ES2201052T3 - Moleculas de adhesion intercelular y sus ligandos de union. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ES RELATIVA A MOLECULAS DE ADHESION INTERCELULAR (ICAM-1) LAS CUALES ESTAN INCLUIDAS EN EL PROCESO A TRAVES DEL CUAL SE RECONOCEN LINFOCITOS Y SE MIGRAN A PUNTOS DE INFLAMACION ASI COMO SE UNEN A SUSTRATOS CELULARES DURANTE LA INFLAMACION. LA INVENCION VA DIRIGIDA HACIA TALES MOLECULAS, ENSAYOS DE FILTRADO PARA IDENTIFICAR TALES MOLECULAS Y ANTICUERPOS CAPACES DE ENLAZAR TALES MOLECULAS. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYE USOS PARA MOLECULAS DE ADHESION Y PARA LOS ANTICUERPOS QUE SON CAPACES DE ENLAZARLOS.

Description

Moléculas de adhesión intercelular y sus ligandos de unión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de adhesión intercelular tales como ICAM-1 que están implicadas en el proceso por el cual las poblaciones de linfocitos reconocen y se adhieren a sustratos celulares de tal manera que aquéllas pueden migrar a sitios de inflamación e interaccionar con las células durante las reacciones inflamatorias. La presente invención se refiere adicionalmente a moléculas de ligandos capaces de fijarse a tales moléculas de adhesión intercelular, a un ensayo de exploración para estos ligandos, y a usos para la molécula de adhesión intercelular, las moléculas de ligandos, y el ensayo de exploración.

Descripción de la técnica afín

Los leucocitos tienen que ser capaces de fijarse a sustratos celulares con objeto de defender adecuadamente el huésped contra invasores extraños tales como bacterias o virus. Una revisión excelente del sistema de defensa ha sido proporcionada por Eisen, H.W., (en: Microbiology, 3ª Edición, Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), pp. 290-295 y 381-418). Dichos leucocitos tienen que ser capaces de fijarse a las células endoteliales a fin de poder migrar desde la circulación a los sitios en que avanza la inflamación. Adicionalmente, los leucocitos tienen que fijarse a las células presentadoras de antígeno a fin de que pueda producirse una respuesta inmune específica normal, y finalmente, tienen que fijarse a células diana apropiadas a fin de que pueda tener lugar la lisis de las células infectadas por virus o las células tumorales.

Recientemente, se han identificado moléculas superficiales de los leucocitos implicadas en la mediación de tales fijaciones, utilizando tecnología de hibridoma. Resumidamente, se identificaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra células T humanas (Davignon, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4535-4539 (1981)) y células de bazo de ratón (Springer, T. et al., Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979)) que se fijaban a las superficies de los leucocitos e inhibían las funciones relacionadas con la fijación arriba descritas (Springer, T. et al., Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985)). Las moléculas identificadas por dichos anticuerpos se denominaron Mac-I y Antígeno-1 asociado a la Función de los Linfocitos (LFA-1). Mac-I es un heterodímero encontrado en macrófagos, granulocitos y grandes linfocitos granulares. LFA-1 es un heterodímero encontrado en la mayoría de los linfocitos (Springer, T.A. et al., Immunol. Rev. 68:111-135 (1982)). Estas dos moléculas, más una tercera molécula, p150,95 (que tiene una distribución tisular similar a Mac-I) juegan un papel en la adhesión celular (Keizer, G. et al., Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)).

Se encontró que las moléculas de leucocitos arriba descritas son miembros de una familia afín de glicoproteínas(Sánchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol 15:1142-1147(1985)). Esta familia de glicoproteínas se compone de heterodímeros que tienen una cadena \alpha y una cadena \beta. Aunque la cadena \alpha de cada uno de los antígenos difería de uno a otro, se encontró que la cadena \beta estaba altamente conservada (Sánchez-Madrid, F., et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)). Se encontró que la cadena \beta de la familia de las glicoproteínas (a la que se hace referencia algunas veces como "CD18") tiene un peso molecular de 95 kg, mientras que se encontró que las cadenas \alpha variaban de 150 kd a 180 kg (Springer, T., Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985)). Aunque las subunidades \alpha de las proteínas de membrana no comparten la extensa homología compartida por las subunidades \beta, un análisis profundo de las subunidades \alpha de las glicoproteínas ha revelado que existen entre ellas semejanzas sustanciales. Revisiones de las semejanzas entre las subunidades \alpha y \beta de las glicoproteínas afines a
LFA-1 han sido proporcionadas por Sánchez-Madrid, F. et al., (J. Exper. Med. 158: 586-605 (1983); J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)).

Se ha identificado un grupo de individuos que son incapaces de expresar cantidades normales de cualquier miembro de esta familia de proteínas de adhesión en la superficie de sus células leucocitarias (Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); (Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-669 (1985). Los linfocitos de estos pacientes exhibían defectos in vitro similares a equivalentes normales cuya familia de moléculas LFA-1 había sido antagonizada por anticuerpos. Adicionalmente, estos individuos eran incapaces de poner en marcha una respuesta inmune normal debido a una incapacidad de sus células para adherirse a sustratos celulares (Anderson, D.C., et. al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); (Anderson, D.C., et. al., J. Infect. Dis. 152:668-669 (1985). Estos datos demuestran que las reacciones inmunes se mitigan cuando los linfocitos son incapaces de adherirse de una manera normal debido a la falta de moléculas de adhesión funcionales de la familia LFA-1. La expresión de un ligando recientemente identificado de LFA-1, la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1) se investigó en diversos tipos de células en respuesta a citoquinas Rothlein R. et al., J. Immunol., 141:1665-1669 (1988)). La inducción de ICAM-1 era neutralizada por antisueros específicos de citoquinas y algunos agentes farmacológicos. La ciclohexamida aumentaba la expresión de ICAM- 1 en células de condrosarcoma, pero tenía poco o ningún efecto en células de carcinoma. Estos datos indicaban mecanismos diferentes en la regulación y expresión de ICAM-1 en los diversos tipos de células.

Así pues, en resumen, la capacidad de los linfocitos para mantener la salud y la viabilidad de un animal requiere que aquéllos sean capaces de adherirse a otras células (tales como las células endoteliales). Se ha encontrado que esta adherencia requiere contactos célula-célula que implican moléculas receptoras específicas presentes en la superficie celular de los linfocitos. Estos receptores hacen posible que un linfocito se adhiera a otros linfocitos o a células endoteliales, y otras células no vasculares. Se ha encontrado que las moléculas receptoras de la superficie celular están altamente relacionadas unas con otras. Los humanos cuyos linfocitos carecen de estas moléculas receptoras de la superficie celular exhiben infecciones crónicas y recurrentes, así como otros síntomas clínicos que incluyen respuestas de anticuerpos defectuosas.

Dado que la adhesión de los linfocitos está implicada en el proceso por el cual se identifica y se rechaza un tejido extraño, una comprensión de este proceso tiene un valor importante en los campos de trasplante de órganos, injerto de tejidos, alergia y oncología.

Sumario de la invencion

La presente invención se refiere a la Molécula-1 de Adhesión Intercelular (ICAM-1) y a sus derivados funcionales, a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos capaces de inhibir la función de ICAM-1, y a otros inhibidores de la función de ICAM-1. La invención incluye usos terapéuticos para la totalidad de las moléculas arriba descritas.

En detalle, la invención está orientada hacia un método para tratar la inflamación resultante de una respuesta del sistema de defensa específica en un mamífero, que comprende proporcionar a un individuo que necesita dicho tratamiento una cantidad de un agente anti-inflamatorio suficiente para reprimir la inflamación; en el cual el agente anti-inflamatorio se selecciona del grupo constituido por: un anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1; un fragmento de un anticuerpo, siendo capaz el fragmento de fijarse a ICAM-1; ICAM-1; un derivado funcional de ICAM-1; y un antagonista no inmunoglobulínico de ICAM-1.

(p. 6, l. 4-6)

La invención incluye adicionalmente el método descrito anteriormente de tratamiento de la inflamación en el cual el antagonista no-inmunoglobulínico de ICAM-1 es un antagonista no inmunoglobulínico de ICAM-1 distinto de
LFA-1.

La invención incluye una composición farmacéutica que comprende:

(p. 8, l.-7/-3)

(a) un agente anti-inflamatorio seleccionado del grupo constituido por: un anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1, un fragmento de un anticuerpo, siendo el fragmento capaz de fijarse a ICAM-1; ICAM-1; un derivado funcional de ICAM-1; y un antagonista no inmunoglobulínico de ICAM-1, y

(b) al menos un agente inmunosupresor seleccionado del grupo constituido por: dexametasona, azatioprina y ciclosporina A.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra en forma diagramática la adhesión entre una célula normal y una célula deficiente en LFA-1.

La Figura 2 muestra en forma diagramática el proceso de la adhesión de células normal/normal.

La Figura 3 muestra la cinética de la agregación celular en ausencia (X) o presencia de 50 ng/ml de PMA (O).

La Figura 4 muestra la coagregación entre células LFA-1^{-} y LFA-1^{+}. Células transformadas por EBV marcadas con diacetato de carboxifluoresceína (10^{4}) como se designa en la figura se mezclaron con 10^{5} células autólogas no marcadas (barras llenas) o células JY (barras vacías) en presencia de PMA. Al cabo de 1,5 h, las células marcadas, en agregados o libres, se enumeraron utilizando el ensayo cualitativo del Ejemplo 2. Se muestra el porcentaje de células marcadas en los agregados. Se muestra un experimento representativo de dos.

La Figura 5 muestra la inmunoprecipitación de ICAM-1 y LFA-1 a partir de células JY. Lisados con Triton X-100 de células JY (pistas 1 y 2) o tampón de lisis de control (pistas 3 y 4) se inmunoprecipitaron con anticuerpos capaces de fijarse a ICAM-1 (pistas 1 y 3) o anticuerpos capaces de fijarse a LFA-1 (pistas 2 y 4). El panel A presenta los resultados en condiciones reductoras; el Panel B muestra los resultados obtenidos en condiciones no reductoras. En la pista S se corrieron patrones de peso molecular.

La Figura 6 muestra la cinética de los efectos de IL-1 y \gamma-interferón sobre la expresión de ICAM-1 en fibroblastos dérmicos humanos. Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos hasta una densidad de 8 x 10^{4} células/pocillo de 0,32 cm^{2}. Se añadió IL-1 (10 U/ml, círculos llenos) o \gamma-interferón recombinante (10 U/ml, cuadrados vacíos), y en el tiempo indicado, se enfrió el ensayo a 4ºC y se realizó un ensayo de fijación indirecta. La desviación estándar no excedía de 10%.

La Figura 7 muestra la dependencia de la concentración de los efectos de IL-1 y \gamma-interferón sobre ICAM-1. Se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos hasta una densidad de 8 x 10^{4} células/pocillo de 0,32 cm^{2}. Se añadieron IL-2 (círculo vacío), IL-1 humano recombinante (cuadrado vacío), IL-1 recombinante de ratón (cuadrado lleno),
\gamma-interferón humano recombinante (círculos llenos), y \gamma-interferón recombinante (triángulo vacío) a la dilución indicada y se incubaron durante 4 horas (IL-1) o 16 horas (\beta- y \gamma-interferón). Los resultados indicados son los valores medios de determinaciones realizadas por cuadruplicado; la desviación estándar no excedía de 10%.

La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de cDNA de ICAM-1. El primer ATG se encuentra en la posición 58. Las secuencias traducidas correspondientes a péptidos trípticos de ICAM-1 están subrayadas. El péptido de señal supuesto hidrófobo y las secuencias transmembranales tienen una línea de subrayado en negrita. Los sitios de glicosilación enlazados a N se muestran encerrados en cajas. La señal de poliadenilación AATAAA en la posición 2976 está marcada con una raya por encima. La secuencia mostrada corresponde al clon de cDNA HL-60. El cDNA de las células endoteliales se secuenció en la mayoría de su longitud y exhibió solamente diferencias menores.

La Figura 9 muestra los dominios homólogos de ICAM-1 y la relación con la familia de supergenes de las inmunoglobulinas. (A) Alineación de cinco dominios homólogos (D1-5). Dos o más residuos idénticos que estaban alineados se muestran encerrados en cajas. Los residuos conservados dos o más veces en dominios NCAM, así como los residuos conservados en dominios de los conjuntos C2 y C1 estaban alineados con las repeticiones internas de ICAM-1. La localización de las cadenas \beta predichas en el dominio ICAM-1 está marcada con barras y letras minúsculas encima de las alineaciones, y la localización conocida de cadenas \beta en los dominios de inmunoglobulina C está marcada con barras y letras mayúsculas bajo la alineación. La posición del puente de disulfuro supuesto dentro de los dominios ICAM-1 está indicada por S-S. (B-D) Alineación de dominios proteínicos homólogos a los dominios ICAM-1; las proteínas se alinearon inicialmente buscando bases de datos NBRF empleando el programa FASTP. Las secuencias de proteínas son MAG, NCAM, dominio V de la subunidad \alpha de los receptores de células T, cadena IgM\mu y glicoproteína \alpha -1-B.

La Figura 10 muestra una comparación diagramática de las estructuras secundarias de ICAM-1 y MAG.

La Figura 11 muestra células linfoblastoides B transformadas por EBV positivas a LFA-1, que se fijan a ICAM-1 en membranas planas.

La Figura 12 muestra linfoblastos T positivos a LFA-1 y células T de linfoma que se fijan a ICAM-1 en vesículas unidas de material plástico.

La Figura 13 muestra la inhibición de la fijación de la célula linfoblastoide B JY que se fija a ICAM-1 en vesículas unidas de material plástico por pretratamiento de células o vesículas con anticuerpos monoclonales.

La Figura 14 muestra el efecto de la temperatura sobre la fijación de linfoblastos T a ICAM-1 en vesículas unidas de material plástico.

La Figura 15 muestra los requerimientos de cationes bivalentes para la fijación de linfoblastos T a ICAM-1 en vesículas unidas de material plástico.

La Figura 16 muestra el efecto de los anticuerpos anti-adhesión sobre la capacidad de las células mononucleares de la sangre periférica para proliferar en respuesta al reconocimiento del antígeno OKT3 asociado a las células T. "OKT3" indica la adición de antígeno.

La Figura 17 muestra el efecto de los anticuerpos antiadhesión sobre la capacidad de las células mononucleares de la sangre periférica para proliferar en respuesta al reconocimiento del mitógeno de las células T no específico, concanavalina A. "CONA" indica la adición de concanavalina A.

La Figura 18 muestra el efecto de anticuerpos antiadhesión sobre la capacidad de las células mononucleares de la sangre periférica para proliferar en respuesta al reconocimiento del antígeno de hemocianina de lapa perforada. La adición de hemocianina de lapa perforada a las células se indica por "KLH".

La Figura 19 muestra el efecto de los anticuerpos antiadhesión sobre la capacidad de las células mononucleares de la sangre periférica para proliferar en respuesta al reconocimiento del antígeno del toxoide del tétanos. La adición del antígeno del toxoide del tétanos a las células se indica por "AGN".

La Figura 20 muestra la fijación de anticuerpos monoclonales RR1/1, R6.5, LB2, y CL203 a mutantes de deleción de ICAM-1.

La Figura 21 muestra la fijación de mutantes de deleción de ICAM-1 a LFA-1.

La Figura 22 muestra los epítopes reconocidos por los anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1 RR1/1, R6.5, LB2, y CL203.

La Figura 23 muestra la capacidad de fijación de mutantes del dominio 2 de ICAM-1 a LFA-1.

La Figura 24 muestra la capacidad de fijación de mutantes del dominio 3 de ICAM-1 a LFA-1.

La Figura 25 muestra la capacidad de fijación de mutantes del dominio 1 de ICAM-1 a LFA-1.

La Figura 26 muestra la alineación de los dominios aminoterminales de ICAM.

Descripcion de las realizaciones preferidas

Un aspecto de la presente invención se refiere al descubrimiento de un ligando de fijación natural para LFA-1. Se hace referencia a las moléculas tales como las de la familia de LFA-1, que están implicadas en el proceso de la adhesión celular como "moléculas de adhesión".

El ligando de fijación natural de la presente invención se designa "Molécula-1 de Adhesión Intercelular" o
"ICAM-1". ICAM-1 es una glicoproteína de 76-97 Kd. ICAM-1 no es un heterodímero. La presente invención está dirigida hacia ICAM-1 y sus "derivados funcionales". Un "derivado funcional" de ICAM-1 es un compuesto que posee una actividad biológica (sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a una actividad biológica de ICAM-1. La expresión "derivados funcionales" tiene por objeto incluir los "fragmentos", "variantes", "análogos" o "derivados químicos" de una molécula. El término "fragmento" de una molécula tal como ICAM-1, tiene por objeto hacer referencia a cualquier subconjunto polipeptídico de la molécula. Son especialmente preferidos los fragmentos de ICAM-1 que tienen actividad de ICAM-1 y que son solubles (es decir, no están fijados a la membrana). El término "variante" de una molécula tal como ICAM-1 tiene por objeto hacer referencia a una molécula sustancialmente similar en estructura y función a la molécula total, o a un fragmento de la misma. Se dice que una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. Así pues, con tal que dos moléculas posean una actividad similar, las mismas se consideran variantes tal como se utiliza dicho término en esta memoria, aún cuando la estructura de una de las moléculas no se encuentre en la otra, o incluso si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica. El término "análogo" de una molécula como ICAM-1 tiene por objeto hacer referencia a una molécula sustancialmente similar en función a la molécula total o a un fragmento de la misma. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando aquélla contiene restos químicos adicionales que no forman normalmente parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la semi-vida biológica de la molécula, etc. Los restos pueden reducir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Restos capaces de mediar tales efectos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences(1980). Las moléculas "derivatizadas de toxina" constituyen una clase especial de "derivados químicos". Una molécula "derivatizada de toxina" es una molécula tal como ICAM-1 o un anticuerpo) que contiene un resto de toxina. La fijación de dicha molécula a una célula pone el resto de toxina en proximidad estrecha con la célula y promueve de este modo la muerte de la célula. Se puede emplear cualquier resto de toxina adecuado; sin embargo, es preferible emplear toxinas tales como, por ejemplo, la toxina ricina, la toxina de la difteria, toxinas de radioisótopos, toxinas formadoras de canales de membrana, etc. Procedimientos para acoplar tales restos a una molécula son bien conocidos en la técnica.

Una molécula de antígeno tal como ICAM-1, o miembros de la familia de moléculas LFA-1 se expresan naturalmente en las superficies de los linfocitos. Así pues, la introducción de tales células en un animal apropiado, por ejemplo por inyección intraperitoneal, etc., dará como resultado la producción de anticuerpos capaces de fijarse a ICAM-1 o miembros de la familia de moléculas LFA-1. Si se desea, el suero de dicho animal puede separarse y utilizarse como fuente de anticuerpos policlonales capaces de fijarse a estas moléculas. Sin embargo, es preferible separar los esplenocitos de tales animales, fusionar tales células esplénicas con una línea de células de mieloma y permitir que dichas células de fusión formen una célula de hibridoma que secrete anticuerpos monoclonales capaces de fijar ICAM-1 o miembros de la familia de moléculas LFA-1.

Las células de hibridoma, obtenidas de la manera arriba descrita, se pueden explorar por una diversidad de métodos para identificar células de hibridoma deseadas que secreten un anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1 o a miembros de la familia de moléculas LFA-1. En un ensayo de exploración preferido, dichas moléculas se identifican por su capacidad para inhibir la agregación de células transformadas por el virus Epstein-Barr. Los anticuerpos capaces de inhibir dicha agregación se evalúan ulteriormente para determinar si los mismos inhiben tal agregación por fijación a ICAM-1, o a un miembro de la familia de moléculas LFA-1. En dicha exploración se puede emplear cualquier medio capaz de distinguir ICAM-1 de la familia de moléculas LFA-1. Así, verbigracia, el antígeno fijado por el anticuerpo puede analizarse por ejemplo por inmunoprecipitación y electroforesis en gel de poliacrilamida. Si el antígeno fijado es un miembro de la familia de moléculas LFA-1, entonces se encontrará que el antígeno inmunoprecipitado es un dímero, mientras que si el antígeno es ICAM-1 se habrá inmunoprecipitado una especia de peso molecular simple. Alternativamente, es posible diferenciar entre aquellos anticuerpos que se fijan a miembros de la familia de moléculas LFA-1 de aquéllos que se fijan a ICAM-1 por exploración de la capacidad del anticuerpo para fijarse a células tales como granulocitos, que expresan LFA-1, pero no ICAM-1. La capacidad de un anticuerpo (que se sabe inhibe la agregación celular) para fijarse a los granulocitos indica que el anticuerpo es capaz de fijar LFA-1. La ausencia de dicha fijación es indicativa de un anticuerpo capaz de reconocer ICAM-1. La capacidad de un anticuerpo para fijarse a una célula tal como un granulocito se puede detectar por medios empleados comúnmente por quienes poseen experiencia ordinaria. Tales medios incluyen inmunoensayos, aglutinación celular, estudios de fijación en filtro, precipitación de anticuerpos, etc.

Los anticuerpos anti-agregación de la presente invención pueden identificarse alternativamente midiendo su capacidad para unirse diferencialmente a células que expresan ICAM-1 (tales como células endoteliales activadas), y su incapacidad para fijarse a células que no expresan ICAM-1. Como será fácilmente apreciado por quienes poseen una experiencia ordinaria, los ensayos anteriores pueden modificarse, o realizarse en un orden secuencial diferente a fin de proporcionar una diversidad de ensayos de exploración potenciales, cada uno de los cuales es capaz de identificar y discriminar entre anticuerpos capaces de fijarse a ICAM-1 frente a miembros de la familia de moléculas LFA-1.

Los agentes anti-inflamatorios de la presente invención se pueden obtener por procesos naturales (tales como, por ejemplo, por inducción de un animal, planta, hongos, bacterias, etc., a producir un antagonista de ICAM-1 no inmunoglobulínico o por inducción de un animal a producir anticuerpos policlonales capaces de fijarse a ICAM-1); por métodos de síntesis (tales como, por ejemplo, por empleo del método Merrifield de síntesis de polipéptidos para sintetizar ICAM-1, derivados funcionales de ICAM-1, o antagonistas proteínicos de ICAM-1 (sean inmunoglobulinas o distintos de inmunoglobulinas)); por tecnología de hibridoma (tal como, por ejemplo, para producir anticuerpos monoclonales capaces de fijarse a ICAM-1); o por tecnología recombinante (tal como, por ejemplo, para producir los agentes anti-inflamatorios de la presente invención en diversos huéspedes (es decir, levaduras, bacterias, hongos, células de mamífero cultivadas, etc.), o a partir de plásmidos recombinantes o vectores víricos). La elección del método a emplear dependerá de factores tales como la conveniencia, el rendimiento deseado, etc. No es necesario emplear solamente uno de los métodos, procedimientos, o tecnologías arriba descritos, para producir un agente anti-inflamatorio particular; los procedimientos, métodos, y tecnologías arriba descritos se pueden combinar a fin de obtener un agente anti-inflamatorio particular.

A. Identificación del socio de fijación de LFA-1 (ICAM-1) 1. Ensayo de agregación dependiente de LFA-1

Muchas células transformadas por el virus Epstein-Barr exhiben agregación. Esta agregación puede intensificarse en presencia de ésteres de forbol. Se encontró que tal agregación homotípica (es decir, agregación que implica sólo un tipo de célula) es bloqueada por anticuerpos anti-LFA-1 (Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)), referencia que se incorpora en esta memoria como anterioridad). Así, la extensión de la fijación dependiente de
LFA-1 puede determinarse por evaluación de la extensión de la formación de agregados espontánea o dependiente de los ésteres de forbol.

Un agente que interfiere con la agregación dependiente de LFA-1 se puede identificar mediante el uso de un ensayo capaz de determinar si el agente interfiere con la agregación espontánea o con la agregación dependiente de los ésteres de forbol de las células transformadas por el virus Epstein-Barr. La mayoría de las células transformadas por el virus Epstein-Barr se pueden emplear en dicho ensayo con tal que las células sean capaces de expresar la molécula del receptor LFA-1. Tales células se pueden preparar de acuerdo con la técnica de Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984), referencia que se incorpora en esta memoria como anterioridad. Aunque se puede emplear cualquiera de tales células en el ensayo de fijación dependiente de LFA-1 de la presente invención, es preferible emplear células de la línea de células JY (Terhost, C.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:910 (1976)). Las células se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo adecuado; sin embargo, es muy preferible cultivar las células en medio de cultivo RMPI 1640 complementado con suero de ternero fetal al 10% y 50 \mug/ml de gentamicina (Gibco Laboratories, NY). Las células deben cultivarse en condiciones adecuadas para proliferación de células de mamífero (es decir, a una temperatura de generalmente 37ºC, en una atmósfera con 5% de CO_{2}, a una humedad relativa de 95%, etc.).

2. LFA-1 se fija a ICAM-1

Se han identificado individuos humanos cuyos linfocitos carecen de la familia de moléculas receptoras de LFA-1 (Anderson, D.C. et al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668-669 (1985)). Se dice de que tales individuos padecen Deficiencia de Adhesión Leucocitaria (LAD). las células transformadas por EBV de tales individuos no consiguen agregarse, sea espontáneamente o en presencia de ésteres de forbol en el ensayo de agregación arriba descrito. Cuando se mezclan dichas células con células que expresan LFA-1 se observó agregación (Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986)) (Figura 1). Es importante indicar que dichos agregados no se formaban si estas células se incubaban en presencia de anticuerpos anti-LFA-1. Así pues, aunque la agregación requería LFA-1, la aptitud de las células deficientes en LFA-1 para formar agregados con células que contenían
LFA-1 indicaba que el socio de fijación de LFA-1 no era LFA-1, sino que era en su lugar una molécula de adhesión celular no descubierta con anterioridad. La Figura 1 muestra el mecanismo de la adhesión celular.

B. La molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1)

La nueva molécula de adhesión intercelular ICAM-1 se identificó primeramente y se caracterizó parcialmente de acuerdo con el procedimiento de Rothlein, R. et al., (J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)), referencia que se incorpora en esta memoria con anterioridad. Para detectar la molécula ICAM-1, se prepararon anticuerpos monoclonales a partir de células del bazo de ratones inmunizados con células procedentes de individuos genéticamente deficientes en expresión de LFA-1. Los anticuerpos resultantes se exploraron en cuanto a su capacidad para inhibir la agregación de células que expresaban LFA-1 (Figura 2). En detalle, la molécula ICAM-1, se inmunizaron ratones con células B transformadas por EBV procedentes de pacientes LAD que no expresan el antígeno LFA-1. Las células del bazo de estos animales se extirparon subsiguientemente, se fusionaron con células de mieloma, y se dejó que se convirtieran en células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales. Se incubaron luego células B transformadas por EBV procedentes de individuos normales que expresan LFA-1 en presencia del anticuerpo monoclonal de la célula de hibridoma con objeto de identificar cualquier anticuerpo monoclonal que fuese capaz de inhibir la agregación espontánea, dependiendo de LFA-1, mediada por ésteres de forbol de las células B transformadas por EBV. Dado que las células de hibridoma se derivaban de células que no habían encontrado nunca el antígeno LFA-1, no se produjo anticuerpo monoclonal alguno para LFA-1. Por consiguiente, cualquier anticuerpo encontrado que inhiba la agregación tiene que ser capaz de fijarse a un antígeno que, aunque no sea LFA-1, participe en el proceso de adhesión a LFA-1. Aunque se puede emplear cualquier método de obtención de tales anticuerpos monoclonales, es preferible obtener anticuerpos monoclonales de fijación a ICAM-1 por inmunización de ratones BALB/C utilizando las vías y los protocolos descritos por Rothlein, et al., (J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)) con células mononucleares de sangre periférica transformadas por el virus Epstein-Barr procedentes de individuos deficientes en LFA-1. Dichas células han sido descritas por Springer, T.A., et al., (J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984)).

