ES2200973T3 - Ensayo. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para controlar la eficacia de un proceso de purificación en la eliminación del activador de plasminógeno (PA) endógeno para las células del ovario del hámster chino (CHO) de una muestra que contiene tPA humano o sus variantes, comprendiendo dicho procedimiento incubar la muestra con una proteasa capaz de escindir de forma específica el enlace Arg275-Ile276 del tPA humano de tipo natural y a continuación, con un agente desnaturalizante y un agente reductor en cantidades eficaces, reducir los enlaces disulfuro del tPA humano de tipo natural; someter la muestra a una etapa de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa y analizar la cantidad de PA endógeno en el perfil de elución de la etapa de cromatografía en las células de CHO en que está presente.
Description
Ensayo.
La presente invención se refiere a un ensayo para
determinar la cantidad de tPA producido por el ovario del hámster
chino (CHO), que está presente en muestras de tPA humano
recombinante con secuencia natural o sus variantes producidas en
células de CHO.
Los activadores de plasminógeno de tipo tejido
(tPA) son proteasas endógenas de serina implicadas en una cascada
de casos que conducen a la disolución de un coágulo de sangre
(Astrup y Permin, Nature, 159, 681-682
(1947); Camiolo et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138,
277-280 (1971); Collen, J. Biol. Chem., 33,
77-86 (1987); Hoylaerts et al., J. Biol. Chem.,
257, 2921-2919 (1982)). ACTIVASE® es la forma
recombinante del tPA humano (r-tPA), utilizada en
el tratamiento del infarto agudo de miocardio y de la embolia
pulmonar (Grossbard, Pharm. Res., 4, 375-378
(1987)). ACTIVASE® está además autorizada actualmente para tratar
la apoplejía isquémica (Smith et al., Acad. Emergency Medicine,
6(6), 618-625 (1999); Kwiatkowski et al.,
New England J. Med., 340(23), 1781-1787 (1999)).
Es una glucoproteína producida al expresar el ADN complementario
(ADNc) para el tPA natural humano en células de ovario de hámster
chino (CHO). TNK-tPA es una variante modificada
genéticamente de las células de ovario de hámster chino (CHO) de
tPA humano clonado y expresado en células de CHO (Keyt et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 3670-3674
(1994)). Se introdujeron mutaciones direccionadas a la zona en tres
zonas específicas del tPA humano para crear la variante
TNK-tPA. Ellas son Thr103 a Asn (T103N), Asn 117 a
Gln (N117Q) y
Lys-His-Arg-Arg
296-299 hasta
Ala-Ala-Ala-Ala
(KHRR296- 299AAAA). Cuando se compara con tPA,
TNK-tPA presenta similar actividad biológica in
vitro, un aumento de resistencia al inhibidor del activador del
plasminógeno y una potenciación de la especificidad de la fibrina y
se elimina más lentamente del plasma (Keyt et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 91, 3670-3674 (1994); Thomas
et al., Stroke, 25:10, 2072-2079 (1994);
Benedict et al., Circulation, 92:10,
3032-3040 (1995); Modi et al., Thromb Haemost,
79, 134-139 (1998)). Está esperando actualmente
la autorización reglamentaria como forma administrada en una sola
embolada de
r-tPA. Las células de CHO biosintetizan tPA endógeno de hámster denominado CHO-PA. CHO-PA presenta una actividad fibrinolítica similar a la del tPA humano determinada mediante el ensayo por lisis del coágulo. La secuencia de aminoácidos de CHO-PA es idéntica en el 80% a la del tPA humano. Muchas de las
sustituciones son semiconservadoras, tales como
Arg \leftrightarrow Lys, Glu \leftrightarrow Asp, Phe \leftrightarrow Tyr, Val \leftrightarrow Ala,
Ile \leftrightarrow Leu o Thr \leftrightarrow Ser. Utilizando un modelo del dominio de proteasa de tPA humano basado en la estructura de la quimiotripsina bovina, se observa que virtualmente todas las sustituciones en CHO-PA están situadas en o cerca de la superficie de la proteína.
r-tPA. Las células de CHO biosintetizan tPA endógeno de hámster denominado CHO-PA. CHO-PA presenta una actividad fibrinolítica similar a la del tPA humano determinada mediante el ensayo por lisis del coágulo. La secuencia de aminoácidos de CHO-PA es idéntica en el 80% a la del tPA humano. Muchas de las
sustituciones son semiconservadoras, tales como
Arg \leftrightarrow Lys, Glu \leftrightarrow Asp, Phe \leftrightarrow Tyr, Val \leftrightarrow Ala,
Ile \leftrightarrow Leu o Thr \leftrightarrow Ser. Utilizando un modelo del dominio de proteasa de tPA humano basado en la estructura de la quimiotripsina bovina, se observa que virtualmente todas las sustituciones en CHO-PA están situadas en o cerca de la superficie de la proteína.
r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA son todas cadenas individuales de polipéptido
de 527 aminoácidos con 17 enlaces disulfuro (Nguyen y Carole,
"Stability Characterization an Formulation Development of
Altepase, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator", en
"Stability and Characterization of Protein and Plasminogen
Activator", en Stability and haracterization of Protein
and Peptide Drugs: Case Histories, Y. J. Wang, R. Pearlman,
eds., (Plenum Press: New York, 1993), págs. 91-135.
Para las tres proteínas, el enlace péptido entre Arg_{275} e
Ile_{276} es particularmente susceptible a la escisión de la
proteasa. La escisión produce dos fragmentos: uno consistente en
los aminoácidos 275 N-terminal y el otro consistente
en los aminoácidos 252 C-terminal. La cadena
N-terminal contiene zonas que son homólogas a las
zonas estratificadas observadas en el plasminógeno y la protrombina
y, por lo tanto, se denominan con frecuencia "fragmento
estratificado" (Nguyen y Carole, supra; de Vos et al.,
Biochem., 31, 270-279 (1992)).
