. Una sonda de conductividad puede insertarse muy sencillamente en un acceso de sonda de pH estándar. Un algoritmo informático puede calcular entonces el cambio de conductividad o conductancia en un periodo de tiempo elegido. Si el cambio de conductividad es mayor que el límite elegido, el algoritmo informático aplicará automáticamente la reducción de la velocidad de adición del medio de alimentación. A su vez, este paso favorecerá el consumo simultáneo del sustrato de alimento y de los metabolitos acumulados presentes y prevendrá su producción posterior. La elección del marco de tiempo y del límite del cambio de la conductividad dependerá de la naturaleza exacta del proceso de fermentación.

Descripción detallada de la invención

Los aspectos preferidos de la invención se describirán a continuación a modo de ejemplo y con respecto a los dibujos acompañantes, en los cuales:

La Figura 1 es una representación de algunos parámetros clave durante la fermentación con alimentación por lotes de una cepa de levadura productora de albúmina recombinante humana. Los puntos en los que comenzó y terminó la adición del alimento están indicados por flechas.

La Figura 2 muestra los parámetros de parte de una fermentación con alimentación por lotes durante la cual, en el momento indicado, se aplicó un incremento súbito y deliberado del 20% de la velocidad de alimentación.

La Figura 3 es un experimento similar al que se muestra en la Figura 2; no obstante, en este caso se aplicó un incremento de parada del 40% a la velocidad de adición del alimento.

La Figura 4 es un diagrama de flujo simplificado de un algoritmo de control típico de la velocidad de alimentación usando una señal de conductancia eléctrica, que se usó en el experimento usado en la Figura 5.

La Figura 5 es la representación de algunos parámetros en un experimento durante el cual el factor exponencial K se fijó en 0,12 h^{-1} que es mayor que el valor habitual de 0,07 h^{-1} para esta cepa de levadura. Durante el experimento, el algoritmo que usa la señal de conductancia, cuyo diagrama de flujo se muestra en la Figura 4, estaba activo.

La Figura 6 muestra algunos parámetros de un experimento con la cepa bacteriana de E. coli DH5\alpha en el cual el algoritmo de control de conductancia que se muestra en la Figura 4 estaba activo. El factor K se fijó en 0,4 h^{-1} en este experimento. Normalmente se habría usado un factor de 0,11 h^{-1} (Riesenberg y cols., 1991).

La Figura 7 muestra algunos parámetros de un experimento con la cepa bacteriana de E. coli DH5\alpha en el que la velocidad de alimentación se aumentó manualmente en tres pasos (21,3-22,3 h) y después se controló con un algoritmo similar al descrito en la Figura 4 pero modificado como se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 8 es una representación esquemática de un fermentador adecuado para el uso en el proceso de la invención.

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Ejemplo 1 La conductancia eléctrica durante una fermentación normal con alimentación por lotes

Para determinar la tendencia normal de la conductancia eléctrica durante una fermentación con alimentación por lotes (Figura 1), monitorizamos la conductancia con un ordenador de control de la fermentación unido a un Biomass Monitor 214A de Aber Instruments (Aberystwyth, UK) con una sonda de capacitancia de Aber Instruments. La señal de conductancia tenía ruido debido a la aireación del fermentador. Por lo tanto, la conductancia tenía que ser filtrada eléctricamente usando el filtro suministrado número 2 en el Biomass Monitor 214A. Como alternativa se pueden usar otras sondas y monitores de conductividad siempre y cuando la señal se filtre adecuadamente para suavizar la señal del ruido. Tal configuración puede conseguirse por la sonda de conductividad Broadley James (de FT Applikon) unido a un monitor MCD43 (LTH Electronics) que usa un filtro de 3 min. Todos los datos de la Figura 1 se promedian a lo largo de 10 min (debido a las limitaciones de almacenamiento de datos del ordenador de control de la fermentación).

La fermentación se realizó según describen Clarke y cols. (1990), cita que se incorpora como referencia. Esencialmente, la fermentación fue la siguiente.