En un método preferido para la generación y detección de anticuerpos capaces de fijarse a ICAM-1, se inmunizan ratones con células B transformadas por EBV que expresan ICAM-1 y LFA-1, o más preferiblemente con células endoteliales activadas por TNF que expresan ICAM-1 pero no LFA-1. En un método muy preferido para generar células de hibridoma que producen anticuerpos anti-ICAM-1, un ratón Balb/C se inmunizó secuencialmente con células JY y con células U937 diferenciadas (ATCC CRL-1593). Las células del bazo de tales animales se extirpan, se fusionan con células de mieloma y se deja que se desarrollen para dar células de hibridoma productoras de anticuerpos. Los anticuerpos se evalúan por su capacidad para inhibir la agregación inducida por ésteres de forbol dependiente de LFA-1 de una línea de células transformadas por EBV, tal como células JY, que expresa tanto el receptor de
LFA-1 como ICAM-1. Como ha sido demostrado por Rothlein, R., et al., (J. Immunol. 137:1270-1274 (1987)), los anticuerpos capaces de inhibir dicha agregación se ensayan luego por su capacidad para inhibir la agregación inducida por los ésteres de forbol de una línea de células, tal como SKW3 (Dustin, M., et al., J. Exper. Med. 165:672-692 (1987)) cuya capacidad para agregarse espontáneamente en presencia de un éster de forbol es inhibida por los anticuerpos capaces de fijar LFA-1 pero no es inhibida por los anticuerpos anti-ICAM-1. Los anticuerpos capaces de inhibir la agregación inducida por los ésteres de forbol de células tales como células JY, pero incapaces de inhibir la agregación inducida por los ésteres de forbol de células tales como SKW3 son probablemente anticuerpos anti-ICAM-1. Alternativamente, los anticuerpos que son capaces de fijarse a ICAM-1 se pueden identificar por exploración respecto a anticuerpos que son capaces de inhibir la agregación dependiente de LFA-1 de las células de expresión de LFA (tales como células JY) pero son incapaces de fijarse a células que expresan LFA-1 pero que expresan poco o no expresan en absoluto ICAM-1 (tales como los granulocitos normales) o son capaces de fijarse a células que expresan ICAM-1 pero no LFA-1 (tales como células endoteliales activadas por TNF). Otra alternativa es la inmunoprecipitación a partir de células que expresan ICAM-1, LFA-1, o ambas, empleando anticuerpos que inhiben la agregación de células dependientes de LFA-1, tales como células JY, y determinar por SDS-PAGE o un método equivalente alguna característica molecular de la molécula precipitada con el anticuerpo. Si la característica es la misma que la de
ICAM-1 entonces puede suponerse que el anticuerpo es un anticuerpo anti-ICAM-1.

Utilizando anticuerpos monoclonales preparados de la manera arriba descrita, se purificó y se caracterizó la molécula ICAM-1 de la superficie de las células. Se purificó ICAM-1 a partir de células o tejidos humanos utilizando cromatografía de afinidad de anticuerpos monoclonales. En dicho método, un anticuerpo monoclonal reactivo con ICAM-1 se copula a una matriz en columna inerte. Se puede emplear cualquier método de realización de dicha copulación; sin embargo, es preferible utilizar el método de Oettgen, H.C. et al., J. Biol. Chem. 259:12034 (1984). Cuando se hace pasar un lisado celular a través de la matriz, las moléculas ICAM-1 presentes son adsorbidas y retenidas por la matriz. Por alteración del pH o la concentración iónica de la columna, las moléculas ICAM-1 fijadas se pueden eluir de la columna. Aunque puede emplearse cualquier matriz adecuada, es preferible emplear Sepharose (Pharmacia) como el material de la matriz. La formación de matrices de columnas, y su uso en purificación de proteínas son bien conocidos en la técnica.

De una manera comprendida por quienes poseen una experiencia ordinaria, los ensayos arriba descritos pueden utilizarse para identificar compuestos capaces de atenuar o inhibir la tasa o la extensión de adhesión celular.

ICAM-1 es una glicoproteína de la superficie celular expresada en células no hematopoyéticas tales como células endoteliales vasculares, células epiteliales tímicas, ciertas otras células epiteliales, y fibroblastos, y en células hematopoyéticas tales como macrófagos tisulares, blastos de linfocitos T estimulados por mitógenos, y células B germinales centradas y células dendríticas en las amígdalas, los ganglios linfáticos, y las placas de Peyer. ICAM-1 es altamente expresada en células endoteliales vasculares en áreas de células T de los ganglios linfáticos y las amígdalas que muestran hiperplasia reactiva. ICAM-1 se expresa en pequeñas cantidades en los linfocitos de la sangre periférica. La diferenciación estimulada por ésteres de forbol de algunas líneas de células mielomolocíticas incrementa notablemente la expresión de ICAM-1. Así, ICAM-1 es expresada preferencialmente en sitios de inflamación, y no es expresada generalmente por células en reposo. La expresión de ICAM-1 en fibroblastos dérmicos es incrementada de tres a cinco veces por la interleuquina 1 o por \gamma-interferón a niveles de 10 U/ml durante un período de 4 ó 10 horas, respectivamente. La inducción depende de la síntesis de proteínas y de mRNA, y es reversible.

ICAM-1 exhibe heterogeneidad de peso molecular en diferentes tipos de células, con un peso molecular de 97 kd en fibroblastos, 114 kd en la línea de células mielomonocíticas U937, y 90 kd en la célula linfoblastoide B, JY. Se ha encontrado que la biosíntesis de ICAM-1 implica un precursor intracelular de aproximadamente 73 kd. La forma no glicosilada en N resultante del tratamiento con tunicamicina (que inhibe la glicosilación) tiene un peso molecular de 55 kd.

\newpage

La ICAM-1 aislada a partir de células U937 estimuladas por ésteres de forbol o a partir de células de fibroblastos da lugar a un producto principal idéntico que tiene un peso molecular de 60 kd después de desglicosilación química. Los anticuerpos monoclonales de ICAM-1 interfieren con la adhesión de los blastos de fitohemaglutinina a las líneas de células deficientes en LFA-1. El pretratamiento de los fibroblastos, pero no de los linfocitos, con anticuerpos monoclonales capaces de fijar ICAM-1 inhibe la adhesión linfocito-fibroblasto. Se ha encontrado también que el pretratamiento de los linfocitos, pero no de los fibroblastos, con anticuerpos contra LFA-1 inhibe la adhesión linfocito-fibroblasto.

ICAM-1 es, por consiguiente, el ligando de fijación del complejo CD 18 en los leucocitos. Dicho ligando es inducible en fibroblastos y células endoteliales in vitro por mediadores inflamatorios tales como IL-1, \gamma-interferón y factor de necrosis de tumores en un marco temporal concordante con la infiltración de los linfocitos en las lesiones inflamatorias in vivo (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986); Prober, J.S., et al., J. Immunol. 137:1893-1896 (1986)). Adicionalmente, ICAM-1 se expresa en células no hematopoyéticas tales como células endoteliales vasculares, células epiteliales tímicas, otras células epiteliales, y fibroblastos y en células hematopoyéticas tales como macrófagos tisulares, blastos de linfocitos T estimulados por mitógenos, y células B germinales centrales y células dendríticas en amígdalas, ganglios linfáticos y placas de Peyer (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). ICAM-1 se expresa en los queratinocitos en lesiones inflamatorias benignas tales como eczema alérgico, liquen plano, exantema, urticaria y enfermedades bulosas. Las reacciones alérgicas dérmicas provocadas por la aplicación sobre la piel de un hapteno al que es alérgico el paciente revelaron también una expresión importante de ICAM-1 en los queratinocitos. Por el contrario, los parches tóxicos sobre la piel no revelaban expresión de ICAM-1 en los queratinocitos. ICAM-1 está presente en los queratinocitos procedentes de biopsias de lesiones de la piel causadas por diversos trastornos dermatológicos y la expresión de ICAM-1 se induce en las lesiones procedentes de ensayos de parches alérgicos, mientras que los queratinocitos procedentes de lesiones causadas por ensayos de parches tóxicos no expresaban ICAM-1.

ICAM-1 es, por consiguiente, un sustrato celular al cual pueden fijarse los linfocitos, de tal manera que los linfocitos pueden migrar a sitios de inflamación y/o transportar diversas funciones efectoras que contribuyen a esta inflamación. Tales funciones incluyen la producción de anticuerpos, lisis de células diana infectadas por virus, etc. El término "inflamación", tal como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto incluir reacciones de los sistemas de defensa específico o inespecífico. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sistema de defensa específico" tiene por objeto hacer referencia a aquel componente del sistema inmune que reacciona a la presencia de antígenos específicos. Se dice que la inflamación es el resultado de una respuesta del sistema de defensa específico si la inflamación está causada por, mediada por, o asociada a una reacción del sistema de defensa específico. Ejemplos de inflamación resultantes de una respuesta del sistema de defensa específico incluyen la respuesta a antígenos tales como el virus de la rubéola, enfermedades autoinmunes, respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado mediada por las células T (como se ve, por ejemplo, en individuos que dan resultado "positivo en el ensayo Mantaux", psoriasis, etc.

Una "reacción del sistema de defensa inespecífico" es una respuesta mediada por leucocitos incapaces de memoria inmunológica. Tales células incluyen granulocitos y macrófagos. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que la inflamación es el resultado de una respuesta del sistema de defensa inespecífico, si la inflamación está causada por, mediada por, o asociada a una reacción del sistema de defensa inespecífico. Ejemplos de inflamación que son resultado, al menos en parte, de una reacción del sistema de defensa inespecífico incluyen inflamación asociada con condiciones tales como: asma; síndrome de dificultad respiratoria de los adultos (ARDS) o síndromes de lesiones de órganos múltiples secundarias a septicemia o traumatismo; lesión de reperfusión del miocardio u otros tejidos; glomerulonefritis aguda; artritis reactiva; dermatosis con componentes inflamatorios agudos; meningitis aguda purulenta u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central; lesiones producidas por el calor; hemodiálisis; leucaféresis; colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; enterocolitis necrotizante; síndromes asociados con la transfusión de granulocitos; y toxicidad inducida por citoquinas.

De acuerdo con la presente invención, los derivados funcionales de ICAM-1, y especialmente tales derivados que comprenden fragmentos o variantes mutantes de ICAM-1 que poseen dominios 1, 2 y 3 se pueden utilizar en el tratamiento o la terapia de tales reacciones del sistema de defensa inespecífico. Más preferidos para dicho tratamiento o terapia son fragmentos de ICAM-1 o variantes mutantes que contienen el dominio 2 de ICAM-1. Muy preferidos para dicho tratamiento o terapia son fragmentos de ICAM-1 o variantes mutantes que contienen el dominio 1 de ICAM-1.

C. Clonación del gen de ICAM-1

Se puede utilizar cualquiera de una diversidad de procedimientos para clonar el gen de ICAM-1. Uno de tales métodos implica analizar una genoteca de vectores lanzadera de inserciones de cDNA (derivadas de una célula que exprese ICAM-1) en cuanto a la presencia de una inserción que contenga el gen de ICAM-1. Dicho análisis se puede llevar a cabo por transfección de células con el vector y ensayo posterior para expresión de ICAM-1. El método preferido para clonar este gen implica determinar la secuencia de aminoácidos de la molécula ICAM-1. Para realizar esta tarea, la proteína ICAM-1 puede purificarse y analizarse por medio de secuenciadores automáticos. Alternativamente, la molécula puede fragmentarse por ejemplo con bromuro de cianógeno, o con proteasas tales como papaína, quimotripsina o tripsina (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257:9751-9758 (1982); Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215 (1983)). Aunque es posible determinar la secuencia completa de aminoácidos de ICAM-1, es preferible determinar la secuencia de fragmentos peptídicos de la molécula. Si los péptidos tienen una longitud mayor que 10 aminoácidos, la información de la secuencia es generalmente suficiente para permitir clonar un gen tal como el gen para ICAM-1.

La secuencia de residuos de aminoácidos en un péptido se designa en esta memoria, o bien por el uso de sus designaciones de tres letras empleadas comúnmente, o por sus designaciones de una sola letra. Un listado de estas designaciones de tres letras y de una letra puede encontrarse en libros de texto tales como Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, Nueva York, NY (1970). Cuando una secuencia de este tipo se enumera verticalmente, debe entenderse que el residuo del terminal amino está situado en el extremo superior de la lista, debiendo entenderse que el residuo del terminal carboxi del péptido está situado en el extremo inferior de la lista. Análogamente, cuando se enumera horizontalmente, debe entenderse que el término amino se encuentra en el extremo izquierdo, debiendo entenderse que el término carboxi se encuentra en el extremo derecho. Los restos de aminoácidos en un péptido pueden separarse por guiones. Tales guiones tienen por objeto exclusivamente facilitar la presentación de una secuencia. Como ejemplo puramente ilustrativo, la secuencia de aminoácidos designada:

-Gly-Ala-Ser-Phe-

indica que un residuo Ala está enlazado al grupo carboxi de Gly, y que un residuo Ser está enlazado al grupo carboxi del residuo Ala y al grupo amino de un residuo Phe. La designación indica adicionalmente que la secuencia de aminoácidos contiene el tetrapéptido Gly-Ala-Ser-Phe. La designación no tiene por objeto limitar la secuencia de aminoácidos a este único tetrapéptido, sino que tiene por objeto incluir (1) el tetrapéptido que tiene uno o más residuos de aminoácidos enlazados a su extremo amino o carboxi, (2) el tetrapéptido que tiene uno o más residuos de aminoácidos enlazados tanto a su extremo amino como a su extremo carboxi, (3) el tetrapéptido que no tiene ningún residuo de aminoácido adicional.

Una vez que se han secuenciado uno o más fragmentos peptídicos adecuados, se examinan las secuencias de DNA capaces de codificarlos. Debido a que el código genético está degenerado, puede utilizarse más de un codón para codificar un aminoácido particular (Watson, J.D., en Molecular Biology of the Gene, 3ª edición, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), pp. 356-357). Los fragmentos peptídicos se analizan para identificar las secuencias de aminoácidos que pueden ser codificadas por oligonucleótidos que tengan el grado de degeneración mínimo. Esto se realiza preferiblemente por identificación de secuencias que contienen aminoácidos que son codificados solamente por un único codón. Aunque ocasionalmente tales secuencias de aminoácidos pueden ser codificadas solamente por un solo oligonucleótido, frecuentemente la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos similares. Es importante que, mientras que la totalidad de los miembros del conjunto contienen oligonucleótidos que son capaces de codificar el fragmento peptídico y, por consiguiente, contienen potencialmente la misma secuencia de nucleotidos que el gen que codifica el fragmento peptídico, únicamente un miembro del conjunto contiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de este gen. Dado que este miembro está presente dentro del conjunto, y es capaz de hibridarse a DNA incluso en presencia de los otros miembros del conjunto, es posible emplear el conjunto de oligonucleótidos no fraccionado de la misma manera en la que podría emplearse un solo oligonucleótido para clonar el gen que codifica el péptido.

De una manera exactamente análoga a la arriba descrita, se puede emplear un oligonucleótido (o un conjunto de oligonucleótidos) que tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria para la secuencia o conjunto de secuencias de oligonucleótidos que es o son capaces de codificar el fragmento peptídico.

Un oligonucleótido adecuado, o conjunto de oligonucleótidos que es capaz de codificar un fragmento del gen de ICAM-1 (o que es complementario de un oligonucleótido de este tipo, o conjunto de oligonucleótidos) se identifica (utilizando el procedimiento arriba descrito), se sintetiza, y se hibrida, por medios bien conocidos en la técnica, contra un DNA o, más preferiblemente, una preparación de DNA derivada de células humanas que son capaces de expresar secuencias del gen de ICAM-1. Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos han sido descritas por Maniatis, T. et al., en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), y por Haymes, B.D. et al., en: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), cuyas referencias se incorporan en esta memoria con anterioridad. La fuente de DNA o cDNA utilizada se habrá enriquecido preferiblemente en secuencias de ICAM-1. Tal enriquecimiento puede obtenerse muy fácilmente a partir de cDNA obtenido por extracción de RNA a partir de células cultivadas en condiciones que inducen la síntesis de ICAM-1 (tales como U937 cultivadas en presencia de ésteres de forbol, etc.).

Técnicas tales como, o similares a, las arriba descritas han permitido satisfactoriamente la clonación de genes para aldehído-deshidrogenasas humanas (Hsu, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3771-3775 (1985)), fibronectina (Suzuki, S. et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 4:2519-2524 (1985)), el gen del receptor de estrógenos humano (Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7889-7893 (1985)), activador del plasminógeno de tipo tisular (Pennica D. et al., Nature 301:214-221 (1983)) y DNA complementario de la fosfatasa alcalina placentaria humana a término (Kam, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8715-8719 (1985)).

En una vía alternativa preferida de clonación del gen de ICAM-1, se prepara una genoteca de vectores de expresión por clonación de DNA o, más preferiblemente cDNA, a partir de una célula capaz de expresar ICAM-1 en un vector de expresión. La genoteca se explora luego respecto a miembros capaces de expresar una proteína que se fija al anticuerpo anti-ICAM-1, y que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de codificar polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos que ICAM-1 o fragmentos de ICAM-1.

\newpage

El gem de ICAM-1 clonado, obtenido por los métodos descritos arriba, puede enlazarse operativamente a un vector de expresión, e introducirse en células bacterianas o eucariotas para producir la proteína ICAM-1. Métodos para tales manipulaciones han sido descritos por Maniatis, T. et al., citado arriba, y son bien conocidos en la técnica.

D. Usos de los ensayos de agregación dependiente de LFA-1

El ensayo arriba descrito, capaz de medir la agregación dependiente de LFA-1, se puede emplear para identificar agentes que actúan como antagonistas para inhibir la extensión de la agregación dependiente de LFA-1. Tales antagonistas pueden actuar empeorando la capacidad de LFA-1 o de ICAM-1 para mediar la agregación. Así, dichos agentes incluyen inmunoglobulinas tales como un anticuerpo capaz de fijarse a LFA-1 ó ICAM-1. Adicionalmente, se pueden examinar agentes distintos a las inmunoglobulinas (es decir, químicos), utilizando el ensayo arriba descrito, para determinar si los mismos son antagonistas de la agregación de LFA-1.

E. Usos de anticuerpos capaces de fijarse a proteínas receptoras de ICAM-1 1. Agentes anti-inflamatorios

Los anticuerpos monoclonales para los miembros del complejo CD-18 inhiben muchas funciones dependientes de la adhesión de los leucocitos que incluyen fijación al endotelio (Haskard, D., et al., J. Immunol. 137:2901-2906 (1986)), adhesiones homotípicas (Rothlein, R., et al., J. Exp. Med. 163:1132-1149 (1986)), proliferación de linfocitos inducida por antígenos y mitógenos (Davignon, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:4535-4539 (1981)), formación de anticuerpos (Fischer, A., et al., J. Immunol. 136:3198-3203 (1986)), y funciones efectoras de todos los leucocitos tales como actividad lítica de las células T citotóxicos (Krensky, A.M., et al., J. Immunol. 132:2180-2182 (1984)), macrófagos (Strassman, G., et al., J. Immunol. 136:4328-4333 (1986)), y todas las células implicadas en las reacciones de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos (Kohl, S., et al., (J. Immunol. 133:2972-2978 (1984)). En la totalidad de las funciones anteriores, los anticuerpos inhiben la capacidad del leucocito para adherirse al sustrato celular apropiado, lo cual inhibe a su vez al desenlace final.

Como se ha expuesto anteriormente, la fijación de moléculas ICAM-1 a los miembros de la familia de moléculas LFA-1 tiene importancia fundamental en la adhesión celular. Mediante el proceso de adhesión, los linfocitos son capaces de observar continuamente a un animal en cuanto a la presencia de antígenos extraños. Aunque estos procesos son normalmente deseables, los mismos son también la causa del rechazo de los trasplantes de órganos, rechazo del injerto de tejidos y muchas enfermedades autoinmunes. Por tanto, cualquier medio capaz de atenuar o inhibir la adhesión celular sería altamente deseable en los receptores de trasplantes de órganos, injertos de tejidos o pacientes autoinmunes.

Los anticuerpos monoclonales capaces de fijarse a ICAM-1 son muy adecuados como agentes anti-inflamatorios en un individuo mamífero. Significativamente, tales agentes difieren de los agentes anti-inflamatorios generales en el sentido de que aquéllos son capaces de inhibir selectivamente la adhesión, y no presentan otros efectos secundarios tales como nefrotoxicidad que se encuentran con los agentes convencionales. Los anticuerpos monoclonales capaces de fijarse a ICAM-1 pueden utilizarse por consiguiente para prevenir el rechazo de órganos o tejidos, o modificar las respuestas autoinmunes sin el temor de dichos efectos secundarios, en el individuo mamífero.

Es importante que el uso de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer ICAM-1 puede permitir la realización de trasplantes de órganos incluso entre individuos que presenten desapareamiento de HLA.

2. Supresores de la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado

Dado que las moléculas ICAM-1 se expresan la mayoría de las veces en sitios de inflamación, tales como aquellos sitios implicados en la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, los anticuerpos (especialmente los anticuerpos monoclonales) capaces de fijarse a las moléculas ICAM-1 tienen potencial terapéutico en la atenuación o eliminación de dichas reacciones. Este uso terapéutico potencial puede explotarse de una de dos maneras. En primer lugar, una composición que contenga un anticuerpo monoclonal contra ICAM-1 puede administrarse a un paciente que sufra la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado. Por ejemplo, tales composiciones podrían proporcionarse a un individuo que hubiera estado en contacto con antígenos tales como hiedra venenosa, roble venenoso, etc. En la segunda realización, el anticuerpo monoclonal capaz de fijarse a ICAM-1 se administra a un paciente en asociación con un antígeno a fin de prevenir una reacción inflamatoria subsiguiente. Así, la administración adicional de un antígeno con un anticuerpo monoclonal de fijación de ICAM-1 puede hacer que un individuo tolere temporalmente la presentación subsiguiente de dicho antígeno.

3. Terapia para la enfermedad inflamatoria crónica

Dado que los pacientes de LAD que carecen de LFA-1 no ponen en marcha una respuesta inflamatoria, se cree que el antagonismo del ligando natural de LFA-1, ICAM-1, inhibirá también una respuesta inflamatoria. La capacidad de los anticuerpos contra ICAM-1 para inhibir la inflamación proporciona la base de su uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso, tiroiditis autoinmune, encefalomielitis alérgica experimental (EAE), esclerosis múltiple, algunas formas del síndrome de Reynaud de la diabetes, artritis reumatoide, etc. Tales anticuerpos se pueden emplear también como terapia en el tratamiento de la psoriasis. En general, los anticuerpos monoclonales capaces de fijarse a ICAM-1 se pueden emplear en el tratamiento de aquéllas enfermedades que se pueden tratar actualmente mediante terapia con esteroides.

4. Aplicaciones de diagnóstico y pronóstico

Dado que ICAM-1 se expresa principalmente en sitios de inflamación, se pueden emplear anticuerpos monoclonales capaces de fijarse a ICAM-1 como medio de formación de imágenes o visualización de los sitios de infección e inflamación en un paciente. En un uso de este tipo, los anticuerpos monoclonales se marcan detectablemente, mediante el uso de isótopos radiactivos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.), marcadores fluorescentes, átomos paramagnéticos, etc. Procedimientos para realizar dicha marcación son bien conocidos en la técnica. La aplicación clínica de anticuerpos en la formación de imágenes de diagnóstico ha sido revisada por Grossman, H.B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986), Unger, E.C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985), y Khaw, B.A. et al., Science 209:295-297 (1980).

La presencia de inflamación se puede detectar también mediante el uso de ligandos de fijación, tales como mRNA, cDNA, o DNA que se fijan a secuencias del gen de ICAM-1, o a secuencias de mRNA de ICAM-1, de células que expresan ICAM-1. Técnicas para la realización de tales ensayos de hibridación han sido descritas por Maniatis, T. (citado arriba).

La detección de focos de tales anticuerpos marcados de manera detectable es indicativa de un sitio de inflamación o desarrollo de tumor. En una realización, este examen para inflamación se realiza por extracción de muestras de tejido o sangre e incubación de dichas muestras en presencia de los anticuerpos marcados detectablemente. En una realización preferida, esta técnica se lleva a cabo de una manera no invasiva mediante el uso de formación magnética de imágenes, fluorografía, etc. Dicho ensayo de diagnóstico se puede emplear en la observación de receptores de trasplantes de órganos para síntomas precoces de rechazo potencial del tejido. Tales ensayos se pueden realizar también en esfuerzos para determinar la propensión de un individuo a la artritis reumatoide u otras enfermedades inflamatorias crónicas.

5. Complemento a la introducción de material antigénico administrado para propósitos terapéuticos o de diagnóstico

Las respuestas inmunes a agentes terapéuticos o de diagnóstico tales como, por ejemplo, insulina de bovino, interferón, activador del plasminógeno de tipo tisular o anticuerpos monoclonales de murino empeoran sustancialmente el valor terapéutico o de diagnóstico de dichos agentes, y pueden, de hecho, causar enfermedades tales como la enfermedad del suero. Dicha situación se puede remediar mediante el uso de los anticuerpos de la presente invención. En esta realización, dichos anticuerpos podrían administrarse en combinación con el agente terapéutico o de diagnóstico. La adición de los anticuerpos impide que el receptor reconoza el agente, y por consiguiente impide que el receptor inicie una respuesta inmune contra el mismo. La ausencia de dicha respuesta inmune da como resultado la posibilidad de que el paciente reciba administraciones adicionales del agente terapéutico o de diagnóstico.

F. Usos de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1)

ICAM-1 es un socio de fijación de LFA-1. Como tal, ICAM-1 o sus derivados funcionales se pueden emplear intercambiablemente con anticuerpos capaces de fijarse a LFA-1 en el tratamiento de enfermedades. Así, en forma solubilizada, se pueden emplear dichas moléculas para inhibir la inflamación, el rechazo de órganos, el rechazo de injertos, etc. ICAM-1, o sus derivados funcionales, se pueden utilizar de la misma manera que los anticuerpos anti-ICAM para reducir la inmunogenicidad de los agentes terapéuticos o de diagnóstico.

ICAM-1, sus derivados funcionales, y sus antagonistas se pueden utilizar para bloquear la metástasis o proliferación de células tumorales que expresan ICAM-1 ó LFA-1 en sus superficies. Se pueden utilizar una diversidad de métodos para alcanzar dicha meta. Por ejemplo, la migración de las células hematopoyéticas requiere la fijación
LFA-1-ICAM-1. Los antagonistas de dicha fijación suprimen por consiguiente esta migración y bloquean la metástasis de las células tumorales del linaje de los leucocitos. Alternativamente, moléculas derivatizadas de toxinas, capaces de fijarse a ICAM-1 o a un miembro de la familia de moléculas LFA-1, pueden ser administradas a un paciente. Cuando tales moléculas derivatizadas de toxinas se fijan a las células tumorales que expresan ICAM-1 o un miembro de la familia de moléculas LFA-1, la presencia de la toxina destruye la célula tumoral inhibiendo de este modo la proliferación de tumor.

