ES2201228T3 - Celula hibrida y su utilizacion para la preparacion de un medicamento destinado a inducir una respuesta inmune contra el tumor. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE UN AGENTE PARA LA INDUCCION DE INMUNIDAD TUMORAL MEDIANTE INYECCION DE CELULAS HIBRIDAS A UN PACIENTE QUE PADECE UNA NEOPLASIA DE LAS CELULAS B.

Description

Célula híbrida y su utilización para la preparación de un medicamento destinado a inducir una respuesta inmune contra el tumor.

La presente invención se refiere a una célula híbrida y su utilización para la inducción de una inmunidad a tumor por inyección en un paciente enfermo de una neoplasia de células B.

Las enfermedades humanas malignas de las células B (neoplasia de células B), por ejemplo el linfoma de células B, tienen todavía un pronóstico muy desfavorable, a pesar de los avances de la quimioterapia y radioterapia en los últimos años. Una curación de estas enfermedades no es posible. Por eso es necesario desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Se han depositado grandes esperanzas en las preparaciones inmunoterapéuticas, mediante las cuales debe determinarse que el sistema inmune del paciente rechace el tumor.

Se sabe que sobre las células tumorales están presentes antígenos asociados a tumor y que principalmente por eso el sistema inmune es capaz de reconocerlos y atacar las células malignas. Sin embargo, los tumores han desarrollado diferentes estrategias que les permiten escapar a la respuesta inmune. Esto lo consiguen por ejemplo mediante una presentación inapropiada de antígenos asociados a tumor y/o a través de una insuficiente activación de las células T específicas de tumor presentes en general.

Las células B malignas, por ejemplo los linfomas de las células B, se caracterizan por el hecho de que poseen un antígeno absolutamente específico de tumor, en concreto el idiotipo de la inmunoglobulina expresada por las mismas. Sin embargo, éste es un inmunógeno muy débil.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo agente para tratar terapéuticamente las enfermedades humanas malignas de las células B.

Este objeto se resuelve según la invención mediante la célula híbrida caracterizada más detalladamente en la reivindicación 1. Algunas realizaciones preferidas de la invención se indican en las reivindicaciones dependientes. La célula híbrida proporcionada según la invención se utiliza para inducir una inmunidad a tumor mediante la inyección de la célula híbrida en un paciente enfermo de una neoplasia de células B, del cual procede la célula B maligna.

La solución de este objeto según la invención pretende inducir una respuesta eficiente de las células T contra el idiotipo, reforzándose su presentación sobre las células presentadoras de antígeno profesionales (APC) y logrando así una activación efectiva de las células T.

La invención se basa en la redirección específica del idiotipo tumoral contra APCs profesionales. Para ello se fusionan células B malignas, por ejemplo células de linfoma extraídas del paciente, con un hibridoma que produce anticuerpos contra proteínas de superficie presentes sobre las APCs. Las células tumorales híbridas se introducen de nuevo en el paciente. De esta manera se consigue lo siguiente:

Las células tumorales híbridas secretan un anticuerpo biespecífico (bsAC), que por un lado contiene la inmunoglobulina específica de tumor (1 cadena H y 1 cadena L) y por otro lado contiene una semimolécula de anticuerpo (1 cadena H y 1 cadena L) que reconoce un antígeno de superficie presente sobre las APCs. En virtud a su unión sobre las APCs, el idiotipo de tumor se internaliza, se procesa y se presenta al sistema inmune en forma de un péptido específico de tumor. Mediante la presentación "profesional" del antígeno tumoral sobre la APC, pueden generarse células T específicas de tumor, a diferencia de la presentación incompleta sobre la célula tumoral. En virtud a la porción xenógena de la célula híbrida, que procede de la molécula asociada a la célula B maligna en la fusión, el hibridoma de ratón o rata, el sistema inmune la reconoce relativamente rápidamente como extraña y la destruye.

Esto ofrece dos ventajas, en concreto la destrucción independiente de estas células artificiales en el paciente y en segundo lugar un reforzamiento adicional de la inmunidad a tumor mediante la fagocitosis de las células lisadas seguida de la presentación final de otros antígenos tumorales. Esto lleva a que pueda alcanzarse una eficacia antitumoral significativamente mejor a través de la inyección de las células híbridas que a través de la inyección de los bsAC producidos y purificados ex vivo.

Tras la fusión de dos células productoras de anticuerpos se produce en general una población mixta de anticuerpos bivalentes con diversos emparejamientos de cadenas H/L. Una importante condición previa para la inyección de células productoras de bsAC en el huésped portador de tumor es la determinación de un emparejamiento H/L preferencial entre cadenas de la misma especificidad. Esto se observa cuando células procedentes de diferentes especies se fusionan entre ellas (procedimiento para la producción de anticuerpos biespecíficos heterólogos, solicitud de patente DE-A-44 19 399, 9 de marzo de 1995). Las células tumorales híbridas a inyectar de nuevo en el huésped expresan la construcción biespecífica deseada con un elevado rendimiento.

