ES2200728T3 - Clonacion y expresion de una lipasa extracelular acidorresistente de yarrowia lipolytica. - Google Patents

Clonacion y expresion de una lipasa extracelular acidorresistente de yarrowia lipolytica. Download PDF

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Abstract

Módulo de expresión de una lipasa extracelular acidorresistente de levadura, caracterizado porque comprende: - un fragmento de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; - secuencias que permiten regular la expresión de dicha lipasa en una célula huésped.

Description

Clonación y expresión de una lipasa extracelular ácido-resistente de Yarrowia lipolytica.
La presente invención se refiere a la producción por ingeniería genética de lipasas de levaduras que se pueden utilizar para la obtención de medicamentos.
Los alimentos que ingiere a diario el ser humano están compuestos básicamente por lípidos, proteínas y azúcares. Todos estos componentes son sometidos, antes de su absorción, a una hidrólisis catalizada por enzimas del tracto digestivo. El déficit de una cualquiera de estas enzimas puede conllevar, por lo tanto, trastornos digestivos y dar lugar a una malnutrición importante. Este es el caso, por ejemplo, en determinadas situaciones patológicas tales como la mucoviscidosis o la insuficiencia pancreática exocrina, a las que se asocia un déficit de lipasa pancreática. Para corregir esta deficiencia, clásicamente se propone administrar por vía oral extractos pancreáticos. En cualquier caso, la eficacia de esta terapia está limitada por el hecho de que las enzimas contenidas en estos extractos (lipasas, amilasas y proteasas) resultan rápidamente inactivadas por la acidez del medio gástrico.
Se ha propuesto, por tanto, utilizar preparaciones de lipasas resistentes a las condiciones gástricas tales como, por ejemplo, preparaciones de lipasa gástrica de mamíferos, producidas por ingeniería genética como la descrita en la Solicitud de Patente Francesa publicada con el número 2 699 179, o preparaciones de lipasas de microorganismos que poseen una actividad correcta en medio ácido [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)].
Entre las lipasas de microorganismos activas en medio ácido cabe citar, en particular, las lipasas fúngicas tales como las de Candida ernobii, [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta; 154, 586-588 (1968)], de Trichosporon asteroide [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)], de Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254 (1993)], o de Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol., 28, 221-227 (1988)]. Además de su actividad a pH ácido, estas lipasas presentan las características comunes de ser resistentes, en presencia de su sustrato, a la digestión por proteasas (tripsina, quimotripsina y pepsina), y ser resistentes a la acción de las sales biliares (su actividad está conservada en presencia de taurocolato sódico 10 mM).
Sin embargo, la producción natural de lipasas por parte de estos microorganismos no es suficiente, por lo general, para permitir su preparación a escala industrial a un coste razonable.
Los inventores se han propuesto aislar y clonar el gen de una lipasa fúngica activa a pH ácido, con el fin de permitir su sobreexpresión en células hospedadoras.
De esta forma, han logrado clonar el gen que codifica una lipasa extracelular, ácido-resistente, de Yarrowia lipolytica (también denominada, en lo sucesivo, LIP2 o LIP2w29a).
La expresión de este gen en células hospedadoras les ha permitido obtener esta enzima en su forma activa.
La presente invención tiene por objeto un fragmento de ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia que codifica el precursor intracelular de una lipasa extracelular, ácido-resistente, de levadura, caracterizado porque dicho precursor intracelular de la citada lipasa presenta, en la secuencia polipeptídica, al menos un 30% de identidad y al menos un 39% de similitud con el precursor intracelular de la lipasa extracelular de Yarrowia lipolytica, definida por la secuencia SEC. ID Nº: 2.
Por la expresión "fragmento de ácido nucleico que codifica una lipasa extracelular" se entiende cualquier fragmento de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia que codifica la forma madura de dicha lipasa; puede comprender, además, parte o la totalidad de las secuencias que codifican las porciones "pre" y "pro" de su precursor intracelular.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención está representadas, por ejemplo, por la secuencia nucleotídica SEC. ID Nº: 1 de la relación de secuencias adjunta.
En la secuencia SEC. ID Nº: 1, los nucleótidos 3737 a 4741 corresponden a la secuencia que codifica el precursor intracelular de la lipasa extracelular de Y. lipolytica, y los nucleótidos 3836 a 4741 codifican la enzima madura, secretada por las células.
