ES2200405T3 - Procedimiento para prever, identificar y describir moleculas capaces de tener un comportamiento buscado principalmente en el campo de la farmacia y moleculas resultantes de dicho procedimiento. - Google Patents

Abstract

Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, caracterizado en que comprende: 1) prever una base de aprendizaje a partir de una familia de estructuras moleculares conocidas, compuesta por una parte por estructuras moleculares activas que presentan la actividad buscada, y por otra parte por estructuras moleculares inactivas que se conoce están desprovistas de la actividad, o que presentan una actividad débil, utilizando los descriptores apropiados; 2) generar filtros estáticos representativos de los intervalos de valores estructurales, fisicoquímicos, y moleculares a los que deben responder las moléculas para ser activas a partir de la base de aprendizaje; 3) efectuar un cribado de un banco combinatorio por medio de estos filtros estáticos; 4) someter las moléculas más prometedoras seleccionadas de esta manera a un filtro dinámico representativo de las restricciones de variación conformacional que deben respetar las moléculas para ser activas.

Description

Procedimiento para prever, identificar y describir moléculas capaces de tener un comportamiento buscado principalmente en el campo de la farmacia y moléculas resultantes de dicho procedimiento.

Esta invención se refiere a la modelización molecular.

Tiene por objeto un nuevo proceso que utiliza un cierto número de moléculas de partida, principalmente, pero no solamente, mediante química combinatoria virtual, para prever, identificar y describir moléculas susceptibles de presentar un comportamiento buscado, principalmente en el dominio farmacéutico.

Se dice que la búsqueda de nuevas moléculas activas, principalmente en el dominio farmacéutico, precisa de la síntesis de un gran número de moléculas, que habrá de ensayar in vitro o in vivo. En el mejor de los casos, sólo un pequeño número de estas moléculas se revelará activo.

Para intentar racionalizar la búsqueda de nuevas moléculas activas, se ha tenido la idea de recurrir a la modelización molecular utilizando bases de datos informatizadas. Los resultados obtenidos con las técnicas de este tipo que se conocen hasta la fecha, no son siempre satisfactorios, en particular a causa de una definición insuficiente de los parámetros y criterios de actividad.

Igualmente se conoce en el estado de la técnica la patente WO-9727559 que describe un procedimiento para seleccionar moléculas mediante la medición de la distancia entre dos descriptores, y mediante búsqueda en una biblioteca combinatoria virtual.

Se sabe también que el documento Yasri et al., "A rational choice of molecular dynamics simulation parameters through the use of the three-dimensional autocorrelation method: application to calmodulin flexibility study" Protein Engineering vol. 9, nº 11, noviembre, 1996, páginas 959-976, XP002078077, Inglaterra, Reino Unido, divulga la utilización de vectores de autocorrelación tridimensional como descriptores, la búsqueda en parcelas conformacionales, y la comparación de las simulaciones dinámicas de las moléculas.

La presente invención tiene por objetivo remediar, al menos en parte, estos inconvenientes.

Este objetivo se consigue según la invención, la cual ofrece un procedimiento para prever, identificar y describir moléculas que tengan un comportamiento buscado, procedimiento que se basa en el diseño asistido por ordenador, y en el cribado, igualmente asistido por ordenador, de bancos combinatorios virtuales. Este procedimiento utiliza diferentes descriptores topológicos, de forma, químicos, físicos, etc., en combinación con un análisis nuevo de las trayectorias de la dinámica molecular. El término "comportamiento" significa una "actividad" en el sentido biológico o farmacológico, cuando las moléculas conciernen a los sectores de aplicación farmacéutica, o una "propiedad" en el sentido fisicoquímico, cuando las moléculas conciernen a sectores de aplicación no farmacéuticos, por ejemplo, materiales tales como los polímeros.