G. Usos de antagonistas de la adhesión dependiente de ICAM-1 no inmunoglobulínicos

La adhesión dependiente de ICAM-1 puede ser inhibida por antagonistas no inmunoglobulínicos que son capaces de fijarse a ICAM-1 o a LFA-1. Un ejemplo de un antagonista de ICAM-1 no inmunoglobulínico es LFA-1. Un ejemplo de un antagonista no inmunoglobulínico que se fija a LFA-1 es ICAM-1. Mediante el uso de los ensayos arriba descritos, se pueden identificar y purificar antagonistas adicionales no inmunoglobulínicos. Los antagonistas no inmunoglobulínicos de la adhesión dependiente de ICAM-1 pueden utilizarse para el mismo propósito que los anticuerpos para LFA-1 o anticuerpos para ICAM-1.

H. Administración de las composiciones de la presente invención

Los efectos terapéuticos de ICAM-1 se pueden obtener proporcionando a un paciente la molécula ICAM-1 entera, o cualesquiera fragmentos peptídicos terapéuticamente activos de la misma.

ICAM-1 y sus derivados funcionales se pueden obtener sea sintéticamente, por el uso de tecnología de DNA recombinante, o por proteólisis. Las ventajas terapéuticas de ICAM-1 se pueden aumentar mediante el uso de derivados funcionales de ICAM-1 que posean residuos de aminoácidos adicionales añadidos para mejorar la copulación al vehículo o intensificar la actividad de la molécula ICAM-1. El alcance de la presente invención tiene por objeto incluir adicionalmente derivados funcionales de ICAM-1 que carecen de ciertos residuos de aminoácidos, o que contienen residuos de aminoácidos alterados, con tal que tales derivados exhiban la capacidad para afectar a la adhesión celular.

Tanto los anticuerpos de la presente invención como la molécula ICAM-1 descritos en esta memoria se dice que están "sustancialmente exentos de contaminantes naturales" si las preparaciones que los contienen están sustancialmente exentas de materiales con los cuales estos productos se encuentran normal y naturalmente.

La presente invención se extiende a anticuerpos, y fragmentos biológicamente activos de los mismos (sean policlonales o monoclonales), que son capaces de fijarse a ICAM-1. Dichos anticuerpos pueden ser producidos sea por un animal, o por cultivo de tejidos, o por medios de DNA recombinante.

Al proporcionar a un paciente anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de fijarse a ICAM-1, o cuando se proporciona ICAM-1 (o un fragmento, variante o derivado del mismo) a un paciente receptor, la dosis de agente administrado variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la estatura, el sexo, el estado médico general, la historia médica previa, etc., del paciente. En general, es deseable proporcionar al receptor una dosis de anticuerpo que esté comprendida en el intervalo que va desde aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (peso corporal del paciente), aunque se puede administrar una dosis menor o mayor. Cuando se proporcionan moléculas ICAM-1 o sus derivados funcionales a un paciente, es preferible administrar tales moléculas en una dosis que esté comprendida también entre aproximadamente 1 pg/kg y 10 mg/kg (peso corporal del paciente) aunque se puede administrar también una dosis menor o mayor. Como se expone más adelante, la dosis terapéuticamente eficaz puede reducirse si el anticuerpo anti-ICAM-1 se administra adicionalmente con un anticuerpo anti-LFA-1. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que un compuesto se administra adicionalmente con un segundo compuesto cuando la administración de los dos compuestos se hace en una proximidad en el tiempo tal que ambos compuestos pueden ser detectados simultáneamente en el suero del paciente.

Tanto el anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1 como ICAM-1 propiamente dicha se pueden administrar a los pacientes por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, enteral o parenteral. Cuando se administra el anticuerpo o ICAM-1 por inyección, la administración puede hacerse por infusión continua, o por bolus simples o múltiples.

Los agentes antiinflamatorios de la presente invención tienen por objeto ser proporcionados a individuos receptores en una cantidad suficiente para reprimir la inflamación. Se dice que una cantidad es suficiente para "reprimir" la inflamación si la dosis, la vía de administración, etc. del agente son suficientes para atenuar o prevenir la inflamación.

Un anticuerpo anti-ICAM-1, o un fragmento del mismo, se puede administrar sea solo o en combinación con uno o más agentes inmunosupresores adicionales (especialmente a un receptor de un trasplante de órgano o tejido). La administración de dicho(s) compuesto(s) puede hacerse para un propósito "profiláctico" o "terapéutico". Cuando se proporciona(n) con carácter profiláctico, el o los compuestos inmunosupresores se proporcionan con anterioridad a cualquier respuesta o síntoma inflamatorio(a) (por ejemplo, antes, durante, o poco tiempo después) del momento del trasplante de un órgano o tejido, pero con anterioridad a cualesquiera síntomas de rechazo del órgano). La administración profiláctica del o de los compuestos sirve para prevenir o atenuar cualquier respuesta inflamatoria subsiguiente (tal como, por ejemplo, el rechazo de un órgano o tejido trasplantado, etc.). Cuando se proporciona(n) con carácter terapéutico, el o los compuestos inmunosupresores se administra(n) en el momento (o poco tiempo después) de la aparición de un síntoma de inflamación actual (tal como, por ejemplo, rechazo de órgano o tejido). La administración terapéutica del o de los compuestos sirve para atenuar cualquier inflamación actual (tal como, por ejemplo, el rechazo de un órgano o tejido trasplantado). Los agentes anti-inflamatorios de la presente invención pueden, por consiguiente, proporcionarse sea antes de la aparición de la inflamación (a fin de reprimir una inflamación previsible) o después de la iniciación de la inflamación.

Se dice que una composición es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Se dice que dicho agente se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.

El anticuerpo y las moléculas ICAM-1 de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en las cuales estos materiales, o sus derivados funcionales, están combinados en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados y su formulación, con inclusión de otras proteínas humanas, p.ej., sero-albúmina humana, se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (edición 16ª, Osol, A., compilador, Mack, Easton PA (1980)). Con objeto de formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de anticuerpo anti-ICAM o molécula ICAM-1, o sus derivados funcionales, junto con una cantidad adecuada de vehículo portador.

Se pueden emplear métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Preparaciones de liberación de control pueden conseguirse mediante el uso de polímeros para complejar o absorber el anticuerpo anti-ICAM-1 ó ICAM-1, o sus derivados funcionales. El suministro controlado puede ejercerse por selección de macromoléculas apropiadas (por ejemplo poliésteres, poli(aminoácidos), polivinil-pirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sulfato de protamina) y la concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación para controlar la liberación. Otro método posible para controlar la duración de la acción por medio de preparaciones de liberación controlada consiste en incorporar anticuerpo anti-ICAM-1 o moléculas ICAM-1, o sus derivados funcionales, en partículas de un material polímero tal como poliésteres, poli(aminoácidos), hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros etileno-acetato de vinilo. Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes en partículas polímeras, es posible atrapar dichos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, cápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en sistemas coloidales de suministro de fármacos, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas, o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

Una vez descrita la invención en líneas generales, la misma se comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos que siguen, los cuales se proporcionan a manera de ilustración, y no tienen por objeto se limitantes de la presente invención, a no ser que se especifique.

Ejemplo 1 Cultivo de células de mamífero

En general, las células transformadas por EBV y células de hibridoma de la presente invención se mantuvieron en medio de cultivo RPMI 1640, complementado por L-glutamina 20 mM, 50 \mug/ml de gentamicina, y 10% de suero de bovino fetal (o de ternero fetal). Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}, y 95% de humedad atmosférica.

Para establecer los transformantes del virus Epstein-Barr (EBV), 10^{6} células mononucleares de sangre periférica empobrecida en células T/ml en medio RPMI 1640 complementado con 20% de suero de ternero fetal (FCS) y 50 \mug/ml de gentamicina se incubaron durante 16 horas con sobrenadante de células B95-8 que contenía EBV (Thorley-Lawson, D.A. et al., J. Exper. Med. 146:495 (1977)). Las células contenidas en una parte alícuota de 0,2 ml se pusieron en 10 pocillos de microtitulación. Se reemplazó el medio con medio RPMI 1640 (complementado con 20% de suero de ternero fetal y 50 \mug/ml de gentamicina) hasta que se observó crecimiento celular. Las células crecían en la mayoría de los pocillos y se expandían en el mismo medio. Se establecieron blastos de fitohemaglutinina (PHA) a razón de 10^{6} células/ml en medio RPMI 1640 (complementado de 20% de suero de ternero fetal) que contenía una dilución de 1:800 de PHA-P (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI). Las líneas de PHA se expandieron con medio acondicionado con interleuquina 2 (IL-2) y se pulsaron semanalmente con PHA (Cantrell, D.A. et al., J. Exper. Med. 158:1895 (1983)). El procedimiento anterior fue descrito por Springer, T. et al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984), referencia que se incorpora aquí como anterioridad. Las células obtenidas por el procedimiento anterior se exploran luego con anticuerpos anti- LFA-1 para determinar si las mismas expresan el antígeno de LFA-1. Tales anticuerpos han sido descritos por Sánchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785 (1983).

Ejemplo 2 Ensayos de agregación y adhesión celular

Con objeto de evaluar la extensión de la adhesión celular, se emplearon ensayos de agregación. Las líneas de células utilizadas en tales ensayos se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 que contenía tampón Hepes 5 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis) y se resuspendieron a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml. Se añadieron a placas de titulación de 96 pocillos con fondo plano (No. 3596; Costar, Cambridge, MA) 50 \mul de sobrenadante de anticuerpos monoclonales apropiados o 50 \mul de medio completo con o sin anticuerpos monoclonales purificados, 50 \mul de medio completo que contenía 200 ng/ml del éster de forbol acetato-miristato de forbol (PMA) y 100 \mul de célula a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml en medio completo. Esto produjo una concentración final de 50 ng/ml de PMA y 2 x 105 células/pocillo. Se dejó que las células se sedimentaran espontáneamente, y se registró el grado de agregación en varios momentos puntuales. Los registros variaron desde 0 a 5+, donde 0 indicaba que prácticamente no existían células agrupadas en racimos; 1+ indicaba que menos del 10% de las células se encontraban en forma de agregados; 2+ indicaba que menos del 50% de las células se encontraban agregadas; 3+ indicaba que hasta el 100% de las células se encontraban en forma de pequeños agregados sueltos; 4+ indicaba que hasta el 100% de las células se encontraban agrupadas en agregados mayores; y 5+ indicaba que el 100% de las células se encontraban en forma de agregados grandes, muy compactos. Con objeto de obtener una estimación más cuantitativa de la adhesión celular, los reactivos y las célula se añadieron a tubos de 5 ml de poliestireno en el mismo orden que anteriormente. Los tubos se pusieron en una bandeja sobre una máquina de sacudidas giratoria a 37ºC. Al cabo de 1 hora a aproximadamente 200 rpm, se pusieron 10 \mul de la suspensión de célula en un hemocitómetro y se cuantificó el número de células libres. Se determinó la agregación porcentual por la ecuación siguiente:

% \ agregación = 100 \ x \ (1 - \frac{ número \ de \ células \ libres}{número \ de \ células \ de \ entrada})

El número de células de entrada en la fórmula anterior es el número de células por ml en un tubo de control que contenía únicamente células y medio completo que no se había incubado. El número de células libres en la ecuación anterior es igual al número de células no agregadas por ml de tubos experimentales. Los procedimientos anteriores fueron descritos por Rothlein, R., et al., J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986).

Ejemplo 3 Agregación celular dependiente de LFA-1

Se llevó a cabo el ensayo de agregación cualitativo descrito en el Ejemplo 2 utilizando la línea de células JY transformadas por Epstein-Barr. Después de la adición de PMA al medio de cultivo en las placas de microtitulación, se observó la agregación de las células. Los registros en vídeo con intervalos de tiempo demostraron que las células JY en el fondo de los pocillos de microtitulación eran movibles y exhibían ondulación activa de la membrana y movimiento por pseudópodos. El contacto entre los pseudópodos de células vecinas daba a menudo como resultado adherencia célula-célula. Si la adherencia se prolongaba, la región de contacto de las células se desplazaba hacia el urópodo. El contacto podía mantenerse a pesar de los movimientos enérgicos de las células y de los tirones de las células en direcciones opuestas. La diferencia primaria entre las células tratadas con PMA y sin tratar parecía estar en la estabilidad de estos contactos una vez formados. Con PMA, se desarrollaron agrupaciones de células, que crecían en tamaño a medida que se adherían células adicionales en su periferia.

Como un segundo medio de medir la adhesión, se utilizó el ensayo cuantitativo descrito en el Ejemplo 2. Se agitaron suspensiones de células a 200 rpm durante 2 horas, se transfirieron a un hemocitómetro, y se enumeraron las células que no se encontraban formando agregados. En ausencia de PMA, 42% (desviación estándar = 20%, N = 6) de las células JY se encontraban en agregados al cabo de 2 horas, mientras que las células JY incubadas en condiciones idénticas con 50 ng/ml de PMA tenían 87% (desviación estándar = 8%, N = 6) de las células formando agregados. Los estudios cinéticos de la agregación demostraron que la PMA intensificaba la velocidad y la magnitud de agregación en todos los momentos puntuales ensayados (Figura 3).

Ejemplo 4 Inhibición de la agregación celular utilizando anticuerpos monoclonales anti-LFA-1

Para examinar los efectos de los anticuerpos monoclonales anti-LFA-1 sobre la agregación celular inducida por PMA, se añadieron dichos anticuerpos a células incubadas de acuerdo con el ensayo de agregación cualitativo del Ejemplo 2. Se encontró que los anticuerpos monoclonales inhibían la formación de agregados de células tanto en presencia como en ausencia de PMA. Tanto los fragmentos F(ab')_{2} como los fragmentos Fab' de anticuerpos monoclonales contra la cadena \alpha de LFA-1 eran capaces de inhibir la agregación celular. Mientras que esencialmente el 100% de las células formaban agregados en ausencia de anticuerpo anti-LFA-1, menos del 20% de las células se encontraron formando agregados cuando se añadió el anticuerpo. Los resultados de este experimento fueron descritos por Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986).

Ejemplo 5 La agregación celular requiere el receptor LFA-1

Se prepararon células linfoblastoides transformadas por EBV a partir de pacientes de la manera descrita en el Ejemplo 1. Dichas células se exploraron contra anticuerpos monoclonales capaces de reconocer LFA-1 y se encontró que las células eran deficientes en LFA-1.

Se empleó el ensayo cualitativo de agregación descrito en el Ejemplo 2, utilizando las células deficientes en LFA-1 arriba descritas. Dichas células no se agregaban espontáneamente, ni siquiera en presencia de PMA.

Ejemplo 6 El descubrimiento de ICAM-1

Las células deficientes en LFA-1 del Ejemplo 5 se marcaron con diacetato de carboxifluoresceína (Patarroyo, M. et al., Cell. Immunol. 63:237-248 (1981)). Las células marcadas se mezclaron en una relación 1:10 con células autólogas o JY, y el porcentaje de células marcadas con fluoresceína en los agregados se determinó de acuerdo con el procedimiento de Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986). Se encontró que las células deficientes en LFA-1 eran capaces de coagregarse con células que expresaban LFA-1 (Figura 4).

Para determinar si LFA-1 era importante solamente en la formación de agregados, o en su mantenimiento, se añadieron anticuerpos capaces de fijarse a LFA-1 a los agregados preformados arriba descritos. Se encontró que la adición de anticuerpo rompía enérgicamente la agregación previamente formada. El registro en vídeo a intervalos de tiempo confirmó que la adición de los anticuerpos monoclonales a los agregados preformados comenzaba a causar disgregación antes de 2 horas (Tabla 1). Después de la adición de anticuerpos monoclonales contra LFA-1, los movimientos por pseudópodos y los cambios en la forma de las células individuales dentro de los agregados se mantenían inalterados. Las células individuales se disociaban gradualmente de la periferia del agregado; al cabo de 8 horas las células estaban dispersadas en su mayoría. Mediante vídeo a intervalos de tiempo, se encontró que la disgregación de los agregados preformados por los anticuerpos monoclonales de LFA-1 resultaba equivalente al proceso de agregación en ausencia del anticuerpo monoclonal de LFA-1 con inversión del tiempo.

TABLA 1 Capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-LFA-1 para disgregar los agregados de células JY inducidos por PMA previamente formados

	Registro de agregación
Exp.	2hª	18 h
		-mAb	+mAb
1	4+	4+	1+^{b}
2	3+	4+	1+^{c}
3	5+	5+	1+^{d}
^{a} Cantidad de agregación inmediatamente antes de la adición de anticuerpo monoclonal al cabo de 2 h.
^{b} TS1/18 + TS1/22.
^{c} TS1/18.
^{d} TS1/22.

La agregación en el ensayo cualitativo en placas de microtitulación se registró visualmente. Con anti-LFA-1 presente a todo lo largo del período de ensayo, la agregación era menor que 1+.

Ejemplo 7 El requerimiento de iones bivalentes para la agregación dependiente de LFA-1

Las adhesiones dependientes de LFA-1 entre células T citotóxicas y dianas requieren la presencia de magnesio (Martz, E. J. Cell. Biol. 84:584-598 (1980)). La agregación de las células JY inducida por PMA se ensayó en cuanto a dependencia de cationes bivalentes. Las células JY no se agregaban (utilizando el ensayo del Ejemplo 2) en medio exento de iones calcio o magnesio. La adición de magnesio bivalente soportaba la agregación a concentraciones tan bajas como 0,3 mM. La adición de iones calcio solos tenía poco efecto. Sin embargo, se encontró que los iones calcio aumentaban la capacidad de los iones magnesio para soportar la agregación inducida por PMA. Cuando se añadieron iones calcio 1,25 mM al medio, se encontró que concentraciones de ion magnesio tan bajas como 0,02 milimolar soportaban la agregación. Estos datos demuestran que la agregación de las células dependiente de LFA-1 requiere iones magnesio, y que los iones calcio, aunque insuficientes por sí mismos, pueden actuar sinérgicamente con los iones magnesio para permitir la agregación.

Ejemplo 8 El aislamiento de células de hibridoma capaces de expresar anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1

Se aislaron anticuerpos monoclonales capaces de fijarse a ICAM-1 de acuerdo con el método de Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986), referencia que se ha incorporado en esta memoria como anterioridad. Así, se inmunizaron tres ratones BALB/C por vía intraperitoneal con células mononucleares de sangre periférica transformadas por EBV, procedentes de un individuo deficiente en LFA-1 (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901 (1984)). Se utilizaron aproximadamente 10^{7} células en 1 ml de medio RPMI 1640 para cada inmunización. Las inmunizaciones se administraron 45, 29 y 4 días antes de la extirpación de las células del bazo de los ratones con objeto de producir las líneas de células de hibridoma deseadas. El día 3 antes de la extirpación de las células del bazo, se administraron a los ratones 10^{7} células adicionales en 0,15 ml de medio (por vía intravenosa).

Las células del bazo aisladas de los animales arriba descritos se fusionaron con células de mieloma P3X73Ag8.653 en una relación de 4:1 de acuerdo con el protocolo de Galfre, G. et al., Nature 266:550 (1977). Se introdujeron partes alícuotas de las células de hibridoma resultantes en placas de microtitulación de 96 pocillos. los sobrenadantes de hibridoma se exploraron respecto a la inhibición de la agregación, y un hibridoma inhibidor (de entre más de 600 pocillos ensayados) se clonó y se subclonó por dilución limitante. Este subclón se designo RR1/1.1.1 (designado en lo sucesivo "RR1/1").

Se encontró consistentemente que el anticuerpo monoclonal RR1/1 inhibía la agregación estimulada por PMA de la línea de células JY que expresaban LFA-1. El anticuerpo monoclonal RR1/1 inhibía la agregación en grado equivalente, o ligeramente menos que algunos anticuerpos monoclonales para las subunidades \alpha o \beta de LFA-1. En contraste, el anticuerpo monoclonal de control contra HLA, que es expresado abundantemente en las células JY, no inhibía la agregación. El antígeno fijado por el anticuerpo monoclonal RR1/1 se define como la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1).

Ejemplo 9 Uso de los anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1 para caracterizar la molécula ICAM-1

Con objeto de determinar la naturaleza de ICAM-1, y particularmente determinar si ICAM-1 era distinta de
LFA-1, se inmunoprecipitaron proteínas celulares utilizando el anticuerpo monoclonal RR1/1. La inmunoprecipitación se llevó a cabo conforme al método de Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986). Las células JY se lisaron a 5 x 10^{7} células/ml en Triton X-100 al 1%, NaCl 0,14 m, Tris 10 mM, pH 8,0, con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM recién añadido, y 0,2 unidades por ml de inhibidor de tripsina aprotinina (tampón de lisis) durante 20 minutos a 4ºC. Los lisados se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos y se preclarificaron con 50 \mul de una suspensión al 50% de Sepharose Cl-4B activada con CNBr y extinguida con glicina durante 1 hora a 4ºC. Un mililitro de lisado se inmunoprecipitó con 20 \mul de una suspensión al 50% de anticuerpo monoclonal RR1/1 copulado con Sepharose Cl-4B (1 mg/ml) durante una noche a 4ºC (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901 (1984)). El anticuerpo monoclonal fijado a Sepharose se preparó utilizando activación con CNBr de Sepharose CL-4B en tampón de carbonato de acuerdo con el método de March, S. et al., (Anal. Biochem.60:149 (1974)). Los inmunoprecipitados lavados se sometieron a SDS-PAGE y tinción con plata de acuerdo con el procedimiento de Morrissey, J.H. Anal. Biochem. 117:307 (1981).

Después de la elución de las proteínas con tampón de muestra SDS (Ho, M.K. et al., J. Biol. Chem. 258:636 (1983)) a 100ºC, las muestras se dividieron por mitades y se sometieron a electroforesis (SDS-8% PAGE) en condiciones reductoras (Figura 5A) o no reductoras (Figura 5B). Las bandas que tenían pesos moleculares de 50 kd y 25 kd correspondían a las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas procedentes del anticuerpo monoclonal Sepharose (Figura 5A, pista 3). Se observaron también cantidades variables de otras bandas en el intervalo de pesos moleculares 25-50 kd, pero no se observaron en precipitados procedentes de leucemia de células pilosas, que producían únicamente una banda de peso molecular 90 kd. Se encontró que la subunidad \alpha de 177 kd y la subunidad \beta de 95 kd de LFA-1 migraban de modo diferente de ICAM-1 tanto en condiciones reductoras (Figura 5A, pista 2) como no reductoras (Figura 5B, pista 2).

Con objeto de determinar el efecto del anticuerpo monoclonal RR1/1 sobre la agregación PHA-linfoblastos, se empleó el ensayo de agregación cuantitativa descrito en el Ejemplo 2. Así, células blásticas de células T se estimularon durante 4 días con PHA, se lavaron concienzudamente, y se cultivaron luego durante 6 días en presencia de medio acondicionado con IL-2. Se encontró que PHA se internalizaba durante este cultivo de 6 días, y no contribuía al ensayo de agregación. En tres ensayos diferentes con preparaciones de células blásticas T diferentes, los anticuerpos monoclonales ICAM-1 inhibían consistentemente la agregación (Tabla 2).

TABLA 2 Inhibición de la agregación PHA linfoblastos estimulada por PMA por el anticuerpo monoclonal RR1/1^{a}

Expt.	PMA	Mab	% Agregación	% Inhibición^{b}
1^{c}	-	Control	9	- -
	+	Control	51	0
	+	HLA-A,B	58	-14^{d}
	+	LFA-1 alfa	31	39
	+	ICAM-1	31	39
2^{e}	-	Control	10	- -
	+	Control	78	0
	+	LFA-1 beta	17	78

TABLA 2 (continuación)

Expt.	PMA	Mab	% Agregación	% Inhibición^{b}
	+	ICAM-1	50	36
3^{f}	-	- - -	7
	+	Control	70
	+	HLA-A,B	80	-14
	+	LFA-3	83	-19
	+	LFA-1 alfa	2	97
	+	LFA-1 beta	3	96
	+	ICAM-1	34	51

^{a} La agregación de los linfoblastos inducidos por PHA estimulada con 50 ng/ml de PMA se cuantificó indirectamente por recuento al microscopio del número de células no agregadas como se describe en el Ejemplo 2. ^{b} Porcentaje de inhibición relativo a las células tratadas con PMA y anticuerpo monoclonal X63. ^{c} La agregación se midió 1 hora después de la adición simultánea de anticuerpo monoclonal y PMA. Las células se agitaron mediante sacudidas a 175 rpm. ^{d} Un número negativo indica porcentaje de intensificación de la agregación. ^{e} La agregación se midió 1 hora después de la adición simultánea de anticuerpo monoclonal y PMA. Las células se sedimentaron por centrifugación a 200 x G durante 1 min, se incubaron a 37ºC durante 15 min, se suspendieron de nuevo suavemente, y se agitaron mediante sacudidas durante 45 min a 100 rpm. ^{f} Las células se sometieron a pretratamiento con PMA durante 4 h a 37ºC. Después de añadir el anticuerpo monoclonal, los tubos se incubaron a 37ºC de manera estacionaria durante 20 min y se agitaron mediante sacudidas a 75 rpm durante 100 min.

Los anticuerpos monoclonales de LFA-1 eran consistentemente más inhibidores que los anticuerpos monoclonales de ICAM-1, mientras que los anticuerpos monoclonales de HLA-A, B y LFA-3 no producían efecto alguno. Estos resultados indican que de los anticuerpos monoclonales ensayados, únicamente aquéllos capaces de fijarse a LFA-1 ó ICAM-1 eran capaces de inhibir la adhesión celular.

Ejemplo 10 Preparación del anticuerpo monoclonal para ICAM-1 Inmunización

Se inmunizó un ratón Balb/C por vía intraperitoneal (i.p.) con 0,5 ml de 2 x 10^{7} células JY en medio RPMI durante 103 días y 24 días antes de la fusión. Los días 4 y 3 antes de la fusión, se inmunizaron ratones por vía i.p. con 10^{7} células U937 diferenciadas con PMA en 0,5 ml de medio RPMI.

Diferenciación de las células U937

Las células U937 (ATCC CRL-1593) se diferenciaron por incubación de las mismas a 5 x 10^{5}/ml en RPMI con 10% de suero de bovino fetal, 1% de glutamina y 50 \mug/ml de gentamina (medio completo) que contenía 2 ng/ml de 12-miristato-acetato de forbol (PMA) en un recipiente de polipropileno estéril. El tercer día de esta incubación, se retiró la mitad del volumen del medio y se reemplazó con medio completo de nuevo aporte que contenía PMA. El día 4, se extirparon las células, se lavaron y se prepararon para inmunización.

Fusión

Células del bazo de los ratones inmunizados se fusionaron con células de mieloma P3x63 Ag8.653 en una relación 4:1 de acuerdo con Galfre et al., (Nature 266:550 (1977)). Después de la fusión, las células se extendieron en una placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo plano a razón de 10^{5} células de bazo/pocillo.

