ES2201184T3

ES2201184T3 - Vacunas virales mejoradas.

Info

Publication number: ES2201184T3
Application number: ES96913234T
Authority: ES
Inventors: Gale Eugene Smith; James T Mattews; Edwin D Kilbourne; Bert E Johannson; Bethanie E Wilkinson; Andrie I Voznesenky; Craig S Hackett; Franklein Volvovitz
Original assignee: Protein Sciences Corp
Current assignee: Protein Sciences Corp
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2016-04-26
Also published as: DK0830141T3; DE69628834D1; AU5631296A; CA2222283C; EP0830141B1; HK1013595A1; ATE243530T1; CN1189103A; CN1141977C; PT830141E; AU696690B2; US5976552A; CA2222283A1; EP0830141A1; WO1996033738A1; US20020071848A1; DE69628834T2

Abstract

LAS VACUNAS DE VIRUS DE MAMIFERO MEJORADAS SON COMBINACIONES QUE CONTIENEN UNA CANTIDAD INMUNOGENICA DE VIRUS INACTIVADOS, TALES COMO EL VIRUS DE LA GRIPE, EL HERPESVIRUS DE LA VARICELLA, EL VIRUS DEL SARAMPION, EL VIRUS DE EPSTEIN BARR, EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO, EL VIRUS DE LA PARAINFLUENZA 3, EL VIRUS DEL HERPES SIMPLEX DE TIPO I, Y EL VIRUS DEL HERPES SIMPLEX DE TIPO 2, Y UNA CANTIDAD INMUNOGENICA DE UNA PROTEINA RECOMBINANTE DE LA ENVUELTA DEL VIRUS PURIFICADA, O UN FRAGMENTO O UN PRECURSOR DE LA PROTEINA. COMO ALTERNATIVA, CONTIENEN EL VIRUS INACTIVADO Y/O ANTIGENOS DE LA PROTEINA DE LA ENVUELTA, Y UN ADYUVANTE TAL COMO UN FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS LA GRIPE SE PREPARA COMBINANDO VIRUS INACTIVADOS, PREFERIBLEMENTE TRES CEPAS DEL VIRUS, Y HEMAGLUTININA, PREFERIBLEMENTE UNA COMBINACION DE LAS RESPECTIVAS HEMAGLUTININAS PARA CADA UNA DE LAS TRES CEPAS PRESENTES. EN OTRA REALIZACION, SE PREPARA UNA VACUNA CONTRA LA GRIPE COMBINANDO EL VIRUS INACTIVADO, DE NUEVO PREFERIBLEMENTE TRES CEPAS DEL VIRUS, Y NEURAMIDASA, PREFERIBLEMENTE UNA COMBINACION DE LAS RESPECTIVAS NEURAMIDASAS PARA CADA UNA DE LAS TRES CEPAS PRESENTES. EN UNA TERCERA REALIZACION, LA VACUNA CONTIENE VIRUS INACTIVADOS Y HEMAGLUTININA Y NEURAMIDASA, PREFERIBLEMENTE UTILIZANDO TRES CEPAS PARA CADA UNA. EN ESTAS REALIZACIONES SE AÑADE OPCIONALMENTE EL FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS

Description

Vacunas vírales mejoradas.

Campo industrial

Esta invención se refiere a vacunas vírales mejoradas para la gripe.

Antecedentes de la invención

La inmunización para la protección frente a enfermedades contagiosas es una de las prácticas de la moderna medicina de más éxito y mayor eficacia en relación con el coste. La viruela ha sido completamente eliminada por vacunación, y la incidencia de muchas otras enfermedades peligrosas tales como polio y difteria ha sido reducida drásticamente a través de programas de inmunización. Sin embargo, las vacunas, especialmente las basadas en la utilización de virus inactivados, tienen una eficacia variable. Por ejemplo, mientras la vacuna de la gripe autorizada se ha comprobado eficaz en más de un 80% en adultos jóvenes, solo es aproximadamente un 60% eficaz en adultos de sesenta y cinco años y mayores y menos de un 50% eficaz en niños por debajo de los dos años. La recientemente autorizada vacuna para la varicela se considera eficaz en un 70%, y no hay actualmente vacunas eficaces frente a muchas enfermedades vírales importantes incluyendo las causadas por virus sincitial respiratorio, virus de parainfluenza 3, Rotavirus y el virus de inmunodeficiencia humana. En algunos casos las vacunas de virus inactivados autorizadas pueden dar lugar a reacciones adversas, lo que ha impedido su uso a las dosis más altas necesarias para mejorar su eficacia.

Las vacunas de virus inactivado confieren protección por estimulación de respuestas inmunes a proteínas encontradas en el virus libre. Los anticuerpos para proteínas de envoltura madura encontradas en el virus libre pueden resultar óptimos para bloqueo de los episodios de infección iniciales (tales como unión de virus a receptor celular y conexión y entrada en una célula) después de la exposición a un virus, pero pueden estar por debajo de ser óptimos una vez que el virus ha entrado en una célula. Una vez infectadas, las células y los viriones inmaduros asociados a la célula contienen precursores a las proteínas de envoltura maduras. Estas proteínas precursoras pueden estimular respuestas inmunes más cerca de óptimas para contener la extensión de la infección y evitar la enfermedad clínica cuando la primera línea de defensa del cuerpo, anticuerpos para virus libre, no previenen por completo a todos los virus de infectar células.

Las vacunas de virus inactivados se producen típicamente a partir de virus que han crecido en células animales, por ejemplo huevos embrionados para gripe, que se inactivan entonces por tratamiento con productos químicos tales como formalina. Vacunas atenuadas para sarampión y varicela son producidas por crecimiento de virus debilitados en cultivos de células. Los avances en la comprensión de la patogénesis de infecciones vírales y tecnología de ADN recombinante han conducido a la identificación y producción de proteínas vírales específicas para su utilización en vacunas vírales de subunidad. Estas han tenido éxito particularmente en la formulación de una vacuna subunidad frente a virus de hepatitis B.