Más precisamente, la invención tienen por objeto un procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el dominio farmacéutico, procedimiento que comprenden esencialmente las etapas sucesivas consistentes en:

1) desarrollar una base de aprendizaje, utilizando los descriptores apropiados, a partir de estructuras moleculares vecinas conocidas, compuestas por una parte por estructuras moleculares activas que se sabe presentan la actividad buscada, y por otra parte por estructuras moleculares inactivas que se sabe están desprovistas de esta actividad o que presentan una débil actividad buscada;

2) generar una serie de estructuras moleculares vecinas, principalmente mediante explosión combinatoria, a partir de la base de aprendizaje;

3) efectuar una cribado de las moléculas así generadas sobre la base del enriquecimiento, en términos de diversidad molecular, aportada por cada moléculas respecto a los descriptores escogidos;

4) someter las moléculas así retenidas a filtros estáticos representativos de las restricciones en las variaciones estructurales, fisicoquímicas, y moleculares a las que deben responder las moléculas para ser activas, y, eventualmente, sintetizar y ensayar las moléculas seleccionadas;

5) someter las moléculas más prometedoras así seleccionadas a un filtro dinámico representativo de los requisitos de variación conformacional que deben respetar las moléculas para ser activas;

6) sintetizar y ensayar las moléculas así seleccionadas;

7) si no se obtiene el resultado que se daba por descontado, o si sólo se obtiene parcialmente, repetir las etapas 3) a 6) modificando los filtros.

La invención concierne igualmente a una moléculas que no se sabía anteriormente que presentaba un comportamiento buscado, que se caracteriza en que ocupa un espacio conformacional idéntico o muy próximo al espacio conformacional de al menos una molécula de referencia, siendo la molécula de referencia conocida previamente por presentar el comportamiento buscado. La noción "muy próxima" se aprecia en función del conjunto de los espacios conformacionales correspondientes a las moléculas ensayadas. Por ejemplo, se considerarán "muy próximos" el 10% de los espacios conformacionales más cercanos al espacio conformacional de las moléculas de referencia.

Cuando el procedimiento se basa en una diversidad de moléculas de referencia, se considerará como "muy próximo" los espacios conformacionales de las moléculas de referencia.

Para realizar una base de aprendizaje se utilizan diversos descriptores que pueden ser todo tipo de propiedades cuantitativas y/o semicuantitativas. Por ejemplo, como es bien sabido por el especialista, a partir de la representación gráfica de una moléculas, en otros casos una representación en dos dimensiones, o la representación 2D, de un compuesto químico, se pueden deducir un conjunto de valores numéricos denominados "descriptores topológicos". Por otra parte, se pueden utilizar descriptores que reflejan ciertas propiedades fisicoquímicas, como por ejemplo, el carácter lipofílico, o lipofilia, que se expresa en forma de log P, siendo P el coeficiente de partición del compuesto considerado entre el agua y el n-octanol, o la refractividad molar. Por otra parte, se pueden utilizar descriptores numéricos representando formas moleculares.

Las técnicas utilizadas clásicamente en las correlaciones cuantitativas de estructura-actividad (Quantitative Structure Activity Relationships: QSAR) se basan en la hipótesis de que si una molécula presenta un comportamiento biológico determinado, todas las informaciones necesarias para caracterizarla se fundan fuertemente en su estructura, es decir, en sus átomos, sus enlaces, y sus formas. Contrariamente al paradigma QSAR lineal clásico en el que la actividad biológica puede expresarse en forma de una combinación lineal de los descriptores apropiados, la solicitud utiliza un paradigma de representación de informaciones o de mapado variable, no lineal, en el cual la actividad es una función no lineal de descriptores estructurales, topológicos y moleculares.

Según la invención, se analiza un conjunto de descriptores para las moléculas activas, en oposición a los compuestos inactivos, lo que permite la definición de filtros para diferenciar entre las dos clases de moléculas [G. Grassy et al., J. Mol. Graphics vol. 13, página 356 (1995)].

Si la muestra de aprendizaje corresponde a los ensayos in vivo, el juego de filtros describe las condiciones de actividad in vivo. En el caso de los ensayos in vitro, el juego de filtros describe las condiciones de actividad in vitro.

Un filtro se define por el rango de variación de un descriptor determinado para todos los compuestos activos conocidos, cuando se compara con el rango de variación del mismo descriptor para todos los compuestos inactivos conocidos.

Si el rango "activo" recubre totalmente el rango "inactivo", el filtro no sirve para nada, lo que viene a decir que la variación de este descriptor particular no tiene una relación con la actividad biológica.

Si el rango "activo" no recubre totalmente el rango "inactivo", toda molécula que presenta para este descriptor un valor que cae en una zona del rango "activo" que no recubre la zona "inactiva" tendrá una probabilidad elevada de ser también activa.