La fermentación se basó en una levadura transformada para expresar albúmina humana recombinante (rHA). La estrategia de clonación para la construcción de la levadura fue la que se revela en la patente EP 431 880.

Para preparar soluciones madre activas (banco de células de trabajo del fabricante) de la levadura del proceso adecuada para la preparación de cultivos en matraces de agitación por congelación de alícuotas del cultivo en presencia de trehalosa al 20% (p/v) se usó un cultivo de células madre a granel en un medio líquido definido (Medio con sales Buffered Minimal Medium (BMM): base nitrogenada de levadura [sin aminoácidos y (NH_{4})_{2}SO_{4}, Difco], 1,7 g/l; ácido cítrico monohidrato 6,09 g/l; Na_{2}HPO_{4} anhidro, 20,16 g/l; pH 6,5\pm0,2; (NH_{4})_{2}SO_{4}, 5 g/l; se añade sacarosa hasta
20 g/l)

Cultivo en matraces de agitación

La levadura [cirº, pAYE316] se hizo crecer como un cultivo axenic fisiológicamente adecuado para la inoculación del vaso de siembra. Si el momento del vaso de siembra debe ser reproducible, es necesario definir la fase de crecimiento (exceso primario de carbohidratos) y la biomasa del inóculo (12 \pm 2 mg/l que requiere un inóculo de 100 ml por 10 litros de medio). Un vial madre se inoculó en un matraz de agitación que contenía 100 ml de BMM + 2% (p/v) de sacarosa y el matraz se incubó a 30ºC en un agitador orbital (200 rpm, revoluciones por minuto) hasta que se obtuvo un peso celular seco (cdw) de 0,6-1,2 g/l (evaluado por densidad óptica a 600 nm). Este cultivo se usó a continuación para inocular un vaso de fermentación de siempre hasta un nivel de 12 \pm 2 mg/l.

Fermentación de siembra

El inóculo para la producción principal se obtuvo por crecimiento del microorganismo de producción, preferiblemente S. cerevisiae [cirº, pAYE316], en un fermentador de siembra hasta un peso celular seco alto de aproximadamente 100 g/l. Se siguió una pauta de alimentación por lotes de forma que se minimizara la acumulación de etanol y acetato y, con ello, se aumentara al máximo el rendimiento celular. El conjunto de cada fermentación se monitorizó y controló con un sistema informático de control, como el programa Multi-Fermenter Computer System (MFCS) disponible en B. Braun (Alemania). El programa suministrado por B. Braun es de tipo Supervisory Control and Data Acquisition Package; otras compañías disponen de paquetes similares. El algoritmo tiene como objetivo controlar la adición de sacarosa de forma que la biomasa máxima se alcance evitando el efecto de pinza de cangrejo, minimizando así la producción de etanol o acetato. El vaso de fermentación estaba sujeto a un lavado con NaOH caliente y aclarado con agua libre de pirógenos (PFW). El vaso esterilizado por calor contenía un volumen de medio estéril MW10
(Tabla 1) con sales de lote más oligoelementos. En la Tabla 2 se indica un medio alternativo. Claramente, la conductividad inicial variará de acuerdo a la composición del medio. El medio para filtración de rHA se puede ultrafiltrar (límite de peso molecular 10.000) para eliminar las endotoxinas.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