La cadena C-terminal contiene la
zona catalíticamente activa y, por lo tanto, se denomina
habitualmente "fragmento de proteasa" (Pennica et al.,
Nature, 301, 214-221 (1983)). Las dos cadenas
escindidas están unidas por un enlace simple de disulfuro formado
entre Cys_{264} y Cys_{395}. La molécula escindida se denomina
habitualmente "tPA de dos cadenas" por oposición al "tPA de
una cadena" o a la forma intacta.
r-tPA contiene cuatro zonas
potenciales para la glucosilación ligada a N identificadas por la
secuencia Asn-X-Ser/Thr (Nguyen y
Carole, supra). Éstas son Asn_{117}, Asn_{184},
Asn_{218} y Asn_{448}. r-tPA existe en forma de
dos isozimas de glucosilación denominadas tipo I y tipo II.
r-tPA de tipo I está glucosilado en Asn_{117},
Asn_{182} y Asn_{448}; mientras que r-tPA de
tipo II está glucosilado solamente en Asn_{117} y Asn_{448}.
Asn_{218} no está glucosilado en ninguna de ambas isoformas.
TNK-tPA presenta el mismo modelo de glucosilación
que r-tPA, excepto que las mutaciones de Thr103 a
Asn y Asn_{117} a Gln movieron eficazmente la zona de
glucosilación de la posición 117 a la 103 (Keyt et al.,
supra). El modelo de glucosilación para CHO-PA
no está totalmente caracterizado (Rijken y Collen, J. Biol.
Chem., 256: 7035-7041 (1981).
ACTIVASE® es una marca registrada para la forma
recombinante del activador de tipo tejido humano
(r-tPA), utilizado para el tratamiento del infarto
agudo de miocardio y de la embolia pulmonar. El tPA de marca
ACTIVASE® está también autorizado actualmente para el tratamiento
de la apoplejía isquémica. Se produce al expresar el ADN
complementario (ADNc) en el tPA humano natural en las células del
ovario de hámster chino (CHO) (Patente U.S. nº 5.753.486).
TNK-tPA es una variante modificada genéticamente de
r-tPA con eficacia mejorada e incidencia más baja en
hemorragias comparado con el r-tPA de ACTIVASE®. Se
creó mediante tres mutaciones direccionadas a la zona (T103N, N117Q
y KHRR296-299AAAA) y también se clonó y se expresó
en células de CHO (Patente U.S. nº 5.612.029). Las células de CHO
biosintetizan tPA endógeno de hámster denominado
CHO-PA. La secuencia de aminoácidos de
CHO-PA es muy homóloga (idéntica en el 80%) a la de
r-tPA. Las tres proteínas trombolíticas existen en
forma de isoformas heterogéneas, principlmente debido a la
proteolisis/hidrólisis y a la glucosilación diferencial.
En la patente U.S. nº 5.411.864 se describe un
procedimiento para purificar tPA humano a partir de
CHO-PA. Este procedimiento comprende poner en
contacto un fluido que contiene el tPA humano con anticuerpos que se
unen específicamente al correspondiente CHO-PA
endógeno y que recuperan el tPA humano. Preferentemente la etapa de
contacto implica pasar el fluido a través de un lecho
cromatográfico que tiene anticuerpos inmovilizados en su
interior.
El desarrollo de productos farmacéuticos de
proteínas derivadas de ADN recombinante se ha facilitado mediante la
introducción de nuevos procedimientos analíticos que se pueden
utilizar para caracterizar proteínas y/o para demostrar la
consistencia de la fabricación de una proteína. La cartografía del
péptido es un procedimiento clave para controlar la secuencia de
aminoácidos y es capaz de detectar pequeños cambios en proteínas de
tamaño pequeño a moderado, por ejemplo, insulina y hormona del
crecimiento humano. El análisis de una proteína mucho mayor p. ej.:
fibrinógeno (masa molecular de 350.000) o de glucoproteínas
heterogéneas, tales como anticuerpo (masa molecular de 150.000),
está impedida por la complejidad de la gama de péptidos generada
por digestión enzimática. Tal complejidad hace que una sola
separación por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase
inversa (RP-HPLC) combinada con detección
ultravioleta en línea sea de utilidad limitada.
La aparición de los sistemas de HPLC combinada y
espectrometría de masas por ionización con electroatomización
disponible en el comercio (LC-ES-MS)
compatibles con HPLC por convección ha aumentado considerablemente
la potencia de la cartografía del péptido (Ling et al., Anal.
Chem. 63: 2909-2915 (1991); Guzetta et al.,
Anal. Chem., 65: 2953-2962 (1993)).
LC-ES-MS en combinación con la
disociación provocada por colisiones en la fuente (CID) se ha
utilizado eficazmente para identificar zonas de glucosilación
unidas a N y O (Carr et al., Protein Sci., 2:
183-196 (1993); Huddleston et al., Anal. Chem.,
65: 877-884 (1993); Conboy y Henion, J. Am.
Soc. Mass Spectrom., 3: 804-814 (1992)). Sin
embargo, incluso esta técnica está limitada por la insuficiente
resolución que resulta de los numerosos péptidos muy similares
producidos por la glucosilación de proteínas variables y las
digestas enzimáticas de glucoproteínas de tamaño moderado. Es
necesario, por lo tanto, emplear una gama de técnicas con
selectividad ortogonal para caracterizar tales muestras.
Se ha investigado la utilización de combinaciones
de electroforesis capilar de alto rendimiento, HPLC,
LC-ES-MS y el periodo de ionización
de la desorción con láser asistida por la matriz de la
espectrometría ligera de masas para permitir la caracterización de
digestas enzimáticas de muestras de glucoproteínas sin derivar, tal
como se ejemplifica en DSPA\alpha1, activador de plasminógeno de
una cadena procedente de las glándulas salivales de un murciélago
(Apffel et al., J. Chromatography A., 717:
41-60 (1995)). Se llegó a la conclusión que estas
cuatro técnicas son técnicas muy complementarias para examinar
glucoproteínas. No obstante, los autores reconocen que se necesita
realizar más trabajo para mejorar la potencia de este planteamiento
y que requerirá etapas de concentración de alto rendimiento debido
a la heterogeneidad extensiva de los carbohidratos.