Las aptitudes para la predicción de este tipo de estrategia se mejoran mediante la utilización de varios filtros, preferentemente de 10 a 30, representando cada uno una forma diferente de cuantificar las propiedades estructurales y fisicoquímicas de una molécula.

Estos filtros, una vez establecidos, pueden utilizarse para cribar los compuestos virtuales generados durante una explosión combinatoria, es decir, todos los compuestos obtenidos por ejemplo, al añadir una lista de sustituyentes sobre partes predeterminadas de un núcleo estructural denominado sintón. Los compuestos más prometedores, a saber, aquéllos que satisfacen todos los requisitos definidos por los filtros, son rápidamente sintetizados mediante síntesis química o mediante generación genética, o aún por cualquier otro medio, y se ensayan en ensayos biológicos.

Las moléculas inactivas que se habían predicho como activas contienen características inexploradas que son determinantes para la actividad. Tales propiedades se utilizan para la definición de filtros adicionales y, después de varias repeticiones, el proceso de cribado virtual puede utilizarse para la identificación exacta de compuestos que presentan las propiedades buscadas.

En la práctica, a partir de estructuras de partida cuya actividad puede medirse in vitro y/o in vivo, se realiza una "base de aprendizaje" determinando los diferentes parámetros fisicoquímicos, estructurales y moleculares que permiten describir las moléculas activas y las moléculas inactivas.

Estos parámetros se representan bajo la forma de rangos de variaciones, o "restricciones", en función de las clases de actividad. Un juego o conjunto de restricciones define un filtro.

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La calidad de los descriptores escogidos se controla en términos de variabilidad, así como la elección de los descriptores a utilizar y la intercorrelación entre los descriptores retenidos.

Esto puede realizarse utilizando un programa concebido por R. Lahana, el programa ANODA (Analysis Of Data), que asocia a una quimioteca una "tarjeta de visita" sencilla en términos de descriptores de base y de análisis en componentes principales. Se aplican diferentes técnicas de selección de descriptores, tales como los análisis de variabilidad, de intercorrelación, de representatividad (regresiones, redes neuronales, algoritmos genéticos).

Se genera una explosión combinatoria a partir de la base de aprendizaje y tomando en consideración las condiciones de variación útiles para cada posición variable. Para hacer esto, es posible utilizar bases de datos de sustituyentes definidos por su estructura y los descriptores que se derivan.

La explosión combinatoria puede generarse utilizando el programa LEGION de la empresa TRIPOS, u otro programa concebido por R. Lahana, el programa COMBEX, el cual crea tal explosión a partir de un repartidor ("scaffold") o de una secuencia consenso, y de una lista de restricciones para cada uno de los puntos de sustitución. Un lenguaje de instrucciones del tipo SQL (lenguaje de preguntas estándar, Standard Query Language) permite combinar a voluntad todo tipo de condiciones de selección de sustituyentes.

Para cada combinación generada, es posible verificar el enriquecimiento en términos de diversidad molecular aportada por la molécula creada con respecto a los descriptores escogidos. Si este enriquecimiento es suficiente, la molécula se conserva, sino se rechaza.

El enriquecimiento en términos de diversidad molecular puede verificarse por medio de un programa concebido por R. Lahana, el programa DIVERSER, el cual permite efectuar una evaluación cuantitativa de la diversidad molecular presentada por una quimioteca cualquiera, incluso si las moléculas que la componen son altamente flexibles y si esta quimioteca es puramente virtual. Este programa permite comparar los bancos en términos de diversidad, caracterizar los "agujeros" de diversidad en un banco, concebir racionalmente bancos mínimos que tengan una diversidad máxima. Las técnicas de clasificación pueden ser, por ejemplo, la clasificación jerárquica (agrupaciones, clusters), las particiones, la concepción uniforme (diseño uniforme), las pruebas aleatorias, etc.

Los "filtros estáticos", es decir, aquéllos que no dependen de la variabilidad conformacional de las moléculas, describen los intervalos de los valores estructurales, fisicoquímicos, moleculares, a los que deben corresponder las moléculas a fin de ser activas. Utilizando estos filtros estáticos, se deducen las moléculas que tienen las mayores probabilidades de ser activas. Eventualmente, estas moléculas se sintetizan y ensayan para la actividad buscada.