La mayoría de las vacunas autorizadas existentes y vacunas en desarrollo, ya se basen en virus inactivados o en tecnología de ADN recombinante, se apoyan principalmente en respuestas inmunes a los virus maduros, o, en unos pocos ejemplos de vacunas basadas en ADN recombinante experimentales, respuestas inmunes a antígenos encontrados en la forma asociada a células del virus, o células infectadas con virus. Tanto el método de virus muertos como el de virus atenuados, por una parte, y los métodos de ADN recombinante por la otra tienen sus ventajas y sus limitaciones. Aunque los métodos de cultivo de células y huevos embrionados se utilizan para hacer crecer el virus completo de forma barata, no son métodos muy eficaces para producción comercial de las proteínas precursoras de vírales encontradas en las células infectadas y las formas asociadas a células del virus. Esto es debido a que estos métodos actúan como líneas de ensamblado miniatura y, aunque se acumula una gran cantidad de virus maduros en los cultivos de células o los huevos en cualquier momento dado, una cantidad mucho más pequeña de virus está en realidad en proceso de ser ensamblado. Por lo tanto, el virus purificado utilizado para hacer la vacuna, contiene muy pocas, si tiene alguna, proteínas de envoltura precursoras u otras proteínas precursoras. Por otra parte, las glicoproteínas de membranas vírales, ya sea en su forma madura o precursora, se puede producir eficazmente por tecnología de ADN recombinante. Cuando se necesita la estructura conformacional natural para producir anticuerpos funcionales neutralizantes, se prefiere el uso de tecnología recombinante que emplea substratos de células de mamífero o células de insecto. Sin embargo, la producción de proteínas de vacuna vírales en células de insecto o de mamífero por métodos recombinantes es por lo general más cara por miligramo de proteína que los métodos de cultivo de células y de producción de huevos.

Pueden aparecer reacciones adversas de vacunas por impurezas o por propiedades biológicas de las proteínas de vacuna (antígenos) responsables para conferir inmunidad protectora. Por ejemplo, la proteína de huevo contaminante presente en las vacunas de gripe autorizadas puede ser responsable en gran medida de las reacciones adversas asociadas con estos productos. Esta fuente de reacciones adversas se puede reducir o eliminar en vacunas de proteínas de subunidad recombinante.

Las proteínas vírales maduras presentes en vacunas pueden tener propiedades biológicas que sean responsables de reacciones adversas. La captación por células mononucleares y granulocitos de virus de gripe inactivados mediada por hemaglutinina madura puede ser responsable también de reacciones adversas. La glicoproteína de envoltura de VIH madura (gp120) en algunas vacunas experimentales frente a VIH puede unirse al receptor CD4 de linfocitos T4 y alterar la función inmune normal. Sería deseable reducir reacciones adversas potenciales por el empleo de las respectivas proteínas precursoras, por ejemplo, HA0 en el caso de vacunas de gripe y gp160 en el caso de vacunas de VIH, en las preparaciones de vacuna, o a través de otros métodos.

Las proteínas de envolturas vírales en vacunas de virus inactivado están substancialmente glicosiladas. Aunque la glicosilación es importante para mantener la estructura conformacional de estas proteínas, puede reducir también su inmunogenicidad. Estas proteínas, ya sea en la forma madura o de precursor, se pueden producir con radicales de hidratos de carbono encajados utilizando vectores de expresión de baculovirus recombinantes en células de insecto cultivadas. Las proteínas producidas por baculovirus retienen suficiente conformación natural para estimular anticuerpos neutralizantes funcionales y pueden proporcionar inmunogenicidad mayor que las proteínas naturales muy glicosiladas.

La infección por el virus de la gripe da lugar a enfermedades sustanciales y muertes prematuras en todo el mundo. La inmunización con vacunas que comprenden preparaciones de virus de gripe inactivados es actualmente la práctica más útil para reducir la enfermedad de gripe viral. Estas vacunas inactivadas han sido autorizadas por los organismos reguladores de todo el mundo. Confieren protección frente a infecciones y enfermedades por estimulación de la producción de respuestas inmunes a la hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoproteínas (NP, M1) y posiblemente otras proteínas de cepas componentes (Murphy, B.R. y col., N. Eng. J. Med. 268:1329-1332 y Kendal, A.P. y col., J. Infect. Dis., 136: S415-24 (1986). Lo más importante es la producción de anticuerpos neutralizantes a HA (Ada, G.L., y Jones, P.D., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128:1-54 (1986)). Las vacunas inactivadas de las que se dispone hoy dia, tienen, sin embargo, limitaciones, que incluyen una inmunogenicidad y una eficacia por debajo de las óptimas en adultos de 65 años y mayores y niños muy pequeños y una baja utilización debido en parte a mala aceptación por parte de los pacientes en relación con la creencia de que tales vacunas no son muy eficaces y del temor a reacciones adversas (Nichol, K.L. y col., Arch. Int. Med. 152:106-110 (1992)). La percepción de la falta de eficacia procede en parte de las variaciones en la potencia de año en año y la asociación de muchas enfermedades del tracto respiratorio que no son gripe con la gripe.

El virus de la gripe maduro contiene tanto proteínas HA como NA en su envoltura exterior. La NA está presente como trímeros. Cada monómero de HA consiste en dos polipéptidos (HA1 y HA2) unidos por un enlace disulfuro. Estos polipéptidos derivan de la escisión de una proteína precursora individual, HA0, durante la maduración del virus de la gripe. En parte, debido a que estas moléculas están fuertemente plegadas, la HA0 y HA1 y HA2 maduras difieren ligeramente en su conformación y características antigénicas. Además, la HA0 es más estable y resistente de desnaturalización y proteolisis. Recientemente, se ha publicado que HA0 recombinante derivada de cultivo de baculovirus/células de insecto confería inmunidad protectora a la gripe (Wilkinson, B. MicroGeneSys Recombinant Influenza Vaccine, PMA/CBER Viral Influenza Meeting, 8 de diciembre de 1994). Una limitación de vacunas de HA0 recombinante es su incapacidad para estimular respuestas inmunes, frente a antígenos no-HA que pueden proporcionar una protección mayor y más durable, especialmente para poblaciones de alto riesgo que no responden bien a la inmunización.

WO-A-94/01133 se refiere a un método para potenciar la respuesta inmune de un mamífero a una vacuna, tal como una vacuna de hepatitis B o una vacuna de gripe, por administración de una cantidad eficaz de GM-CSF en unión con la vacuna.

Jones y Lin (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. (1994) Vol. 13, Suplemento 2 páginas 47-53) han revisado la utilización de GM-CSF como inmunomodulador y una substancia auxiliar de vacuna.

Webster y col. (J. Immunol (1997) vol. 119/6 páginas 2073-2077) han investigado dos métodos para potenciar la respuesta inmune a vacunas de subunidad de virus de gripe en un modelo animal y han comparado esto con estudios preliminares sobre un método en humanos. Estos señalan que dosis bajas de virus de gripe intactos mezclados con vacunas de subunidad de gripe potencian la respuesta humoral de hamsters y adultos humanos jóvenes a las vacunas de subunidad.

Sería deseable proporcionar preparaciones de vacunas de virus mejoradas que no presentaran tantas limitaciones e inconvenientes como los observados al utilizar las vacunas de las que actualmente se dispone.

Un objeto de la invención es proporcionar vacunas mejoradas para la prevención de infecciones vírales tales como gripe, con eficacia y seguridad mejoradas sobre las vacunas de las que hoy se dispone.

Otro objeto de la invención es proporcionar vacunas de virus que proporcionen una protección mayor y más durable, especialmente para poblaciones de alto riesgo que no responden bien a la inmunización.