El polipéptido de secuencia SEC. ID Nº: 2 comprende, en total, 335 aminoácidos, y la masa molecular teórica deducida de su secuencia es de 36.782 daltons. La proteína madura comprende 301 aminoácidos.
De acuerdo con una forma de realización ventajosa del fragmento de ácido nucleico, éste comprende al menos una secuencia que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 34 a 334 del polipéptido definido 4 por la secuencia SEC. ID Nº: 2. En este caso, dicho fragmento comprende, de manera conveniente, la secuencia correspondiente a los nucleótidos 3836-4738 de la SEC. ID Nº: 1.
\newpage
Según una disposición ventajosa de esta forma de realización, dicho fragmento de ácido nucleico comprende, adicionalmente, una secuencia que codifica un polipéptido que permite la secreción de la citada lipasa. En tal caso, dicho fragmento comprende, de manera conveniente, una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 33 del polipéptido definido por la secuencia SEC. ID Nº: 2.
Los resultados de la comparación de la secuencia SEC. ID Nº: 2 correspondiente al precursor intracelular, con las secuencias del banco de datos SWISSPROT, utilizando el programa GCP-gap [versión 9.1-UNIX (sept. 97).] y la matriz BLOSUM 62, (GENETICS COMPUTER GROUP, Universidad de Wisconsin), aparecen ilustrados en la siguiente Tabla I.
TABLA I
100
La invención abarca, igualmente, los casetes de expresión de una lipasa extracelular ácido-resistente de levadura, que comprenden:
-
un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención;
-
secuencias que permiten regular la expresión de dicha lipasa en una célula hospedadora.
El fragmento de ADN de acuerdo con la invención comprende la secuencia que codifica la forma madura de la lipasa ácido-resistente, sola o asociada con secuencias que codifican las señales de secreción. Estas señales de secreción pueden ser las que se encuentran asociadas de manera natural a la citada lipasa, o ser señales heterólogas.
Secuencias que permiten la regulación de la expresión son, en particular, secuencias de tipo promotor y terminador de la transcripción, funcionales dentro de la célula hospedadora en la que se desea expresar la lipasa.
Las secuencias reguladoras apropiadas se pueden seleccionar en función de la célula hospedadora, de las condiciones (por ejemplo, inducible o constitutiva), y del grado de expresión deseado.
Es posible utilizar secuencias de regulación asociadas de forma natural a la que codifica la lipasa, y/o secuencias heterólogas. Se pueden usar secuencias precedentes de diferentes genes, asociadas en diferentes combinaciones.
De este modo, por ejemplo, es posible construir un casete que exprese un precursor intracelular, en el que la forma madura de una lipasa ácido-resistente, codificada por un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención, se encuentra asociada a sus propias señales de secreción, o a señales de secreción de origen heterólogo; la secuencia que codifica este precursor puede estar bajo el control transcripcional de sus propios promotor y terminador, o estar asociada a un promotor heterólogo y/o a un terminador heterólogo.
De este modo, resulta posible utilizar en el marco de un casete de expresión de acuerdo con la invención el promotor y/o el terminador de transcripción del gen de la lipasa extracelular de Y. lipolytica, así como la secuencia que codifica la totalidad o parte de la región pre-pro de la lipasa extracelular de Y. lipolytica.
Por otra parte, la secuencia que codifica la forma madura de la lipasa de Y. lipolytica codificada por un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede estar asociada con un promotor y/o un terminador y/o las señales de secreción heterólogas. Por ejemplo, para la expresión en una levadura de la lipasa extracelular de Y. lipolytica es posible utilizar la secuencia señal de dicha lipasa tal como, por ejemplo, el promotor ACO2 de Y. lipolytica [LE CLAINCHE, Tesis doctoral del Instituto Nacional de Agronomía de París Grignon, expuesta el 2 de julio de 1997] que, al igual que el de la lipasa LIP2, es inducible por triglicéridos y ácidos grasos.
Para expresar una lipasa codificada por un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención en otras células hospedadoras, se deberá asociar la secuencia que codifica la proteína madura con secuencias de control de la transcripción, y con señales de secreción funcionales en esa célula hospedadora.
La presente invención comprende, igualmente, los vectores recombinantes que se pueden obtener por la inserción de al menos un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención y, de forma ventajosa, de al menos un casete de expresión de acuerdo con la invención, en un vector hospedador.