El efecto antitumoral no se proporciona sólo a través de la naturaleza xenógena de la célula híbrida, ya que una célula híbrida que secrete un bsAC con un brazo de unión a APC defectuoso, no puede inducir una protección a tumor completa. Sin embargo, la porción xenógena parece ser importante, dado que actúa de forma sinérgica junto al mecanismo de la redirección de idiotipo específica. Estas propiedades xenógenas de la célula híbrida permiten renunciar a una irradiación previa a la inyección. Esto constituye una ventaja frente a los procedimientos de vacunación celular existentes hasta el momento.

Sin embargo, también es posible hacer las células híbridas incompetentes para la replicación antes de la inyección mediante irradiación, sin que se perjudique la expresión del bsAC. Otra ventaja de la inyección de células productoras de bsAC en el paciente reside en la supresión de las costosas etapas de producción y purificación necesarias para la preparación del bsAC en cantidades clínicamente relevantes. Finalmente es importante el hecho de que las células B malignas no tienen que adaptarse al crecimiento del cultivo celular, lo cual es en principio problemático en el caso de tumores humanos. Para fusionar las células con el hibridoma, no se requiere el estadio de división celular.

La célula B maligna que se fusiona con la célula de hibridoma puede ser por ejemplo una célula de leucemia de células B, una célula de linfoma de células B o una célula de plasmacitoma.

La célula de hibridoma procede de la fusión de una célula de linfocito, que produce un anticuerpo contra un antígeno de superficie presente sobre una APC, con una célula de mieloma. El antígeno de superficie puede ser por ejemplo un receptor Fc, un receptor de manosa-5 o un antígeno MHC Clase II. La célula de hibridoma se produce mediante procedimientos conocidos como tal. A modo de ejemplo se remite a la primera publicación de Köhler y Milstein, Nature Band 256, 495-497 (1975) y Römpp, Lexikon Biotechnologie (Enciclopedia de Biotecnología), editorial Georg Thime, Stuttgart, New York, 1992, página 379. En particular pueden utilizarse células de hibridoma ya existentes, incluidas las comerciales, que presenten las características requeridas. Por ejemplo se remite aquí a la línea de hibridoma del receptor Fc 2.4G2 (ATCC HB-197) comercializada por la American Type Culture Collection.

La célula híbrida proporcionada de acuerdo con la invención se administra al paciente en una cantidad terapéuticamente activa, preferentemente junto a un portador y/o coadyuvante compatible, preferentemente después de una purificación. El fármaco proporcionado de acuerdo con la invención, que contiene la célula híbrida según la invención en una cantidad terapéuticamente activa, se administra a un paciente enfermo de una neoplasia de células B, por ejemplo mediante inyección. Las neoplasias de células B son por ejemplo leucemias de células B, linfomas de células B y plasmacitomas.

Las inmunoglobulinas producidas por las células B malignas se ensamblan con la inmunoglobulina de las células de hibridoma productoras de anticuerpos para dar anticuerpos biespecíficos. Estos anticuerpos biespecíficos se ceden preferentemente en el medio circundante. Este anticuerpo biespecífico es capaz de unirse a un antígeno de superficie presente sobre una célula presentadora de antígeno, preferentemente es capaz de unirse a receptores Fc, a receptores de manosa-5 y a antígenos MHC Clase II.

Como estado de la técnica se citan las siguientes referencias bibliográficas, que sin embargo no describen ni sugieren la presente invención.

Snider et al., J. Exp. Med., 1957-1963 (1990) describen que un antígeno (en este caso la lisozima de albúmina de gallina) se convierte en un potente inmunógeno, incluso a bajas dosis y sin adyuvantes, cuando se dirige contra células presentadoras de antígeno. En este trabajo esto sucede con la ayuda de anticuerpos biespecíficos, que por un lado unen el antígeno y con el otro brazo de unión reconocen moléculas de superficie presentes sobre la APC (receptor Fc o MHCII).

Guo et al. Describen en Science 518-520, Band 263, 1994, un modelo de hepatoma de rata. Los animales se vacunan suministrándoles células tumorales híbridas contra el tumor de tipo salvaje, pero no pueden inmunizarse contra un antígeno tumoral definido y específico. Las células híbridas no producen una inmunoglobulina biespecífica que dirige el antígeno tumoral contra las APCs profesionales, sino que la propia célula tumoral híbrida se convierte en una APC. Esto se consigue a través de la fusión de la célula tumoral con células B activadas.