Otro y más específico objeto de la invención es proporcionar una vacuna diseñada para optimizar respuestas inmunes observadas tanto con virus libres como con virus asociados a células para proporcionar mejor protección frente a infección y enfermedades.

Otro objeto específico de la invención es proporcionar una vacuna de gripe mejorada.

Compendio de la invención

Vacunas de combinación que contienen al menos dos componentes: una vacuna de gripe inactivada y proteína neuraminidasa de gripe recombinante (NA) o un fragmento o precursor de la misma y métodos para su uso.

La vacuna puede contener también una substancia auxiliar. Las substancias auxiliares preferidas son factores de crecimiento de estimulación de colonias. El factor que estimula colonias de granulocito-macrofago es el preferido en particular en algunos modos de realización.

En un modo de realización, una vacuna de gripe mejorada contiene tres cepas inactivadas del virus y neuraminidasa recombinante de al menos una, y preferiblemente de cada una de tres cepas. Algunos modos de realización de vacunas de gripe contienen tanto hemaglutinina como neuraminidasa. En estos modos de realización, están presentes preferiblemente tres cepas de virus, con al menos dos, y preferiblemente dos a seis de las correspondientes proteínas de envoltura, o fragmentos o precursores de las mismas.

Descripción detallada de la invención Componentes de la vacuna

Las vacunas se preparan a partir de combinaciones de al menos dos componentes: una vacuna de gripe inactivada y una cantidad inmunogénica de una proteína de envoltura recombinante purificada, neuroaminidasa (NA), fragmento o precursor de la mima y, opcionalmente, substancias auxiliares. Los antígenos se producen por una diversidad de métodos que incluyen el uso de células infectadas por virus (cultivos de células o huevos embrionados) o por tecnología de ADN recombinante que incluye vector recombinante vivo (vacunas) o proteína de subunidad recombinante (baculovirus/células de insectos, células de mamífero, levadura, o bacterias).

Sistemas de expresión para antígenos recombinantes

La neuraminidasa (NA es una proteína de la envoltura viral. Las proteínas de envoltura viral y proteínas de envoltura precursoras ("VEP") se pueden producir recombinantemente utilizando cualquiera de los sistema de expresión establecidos, tales como bacterias, levadura, baculovirus y cultivos de células de mamífero. Tal como aquí se emplea, el término "recombinante" se refiere a cualquier proteína o ácido nucleico producidos por cualquier método que emplea manipulaciones de ácido nucleico bien conocidas, ejemplos de las cuales se dan a continuación. Tal como aquí se utiliza, cualquier proteína o ácido nucleico que resulta de, o es expresada por, un ácido nucleico resultante de tales manipulaciones es una proteína o ácido nucleico producidos recombinantemente.

El ADN utilizado para producir VEP puede ser ADN genómico, en cuyo caso puede incluir intrones, o puede ser ADNc que se prepara in vitro a partir de ARNm utilizando una transcriptasa inversa y que contiene cuadros de lectura abiertos. Los métodos de aislamiento, clonación o síntesis de ADN y ADNc son muy conocidos por los expertos en la especialidad. Expresión es el proceso por el cual el ácido nucleico es transcripto y traducido a péptidos. polipéptidos y proteínas. Si el ácido nucleico deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir, si se selecciona una célula huésped eucariótica u organismo apropiados, un empalme de ARNm y subsiguiente glicosilación. Un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plasmidio, un fago, virus recombinante u otro vector que, al ser introducido en células huésped apropiadas, hace que las moléculas de ácido nucleico que han sido clonadas en el vector sean transcriptas y después haya una traducción del ácido nucleico transcrito a un polipéptido. La molécula de ácido nucleico se clona en el vector de tal manera que es ligada operativamente a secuencias reguladoras que efectúan la expresión de las moléculas de ácido nucleico heterólogo. Al tener lugar la expresión en una célula huésped u organismo seleccionados, si las secuencias reguladoras apropiadas se ligan operativamente al ADN o se incluyen en el ADN heterólogo, el producto de expresión puede ser exportado al citoplasma y/o puede ser secretado fuera de la célula huésped.

Los vectores de expresión apropiada son muy conocidos por los expertos en la especialidad e incluyen los que son replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas. Estos vectores de expresión pueden permanecer episomales o pueden integrarse en el genoma de la célula huésped.

En todos los casos, el ADNc de la VEP o gen puede ser insertado en vectores de expresión apropiados que contienen elementos reguladores de la expresión, tales como señales de iniciación de la transcripción, señales de iniciación de la traducción, codón de iniciación, codón de terminación, señales de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación y otros. Los vectores adecuados están disponibles comercialmente de una diversidad de compañías. Después de que los vectores recombinantes que contienen ADN que codifica VEP han sido transfectados a las células huésped, pueden permanecer como ADN extracromosómico o pueden integrarse en el genoma del huésped. En uno u otro caso, pueden dirigir la síntesis de VEP recombinante en las células huésped. Algunos ejemplos para la expresión de genes heterólogos están descritos en Methods in Enzymology, Vol, 153, Capítulos 23 a 34 (Wu y Grossman, eds, Academic Press, 1987). El cultivo a gran escala de las células huésped que sintetizan VEP y la purificación de la proteína puede formar un medio comercial efectivo en costes de producción de VEP. Los métodos de producción de proteínas a gran escala, son muy conocidos por los expertos en la especialidad. En The 1995 Lab Manual Source Book (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1995) se describen muchos métodos y reactivos útiles para expresión recombinante de VEP.

Algunos ejemplos de sistemas de expresión potencialmente útiles para VEP incluyen, sin que quede limitado a ellos, los que utilizan E. coli u otras bacterias como huésped. Muchos ADNc de mamífero han sido expresados en E. coli y muchos vectores de expresión con diferentes promotores, operadores y otros elementos reguladores están disponibles comercialmente. Una contrucción y expresión de vector típica es la descrita por Lin y Tang, J. Biol. Chem. 264: 4482-4489 (1989). La expresión de algunas proteínas eucarióticas en citosol de E. coli produce "cuerpos de inclusión" insolubles y requerirán el replegado de proteína recombinante. Sin embargo, el uso de una secuencia "líder", tal como omp, descrita por Duffaud y col. en Methods in Enzymology 153: 492-506 (Wu and Grossman, eds., Academic Press, 1987), dirigirá el replegado apropiado y también exportará la VEP recombinante al espacio periplásmico de las bacterias.

Alternativamente, se puede emplear levadura como huésped. Los principios para la expresión de VEP recombinante en la levadura son similares a los de la expresión en E. coli. Entre los ejemplos están los proporcionados por Bitter y col. en Methods in Enzymology 153: 516-544 (Wu and Grossman, eds., Academic Press, 1987). Lo mismo que ocurre con E. coli, las células huésped de levadura pueden expresar un gen extraño en el citosol o como proteína secretada. A diferencia de la expresión de E. coli, la expresión secretada en levadura es capaz de glicosilación.