Preferentemente, se seleccionarán como vectores hospedadores vectores que permitan la replicación en múltiples copias de la información genética introducida en la célula hospedadora y, de manera conveniente, su conservación bajo una forma estable. Puede tratase de vectores extra-cromosómicos tales como plasmidios multicopia estables, o de vectores episómicos; asimismo, puede tratarse de vectores de integración.
A modo de ejemplo de vectores hospedadores que se pueden utilizar para la clonación y la expresión de una lipasa extracelular ácido-resistente, codificada por un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención, caben citar, por ejemplo, los vectores descritos en la Solicitud PCT WO 00/12729 a nombre de INRA.
En la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, calle del Doctor Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, se depositó con fecha 12 de mayo de 1998, bajo el número I-2013, una cepa de E. coli que contiene uno de estos vectores denominado JMP10, que comprende un inserto correspondiente a la región 1715-4806 de la secuencia SEC. ID Nº: 1, que contiene el promotor, la porción codificadora y el terminador de transcripción de la lipasa de Y. lipolytica.
La presente invención tiene como objeto, igualmente, células eucariotas o procariotas transformadas a través de al menos un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Las células transformadas de acuerdo con la invención se pueden obtener, por ejemplo, a partir de células bacterianas, células de levadura o de hongos, o de células animales (por ejemplo, células de mamíferos o de insectos).
En especial, los inventores han obtenido, a partir de células de Y. lipolytica transformadas por un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una cepa sobreproductora de la citada lipasa.
Un objeto adicional de la presente invención se refiere, por lo tanto, a esta cepa de Y. lipolytica, que fue depositada con fecha 24 de agosto de 1999, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, calle del Doctor Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, bajo el número 1-2294.
La invención se refiere, asimismo, a un procedimiento de producción de lipasa recombinante, procedimiento éste que se caracteriza por comprender al menos una etapa en el transcurso de la cual se recoge la lipasa recombinante producida por dichas células.
Según una forma de realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, dichas células transformadas son células de la cepa 1-2294.
Esta lipasa recombinante se puede obtener tras la lisis celular o, de forma conveniente, a partir del medio de cultivo al que es secretada por las células, por medio de técnicas convencionales conocidas en sí mismas, por ejemplo, por precipitación fraccional seguida de una o múltiples etapas de cromatografía.
La presente invención se comprenderá mejor con ayuda del complemento de descripción siguiente, que hace referencia a ejemplos que describen la clonación del gen que codifica la lipasa extracelular de Y. lipolytica, y la obtención de cepas de levadura transformada que expresan este gen.
Se debe entender, en cualquier caso, que los presentes ejemplos se ofrecen exclusivamente a modo de ilustración del objeto de la invención, sin que en forma alguna representen una limitación del mismo.
Ejemplo 1
Aislamiento y caracterización del gen de la lipasa de Yarrowia lipolytica Aislamiento del ADNc
Con la ayuda de sondas de ácido nucleico derivadas de la secuencia que codifica la lipasa de Candida ernobii, se criba un banco de ADNc de Yarrowia lipolytica.
\newpage
A partir de los clones positivos, se amplifica el gen de la lipasa de Yarrowia lipolytica (LIP2W29a) por PCR, con ayuda de un par de oligonucleótidos convergentes LipATG/Lip STOP:
1
2
y se clona en el plasmidio pBLUESCRIPT KS+ (STRATAGENE, La Jolla) en el sitio EcoRV.
El plasmidio recombinante obtenido se denomina pKS-LIP2W29a. Contiene un inserto de 1118 pb (coordenadas 3737 a 4806 de la secuencia SEC. ID Nº: 1), que contiene los sitios de restricción SmaI y SfiI, seguidos de la secuencia de consenso del entorno del ATG (CACAATG), de la secuencia del marco de lectura de la prolipasa, de la secuencia terminal hasta el sitio de poliadenilación, y de los sitios de restricción BamHI, EcoRI y NotI.
Aislamiento del ADN genómico
Con la ayuda del par de oligonucleótidos convergentes Ylip04 e Ylip05, se analizaron los seis combinados de un banco de ADN genómico de Y. lipolytica [XUAN et al., C. Curr. Genet. 14, 15-21 (1988)].