Es necesaria una técnica para controlar las
cantidades relativas y absolutas de CHO-PA presente
después de realizar un procedimiento de purificación de tPA, tal
como el indicado en la patente U.S. nº 5.411.864, supra.
Por consiguiente, se desarrolló en la presente
invención un procedimiento de HPLC en fase inversa para el análisis
de las tres moléculas trombolíticas, CHO-tPA, tPA
humano recombinante con secuencia natural y TNK-tPA.
Este procedimiento no sólo tiene capacidad para resolver el tPA
humano y/o el TNK-tPA de CHO-PA,
sino también es capaz de identificar y cuantificar diferentes
isoformas de cada molécula.
Particularmente, la presente invención
proporciona un procedimiento para controlar la eficacia de un
proceso de purificación eliminando el activador del plasminógeno
(PA) endógeno para las células del ovario del hámster chino (CHO)
de una muestra que contiene tPA humano o sus variantes, cuyo proceso
comprende incubar la muestra con una proteasa capaz de escindir de
forma específica el enlace Arg_{275}-Ile_{276}
del tPA humano de tipo natural y a continuación, con agentes
desnaturalizantes y reductores en cantidades eficaces, reducir los
enlaces disulfuro del tPA humano de tipo natural; sometiendo la
muestra a una etapa de cromatografía líquida de alto rendimiento en
fase inversa y analizando la cantidad de PA endógeno en el perfil
de elución de la etapa de cromatografía en las células de CHO en
que está presente.
La Figura 1 presenta un análisis de HPLC en fase
inversa de r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA naturales.
La Figura 2 presenta un análisis de HPLC en fase
inversa de r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA tratados con DTT/urea. Se trataron
activadores de plasminógeno con DTT/urea antes de la
cromatografía.
La Figura 3 presenta un análisis de HPLC en fase
inversa de plasmina y r-tPA,
TNK-tPA y CHO-PA tratados con
DTT/urea. Se sometieron activadores de plasminógeno a tratamiento
con plasmina seguido de tratamiento con DTT/urea antes de la
cromatografía.
Los términos "activador de plasminógeno del
tejido" y "tPA" se refieren al activador de plasminógeno
(tipo tejido) extrínseco humano que posee actividad fibrinolítica,
que presenta típicamente una estructura con cinco dominios (dedo,
factor de crecimiento, estratificado-1,
estratificado-2 y dominios de proteasa), pero no
obstante puede tener pocos dominios o puede tener algunos de sus
dominios repetidos si todavía funciona como agente trombolítico y
conserva las zonas de glucosilación unidas a N en las posiciones
117, 184 y 448. En el mínimo, el tPA está constituido por un dominio
de proteasa que es capaz de transformar el plasminógeno en plasmina
y una zona N-terminal que se cree que es por lo
menos parcialmente responsable de la unión a la fibrina y conserva
las zonas de glucosilación unidas a N en las posiciones 117, 184 y
448 del tPA humano natural. La conservación de estas zonas de
glucosilación se debe al hecho de que la ocupación de la zona
variable del tPA natural recombinante y derivado del melanoma
conduce a la producción de dos variantes, denominadas "tPA de tipo
I" y "tPA de tipo II", respectivamente. El tPA de tipo I
contiene oligosacáridos unidos a N en las posiciones 117, 184 y 448.
El tPA de tipo II contiene oligosacáridos unidos a N en las
posiciones 117 y 448. Debe entenderse que existen variaciones
alelas naturales y pueden tener lugar entre individuos, tal como se
demostró mediante una o más diferencias en la secuencia de
aminoácidos de tPA de cada individuo.
Los términos "activador de plasminógeno del
tejido humano de tipo natural", "tPA humano de tipo
natural", "activador de plasminógeno del tejido humano
natural" y "tPA humano natural", en los que "tPA
humano" se puede abreviar como "htPA", se refieren al tPA
humano con secuencia natural, es decir, el codificado por la
secuencia de ADNc descrita en la patente U.S. nº 4.766.075,
concedida el 23 de agosto de 1988. Los números o posiciones de la
zona de aminoácidos en la molécula de tPA están etiquetados según
la patente U.S. nº 4.766.075.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las
referencias a varios dominios de tPA significan los dominios del
tPA humano de tipo natural definidos anteriormente y partes
funcionalmente equivalentes del tPA humano que presentan
alteraciones de aminoácidos comparadas con la secuencia del tPA
humano natural o del tPA (natural o variante) de otros orígenes,
tal como el activador de plasminógeno del tejido de murciélago (PA
de murciélago). Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente
memoria, el término "dominio de proteasa" se refiere a la zona
que abarca desde la posición del aminoácido 264 a la posición del
aminoácido 527, inclusive, de la forma madura del tPA humano de tipo
natural y a las partes funcionalmente equivalentes del tPA humano
que presentan alteraciones de aminoácidos comparadas con la
secuencia de tPA humano natural o de tPA de otros orígenes, tal
como el PA de murciélago.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"variantes de tPA" se refiere a moléculas que se diferencian
del tPA natural en uno o más cambios o modificaciones de
aminoácidos en aminoácidos existentes. La variante preferida en la
presente memoria es TNK- tPA. La modificación para cambiar o
insertar el/los aminoácido(s) apropiado(s) en la
molécula natural para efectuar las variaciones de secuencia deseadas
se realiza por cualquier medio conocido en la materia, tal como p.
ej.: mutagénesis direccionada a la zona o ligadura de la secuencia
apropiada en el ADN que codifica la proteína relevante.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"TNK-tPA" se refiere a la molécula de tPA en
la que Thr103 ó tPA de tipo natural se cambia por Asn (T103N),
Asn117 de tPA de tipo natural se cambia a Gln (N117Q) y 296 a 299
Lys-His-Arg-Arg de
tPA de tipo natural se cambia a
Ala-Ala-Ala-Ala
(KHRR296- 299AAAA). Dicho TNK está descrito además en la patente
U.S. nº 5.612.029.