También se pueden utilizar hongos como huésped. Existe un pequeño número de vectores de expresión de hongos que se han utilizado con éxito para expresar genes heterólogos. Los vectores de expresión de hongos existentes se integran por sí mismos en el genoma del huésped después de transfección como indican Cullen y col. en A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses (Butterworth Publishers, Stoneham, MA, 1986). Cuando está presente un líder en el frente de los codones de proteína expresados, las proteínas recombinantes secretadas pueden ser glicosiladas. Algunos ejemplos de expresiones con éxito comprenden quimosina bobina, descrita por Cullen y col. Bio/Technology 5: 369-378 (1987) y una proteasa ácida a partir de diferentes hongos, descrita por Gray y col., Gene 8: 41-53 (1987).

Las células de insecto pueden ser utilizadas como huésped y son las preferidas en algunos modos de realización. Vectores de expresión de baculovirus para la síntesis de genes extraños en células de insecto se han utilizado con éxito para expresión de muchas proteínas eucarióticas y vírales. Este sistema es capaz de glicosilación y puede expresar también proteínas recombinantes a alto nivel. La utilización de este sistema ha sido revisada con algún detalle por Luckow y Summers, Bio/Technology, 11 de setiembre, 1987 y por Luckow en Laboratory Manual for Baculovirus Expression Systems, 1994). La VEP recombinante puede ser expresada también en células de insectos utilizando otros vectores de expresión tales como Entomopoxvirus y virus de polihedrosis citoplásmica (CPV).

Por último, las células de mamíferos pueden servir como huéspedes. Muchos genes heterólogos han sido expresados en células de mamíferos a escala comercial. La producción comercial de activador de plasminógeno de tejido humano recombinante es un ejemplo. La mayoría de estos vectores de expresión contienen 1) o bien un promotor de mamífero, tal como metalocianina u hormona del crecimiento, o promotores vírales, tales como promotor temprano SV40 o repeticiones de terminal largo de genes vírales; 2) señales de poliadenilación; y 3) elementos reguladores apropiados para clonación de E. coli incluyendo genes de resistencia a antibióticos. Después de la inserción del gen de VEP corriente abajo desde el promotor, el vector se puede clonar primero en E. coli, aislarse y transfectarse a células de mamífero. La neomicina, o marcadores de selección resistentes similares pueden co-transfectarse en otro vector o en el mismo vector. Para expresión a alto nivel, es ventajoso un sistema de amplificación de gen. Por ejemplo, el vector de expresión puede contener el gen que codifica dihidrofolato reductasa (dhfr). Cuando se utiliza cepa-dhfr de células de ovario de hamster chino (CHO), se puede co-amplificar el gen clonado con el de dhfr por adaptación de las células transformadas para aumentar la concentración de metotrexato. Los clones transformados que secretan VEP pueden ser identificados por ensayos de enzimas o por ensayos de manchas Western. Entre los ejemplos con éxito de este método se incluyen la síntesis de prorenina recombinante, descrita por Poorman y col., Proteins 1: 139-145 (1986), e interferon inmune humano, descrito por Scahill y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 80: 4654-4658 (1983).

Los métodos para purificar la VEP recombinante son muy conocidos y pueden dividirse por lo general en métodos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio de ión, tamizado de pesos moleculares, cromatografía de líquidos a alta presión, cromatografía de afinidad, y métodos electroforéticos, por ejemplo, electoforesis sobre geles de agarosa o acrilamida y enfocado isoeléctrico. Cualquiera de estos métodos puede adaptarse a la purificación de VEP.

Un método preferido de purificación es la cromatografía de afinidad. En la cromatografía de inmunoafinidad, se inmoviliza un anticuerpo para VEP sobre un substrato cromatográfico, se aplica una mezcla que contiene VEP al substrato en condiciones que permiten al anticuerpo unirse a VEP, se elimina por lavado el material no unido, y la VEP unida se eluye empleando, por ejemplo, desnaturalizantes de proteínas o caotropos, de pH alto o bajo.

Por ejemplo, la VEP se puede purificar por cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo o combinación de anticuerpos inmovilizados tales como los descritos después unidos covalentemente a perlas de agarosa o unidos no-covalentemente a través de un anticuerpo IgM de ratón anti-cabra a perlas de proteína G de Staphylococcus aureus. También puede conseguirse el aislamiento de VEP, por ejemplo por incubación de extractos de células con anticuerpos anti-VEP, descritos después, unidos a una fase sólida, tal como conjugación química a perlas de agarosa. Después de la incubación, se lavan las perlas, se desnaturaliza la proteína y se resuelve sobre gel de poliacrilamida.

Para preparar vacunas, se combinan VEP o fragmentos inmunogénicos de VEP con el respectivo virus inactivado del que deriva la VEP originalmente como se ha descrito antes. El virus inactivado combinado y la preparación de VEP se pueden formular y empaquetar utilizando métodos y materiales conocidos por los expertos en la especialidad de vacunas, ejemplos de los cuales se describen después. Tal como aquí se emplea, un fragmento inmunogénico de una proteína es un fragmento de proteína de al menos cinco a ocho aminoácidos, típicamente de menos de 100 aminoácidos, tiene típicamente menos de 25 a 40 aminoácidos, que elicita una respuesta inmune en un animal o un individuo.

Substancias auxiliares

Se pueden emplear opcionalmente substancias auxiliares y son preferidas en algunos modos de realización Las vacunas de combinación antes descritas pueden combinarse con una substancia auxiliar en una cantidad efectiva para potenciar la respuesta inmunogénica. Una substancia auxiliar común ampliamente utilizada es alumbre, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. La saponina y su componente purificado Quil A, auxiliar completo de Freund y otras substancias auxiliares utilizadas en investigación y aplicaciones de veterinaria tienen toxicidades que limitan su uso potencial en vacunas humanas. También se pueden utilizar preparaciones definidas químicamente tales como dipéptido muramílico, lípido monofosfórilico A, y conjugados de fosfolípidos tales como los descritos por Goodman-Snitkoff, y col. J. Inmunol. 147: 410-415 (1991), que se incorpora aquí como referencia.

Para administración oral, se sabe que una mezcla de cantidades traza de toxina del cólera (CT), ya sea subunidad A de toxina del cólera, subunidad B de toxina del cólera, o ambas, y un segundo antígeno estimulan la inmunidad de mucosas al antígeno co-administrado. Además, hay una respuesta inmune humoral espectacular al segundo antígeno en lugar de la tolerancia inmune que es elicitada por administración oral del antígeno solo. Según esto, la CT suministrada mucosalmente funciona como un poderoso inmunoestimulante o substancia auxiliar de ambas inmunidades mucosal y humoral. Es preferible por lo tanto potenciar la inmunogenicidad de antígeno administrado oralmente por inclusión de CT en la vacuna.