Medio MW10
Componentes	Medio del lote	Medio de alimentación
Sales
KH_{2}PO_{4}	2,74 g/l	10,9 g/l
MgSO_{4}, 7 H_{2}O	0,58 g/l	2,3 g/l
CaCl_{2}, 2 H_{2}O	0,06 g/l	0,24 g/l
H_{3}PO_{4}(85% en peso)	0,88 ml/l	1,76 ml/l
Vitaminas
Pantotenato cálcico	20 mg/l	180 mg/l
Ácido nicotínico	33,3 mg/l	300 mg/l
m-inositol	20 mg/l	180 mg/l
d-biotina	0,133 m g/l	0,8 m g/l
Tiamina.HCl	16 mg/l	32 mg/l
Reserva de oligoelementos	10 ml/l	20 ml/l
Sacarosa	0*	500 g/l
Componentes de la reserva de oligoelementos
ZnSO_{4}. 7 H_{2}O	3 g/l
FeSO_{4}. 7 H_{2}O	10 g/l
MnSO_{4}. 4 H_{2}O	3,2 g/l
CuSO_{4}. 5 H_{2}O	0,079 g/l
H_{3}BO_{3}	1,5 g/l
KI	0,2 g/l
Na_{2}MoO_{4}. 2 H_{2}O	0,5 g/l
CoCl_{2}. 6 H_{2}O	0,56 g/l
Los oligoelementos se añadieron en agua desmineralizada y se acidificó con 35 ml/l de H_{2}SO_{4} al 98%. *Se
añadieron 20 g Sacarosa/l al medio del lote en la etapa del fermentador de siembra del 20 l. Se puede usar
cualquier método conveniente de esterilización, como puede usarse cualquier método de despirogenado,
como la ultrafiltración por ejemplo. Las vitaminas siempre se esterilizaron por filtración.

TABLA 2

Medio MW11D
Componentes	Medio del lote	Medio de alimentación
Sales
KH_{2}PO_{4}	4,66 g/l	9,54 g/l
MgSO_{4}, 7 H_{2}O	2,02 g/l	2,02 g/l
CaCl_{2}, 2 H_{2}O	0,10 g/l	0,21 g/l
H_{3}PO_{4} (85% p/p)	1,63 g/l	3,33 g/l
Vitaminas
Pantotenato cálcico	68 mg/l	140 mg/l
Ácido nicotínico	114 mg/l	233 mg/l1
m-Inositol	68 mg/l	140 mg/l
d-biotina	0,34 mg/l	0,70 mg/l
Tiamina.HCl	17,1 mg/l	35 mg/l
Reserva de oligoelementos	10,2 ml/l	21 ml/l
Sacarosa	0*	500 g/l
Componentes de la reserva de oligoelementos
ZnSO_{4}, 7 H_{2}O	3 g/l
FeSO_{4}, 7 H_{2}O	10 g/l
MnSO_{4}, 4 H_{2}O	3,2 g/l
CUSO_{4}, 5 H_{2}O	0,079 g/l
Na_{2}MoO_{4}, 5 H_{2}O	0,5 g/l
CoCl_{2}, 6 H_{2}O	0,56 g/l
Los oligoelementos se añadieron en agua desmineralizada y se acidificó con 35 ml/l de H_{2}SO_{4} al 98%. *Se
añadieron 20 g Sacarosa/l al medio del lote en la etapa del fermentador de siembra del 20 l. Se puede usar
cualquier método conveniente de esterilización, como puede usarse cualquier método de despirogenado,
como la ultrafiltración por ejemplo. Las vitaminas siempre se esterilizaron por filtración.

Después de añadir el medio al vaso, la temperatura de trabajo se fijó en 30ºC y también se fijó la velocidad mínima del agitador, típicamente 400-500 rpm. El pH inicial se ajustó con solución de amoniaco (densidad específica 0,901) usando un controlador de pH configurado a pH 5,7 \pm 0,2. También se usó H_{2}SO_{4} 2 M como agente corrector del pH. Al vaso se añadieron también sacarosa hasta 20 g/l, vitaminas del lote MW10 y antiespuma Breox FMT30 hasta
0,04 g/l.