El término "célula de ovario de hámster
chino" o "célula CHO" se refiere a las células o líneas
celulares procedentes de ovarios de hámster chino, tal como se
describen, por ejemplo, en el documento EP 117.159, publicado el 29
de agosto de 1989; patente U.S. nº 4.766.075; nº 4.853.330 y nº
5.185.259 (Lubiniecki et al., en Advances in Animal Cell
Biology and Technology for Bioprocesses, Spier et al.,
eds. (1989), págs. 442-451), además de derivados de
CHO tales como CHO/-DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77: 4216 (1980)), CHO-K1 DUX B11
(Simonsen y Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:
2495-2499 (1983); (Urlaub y Chasin, supra) y
células dp12.CHO (patente europea EP nº 307.247 publicada el 15 de
marzo de 1989). Las células huésped preferidas incluyen células de
CHO-K1 DUX B11 y dp12.CHO.
Las células de CHO desarrolladas para la
producción de tPA a gran escala se mantienen criogénicamente en un
sistema del banco de células de trabajo/MCB (WCB) descrito por
Wiebe et al., en Large Sale Mammalian Cell culture
Technology, Lubiniecki, ed., (Marcel Dekker, Nueva York, 1990),
págs. 147-160. Se han depositado células DHFR+
CHO-K1 transfectadas con ADN que codifica el tPA
humano en la American Type Culture Colletion, Manassas, Virginia
(ATCC) y están disponibles con el número de acceso CCL 61. Se ha
depositado una muestra de otra línea celular de CHO que produce tPA
(línea celular 1-15_{15} de CHO) con el número de
acceso ATCC CRL 9606. Esta última línea celular se señaló que
produce concentraciones de tPA humano que se aproximan a 50
pg/célula/día.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"activador del plasminógeno de CHO" o
"CHO-PA" se refiere al activador del
plasminógeno que producen las células de CHO de forma endógena.
Este PA endógeno expresado por las células de CHO presenta una
secuencia ligeramente diferencia (idéntica aproximadamente en el
80%) del tPA humano de tipo natural. El CHO-PA no es
un PA de tipo natural.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"proteasa" se refiere a un enzima que es capaz de escindir
específicamente el enlace Arg_{275}- Ile_{276} del tPA humano
de tipo natural. Los ejemplos comprenden plasmina (o plasminógeno,
que se transforma en plasmina), calicreína del tejido o Factor Xa,
además de cualesquiera de las proteasas similares a tripsina, que
pueden efectuar esta proteólisis específica, limitada. Las
proteasas seleccionables se describen además en Ichinosi et al.,
FEBS Letters, 175: 412-418 (1984). En la
presente memoria se prefiere plasmina/plasminógeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"agentes desnaturalizantes/reductores" o "agente
desnaturalizante y agente reductor" se refiere a una combinación
de desnaturalizante y reductor que reduce los enlaces disulfuro del
tPA humano de tipo natural. Preferentemente, el agente
desnaturalizante es guanidina o urea y el agente reductor es
ditioltreitol (DTT) ó
2-mercaptoetanol.
2-mercaptoetanol.
Después de la producción recombinante, se
recuperan el tPA o la variante de tPA del medio de cultivo de CHO,
como proteína segregada o a partir de los lisados de célula huésped
cuando se expresan directamente sin una señal segregadora. Es
necesario purificar el tPA o su variante de las proteínas de la
célula huésped para obtener preparaciones que son prácticamente
homogéneas en relación con la proteína. Como primera etapa, se
centrifuga o se filtra el medio de cultivo o lisado para eliminar
los desechos celulares en partículas.
El tPA humano o su variante se purifica a
continuación a partir de las correspondientes proteínas endógenas
contaminantes, tal como CHO-PA, mediante técnicas
tales como fraccionamiento o inmunoafinidad o columnas de
intercambio iónico tal como se describe, por ejemplo, en la patente
U.S. nº 5.411.864; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa;
cromatografía sobre sílice o sobre resina de intercambio catiónico,
tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato de amonio; o utilizando electroforesis en
gel, por ejemplo, Sephadex G-75. Un inhibidor de
proteasa que no interfiere en la actividad de tPA, tal como el
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) puede ser también útil para
inhibir la degradación proteolítica durante la purificación y los
antibióticos pueden estar incluidos para prevenir el desarrollo de
contaminantes adventicios. Cualquier experto en la materia
reconocerá que los procedimientos de purificación adecuados para el
tPA de tipo natural pueden requerir modificación para tener en
cuenta los cambios en el carácter de tPA o sus variantes en la
expresión en el cultivo celular recombinante.
En una forma de realización preferida, si se está
produciendo una variante de tPA, se segrega y el sobrenadante se
pasa a través de una columna de bolas de cristal preacondicionada
con PBS acoplada a un anticuerpo A6 policlonal de cabra
anti-tPA, se equilibra la columna con un tampón y se
eluye a continuación la variante de tPA.
En la presente memoria la invención se refiere al
control de las concentraciones de CHO-PA natural
(incluyendo la determinación cualitativa y cuantitativa) en una
muestra tomada de dichos sistemas de purificación que contienen por
lo menos una forma de tPA humano que se produce en las células de
CHO. El proceso comprende incubar la muestra con una proteasa capaz
de escindir de forma específica el enlace
Arg_{275}-Ile_{276}. Esto se sigue con la incubación de la muestra tratada con proteasa con una combinación de un agente desnaturalizante y reductor en cantidades relativas y absolutas apropiadas para efectuar la reducción de enlaces disulfuro en el tPA humano de tipo natural. Como el tratamiento con agentes desnaturalizantes y reductores da lugar a la pérdida de la actividad del enzima, la incubación con proteasa tiene lugar en primer lugar.