Para la administración parenteral, las substancias auxiliares incluyen dipéptidos muramílicos, tripéptidos muramílicos, citocinas, toxoide de difteria y exotoxina A. Entre las substancias auxiliares comercialmente disponibles se incluyen QS-21® de Cambridge Biosciences, Worcester, MA y lípido monofosforílico A (MPLA) de Ribi Inmunochem.

Son también útiles como substancias auxiliares un grupo de factores de crecimiento conocidos como factores de estimulación de colonias que mantienen la supervivencia, expansión clonal, y diferenciación de células progenitoras hematopoiéticas. El factor de estimulación de colonias granulocito-macrofago (GM-CFS) pertenece a este grupo e induce a células progenitoras parcialmente comprometidas a dividirse y diferenciarse en caminos de granulocito-macrofago. El factor GM-CSF es capaz también de activar granulocitos y macrofagos maduros. Las diversas respuestas celulares (es decir, división, maduración, activación) son inducidas a través de unión del factor GM-CSF a receptores específicos expresados sobre la superficie celular de células diana. Una forma recombinante de GM-CSF es la comercialmente disponible de Immunex Corporation, Seattle, WA que se vende bajo el nombre de LEUKINE®. LEUKINE® es una glicoproteína de 127 amino ácidos caracterizada por tres especies moleculares primarias que tienen pesos moleculares de 19.500, 16.800 y 15.500 daltons. La secuencia de aminoácidos de LEUKINE difiere del GM-CSF humano natural por una substitución de leucina en la posición 23, y la fracción hidrato de carbono puede ser diferente de la proteína natural (LEUKINE Product Insert, Inmunex Corporation, 1992).

GM-CSF ha sido utilizado tradicionalmente para acelerar la recuperación mieloide en pacientes con linfoma no-Hodgkin (NHL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y enfermedad de Hodgkin que reciben transplante de médula ósea autólogo (BMT). Después del BMT autólogo en pacientes con NHL, ALL o enfermedad de Hodgkin, se ha encontrado que el GM-CSF es seguro y eficaz en la aceleración del injertado mieloide, reducción de la duración media de administración de antibiótico, reducción de la duración media de episodios infecciosos y acortamiento de la duración media de la hospitalización. Se ha descubierto recientemente que cuando se da GM-CSF a pacientes de cáncer con antígeno carcinoembriónico recombinante (CEAr) la respuesta inmune a CEAr es substancialmente mayor que cuando los pacientes reciben CEAr solo. En la bibliografía científica está publicado que se pueden transformar células de tumor para expresar GM-CSF. En animales de laboratorio, las respuestas inmunes a estas células transformadas eran superiores a las de células no-transformadas con GM-CSF.

El GM-CSF comercialmente disponible de Immunex Corporation se proporciona como un polvo liofilizado blanco estéril, libre de conservante y es para infusión intravenosa después de reconstitución con 1 ml de agua estéril para inyección, USP (Farmacopea EEUU). El pH de la solución isotónica reconstituida es 7,4\pm0,3. La actividad específica de LEUKINE® es aproximadamente 5x10^{7} unidades que forman colonia por mg en un ensayo de colonias de médula ósea humana normal. Cuando se utiliza como una substancia auxiliar, la LEUKINE se puede reconstituir con agua estéril o con la preparación de vacuna. Si se reconstituye con agua, entonces la LEUKINE se administra por inyección intramuscular en el mismo lugar que la inmunización con la vacuna o se mezcla primero con la preparación de vacuna. La mezcla vacuna/GM-CSF obtenida ya sea por reconstitución de GM-CSF con la preparación de vacuna directamente o por mezcla del GM-CSF reconstituido con agua con la vacuna, se administra entonces por inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. Cada vial de un solo uso de LEUKINE contiene 250 \mug o 500 \mug de GM-CSF humano recombinante derivado de levadura.

En cada uno de los ejemplos anteriores de vacunas vírales de combinación, la formulación final de la vacuna se modifica además por adición de una cantidad efectiva de GM-CSF para aumentar la immunogenicidad. Esto se lleva a cabo por reconstitución del vial de GM-CSF de 500 \mug con 1 ml de la preparación de la vacuna de la combinación descrita. Alternativamente, el vial de 500 \mug de GM-CSF se puede reconstituir con 1 ml de agua estéril y mezclarse 0,5 ml del GM-CSF reconstituido con 0,5 ml de la preparación de vacuna de combinación.

Se pueden obtener 500 \mug de GM-CSF a partir de vial de una sola dosis de 500 \mug de LEUKINE que está comercialmente disponible de Immunex Corporation. A menos que se establezca otra cosa, una cantidad de antígeno preferida es 100 \mug para cada antígeno incluido en la preparación de vacuna.

Vehículos

Se conocen numerosos vehículos para administración de composiciones de vacuna. Entre estos se incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, vehículos líquidos simples y composiciones poliméricas y de lípidos. Los vehículos líquidos simples, tales como agua o solución salina tamponada, se pueden utilizar solos o en combinación con otros vehículos.

El vehículo puede ser también un sistema polimérico de liberación retardada. Los polímeros sintéticos son particularmente útiles en la formulación de una vacuna para efectuar la liberación controlada de antígenos. Un ejemplo de esto es el descrito por Kreuter, Microcapsules y Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, páginas 125-148 (M. Donbrow, ed., CRC Press). El empleo de otras partículas ha demostrado que el efecto auxiliar de estos polímeros depende del tamaño de partícula y de la hidrofobicidad.

La microencapsulación ha sido aplicada a la inyección de productos farmacéuticos microencapsulados para obtener una liberación controlada. Hay una serie de factores que contribuyen a la selección de un polímero particular para microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis de polímero y el proceso de microencapsulación, el coste de los materiales de microencapsulación y proceso, el perfil toxicológico, los requerimientos para cinética de liberación variable y la compatibilidad físico-química del polímero y los antígenos son todos ellos factores que deben ser considerados. Como ejemplos de polímeros útiles se pueden señalar policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres y poliamidas, en particular los que son biodegradables.