Ylip04 5' GGCACTAAGATCTTCAAGCCC 3'
Ylip05 5' GAAGCCATTGTGGACAAGACAG 3'
Se obtuvo una amplificación para el combinado 2. Las colonias bacterianas de este combinado fueron ensayadas por hibridación con el gen LIP2W29a, obtenido de la forma descrita anteriormente en 1) en forma de sonda. Este cribado permitió obtener el plasmidio pINA-LIP2, que contiene un fragmento genómico de aproximadamente 6,5 kb (Figura 1-C). Este fragmento fue digerido por diferentes enzimas de restricción. Los fragmentos EcoRV (E1), PstI (P1, P2, P3 y P4), y BgIII (B1), obtenido de este modo, se clonaron en el plasmidio pBLUESCRIPT KS+ en los sitios EcoRV, PstI y BamHI, respectivamente. El análisis del plasmidio pINA-LIP2 demostró que contiene las regiones promotoras y una parte de la secuencia codificadora de la lipasa.
Al objeto de obtener el final del gen de la lipasa y la región terminal, se llevó a cabo una etapa de PCR inversa. La hibridación del ADN genómico cortado por las enzimas de restricción HindIII, PstI y SphI, con el gen LIP2W29a reveló fragmentos de 1,4 kb, 1,66 kb y 3,7 kb, respectivamente. Se amplificó el fragmento HindIII de 1,4 kb de ADN genómico: el ADN genómico fue digerido con HindIII, ligado y amplificado por PCR, con ayuda de los oligonucleótidos divergentes Ylip03 e Ylip04. Ylip03:
5' TATCCAATGTTTGCAGTCGGG 3'.
El fragmento obtenido (Figura 1-D) se clonó en el plasmidio pBLUESCRIPT KS+ en el sitio EcoRV. Se llevó a cabo la secuenciación del plasmidio recombinante, denominado pKS-PCR-H.
Se ensamblaron las secuencias de una parte del inserto de pINA-LIP2, del plasmidio pKS-LIP2W29a, y del plasmidio pKS-PCR-H, para obtener un segmento EcoRV-HindIII de 5304 pb (Figura 1-E), cuya secuencia figura en el anexo bajo el número SEC. ID Nº: 1.
La Figura 1 representa esquemáticamente las diferentes etapas, que se han descrito anteriormente, de la clonación gel gen de la lipasa extracelular de Yarrowia lipolytica (LIP2W29a).
Leyenda de la Figura 1:
A:
Mapa de restricción genómica parcial del locus de LIP2W29a. Los símbolos representan EcoRV (EV), PstI (P), BgIII (Bg), e HindIII (H).
La localización del ORF de la LIP2W29a se representa esquemáticamente por un bloque de color negro.
B:
Localización de la secuencia de ADNc y representación esquemática de los oligonucleótidos Lip ATG y Lip STOP, utilizados para amplificar el gen que codifica la lipasa. El plasmidio recombinante se denomina pKS-LIP2W29a. Localización de los oligonucleótidos Ylip04 e Ylip05, usados para analizar el banco de Xuan (Xuan et al., 1988).
C:
Representación esquemática del inserto de 6,5 kb contenido en el plasmidio pINA-LIP2, y localización de los sub-clones EcoRV (E1), PstI (P1, P2, P3 y P4), y BgIII (B1) utilizados para secuenciar la región 5' del gen de la LIP2W29a.
D:
Secuenciación del fragmento de ADN genómico HindIII de 1,4 kb. El ADN genómico fue digerido por HindIII, ligado y amplificado por PCR con el par de oligonucleótidos divergentes Ylip03 e Ylip04. El fragmento de PCR se clonó y el plasmidio recombinante que contiene dicho fragmento se denomina pKS-PCR-H.
E:
Secuencia del locus YL-LIP2. Se ensamblan las secuencias del plasmidio pKS-LIP2W29a (B), de los sub-clones de pINA-LIP2 (C), y del plasmidio pKS-PCR-H (D). La secuencia final representa una región EcoRV-HindIII de 5304 pb.
El análisis de la secuencia nucleotídica de la región EcoRV-HindIII de 5304 pb permitió establecer la presencia de una fase abierta de lectura, que codifica un polipéptido de 335 aminoácidos. La secuencia de este polipéptido aparece representada en la lista adjunta de secuencias bajo el número SEC. ID Nº: 2.