Arg_{275}-Ile_{276}. Esto se sigue con la incubación de la muestra tratada con proteasa con una combinación de un agente desnaturalizante y reductor en cantidades relativas y absolutas apropiadas para efectuar la reducción de enlaces disulfuro en el tPA humano de tipo natural. Como el tratamiento con agentes desnaturalizantes y reductores da lugar a la pérdida de la actividad del enzima, la incubación con proteasa tiene lugar en primer lugar.
Después de la incubación, la muestra se somete a
una etapa de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase
inversa y se analiza la cantidad de PA endógeno en las células CHO
presentes en éste en el perfil de elución de la etapa de
cromatografía. Preferentemente, la proteasa es plasminógeno, que
transforma la forma activa, plasmina, el tPA humano es tPA con
secuencia natural y la variante de Tpa es
TNK-tPA.
La etapa de incubación consecutiva con la
proteasa seguida de los agentes desnaturalizantes/reductores tiene
lugar típicamente a una temperatura de aproximadamente 30 a 40ºC,
más preferentemente aproximadamente de 36 a 38ºC y lo más
preferentemente aproximadamente a 37ºC, durante un mínimo de
aproximadamente 15 minutos, más preferentemente aproximadamente de
20 a 40 minutos.
Asimismo, preferentemente antes de la incubación,
se diluye la muestra con un tampón de digestión, que tiene
preferentemente un pH de aproximadamente 7 a 8, más preferentemente
el tampón fosfato a pH 7,4-7,6 y más preferentemente
conteniendo además arginina.
Para los fines de la presente invención se puede
utilizar cualquier columna de HPLC adecuada en la que se cargue la
muestra, incluyendo a escala preparativa o analítica. La columna
está típicamente equilibrada durante 15 minutos por lo menos antes
de la inyección de la muestra. El tamaño de la columna, material de
la columna, caudal, tampones de elución, tipo de gradiente, volumen
de inyección y tamaño de partícula de la columna depende de varios
factores, incluyendo el tamaño de la muestra que se está examinando,
el tipo de composición y gradiente de la fase móvil y las formas de
tPA que se distinguen.
El disolvente de carga puede ser cualquier
disolvente pero preferentemente es un disolvente basado en
acetonitrilo, tal como agua, acetonitrilo y ácido trifluoroacético
(TFA). Preferentemente, la columna es una columna empaquetada
Zorbax C8, Vydac o Baker C18 con un medio que tiene un diámetro de
partícula de aproximadamente 4 a 40 \mum, más preferentemente
aproximadamente 5 a 15 \mum y un tamaño de poro de
aproximadamente 100 a 4000 \ring{A}, más preferentemente
aproximadamente 150 a 350 \ring{A}. Asimismo, el medio tiene
preferentemente un grupo alquilo C4, C8 o C18 y más preferentemente
es un medio de sílice con C8. Preferentemente, la elución se
realiza con un disolvente constituido por acetonitrilo, tal como
agua, acetonitrilo y TFA, en un formato de gradiente durante 60 a
100 minutos, preferentemente in gradiente lineal, en el que se
aumenta la cantidad relativa de acetonitrilo en el disolvente. En
otra forma de realización preferida, se emplea un gradiente con
pendiente suave de aproximadamente acetonitrilo al 0,25%.
Si en la presente memoria el análisis de pureza
indica que la técnica empleada con éxito elimina
CHO-PA, las etapas de purificación adicionales se
pueden realizar a medida que sea necesario para eliminar cualesquier
otros contaminantes. Si la técnica no eliminó con éxito
CHO-PA a concentraciones aceptables, se puede
utilizar un esquema de purificación diferente y repetir el proceso
en la presente memoria para determinar en qué medida es eficaz este
esquema.
Después de la purificación final, se puede
formular el tPA o su variante según los procedimientos conocidos
para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante las
cuales se combina el producto tPA en mezcla con un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones, además de sus
dosificaciones y utilizaciones, están bien descritas en la
bibliografía. Por ejemplo, el tPA o su variante se administra
adecuadamente por vía parenteral a pacientes que padecen
enfermedades cardiovasculares o dolencias y apoplejía.
Los siguientes ejemplos están destinados a
ilustrar una forma de realización conocida actualmente para poner
en práctica la invención, pero la invención no se considera
limitada a estos ejemplos. Todas las citas bibliográficas expuestas
al público y patentadas de la presente memoria se incorporan
expresamente como referencia.
ACTIVASE® (r-tPA) y
TNK-tPA se adquirieron en Genentech, Inc. (San
Francisco Sur, CA) en forma purificada a partir de las células de
CHO. Véase también, por ejemplo, las patentes U.S nº 4.766.075 y nº
5.753.486 para r-tPA de ACTIVASE® y la patente U.S.
nº 5.612.029 para TNK-tPA.
El anticuerpo monoclonal nº 354 para
CHO-PA se produjo tal como se describe en la
patente U.S. nº 5.411.864. En resumen, se inmunizó un ratón Balb/c
hembra durante un periodo de 12 semanas con soluciones de proteína
sustancialmente enriquecidas en activador de plasminógeno de CHO
purificado en células huésped que carecen de tPA humano. Se
administraron cinco inyecciones constituidas cada una por
aproximadamente 30 \mug. La inyección inicial se emulsionó con
adyuvante completo de Freund y se administró en zona(s)
subcutánea(s). La segunda inyección administrada 1,5 semanas
después se emulsionó con adyuvante completo de Freund y se
administró la mitad por vía subcutánea y la otra mitad por vía
intraperitoneal. Las tres inyecciones restantes se administraron
las semanas 3, 6 y 12 en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) administrada en una zona intraperitoneal.
Se extirpó el bazo de los ratones inmunizados la
semana 13 y se fusionaron las células del bazo con la línea celular
NP3X63-Ag8.653 de mieloma de ratón utilizando los
procedimientos generales de Fazekas et al., J. Immunol.