Una elección frecuente de un vehículo para productos farmacéuticos y más recientemente para antígenos es poli(d,1-lactida-co-glicólida) (PLGA). Este es un poliéster biodegradable que tiene una larga historia de utilización médica en suturas erosionables, placas para huesos y otras prótesis temporales, donde ha demostrado no ser tóxico. Existe una amplia variedad de productos farmacéuticos, que incluyen péptidos y antígenos, que ha sido formulada en microcápsulas de PLGA. Hay acumulado un cuerpo de datos sobre la adaptación de PLGA para liberación controlada de antígeno, por ejemplo, en la revisión de Eldridge y col, Current Topics in Microbiology and Inmunology 146: 59-66 (1989). El proceso de microencapsulación en PLGA utiliza una separación de fases de una emulsión agua-en-aceite. En este proceso, el virus inactivado y la respectiva VEP de la vacuna de combinación se preparan como solución acuosa y el PLGA se disuelve en un disolvente orgánico adecuado tal como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas dos soluciones inmiscibles se co-emulsionan por agitación a alta velocidad. Se añade entonces un no-disolvente para el polímero, lo que da lugar a precipitación del polímero alrededor de las gotitas acuosas para formar microcápsulas embriónicas. Las microcápsulas se recogen y se estabilizan con uno de entre la selección de agentes poli(alcohol vinílico) (PVA), gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), o metil celulosa y el disolvente se elimina por secado al vacío o extracción del disolvente.

Se pueden utilizar también proteosomas, combinaciones de proteína y liposomas, como vehículos para vacunas de combinación, utilizando el virus inactivado y la VEP correspondiente de las vacunas de combinación como el componente proteína. Los procedimientos y materiales para el uso de proteosomas son los descritos en Lowell y col. Science 240: 800 (1988); Lowell, en New Generation Vaccines (Woodrow and Levine, eds., Marcel Dekker, NY, 1990), Cap. 12, páginas 141-160; y Orr y col., Infect. Immun. 61: 2390 (1993), cuyas directrices se incorporan aquí como referencia.

Se comprenderá por todos los expertos en la especialidad que la composición de vacuna inmunogénica puede contener otros ingredientes fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina o un aceite mineral tal como Drakeol®, Markol® y escualeno, para formar una emulsión, o puede estar en combinación con agentes tampón acuosos, o encapsulada dentro de una cápsula o recubrimiento entérico para proteger la proteína de la degradación mientras pasa a través del estómago.

En un modo de realización preferido, la vacuna se empaqueta en dosis individual para inmunización por administración parenteral, es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea; o administración nasofaríngea, es dicir, administración inntranasal. La dosis eficaz se determina utilizando técnicas convencionales tales como la concentración de anticuerpo. El antígeno puede liofilizarse para re-suspensión en el momento de la administración, o en solución. Si se administra con substancia auxiliar, la substancia auxiliar puede ser administrada en combinación con o en proximidad a la vacuna.

Determinación de respuesta inmunogénica

La inmunidad se mide utilizando ensayos para detectar y cuantificar anticuerpos que se unen a la VEP. La inmunidad celular se mide por un ensayo en el que se determina las respuestas específicas a células T tales como hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) y proliferación de linfocitos. La dosificación se determina por carga del antígeno y por técnicas convencionales para determinar la dosificación y esquemas de administración para cada antígeno, basado en la concentración de anticuerpo elicitada por la administración del antígeno. Tal como aquí se emplea, una dosis eficaz para elicitar una respuesta inmune se considera ser aquella que hace aumentar la concentración de anticuerpo comparando con la de los animales o individuos no tratados, empleando cualquiera de los métodos conocidos de valoración de anticuerpos.

Los anticuerpos circulantes para la VEP recombinante se detectan por inmunoensayo de enzima empleando VEP recombinante como antígeno. Estos ensayos se describen a continuación. Dicho brevemente, se pueden recubrir placas con 1 microgramo de VEP recombinante por pocillo. Se utilizan anticuerpos IgG de cabra anti-perro conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:1.000. Las respuestas inmunes se pueden medir también por inmunofluorescencia (IFA), difusión de agarosa en dos direcciones y por inmuno-manchas Western como describen Liu Shu-xian y col,. SE Asian J. Trop. Med. Pub. Health 24: 61-65 (1993).

En un modo de realización, se preparan vacunas mejoradas de gripe. Se combina una cantidad inmunogénica de virus de gripe inactivado con una cantidad inmunogénica de una proteína de envoltura de virus de gripe recombinante, o un fragmento o un precursor de proteína de envoltura. Por "inmunogénica" se entiende ser capaz de elicitar producción de anticuerpos.

La proteína de envoltura de gripe es neuraminidasa o una mezcla de neuraminidasa y cualquier otra proteína de envoltura de virus de gripe, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa. Las proteínas recombinantes se preparan utilizando medios convencionales como los antes descritos tales como la producción utilizando vectores baculovirus en cultivos de células de insectos, tales como cultivos de células de lepidópteros como describen Powers, D.C. y col. (1995). Alternativamente, las proteínas se pueden preparar empleando sistemas de expresión de mamíferos tales como los que utilizan vectores de expresión de células de COS o células de CHO como describen Ausubel, F.M. y col. Short Protocols in Molecular Biology, 2ª ed., John Wiley, Nueva York, 1992, páginas 16-53 a 16-62. El método baculovirus/lepidóptero se emplea en un modo de realización.

Para la gripe, la vacuna de combinación preferida contiene virus de gripe inactivado para tres cepas de virus en un período epidémico dado, tales como las comercialmente disponibles e ilustrados en los Ejemplos que se dan después Las cepas seleccionadas por FDA y CDC para periodos epidémicos representativos se muestran en la siguiente tabla.

Cepa	1922/93	1993/94	1994/95
H1N1	A/Texas/36/91	A/Texas/36/91	A/Texas/36/91
H3N2	A/Pekín/353/89	A/Pekín/32/92	A/Shandong/9/93
B	B/Panamá/45/90	B/Panamá/45/90	B/Panamá/45/90

La vacuna autorizada frente a cepas H1N1, H3N2 y B seleccionadas por FDA y CDC para el período epidémico es la preferida. En estos modos de realizaciónse emplea una cantidad inmunogénica de NA de al menos una de las cepas seleccionadas en la vacuna de combinación, preferiblemente al menos una de las proteínas de envoltura recombinantes respectivas tales como HA0 o NA (o fragmento o precursor) para cada una de las cepas seleccionadas. Cuando se emplean fragmentos de proteína o precursores en el componente de proteína recombinante, las vacunas pueden contener una mezcla de proteínas y fragmentos o precursores.

En modos de realización alternativos, la vacuna de combinación contiene dos proteínas de envoltura tales como hemaglutinina y neuraminidasa. Cuando la vacuna contiene tres cepas, la vacuna de combinación contiene al menos una hemaglutinina y al menos una neuraminidasa. Los modos de realización preferidos contienen una hemaglutinina que corresponde a cada cepa y una neuroaminidasa para cada cepa.

La cantidad de virus inactivado presente en la vacuna de combinación para cada cepa se ajusta típicamente de manera que la vacuna contenga de aproximadamente 12 a aproximadamente 18 \mug de proteína de envoltura viral para cada cepa; en un modo de realización, la cantidad de virus inactivado se ajusta de manera que la vacuna contiene
15 \mug de HA viral (HA1 + HA2) para cada cepa por dosis. En un modo de realización, se emplea aproximadamente 15 \mug de HA0 recombinante para cada una de las respectivas cepas.