En esta etapa, se puede utilizar un programa diseñado por G. Grassy, el programa VARIMAP, que establece filtros estáticos a partir de los descriptores obtenidos por TSAR, el cual es un programa comercializado por Oxford Molecular Group, Oxford (Reino Unido), y cuyos autores son G. Grassy y R. Lahana.

Los candidatos más prometedores seleccionados por medio de los filtros estáticos son sometidos inmediatamente a un filtro dinámico, es decir, representativo de las restricciones de variación conformacional que deben respetar las moléculas generadas para tener probabilidades de ser activas, por comparación con las de la base de aprendizaje.

Este filtrado dinámico puede efectuarse por medio de un programa nuevamente concebido por G. Grassy, el programa MULTIDYN, el cual permite, a partir de trayectorias de dinámica molecular, caracterizar los espacios conformacionales de cualesquiera moléculas. De este modo se ponen en evidencia las conformaciones bioactivas de las moléculas en cuestión.

Las moléculas retenidas son inmediatamente sintetizadas y ensayadas.

Si la actividad biológica hallada no responde, o sólo responde parcialmente, a los criterios considerados, las etapas de verificación del enriquecimiento en términos de diversidad molecular, de filtrado estático, de filtrado dinámico, de síntesis y de ensayo, se repiten.

Si se halla que las moléculas responden a los criterios biológicos establecidos, el objetivo se ha alcanzado.

El procedimiento según la invención permite por tanto definir nuevas moléculas activas mediante un proceso totalmente racional, sin utilizar en momento alguno una hipótesis sobre sus posibles mecanismos de acción, o sobre su receptor eventual.

El procedimiento según la invención ha sido puesto en práctica con éxito en los dominios de modulación farmacéutica de moléculas con objeto de mejorar las prestaciones de estas moléculas in vitro y, sobretodo, in vivo.

El ejemplo detallado de puesta en práctica que sigue sirve para ilustrar y explicar mejor la invención.

Ejemplo Obtención de nuevos compuestos inmuno-moduladores.

Se ha mostrado recientemente que el péptido 2702.75-84 (péptido derivado del HLA-B2702, aminoácidos 75 a 84) prolonga, en los ratones, la supervivencia después de un alo-transplante de corazón (Transplantation, vol. 59, p. 455 (1995)).

La administración del péptido 2702.75-84 a razón de 80 mg/kg/día durante 10 días después del transplante de corazones B6 en receptores CBA prolonga la supervivencia del alo-transplante de corazón hasta 11,4 2,6 (n = 8) días en comparación con los 8,2 1,2 días en los animales control no tratados (p < 0,01). No se ha observado ningún efecto sobre la supervivencia al transplante después de una terapia con el péptido 2702.75-84 en dosis inferiores.

La actividad in vivo de varios péptidos (n = 19) derivados del péptido 2702.75-84 y de otras secuencias MHC/HLA ha sido evaluada de forma similar. Los péptidos ensayados comprendían péptidos de aminoácidos de los tipos D y L. Ciertos péptidos diferían del péptido 270.75-84 en tan sólo seis posiciones de aminoácidos, otros tenían una secuencia invertida.

Todos estos péptidos, cuyas secuencias se representan en la Tabla 1 siguiente, han sido sintetizados utilizando la química F-moc/tBu, y se han ensayado a continuación.

Los estudios de respuesta a las dosis en ratones que han recibido un alo-transplante de corazón ha sido efectuados utilizando péptidos bajo la forma acetato, purificados a más del 90% mediante cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC).

El transplante cardíaco heterótropo abdominal se ha efectuado tal como se ha descrito previamente, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., vol. 7, p. 225 (1969).

Los ratones CBA receptores de corazones C57B1/6 ha sido tratados diariamente con diferentes dosis de péptido después del transplante del órgano. Los péptidos estaban disueltos en DMSO, y se han diluido en PBS (concentración final de DMSO del 10%) antes de su administración intraperitoneal. Los animales se han tratado a partir del día del transplante, hasta el noveno día. La supervivencia al transplante a sido controlada diariamente mediante palpación directa, y el rechazo se ha definido como el final de la contracción cardíaca palpable. La significación estadística de la prolongación de la supervivencia al alo-transplante de corazón ha sido calculada utilizando el test de Mann-Whitney.