Methods 35: 1 (1980) y Lane, J. Immunol. Methods 81: 223
(1985). Se distribuyeron las células fusionadas en diez placas de
microvaloración conteniendo cada una 96 pocillos. En cada pocillo
se identificó la producción de anticuerpo específico utilizando
reactividad diferencial en dos ensayos ELISA (Ensayo inmunosorbente
con enzima ligado). Un ELISA detectó específicamente anticuerpos
contra CHO-PA y el segundo detectó anticuerpos que
interreaccionan con tPA recombinante humano.
Aproximadamente el 5% de los pocillos totales
fueron reactivos solamente con CHO-PA y el 3%
reaccionó con CHO-PA y tPA humano.
Se expandieron y clonaron las células de
hibridoma de los pocillos que contienen anticuerpos específicos
para CHO-PA limitando la dilución (Oi y Herzenberg,
"Immunoglobin-Producing Hybrid Cell
Lines", págs. 351-372 en Selected Methods
in Cellular Immunology, Mishell y Shiigi, eds. (W.H. Freeman y
Co., 1980)). Los cultivos celulares de células de hibridoma o la
inyección de células de hibridoma en ratones produjeron grandes
cantidades de anticuerpos monoclonales específicos, produciendo de
este modo tumores de ascitis. MAb 354 fue un anticuerpo resultante
que redujo más de aproximadamente 100 veces las concentraciones de
CHO-PA en un solo paso de columna cuando se
inmoviliza y es estable a varias químicas de inmovilización
diferentes y condiciones severas de lavado.
Se purificó MAb 354 utilizando las etapas
indicadas anteriormente, todas las etapas se realizaron a
temperatura ambiente. La concentración se realizó de la forma
siguiente: El fluido de recolección (HF) del cultivo de la
suspensión de hibridoma se filtró a través de un filtro de 0,2
\mum. Se concentró el fluido de cultivo por ultrafiltración, por
cromatografía o por resina de intercambio iónico.
La purificación por afinidad se realizó de la
forma siguiente: Se añadió timerosal a la solución concentrada de
MAb HF a aproximadamente 0,02%. Se ajustó la solución a
aproximadamente glicina 1,5 M, NaCl 3,0 M, pH 9,0 por adición de
glicina 3,0 M seguida de adición de NaCl cristalino. La proteína A
presenta escasa unión a Ab, de este modo la adición de NaCl y de
glicina aumenta la interacción hidrófoba, con el fin de facilitar
la unión de Ab. Se clarificó la solución por filtración. El MAb HF
concentrado clarificado se aplicó a una columna de proteína A
inmovilizada en agarosa. Se lavó el MAb unido con el tampón
utilizado para equilibrar la columna, que tiene la composición
aproximada de glicina 1,5 M NaCl 3,0 M, EDTA 0,02 M, pH 9,0. Se
eluyó el MAb con citrato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, tampón de pH
3,0. Se regeneró la columna de la proteína A lavando con NaSCN 3,0
M, TRIS 0,03 M, pH 8,5 y se reequilibró. Se recogió el pico de MAb
eluido basándose en el perfil de absorbancia a 280 nm. El pico de
MAb eluido con citrato se neutralizó inmediatamente mediante
recogida en el tampón con la composición aproximada:
TRIS-HCl 1,5 M, pH 9,0. Después de la utilización,
se desempaquetó la columna con proteína A y se almacenó en
recipientes sellados a 2-8ºC en timerosal
aproximadamente al 0,02% como tampón de almacenamiento.
El 354 MAb fue a continuación el tampón
intercambiado por diafiltración. La diafiltración procedió hasta
que la condutividad y el pH fueron similares a los valores para
TRIS 0,03 M, NaCl 0,05 M, tampón de pH 8,5.
Se aplicó posteriormente MAb a una columna de
cromatografía de intercambio iónico que contiene soporte de agarosa
DEAE-FAST FLOW™ y se lavó con TRIS 0,03 M, NaCl
0,05 M, tampón de pH 8,5. El MAb fue la etapa eluida con un tampón
que tiene aproximadamente la composición: TRIS 0,03 M, NaCl 0,15 M,
pH 8,5. Se recogió el pico de MAb eluido basándose en el perfil de
absorbancia a 280 nm.
Se filtró el MAb (0,2 \mum) en recipientes
sellados esterilizados y se almacenó por debajo de -40ºC.
El plasminógeno se adquirió en Fluka (Suiza). El
acetonitrilo, calidad HPLC, se adquirió en Burdick & Jackson
(Muskgon, MI) y el ácido trifluoroacético (TFA) fue de Pierce
(Rockford, IL). Se purificó el agua para la fase móvil de HPLC y
las soluciones con un sistema MILLI-Q™ de Millipore
(Milford, MA). Todos los demás productos químicos eran de calidad
reactivo de Sigma (San Luis, MO).
Se aisló CHO-PA del líquido de
cultivo de células CHO mediante cromatografía por afinidad seguido
de inmunoabsorción. Se utilizó resina de lisina hiper D de BioSepra
(París, Francia) para la cromatografía por afinidad, a medida que
la lisina se une a la zona estratificada 2 de los activadores de
plasminógeno (Cleary et al., Biochem, 28,
1884-1890 (1989)). Se condujo la inmunoabsorción
utilizando anticuerpo nº 354 monoclonal específico
CHO-PA (MAb nº 354). El MAb nº 354 se acopló al gel
de SEPHAROSE 4B™ activado con CNBr según el protocolo del vendedor
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se acoplaron aproximadamente
10 mg de MAb nº 354 por ml del gel de Sepharose 4B activado con
CNBr. Después del acoplamiento, se empaquetó una columna de
SEPHAROSE 4B™ con MAb nº 354.