\newpage

Selección para células positivas anti-ICAM-1

Al cabo de una semana, se exploraron 50 \mul de sobrenadante en el ensayo cualitativo de agregación del Ejemplo 2 utilizando JY y SKW-3 como líneas de células agregantes. Las células procedentes de los sobrenadantes que inhibían la agregación de las células JY, pero no la de SKW-3 se seleccionaron y se clonaron dos veces utilizando dilución limitante.

Este experimento dio como resultado la identificación y clonación de tres líneas de hibridoma separadas que producían anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1. Los anticuerpos producidos por estas líneas de hibridoma eran IgG_{2a}, IgG_{2b}, e IgM, respectivamente. La línea de células de hibridoma que producía el anticuerpo anti-ICAM-1 IgG_{2a} recibió la designación R6'5'D6'E9'B2. El anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma preferida se designó R6'5'D6'E9'B2 (al que se hace referencia en esta memoria como "R6-5-D6").

Ejemplo 11 La expresión y regulación de ICAM-1

Con objeto de medir la expresión de ICAM-1, se desarrolló un ensayo radioinmune. En este ensayo, se yodó RR1/1 purificado utilizando yodógeno a una actividad específica de 10 \muCi/\mug. Se dejaron células endoteliales crecer en placas de 96 pocillos y se trataron como se describe para cada experimento. Las placas se enfriaron a 4ºC poniéndolas en un ambiente frío durante 0,5-1 h, no inmediatamente en hielo. Las monocapas se lavaron tres veces con medio completo frío y se incubaron luego durante 30 min a 4ºC con ^{125}I RR1/1. Las monocapas se lavaron luego tres veces con medios completos. El ^{125}I fijado se liberó utilizando NaOH 0,1 N y se sometió a recuento. La actividad específica del ^{125}I RR1/1 se ajustó utilizando RR1/1 sin marcar para obtener una señal lineal a lo largo del intervalo de densidades de antígeno encontrado en este estudio. Se determinó la fijación inespecífica en presencia de un exceso de 1000 veces de RR1/1 sin marcar y se sustrajo de la fijación total para dar la fijación específica.

La expresión de ICAM-1, medida utilizando el ensayo radioinmune arriba descrito, es incrementada en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y las células endoteliales de la vena safena humana (HSVEC) por IL-1, TNF, LPS y \gamma-IFN (Tabla 3). Se utilizaron células endoteliales de la vena safena en este estudio para confirmar los resultados de las células endoteliales de la vena umbilical en células endoteliales cultivadas de venas grandes derivadas de tejido adulto. La expresión basal de ICAM-1 es dos veces mayor en las células endoteliales de la vena safena que en las células endoteliales de la vena umbilical. La exposición de las células endoteliales de la vena umbilical a \alpha-IL-1, \beta-IL-1, y \gamma-TNF recombinantes aumenta la expresión de ICAM-1 10-20 veces. IL-1\alpha, TNF y LPS eran los inductores más potentes y IL-1 era menos potente sobre base de peso y también en concentraciones de saturación en cuanto a la respuesta (Tabla 3). IL-1 \beta a 100 ng/ml aumentaba la expresión de ICAM-1 9 veces en HUVEC y 7,3 veces en HSVEC, presentándose el aumento semi-máximo a 15 ng/ml. rTNF a 50 ng/ml aumentada la expresión de
ICAM-1 16 veces en HUVEC y 11 veces en HSVEC con efectos semi-máximos a 0,5 ng/ml. El interferón \gamma produjo un aumento significativo en la expresión de ICAM-1 de 5,2 veces en HUVEC ó 3,5 veces en HSVEC a 10.000 U/ml. El efecto de LPS a 10 \mug/ml era similar en magnitud al de rTNF. Combinaciones por pares de estos mediadores dieron como resultado efectos aditivos o efectos ligeramente inferiores a los aditivos en la expresión de ICAM-1 (Tabla 3). La titulación cruzada de rTNF con rIL-1 \beta o rIFN \gamma no acusó sinergia alguna entre éstos a concentraciones subóptimas u óptimas.

Dado que LPS aumentaba la expresión de ICAM-1 en células endoteliales a niveles encontrados algunas veces en medios de cultivo, se examinó la posibilidad de que la expresión basal de ICAM-1 pudiera ser debida a LPS. Cuando se ensayaron varias cargas de suero, se encontró que el suero pobre en endotoxina daba una expresión basal de ICAM-1 menor en un 25%. Todos los resultados consignados aquí se referían a células endoteliales cultivadas en suero pobre en endotoxina. Sin embargo, la inclusión del antibiótico polimixina B neutralizante de LPS a 10 \mug/ml reducía la expresión de ICAM-1 solamente en un 25% adicional (Tabla 3). El aumento de la expresión de ICAM-1 por tratamiento con IL-1 ó TNF no se veía afectado por la presencia de 10 \mug/ml de polimixina B, lo cual es consistente con los bajos niveles de endotoxina en estas preparaciones (Tabla 3).

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1

Condición (16 h)	^{125}I Fijado específicamente (CPM)
	HUVEC	HSVEC
Control	603 \pm 11	-	1132 \pm 31	-
100 ng/ml rIL-1 beta	5680 \pm 633	9x	8320 \pm 766	7,3x
50 ng/ml rIL-1 alfa	9910 \pm 538	16x	-	-
50 ng/ml rTNF alfa	9650 \pm 1500	16x	12690 \pm 657	11,2x
10 \mug/ml LPS	9530 \pm 512	16x	10459 \pm 388	9,2x
10 ng/ml rIFN gamma	3120 \pm 308	5,2x	4002 \pm 664	3,5x
rIL-1 beta + rTNF	1469 \pm 1410	24x	16229 \pm 660	14x
rIL-1 beta + LPS	13986 \pm 761	23x	10870 \pm 805	10x
rIL-1 beta + rIFN gamma	7849 \pm,601	13x	8401 \pm 390	7,4x
rTNF + LPS	15364 \pm 1241	24x	16141 \pm 1272	14x
rTNF + rIFN gamma	13480 \pm 1189	22x	13238 \pm 761	12x
LPS + IFN gamma	10206 \pm 320	17x	10987 \pm 668	10x
Poliximina B (10 \mug/ml)	480 \pm 23	-	-	-
Poliximina B + rIL-1	5390 \pm 97	11x	-	-
Poliximina B + rTNF	9785 \pm 389	20x	-	-
1 \mug/ml LPS	7598 \pm 432	13x	-	-
Poliximina B + LPS	510 \pm 44	1,1x

Regulación creciente de la expresión de ICAM-1 en HUVEC y HSVEC - Se sembraron HUVEC o HSVEC en placas de 96 pocillos en relación 1:3 a partir de una monocapa confluyente y se dejaron crecer hasta confluencia. Las células se trataron luego con los materiales o medios indicados durante 16 h y se realizó el ensayo RIA como en los métodos. Todos los puntos se determinaron por cuadruplicado.

Ejemplo 12 Cinética de la inducción de ICAM-1 por interleuquina 1 y \gamma-interferón

Las cinéticas de los efectos de interleuquina 1 y \gamma-interferón sobre la expresión de ICAM-1 en fibroblastos dérmicos se determinaron utilizando el ensayo de fijación de IgG anti-ratón de cabra marcado con ^{125}I de Dustin, M.L. et al., (J. Immunol. 137:245-254 (1986); referencia que se incorpora aquí como anterioridad). Para realizar este ensayo de fijación, se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos en una placa de microtitulación de 96 pocillos hasta una densidad de 2-8 x 10^{4} células/pocillo (0,32 cm^{2}). Las células se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 complementado como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células se lavaron adicionalmente una sola vez con Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS), HEPES 10 mM, 0,05% de NaN_{3} y 10% de suero de bovino fetal desactivado por el calor. El lavado con este tampón de fijación se realizó a 4ºC. Se añadieron a cada pocillo 50 \mul del tampón de fijación arriba descrito y 50 \mul del sobrenadante de hibridoma apropiado con X63 y W6/32 como controles negativo y positivo, respectivamente. Después de incubación durante 30 minutos a 4ºC, con agitación moderada, los pocillos se lavaron dos veces con tampón de fijación, y el segundo anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra marcado con ^{125}I se añadió a 50 nCi en 100 \mul. El anticuerpo anti-ratón ^{125}I de cabra se preparó utilizando Iodogen (Pierce) de acuerdo con el método de Fraker, P.J. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:849 (1978)). Al cabo de 30 minutos a 4ºC, los pocillos se lavaron dos veces con 200 \mul de tampón de fijación y la capa de células se solubilizó por adición de 100 \mul de NaOH 0,1 N. Este producto y un lavado de 100 \mul se sometieron a recuento en un contador gamma Beckman 5500. Los recuentos específicos por minuto fijados se calcularon como [cpm con anticuerpo monoclonal] - [cpm con X63]. Todos los pasos, con inclusión de la inducción con reactivos específicos, se llevaron a cabo por cuadruplicado.

El efecto de la interleuquina 2 con una semi-vida para la inducción de ICAM-1 de dos horas era más rápido que el de \gamma-interferón, que tenía una semi-vida de 3,75 horas (Figura 6). La evolución en el tiempo de la vuelta a los niveles de reposo de ICAM-1 parecía depender del ciclo celular o de la velocidad de crecimiento de las células. En las células en reposo, los efectos de interleuquina 1 y \gamma-interferón son estables durante 2-3 días, mientras que en cultivos de fase logarítmica, la expresión de ICAM-1 está cerca de la línea base dos días después de la retirada de estos agentes inductores.

Las curvas dosis-respuesta para la inducción de ICAM-1 por interleuquina 1 de ratón y humana recombinante, y para el \gamma-interferón humano recombinante, se muestran en la Figura 7. Se encontró que el interferón \gamma y la interleuquina 1 tenían dependencias de concentración similares con efectos aproximadamente idénticos a 1 ng/ml. La interleuquina 1 recombinante humana y la de ratón presentan también curvas similares, pero son mucho menos eficaces que las preparaciones de interleuquina 1 humana en la inducción de la expresión de ICAM-1.

La ciclohexamida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, y la actinomicina D, un inhibidor de la síntesis de mRNA, anulan los efectos tanto de la interleuquina 1 como del interferón \gamma en la expresión de ICAM-1 en los fibroblastos (Tabla 4). Adicionalmente, la tunicamicina, un inhibidor de la glicosilación enlazada a N, inhibía solamente el efecto de la interleuquina en un 43%. Estos resultados indican que la síntesis de proteínas y de mRNA, pero no la glicosilación enlazada a N, se requieren para los aumentos en la expresión de ICAM-1 estimulados por interleuquina 1 y
\gamma-interferón.

TABLA 4 Efectos de Cicloheximida, Actinomicina D, y Tunicamicina sobre la inducción de ICAM-1 por IL-1 y \gamma-IFN en fibroblastos dérmicos humanos^{a}

Tratamiento	IgG ^{125}I anti-ratón de cabra fijada específicamente (cpm)
	Anti-ICAM-1	Anti-HLA-A,B,C
Control (4h)	1524 \pm 140	11928 \pm 600
+ Cicloheximida	1513 \pm 210	10678 \pm 471
+ Actinomicina D	1590 \pm 46	12276 \pm 608
+ Tunicamicina	1461 \pm 176	12340 \pm 940
IL-1 (10 U/ml) (4h)	4264 \pm 249	12155 \pm 510
+ Cicloheximida	1619 \pm 381	12676 \pm 446
+ Actinomicina D	1613 \pm 88	12294 \pm 123
+ Tunicamicina	3084 \pm 113	13424 \pm 661
IFN-\gamma (10 U/ml)(18h)	4659 \pm 109	23635 \pm 500
+ Cicloheximida	1461 \pm 59	10675 \pm 800
+ Actinomicina D	1326 \pm 186	12089 \pm 550

^{a} Los fibroblastos humanos se dejaron crecer hasta una densidad de 8 x 10^{4} células/pocillo de 0,32 cm^{2}. Los tratamientos se llevaron a cabo en un volumen final de 50 \mul que contenía los reactivos indicados. Se añadieron cicloheximina, actinomicina D, y tunicamicina a 20 \mug/ml, 10 \muM y 2 \mug/ml, respectivamente, al mismo tiempo que las citoquinas. Todos los puntos son valores medios de pocillos cuadruplicados \pm desviación estándar.

Ejemplo 13 La distribución tisular de ICAM-1

Se realizaron estudios histoquímicos sobre tejido congelado de órganos humanos para determinar la distribución de ICAM-1 en timo, ganglios linfáticos, intestino, piel, riñón, e hígado. Para realizar dicho análisis, se fijaron en acetona secciones de tejido congelado (de 4 \mum de espesor) de tejidos humanos normales durante 10 minutos y se tiñeron con el anticuerpo monoclonal RR1/1 por una técnica de inmunoperoxidasa que empleaba el método del complejo avidina-biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) descrito por Cerf--Bensussan N. et al. (J. Immunol. 130:2615 (1983)). Después de incubación con el anticuerpo, las secciones se incubaron secuencialmente con IgG biotinilado anti-ratón de caballo y complejos avidina peroxidasa biotinilada. Las secciones se sumergieron finalmente en una solución que contenía 3-amino--9-etil-carbazol (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) para desarrollar una reacción coloreada. Las secciones se fijaron luego en formaldehído al 4% durante 5 minutos y se sometieron a contra-tinción con hematoxilina. Los controles incluían secciones incubadas con anticuerpos monoclonales no afines en lugar del anticuerpo RR1/1.

Se encontró que ICAM-1 tenía una distribución sumamente similar a la de los antígenos de Clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La mayoría de los vasos sanguíneos (tanto pequeños como grandes) en todos los tejidos exhibían tinción de las células endoteliales con el anticuerpo ICAM-1. La tinción endotelial vascular era más intensa en las áreas interfoliculares (paracorticales) en los ganglios linfáticos, las amígdalas, y las plagas de Peyer en comparación con los vasos de riñón, hígado, y piel normal. En el hígado, la tinción estaba restringida en su mayoría a las células del revestimiento sinusoidal; los hepatocitos y las células endoteliales que revestían la mayor parte de las venas y arterias de la circulación portal no se teñían.

En la médula tímica, se observó una tinción difusa de células grandes y un patrón de tinción dendrítico. En la corteza, el patrón de tinción era focal y predominantemente dendrítico. Los timocitos no se teñían. En el tejido linfoide periférico, las células germinales del centro de los folículos linfoides secundarios estaban intensamente teñidas. En algunos folículos linfoides, el patrón de tinción era en su mayor parte dendrítico, sin tinción reconocible alguna de los linfocitos. Se observó también una tinción tenue de las células en la zona del manto. Adicionalmente, las células dendríticas con extensiones citoplásmicas (células del retículo de interdigitación) y un pequeño número de linfocitos en las áreas interfolicular o paracortical se teñían con el anticuerpo de fijación de ICAM-1.

Células que se asemejaban a macrófagos se teñían en los ganglios linfáticos y la lámina propia del intestino delgado. Células semejantes a fibroblastos (células en forma de husillo) y células dendríticas estaban dispersas en el estroma de la mayor parte de los órganos estudiados teñidos con el anticuerpo de fijación de ICAM-1. No se pudo apreciar tinción alguna en las células de Langerhans/indeterminantes en la epidermis. No se observó tinción alguna en el tejido muscular liso.

La tinción de las células epiteliales se observó consistentemente en la mucosa de las amígdalas. Aunque los hepatocitos, el epitelio del conducto biliar, las células epiteliales intestinales, y las células epiteliales tubulares del riñón no se teñían en la mayor parte de los casos, secciones de tejido de riñón normal obtenidas a partir de una muestra de nefrectomía con carcinoma de células renales exhibían la tinción de muchas células tubulares próximas para ICAM-1. Estas células epiteliales tubulares se teñían también con un anticuerpo de fijación anti-HLA-DR.

En resumen, ICAM-1 se expresa en células no hematopoyéticas tales como células endoteliales vasculares y en células hematopoyéticas tales como macrófagos tisulares y blastos de linfocitos T estimulados por mitógenos. Se encontró que ICAM-1 se expresaba en bajas cantidades en los linfocitos de la sangre periférica.

Ejemplo 14 La purificación de ICAM-1 por cromatografía de afinidad de anticuerpos monoclonales Esquema general de purificación

Se purificó ICAM-1 a partir de células o tejido humanos utilizando cromatografía de afinidad de anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal, RR1/1, reactivo con ICAM-1 se purificó primeramente, y se copuló a una matriz de columna inerte. Este anticuerpo ha sido descrito por Rothlein, R. et al. J. Immunol. 137:1270-1274 (1986) y Dustin, M.L. et al. J. Immunol. 137:245 (1986). Se solubilizó ICAM-1 a partir de membranas celulares por lisis de las células en un detergente no iónico, Triton X-100, a un pH aproximadamente neutro. El lisado celular que contenían ICAM-1 solubilizada se hizo pasar luego a través de precolumnas diseñadas para separar los materiales que se fijan de manera inespecífica al material de la matriz de la columna, y luego a través de la matriz de la columna de anticuerpos monoclonales, dejando que ICAM-1 se fijara al anticuerpo. La columna de anticuerpos se lavó luego con una serie de tampones detergentes de lavado de pH creciente hasta pH = 11,0. Durante estos lavados, ICAM-1 permaneció fijada a la matriz de anticuerpos, mientras que se separaron los contaminantes que no se fijaban y que se fijaban débilmente. La ICAM-1 fijada se eluyó luego específicamente de la columna por aplicación de un tampón detergente de pH 12,5.

Purificación del anticuerpo monoclonal RR1/1 y copulación covalente con Sepharose CL-4B

El anticuerpo monoclonal RR1/1 anti-ICAM-1 se purificó del fluido de ascitis de ratones portadores de hibridoma, o de sobrenadantes de cultivos de hibridoma por técnicas estándar de precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de afinidad con proteína A (Ey et al., Immunochem. 15:429 (1978)). La IgG purificada, o IgG de rata (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se acopló covalentemente a Sepharose CL- -4B (Pharmacia, Upsala, Suecia) utilizando una modificación del método de March et al., (Anal. Biochem. 60:149 (1974)). Resumidamente, se lavó Sepharose CL-4B en agua destilada, se activó con 40 mg/ml de CNBr en K_{2}HPO_{4} 5 M (pH aproximadamente 12) durante 5 minutos, y se lavó luego extensamente con HCl 0,1 mM a 4ºC. La Sepharose filtrada y activada se resuspendió con un volumen igual de anticuerpo purificado (2-10 mg/ml en NaHCO_{3} 0,1 mM, NaCl 0,1 M). La suspensión se incubó durante 18 horas a 4ºC con agitación suave extremo con extremo. El sobrenadante se observó luego en cuanto a anticuerpos no fijados por absorbancia a 280 nm, y los sitios reactivos remanentes en la Sepharose activada se saturaron por adición de glicina a concentración 0,05 M. La eficiencia de copulación era usualmente mayor que 90%.

Solubilización con detergente de membranas preparadas a partir de bazo humano

Todos los procedimientos se realizaron a 4ºC. Bazo humano congelado (fragmentos de 200 g) procedente de pacientes con leucemia de células pilosas se descongelaron en hielo en 200 ml de Tris-solución salina (Tris 50 mM, NaCl 0,14 M, pH 7,4 a 4ºC) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, 0,2 U/ml de aprotinina, y yodoacetamida 5 mM. El tejido se cortó en pequeños fragmentos, y se homogenizó a 4ºC con un homogeneizador mecánico Teckmar. El volumen se llevó luego a 300 ml con Tris-solución salina, y se añadieron 100 ml de Tween 40 al 10% (monopalmitato de polioxietilen-sorbitán) en Tris- solución salina para alcanzar una concentración final de 2,5% de Tween 40.

Para preparar las membranas, el homogeneizado se extrajo utilizando tres emboladas de un homogeneizador Dounce o, más preferiblemente, Potter Elvejhem de Teflón, y se centrifugaron luego a 1000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se retuvo y el sedimento se extrajo de nuevo con 200 ml de Tween 40 al 2,5% en Tris-solución salina. Después de centrifugación a 1000 x g durante 15 minutos, los sobrenadantes de ambas extracciones se reunieron y se centrifugaron a 150.000 x g durante 1 hora para reducir las membranas a un sedimento. Se lavaron las membranas por resuspensión en 200 ml de Tris-solución salina, y se centrifugaron a 150.000 x g durante 1 hora. El sedimento de membranas se resuspendió en 200 ml de Tris-solución salina y se homogeneizó con un homogeneizador motorizado y una mano de mortero de teflón hasta que la suspensión fue uniformemente turbia. Se llevó luego el volumen hasta 900 ml con Tris-solución salina, y se añadió N-lauroil-sarcosina a una concentración final de 1%. Después de agitación a 4ºC durante 30 minutos, el material insoluble contenido en el lisado de detergente se separó por centrifugación a 150.000 x g durante 1 hora. Se añadió luego Triton X-100 al sobrenadante hasta una concentración final de 2%, y el lisado se agitó a 4ºC durante 1 hora.

Solubilización con detergente de las células B linfoblastoide JY

La línea de células B linfoblastoides JY transformada por EBV se cultivó en RPMI 1640 que contenía 10% de suero de ternero fetal (FCS) y HEPES 10 mM hasta una densidad aproximada de 0,8-1,0 x 10^{6} células/ml. Para aumentar la expresión de ICAM-1 en la superficie celular, se añadió 12-miristato--13-acetato de forbol (PMA) a 25 ng/ml durante 8-12 horas antes de recoger las células. Se añadió también vanadato de sodio (50 \muM) a los cultivos durante este tiempo. Las células se redujeron a un sedimento por centrifugación a 500 x g durante 10 minutos, y se lavaron dos veces en solución salina equilibrada de Hank's (HBSS) por resuspensión y centrifugación. Las células (aproximadamente 5 g por 5 litros de cultivo) se lisaron en 50 ml de tampón de lisis (NaCl 0,14 M, Tris 50 mM de pH 8,0, 1% de Triton X-100, 0,2 U/ml de aprotinina, PMSF 1 mM, vanadato de sodio 50 \muM) por agitación a 4ºC durante 30 minutos. Los núcleos que no habían sufrido lisis y los restos insolubles se separaron por centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos, seguido por centrifugación del sobrenadante a 150.000 x g durante 1 hora, y filtración del sobrenadante a través de papel de filtro Whatman 3 mm.

Cromatografía de afinidad e ICAM-1 para estudios estructurales

Para la purificación en gran escala de ICAM-1 destinada a la utilización en estudios estructurales, se utilizaron una columna de 10 ml de RR1/1-Sepharose CL-4B (copulada con 2,5 mg de anticuerpo/ml de gel), y dos pre-columnas de 10 ml de Sepharose CL-4B activada con CNBr y extinguida con glicina e IgG de rata copulada a Sepharose CL-4B (2 mg/ml). Las columnas se conectaron en serie, y se prelavaron con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis, 10 volúmenes de columna de tampón de pH 12,5 (trietilamina 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, pH 12,5 a 4ºC), seguido por equilibración con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis. Se cargó 1 litro del lisado de bazo humano con detergente a un caudal de 0,5-1,0 ml por minuto. Las dos precolumnas se utilizaron para separar el material que se fijaba de manera inespecífica del lisado antes del paso a través de la columna de RR1/1-Sepharose.

Después de la carga, la columna de RR1/1-Sepharose e ICAM-1 fijada se lavó secuencialmente a un caudal de 1 ml/minuto con un mínimo de 5 volúmenes de columna de cada uno de los siguientes: 1) tampón de lisis, 2) Tris 20 mM de pH 8,0/NaCl 0,14 M/Triton X-100 al 0,1%, 3) glicina 20 mM de pH 10,0/Triton X-100 al 0,1%, y 4) trietilamina 50 mM de pH 11,0/Triton X-100 al 0,1%. Todos los tampones de lavado contenían PMSF 1 mM y 0,2 U/ml de aprotinina. Después del lavado, la ICAM-1 fijada remanente se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón de elución (trietilamina 50 mM/Triton X-100 al 0,1%/pH 12,5 a 4ºC) a un caudal de 1 ml/3 minutos. La ICAM-1 eluida se recogió en fracciones de 1 ml y se neutralizó inmediatamente por adición de 0,1 ml de Tris 1 M, pH 6,7. Las fracciones que contenían ICMA-1 se identificaron por electroforesis en SDS-poliacrilamida de partes alícuotas de 10 \mul (Springer et al, J. Exp. Med. 160:1901 (1984)), seguido por tinción con plata (Morrissey, J.H., Anal. Biochem. 117:307 (1981)). En estas condiciones, la mayor parte de la ICAM-1 se eluia en aproximadamente 1 volumen de columna y tenía una pureza mayor que 90% como se interpretó por los electroferogramas teñidos con plata (una pequeña cantidad de IgG, lixiviada de la matriz de afinidad, era el contaminante principal). Las fracciones que contenían ICAM-1 se agruparon y se concentraron aproximadamente 20 veces utilizando microconcentradores Centricon-30 (Amicon. Danvers, MA). La ICAM-1 purificada se cuantificó por el ensayo de proteínas de Lowry a partir de una parte alícuota de la agrupación precipitada con etanol: se produjeron aproximadamente 500 \mug de ICAM-1 pura a partir de los 200 gramos de bazo humano.

Aproximadamente 200 \mug de ICAM-1 purificada se sometieron a una segunda etapa de purificación por electroforesis preparativa en gel de SDS-poliacrilamida. La banda que representaba ICAM-1 se visualizó por impregnación del gel en KCl 1 M. La región del gel que contenía ICAM-1 se cortó luego y se electroeluyó de acuerdo con el método de Hunkapiller et al, Meth. Enzymol. 91:227-236 (1983). La proteína purificada tenía una pureza superior a 98% tal como se dedujo por SDS--PAGE y tinción con plata.

Purificación por afinidad de ICAM-1 para estudios funcionales

Se purificó ICAM-1 para uso en estudios funcionales a partir de lisados con detergente de células JY como se ha descrito arriba, pero en menor escala (una columna de 1 ml de RR1/1-Sepharose), y con las modificaciones siguientes. Todas las soluciones contenían vanadato de sodio 50 \muM. Después de lavar la columna con tampón de pH 11,0 que contenía Triton X-100 al 0,1%, la columna se lavó de nuevo con 5 volúmenes de columna del mismo tampón que contenía 1% de n-octil-\beta-D--glucopiranosido (octiglucosido) en lugar de Triton X-100 al 0,1%. El detergente octilglucosido desplaza el Triton X-100 fijado a ICAM-1, y al contrario que Triton X-100, se puede separar subsiguientemente por diálisis. La ICAM-1 se eluyó luego con tampón de pH 12,5 que contenía 1% de octilglucosido en lugar de Triton X-100 al 0,1%, y se analizó y concentró como se ha descrito arriba.