La terapia de los receptores de corazón de ratones alo-transplantados con ciertos péptidos (n = 9; en negrita en la Tabla I siguiente) a permitido una prolongación significativa de la supervivencia al transplante, mientras que los otros no tuvieron efectos significativos.

Las estructuras de los péptidos utilizados y los resultados obtenidos se presentan en la Tabla I siguiente,

TABLA I

Secuencia peptídica	HLA/MHC	MST	SD
Sin tratar		7,5	1,1
RENLRIALRY	B2702	11,4	2,6
YRLAIRLNER	-	12,1	2,8
renlrialry	-	11,4	4,1
yrlairlner	-	13,2	2,7
RVNLRIALRY	-	11,5	0,5
YRLAIRLNVR	-	12,5	1,6
rvnlrialry	-	13,1	3,9
yrlairlnvr	-	12,2	2,9
NLRIALRYYW	-	11,6	1,3

TABLA I (continuación)

Secuencia peptídica	HLA/MHC	MST	SD
RVNLRTALRY	Kk	8,5	0,7
RVDLRTLLRY	Dk	7,0	0,5
RVDKRTLLGY	Kb	7,8	1,0
RVSLRNLLGY	Db	8,0	0,5
RESLRNLRGY	07	7,5	0,7
REDLRTLLRY	B2705	7,7	1,2
ENLRIALR	-	8,5	0,7
renlpialry	-	9,5	2,4
RVNLRTLRRY	E	8,0	0,5
RMNLQTLRGY	G	7,5	0,7

El conjunto de los 19 péptidos se ha utilizado como base de aprendizaje para definir la estrategia de diseño racional.

Aunque este conjunto de partida era muy pequeño, ha permitido, como lo demuestra la distinción inicial entre los compuestos activos y los compuestos inactivos,d una definición eficaz de los requisitos.

Inicialmente se han calculado 27 descriptores independientes de la conformación para cada péptido (consultar la Tabla II a continuación).

Los descriptores fisicoquímicos y topológicos ha sido generados por el programa TSAR V2.31 (Oxford Molecular Group, Oxford, Reino Unido).

Estos 27 descriptores comprendían el momento dipolar, calculado en base de una conformación totalmente desarrollada de cada péptido. El análisis estadístico a mostrado que 14 descriptores estaban intercorrelacionados. En consecuencia, no se han utilizado para la definición de restricciones que diferencian entre los péptidos activos y los inactivos. Los otros 13 descriptores, independientes de la conformación, ha sido utilizados para construir un filtro estático para el cribado de una biblioteca combinatoria virtual como la descrita más adelante.

TABLA II

Los 27 descriptores topológicos y fisicoquímicos utilizados
Propiedad	Naturaleza	Incluido/Excluido
Masa molar	Físico	Excluido
Volumen elipsoidal	Forma	Incluido
Volumen molecular	Forma	Incluido
Refractividad molar	Topológico	Incluido
Lipofilia (log P)	Topológico	Incluido
Kappa 1	Topológico	Excluido
Kappa 2	Topológico	Excluido
Kappa 3	Topológico	Excluido

TABLA II (continuación)

Los 27 descriptores topológicos y fisicoquímicos utilizados
Propiedad	Naturaleza	Incluido/Excluido
Kappa Alpha 1	Topológico	Excluido
Kappa Alpha 2	Topológico	Incluido
Kappa Alpha 3	Topológico	Excluido
Flexibilidad	Topológico	Incluido
Kier Chi V4	Topológico	Incluido
Índice Randic	Topológico	Excluido
Índice Balaban	Topológico	Incluido
Índice Wiener	Topológico	Excluido
La suma de estados E	Físico	Excluido
Momento dipolar	Físico	Incluido
Número de átomos de C	Químico	Excluido
Número de átomos de O	Químico	Incluido
Número de átomos de N	Químico	Incluido
Número de átomos de H	Químico	Excluido
Número total de átomos	Químico	Excluido
Número de grupos metilo	Químico	Excluido
Número de grupos etilo	Químico	Incluido
Número de grupos amino	Químico	Excluido
Número de grupos hidroxilo	Químico	Incluido

Los descriptores topológicos listados aquí arriba se han utilizado para calcular los filtros estáticos. Trece descriptores (en letra redonda) han proporcionado información sobre las características de los péptidos poseedores de una actividad inmuno- moduladora, y se han utilizado para definir las restricciones para cribar una biblioteca combinatoria virtual. Los otros catorce descriptores se ha revelado que están intercorrelacionados y se han excluido del análisis.