El aire filtrado estéril se introdujo en el vaso a una velocidad de 0,5 vvm (es decir, 0,5 litros de aire no comprimido por litro de medio y minuto), el medio se inoculó hasta 12 \pm 2 mg de peso de células secas L^{-1} a partir de un cultivo axenic en matraces de agitación y se puso en marcha el sistema informático MFCS. Después de completar la fase de crecimiento del lote (señalizada por un incremento de la tensión de oxígeno disuelto de > 15% en 30 min) dio comienzo la adición del medio de alimentación bajo el control del sistema MFCS. La estrategia de control fue, efectivamente, la misma que se describe más adelante para el fermentador de producción. Durante la fermentación el flujo de aire aumentó en dos etapas para mantener un flujo de aproximadamente 1 vvm. Se añadió de nuevo Breox FMT30 hasta una concentración final de 0,3 g/l. La tensión de oxígeno disuelto (DOT) se controló con una saturación de aire del 20% cambiando la velocidad del agitador. Una vez que dicha velocidad del agitador pudo aumentar más y la velocidad del flujo de aire alcanzó su valor máximo, el algoritmo de control de la alimentación (véase más adelante) controló la velocidad de alimentación de forma que la DOT no disminuyese por debajo del 15% para prevenir las condiciones limitadas de oxígeno que, de otro modo, podrían llevar a la formación de productos de fermentación.

También se usó el CR como información de retorno del control de adición de alimentación. La velocidad de alimentación se redujo cada 10 min mientras que el CR fuese \geq 1,2. Además, se calculó un CR medio a 120 min (CRMED_{120}) para filtrar la señal de ruido del CR (Goodey y cols., 1996). La velocidad de alimentación se redujo una vez cada dos horas en un 20% del valor de CRMED_{120} \geq1,13. Debido a un valor de CR alto esperado al inicio de la fermentación, este control de CRMED_{120} no se realizó durante las primeras 4 horas de la fase de adición del alimento. Al final de la alimentación, el cultivo se transfirió a un vaso de producción.

Fermentación de producción

El fermentador de producción (Figura 8) se inoculó con el crecimiento de cultivo en el fermentador de siembra (véase más arriba). La concentración del peso seco de las células (CDW) en el fermentador de siembra fue normalmente mayor de 80 g/l. La concentración del CDW en el fermentador de producción inmediatamente después de la transferencia del segundo cultivo en el fermentador fue de 0,25-1,00 g/l. Aunque se prefiere iniciar la alimentación antes de una hora, se puede retrasar si es necesario. La pauta de alimentación tenía como objetivo minimizar la acumulación de etanol y acetato, de forma que se optimizara al máximo el rendimiento de células y producto.

La fermentación se realizó en un fermentador como el que se muestra en la Fig. 8, diseñado para dar una disolución del gas y mezclado a granel óptimos. El fermentador estaba equipado con accesos para, entre otros componentes, suministrar el medio de alimentación, extraer el medio al final de la fermentación e introducción de una sonda para medir la conductancia eléctrica. El vaso, que estaba sujeto a un lavado caliente con NaOH y aclarado con agua libre de pirógenos, contenía un volumen de MW10 estéril (Tabla 1), sales de lote y oligoelementos. Este medio se esterilizó independientemente del vaso, utilizando esterilización por calor o por filtración. Se ha encontrado, de acuerdo con la presente invención, que es una ventaja para el medio de fermentación, como MW10, carecer de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), o una de sus sales, ya que su presencia da lugar a un grado significativamente alto de contaminantes de color en la albúmina producida.

La temperatura de trabajo se fijó a 30ºC, y la velocidad del agitador se reguló de forma que fuera suficiente para mantener una solución homogénea, típicamente aproximadamente 50 rpm. El pH inicial se ajustó con solución de amoniaco (SG 0,901) (controlador fijado a 5,7 \pm 0,2). Se puede usar H_{2}SO_{4} 2M como segundo agente corrector del pH. Se añadieron las vitaminas de lote de medio MW10, al igual que un antiespuma adecuado, según necesidades (como Breox FMT30 hasta 0,4 g/l). Cuando comenzó la alimentación, el control de anulación del CR estaba desactivado hasta que los valores OUR y CER eran suficientemente altos como para hacer un control eficaz; la velocidad de alimentación se redujo manualmente durante este periodo si el CR era sistemáticamente > 1,2.