Aunque pueden estar presentes HA0 monomérica u otras formas poliméricas y pueden estar presentes NA monomérica y otras formas de NA, la HA0 preferida utilizada está principalmente en la forma de trímeros y NA en la forma de tetrámeros, con una u otra, o ambas, producidas con vectores de baculovirus recombinantes en cultivos de células de lepidópteros y extraidas y purificadas en condiciones no-desnaturalizantes a una pureza de la menos el 90%.

Una ventaja de la vacuna de gripe inactivada/recombinante de combinación es la expectativa de un menor coste, más seguridad y eficacia que uno u otro producto por si mismo y podrá recibir autorización más rápidamente que la vacuna HA0 recombinante por si misma. La vacuna de combinación será optimizada para estimular la inmunidad a antígenos en los virus libres (por ejemplo HA1, HA2) y a antígenos de virus asociados a células y células infectadas con virus (por ejemplo HA0), y posteriormente optimizada para estimular la inmunidad por inclusión de antígenos glicosilados naturalmente (virus de gripe inactivado) y antígenos glicosilados encajados (HA0 derivada de baculovirus/células de insecto).

Otra ventaja es que, por manipulación del componente virus inactivado y el componente proteína de envoltura, se pueden proporcionar vacunas mejoradas para gripe a los distintos niveles de dosificación requeridos para adultos sanos, y a altos niveles de dosificación para adultos mayores y niños pequeños.

En el caso de vacunas de gripe mejoradas, los requerimientos de autorización por parte de la FDA (Administración de Alimentos y Fármacos) para la vacuna de combinación pueden ser satisfechos por un simple ensayo de equivalencia en vez de pruebas de campo de fase III a escala completa. Los ensayos en grupos de alto riesgo, donde se espera mejorar la eficacia en individuos muy jóvenes o viejos, se simplificará porque los componentes de la vacuna autorizada están contenidos en la vacuna de combinación. Las demandas de ampliación de escala y manufactura no serían tan grandes debido a necesitarse menos antígeno que el que sería necesario para una vacuna de proteína recombinante independiente tal como vacuna de HA0. La incorporación de una substancia auxiliar tal como factor de estimulación de colonias granulocito-macrofago aumenta notablemente la eficacia de las vacunas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para explicar con más detalle e ilustrar la invención y no han de considerarse como limitativos en ningún aspecto. A menos que se indique otra cosa, todas las partes y porcentajes son en peso y se dan basados en el peso de la composición en la etapa de proceso indicada.

Ejemplo 1 Vacunas de gripe de combinación (Solo con propósito comparativo)

Este ejemplo ilustra formulaciones para vacunas de gripe de combinación que emplean cualquiera de las tres vacunas de gripe inactivadas comercialmente disponibles obtenidas y aisladas de embriones de pollo utilizando medios convencionales.

Las tres vacunas de gripe son Fluzone® de Connaught Laboratories (Swiftwater, PA), Fluagen® de Parke Davis (Morris Plains, NJ) y Flushield® de Wyeth Ayerst Laboratories (Philadelphia, PA). Las descripciones de estos productos que incluyen dosificación, que comprenden información, reacciones adversas, método de administración y métodos de producción están publicadas en Physicians Desk Reference, 49 edición, Medical Economics Data Production Company Montvale, NJ, 1995 (páginas 908. 2660. 2740) y en la inserción que acompaña al producto comercial. (También está disponible información adicional sobre el producto de la Food and Drug Administration bajo el acta Freedom of Information Act que incluye las Bases del Sumario para aprobación para cada vacuna de gripe autorizada).

Las vacunas de gripe de combinación de virus inactivado/HA0 recombinante se preparan a partir de una dosis normalizada para adultos de una de las tres vacunas de gripe autorizadas antes mencionadas por adición de 0,5 ml de antígeno trivalente HA0 en solución salina tamponada con fosfato a pH 7, preparada como describe Powers D.C. y col. (1995). De forma breve, el HA0 recombinante se produce en cultivos de células de Lepidópteros después de la infección con un vector baculovirus que contiene insertado ADNc que codifica el gen de HA. La proteína expresada se purifica en condiciones no-desnatualizantes a más del 95%, medido por densitometría de exploración cuantitativa del antígeno en volumen electroforizado sobre geles de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida. La identidad del péptido se confirma por análisis de amino ácidos, secuenciado de terminal N y análisis de manchas Western con sueros anti-gripe. Se prefiere que el antígeno HA0 esté en forma de trímeros (aunque pueden utilizarse HA0 monomérico u otras formas oligoméricas).

El antígeno trivalente HA0 contiene la respectiva HA0 para cada una de las tres cepas de gripe presentes en la vacuna comercial que se utiliza para hacer la vacuna de combinación durante un período epidémico dado: A/Pekín/353/89. A/Texas/36/91 y B/Panamá/45/90; A/Pekín/32/92, A/Texas/36/91 y B/Panamá/45/90; o A/Shandong/9/93, A/Texas/
36/91 y B/Panamá/45/90. Cada HA0 se ajusta a una concentración final de 30 \mug por ml en la preparación de antígeno, de manera que, después de la adición del antígeno trivalente a la vacuna de virus inactivado, la vacuna de combinación contiene 15 \mug de cada HA0 recombinante.

La vacuna de combinación se administra como dosis única de 1 ml inyectada en el músculo deltoide. Es más eficaz si la inyección se da en el otoño anterior al brote de la epidemia de gripe.

Ejemplo 2 Vacuna de combinación de gripe de alta dosis (solo con propósito comparativo)

Este ejemplo describe una vacuna de combinación de gripe de alta dosis. Para adultos de 65 años y de más edad y niños de menos de dos años, una formulación preferida para las vacunas de gripe de combinación virus inactivado/HA0 recombinante descritas en el Ejemplo 1 contiene 150 \mug de cada HA0 recombinante o 100 \mug de cada HA0 recombinante en lugar de la cantidad de 15 \mug señalada en el Ejemplo 1.

Cada HA0 se ajusta a una concentración final de 300 \mug por ml o 200 \mug por ml en la preparación de antígeno, de manera que, después de la adición del antígeno trivalente a la vacuna de virus inactivado, la vacuna de combinación contiene 150 \mug de cada HA0 recombinante o 100 \mug de cada HA0 recombinante,

Para que las concentraciones de HA0 recombinante lleguen a una concentración de 200 \mug o más, se concentra más el eluato de la etapa de columna final por repetición de esta etapa, pero reduciendo el tamaño de la columna y lecho de resina del relleno en un 50% a 75% y reduciendo proporcionalmente el volumen del agente tampón de elución. Alternativamente, cada HA0 recombinante se concentra por diálisis a presión en una cubeta con agitación.