Ejemplo 15 Características de la ICAM-1 Purificada

La ICAM-1 purificada a partir de bazo humano migra en los geles de SDS-poliacrilamida como una banda ancha de M_{r} comprendido entre 72.000 y 91.000. La ICAM-1 purificada a partir de células JY migra también como una banda ancha de M_{r} 76.500 a 97.000. Estos valores M_{r} están dentro del intervalo indicado para ICAM-1 inmunoprecipitada a partir de diferentes fuentes de células: M_{r} = 90.000 para células JY, 114.000 en la línea de células mielomonocíticas U937, y 97.000 en fibroblastos (Dustin et al., J. Immunol. 137:245 (1986)). Este amplio intervalo de M_{r} ha sido atribuido a un grado de glicosilación extenso, pero variable. El precursor no glicosilado tiene un valor M_{r} de 55.000 (Dustin et al.). La proteína purificada a partir de células JY o de bazo humano retiene su actividad antigénica como se evidencia por su capacidad para re-fijarse a la columna de afinidad original, y por inmunoprecipitación con RR1/1-Sepharose y electro-foresis en SDS-poliacrilamida.

Para producir fragmentos peptídicos de ICAM-1, se redujeron aproximadamente 200 \mug con ditiotreitol 2 mM/SDS al 2%, seguido por alquilación con ácido yodoacético 5 mM. La proteína se precipitó con etanol, y se redisolvió en NH_{4}CO_{3} 0,1 M/CaCl_{2} 0,1 mM/Zwittergent 3-14 al 0,1% (Calbiochem), y se digirió con tripsina al 1% peso/peso a 37ºC durante 4 horas, seguido por una digestión adicional con tripsina al 1% durante 12 horas a 37ºC. Los péptidos trípticos se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés "high pressure liquid, chromatography") en fase inversa utilizando una columna C4 de 0,4 x 15 cm (Vydac). Los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de 0% a 60% de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1%. Los péptidos seleccionados se sometieron a análisis de la secuencia en un microsecuenciador en fase gaseosa (Applied Biosystems). La información de secuencias obtenida a partir de este estudio se muestra en la Tabla 5.

TABLA 5 Secuencias de aminoácidos de los péptidos trípticos de ICAM-1

Residuo de

Péptido

aminoácido

50a

50b

46a

46b

X

45

K

AA

J

U

O

MI

1

[T/V]

A

(V/A)

E

V

S

L

E

A

L

V

L

2

F

S

Q

P

E

F

N

L

G

L

T

L/E

3

L

I

T

A

L

P

P

D

S

G

L

P/(G)

4

T

S

F

A

A

T

L

V

I

P

5

V

L

P

P

P

V

R

L

E

G/Y

6

Y

G

L

L

N

T

P

V

T

N/L

7

P

W

P

P

V

Y

Q

T

P

(N)

8

T

P

I

I

T/I

G

G

C

P/V

(Q)

9

S

F

G

(G)

L

-

L

S

K

(E)

10

E

E

(Q)

-

D

E

T

(D)

11

A

S

D/P

K

S

L

S

12

G/S

V

V

P

F

F

C

13

A

T

D

Q

S

E

D

14

G

V

W

V/L

A

-

Q

TABLA 5 (continuación)

Residuo de

Péptido

aminoácido

50a

50b

46a

46b

X

45

K

AA

J

U

O

MI

15

I

K

T

P

16

S

K

17

A

18

P

19

X

20

Q

21

L

( ) = Secuencia de confianza baja

[ ] = Secuencia de confianza muy baja

/ = Indica ambigüedad en la secuencia; se cita en

primer lugar el aminoácido más probable

a = Péptido mayor

b = Péptido menor.

Ejemplo 16 Clonación del fen de ICAM-1

El gen para ICAM-1 se puede clonar utilizando cualquiera de una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, la informción de la secuencia de aminoácidos obtenida por la secuenciación de los fragmentos trípticos de
ICAM-1 (Tabla 5) se puede utilizar para identificar una secuencia de oligonucleótidos que correspondería al gen de ICAM-1. Alternativamente, el gen de ICAM-1 se puede clonar utilizando anticuerpo anti-ICAM-1 para detectar clones que producen ICAM-1.

Clonación del gen para ICAM-1 mediante el uso de sondas de oligonucleótidos

Utilizando el código genético (Watson, J.D., en: Molecular Biology of the Gene, 3ª edición, W.A. Benjamin Inc., Menlo Park, CA (1977)), se pueden identificar uno o más oligonucleótidos diferentes, cada uno de los cuales sería capaz de codificar los péptidos trípticos de ICAM-1. La probabilidad de que un oligonucleótido particular constituya, de hecho, la secuencia real que codifica ICAM-1 puede estimarse por consideración de relaciones de apareamiento de bases anormales y la frecuencia con la cual se utiliza realmente un codón particular (para codificar un aminoácido particular) en células eucariotas. Tales "reglas del uso de codones" han sido descritas por Lathe, R., et al., J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Utilizando las "reglas del uso de codones" de Lathe, se identifica un oligonucleótido individual, o un conjunto de oligonucleótidos, que contiene una secuencia de nucleótidos teórica "más probable" (es decir la secuencia de nucleótidos que tiene la redundancia mínima) capaz de codificar las secuencias de péptidos críticos de ICAM-1.

El oligonucleótido, o el conjunto de oligonucleótidos, que contienen la secuencia teórica "más probable" capaz de codificar los fragmentos de ICAM-1 se utiliza para identificar la secuencia de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos complementario que es capaz de hibridarse a la secuencia o conjunto de secuencias "más probable". Un oligonucleótido que contenga una secuencia complementaria de este tipo se puede emplear como sonda para identificar y aislar el gen de ICAM-1 (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Como se ha descrito anteriormente en la Sección C, es posible clonar el gen de ICAM-1 a partir de preparaciones de DNA eucariota sospechosas de contener este gen. Para identificar y clonar el gen que codifica la proteína ICAM-1, se explora una genoteca de DNA en cuanto a su capacidad para hibridarse con las sondas de oligonucleótidos descritas anteriormente. Dado que es probable que existan únicamente dos copias del gen para ICAM-1 en una célula diploide normal, y puesto que es posible que el gen de ICAM-1 pueda tener grandes secuencias intercaladas no transcritas (intrones) cuya clonación no se desea, es preferible aislar las secuencias que codifican ICAM-1 de una genoteca de cDNA preparada a partir de mRNA de una célula productora de ICAM-1, en lugar de hacerlo a partir de DNA genómico. El DNA, o preparaciones de cDNA adecuado(s) se escinden enzimáticamente, o se cizallan aleatoriamente, y se ligan a vectores recombinantes. Se mide a continuación. La capacidad de estos vectores recombinantes para hibridarse a las sondas de oligonucleótidos arriba descritas. Procedimientos para hibridación se describen, por ejemplo, en Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) o en Haymes, B.T., et al., Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra (1985). Los vectores encontrados capaces de tal hibridación se analizan luego para determinar la extensión y naturaleza de las secuencias de ICAM-1 que contienen los mismos. Sobre la base de consideraciones exclusivamente estadísticas, pudo identificarse inequívocamente un gen tal como el que codifica la molécula ICAM-1 (por exploración de hibridación) utilizando una sonda oligonucleotídica que tenía solamente 18 nucleótidos.

Así pues, en resumen, la identificación real de las secuencias peptídicas de ICAM-1 permite la identificación de una secuencia de DNA teórica "más probable", o un conjunto de tales secuencias, capaz de codificar un péptido de este tipo. Por construcción de un oligonucléotido complementario a esta secuencia teórica (o por construcción de un conjunto de oligonucleótidos complementarios al conjunto de oligonucleótidos "más probables"), se obtiene una molécula de DNA (o conjunto de moléculas de DNA), capaces de funcionar como sonda para identificar y aislar el gen de ICAM-1.

Utilizando las secuencias peptídicas de ICAM-1 de la Tabla 5, se determinó la secuencia de la secuencia "más probable" de un oligonucleótido capaz de codificar los péptidos AA y J (Tablas 6 y 7), respectivamente). Se sintetizaron oligonucleótidos complementarios a estas secuencias y se purificaron para uso como sondas con objeto de aislar secuencias del gen de ICAM-1. Se generaron genotecas de cDNA adecuadas seleccionadas por tamaño a partir del RNA poli(A)^{+} tanto de células HL-60 inducidas por PMA como de células endoteliales de la vena umbilical estimuladas por PS. Se preparó una genoteca de cDNA seleccionada por tamaños utilizando RNA poli(A)^{+} procedente de células HL-60 inducidas por PMA de acuerdo con el método de Gubler, U., et al. (Gene 25:263-269 (1983)) y Corbi, A., et al., (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)), referencias que se incorporan en este documento como anterioridad.

Se preparó una genoteca de cDNA seleccionada por tamaños utilizando RNA poli(A)^{+} a partir de células endoteliales de la vena umbilical que se habían estimulado durante 4 horas con 5 \mug/ml de PS. El RNA se extrajo por homogeneización de las células en isotiocianato de guanidinio 4M y sometimiento del sobrenadante a ultracentrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin, J.M., et al., Biochem. 18:5294-5299 (1979)). Se aisló RNA poli(A)^{+} a partir de la mezcla de especies totales de RNA mediante el uso de cromatografía con oligo (dT)-celulosa (Tipo 3, Collaborative Research) (Aviv, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69:1408-1412 (1972).

TABLA 6 Oligonucleótido complementario para la secuencia de nucleótidos más probable capaz de codificar el péptido AA de ICAM-1

Residuo de aminoácido	Péptido AA	Secuencia probable que	Secuencia
de ICAM-1	de ICAM-1	codifica el péptido AA	complementaria
		5'	3'
		G	C
162	Glu	A	T
		G	C
		C	T
163	Leu	T	A
		G	C
		G	C
164	Asp	A	T
		C	G
		C	G
165	Leu	T	A
		G	C
		C	G
166	Arg	G	C
		G	C
		C	G
167	Pro	C	G
		C	G

TABLA 6 (continuación)

Residuo de aminoácido	Péptido AA	Secuencia probable que	Secuencia
de ICAM-1	de ICAM-1	codifica el péptido AA	complementaria
		C	G
168	Gln	A	T
		G	C
		G	C
169	Gly	G	C
		C	G
		C	G
170	Leu	T	A
		G	C
		G	C
171	Glu	A	T
		G	C
		C	G
172	Leu	T	A
		G	C
		T	A
173	Phe	T	A
		T	A
		G	C
174	Glu	A	T
		G	C
		3'	5'
		A	T
175	Asn	A	T
		C	G
		A	T
176	Thr	C	G
		C	G
		U	A
177	Ser	C	G
		A
		3'	5'

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Oligonucleótido complementario para la secuencia de nucleótidos más probable capaz de codificar el péptido J de ICAM-1

Residuo de aminoácido	Péptido AA	Secuencia probable que	Secuencia
de ICAM-1	de ICAM-1	codifica el péptido AA	complementaria
		5'	3'
		G	C
19	Val	T	A
		G	C
		A	T
20	Thr	C	G
		C	G
		T	A
21	Cys	G	C
		C	G
		T	A
22	Ser	C	G
		C	G
		A	T
23	Thr	C	G
		C	G
		T	A
24	Ser	C	G
		C	G
		T	A
25	Cys	G	C
		T	A
		G	C
26	Asp	A	T
		C	G
		C	G
27	Gln	A	T
		G	C
		C	G
28	Pro	C	G
		C	G
		A	T
29	Lys	A	T
		3'	5'

Se sintetizó cDNA de la primera cadena utilizando 8 \mug de RNA poli(A)^{+}, transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Life Sciences) y un cebador de oligo(dT). El híbrido DNA- RNA se digirió con RNasa H (BRL) y se sintetizó la segunda cadena utilizando DNA-polimerasa I (New England Biolabs). El producto se metiló con metilasa Eco R1 (New England Biolabs), se ligó en los extremos romos a enlazadores Eco R1 (New England Biolabs), se digirió con Eco R1 y se seleccionó por tamaños en un gel de agarosa de punto de fusión bajo. Los fragmentos de cDNA mayores que 500 pares de bases se ligaron a \lambdaagt10 que se había digerido y desfosforilado previamente con Eco R1 (Stratagene). El producto de la ligación se empaquetó posteriormente (Stratagene Gold).

Se extendieron luego en placas genotecas de células endoteliales de la vena umbilical y cDNA HL-60 a razón de 20.000 PFUC unidades formadoras de calvas (del inglés "plaque forming unit")/placa de 150 mm. Se tansfirió RNA recombinante por duplicado a filtros de nitrocelulosa, se desnaturalizó en NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M, se neutralizó en Tris 1 M, pH 7,5/NaCl 1,5 M y se secó a la estufa a 80ºC durante 2 horas (Benton, W.D., et al., Science 196:180-182 (1977)). Se prehibridaron y se hibridaron filtros en 5X SSC que contenía 5X solución de Denhardt, NaPO_{4} 50 mM y 1 \mug/ml de DNA de esperma de salmón. La prehibridación se llevó a cabo a 45º durante 1 hora.

La hibridación se llevó a cabo utilizando oligonucleótidos antisentido de 32 pares de bases (5'-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) o de 47 pares de bases (5'-GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGG-
GGCCGCAGGTCCAGCTC), basados, de la manera arriba expuesta, en los péptidos trípticos J y AA de ICAM-1, respectivamente (Tabla 6 y 7) (Lathe, R. J. Molec. Biol., 183:1-12 (1985)). Los oligonucleótidos se marcaron en los extremos con \gamma-(^{32}P)ATP utilizando polinucleotidoquinasa T4 y las condiciones recomendadas por el fabricante (New England Biolabs). Después de hibridación durante una noche, los filtros se lavaron dos veces con 2X SSC/SDS al 0,1% durante 30 minutos a 45ºC. Se aislaron fagos a partir de aquellas calvas que exhibían hibridación, y se purificaron por re-extensión en placa y re-exploración sucesivas.

Clonación del gen para ICAM-1 mediante el uso de anticuerpo anti-ICAM-1

El gen para ICAM-1 se puede clonar alternativamente mediante el uso de anticuerpo anti-ICAM-1. Se extrae DNA, o más preferiblemente cDNA, y se purifica a partir de una célula que es capaz de expresar ICAM-1. El cDNA purificado se fragmenta (por cizallamiento, digestión con endonucleasas, etc.) para producir una agrupación de fragmentos de DNA o cDNA. Los fragmentos de DNA o cDNA de esta agrupación se clonan luego a un vector de expresión con objeto de producir una genoteca genómica de vectores de expresión cuyos miembros contienen cada uno un fragmento de DNA o cDNA clonado único.

Ejemplo 17 Análisis de los clones de cDNA

Los DNA's de fago procedentes de clones positivos se digirieron con Eco R1 y se examinaron por análisis Southern utilizando un cDNA procedente de un clon como sonda. Las inserciones de cDNA de tamaño máximo que se hibridaban en cruz se sometieron a subclonación en el sitio Eco R1 del vector de plásmido pGEM 4Z (Promega). Los subclones HL-60 que contenían el cDNA en ambas orientaciones se delecionaron por digestión con exonucleasa III (Henikoff, S., Gene 28:351-359 (1984)) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes (Erase-a-Base, Promega). Los cDNA's delecionados progresivamente se clonaron luego y se sometieron a secuenciación por terminación de cadena de didesoxinucleótidos (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467 (1977)) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes (Sequenase, U.S. Biochemical). Las regiones 5' y codificantes de cDNA HL-60 se secuenciaron completamente en ambas cadenas y la región 3' se secuenció aproximadamente en un 70% en ambas cadenas. Se secuenció un cDNA endotelial representativo en la mayor parte de su longitud mediante clonación por perdigonada de fragmentos de enzimas de restricción que reconocían cuatro pares de bases.

Se estableció la secuencia de cDNA de una cDNA HL-60 y un cDNA de células endoteliales (Figura 8). La secuencia de 3023 pares de bases contiene una región corta 5' no traducida y una región 3' de 1,3 kilobases no traducida con una señal de poliadenilación de consenso en la posición 2966. El marco de lectura abierto más largo comienza con el primer ATG en la posición 58 y termina con un triplete de finalización TGA en la posición 1653. La identidad entre la secuencia de aminoácidos traducida y las secuencias determinadas a partir de 8 péptidos trípticos diferentes que totalizan 91 aminoácidos (subrayadas en la Figura 8) confirmó que se habían aislado clones de cDNA de ICAM-1 auténticos. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos trípticos de ICAM-1 se muestran en la Tabla 8.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8 Secuencias de aminoácidos de los péptidos trípticos de ICAM-1

Péptido	Residuos	Secuencia
J	14-29	X G S V L V T C S T S C D O P K
U	30-39	L L G I E T P L (P) (K)
50	78-85	(T) F L T V Y X T
X	89-95	V E L A P L P
AA	161-182	X E L D L R P O G L E - -
		L F E X T S A P X Q L
K	232-246	L N P T V T Y G X D S F S A K
45	282-295	S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L)
- -Indica que la secuencia continúa en la línea inmediatamente siguiente. Las secuencias subrayadas se
utilizaron para preparar sondas de oligonucleótidos.

El análisis de hidrofobicidad (Kyte, J., et al., J. Molec. Biol., 157:105-132 (1982)) sugiere la presencia de una secuencia de señal de 27 residuos. La asignación de la glutamina +1 es consiste nte con la imposibilidad que encontraron los autores de la invención de obtener la secuencia N-terminal en tres preparaciones de proteína ICAM-1 diferentes; la glutamina puede ciclarse a ácido piroglutámico, dando como resultado un término N bloqueado. La secuencia traducida desde 1 a 453 es predominantemente hidrófila, seguida por un dominio transmembranal supuesto hidrófobo de 24 residuos. El dominio transmembranal va seguido inmediatamente por varios residuos cargados contenidos dentro de un dominio citoplásmico supuesto de 27 residuos.

El tamaño predicho de la cadena del polipéptido maduro es 55.219 daltons, en concordancia excelente con el tamaño observado de 55.000 para ICAM-1 desglicosilada (Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Se predicen 8 sitios de glicosilación enlazados a N. La ausencia de asparagina en las secuencias de péptidos trípticos de dos de estos sitios confirma su glicosilación y su orientación extracelular. Suponiendo 2.500 daltons por cada carbohidrato enlazado a N rico en manosa, se predice un tamaño de 75.000 daltons para el precursor de ICAM-1, comparado con los seis observados de 73.000 daltons (Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Después de la conversión del carbohidrato rico en manosa en carbohidrato complejo, la glicoproteína ICAM-1 madura tiene un tamaño de 76 a 114 kd, dependiendo del tipo de célula (Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Así pues, ICAM-1 es una proteína fuertemente glicosilada pero por lo demás una proteína de membrana integral típica.

Ejemplo 18 ICAM-1 es un miembro de fijación de integrinas de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas

La alineación de las repeticiones internas de ICAM-1 se realizó utilizando el programa de alineación de proteínas Microgenie (Queen, C., et al., Nucl. Acid. Res., 12:581-589 (1984)) seguido por inspección. La alineación de ICAM-1 a IgM, N-CAM y MAG se llevó a cabo utilizando Microgenie y el programa ALIGN (Dayhoff, M.O., et al., Meth. Enzymol. 91:524-545 (1983)). Se investigaron cuatro bases de datos de secuencias de proteínas, mantenidas por la National Biomedical Research Foundation, en cuanto a semejanzas de secuencia proteínica utilizando el programa FASTP de Williams y Pearson (Lipman, D.J., et al., Science 227:1435-1439 (1985)).

Dado que ICAM-1 es un ligando de una integrina, resultó inesperado que el mismo fuera un miembro de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas. Sin embargo, la inspección de la secuencia de ICAM-1 demuestra que la misma cumple todos los criterios propuestos para la pertenencia a la familia de supergenes de las inmunoglobulinas. Estos criterios se exponen ordenadamente más adelante.

El dominio extracelular entero de ICAM-1 está constituido por cinco dominios homólogos semejantes a inmunoglobulinas que se muestran alineados en la Figura 9A. Los dominios 1-4 tienen una longitud de 88, 97, 99 y 99 residuos, respectivamente, y por consiguiente son del tamaño típico de los dominios Ig; el dominio 5 está truncado dentro de 68 restos. Las investigaciones de la base de datos NBRF utilizando el programa FASTP revelaron homologías significativas con miembros de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas que incluían dominios C de IgM a IgG, el dominio variable de la subunidad \alpha del receptor de las células T, y \alpha-1-glicoproteína (Fig. 9B-D).

Utilizando la información anterior, se comparó la secuencia de aminoácidos de ICAM-1 con las secuencias de aminoácidos de otros miembros de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas.

Se han diferenciado tres tipos de dominios de la superfamilia Ig, V, Cl, y C2. Los dominios V y C están construidos ambos a partir de 2 hojas \beta enlazadas entre sí por el enlace disulfuro intradominio; los dominios V contienen 9 cadenas \beta anti-paralelas, mientras que los dominios C tienen 7. Los dominios constantes se dividieron en los conjuntos Cl y C2 sobre la base de los residuos característicos que se muestran en la Figura 9A. El conjunto C1 incluye proteínas implicadas en el reconocimiento de antígenos. El conjunto C2 incluye varios receptores Fc y proteínas implicadas en la adhesión de llamada con inclusión de CD2, LFA-3, MAG y NCAM. Se encontró que los dominios ICAM-1 eran muy estrechamente homólogos con los dominios del conjunto C2, colocando a ICAM-1 en este conjunto; esto se refleja en la semejanza más fuerte con los residuos conservados en los dominios C2 que en los C1 como se muestra para las cadenas \beta B-F en la Figura 9. Asimismo, los dominios ICAM-1 se alineaban mucho mejor con las cadenas \beta A y G de los dominios C2 que con estas cadenas en los dominios V y C1, permitiendo alineaciones satisfactorias a lo largo de la resistencia del dominio C2 entero. Las alineaciones con los dominios C2 de NCAM, MAG, y \alpha-1-\beta-glicoproteína se muestran en las Figuras 9B y 9C; la identidad abarcaba desde 28 a 33%. Se muestran también las alineaciones con una identidad de 27% del receptor V\alpha de las células T y una identidad de 34% del dominio 3 de IgM C (Figuras 9B, 9D).

Una de las características más importantes de los dominios de inmunoglobulina son las cisteínas enlazadas por disulfuro que puentean las cadenas \beta B y F que estabilizan el sándwich de hoja \beta: en ICAM-1, las cisteínas están conservadas en todos los casos excepto en la cadena f del dominio 4, en la que se encuentra una leucina que puede estar enfrentada en el sándwich y estabilizar el contacto como ha sido propuesto para otros dominios de los conjuntos V y C2. La distancia entre las cisteínas (43, 50, 52, y 37 residuos) es como se ha descrito para el conjunto C2.

Para ensayar en cuanto a la presencia de enlaces disulfuro intracatenarios en ICAM-1, se sometió ICAM-1 de células endoteliales a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Se utilizó ICAM-1 de células endoteliales porque la misma muestra menos heterogeneidad de glicosilación que JY o que ICAM-1 esplénica de células pilosas y permite una mayor sensibilidad a los desplazamientos en M_{r}. Por esta razón se purificó ICAM-1 a partir de cultivos de células endoteliales de la vena umbilical estimuladas por LPS (5 \mug/ml) durante 16 horas por cromatografía de inmunoafinidad como se ha descrito arriba. La ICAM-1 precipitada con acetona se resuspendió en tampón de muestra (Laemmli, U.K., Nature 227:680-685 (1970)) con 0,25% de 2-mercaptoetanol o yodoacetamida 25 mM y se llevó a 100ºC durante 5 min. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE 4670 y tinción con plata 4613. La ICAM-1 de las células endoteliales tenía un M_{r} aparente de 100 Kd en condiciones reductoras y 96 Kd en condiciones no reductoras, lo cual sugería fuertemente la presencia de disulfuros intracatenarios en la ICAM-1 nativa.

El uso de la secuencia primaria para predecir la estructura secundaria (Chou, P.Y., et. al., Biochem. 13:211-245 (1974)) mostró las 7 cadenas \beta esperadas en cada dominio de ICAM-1, marcadas a-g en la Figura 9A superior, que cumplían exactamente la predicción de un dominio de inmunoglobulina y correspondían a las posiciones de las cadenas A-H en las inmunoglobulinas (Figura 9A, inferior). El dominio 5 carece de las cadenas A y C, pero dado que éstas forman bordes de las hojas, las hojas podían formarse todavía, ocupando quizás la cadena D el lugar de la cadena C como ha sido propuesto para otros dominios C2; y en enlace disulfuro característico entre las cadenas B y F no se vería afectado. Así pues, los criterios para tamaño de dominio, homología de secuencia, cisteínas conservadas que forman el enlace disulfuro intradominio supuesto, presencia de enlaces disulfuro, y estructura predicha de la hoja \beta se cumplen todos ellos para la inclusión de ICAM-1 en la familia de supergenes de las inmunoglobulinas.

Se encontró que ICAM-1 era muy fuertemente homólogo con las glicoproteínas NCAM y MAG del conjunto C2. Esto es particularmente interesante, dado que tanto NCAM como MAG median la adhesión célula-célula. NCAM es importante en las interacciones neurona- neurona y neuro-musculares (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)), mientras que MAG es importante en las interacciones neuro-oligodendrocito y oligodendrocito-oligodendrocito durante la mielinación (Poltorak M., et al., J. Cell. Biol. 105:1893-1899 (1987)). La expresión de la superficie celular de NCAM y MAG está regulada en su desarrollo durante la formación y la mielinación del sistema nervioso, respectivamente, en analogía con la inducción regulada de ICAM-1 en la inflamación (Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)). ICAM-1, NCAM (Cunningham B-A., et al., Science 236:799-806 (1987)), y MAG (Salzer, J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957-965 (1987)) son similares en estructura global así como homólogos, dado que cada una de ellas es una glicoproteína integral de membrana construida a partir de 5 dominios C2 que forman la región extracelular N-terminal, aunque en NCAM está presente alguna secuencia adicional no semejante a Ig entre el último dominio C2 y el dominio transmembranal. ICAM-1 se alinea en toda su longitud con inclusión de los dominios transmembranal y citoplásmico con MAG, con 21% de identidad; se encuentra el mismo % de identidad comparando los 5 dominios de ICAM-1 y NCAM-1. Una comparación diagramática de las estructuras secundarias de ICAM-1 y MAG se muestra en la Figura 10. Las comparaciones dominio por dominio demuestran que el nivel de homología entre los dominios dentro de las moléculas ICAM-1 y NCAM (x \pm desviación estándar [s.d., del inglés "standard deviation"] 21 \pm 2,8% y 18,6 \pm 3,8%, respectivamente) es el mismo que el nivel de homología comparando los dominios de
ICAM-1 con los dominios de NCAM y MAG (20,4 \pm 3,7 y 21,9 \pm 2,7 respectivamente). Aunque existe evidencia de corte y empalme alternativos en las regiones C-terminales de NCAM (Cunningham B.A., et al., Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al., EMBO J. 6:907-914 (1987)) y MAG (Lai, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:4377-4341 (1987)), no se ha encontrado evidencia alguna de esto en la secuenciación de clones de ICAM-1 endotelial o
HL-70 o en estudios sobre la cadena principal de la proteína ICAM-1 y el precursor en una diversidad de tipos de células (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)).