El pH del cultivo se mantuvo constante a 5,5 mediante la adición automática de amoniaco al 17% (p/v). La temperatura se mantuvo a 30ºC. El flujo de aire estéril se introdujo a 0,5 vvm. Durante la fermentación, el flujo de aire aumentó en tres pasos para mantener un flujo de aproximadamente 1 vvm. Su intensidad se midió con un análisis espectrométrico de masas continuo (analizador de gas Fisons VG). La fermentación se efectuó como se ha descrito anteriormente. También la presión en el fermentador aumentó durante la fermentación hasta aproximadamente 0,5 bar g usando un controlador de presión de Brooks.

La velocidad de alimentación se inició a una velocidad de alimentación, FR_{start}, que era necesaria para alcanzar una velocidad de crecimiento de aproximadamente 0,07 h^{-1}. Después, la velocidad de alimentación aumentó, mediante el control informático, de acuerdo con el algoritmo:

FR = FR_{start} EXP(K*Contador)

Donde: FR: velocidad de alimentación (ml.min^{-1})

K: la constante exponencial que se mantuvo en 0,07

Contador: una variable de contador que comenzaba en 0 y que aumentaba en 0,0167 una vez por min. Sin embargo, la variable del contador disminuía:

a. en 0,0167 una vez por min si la tensión de oxígeno disuelto (DOT) era menor del 15%.

b. en 0,333 una vez cada 10 min mientras el CR \geq 1,2.

c. en 0,223/K (dando lugar a una disminución del 20% de la velocidad de alimentación) una vez cada dos horas mientras CRMED_{120} \geq 1,13 si la adición del alimento había comenzado hace más de 4 h.

El resultado de dicha fermentación se muestra en la Figura 1. Se puede concluir que la tendencia de conductancia en general adoptaba una tendencia descendente durante el curso de la fermentación con alimentación por lotes.

Ejemplo 2 Conductancia eléctrica durante una fase en la que la velocidad de alimentación aumentó bruscamente en un 20%

Para establecer el uso de la señal de conductancia en la prevención y corrección de la acumulación de acetato, se aplicó un incremento brusco deliberado de la velocidad de alimentación del 20% en alguna etapa de una fermentación con carbono limitado y con alimentación por lotes similar a la que se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se demuestra que la conductancia aumentó significativamente durante el periodo en el que se aplicó una sobrealimentación. De hecho, el CR, un parámetro que se usa a menudo para el control de la producción de la levadura de Baker, no mostró ningún incremento significativo. Esto demuestra la utilidad de la señal de conductancia porque la producción de acetato no es deseada durante la producción de la levadura de Baker. El incremento de la conductancia se correlacionó con un incremento de la concentración de acetato en el cultivo, tal como se valoró en las muestras de cultivo. El acetato se valoró usando un kit de determinación enzimático Nº 148 261 de Boehringer Mannheim.

Ejemplo 3 Conductancia eléctrica durante una fase en la que la velocidad de alimentación aumentó bruscamente en el 40%

En un experimento similar al que se muestra en el Ejemplo 2 se aplicó un aumento brusco del 40% en la velocidad de alimentación (véase la Figura 3). Los efectos fueron más extremos que en el Ejemplo 2, como sería de esperar. También aumentó el CR. No obstante, no se alcanzó el valor de 1,2, que se usa típicamente como nivel para provocar la reducción de la velocidad de alimentación (véase el Ejemplo 2). De nuevo, se demuestra con ello que la conductancia es un parámetro de control físico más sensible que el CR.

Ejemplo 4 Uso de un algoritmo de control de la velocidad de alimentación que incorpora una conductancia eléctrica

En la Figura 4 se muestra un diagrama de flujo que representa el algoritmo de control de la adición de alimentación que se usó en este Ejemplo. La base era un algoritmo de control normal que se muestra en el Ejemplo 1. La condición en la que el incremento fijado del flujo o presión de aire previene que el control de alimentación de la conductancia se aplique durante 1 hora fue necesaria porque el incremento del flujo y presión de aire dará lugar a un pequeño incremento de la conductancia debido a cambios en el volumen de demora del gas.