Características de la lipasa Secuencia señal
La región pre-pro se halla situada entre las posiciones -33 y -1 de la secuencia peptídica. Comprende una secuencia señal de 13 aminoácidos, situada entre las posiciones -33 y -19 de la secuencia peptídica, 4 dipéptidos X-Ala o X-Pro, sustratos de la diamino-peptidasa, una región pro de 12 aminoácidos situada entre las posiciones -12 y -1 de la secuencia peptídica, y cuyos dos últimos aminoácidos forman un sitio KR (Lys-Arg), que actúa como sustrato de una endoproteasa codificada por el gen XPR6 (homólogo de Kex2 en C. cerevisiae).
Sitios potenciales de N-glicosilación
Existen dos sitios potenciales de N-glicosilación (Asparagina-X-Ser/Thr) que están localizados al nivel de los aminoácidos 113 y 134.
Sitio catalítico
Se detectan los tres aminoácidos que, aparentemente, se encuentran implicados en la composición del sitio catalítico de la enzima, en las respectivas posiciones siguientes: 162 para el residuo serina comprendido en la secuencia de consenso GxSxG común a todas las lipasas, 230 para el residuo ácido aspártico, y en 289 para el residuo histidina.
El análisis por transferencia de Southern demuestra que este gen se encuentra presente en una única copia en el genoma de Yarrowia lipolytica.
Ejemplo 2
Clonación del gen de la lipasa LIP2 de Yarrowia lipolytica en vectores de integración y expresión en Yarrowia lipolytica Construcción de vectores que comprenden el gen que codifica la lipasa de Yarrowia lipolytica
El gen que codifica la lipasa LIP2 de Yarrowia lipolytica se clonó en el vector de integración JMP3. Este vector hospedador aparece descrito en la Solicitud Francesa a nombre del INRA titulada: "Procedimiento de transformación no homóloga de Yarrowia lipolytica", depositada el mismo día que la presente solicitud.
Se trata de un vector de autoclonación que se integra en el genoma después del corte con la enzima de restricción NotI. Esta restricción permite eliminar la parte bacteriana (origen de replicación de E. coli y del marcador de resistencia KanR).
Estos vectores derivan del vector pINA1067 (denominado también pINA970), descrito por BARTH y GAILLARDIN [The dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. In: Non conventional yeasts in biotechnology (Wolf K. Ed.), Editorial Springer, Berlín, págs. 313-388 (1996)], en el que se ha introducido un fragmento NotI que comprende un origen de replicación para E. coli, y un marcador de resistencia a la kanamicina, y de donde se ha escindido un fragmento HindIII-EcoRI (que contiene las secuencias del plasmidio pBR322, un marcador de resistencia a la tetraciclina, y el promotor y el terminador XPR2), que se ha sustituido por un adaptador que contiene los sitios de restricción HindIII, ClaI, MiuI, HpaI, BamHI y EcoRI.
Construcción de los vectores de amplificación JMP6 y JMP10
Los vectores de amplificación JMP6 y JMP10 se construyeron por ligadura de tres vías, utilizando fragmentos purificados por electroforesis sobre gel de agarosa.
Construcción de JMP6
El promotor del gen de acil CoA oxidasa ACO2 de Y. lipolytica se amplificó por PCR con los oligonucleótidos Aco2P1 y Aco2P2, que contienen un sitio ClaI e HindIII, respectivamente. El fragmento de PCR de 2168 pb se clonó en el sitio EcoRV del vector BLUESCRIPT KS+. El plasmidio resultante se denomina KS-ACO2prom. Este vector fue digerido con ClaI y, de forma parcial, por HindIII, para obtener un fragmento de 2156 pb que contiene el promotor completo.
El gen de la lipasa está contenido en un fragmento HindIII-EcoRI de 1134 pb, aislado del plasmidio KS+-LIP2W29a.
Los dos fragmentos se purificaron e insertaron en los sitios ClaI-EcoRI del vector JMP3. El plasmidio resultante se denomina JMP6.
El plasmidio aparece representado en la Figura 2.
Construcción de JMP10
Un fragmento NdeI*-HindIII de 2030 pb del plasmidio KS+-LIP2prom porta el promotor del gen de la lipasa LIP2 de Y. lipolytica. Este plasmidio fue digerido con NdeI, fue tratado con ADN-polimerasa T4 para dar el sitio NdeI franco (NdeI*). Después de la inactivación de la enzima NdeI y de la polimerasa (20 min, 70ºC), el ADN se cortó con HindIII. El fragmento NdeI*-HindIII de 2030 pb se ligó con el fragmento HindIII-EcoRI de 1134 pb portador del gen de la lipasa y su terminador, y se insertó en los sitios HpaI-EcoRI del vector JMP3.