ICAM-1 funciona como un ligando para LFA-1 en interacciones de linfocitos con cierto número de tipos de células diferentes. Los linfocitos se fijan a ICAM-1 incorporada en bicapas de membrana artificiales, y esto requiere LFA-1 en el linfocito, lo que demuestra directamente la interacción de LFA-1 con ICAM-1 (Marlin, S.D., et. al., Cell 51:813-819 (1987)). LFA-1 es una integrina leucocitaria y no tiene característica alguna semejante a las inmunoglobulinas. Las integrinas leucocitarias comprenden una subfamilia de integrinas. Las otras dos subfamilias median las interacciones célula-matriz y reconocen la secuencia RGD dentro de sus ligandos que incluyen fibronectina, vitronectina, colágeno, y fibrinógeno (Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987); Ruoslahti, E., et al., Science 238:491-497 (1987)). Las integrinas leucocitarias se expresan solamente en los leucocitos, están implicadas en interacciones célula-célula, y los únicos ligandos conocidos son ICAM-1 e iC3b, un fragmento del componente del complemento C3 que no presenta característica alguna semejante a las inmunoglobulinas y es reconocido por Mac-1 (Kishimoto, T.K., et al., en: Leukocyte Typing III, McMichael, M. (compilador), Springer-Verlag, Nueva York (1987); Springer, T.A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987); Anderson, D.C. et al., Ann. Rev. Med. 38:175-194 (1987)). Sobre la base del análisis de secuencia, los péptidos posibles dentro de la secuencia de ICAM-1 reconocida por LFA-1 se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9 Péptidos comprendidos dentro de la secuencia de ICAM-1 posiblemente reconocida por LFA-1

-L-R-G-E-K-E-L-

-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-

-L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E-

-P-R-G-G-S-

-P-G-N-N-R-K-

-Q-E-D-S-Q-P-M-

-T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S-

-R-R-D-H-H-G-A-N-F-S-

-D-L-R-P-Q-G-L-E-

ICAM-1 es el primer ejemplo de un miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulina que se fija a una integrina. Aunque estas dos familias juegan un papel importante en la adhesión celular, la interacción entre ellas no se había esperado con anterioridad. En contraste, las interacciones dentro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina son bastante comunes. Es bastante posible que se encuentren ejemplos adicionales de interacciones entre las familias de integrinas e imunoglobulinas. LFA-1 reconoce un ligando distinto de ICAM-1 (Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)), y la integrina leucocitaria Mac-1 reconoce un ligando distinto de C3bi en la adhesión neutrófilo-neutrófilo (Anderson, D.C., et al, Ann. Rev. Med. 38:175-194 (1987)). Adicionalmente, las vesículas que contienen MAG purificada se fijan a neuritas que son MAG, y por consiguiente MAG tiene que ser capaz de interacción heterófila con un receptor distinto (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987)).

Se ha sugerido que el papel de NCAM en las interacciones celulares neural-neural y neural-muscular es debido a interacciones homófilas NCAM-NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)). El importante papel de MAG en las interacciones entre las vueltas adyacentes de las células de Schwann que envuelven los axones durante la formación de la vaina de mielina podría ser debido a interacción con un receptor distinto, o debido a interacciones homófilas MAG-MAG. La homología con NCAM y la aparición frecuente de interacciones dominio-dominio dentro de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas aumenta la posibilidad de que ICAM-1 pudiera intervenir en interacciones homófilas así como en interacciones heterófilas ICAM-1-LFA-1. Sin embargo, la fijación de las células de linfoblastos B que co-expresan densidades similares de LAF-1 e ICAM-1 a ICAM-1 en monocapas artificiales o celulares puede ser inhibida completamente por pretratamiento del linfoblasto B con MAb de LFA-1, mientras que la adherencia no se ve afectada por el pretratamiento de los linfoblastos B con MAb de ICAM-1. El pretratamiento de la monocapa con MAb de ICAM-1 anula por completo la fijación (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986); Marlin, S.D., et al., Cell 51:813-819 (1987)). Estos descubrimientos demuestran que si ocurren en algún caso interacciones homófilas de ICAM-1, las mismas tienen que ser mucho más débiles que la interacción heterófila con LFA-1.

La posibilidad de que las integrinas leucocitarias reconozcan ligandos de una manera fundamentalmente diferente es coherente con la presencia de una secuencia de 180 residuos en sus subunidades \alpha que puede ser importante en la fijación de ligandos y que no está presente en las integrinas que reconocen RGD (Corbi, A., et al., EMBO J. 6:4023-4028 (1987)). Aunque se ha propuesto que Mac-1 reconoce la secuencia de RGD presente en iC3b 5086, no existe secuencia RGD alguna en ICAM-1 (Fig. 8). Esto está de acuerdo con el hecho de que el péptido de fibronectina GRGDSP y el péptido de control GRGESP no inhiben la adhesión ICAM-1-LFA-1 (Marlin, S.D., et al., Cell 51:813-819 (1987)). Sin embargo, secuencias afines tales como PRGGS y RGEKE están presentes en ICAM-1 en regiones que se predice forman bucles entre las cadenas \beta a y b del dominio 2 y c y d del dominio 2, respectivamente (Fig. 9), y por consiguiente pueden estar accesibles para reconocimiento. Es interesante que la molécula MAG homóloga contiene una secuencia RGD entre los dominios 1 y 2 (Poltorak, M., et al., J. Cell. Biol. 105:1893-1899 (1987); Salzer, J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957-965 (1987)).

\newpage

Ejemplo 19 Transferencias Southern y Northern

Se realizaron transferencias Southern utilizando una muestra de 5 \mug de DNA genómico extraída de 3 líneas de células: BL2, una línea de células de linfoma de Burkitt (obsequio del Dr. Gilbert Lenoir); JY y Er-LCL, líneas de células B-linfoblastoides transformadas por EBV.

Los DNAs se digirieron con 5 veces la cantidad recomendada por los fabricantes de endonucleasas Bam H1 y Eco R1 (New England Biolabs). A continuación de la electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,8%, los DNAs se transfirieron a una membrana de nailon (Zeta Probe, BioRad). El filtro se prehibridó y se hibridó siguiendo procedimientos estándar con empleo de cDNA de ICAM de HL-60 marcado con \alpha-(^{32}P)d XTP's por cebado aleatorio (Boehringer Mannheim). Las transferencias Northern se realización utilizando 20 \mug de RNA total ó 6 \mug de RNA poli(A)^{+}. El RNA se desnaturalizó y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%-formaldehído y se electrotransfirió a Sonda Zeta. Los filtros se prehibridaron y se hibridaron como se ha descrito anteriormente (Staunton, D.E., et al., Embo J. 6:3695-3701 (1987)) utilizando la sonda de cDNA HL-60 de sondas de oligonucleótidos marcados con ^{32}P (descritas anteriormente).

Las transferencias Southern que utilizaron la sonda de cDNA de 3 kilobases y DNA genómico digerido con Bam H1 y Eco R1 mostraban fragmentos individuales predominantes de hibridación de 20 y 8 kilobases, respectivamente, lo que sugería un gen único y sugería que la mayor parte de la información codificante está presente dentro de 8 kilobases. En las transferencias de 3 líneas de células diferentes no hay evidencia alguna de polimorfismo de los fragmentos de restricción.

Ejemplo 20 Expresión del gen de ICAM-1

Un "vector de expresión" es un vector que (debido a la presencia de secuencias de control apropiadas de la transcripción y/o traducción) es capaz de expresar una molécula de DNA (o cDNA) que se ha clonado al vector y de producir por consiguiente un polipéptido o una proteína. La expresión de las secuencias clonadas ocurre cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped apropiada. Si se emplea un vector de expresión procariota, entonces la célula huésped apropiada sería cualquier célula procariota capaz de expresar las secuencias clonadas. Análogamente, si se emplea un vector de expresión eucariota, entonces la célula huésped apropiada sería cualquier célula eucariota capaz de expresar las secuencias clonadas. De modo importante, dado que el DNA eucariota puede contener secuencias intercaladas, y puesto que dichas secuencias no pueden procesarse correctamente en células procariotas, es preferible emplear cDNA procedente de una célula que sea capaz de expresar ICAM-1 con objeto de producir una genoteca de vectores de expresión genómicos procariotas. Procedimientos para preparar cDNA y para producir una genoteca genómica han sido descritos por Maniatis, T., et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

La genoteca genómica de vectores de expresión arriba descrita se utiliza para crear un banco de células huésped (cada una de las cuales contiene un miembro de la genoteca). El vector de expresión puede introducirse en la célula huésped por cualquiera de una diversidad de medios (es decir, transformación, transfección, fusión de protoplastos, electroporación, etc.). El banco de células que contienen vectores de expresión se propaga por clonación, y sus miembros se ensayan individualmente (utilizando un inmunoensayo) para determinar si los mismos producen una proteína capaz de fijarse al anticuerpo anti-ICAM-1.

Los vectores de expresión de aquellas células que producen una proteína capaz de fijarse al anticuerpo anti-
ICAM-1 se analizan ulteriormente para determinar si los mismos expresan (y por consiguiente contienen) el gen entero de ICAM-1, si aquéllos expresan (y contienen) solamente un fragmento del gen de ICAM-1, o si expresan (y contienen) un gen cuyo producto, aunque inmunológicamente afín a ICAM-1, no es ICAM-1. Aunque dicho análisis puede realizarse por cualquier medio conveniente, es preferible determinar la secuencia de nucleótidos del fragmento de DNA ó cDNA que se había clonado al vector de expresión. Tales secuencias de nucleótidos se examinan luego para determinar si las mismas son capaces de codificar polipéptidos que tengan la misma secuencia de aminoácidos que los fragmentos de digestión típicos de ICAM-1 (Tabla 5).

Un vector de expresión que contiene una molécula de DNA ó cDNA que codifica el gen de ICAM-1 puede, por consiguiente, ser reconocido por: (i) la capacidad para dirigir la expresión de una proteína que es capaz de fijarse al anticuerpo anti-ICAM-1; y (ii) la presencia de una secuencia de nucleótidos que es capaz de codificar cada uno de los fragmentos trípticos de ICAM-1. La molécula de DNA clonada de un vector de expresión de este tipo puede separarse del vector de expresión y aislarse en forma pura.

\newpage

Ejemplo 21 Actividades funcionales de ICAM-1 purificada

En las células, ICAM-1 funciona normalmente como una proteína de superficie asociada con la membrana celular. Por esta razón, la función de ICAM-1 purificada se ensayó después que la molécula se reconstituyó en membranas de lípido artificiales (liposomas, o vesículas), por disolución de la proteína en lípidos solubilizados con detergentes, seguido por la separación del detergente por diálisis. La ICAM-1 purificada a partir de células JY y eluida en el octilglucosido detergente como se ha descrito arriba se reconstituyó en vesículas, y las vesículas que contenían
ICAM-1 se fusionaron a cubreobjetos de vidrio o pocillos de cultivo de plástico para permitir la detección de las células que se fijaban a la proteína.

Preparación de membranas planas y vesículas unidas a material plástico

Se prepararon vesículas por el método de Gay et al., (J. Immunol. 136:2026 (1986)). Resumidamente, se disolvieron fosfatidilcolina de huevo y colesterol en cloroformo y se mezclaron en una relación molar de 7:2. La mezcla de lípidos se secó para dar una película delgada mientras se hacía girar en una corriente de nitrógeno gaseoso, y se liofilizó luego durante 1 hora para separar totalmente las trazas de cloroformo. La película de lípido se disolvió luego en octilglucosido al 1%/NaCl 0,14 M/Tris 20 mM (pH 7,2) a una concentración final de fosfatidilcolina de 0,1 mM. Se añadieron aproximadamente 10 \mug de ICAM-1 purificada, o glicoforina humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como una glicoproteína de membrana de control, a cada ml de lípidos disueltos. La solución proteína-lípido-detergente se dializó luego a 4ºC contra 3 cambios de 200 volúmenes de Tris 20 mM/NaCl 0,14 M, pH 7,2, y un cambio de HBSS.

Se prepararon membranas planas por el método de Brian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6159 (1984). Se hirvieron cubreobjetos de vidrio (de 11 mm de diámetro) durante 15 minutos en una dilución 1:6 de detergente 7X (Linbro), se lavaron durante una noche en agua destilada, se impregnaron en etanol al 70%, y se secaron al aire. Se puso una gota de 80 \mul de suspensión de vesículas que contenía ICAM-1 o glicoforina en el fondo de los pocillos en una placa de 24 pocillos agrupados, y los cubreobjetos de vidrio preparados se dejaron flotar suavemente encima. Después de 20-30 minutos de incubación a la temperatura ambiente, los pocillos se llenaron con HBSS, y los cubreobjetos se invirtieron para dejar la membrana plana orientada hacia arriba. Los pocillos se lavaron luego abundantemente con HBSS para eliminar las vesículas no fijadas. La superficie de la membrana plana no se expuso nunca al aire.

En el curso de experimentos con la membrana plana fusionada a superficies de vidrio, se encontró que las vesículas que contenían ICAM-1 se fijaban directamente a la superficie del material plástico de las placas de cultivo de tejidos de pocillos múltiples, y retenían su actividad funcional como se ponía de manifiesto por la fijación específica de las células. Dichas vesículas se denominan en lo sucesivo "vesículas fijadas a material plástico" (PBV) dado que la naturaleza de las vesículas lipídicas fijadas al material plástico no se ha determinado. Las vesículas fijadas a material plástico se prepararon por adición de 30 \mul de suspensión de vesículas directamente al fondo de los pocillos en bandejas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Falcon), seguido por incubación y lavado como se ha descrito para las membranas planas.

Ensayos de adhesión celular

Los ensayos de adhesión celular utilizando membranas planas o vesículas fijadas a material plástico se realizaron ambos esencialmente de la misma manera, excepto que los números de células y volúmenes para los ensayos PBV se redujeron a la quinta parte de los utilizados en los ensayos de membranas planas.

Linfocitos T procedentes de controles normales y de un paciente con Deficiencia de Adhesión Leucocitaria (LAD) cuyas células no consiguen expresar LFA-1 (Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668 (1985)) se prepararon por cultivo de células mononucleares de sangre periférica con 1 \mug/ml de Concanavalina-A (Con-A) en RPMI-1640 más 20% de FCS a 5 x 10^{5} células/ml durante 3 días. Las células se lavaron luego dos veces con RPMI y una sola vez con metil-\alpha-D-manopiranosido 5 mM para separar la lectina residual de la superficie celular. Las células se cultivaron en RPMI/20% de FCS que contenía 1 ng/ml de IL-2 recombinante, y se utilizaron entre 10 y 22 días después de la iniciación del cultivo.

Para detectar la fijación celular a las membranas planas o PBV, blastos de Con-A, el linfoma T SKW-3, y las líneas de células B-linfoblastoides JY transformadas por EBV (positivas a LFA-1) y la línea de células linfoblastoides deficientes en LFA-1 (BBN) (derivada del paciente 1, Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1986) se radiomarcaron por incubación de 1 x 10^{7} células en 1 ml de RPMI-1640/10% de FCS con 100 \muCi de Na^{51}CrO_{4} durante 1 hora a 37ºC, seguido por 4 lavados con RPMI-1640 para separar el marcador no incorporado. En los experimentos de bloqueo de anticuerpos monoclonales, se pretrataron células o vesículas fijadas a material plástico con 20 \mug/ml de anticuerpo purificado en RPMI1640/10% de FCS a 4ºC durante 30 minutos, seguido por cuatro lavados para separar el anticuerpo no fijado. En experimentos acerca de los efectos de los cationes bivalentes sobre la fijación celular, las células se lavaron una sola vez con HBSS exento de Ca^{2+} y Mg^{2+} más 10% de FCS dializado, y se añadieron CaCl_{2} y MgCl_{2} a las concentraciones indicadas. En todos los experimentos, las células y las membranas planas o PBV se equilibraron previamente a la temperatura apropiada (4ºC, 22ºC, ó 37ºC) en el tampón de ensayo apropiado.

Para medir la fijación celular a ICAM-1 purificada, células marcadas con ^{51}Cr (5 x 10^{5} transformantes EBV en los ensayos de membrana plana; 1 x 10^{5} transformantes EBV o células SKW-3, 2 x 10^{5} blastos de Con-A en los ensayos PBV) se centrifugaron durante 2 minutos a 25 x g sobre membranas planas o PBV, seguido por incubación a 4ºC, 22ºC ó 37ºC durante 1 hora., Después de la incubación, las células no fijadas se separaron por 8 ciclos de llenado y aspiración con tampón pre-equilibrado a la temperatura apropiada. Las células fijadas se cuantificaron por solubilización de los contenidos de los pocillos con NaOH 0,1 N/1% de Triton X-100 y recuento en un contador gamma. El porcentaje de fijación celular se determinó por división de los cpm procedentes de las células fijadas por los cpm asociados a las células de entrada. En los ensayos de membranas planas, los cpm de la entrada se corrigieron por la relación de la superficie de los cubreobjetos comparada con la superficie de los pocillos de cultivo.

En estos ensayos, las células linfoblastoides B transformadas por EBV, células de linfoma T SKW-3, y linfoblastos T de Con-A se fijaban específicamente a ICAM-1 en membranas artificiales (Figuras 11 y 12). La fijación era específica, dado que las células se fijaban muy pobremente a las membranas planas de control o vesículas que contenían cantidades equivalentes de otra glicoproteína humana de la superficie celular, glicoforina. Adicionalmente, los transformantes EBV positivos a LFA-1 y los blastos de Con-A se fijaban, mientras que sus contrapartidas negativas a LFA-1 no conseguían fijarse en una proporción significativa, lo que demostraba que la fijación era dependiente de la presencia de LFA-1 en las células.

Tanto la especificidad de la fijación celular como la dependencia de LFA-1 celular se confirmaron en experimentos de bloqueo con anticuerpos monoclonales (Figura 13). La fijación de células JY podía inhibirse en un 97% cuando las PBV que contenían ICAM-1 se pretrataron con el anticuerpo monoclonal RR1/1 anti-ICAM-1. El pretratamiento de las células con el mismo anticuerpo tenía poco efecto. Inversamente, el anticuerpo monoclonal TS1/18 anti-LFA-1 inhibía la fijación en 96%, pero sólo cuando se pretrataron las células, y no las PBV. Un anticuerpo TS2/9 de control reactivo con LFA-3 (un antígeno diferente de superficie de los linfocitos) no tenía efecto inhibidor significativo alguno cuando se pretrataron células o PBV. Este experimento demuestra que la ICAM-1 propiamente dicha en las membranas artificiales, y no algún contaminante de menor importancia, media la adhesión celular observada y que la adhesión es dependiente de LFA-1 en la célula de fijación.

La fijación de las células a ICAM-1 en membranas artificiales exhibía también otras dos características del sistema de adhesión dependiente de LFA-1: la dependencia de la temperatura y un requerimiento de cationes bivalentes. Como se muestra en la Figura 14, los blastos de Con-A se fijaban a ICAM-1 en PBV más eficazmente a 37ºC, parcialmente a 22ºC, y muy pobremente a 4ºC. Como se muestra en la Figura 15, la fijación era totalmente dependiente de la presencia de cationes bivalentes. A las concentraciones fisiológicas, Mg^{2+} era suficiente por sí solo para la fijación celular máxima, mientras que Ca^{2+} producía por sí solo niveles de fijación muy bajos. Sin embargo, Mg^{2+} a una décima parte de la concentración normal combinado con Ca^{2+} producía un efecto sinérgico y daba lugar a la fijación máxima.

En suma, la especificidad de la fijación celular a ICAM-1 purificada incorporada en membranas artificiales, la inhibición específica con anticuerpos monoclonales, y los requerimientos de temperatura y cationes bivalentes demuestran que ICAM-1 es un ligando específico para el sistema de adhesión dependiente de LFA-1.

Ejemplo 22 Expresión de ICAM-1 y HLA-DR en reacciones de ensayo de parches alérgicos y tóxicos

Se estudiaron biopsias de piel de cinco individuos normales en cuanto a su expresión de ICAM-1 y HLA-DR. Se encontró que, mientras que las células endoteliales en algunos vasos sanguíneos expresaban usualmente ICAM-1, no se expresaba cantidad alguna de ICAM-1 en los queratinocitos de la piel normal. No se observó tinción alguna de
HLA-DR en ningún queratinocito procedente de biopsias de piel normal. Las cinéticas de expresión de ICAM-1 y de los antígenos de clase II se estudieron luego en células procedentes de biopsias de lesiones de la piel alérgicas y tóxicas. Se encontró que la mitad de los 6 individuos estudiados tenían queratinocitos que expresaban ICAM-1, 4 horas después de la aplicación del hapteno (Tabla 10). Había un aumento en el porcentaje de individuos que expresaban ICAM-1 en sus queratinocitos con el tiempo de exposición al hapteno, así como un aumento en la intensidad de tinción, que indicaba más expresión de ICAM-1 por queratinocito hasta las 48 horas. De hecho, en este momento, cierta proporción de queratinocitos en todas las biopsias se teñían positivamente para ICAM-1. A las 72 horas (24 horas después de la retirada del hapteno), 7 de los 8 individuos tenían todavía ICAM-1 expresada en sus queratinocitos, mientras que la expresión de ICAM-1 en un solo individuo decaía entre las 48 y las 72 horas.

\newpage

TABLA 10 Cinética de la inducción de ICAM-1 y HLA-DR en queratinocitos procedentes de biopsias de ensayos de parches alérgicos

Tiempo después de la	N^{o} de	ICAM-1	HLA-DR	ICAM-1
aplicación del parche (h)	biopsias	solamente	solamente	\textamp HLA-DR
Piel normal	5	0	0	0
Ensayo de parches alérgicos
4	6	3^{a}	0	0
8	9	3	0	0
24	8	7	0	0
48^{b}	8	5	0	3
72	8	6	0	1
^{a} Las muestras se consideraron positivas si se teñían al menos pequeñas agrupaciones
de queratinocitos.
^{b} Todos los parches se retiraron en este momento. (Rt)

Histológicamente, el patrón de tinción para ICAM-1 en los queratinocitos procedentes de biopsias tomadas 4 horas después de la aplicación del hapteno se encontraba usualmente en pequeñas agrupaciones. Al cabo de 48 horas, se expresaba ICAM-1 en la superficie de la mayoría de los queratinocitos, no observándose diferencia alguna entre el centro y la periferia de la lesión. La intensidad de la tinción decrecía a medida que los queratinocitos se aproximaban a la capa córnea. Esto se encontró en biopsias tomadas tanto del centro como de la periferia de las lesiones. Asimismo, en este momento, el ensayo del parche era positivo (infiltración, eritema y vesículas). No se observó diferencia alguna en la expresión de ICAM-1 cuando se aplicaron haptenos diferentes a individuos sensibles. Además de los queratinocitos, ICAM-1 se expresaba también en algunas células mononucleares y células endoteliales en el sitio de la lesión.

La expresión de HLA-DR en los queratinocitos en las lesiones alérgicas de piel era menos frecuente que la de ICAM-1. Ninguno de los individuos estudiados tenía lesiones con queratinocitos que se tiñeran positivamente para HLA-DR hasta 24 horas después de la aplicación del hapteno. De hecho, solamente 4 muestras de biopsias tenían queratinocitos que expresaban HLA-DR, y ninguna biopsia tenía queratinocitos que fuesen positivos para HLA-DR y no para ICAM-1 (Tabla 10).

En contraste con la lesión del ensayo del parche alérgico, la lesión del ensayo del parche tóxico inducida con aceite de croton o lauril-sulfato de sodio tenía queratinocitos que exhibían poca o ninguna ICAM-1 en sus superficies en todos los momentos ensayados (Tabla 11). De hecho, al cabo de 48 horas después de la aplicación del parche, que era el momento óptimo para la expresión de ICAM-1 en los individuos del ensayo del parche alérgico, solamente uno de los 14 individuos del ensayo del parche tóxico tenía queratinocitos que expresaban ICAM-1 en sus lesiones. Asimismo, en contraste con las biopsias del ensayo del parche alérgico, no se expresaba cantidad alguna de HLA-DR en los queratinocitos de las lesiones del ensayo del parche tóxico.

Estos datos indican que ICAM-1 se expresa en la inflamación basada en la inmunidad y no en la inflamación basada en la presencia de sustancias tóxicas, y por consiguiente la expresión de ICAM-1 se puede utilizar para distinguir entre la inflamación de base inmunológica y la de base tóxica, tal como la insuficiencia renal aguda en los pacientes de trasplante de riñón en la que es difícil determinar si el fallo es debido al rechazo o a la nefrotoxicidad del agente terapéutico inmuno-supresor. La biopsia renal y la evaluación de la regulación creciente de la expresión de ICAM-1 permitirá la diferenciación de la reacción de rechazo de base inmunológica y la reacción de toxicidad no basada en causas inmunológicas.

TABLA 11 Cinética de la inducción de ICAM-1 y HLA-DR en queratinocitos procedentes de biopsias de ensayo de parches tóxicos

Tiempo después de la	N^{o} de	ICAM-1	HLA-DR	ICAM-1
aplicación del parche (h)	biopsias	solamente	solamente	\textamp HLA-DR
4	4	0	0	0
8	3	1^{a}	0	0
24	3	1	0	0
48^{b}	14	1	0	0
72	3	1	0	0
^{a} Las muestras se consideraron positivas si se teñían al menos pequeñas
agrupaciones de queratinocitos.
^{b} Todos los parches se retiraron en este momento.

Ejemplo 23 Expresión de ICAM-1 y HLA-DR en enfermedades cutáneas benignas

Se estudiaron células procedentes de biopsias de piel de lesiones de pacientes con diversos tipos de enfermedades inflamatorias de la piel en cuanto a su expresión de ICAM-1 y HLA-DR. Una proporción de queratinocitos presentes en las biopsias de eczema de contacto alérgico, penfigoide/pénfigo y liquen plano expresaban ICAM-1. Las biopsias de liquen plano exhibían la tinción más intensa con un patrón similar a o incluso más fuerte que el observado en las biopsias del ensayo del parche alérgico al cabo de 48 horas (Tabla 12). En concordancia con los resultados observados en el ensayo del parche alérgico, la tinción más intensa de ICAM-1 se observó en sitios de infiltración intensa de células mononucleares. Adicionalmente, 8 de las 11 biopsias de liquen plano ensayadas eran positivas para la expresión de HLA-DR en queratinocitos.

La expresión de ICAM-1 en queratinocitos procedentes de biopsias de la piel de pacientes con exantema y urticaria era menos pronunciada. Solamente 4 de los 7 pacientes ensayados con estas enfermedades tenían queratinocitos que expresaban ICAM-1 en el sitio de la lesión. La expresión de HLA-DR se encontró únicamente en un paciente y esto estaba en asociación con ICAM-1.

Las células endoteliales y una proporción del infiltrado de células mononucleares procedente de la totalidad de las enfermedades de la piel inflamatorias benignas ensayadas expresaban ICAM-1 en una magnitud variable.

TABLA 12 Expresión de ICAM-1 y HLA-DR en queratinocitos procedentes de enfermedades cutáneas benignas

Diagnóstico	N^{o} de	ICAM-1	HLA-DR	ICAM-1
	casos	solamente	solamente	\textamp HLA-DR
Eczema de contacto alérgico	5	3^{a}	0	2
Liquen plano	11	3	0	8
Penfigoide/pénfigo	2	2	0	0
Exantema	3	2	0	0
Urticaria	4	1	0	1
^{a} Las muestras se consideraron positivas si se teñían al menos pequeñas
agrupaciones de queratinocitos.