Se cargó el líquido de cultivo celular de CHO
conteniendo CHO-PA segregado en una columna con
afinidad por la lisina preequilibrada con un tampón de equilibrado
que contenía fosfato de sodio 50 mM y detergente POLYSORBATE 80™ al
0,01% a pH 7,5. Después de la carga, se lavó la columna de afinidad
a la lisina tres veces: la primera con el tampón de equilibrado,
seguido de un tampón que contiene TRIS 40 mM, NaCl 800 mM y
POLYSORBATE 80™ al 0,008% a pH 8,0 y por último con el tampón de
equilibrio. Se eluyó a continuación con CHO-PA en la
columna de afinidad a la lisina con un tampón que contenía un
tampón de fosfato de sodio 50 mM, L-arginina 200 mM
y POLYSORBATE 80™ al 0,01% a pH 7,5. Después de equilibrar con
solución salina tamponada con fosfato (PBS, 8 g/l de NaCl, 0,2 g/l
de KCl, 1,44 g/l de Na_{2}HPO_{4} y 0,24 g/l de
KH_{2}PO_{4} a pH 7,4), se cargó la columna de SEPHAROSE 4B™ con
MAb nº 354 con el pozo de elución de la columna con afinidad a la
lisina. Después de la carga, se lavó la columna con un tampón
conteniendo Na_{2}HPO_{4} 9,5 mM, NaCl 1 M y propilenglicol al
5% (v/v) a pH 7,4. Se eluyó el CHO-PA unido en la
columna con glicina-HCl 0,2 M a pH 2,5. Se controló
la elución espectrofotométricamente a 280 nm y se neutralizaron las
fracciones que contienen CHO-PA con 0,14 volúmenes
de arginina-fosfato 1,5 M (pH 8,0) inmediatamente
en el momento de la recolección. Se confirmó la identidad y pureza
del CHO-PA eluido por SDS-PAGE y los
análisis de secuencia de aminoácidos.
Se diluyó la solución que contiene
activador(es) de plasminógeno 1:1 (v/v) con un tampón de
desnaturalización (urea 8 M, TRIS 0,5 M y EDTA 3,2 mM a pH 8,4). Se
añadió ditiotreitol (DTT) de una solución madre 1 M hasta una
concentración final de 20 mM y se incubó la mezcla a 37ºC durante 30
minutos.
Se diluyó la solución que contiene
activador(es) de plasminógeno 1:3 (v/v) con el tampón de
digestión (Na_{2}HPO_{2} 125 mM, arginina 200 mM y NaN_{3}
0,01% a pH 7,5). Se añadió una centésima (p/p) de plasminógeno y se
incubó la mezcla a 37ºC durante 30 min.
Se llevó a cabo el ensayo en un sistema
Hewlett-Packard 1090M™ (Hewlett Packard, Avondale,
PA) en una columna Zorbax SB-C8 de 4,6 mm !68! 250
mm, tamaño de partícula 5 \mum, resina de poro 300 \ring{A}
(Mac-Mod, Chadds Ford, PA). Se equilibró la columna
durante por lo menos 15 minutos antes de la inyección de la
muestra. La composición inicial de la fase móvil fue 70/30/0,1
(v/v/v) de agua/acetonitrilo/TFA. Después de una pausa inicial de
cinco minutos, se realizó un gradiente lineal en 80 minutos (para
las Figs. 1 y 2) y en 60 minutos (para Fig. 3) a 50/50/0,1 (v/v/v)
de agua/acetonitrilo/TFA. Inmediatamente después del gradiente, se
regeneró la columna durante 10 minutos con 100/0,1 (v/v) de
acetonitrilo/TFA. Se volvió a llevar a continuación la composición a
las condiciones iniciales en 5 minutos y se reequilibró el sistema
para la próxima inyección. El volumen de inyección fue de 250 ml y
el caudal fue 1 ml/min. Se condujo la cromatografía a 40ºC. Se midió
la fluorescencia con un detector de fluorescencia programable
Hewlett-Packard 1046A™ (Ex = 275 nm y Em = 340 nm).
Se registraron los cromatogramas y se analizaron con el programa
informático CHEMSTATION™ Hewlett-Packard.
Debido a la gran analogía de secuencia, ACTIVASE®
(r-tPA), TNK-tPA y
CHO-PA presentan propiedades bioquímicas/biofísicas
muy similares. Se necesitan procedimientos analíticos y
preparativos capaces de resolver estos tres activadores de
plasminógeno entre sí o capaces de resolver tPA de
CHO-PA o TNK- tPA de CHO-PA para el
desarrollo del proceso de recuperación y para estimar la pureza de
cada molécula para estudios clínicos y producción comercial. En la
presente memoria se describe un procedimiento sencillo de HPLC en
fase inversa que lleva a cabo estos objetivos.
Con una pendiente suave de gradiente a 0,25% de
acetonitrilo por minuto y sin proteasa o agentes
desnaturalizantes/reductores, la HPLC en fase inversa no fue capaz
de separar la forma natural de r-tPA del
CHO-PA nativo (Figura 1). Sin embargo, la forma
nativa de TNK-tPA se resolvió muy bien tanto en
r-tPA natural como en CHO-PA en
estas condiciones. Después, se realizó el tratamiento con DTT/urea
para reducir los enlaces disulfuro y desnaturalizar las proteínas.
Para las tres proteínas, el enlace péptido entre Arg_{275} e
Ile_{276} es muy susceptible a la escisión por proteasa. A lo
largo del tiempo, está susceptibilidad conduce a la heterogeneidad
para r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA en solución. Una pequeña cantidad de la
forma de una cadena se transforma en la forma de dos cadenas debido
a la escisión por la proteasa. El tratamiento con DTT/urea reduce
el enlace disulfuro entre Cys_{264} y Cys_{395} que mantiene la
forma de dos cadenas de la molécula juntas, produciendo la
disociación de la molécula en dos fragmentos (el fragmento
estratificado y el fragmento de proteasa).