El plasmidio resultante, denominado JMP10, aparece representado en la Figura 3. Este plasmidio fue depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, calle del Doctor Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, con fecha 12 de mayo de 1998, bajo el número I-2013.
Los plasmidios JMP6 y JMP10 fueron introducidos por transformación con acetato de litio, tras la linealización con NotI, E150 (que comprende los sitios zeta), o en la cepa PO1d (desprovista de los transposones y de sitios zeta). Las dos cepas de Y. lipolytica poseen una deleción del gen URA3.
De manera típica, se obtienen de 20 a 50 transformantes/\mug de ADN con la cepa PO1d, y 100 a 200 transforman-
tes/\mug de ADN con la cepa E150.
Los transformantes se designan, en lo sucesivo, de acuerdo con la nomenclatura siguiente: nombre de la cepa -número de plasmidio- número de transformante. Ejemplo: PO1d-6-15, cepa PO1d, plasmidio JMP6, transformante número 15.
La integración del gen de la lipasa en el genoma de los transformantes se verifica por transferencia de SOUTHERN, e hibridación con las sondas derivadas de las secuencias ZETA, de la secuencia del promotor ACO2, y de la secuencia de la lipasa.
Producción de lipasa en el medio de cultivo por parte de las cepas transformadas de Yarrowia lipolytica
Las diferentes cepas se cultivan a 28ºC bajo agitación (200 rpm) en un matraz de Erlenmeyer con aletas de 250 ml, que contiene 40 ml de medio (extracto de levadura 10 g/l; bactopeptona 20 g/l; tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6,8), con o sin inductor (por ejemplo, oleato al 0,5%). La siembra original se lleva a cabo en una densidad óptica de 0,1 unidades por ml a 600 nm.
En el transcurso del período de cultivo, se llevan a cabo diferentes tomas de muestras, y se efectúan ensayos de actividad de lipasa en los sobrenadantes por titrimetría, de acuerdo con el siguiente protocolo:
Se incuban las mezclas de reacción (5 ml de emulsión de aceite de oliva (SIGMA, Francia, ref. 800-1); 2 ml de tampón Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 6,8; enzima a diferentes concentraciones) durante 20 min a 37ºC, bajo agitación orbital (250 rpm), en tubos de plástico de 20 ml. La reacción se interrumpe mediante la adición de 4 ml de solución de una mezcla 1/1 (v/v) de etanol/acetona, que contiene 0,09% de timolftaleína (p/v). A continuación, se titula el contenido de los tubos con sosa 50 mM (sosa 0,0SN (TITRISOL, MERCK) hasta la aparición de un cambio de color azul de la timolftaleína. La actividad enzimática presente en los tubos se calcula de la forma siguiente:
3
Vo = volumen de sosa incorporado en la muestra de control para la dosificación (ml)
V = volumen de sosa incorporado a la muestra (ml)
T = tiempo de reacción (min)
M = molaridad de la sosa utilizada para la dosificación (mM)
D = dilución llevada a cabo de la muestra usada para la dosificación (ml)
E = volumen de muestra utilizada para la dosificación (ml).
Una unidad de lipasa corresponde a la cantidad de enzima capaz de catalizar la formación de 1 \mumol de ácido graso/min bajo las condiciones operativas anteriormente descritas.
Los resultados obtenidos con la cepa de referencia E150 y las cepas modificadas E150-6-2 y E150-10-4 se muestran en la siguiente Tabla II:
TABLA II
4
Los resultados obtenidos con la cepa de referencia PO1d y el clon transformado PO1d-6-17 se muestran en la siguiente Tabla III:
TABLA III
6 
\newpage
Ejemplo 3
Producción de lipasa extracelular por el clon MS4 de Yarrowia lipolytica
A partir de los cultivos de células PO1d de Yarrowia lipolytica transformadas de la forma descrita en el Ejemplo 2, los inventores lograron seleccionar un clon productor de una cantidad de lipasa mucho más importante que los restantes clones transformados, sin que esta superproducción afectase a su capacidad de crecimiento.
Este clon, designado en lo sucesivo como MS4, contiene 10 copias del casete de expresión; fue depositado con fecha 24 de agosto de 1999 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25, calle del Doctor Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, bajo el número I.2294.
La producción de lipasa por parte de este clon se determina del modo que se describe a continuación.