\newpage

Ejemplo 24 Expresión de ICAM-1 en queratinocitos de lesiones psoriásicas de la piel

La expresión de ICAM-1 en biopsias de piel de 5 pacientes con psoriasis se estudió antes de la iniciación y periódicamente durante el transcurso de un tratamiento PUVA. Se obtuvieron biopsias de 5 pacientes con psoriasis clásica confirmada por histología. Las biopsias se tomaron secuencialmente antes y durante el tiempo indicado del tratamiento PUVA. El tratamiento PUVA se administró 3 a 4 veces por semana. Las biopsias se tomaron de la periferia de las placas psoriásicas en 5 pacientes y, adicionalmente, se tomaron biopsias de piel clínicamente normal en 4 de los pacientes.

Las muestras de biopsia de la piel recientes se congelaron y se guardaron en nitrógeno líquido. Secciones criostáticas de 6 micrómetros se secaron al aire durante una noche a la temperatura ambiente, se fijaron en acetona durante 10 minutos y se tiñeron inmediatamente o se envolvieron en lámina delgada de aluminio y se guardaron a -80ºC hasta su tinción.

La tinción se realizó de la manera siguiente. Se incubaron las secciones con anticuerpos monoclonales y se tiñeron por un método de inmunoperoxidasa en tres etapas (Stein, H., et al., Adv. Cancer Res. 42:67-147, (1984)), utilizando un sustrato de diaminobenzidina-H_{2}O_{2}. Se utilizaron amígdalas y ganglios linfáticos como control positivo para la tinción anti-ICAM-1 y HLA-DR. Como controles negativos se utilizaron tejidos teñidos en ausencia de anticuerpo primario.

Los anticuerpos monoclonales contra HLA-DR se adquirieron de Becton Dickinson (Mountainview, California). El anticuerpo monoclonal anti-ICAM-1 era R6-5-D6. La Ig anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa y la Ig anti-conejo de cerdo conjugada con peroxidasa se adquirieron de DAKAPATTS, Copenhague, Dinamarca. El tetrahidrocloruro de diaminobenzidina se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO).

Los resultados del estudio demuestran que las células endoteliales de algunos vasos sanguíneos expresan ICAM-1 tanto en la piel enferma como en la piel normal, pero la intensidad de la tinción y el número de vasos sanguíneos que expresan ICAM-1 se incrementaba en las lesiones psoriásicas de la piel. Además, el patrón de expresión de ICAM-1 en los queratinocitos de las lesiones psoriásicas de la piel sin tratar de los cinco pacientes variaba desde la tinción de solamente pequeñas agrupaciones de células a la tinción de muchos queratinocitos. Durante el curso del tratamiento PUVA, la expresión de ICAM-1 en dos de los pacientes (pacientes 2 y 3) mostró una reducción acusada que precedía o era simultánea a la remisión clínica (Tabla 13). Los pacientes 1, 4 y 5 presentaban disminuciones y aumentos de la expresión de ICAM-1 durante el tratamiento PUVA que estaban correlacionados con remisiones y relapsos clínicos, respectivamente. No se observó expresión alguna de ICAM-1 en los queratinocitos procedentes de la piel normal antes o después del tratamiento PUVA. Esto indica que el tratamiento PUVA no induce ICAM-1 en los queratinocitos procedentes de piel normal.

Fue digna de mención la observación de que la densidad del infiltrado de células mononucleares estaba en correlación con la magnitud de la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos. Esto se refería a un número reducido de células mononucleares en las lesiones durante el tratamiento de PUVA cuando la expresión de ICAM-1 decaía también y un número incrementado de células mononucleares durante el tratamiento PUVA cuando la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos era más prominente. Las células endoteliales y las células mononucleares dérmicas son también positivas a ICAM-1. En la piel clínicamente normal, la expresión de ICAM-1 estaba confinada a las células endoteliales sin marcación alguna de los queratinocitos.

La expresión de HLA-DR en los queratinocitos era variable. No se observó ninguna biopsia positiva a HLA-DR que no fuese también positiva a ICAM-1.

En suma, estos resultados demuestran que, antes del tratamiento, la expresión de ICAM-1 es acusada en los queratinocitos y está en correlación con un infiltrado celular mononuclear denso. Durante el tratamiento PUVA, se observa una disminución pronunciada de la tinción de ICAM-1 en paralelo con la mejoría clínica. Histológicamente, el infiltrado dérmico disminuía también. Cuando resultó evidente un relapso clínico durante el tratamiento, la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos aumentaba, así como la densidad del infiltrado dérmico. Cuando se observó una remisión clínica durante el tratamiento, había una disminución concurrente en la tinción de ICAM-1 en los queratinocitos así como una disminución del infiltrado dérmico. Por consiguiente, la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos correspondía a la densidad del infiltrado celular mononuclear de la dermis. Estos datos demuestran que la respuesta clínica al tratamiento PUVA daba como resultado una disminución pronunciada de la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos paralela a una disminución más moderada de las células mononucleares. Esto indica que la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos es responsable de la iniciación y el mantenimiento del infiltrado dérmico y que el tratamiento PUVA regula en sentido decreciente ICAM-1, lo cual mitiga a su vez el infiltrado dérmico y la respuesta inflamatoria. Los datos indican también que se producía una expresión variable de HLA-DR en los queratinocitos durante el tratamiento PUVA.

La expresión de ICAM-1 en los queratinocitos de las lesiones psoriásicas está en correlación con la gravedad clínica de la lesión así como con el tamaño del infiltrado dérmico. Por consiguiente, ICAM-1 juega un papel central en la psoriasis y la inhibición de su expresión y/o la inhibición de su interacción con el complejo CD 18 en las células mononucleares será un tratamiento eficaz de la enfermedad. Adicionalmente, la observación de la expresión de ICAM-1 en los queratinocitos será una herramienta eficaz para el diagnóstico y el pronóstico, así como para la evaluación del curso de la terapia de la psoriasis.

TABLA 13 Expresión secuencial de ICAM-1 por queratinocitos en lesiones psoriásicas de la piel (PS) y piel clínicamente normal (N) antes y durante el tratamiento PUVA

Tiempo antes	Paciente Nº
y durante el
tratamiento PUVA
	1	2	3	4	5
	PS	PS	N	PS	N	PS	N	PS	N
0	+	+	-	++	-	++	-	+++	-
1 día	+
1 semana	+	+	-	-	-	++	-	+	-
	0
2 semanas	++			+	-	+	-	+	-
3 semanas	++
				*	0
4 semanas	++	+	-	-	-	++	-
		*					*
5-6 semanas		-	-					-	-
								0
7 semanas						(++)	(+)	+++	-
	*							*
10 semanas	(+)							-	-
+++ Muchos queratinocitos positivos
++ Cierta proporción de queratinocitos positivos
+ Queratinocitos positivos focales
(+) Muy pocos queratinocitos positivos dispersos
- Ausencia de tinción positiva
* Remisión clínica
0 Relapso clínico

Ejemplo 25 Expresión de ICAM-1 y HLA-DR en enfermedades cutáneas malignas

Al contrario que las lesiones procedentes de condiciones cutáneas benignas, la expresión de ICAM-1 en queratinocitos procedentes de lesiones malignas de la piel era mucho más variable (Tabla 14). De los 23 linfomas de células T cutáneos estudiados, se identificaron solamente queratinocitos positivos a ICAM-1 en 14 casos. Había cierta tendencia a que los queratinocitos procedentes de biopsias de lesiones de micosis fungoides perdieran su expresión de ICAM-1 con la progresión de la enfermedad a estados más avanzados. Sin embargo, se observó la expresión de
ICAM-1 en una proporción variable del infiltrado de células mononucleares procedente de la mayoría de las lesiones de linfoma cutáneo de las células T. Entre los linfomas restantes estudiados, 4 de 8 tenían queratinocitos que expresaban ICAM-1. De los 29 pacientes con enfermedades cutáneas malignas examinados, 5 tenían queratinocitos que expresaban HLA-DR sin expresar ICAM-1 (Tabla 14).

TABLA 14 Expresión de ICAM-1 y HLA-DR en queratinocitos procedentes de enfermedades cutáneas malignas

Diagnóstico	N^{o} de casos	ICAM-1	HLA-DR	ICAM-1
		solamente	solamente	\textamp HLA-DR
CTCL, MFI	8	1^{a}	0	4
CTCL, MFII-III	10	1	2	5
CTCL, SS	3	1	0	2
CTCL, Células Grande	2	0	2	0
CBCL	2	0	0	1
Cutis de Leucemia	3	1	1	1
Histiocitosis X	1	0	0	0
^{a} Las muestras se consideraron positivas si se teñían al menos pequeñas agrupaciones
de queratinocitos.

Ejemplo 26 Efecto de los anticuerpos anti-ICAM-1 en la proliferación de las células mononucleares de la sangre periférica humana

Se induce la proliferación de las células mononucleares de la sangre periférica humana por la presencia y el reconocimiento de antígenos o mitógenos. Ciertas moléculas tales como el mitógeno concanavalina A, o el anticuerpo OKT3 de fijación de las células T, hacen que se produzca una proliferación inespecífica de las células mononucleares de la sangre periférica.

Las células mononucleares de la sangre periférica humana son heterogéneas en el sentido de que las mismas se componen de subpoblaciones de células que son capaces de reconocer antígenos específicos. Cuando una célula mononuclear de sangre periférica que es capaz de reconocer un antígeno específico particular encuentra el antígeno, se induce la proliferación de dicha subpoblación de células mononucleares. El toxoide del tétanos y la hemocianina de lapa perforada son ejemplos de antígenos que son reconocidos por subpoblaciones de células mononucleares periféricas pero no son reconocidos por todas las células mononucleares periféricas en individuos sensibilizados.

Se ensayó la capacidad del anticuerpo monoclonal R6-5-D6 anti-ICAM-1 para inhibir las respuestas proliferativas de las células mononucleares de la sangre periférica humana en sistemas que se sabe requieren adhesiones célula-célula.

Las células mononucleares de la sangre periférica se purificaron en gradientes Ficoll-Paque (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación de la recogida de la interfase, las células se lavaron tres veces con medio RPMI 1640, y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo plano a una concentración de 10^{6} células/ml en medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero de bovino fetal, glutamina 2 mM, y gentamicina (50 \mug/ml).

Los antígenos, mitógeno de las células T concanavalina A (0,25 \mug/ml); el anticuerpo de fijación de las células T, OKT3 (0,001 \mug/ml); hemocianina de lapa perforada (10 g/ml) o toxoide del tétanos (dilución 1:100 a partir de la fuente) se añadieron a células que se cultivaron como se ha descrito arriba en presencia o ausencia de anticuerpo anti-ICAM (R6-5--D6; concentración final de 5 g/ml). Las células se cultivaron durante 3,5 días (experimento con concanavalina A), 2,5 días (experimento con OKT3), o 5,5 días (experimentos con hemocianina de lapa perforada y toxoide del tétanos) antes de la terminación de los ensayos.

Dieciocho horas antes de la terminación del ensayo, se añadieron a los cultivos 2,5 \muCi de ^{3}H-timidina. Se ensayó la proliferación celular por medida de la incorporación de timidina al DNA por las células mononucleares de la sangre periférica. La timidina incorporada se recogió y se contó en un contador de centelleo de líquido (Merluzzi et al., J. Immunol. 139:166-168 (1987)). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 16 (experimento con concanavalina A), Figura 17 (experimento con OKT3), Figura 18 (experimento con hemocianina de lapa perforada), y Figura 19 (experimento con toxoide del tétanos).

Se encontró que el anticuerpo anti-ICAM-1 inhibe las respuestas proliferativas al mitógeno inespecífico de las células T, ConA; al antígeno inespecífico asociado a las células T, OKT-3; y a los antígenos específicos, hemocianina de lapa perforada y toxoide del tétanos, en las células mononucleares. La inhibición por el anticuerpo anti-ICAM-1 era comparable a la del anticuerpo anti-LFA-1, lo cual sugería que ICAM-1 es un ligando funcional de LFA-1 y que el antagonismo de ICAM-1 inhibirá las respuestas específicas del sistema de defensa.

Ejemplo 27 Efecto del anticuerpo anti-ICAM-1 sobre la reacción de los linfocitos mezclados

Como se ha expuesto arriba, ICAM-1 es necesaria para las interacciones celulares efectivas durante una respuesta inmune mediada por la adhesión celular dependiente de LFA-1. La inducción de ICAM-1 durante las respuestas inmunes o la enfermedad inflamatoria permite la interacción de los leucocitos entre sí y con las células endoteliales.

Cuando se cultivan unos en presencia de otros linfocitos procedentes de dos individuos afines, se observan transformación en blastos y proliferación celular de los linfocitos. Esta respuesta de una población de linfocitos a la presencia de una segunda población de linfocitos, se conoce como una reacción de linfocitos mezclados (MLR), y es análoga a la respuesta de los linfocitos a la adición de mitógenos (Immunology, the Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J., John Wiley & Sons, NY (1982), pp 453-458).

Se realizaron experimentos para determinar el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-ICAM sobre la MLR humana. Estos experimentos se condujeron como sigue. Se obtuvo sangre periférica de donantes normales sanos por punción venosa. La sangre se recogió en tubos heparinizados y se diluyó 1:1 a la temperatura ambiente con solución equilibrada de sales (BSS) G de Puck (GIBCO). La mezcla de sangre (20 ml) se estratificó sobre 15 ml de un gradiente de densidad Ficoll/Hypaque (Pharmacia, densidad = 1,078, temperatura ambiente) y se centrifugó a 1000 x g durante 20 minutos. Se recogió luego la interfase y se lavó 3X en G de Puck. Las células se sometieron a recuento en un hemacitómetro y se resuspendieron en medio de cultivo RPMI-1640 (GIBCO) que contenía 0,5% de gentamicina, L-glutamina 1 mM (GIBCO) y 5% de sueros AB humanos inactivados por calentamiento (56ºC, 30 min) (Flow Laboratories) (denominado en lo sucesivo medio de cultivo RPMI).

En estos experimentos se utilizó anti-ICAM-1 de ratón (R6-5-D6). Todos los anticuerpos monoclonales (preparados a partir de ascitis por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Boston, MA) se utilizaron como preparaciones de IgG purificadas.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se cultivaron en el medio a razón de 6,25 x 10^{5} células/ml en placas de microtitulación Linbro con fondo redondo (#76-013-05). Las células estimuladoras procedentes de un donante separado se irradiaron a 1000 R y se cultivaron con las células respondedoras a la misma concentración. El volumen total por cultivo era 0,2 ml. Los controles incluían células respondedoras solas así como células estimuladoras solas. Las placas de cultivo se incubaron a 37ºC en una atmósfera de aire humidificado con 5% de CO_{2} durante 5 días. Los pocillos se pulsaron con 0,5 \muCi de timidina tritiada (^{3}HT) (New England Nuclear) durante las 18 últimas horas de cultivo. En algunos casos se realizó una MLR de dos vías. El protocolo fue el mismo excepto que las células del segundo donante no se desactivaron por irradiación.

Las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio utilizando un recogedor de muestras múltiples automático (Skatron, Noruega), enjuagando con agua y metanol. Los filtros se secaron luego a la estufa y se sometieron a recuento en Aquasol en un contador de centelleo de líquidos Beckman (LS-3801). Los resultados se consignan como el valor medio de CPM \pm el error estándar de 6 cultivos individuales.

La Tabla 15 muestra que los anticuerpos monoclonales anti-ICAM purificados inhibían la MLR de una manera dependiente de la dosis con supresión significativa aparente a 20 ng/ml. La IgG de ratón purificada tenía poco o ningún efecto supresor. La supresión de la MLR por el anticuerpo monoclonal anti-ICAM-1 ocurre cuando el anticuerpo se añade dentro de las primeras 24 horas de los cultivos (Tabla 16).

TABLA 15 Efecto del anticuerpo anti-ICAM-1 sobre la reacción de los linfocitos de una vía

Células	Células	Anticuerpo^{c}	Incorporación de ^{3}HT
respondedoras^{a}	estimuladoras^{b}		(CPM)
-	-	-	445^{d} \pm 143
-	+	-	148 \pm 17
+	-	-	698 \pm 72
+	+	-	42.626 \pm 1.579
+	+	mIgG (10,0 \mug)	36.882 \pm 1.823 (14%)
+	+	mIgG ( 0,4 \mug)	35.500 \pm 1.383 (17%)
+	+	mIgG (0,02 \mug)	42.815 \pm 1.246 (0%)
+	+	R6-5-D6 (10,0 \mug)	8.250 \pm 520 (81%)
+	+	R6-5-D6 ( 0,4 \mug)	16.142 \pm 858(62%)
+	+	R6-5-D6 (0,03 \mu)	28.844 \pm 1.780 (32%)

a.Células respondedoras (6,25 x 10^{5}/ml) b.Células estimuladoras (6,25 x 10^{5}/ml, irradiadas a 1000R) c.Anticuerpo monoclonal purificado para ICAM-1 (R6-5-D6) o IgG de ratón purificada (mIgG) a concentraciones finales (\mug/ml) d.Valor medio \pm error estándar [S.E. (del inglés "standard error")] de 5-6 cultivos; los números entre paréntesis indican el porcentaje de inhibición de la MLR.

TABLA 16 Tiempo de adición de anti-ICAM-1

R^{a}	S^{b}	Adiciones^{c}	Incorporación de ^{3}HT (CPM)
			Tiempo de adición del medio o anticuerpo
			Día 0	Día 1	Día 2
-	-	medio	205^{d}\pm14	476\pm132	247\pm75
-	+	medio	189\pm16	nd^{e}	nd
+	-	medio	1860\pm615	nd	nd
+	+	medio	41063\pm2940	45955\pm2947	50943\pm3072
+	+	R6-5-D6	17781\pm1293	38409\pm1681	47308\pm2089
			(57%)	(16%)	(7%)

a.Células respondedoras (6,25 x 10^{5}/ml) b.Células estimuladoras (6,25 x 10^{5}/ml, irradiadas a 1000R) c.Se añadieron Medio de Cultivo o Anticuerpo Monoclonal Purificado para ICAM-1 (R6-5-D6) a 10 \pmg/ml el día 0 a intervalos de 24 horas d.Valor medio \pm S.E. de 4-6 cultivos e.nd = no realizado f.Porcentaje de Inhibición

En resumen, la capacidad del anticuerpo contra ICAM-1 para inhibir la MLR demuestra que los anticuerpos monoclonales de ICAM-1 tienen utilidad terapéutica en el rechazo agudo de los injertos. Los anticuerpos monoclonales de ICAM-1 tienen también utilidad terapéutica en trastornos afines mediados inmunológicamente, dependientes de las interacciones célula a célula reguladas por LFA-1/ICAM-1.

Los experimentos descritos en esta memoria demuestran que la adición de anticuerpos monoclonales para
ICAM-1 inhibe la reacción de los linfocitos mezclados (MLR) cuando se añaden durante las primeras 24 horas de la reacción. Adicionalmente, ICAM-1 llega a regularse en sentido creciente en los monocitos de la sangre periférica humana durante el cultivo in vitro.

Por otra parte, se encontró que ICAM-1 no se expresa en los linfocitos o monocitos de la sangre periférica humana en reposo. ICAM-1 se regula en sentido creciente en los monocitos de las células cultivadas solas o células co-cultivadas con células de donantes no afines en una reacción de linfocitos mezclados utilizando análisis por citometría de flujo convencionales. Esta regulación creciente de ICAM-1 en los monocitos puede utilizarse como indicador de inflamación, particularmente si ICAM-1 se expresa en monocitos recientes de individuos con inflamación aguda o crónica.

La especificidad de ICAM-1 para los monocitos activados y la capacidad del anticuerpo contra ICAM-1 para inhibir una MLR sugiere que los anticuerpos monoclonales de ICAM-1 pueden tener potencial diagnóstico y terapéutico en el rechazo agudo de los injertos y trastornos afines mediados por el sistema inmune que requieran interacciones célula a célula.

Ejemplo 28 Efectos sinérgicos de la administración combinada de anticuerpos Anti-ICAM-1 y anti-LFA-1

Como se muestra en el Ejemplo 27, la MLR es inhibida por el anticuerpo anti-ICAM-1. La MLR puede ser inhibida también por el anticuerpo anti-LFA-1. Con objeto de determinar si la administración combinada de anticuerpos anti-ICAM-1 y anti--LFA-1 pudiera tener un efecto intensificado, o sinérgico, se realizó un ensayo de MLR (efectuado como se ha descrito en el Ejemplo 27) en presencia de diversas concentraciones de los dos anticuerpos.

Este ensayo de MLR reveló que la combinación de anti--ICAM-1 y anti-LFA-1, a concentraciones en las que ninguno de los anticuerpos inhibe por sí solo espectacularmente la MLR, es significativamente más potente en la inhibición de la respuesta MLR (Tabla 17). Este resultado indica que las terapias que implican adicionalmente la administración de anticuerpo anti-ICAM-1 (o fragmentos del mismo) y anticuerpo anti-LFA-1 (o fragmentos del mismo) tienen capacidad para proporcionar una terapia anti-inflamatoria mejorada. Dicha terapia mejorada permite la administración de dosis menores de anticuerpo que las que serían terapéuticamente eficaces en caso contrario, y tiene importancia en circunstancias en las cuales concentraciones altas de anticuerpos individuales inducen una respuesta anti-idiotípica.

TABLA 17 Efectos de diversas dosis de anti-ICAM-1 y anti-LFA-1 (R3.1) en la reacción de los linfocitos mezclados

	% Inhibición
Concentración
(\mug/ml)
Anti-LFA-1	Anti-ICAM-1 (R6-5-D6)
	0	0,004	0,02	0,1	0,5	2,5
0,0	0	7	31	54	69	70
0,0008	1	7	28	48	62	71
0,004	0	13	30	50	64	72
0,02	29	38	64	75	84	86
0,1	92,5	90	91	92	92	92
0,5	93	90	90	92	92	91

Ejemplo 29 Efectos aditivos de la administración combinada de dosis sub-óptimas de anti-ICAM-1 y otros agentes inmunosupresores en la MLR

Como se muestra en el Ejemplo 28, la MLR es inhibida por combinaciones de anticuerpos anti-ICAM-1 y anti-LFA-1. Con objeto de determinar si la administración conjunta de anti-ICAM-1 y otros agentes inmunosupresores (tales como dexametasona, azatioprina, ciclosporina A o esteroides (tales como, por ejemplo, prednisona, etc.) pudiera tener también efectos intensificados, se llevaron a cabo ensayos MLR utilizando concentraciones sub-óptimas (es decir concentraciones que serían menores que la concentración óptima a la cual debería proporcionarse a un individuo el agente aisladamente considerado) de R6-5-D6 en asociación con otros agentes inmunosupresores de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 27.

Los datos indican que los efectos inhibidores de R6-5-D6 son al menos aditivos con los efectos inhibidores de la dosis subóptimas de dexametasona (Tabla 18), azatioprina (Tabla 19) y ciclosporina (Tabla 20). Esto implica que los anticuerpos anti-ICAM-1 pueden ser eficaces en la disminución de las dosis necesarias de inmunosupresores conocidos, reduciendo así sus efectos tóxicos secundarios. En la utilización de un anticuerpo anti-ICAM-1 (o un fragmento del mismo) para conseguir dicha inmunosupresión, es posible combinar la administración del anticuerpo (o fragmento del mismo) con un solo agente inmunosupresor adicional, o con una combinación de más de un agente inmunosupresor adicional.

TABLA 18 Efecto de anti-ICAM-1 y Dexametasona sobre la MLR humana

Grupo	Inhibidor	Incorporación de	% de Inhibición
	(ng/ml)	^{3}HT (CPM)
Medios	-	156	-
Estimuladores (S)	-	101	-
Respondedores (R)	-	4.461	-
R x S	-	4.461	-
R x S	R6-5-D6 (8)	26.224	23
R x S	Dex (50)	14.158	59
R x S	R6-5-D6 (8) +	7.759	77
	Dex (50)
Dex: Dexametasona

TABLA 19 Efecto de anti-ICAM-1 y Azatioprina sobre la MLR humana

Grupo	Inhibidor	Incorporación de	% de Inhibición
	(ng/ml)	^{3}HT (CPM)
Medios	-	76	-
Estimuladores (S)	-	174	-
Respondedores (R)	-	3.419	-
R x S	-	49.570	-
R x S	R6-5-D6 (8)	44.374	11
R x S	Azatioprina (1)	42.710	14
R x S	R6-5-D6 (8) +	34.246	31
	Azatioprina (1)

TABLA 20 Efecto de anti-ICAM-1 y Ciclosporina A sobre la MLR humana

Grupo	Inhibidor	Incorporación de	% de Inhibición
	(ng/ml)	^{3}HT (CPM)
Medios	-	87	-
Estimuladores (S)	-	206	-
Respondedores (R)	-	987	-
R x S	-	31.460	-
R x S	R6-5-D6 (8)	26.282	17
R x S	CyA (10)	23.617	25
R x S	R6-5-D6 (8) +	19.204	39
	CyA (19)
CyA: Ciclosporina A

Ejemplo 30 Efecto del anticuerpo anti-ICAM-1 en la supresión del rechazo de organos alogénicos trasplantados

A fin de demostrar el efecto del anticuerpo anti-ICAM-1 en la supresión del rechazo de un órgano alogénico trasplantado, se trasplantaron monos Cynomolgus con riñones alogénicos de acuerdo con el método descrito por Cosimi et al. (Transplant. Proc. 13:499-503 (1981)) con la modificación de que se utilizaran Valium y Ketamine como anestesia.

Así, el trasplante de riñón se realizó esencialmente como sigue. Se realizaron aloinjertos renales heterótropos en monos Cynomolgus de 3-5 kg, esencialmente como ha sido descrito por Marquet (Marquet et al., Medical Primatology, Parte II, Basilea, Karger, p. 125 (1972)) después de la inducción de la anestesia con Valium y Ketamina. Se construyeron anastomosis terminolaterales de vasos renales del donante sobre un parche de aorta o vena cava utilizando sutura con Prolene 7-0. El uréter del donante se recogió con la espátula y se implantó en la vejiga por la aposición extravesical (Taguchi, Y., et al., en Dausset et al., (compiladores), en Advances in Transplantation, Baltimore, Williams & Wilkins, p. 393 (1968). La función renal se evaluó por determinaciones semanales o bisemanales de creatinina en suero. Adicionalmente, se obtuvieron biopsias frecuentes del aloinjerto para examen histopatológico y se llevaron a cabo autopsias completas en todos los receptores que no sobrevivieron. En la mayoría de los receptores, se realizó una nefrectomía bilateral en el momento del trasplante y se consideró la muerte urémica subsiguiente como el punto final de supervivencia del aloinjerto. En algunos receptores se realizaron nefrectomía nativa unilateral y ligación contralateral del uréter en el momento del trasplante. Cuando se produjo el rechazo del aloinjerto, se retiró luego la ligadura en el uréter autólogo dando como resultado la restauración de la función renal normal y la oportunidad de continuar la observación inmunológica del animal receptor.

Se administró el anticuerpo monoclonal R6-5-D6 diariamente durante 12 días comenzando dos días antes del trasplante a una dosis de 1-2 mg/kg/día. Se ensayaron periódicamente los niveles de creatinina en suero para observar el rechazo. El efecto del anticuerpo anti-ICAM-1 sobre el rechazo por el sistema inmune de los riñones alogénicos se muestra en la Tabla 21.