La Figura 2 demuestra que, en la misma pendiente
de gradiente, la HPLC en fase inversa fue capaz de resolver la
forma de una cadena de las tres moléculas trombolíticas entre sí
después del tratamiento con DTT/urea. Las tres proteínas
presentaban perfiles de elución similares en el fragmento
estratificado de la forma de dos cadenas que se eluye en primer
lugar, la forma de una cadena que se eluye en segundo lugar y el
fragmento de proteasa de la forma de dos cadenas que se eluye al
final. Los fragmentos respectivos de proteasa de los tres
activadores de plasminógeno se resolvieron bien también entre sí,
mientras que los fragmentos estratificados para las tres moléculas
no se separaron bien. Por consiguiente, este procedimiento se puede
utilizar para detectar y cuantificar la fragmentación de la forma
de una cadena en la forma de dos cadenas de los activadores de
plasminógeno.
La heterogeneidad observada en los perfiles de
r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA (Figura 2) hace muy difícil la
cuantificación de estas moléculas, especialmente cuando se trata e
cuantificar cada molécula individual en una mezcla de
r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA. Para eliminar la heterogeneidad asociada a
la proteólisis, todas las formas de una cadena se transformaron en
forma de dos cadenas incubando con plasminógeno. Plasminógeno es el
sustrato del activador de plasminógeno en el sistema fibrinolítico
natural. r-tPA, TNK-tPA y
CHO-PA presentan actividad enzimática de escisión
del enlace péptido Arg_{560}-Val_{561} de
plasminógeno. Dicha escisión transforma el plasminógeno en su forma
activa, plasmina. La plasmina es una serina proteasa con
especificidad baja y es capaz de escindir el enlace péptido
Arg_{275}-Ile_{276} en r-tPA,
TNK-tPA y CHO-PA. Como resultado la
incubación con plasminógeno transforma la forma de una cadena de los
tres activadores de plasminógeno en la forma de dos cadenas.
Después del tratamiento con plasmina, se trataron
las muestras con DTT/urea para reducir los enlaces disulfuro y
disociar de este modo la forma de dos cadenas de la molécula en dos
fragmentos discretos. La Figura 3 presenta los perfiles de HPLC en
fase inversa para los activadores de plasminógeno tratados con
plasmina y DTT/urea. Los respectivos fragmentos de proteasa de las
tres proteínas se separaron bien entre sí, mientras que los
fragmentos estratificados de las tres moléculas no se resolvieron.
Por consiguiente, se utilizó el fragmento de proteasa para la
integración y cuantificación de cada activador de plasminógeno.
Tanto para r-tPA como para TNK-tPA,
los fragmentos estratificados de los isozimas de tipo I y tipo II
se separaron bien. Como resultado, este procedimiento es también
útil para la cuantificación de la relación de tipo I a tipo II
tanto para r-tPA como para
TNK-tPA.
La disponibilidad de este procedimiento de HPLC
en fase inversa facilita en gran medida el desarrollo del proceso
de fabricación. Se ha utilizado para evaluar el efecto de
diferentes condiciones de fermentación en la calidad del producto
con relación a la integridad del producto (es decir el porcentaje de
una cadena) y la relación de isozimas de tipo I y tipo II. Se ha
utilizado también para ayudar al desarrollo del proceso de
purificación y para asegurar la consistencia entre los lotes de
producción. Todas estas aplicaciones ejemplifican el papel crucial
de los procedimientos analíticos y comerciales en el desarrollo de
nuevos productos farmacéuticos.
Claims (11)
1. Procedimiento para controlar la eficacia de un
proceso de purificación en la eliminación del activador de
plasminógeno (PA) endógeno para las células del ovario del hámster
chino (CHO) de una muestra que contiene tPA humano o sus variantes,
comprendiendo dicho procedimiento incubar la muestra con una
proteasa capaz de escindir de forma específica el enlace
Arg_{275}-Ile_{276} del tPA humano de tipo
natural y a continuación, con un agente desnaturalizante y un
agente reductor en cantidades eficaces, reducir los enlaces
disulfuro del tPA humano de tipo natural; someter la muestra a una
etapa de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa
y analizar la cantidad de PA endógeno en el perfil de elución de la
etapa de cromatografía en las células de CHO en que está
presente.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la proteasa es plasminógeno.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el tPA humano es tPA con secuencia natural.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la variante de tPA es TNK-tPA.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que antes de la incubación se diluye la muestra con un tampón de
digestión.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que el tampón tiene un pH de aproximadamente 7 a 8.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el tampón es un tampón de fosfato.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el
que el tampón comprende además arginina.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el agente desnaturalizante comprende urea o guanidina.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el agente reductor comprende ditiotreitol o
2-mercaptoetanol.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de cromatografía se realiza eluyendo con un
disolvente que comprende acetonitrilo en un formato de
gradiente.
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| TW200821026A (en) * | 2006-09-08 | 2008-05-16 | Wyeth Corp | Arginine wash in protein purification using affinity chromatography |
| EP2407783A1 (en) * | 2006-10-27 | 2012-01-18 | Janssen Pharmaceutica, N.V. | A method for pharmacologically profiling compounds |
| CN101539550B (zh) * | 2009-04-28 | 2012-05-23 | 李绍平 | 用于多糖的定性与定量分析方法 |
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| CN114426962B (zh) * | 2021-12-21 | 2024-06-18 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | t-PA纯化方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| FI831484A7 (fi) | 1982-05-05 | 1983-11-06 | Genentech Inc | Ihmiskudoksen plasminogeenien aktivaattori. |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| US5120535A (en) * | 1986-11-26 | 1992-06-09 | Oncogen | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
| US5411864A (en) * | 1987-11-05 | 1995-05-02 | Genentech, Inc. | Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins |
| GB8919803D0 (en) * | 1989-09-01 | 1989-10-18 | Ciba Geigy | Pharmaceutical compositions |
| JP3559559B2 (ja) | 1992-06-03 | 2004-09-02 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 向上した治療特性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子グリコシル化変異体 |
| US5753702A (en) * | 1996-05-22 | 1998-05-19 | University Of Vermont | Arachidonic acid metabolite, 16-hete |
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