A/ Producción de lipasa extracelular por parte del clon MS4 en Erlenmayer Condiciones experimentales
Todos los cultivos se llevaron a cabo a 28ºC bajo agitación (150 rpm) en matraces de aletas, provistos de tapón, de 250 ml (CML, Francia), que contuvieron 50 ml de medio de cultivo (agua desionizada; extracto de levadura 10 g/l; bactotriptona N1 20 g/l (ORGANOTECHNIE); tampón Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 6,8; glucosa 10 g/l (SIGMA); aceite de oliva o ácido oleico (MERCK) a diferentes concentraciones).
Las siembras iniciales de los cultivos de los cultivos se llevan a cabo de manera que se obtiene una densidad óptica de 600 nm (DO_{600 \ nm}) de 0,25 por 1 ml (es decir, aproximadamente 2,5 x 10^{7} células/ml).
En el transcurso de la reacción se efectuaron múltiples tomas de muestras. En cada una de ellas, se separaron por centrifugación la biomasa y el sobrenadante y se midió su DO_{600 \ nm} para 1 ml. La actividad de lipasa se dosifica en el sobrenadante por titrimetría, tal como se indica en el Ejemplo 2 anterior, en tanto que el crecimiento celular se midió a partir de la biomasa.
Resultados
En la Figura 4 aparecen representados:
-
El crecimiento celular del clon MS4 (O), evaluado por la medición de la absorbancia a 600 nm A_{600 \ nm} en función del tiempo.
-
La actividad de lipasa (\bullet) en función del tiempo.
Estos resultados demuestran que bajo estas condiciones de cultivo, la actividad de lipasa aumenta en el sobrenadante hasta alcanzar su nivel máximo a las 96 horas; el clon MS4 permite la producción de aproximadamente 0,5 g/l de lipasa, es decir, 12000 U/ml (Figura 4) en el sobrenadante después de 100 horas de cultivo. Este valor representa 200 veces más lipasa que la cepa PO1d inicial.
El análisis sobre SDS-PAGE en gel de la cinética de producción de la lipasa en el sobrenadante de cultivo pone de manifiesto una acumulación constante de lipasa, sin ninguna degradación aparente.
Adicionalmente, los inventores han analizado la influencia de las condiciones de cultivo y de la composición del medio sobre la producción de lipasa.
De esta forma, han demostrado que el uso de bactotriptona favorece en gran medida la actividad de lipasa. De hecho, cuando se sustituye este componente por una bactopeptona, la actividad observada es alrededor de 3 veces menor.
Asimismo, se ha observado que la presencia de un ácido graso o de un triglicérido resulta indispensable para la inducción de la producción de lipasa. La presencia de aceite de oliva al 5% en el cultivo permite obtener títulos máximos de lipasa, y la adición de aceite de oliva al 10% no aumenta de manera significativa los títulos. Del mismo modo, el ácido oleico es un excelente inductor cuando se le utiliza al 10%.
B/ Producción de lipasa extracelular en fermentador - Condiciones experimentales - Preparación de ampollas de siembra
El clon MS4 se extiende con una fuerte densidad sobre medio mínimo de agar (YNB ww DIFCO 1,7 g/l; glutamato 0,5 g/l; glucosa 10 g/l; PASTAGAR B 12 g/l), y se somete a incubación durante 48 h a 28ºC. Las células se recuperan con 5 ml de YPD y se utilizan para sembrar 200 ml de medio YPD. Seguidamente, se cultivan hasta una A_{600 \ nm} de 10 (es decir, 10^{6} células/ml). Las levaduras de recogen después de centrifugar en 50 ml de YEA glicerol (extracto de levadura 5 g/l; glucosa 10 g/l; glicerol al 20%) frío, y se conservan en ampollas de 1 ml a -80ºC.
- Precultivo
Se llevan a cabo 2 precultivos durante 16 horas a 28ºC, bajo agitación orbital (150 rpm) en los matraces con aletas de 11, que contienen 200 ml de medio YPD (extracto de levadura (LIFE TECHNOLOGIES, Francia) 10 g/l; bactopeptona (DIFCO, Francia) 10 g/l; glucosa anhidra (SIGMA, Francia) 10 g/l).
Cada precultivo se siembra con una ampolla de 1 ml del clon MS4 (es decir, 4 x 10^{8} células).