A continuación se describe en detalle la invención con la ayuda de un ejemplo de realización y dos figuras.

Ejemplo

1)

El linfoma de células B A20 procedente de ratón BALB/c (ATCC TIB-208) se fusiona con el hibridoma anti-receptor Fc 2.4G2 (ATCC HB-197). Ambas líneas pueden adquirirse comercialmente bajo el número indicado en la American Type Culture Collection. Para ello se hace al hibridoma sensible a HAT cultivándolo en presencia de 8-azaguanina. Se incuban 5x10^{6} células de la pareja de fusión 30 minutos en yodoacetamida, se lavan y se mezclan con 1,5x10^{7} células sensibles a HAT. La fusión se lleva a cabo mediante una incubación de dos minutos con polietilenglicol 1500. Las células se distribuyen en placas de microvaloración y se lleva a cabo la selección en medio HAT después de dos a tres días.

2)

Se inyecta intraperitonealmente 10^{5} células híbridas (células BiV) a los ratones BALB/c dos veces con un intervalo de 3 semanas. 7 días más tarde se lleva a cabo la inoculación intraperitoneal con 10^{5} células de tumor salvaje (A20). Mediante la preinmunización se alcanza una protección contra tumor de larga duración (véase la figura 1). Incluso se rechaza un nuevo inóculo después de más de 100 días. Una inmunización con 10^{3} células híbridas no conduce al mismo éxito. Las células híbridas que secretan un anticuerpo que ya no es capaz de unirse a las APCs, no muestran actividad antitumoral (BiVneg).

3)

El anticuerpo biespecífico secretado por las células BiV se purifica mediante cromatografía sobre una columna de sefarosa A para proteínas. El bsAC se eluye de la columna con tampón citrato 0,1 M de pH 5,8 y se dializa contra PBS. Se inyecta intraperitonealmente en ratones: 50 \mug del bsAC (proteína BiV) purificado, de la inmunoglobulina monoespecífica del tumor A20 purificada así como una mezcla de 25 \mug de esta inmunoglobulina y 25 \mug del anticuerpo anti-receptor Fc. Después de otra inmunización 21 días más tarde, se inyectan 10^{5} células de tumor nativo con un intervalo de 7 días (Figura 2).

La invención se ha descrito más arriba mediante un ejemplo llevado a cabo en un modelo animal. Los resultados obtenidos pueden transferirse al hombre en virtud de los experimentos de larga duración realizados. La invención se ha descrito más arriba con ayuda de un ejemplo de realización particular. Evidentemente, la invención no se limita a este ejemplo de realización particular, sino que puede modificarse dentro de los límites de las reivindicaciones siguientes.

Claims (14)

1. Célula híbrida que puede obtenerse mediante la fusión de una célula B maligna procedente de un paciente y una célula de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un antígeno de superficie presente sobre una célula presentadora de antígeno (APC).

2. Célula híbrida según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que la célula B maligna es una célula de leucemia de células B, una célula de linfoma de células B o una célula de plasmacitoma.

3. Célula híbrida según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que la célula de hibridoma se ha producido por fusión de una célula de linfocito que produce un anticuerpo contra un antígeno de superficie presente sobre una APC con una célula de mieloma.

4. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que la célula B maligna produce inmunoglobulinas que se ensamblan con la inmunoglobulina de la célula de hibridoma productora de anticuerpo para dar anticuerpos biespecíficos.

5. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el anticuerpo biespecífico se secreta en el medio circundante.

6. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el anticuerpo biespecífico se une a receptores Fc.

7. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el anticuerpo biespecífico se une a receptores de manosa-5.

8. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el anticuerpo biespecífico se une a antígenos MHC Clase II.

9. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que no se hace incompetente para la replicación antes de la inyección en el paciente.

10. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que se hace incompetente para la replicación mediante irradiación antes de la inyección en el paciente.

11. Célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el antígeno de superficie presente sobre la célula presentadora de antígeno es un receptor Fc, un receptor de manosa-5 o un antígeno MHC Clase II.

12. Composición farmacéutica caracterizada por el hecho de que contiene una célula híbrida según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores en una cantidad terapéuticamente activa junto a uno o varios portadores y/o coadyuvantes farmacéuticamente compatibles.

13. Procedimiento para la producción de una célula híbrida según cualquiera o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que una célula B maligna procedente de un paciente se fusiona con una célula de hibridoma que produce un anticuerpo, el cual se une a un antígeno de superficie presente sobre una célula presentadora de antígeno (APC), mediante un procedimiento conocido como tal.

14. Utilización de una célula híbrida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la producción de un fármaco para la inducción de una inmunidad a tumor mediante la inyección de la célula híbrida en un paciente enfermo de una neoplasia de células B, del cual procede la célula B maligna.