TABLA 21 Actividad de R6-5-D6 en la prolongación de la supervivencia del aloinjerto renal en protocolos profilácticos realizados en el mono Cynomolgus^{a}

Mono	Dosis de R6-5-D6	Días de Supervivencia
	(mg/kg)	/Post-Tratamiento
Control 1	-	8
Control 2	-	11
Control 3	-	11
Control 4	-	10
Control 5	-	9
Control 6	-	10
M15	1,0	20
M19	1,0	7^{b}
M17	1,0	30
M25	1,5	29
M23	1,0	11^{c}
M27	2,0	34
M7	0,5	22
M11	0,5	26
M10	0,5	22
M8	0,5	26^{d}
^{a} Los monos recibieron R6-5-D6 durante 12 días consecutivos comenzando
dos días antes del trasplante.
^{b} La causa de la muerte se desconoce. Había evidencia de malaria latente.
^{c} Muerto por infarto renal.
^{d} Vivo todavía en fecha 15 de agosto de 1988.

Los resultados muestran que R6-5-D6 era eficaz en la prolongación de la vida de los monos que recibieron trasplante de riñón alogénico.

Ejemplo 31 Efecto del anticuerpo anti-ICAM-1 en la supresión del rechazo agudo de los organos trasplantados

A fin de demostrar que el anticuerpo anti-ICAM-1 es eficaz en un modelo agudo de rechazo de trasplantes, se ensayó también R6-5-D6 en un modelo de rechazo terapéutico o agudo de riñón. En este modelo, se trasplantaron riñones de mono (utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 30) y recibieron perioperativamente 15 mg/kg de ciclosporina A (CyA) por vía intramuscular hasta que se alcanzó una función renal estable. La dosis de CyA se redujo luego bisemanalmente en incrementos de 2,5 mg/kg hasta que se produjo el rechazo como se indicó por una subida en los niveles de creatinina en sangre. En este momento, se administró R6-5-D6 durante 10 días y se observó la duración de la supervivencia. Es importante indicar que, en este protocolo, la dosis de CyA sigue siendo subóptima dado que la misma no cambio una vez que se produce el episodio de rechazo agudo. En este modelo, los controles históricos (N = 5) sin ningún rescate por anticuerpos sobreviven 5-14 días desde el comienzo del episodio de rechazo. Hasta la fecha, se ensayaron 6 animales utilizando R6-5-D6 en este producto (Tabla 22). Dos de estos animales sobreviven todavía (M12, 31 días y M5, 47 días después de la administración de R6-5-D6). Dos animales vivieron 38 y 55 días después de las iniciaciones de la terapia con R6-5-D6, y dos animales murieron por causas distintas del rechazo agudo (un animal murió por toxicidad producida por CyA y el otro murió mientras se le estaba administrando R6-5-D6 bajo anestesia). Este modelo se aproxima más estrechamente a la situación clínica en la cual se utilizaría inicialmente R6-5-D6.

TABLA 22 Actividad de R6-5-D6 en la prolongación de la supervivencia del aloinjerto renal en protocolos terapéuticos en el mono Cynomolgus^{a}

Mono	Día del Episodio de	Días de Supervivencia/
	Rechazo^{b}	Post-Tratamiento
Controles^{c}	14-98	5-14
M24	41	38
M21	34	4^{d}
M3	41	55
M9	12	11^{e}
M12	37	> 31^{f}
M5	26	> 47^{f}

^{a} Los monos recibieron 1-2 mg/kg de R6-5-D6 durante 10 días consecutivos después del comienzo del rechazo. ^{b} Día en el que los niveles de creatinina aumentaron como resultado de la reducción de la dosificación de CyA y se inició la terapia con R6-5-D6. ^{c} Se ensayaron 5 animales utilizando el protocolo terapéutico descrito arriba, excepto que no se realizó terapia de rescate alguna. Los días de supervivencia/post-tratamiento representan los días de supervivencia una vez que comenzaron a aumentar los niveles de creatinina. ^{d} Muerto mientras se encontraba bajo anestesia. Los niveles de creatinina eran bajos. ^{e} Muerto por toxicidad producida por CyA. Los niveles de creatinina eran bajos. ^{f} Vivo todavía en fecha 15 de agosto de 1988.

Construcción genética y expresión de derivados truncados de ICAM-1

En su estado natural, ICAM-1 es una proteína fijada a la membrana celular que contiene una región extracelular de 5 dominios análogos a inmunoglobulina, un dominio transmembranal, y un dominio citoplásmico. Era deseable construir derivados funcionales de ICAM-1 que carecieran del dominio transmembranal y/o el dominio citoplásmico en el sentido de que podría generarse una forma soluble secretada de ICAM-1. Estos derivados funcionales se construyeron por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos del gen de ICAM-1, seguida por expresión en células de mono después de la transfección con el gen mutante.

Se generaron mutaciones en el gen de ICAM-1, que daban como resultado sustituciones de aminoácidos y/o derivados truncados, por el método de Kunkel, T. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:488-492 (1985)). Se digirió cDNA de ICAM-1 preparado como se ha descrito arriba con las endonucleasas de restricción Sal 1 y Kpn 1, y el fragmento de DNA de 1,8 kilobases resultante se subclonó en el vector de plásmido CDM8 (Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:3365-3369 (1987)). Se transformó luego una cepa dut^{-}, ung^{-} de E. coli (BW313/P3) con esta construcción, designada pCD1.8C. Se rescató un molde monocatenario que contenía uracilo a partir de los transformantes por infección con el fago adyuvante R408 (Stratagene®). Se generaron luego cDNAs mutantes de ICAM-1 por cebado de una síntesis de segunda cadena con un oligonucleótido que poseía bases desapareadas, y transformación subsiguiente de un huésped ung^{+} (MC1061/P3) con el heterodúplex resultante. Se aislaron mutantes por exploración para sitios de restricción por endonucleasas recién creados introducidos por el oligonucleótido mutante. Se expresó la proteína ICAM-1 mutante por transfección de células Cos-7 con el DNA mutante en el vector de expresión eucariota CDN8 utilizando procedimientos estándar de DEAE-Dextrano (Selden, R.F. et al. en: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., compiladores, páginas 9.2.1-9.2.6 (1987)).

Se preparó un derivado funcional truncado de ICAM-1 que carecía de los dominios transmembranal y citoplásmico, pero que contenía la región extracelular que poseía la totalidad de los 5 dominios afines a las inmunoglobulinas. Se utilizó un oligonucleótido mutante de 30 pares de bases (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) para transformar los codones para los aminoácidos tirosina (Y) y ácido glutámico (E) en las posiciones 452 y 453, respectivamente, en una fenilalanina (F) y un codón de parada de la traducción (TAG). El mutante se aisló por su único sitio de restricción Xba-1, y se designó Y^{452}E/F,TAG.

Para expresar la proteína mutante, se transfectaron células COS con 3 subclones mutantes (#2, #7, y #8). Tres días después de la transfección con los tres subclones mutantes, se analizaron los sobrenadantes de cultivo y el lisado de células por inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal anti-ICAM-1 RR1/1 y SDS-PAGE. Se precipitó ICAM-1 a partir de los sobrenadantes de cultivo de células transfectadas con los subclones mutantes #2 y #8, pero no de los lisados con detergente de dichas células. El peso molecular de ICAM-1 encontrado en el sobrenadante de cultivo se redujo aproximadamente 6 kd con relación a la forma de membrana de ICAM-1, lo cual es coherente con el tamaño predicho a partir del DNA mutante. Así, este derivado funcional de ICAM-1 se excreta como una proteína soluble. En contraste, ICAM-1 no se inmunoprecipitó a partir de los sobrenadantes de cultivos de control de células transfectadas con ICAM-1 nativa, lo que demostraba que la forma membranal de ICAM-1 no se desprende de las células Cos. Adicionalmente, no se inmunoprecipitó cantidad alguna de ICAM-1 a partir de los sobrenadantes de cultivo o los lisados de células procedentes de las células transfectadas falsamente de los controles negativos.

La ICAM-1 truncada secretada a partir de las células transfectadas se purificó por cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo específico de ICAM-1 (R6-5-D6) y se ensayó respecto a actividad funcional en un ensayo de fijación celular. Después de la purificación en presencia del octilglucosido detergente, preparaciones que contenían ICAM-1 nativa o la forma secretada truncada se diluyeron a una concentración final de 0,25% de octilglucosido (una concentración inferior a la concentración micelar crítica del detergente). Se dejó que estas preparaciones de
ICAM-1 se fijaran a las superficies de placas de 96 pocillos de material plástico (Nunc), para producir ICAM-1 fijada a una fase sólida. Después de separar por lavado el material no fijado, aproximadamente el 75-80% y el 83-88% de las células SKW-3 que llevaban LFA-1 en su superficie se fijaron específicamente a las formas nativa y truncada de ICAM-1, respectivamente. Estos datos demuestran que el derivado funcional de ICAM-1 soluble, truncado y secretado, retenía tanto la reactividad inmunológica como la capacidad para mediar la adhesión dependiente de ICAM-1 que son características de la ICAM-1 nativa.

Un derivado funcional de ICAM-1 que carecía solamente del dominio citoplásmico se preparó por métodos similares. Se utilizó un oligonucleótido de 25 pares de bases (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) para alterar el codón para el aminoácido 476 (Y) a un codón TAG de parada de la traducción. El mutante se designó Y^{476}/TAG. El análisis por inmunoprecipitación y SDS/PAGE de células Cos transfectadas con el mutante detectó una forma de ICAM-1 fijada a la membrana con un peso molecular de aproximadamente 3 kd menos que la ICAM-1 nativa. La inmunofluorescencia indirecta de las células Cos transfectadas por el mutante demostró un patrón de tinción punteada similar a la ICAM-1 natural expresada en las células endoteliales humanas estimuladas por LPS. Finalmente, las células transfectadas con el DNA mutante se fijaban específicamente a LFA-1 purificada sobre superficies de material plástico de una manera similar a las células Cos transfectadas con DNA de ICAM-1 natural (Tabla 23).

TABLA 23 Capacidad de las células que expresan ICAM-1 o un derivado funcional de ICAM-1 para fijar LFA-1

Transfección	% de las Células que Expresan ICAM-1
	que Fijan LFA-1 en Presencia de:
	Ningún Anticuerpo	RR1/1
Falsa	0	0
ICAM-1 natural	20	0
Y^{476}/TAG	20	0

Ejemplo 33 Mapeado de los dominios funcionales de ICAM-1

Los estudios de ICAM-1 han revelado que la molécula posee 7 dominios. Cinco de estos dominios son extracelulares (siendo el dominio 5 el más próximo a la superficie celular, y siendo el dominio 1 el más alejado de la superficie celular), un dominio es un dominio transmembranal, y un dominio es citoplásmico (es decir se encuentra en el interior de la célula). Con objeto de determinar qué dominios contribuyen a la capacidad de ICAM-1 para fijar LFA-1, se pueden utilizar estudios de mapeado con epítopes. Para realizar tales estudios, se preparan mutantes de deleción diferentes y se caracterizan por su capacidad para fijarse a LFA-1. Alternativamente, los estudios pueden realizarse utilizando el anticuerpo anti-ICAM que se sabe interfiere con la capacidad de ICAM-1 para fijar LFA-1. Ejemplos de dicho anticuerpo adecuado incluyen RR1/1 (Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)), R6.5 (Springer, T. A. et al., Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/250.446), LB-2 (Clark, E.A. et al., en: Leukocyte Typing I (A. Bernard, et al., compiladores), Springer-Verlag pp. 339-346 (1984)), o CL203 (Staunton, D.E. et al., Cell 56:849-853 (1989)).

Se pueden crear mutantes de deleción de ICAM-1 por cualquiera de una diversidad de medios. Sin embargo, es preferible producir dichos mutantes por mutagénesis dirigida al sitio, o por otros medios recombinantes (por ejemplo por construcción de secuencias génicas que expresan ICAM-1, en las cuales se han delecionado las secuencias que codifican regiones proteínicas particulares. Los procedimientos que pueden adaptarse para producir dichos mutantes son bien conocidos en la técnica. Utilizando tales procedimientos, se prepararon tres mutantes de deleción de
ICAM-1. El primer mutante carece de los residuos de aminoácidos F185 a P284 (es decir deleción del dominio 3). El segundo mutante carece de los residuos de aminoácidos P284 a R451 (es decir deleción de los dominios 4 y 5). El tercer mutante carece de los residuos de aminoácidos posteriores a Y476 (es decir, deleción del dominio citoplásmico). Los resultados de tales estudios indican que los dominios 1, 2, y 3 están implicados predominantemente en las interacciones de ICAM-1 con el anticuerpo anti-ICAM-1 y LFA-1.

Ejemplo 34 Efecto de las mutaciones en ICAM-1 sobre la fijacion de LFA-1

La capacidad de ICAM-1 para interaccionar con y fijarse a LFA-1 está mediada por los residuos de aminoácidos de ICAM-1 que están presentes en los dominios 1 de la molécula ICAM-1 (Figuras 8, 9 y 10). tales interacciones están asistidas, sin embargo, por contribuciones de aminoácidos presentes en los dominios 2 y 3 de ICAM-1. Así, entre los derivados funcionales preferidos de la presente invención se encuentran fragmentos solubles de la molécula
ICAM-1 que contienen los dominios 1, 2, y 3 de ICAM-1. Más preferidos son fragmentos solubles de la molécula ICAM-1 que contienen los dominios 1 y 2 de ICAM-1. Son muy preferidos fragmentos solubles de la molécula
ICAM-1 que contienen el dominio 1 de ICAM-1. Varios residuos de aminoácidos comprendidos dentro del primer dominio de ICAM-1 están implicados en la interacción de ICAM-1 y LFA-1. Las sustituciones de estos aminoácidos con otros aminoácidos alteran la capacidad de ICAM-1 para fijar LFA-1. Estos residuos de aminoácidos y las sustituciones se muestran en la Figura 25. La Figura 25 muestra los efectos de dichas mutaciones sobre la capacidad de la molécula ICAM-1 mutante resultante para fijarse a LFA-1. En las Figuras 23-25, los residuos se describen con referencia al código de una sola letra para los aminoácidos, seguido por la posición del residuo en la molécula ICAM-1. Así, por ejemplo, "E90" se refiere al resto de ácido glutámico en la posición 90 de ICAM-1. Análogamente, "E90V" se refiere al dipéptido compuesto del residuo de ácido glutámico en la posición 90 y el residuo de valina en la posición 91. La secuencia de sustitución se indica a la derecha de la barra diagonal ("/"). Los restos V4, R13, Q27, Q58 y D60S61 de ICAM-1 están involucrados en la fijación de LFA-1.

El reemplazamiento de estos aminoácidos alteraba la capacidad de ICAM-1 para fijarse a LFA-1. Por ejemplo, el reemplazamiento de V4 con G da como resultado la formación de una molécula ICAM-1 mutante que es menos capaz de fijarse a LFA-1 (Figura 25). El reemplazamiento del residuo R13 de ICAM-1 con E conduce a la formación de una molécula mutante con capacidad sustancialmente menor de fijar LFA-1. (Figura 25). El reemplazamiento del residuo Q58 de ICAM-1 con H conduce a la formación de una molécula mutante que tiene una capacidad sustancialmente normal de fijar LFA-1 (Figura 25). El reemplazamiento de los residuos D60S de ICAM-1 con KL conduce a la formación de una molécula mutante que tiene una capacidad sustancialmente menor de fijar LFA-1 (Figura 25).

Los sitios de glicosilación en el segundo dominio están implicados también en la fijación de LFA-1 (Figura 23). El reemplazamiento de N103 con K, o de A155N con SV, da como resultado la formación de una molécula
ICAM-1 mutante que es sustancialmente incapaz de fijar LFA-1. En contraste, el reemplazamiento del sitio de glicosilación N175 con A no parecía afectar sustancialmente a la capacidad de la ICAM-1 mutante para fijar LFA-1.

Las mutaciones en el tercer dominio de ICAM-1 no alteraban apreciablemente la fijación ICAM-1-LFA-1 (Figura 24).

Ejemplo 35 Formas multímeras de ICAM-1 con afinidad de semi-vida biológica y capacidad de aclaramiento incrementadas

Se construyen moléculas quiméricas en las cuales los dominios 1 y 2 de ICAM-1 están fijados a la región bisagra de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. Las construcciones preferidas fijan el término C del dominio 2 de
ICAM-1 a un segmento del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina justamente en la posición N-terminal respecto a la región bisagra, permitiendo la flexibilidad segmentaria conferida por la región bisagra. Los dominios 1 y 2 de ICAM-1 reemplazarán así el fragmento Fab de un anticuerpo. La fijación a las cadenas pesadas de la clase IgG y la producción de células animales darán como resultado la producción de una molécula quimérica. La producción de moléculas que contienen cadenas pesadas derivadas de IgA ó IgM dará como resultado la producción de moléculas de multimericidad más alta que contienen de 2 a 12 moléculas ICAM-1. La co-expresión del gen de la cadena J en las células animales que producen las moléculas quiméricas de la cadena pesada de ICAM-1 permitirá el ensamblaje apropiado de multímero de IgA e IgM dando como resultado predominantemente moléculas de IgA que contienen 4 a 6 moléculas ICAM-1 y que en el caso de IgM contienen aproximadamente 10 moléculas ICAM-1. Estas moléculas quiméricas pueden presentar varias ventajas. En primer lugar, se diseñan moléculas Ig que tienen mayor duración en la circulación y esto puede aumentar la semi-vida biológica.

Adicionalmente, la naturaleza multímera de estas moléculas manipuladas por ingeniería genética permitirá que las mismas interaccionen con mayor avidez con rinovirus así como con LFA-1 de la superficie celular, dependiendo del contexto terapéutico, y por consiguiente reducirán notablemente la cantidad de proteína recombinante que es preciso administrar para proporcionar una dosis eficaz. IgA e IgM son moléculas altamente glicosiladas que están presentes normalmente en las secreciones de sitios mucosos tales como la nariz. Su naturaleza altamente hidrófila contribuye a mantener las bacterias y virus a las que se fijan las mismas fuera de la mucosa, impidiendo la fijación a las células y previniendo el cruzamiento de la barrera membranal de las células epiteliales. Así pues, aquéllas pueden tener eficacia terapéutica incrementada. IgM y en particular IgA son estables en ambientes mucosos y las mismas pueden aumentar la estabilidad de las construcciones de ICAM-1. Si un derivado funcional de ICAM-1 de este tipo se administra en el torrente sanguíneo, el mismo puede aumentar también la semi-vida biológica. IgA no se fija al complemento y por tanto podría ser ideal para aplicaciones en las cuales esto pudiera ser perjudicial. Si se desean formas quiméricas de la cadena H de IgG, sería posible mutar las regiones implicadas en la fijación al complemento así como en las interacciones con los receptores Fc.

Ejemplo 36 Generacion de mutantes de ICAM-1 Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos

La región codificante de una cDNA de ICAM-1 en un fragmento Sal1-Kpn1 de 1,8 kilobases, se subclonó al vector de expresión CDMB (Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:3365-3369 (1987)). Sobre la base del método de Kunkel, T. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:488-492 (1985)) y modificaciones de Staunton D. et al., (Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933 (1988)), se utilizó esta construcción (pCD1.8) para generar un molde monocatenario que contenía uracilo para ser utilizado en la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos.

Resumidamente, la cepa de E. coli XS127 se transformó con pCD1.8. Se dejaron crecer colonias individuales en 1 ml de medio Caldo Luria (LB) (Difco) con 13 \mug/ml de ampicilina y 8 \mug/ml de tetraciclina hasta cerca de la saturación. Se infectaron 100 \mul del cultivo con el fago adyuvante R408 (Stratagene) a una multiplicidad de infección (MOI) de 10, y se añadieron 10 ml de medio LB con ampicilina y tetraciclina para un cultivo de 16 horas a 37ºC. Después de la centrifugación a 10.000 rpm durante 1 minuto, y filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22\mum, se utilizó la suspensión de fago para infectar E. coli BW313/P3 que se extendió luego sobre placas de agar LB (Difco) complementadas con ampicilina y tetraciclina. Se recogieron las colonias, se cultivaron en 1 ml de medio LB con ampicilina y tetraciclina hasta cerca de la saturación y se infectaron con el fago adyuvante a MOI de 10. Se incrementó luego el volumen de cultivo a 250 ml y las células se cultivaron durante una noche. Se aisló DNA monocatenario por extracción de fago estándar.

Los oligonucleótidos mutantes se fosforilaron y se utilizaron con el molde pCD1.8 en una reacción de síntesis de la segunda cadena (Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933 (1988)).

Transfección

Se sembraron células COS en placas de cultivo de tejidos de 10 cm de tal manera que las mismas fuesen confluyentes en un 50% al cabo de 16-24 horas. Las células COS se lavaron luego una sola vez con TBS y se incubaron durante 4 horas con 4 ml de RPMI que contenía 10% de sueros Nu (Collaborative), 5 \mug/ml de cloroquina, 3 \mug de plásmido mutante y 200\mug/ml de DEAE-sulfato de dextrano. Las células se lavaron luego con DMSO al 10%/PBS seguido por PBS y se cultivaron durante 16 horas en medio de cultivo. El medio de cultivo se reemplazó con medio de nuevo aporte y 48 horas después de la transfección, las células COS se suspendieron por tratamiento con tripsina/EDTA (Gibco) y se dividieron en dos placas de 10 cm así como placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos para la fijación de HRV. Al cabo de 72 horas, se recogieron las células procedentes de las placas de 10 cm con EDTA 5 mM/HBSS y se procesaron respecto a la adhesión a material plástico revestido con LFA-1 e inmunofluorescencia.

Fijación de LFA-1 y HRV

Se purificó LFA-1 procedente de lisados SKW-3 por cromatografía de inmunoafinidad sobre TS2/4 LFA-1 mAb Sepharose y se eluyó a pH 11,5 en presencia de MgCl_{2} 2 mM y octilglucosido al 1%. LFA-1 (10 \mug por 200 \mul por placa de 6 cm) se fijó a cápsulas bacteriológicas Petri por dilución del octilglucosido al 0,1% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) con MgCl_{2} 2 mM e incubación durante una noche a 4ºC. Las placas se bloquearon con BSA (sero-albúmina de bovino) al 1% y se guardaron en PBS que contenía MgCl_{2} 2 mM, 0,2% de BSA, 0,25% de azida, y 50 \mug/ml de gentamicina.

Células COS marcadas con ^{51}Cr en PBS que contenía 5% de FCS (suero de ternero fetal), MgCl_{2} 2 mM, y 0,025% de azida (tampón) se incubaron con o sin 5 \mug/ml de RR1/1 y R6.5 en placas de microtitulación revestidas con LFA-1 a 25ºC durante 1 hora. Las células no adherentes se separaron por tres lavados con tampón. Las células adherentes se eluyeron por la adición de EDTA hasta 10 mM y se sometieron a recuento gamma.

Resultados

Se han identificado anticuerpos anti-ICAM-1 tales como RR1/1, R6.5, LB-2 o CL203. Si estos anticuerpos son capaces de inhibir la función de ICAM-1, los mismos tienen que ser capaces de fijarse a un sitio particular en la molécula ICAM-1 que es también importante para la función de ICAM-1. Así pues, por preparación de los mutantes de deleción de ICAM-1 arriba descritos, y determinación de la extensión con la cual los anticuerpos anti-ICAM-1 pueden fijarse a la deleción, es posible determinar si los dominios delecionados son importantes para la función.

\newpage

ICAM-1 es una proteína de membrana integral, cuyo dominio extracelular está compuesto, según se ha predicho, por cinco dominios C semejantes a Ig. Para identificar los dominios involucrados en la fijación de LFA-1, se delecionaron el dominio 3 y los dominios 4 y 5 (terminal carboxilo) por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y se ensayaron funcionalmente después de la expresión en células COS. Adicionalmente, se delecionó el dominio citoplásmico entero para averiguar su influencia potencial en las interacciones de ICAM-1. Como era de esperar, la deleción del dominio citoplásmico, Y476/* demostró la inexistencia de pérdida de reactividad de RR1/1, R6.5, LB-2 y CL203, mientras que la deleción del dominio 3, F185-R451 dio como resultado una disminución y pérdida de reactividad de CL203, respectivamente (Figura 20). Así pues, parece ser que el epítope CL203 está localizado en el dominio 4, mientras que RR1/1, R6.5 y LB-2 parecen estar localizados en los dos dominios amino-terminales.

La totalidad de los tres mutantes de deleción demuestran niveles de adherencia del tipo salvaje a LFA-1 (Figura 21). Se generaron también sustituciones de aminoácidos en las vueltas \beta predichas de los dominios 1, 2 y 3 y se ensayaron funcionalmente después de la expresión en células COS. El epítope R6.5 se localizó así en la secuencia E111GGA del dominio 2 y puede implicar también E39 en el dominio 1, mientras que RR1/1 y LB- 2 son ambos dependientes de R13 en el dominio 1 (Figura 22). Adicionalmente, la fijación de RR1/1 se reduce por mutaciones en la secuencia D71GQS. Las mutaciones que eliminan los sitios de glicosilación enlazados a N en N103 y N165 dan como resultado una fijación reducida de RR1/1, R6.5 y LB-2, a LFA-1 HRV. Estas mutaciones parecen afectar al procesamiento, de tal manera que se generan dímeros de ICAM-1.

Otras mutaciones en el dominio 2 ó 3 no daban como resultado una adhesión alterada de LFA-1 (Figuras 23 y 24). Los aminoácidos en el dominio 1, R13 y D60 están implicados ambos con la fijación de LFA-1 (Figura 25).

Así pues, la fijación de LFA-1 y HRV parece ser una función del dominio semejante a Ig amino-terminal de
ICAM-1. La Figura 26 muestra una alineación de los dominios amino-terminales de ICAM.

Claims (3)

1. Un agente anti-inflamatorio para uso en la preparación de una composición farmacéutica a utilizar junto con un fármaco inmunosupresor seleccionado preferiblemente de dexametasona, azatioprina y ciclosporina A para tratamiento se inflamación resultante de una respuesta del sistema específico de defensa, seleccionándose dicho agente anti--inflamatorio de un anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1; un fragmento de un anticuerpo, siendo capaz dicho fragmento de fijarse a ICAM-1; ICAM-1; un derivado funcional de ICAM-1; y un antagonista no inmunoglobulínico de ICAM-1.

2. Un agente anti-inflamatorio para uso en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de inflamación resultante de una respuesta del sistema específico de defensa para ser utilizado junto con un segundo agente seleccionado de: un anticuerpo capaz de fijarse a LFA-1; un derivado funcional de un anticuerpo, siendo dicho derivado funcional capaz de fijarse a LFA-1; y un antagonista no inmunoglobulínico de LFA-1; seleccionándonse dicho agente anti-inflamatorio de un anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1; un fragmento de un anticuerpo, siendo capaz dicho fragmento de fijarse a ICAM-1; ICAM-1; un derivado funcional de ICAM-1; y un antagonista no inmunoglobulínico de ICAM-1.

3. Una composición farmacéutica que comprende:

(a)

un agente anti-inflamatorio seleccionado del grupo constituido por: un anticuerpo capaz de fijarse a ICAM-1; un fragmento de un anticuerpo, siendo capaz dicho fragmento de fijarse a ICAM-1; ICAM-1; un derivado funcional de ICAM-1; y un antagonista no inmunoglobulínico de ICAM-1, y

(b)

al menos un agente inmunosupresor seleccionado del grupo constituido por: dexametasona, azatioprina y ciclosporina A.