Además, en comparación con el Ejemplo 1 se hicieron las siguientes adiciones al algoritmo de control de la velocidad de alimentación. El cambio de conductancia (\DeltaC en mS) se midió en un intervalo de tiempo de 30 min. Si la alimentación había comenzado en la última 1,5 h no se produciría ningún control de retroalimentación. Sin embargo, después de ello, en los casos en los que el incremento de \DeltaC fuese \geq 0,1 mS sobre el intervalo de tiempo elegido, se produciría una reducción automática de la velocidad de alimentación. El tamaño real de la reducción de la velocidad de alimentación se hizo dependiente del valor real de \DeltaC como sigue: FR_{reducido} = FR_{original} * (1 - \DeltaC). No se aplicaría ninguna reducción de la velocidad de alimentación si el CR es \leq 0,95 o si la diferencia en el CR_{30} (CR promedio durante 30 min) en un intervalo de tiempo de 20 min: CR30 - CR_{30\ hace\ 20\ min} <-0,025. Ambas condiciones indican que las levaduras ya estaban cometabolizando el sustrato del alimento y los productos de fermentación, aboliendo con ello la necesidad de reducir la velocidad de alimentación.

Se realizó un experimento en el que la constante exponencial K (véase el Ejemplo 1) se fijó a 0,12 h^{-1}, que es tan alto que se esperarían los productos de fermentación de la producción para esta cepa de levadura, que era la misma que en el Ejemplo 1. Esto se hizo para probar la acción del algoritmo de control como se demuestra en la Figura 4 que se ha explicado anteriormente. Los resultados se presentan en la Figura 5. La Figura muestra un incremento paulatino de la conductancia que se correlaciona con un incremento en la concentración de acetato. A las 2,3 h (edad del lote) se aplicó una reducción automática de la velocidad de alimentación. Esta, sin embargo, no fue suficiente y se aplicó otra reducción automática de la velocidad de alimentación a las 4,5 h (edad del lote). Después de ello, la concentración de acetato se redujo a 0 mM. A continuación, la concentración de acetato aumentó temporalmente con una edad de lote de 5 h, mientras que la conductancia estaba disminuyendo. Al mismo tiempo, es probable que se estuviese consumiendo un exceso de iones amonio, que se habrán añadido en el periodo de hasta 4,5 h (edad del lote) para el control del pH, a juzgar por los cambios de pH en el cultivo. Se sabe que los iones amonio conducen la electricidad mejor que los iones acetato (Owens, 1985), lo que explica el descenso global de la señal de conductancia. De nuevo, se produjo un pequeño pico en la concentración de acetato con una edad de lote de 6 h. En este caso, el incremento de la conductancia no fue suficiente para invocar una reducción de la velocidad de alimentación. Sin embargo, a juzgar por la reducción de la concentración de acetato subsiguiente, no fueron necesarias nuevas reducciones en la velocidad de alimentación.

Ejemplo 5 Uso de un algoritmo de control de la velocidad de alimentación que incorpora la conductancia eléctrica con la cepa bacteriana de E. coli

La cepa bacteriana Escherichia coli DH5\alpha se hizo crecer en un fermentador usando el medio descrito por Riesenberg y cols. (1991). Se usó el mismo algoritmo de control que en el Ejemplo 4. No obstante, el factor K se fijó a
0,4 h^{-1}. En la Figura 6 se muestra el resultado de la acción del algoritmo de control. Después de la acumulación de acetato, dos reducciones automáticas de la velocidad de alimentación dieron lugar a un descenso de acetato de 45 a 5 mM.

Este reto artificialmente alto para la fermentación demostró que el sistema actuaría incluso en condiciones extremas.