- Fermentación - Medio de fermentación en lotes
Agua desionizada, extracto de levadura (ORGANOTECHNIE, Francia) 10 g/l; bactotriptona (ORGANOTECHNIE, Francia) 20 g/l; tampón Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 6,8; aceite de oliva al 5% (aceite de oliva ROUX, Francia); 3,5 ml de antiespumante (RHODORSIL 426R, PROLABO), agregados de una sola vez desde el inicio de la fermentación.
El tampón fosfato y el aceite de oliva se tratan en autoclave por separado.
- Medio de fermentación continua
Extracto de levadura (ORGANOTECHNIE, Francia) 5 g/l; bactotriptona (ORGANOTECHNIE, Francia) 10 g/l; tampón Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 6,8.
Condiciones de fermentación
La siembra inicial del fermentador se realiza a una DO_{600 \ nm} de 1 por 1 ml.
La fermentación se lleva a cabo a 27ºC y a pH 6 (pH regulado por sosa 2,5 M), en un fermentador de 5 l que contiene 3,5 l de medio (véase antes), con una aireación de 1 vvm, una pO_{2} fija de valor mínimo de 5%, con una velocidad de agitación de partida de 300 rpm, que se puede aumentar hasta 1000 rpm en incrementos de 5 rpm para conservar la pO_{2} mínima).
La fermentación tiene una duración de 24 h en medio de fermentación en lotes, y hasta 3 días en medio de fermentación en continuo.
Resultados - Fermentación en lotes
Se obtiene una producción máxima de actividad de lipasa después de 24 horas (4000 U/ml). La actividad se mantiene seguidamente de forma plana durante algunas horas, antes de iniciar su descenso. Este decremento parece estar unido a la desaparición del aceite de oliva, sustrato de la lipasa, en el medio.
- Fermentación continua
Ha sido posible obtener una producción de lipasa durante 2 días, con un rendimiento de 200 ml/h y se ha obtenido un índice de producción de enzima al entorno de 80 U/ml/h.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente Europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.
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PIGNEDE, Georges 
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FUDALEJ, Franck 
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NICAUD, Jean-Marc 
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GAILLARDIN, Claude 
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<120> CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE UNA LIPASA EXTRACELULAR, ÁCIDO-RESISTENTE, DE LEVADURA
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<130> MJPcb269/24
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 5304
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<212> ADN
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<213> Yarrowia lipolytica 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (3737)..(4741)
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<220>
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<221> mat_peptide
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<222> (3836) (4741)
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<400> 1
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11 
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<210> 2
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<211> 334
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<212> PRT
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<213> Yarrowia lipolytica 
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<400> 2
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12

Claims (12)

1. Fragmento de ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia que codifica un precursor intracelular de una lipasa extracelular, ácido-resistente, de levadura, caracterizado porque la secuencia polipeptídica de dicho precursor intracelular de la citada lipasa presenta al menos un 30% de identidad y al menos un 39% de similitud con el precursor intracelular de la lipasa extracelular de Yarrowia lipolytica, definida por la secuencia SEC. ID Nº: 2.
2. Fragmento de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 34 a 334 del polipéptido definido por la secuencia SEC. ID Nº: 2.
3. Fragmento de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende la secuencia correspondiente a los nucleótidos 3836 a 4738 de la secuencia SEC. ID Nº: 1.
4. Fragmento de ácido nucleico aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende, adicionalmente, una secuencia que codifica un polipéptido que permite la secreción de dicha lipasa.
5. Fragmento de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 33 del polipéptido definido por la secuencia SEC. ID Nº: 2.
6. Fragmento de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende la secuencia correspondiente a los nucleótidos 37373 a 3835 de la secuencia SEC. ID Nº: 1.
7. Casete de expresión de una lipasa extracelular, ácido-resistente, de levadura, caracterizado porque comprende:
-
un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
-
secuencias que permiten regular la expresión de dicha lipasa en una célula hospedadora.
8. Vector recombinante que comprende al menos un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende al menos un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
10. Célula eucariota o procariota transformada por al menos un fragmento de ácido nucleico, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Cepa celular transformada de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque se trata de un clon de Yarrowia lipolytica designado MS4, depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (C.N.C.M.) con fecha 24 de agosto de 1999, bajo el número 1-2294.
12. Procedimiento de producción de una lipasa ácido-resistente, caracterizado porque comprende al menos una etapa en el transcurso de la cual se cultivan células transformadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, y una etapa en el transcurso de la cual se recoge la lipasa recombinante producida por dichas células.
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