Utilizando el programa COMBEX (Synt:em, Nimes, Francia), se ha generado una explosión combinatoria basada en la secuencia consenso RXXXRXXXXY, derivada del conjunto de aprendizaje, después del alineamiento de todas las secuencias activas e inactivas. Esta secuencia ha dejado 7 posiciones, las posiciones representadas por "X", para efectuar mutaciones con objeto de crear una biblioteca.

Todas las moléculas se han generado utilizando la convención SMILES, convertidas después en una estructura 3D utilizando el programa CORINA (Oxford Molecular Group, Oxford, Reino Unido).

Inicialmente, los aminoácidos tanto naturales como no naturales estaban comprendidos en la base de datos de sustituyentes. Todos los aminoácidos estaban descritos en términos de propiedades fisicoquímicas (lipofilia, basicidad, aromaticidad, etc.), e igualmente por descriptores topológicos (análisis de Kier, índice Balaban, etc.). Utilizando 35 aminoácidos, esto condujo a 357 combinaciones, es decir, 64 mil millones de compuestos, lo que era todavía demasiado elevado para la capacidad del ordenador utilizado.

A fin de disminuir este número, se han tomado en consideración algunos datos suplementarios tales como la distribución de la lipofilia. De hecho, la estructura del compuesto "conductor" (2702.75-84) presentaba dos dominios lipofilos separados por residuos hidrófilos. Esto sugería que una distribución tal era importante para la actividad. A fin de respetar esta distribución, los solicitantes decidieron utilizar, para cada una de las 7 posiciones, la siguiente lista de aminoácidos: V, I, T, W, L, nL (nL = norleucina). De este modo, el número de compuestos de la biblioteca se estableció en 67 combinaciones, es decir, 279.936 compuestos.

Para cribar la biblioteca combinatoria virtual, se ha calculado "al vuelo", para cada estructura generada por el programa COMBEX, el correspondiente conjunto de propiedades. Estas propiedades se han analizado utilizando los filtros estáticos y los filtros dinámicos predefinidos, basados en las restricciones, y se han retenido los compuestos que satisfacían todas los requisitos.

Los filtros estáticos, obtenidos a partir de los rangos de variación de los descriptores retenidos, se basaban en el conjunto de restricciones independientes de la conformación definido utilizando el conjunto de aprendizaje de compuestos activos e inactivos. Se han obtenido utilizando el programa VARIMAP (Synt:em, Nimes, Francia).

Cribando la biblioteca de 279.936 compuestos con los filtros estáticos, se han identificado 26 péptidos que satisfacían todos los requisitos. Por medio de éstos, se han estudiado los péptidos desde el punto de vista de sus espacios conformacionales (filtro dinámico), y en particular se han estudiado 5, denominados respectivamente RDP1257, RDP1258, RDP1259, RDP1271 y RDP1277.

El carácter flexible de los péptidos se ha analizado utilizando simulaciones de dinámica molecular (MD).

Las simulaciones de MD de los péptidos solvatados con condiciones periódicas se han efectuado utilizando el programa AMBER 4.1 (Oxford Molecular Group, Oxford, Reino Unido). Se utilizó una duración de 1015 ps para cada péptido solvatado. La constante dieléctrica se ha calibrado a la unidad. La temperatura del sistema se ha llevado inicialmente de forma progresiva de 10 a 300 K, durante un período de 15 ps. Durante la simulación, se ha mantenido una temperatura constante de 300 \pm 10 K acoplando un baño exterior con un duración de relajación de 0,1 ps. El "paso" temporal escogido fue de 1 fs. El tiempo de cálculo era aproximadamente de 0,5 horas por ps. Se ha utilizado un corte "basado en los residuos" de 10 Angstroms para todas las interacciones no unidas. La lista de pares no unidos se ha actualizado cada 10 fs, y las coordenadas se han recogido cada ps durante las trayectorias, lo que da un conjunto de 1015 conformaciones para cada trayectoria. En todas las trayectorias, no se ha aplicado restricción alguna a los átomos, y no se ha utilizado ningún "término parásito" en la expresión de la energía.