La dosis preferida de la vacuna de combinación de alta dosis es una dosis individual de 1 ml administrada por inyección intramuscular en el músculo deltoide. Es preferible administrar la inyección en el otoño que precede al brote epidémico.

Ejemplo 3 vacuna de gripe de combinación

Este ejemplo describe una vacuna de gripe de combinación que contiene HA0r y NAr.

El contenido de nuraminidasa de vacunas de gripe inactivada es tendente a la variabilidad, en parte debido a que la concentración de virus inactivado en el producto final se ajusta para producir la concentración deseada de hemaglutinina. Aunque no existe ni un contenido mínimo de neuroaminidasa (NA) requerido por la FDA para vacunas autorizadas en los Estados Unidos, en Europa, es requerida la neuraminidasa para vacunas autorizadas. La adición de una cantidad especificada de NA recombinante a las vacunas autorizadas existentes o a la vacuna de combinación descrita en el Ejemplo 1 o a la vacuna de combinación de alta dosis descrita en el Ejemplo 2, proporciona protección adicional frente a enfermedades de gripe viral.

La NA recombinante se produce utilizando vectores de expresión de baculovirus recombinante y cultivos de células de lepidópteros y se extrae y purifica en condiciones de no-desnaturalización a una pureza de al menos un 90% (aunque se puede utilizar también NA de pureza menor o mayor). El antígeno NA está en la forma de tetrámeros (aunque también pueden emplearse formas oligoméricas o monoméricas de NA).

Las vacunas de gripe de combinación virus inactivado/NA recombinante se preparan a partir de dosis de adulto normalizadas de las vacunas de gripe comercialmente disponibles señaladas en el Ejemplo 1 por adición de 0,5 ml de antígenos trivalentes de NA recombinante en solución salina tamponada con fosfato, pH 7. La preparación de antígenos trivalentes de NA contiene la NA correspondiente a cada una de las tres cepas de gripe presentes en la vacuna comercial que se utilizan para hacer la vacuna de combinación. Cada NA recombinante se ajusta a una concentración final de 10 \mug por ml en la preparación de antígeno, de manera que después de la adición del antígeno trivalente a la vacuna de virus inactivado, la vacuna de combinación contiene 5 \mug de cada NA recombinante.

Las vacunas de gripe de combinación de virus inactivado/HA0 recombinante/NA recombinante se preparan con las vacunas de combinación de virus inactivados/HA0 recombinante descritas en el Ejemplo 1 y las vacunas de combinación de alta dosis descritas en el Ejemplo 2 por adición de antígenos trivalentes de NA recombinante en solución salina tamponada con fosfato, pH 7, a los antígenos trivalentes de HA0 descritos en el Ejemplo. La preparación de antígenos trivalentes HA0/NA se añade como se ha descrito a la vacuna inactivada autorizada. En el caso de vacunas preparadas según la vacuna de combinación descrita en el Ejemplo 1, cada NA se ajusta a una concentración de 10 \mug por ml en la preparación de antígenos trivalentes de HA0/NA, de manera que, después de la adición de antígenos trivalentes a la vacuna de virus inactivado, la vacuna de combinación contiene 5 \mug de cada NA recombinante y 15 \mug de cada HA0 recombinante.

En el caso de vacunas preparadas según las vacunas de combinación descritas en el Ejemplo 2, cada NA se ajusta a una concentración de 100 \mug por ml o a una concentración de 67 \mug por ml, respectivamente, en la preparación de antígenos trivalentes de HA0/NA, de manera que, después de la adición de los antígenos trivalentes a la vacuna de virus inactivado, la vacuna de combinación contiene 50 \mug de cada NA recombinante y 150 \mug de cada HA0 recombinante o 33,5 \mug de cada NA recombinante y 100 \mug de cada HA0 recombinante. Las preparaciones de antígenos trivalentes de NA contienen la NA correspondiente a cada una de las tres cepas de gripe presentes en la vacuna comercial que se utiliza para hacer la vacuna de combinación.

La dosificación de la vacuna de combinación es una dosis individual de 1 ml administrada por inyección intramuscular en el músculo deltoide. Se prefiere que la inyección se dé en el otoño precedente al brote epidémico de gripe.

La descripción anterior está destinada a que la persona especialista en esta técnica sea capaz de poner en práctica la invención, y todas las citas dadas se incorporan expresamente aquí como referencias. No se intenta detallar todas las modificaciones y variaciones posibles que quedarán de manifiesto para el especialista que lea la descripción. Hay que entender, sin embargo, que todas estas modificaciones y variaciones quedan incluidas dentro del alcance de la invención que está definida en las reivindicaciones siguientes. Las reivindicaciones tienen por objeto cubrir los elementos y las etapas indicados en cualquier disposición o secuencia que sea eficaz para satisfacer los objetivos intentados en la invención, a menos que el contexto indique lo contrario.

Claims

1. Una composición de vacuna que comprende una vacuna de gripe inactivada caracterizada porque la composición de vacuna comprende también, como aditivo, una cantidad eficaz de proteína neuraminidasa de gripe recombinante, substancialmente pura (NA) o fragmento o precursor de la misma.

2. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 donde el aditivo comprende una cantidad eficaz de NA de gripe recombinante, substancialmente pura.

3. Una composición de vacuna según las reivindicaciones 1 ó 2 donde la NA se produce por un sistema de expresión de baculovirus en células de insectos cultivadas.

4. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la NA se purifica hasta un 90% o más.

5. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el aditivo incluye un factor de estimulación de granulocito macrofago.

6. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el aditivo incluye hemaglutinina de gripe (HA).

7. Una composición de vacuna según la reivindicación 6 donde la HA se produce por un sistema de expresión de baculovirus en células de insectos cultivadas.

8. Una composición de vacuna según la reivindicación 6 o la reivindicación 7 donde la HA se purifica hasta un 90% o más.

9. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 donde HA es la subunidad de HA0.

10. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la vacuna de gripe inactivada comprende tres cepas de gripe.

11. Una composición de vacuna según la reivindicación 10 que comprende una cantidad eficaz de proteína neuraminidasa de gripe recombinante, substancialmente pura (NA) de al menos una de las cepas de gripe.

12. Una composición de vacuna según la reivindicación 10 que comprende una cantidad eficaz de proteína neuroaminidasa de gripe recombinante, substancialmente pura (NA) de cada una de las tres cepas de gripe.

13. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la vacuna contiene una substancia auxiliar.

14. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la NA está en una relación en peso de aproximadamente 1:3 respecto a hemaglutinina.

15. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su utilización en la vacunación de un mamífero.

16. Una composición de vacuna según la reivindicación 15 donde el mamífero es una persona.

17. Utilización de una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la manufactura de un medicamento para su utilización en un método de inmunización frente a la gripe.