Ejemplo 6 Una nueva fermentación de E. coli

Esto representa un estímulo más realista (pero aún artificial) al equilibrio de la fermentación.

La cepa bacteriana E. coli DH5\alpha creció en un fermentador usando el método descrito por Riesenberg y cols. (1991). Se usó un control similar al del Ejemplo 4. No obstante, el factor K se fijó en 0,1 h^{-1}. En condiciones aerobias normales, con este valor no se provocaría la producción de aniones orgánicos. Después, entre una edad de lote de 21,3-22,3 h (véase la Figura 7) se incrementó la velocidad de alimentación manualmente en tres pasos. Después de esta intervención, la conductividad aumentó y la velocidad de alimentación se controló de acuerdo con el algoritmo descrito en la Figura 4 con las siguientes modificaciones. Se aplicó un paso de control una vez cada 10 min (ya que el incremento de la conductividad era muy paulatino) pero el tamaño de la reducción de la velocidad de alimentación fue un cuarto del descrito en la Figura 4. Por tanto, la fórmula para la velocidad de alimentación fue FR_{reducida} = FR_{original} (1-\DeltaC/4). Como se muestra en la Figura 7, así se controló la fermentación de forma que el acetato producido se consumió por las propias células. Este ejemplo muestra que los algoritmos de control se pueden optimizar por diferentes situaciones como diferentes microorganismos, velocidad de crecimiento y tipos de medio. "Breox" es una marca registrada.

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Claims

1. Un proceso de cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo en el que la adición de un medio de alimentación se controla usando la producción de un subproducto como medida de las condiciones de cultivo, caracterizado porque el subproducto es un metabolito con carga eléctrica producido por el microorganismo, la formación de cuyo metabolito no es deseable y porque la producción del metabolito se monitoriza midiendo la conductancia de un medio de cultivo.

2. Un proceso de cultivo de un microorganismo de acuerdo a la reivindicación 1; el proceso comprende los pasos de

(i) proporcionar un vaso de fermentación adaptado para contener un medio de fermentación y dicho microorganismo, teniendo el vaso un primer acceso para permitir el suministro de medio de alimentación al vaso, un medio de control para controlar la velocidad de dicha introducción del medio de alimentación, una sonda para medir la conductancia eléctrica del medio de fermentación, y un segundo acceso para permitir la extracción del medio de fermentación del vaso,

(ii) introduciendo dicho microorganismo y medio de fermentación en el vaso,

(iii) midiendo la conductancia eléctrica del medio de fermentación con dicha sonda a intervalos durante el curso de dicho proceso de cultivo, de forma que dicha sonda genera una serie de señales eléctricas que indican dicha conductancia eléctrica a los intervalos mencionados, y

(iv) suministrando dichas señales eléctricas a dichos medios de control para controlar dicho suministro de medio de alimentación, en los cuales, en respuesta a un valor indeseablemente alto de la conductancia del medio, se corrige el suministro del medio de alimentación.

3. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 2 en el cual dichos medios de control consisten en un ordenador que opera un algoritmo, incluyendo dicho algoritmo una comparación entre dicha señal de conductancia eléctrica medida y un valor predeterminado.

4. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 2 en el cual dichos medios de control consisten en un ordenador que opera un algoritmo, incluyendo dicho algoritmo un cálculo de un cambio de conductancia en un periodo dado, y una comparación de dicho cambio con un valor predeterminado.

5. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual el microorganismo es un hongo.

6. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 5 en el cual el hongo es una levadura.

7. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 6 en el cual la levadura es un Saccharomyces.

8. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el cual el microorganismo es E. coli.

9. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual el metabolito es un ácido orgánico.

10. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 9 en el cual el ácido orgánico es ácido acético.

11. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual el microorganismo produces un polipéptido que es heterólogo para el microorganismo.

12. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 11 en el cual el polipéptido es albúmina humana.

13. Un proceso para producir un material cultivando un microorganismo que produce el material y después recuperar ese material, que se caracteriza porque el cultivo se realiza de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.