Cada conformación se ha representado mediante un descriptor de forma denominado vector de autocorrelación 3D, a partir de ahora "3D-ACV" [Eur. J. Med. Chem.-Chim. Theor., vol. 19, página 61 (1984)]. Se ha calculado un conjunto de 3D-ACV para cada serie de conformaciones obtenidas mediante dinámica molecular (MD), y posteriormente se ha tratado utilizando las estadísticas de múltiples variables [Trends in QSAR and Molecular Modelling, 92 ESCOM Publishers, página 216 (1993)]. Esto se ha realizado en tres etapas principales (i a iii):

(i) Para una conformación determinada de la molécula estudiada, en este caso un péptido, se ha calculado el descriptor 3D-ACV correspondiente como sigue. Se han calculado las distancias entre todos los pares de átomos. La distribución de estas distancias era un vector en el que cada "caja" (bin) era la suma de pares de átomos dentro de un rango específico de separación interatómica, es decir, dos átomos determinados estaban separados por una distancia comprendida entre (r - 1) y r Angstroms. En este trabajo, el incremento era igual a 1 Angstrom. Evidentemente, la mínima modificación de la conformación de dicha molécula conducía a un cambio en la distribución de las distancias interatómicas, por tanto, a una modificación del 3D-ACV. En consecuencia, este descriptor es uno de los más eficaces para representar las formas conformacionales de las moléculas.

(ii) Una trayectoria MD es el conjunto de conformaciones adoptadas por una molécula determinada durante la simulación de MD. Para cada conformación, se ha calculado "al vuelo" el 3D-ACV correspondiente y se ha memorizado. Este 3D-ACV múltiple, que es función del tiempo, es un descriptor del comportamiento dinámico de dicha molécula.

(iii) Para la comparación de los 3D-ACV múltiples que representan las trayectorias del conjunto de moléculas analizadas, se ha aplicado un análisis de componentes principales (PCA) a cada uno de los 3D-ACV múltiples. Esta transformación ha reducido las dimensiones del conjunto de datos a un número menor (en el caso actual, un espacio 2D), y a permitido de este modo la proyección de todas las trayectorias de todas las moléculas sobre un plano. En este espacio reducido, cada molécula está representada por un conjunto de puntos, es decir, sus conformaciones durante la totalidad de la duración de la simulación de MD, lo que representa su espacio conformacional. Las moléculas pueden compararse a continuación las unas con las otras en términos de espacios conformacionales. Los análisis de las trayectorias y de los espacios conformacionales se han calculado por medio del programa MULTIDYN (Synt:em, Nimes, Francia).

Mediante la utilización de un filtro dinámico para cribar los péptidos en términos de espacios conformacionales, ha aparecido que 4 de estos 5 péptidos ocupaban el mismo espacio conformacional o un mismo espacio muy similar, excepto uno, el RDP1277, era diferente desde este punto de vista.

Estos 5 péptidos se han sintetizado y ensayado en ensayos biológicos de supervivencia a alo-transplante de corazón.

A una dosis de 10 mg/kg/día, todos estos péptidos, excepto el RDP1277, eran activos in vivo. No se ha observado ninguna prolongación significativa de la supervivencia al transplante después de la terapia con el RD1277 (MST = 9,0 1,4). Por contra, la terapia con todos los otros péptidos ha permitido una prolongación significativa de la supervivencia al transplante, desde 11 a 13 días.

Ensayos suplementarios con el péptido RDP1258 en dosis de 1 a 10 mg/kg/día han revelado una eficacia acrecentada de la terapia a dosis inferiores. A una dosis de 1 mg/kg/día, el 30% de los ratones que habían recibido un alo-transplante de corazón y habían sido tratados con el RDP1258, han sobrevivido durante más de 100 días, mientras que el péptido de referencia, el 2702.75-84, prolongaba la supervivencia del alo-transplante de corazón durante una terapia a razón de 80 mg/kg/día, mientras que no se observó efecto alguno a dosis inferiores. Además, no se ha inducido ninguna supervivencia de larga duración al transplante mediante una terapia que utilizara este péptido de referencia.

La estrategia según la invención ha permitido, por tanto, concebir de forma racional varios compuestos bioactivos, la actividad de los cuales se ha revelado superior a la de las moléculas activas de la base de aprendizaje.

Claims (7)

1. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, caracterizado en que comprende:

1)

prever una base de aprendizaje a partir de una familia de estructuras moleculares conocidas, compuesta por una parte por estructuras moleculares activas que presentan la actividad buscada, y por otra parte por estructuras moleculares inactivas que se conoce están desprovistas de la actividad, o que presentan una actividad débil, utilizando los descriptores apropiados;

2)

generar filtros estáticos representativos de los intervalos de valores estructurales, fisicoquímicos, y moleculares a los que deben responder las moléculas para ser activas a partir de la base de aprendizaje;

3)

efectuar un cribado de un banco combinatorio por medio de estos filtros estáticos;

4)

someter las moléculas más prometedoras seleccionadas de esta manera a un filtro dinámico representativo de las restricciones de variación conformacional que deben respetar las moléculas para ser activas.

2. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, según la reivindicación 1, caracterizado en que comprende esencialmente las etapas sucesivas consistentes en:

1)

producir una base de aprendizaje a partir de una familia de estructuras moleculares conocidas, compuesta por una parte por estructuras moleculares activas que presentan la actividad buscada, y por otra parte por estructuras moleculares inactivas que se conoce están desprovistas de esta actividad, o que presentan una actividad débil, utilizando los descriptores apropiados;

2)

generar una explosión combinatoria de moléculas a partir de la base de aprendizaje;

3)

efectuar un cribado de las moléculas así generadas en base al enriquecimiento, en términos de diversidad molecular, aportado por cada molécula en relación a los descriptores escogidos;

4)

someter las moléculas así retenidas a filtros estáticos representativos de las restricciones de las variaciones estructurales, fisicoquímicas y moleculares a las que deben responder las moléculas para ser activas, y, eventualmente, sintetizar y ensayar las moléculas seleccionadas;

5)

someter las moléculas más prometedoras seleccionadas de esta manera a un filtro dinámico representativo de las restricciones de variación conformacional que deben respetar las moléculas para ser activas;

6)

sintetizar y ensayar las moléculas así seleccionadas.

3. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, según la reivindicación 2, caracterizado en que, si el resultado deseado no es el obtenido, o si sólo se obtiene parcialmente, las etapas 3) a 6) se repiten modificando los filtros.

4. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado en que el filtrado dinámico puede efectuarse por medio de un programa que permite caracterizar los espacios conformacionales de cualesquiera moléculas a partir de trayectorias de dinámica molecular.

5. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el filtrado dinámico pone en práctica el descriptor de forma que consiste en el vector de autocorrelación 3D (3D-ACV).

6. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, según la reivindicación 5, caracterizado en que el filtrado dinámico consiste en calcular un conjunto de 3D-ACV para cada serie de conformaciones obtenidas mediante dinámica molecular (MD), tratados, posteriormente, utilizando las estadísticas de múltiples variables en tres etapas principales (i a iii):

(i)

para una conformación determinada de la molécula estudiada, se calcula el descriptor 3D-ACV correspondiente mediante la determinación de las distancias entre todos los pares de átomos, y de la distribución de estas distancias que forman un vector en el que cada "caja" (bin) es la suma de pares de átomos dentro de un rango específico de separación interatómica;

(ii)

se calcula y memoriza "al vuelo", para cada conformación, el 3D-ACV múltiple correspondiente;

(iii)

se procede a un análisis de componentes principales (PCA) de cada uno de estos 3D-ACV múltiples.

7. Procedimiento asistido por ordenador para prever, identificar y describir moléculas que tienen un comportamiento buscado, principalmente en el campo de la farmacia, según la reivindicación 4, caracterizado en que el filtrado estático pone en práctica descriptores fisicoquímicos y topológicos, una parte de los cuales, al menos, se escoge de entre la masa molar, el volumen elipsoidal, el volumen molecular, la refractividad molar, la lipofilia (log P), kappa 1, kappa 2, kappa 3, kappa alpha 1, kappa alpha 2, kappa alpha 3, la flexibilidad, el kier chi V4, el índice Randic, el índice Balaban, el índice Wiener, la suma de estados E, el momento dipolar, el número de átomos de C, el número de átomos de O, el número de átomos de N, el número de átomos de H, el número total de átomos, el número de grupos metilo, el número de grupos etilo, el número de grupos amino, y el número de grupos hidroxilo.