ES2201283T3

ES2201283T3 - Microparticulas secadas por pulverizacion como vehiculos terpeuticos para su utilizacion en terapia genica.

Info

Publication number: ES2201283T3
Application number: ES97915601T
Authority: ES
Inventors: Andrew Derek Sutton; Jill Elizabeth Ogden; Richard Alan Johnson
Original assignee: Elan Drug Delivery Ltd
Current assignee: Quadrant Drug Delivery Ltd
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-03
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2017-04-03
Also published as: CA2250478A1; GB9607035D0; DE69722952D1; DK0936902T3; PT936902E; WO1997036578A1; AR007493A1; ATE243027T1; DE69722952T2; EP0936902A1; EP0936902B1; ZA972837B; AU715512B2; AU2302097A; NO984462D0; JP2000507568A; NO984462L

Abstract

SE PRESENTAN MICROPARTICULAS, QUE SON LISAS Y ESFERICAS, Y AL MENOS EL 90% DE LAS MISMAS TIENEN UN TAMAÑO MEDIO DE PARTICULA DE ENTRE 1 Y 10 MI M, LAS MICROPARTICULAS COMPRENDEN UNA MEZCLA BASICAMENTE UNIFORME DE UN AGENTE PARA TERAPIA GENETICA Y UN EXCIPIENTE. POR EJEMPLO, DE ESTA FORMA PUEDE ADMINISTRARSE UN GEN DESNUDO O ENCAPSULADO, UTILIZANDO UN INHALADOR DE POLVO SECO.

Description

Micropartículas secadas por pulverización como vehículos terapéuticos para su utilización en terapia génica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a micropartículas secadas por pulverización y su utilización como vehículos terapéuticos. En particular, la invención se refiere a medios para la administración de agentes para terapia génica.

Antecedentes de la invención

Entre los métodos actuales de aerosolización de fármacos para inhalación se incluyen nebulizadores, inhaladores de dosis controlada y sistemas de inhaladores de polvo seco. La nebulización de soluciones acuosas y suspensiones requiere grandes volúmenes de fármacos e implica la utilización de dispositivos aparatosos y no portátiles.

El método más habitual de administración de agentes terapéuticos al pulmón es mediante el uso de dispositivos basados en propelentes volátiles, habitualmente denominados inhaladores de dosis controlada. Se utiliza una solución de propelente, habitualmente CFC 11, 12 ó 114, que contiene fármaco disuelto, o una suspensión del fármaco en un cartucho presurizado. Se consigue la dosificación apretando un accionador el cual libera un aerosol propelente de una suspensión o solución del fármaco que se transporta hasta las vías respiratorias. Durante su camino hacia los pulmones, el propelente se evapora, proporcionando precipitados microscópicos de la solución o partículas libres de la suspensión. La dosificación es bastante reproducible y barata, y existe una presión medioambiental creciente para reducir el uso de los CFC. Los CFC pronto serán sustituidos por propelentes no destructivos de ozono, denominados hidrofluoroalcanos. Además, la utilización de disolventes CFC sigue siendo, en gran parte, incompatible con muchos fármacos, debido a su susceptibilidad a la desnaturalización y baja estabilidad.

Al mismo tiempo, la tendencia actualmente es utilizar inhaladores de polvo seco (DPI) que contienen fármacos, habitualmente mezclados con un portador, tal como manitol, lactosa o glucosa, lo que facilita la aerosolización y dispersión de las partículas de fármaco. La energía para la desagregación a menudo la suministra el aliento o inspiración de aire a través del dispositivo por parte del paciente.

En la actualidad los fármacos están micronizados, con el fin de reducir el tamaño de partícula. Este enfoque no es aplicable a productos biotecnológicos. En general, éstos están disponibles en cantidades pequeñas y, además, son susceptibles a los métodos utilizados actualmente para secar y micronizar los fármacos, previamente a la mezcla con el portador. Además, es especialmente difícil proporcionar mezclas de fármaco y portador que sean suficientemente fluidas para fluir y dosificarse reproduciblemente en los inhaladores de dosificación múltiple modernos, tal como el Turbohaler (Astra) y el Diskhaler (Glaxo).

La patente WO-A-9116882 describe la utilización del secado por pulverización para producir polvos de lípido/fármaco de medicamentos convencionales para el asma, los cuales, supuestamente, mostraban un efecto de liberación sostenida debido a la presencia del lípido. Las condiciones dadas para el secado por pulverización producen polvo seco de distribución bimodal, con picos en 1 \mum y en 7-10 \mum.

La patente WO-A-8806441 describe la utilización del secado por pulverización de formulaciones de liposoma estable. Se seca por pulverización un aditivo conservante tal como un azúcar junto con el material lipídico. Tras la reconstitución, los liposomas conservan su distribución de tamaños e integridad. Los liposomas estabilizados pueden contener un agente terapéutico, aparentemente para su utilización después del almacenamiento de los liposomas y la extracción del aditivo conservante.

El tamaño óptimo de partícula para la penetración en las regiones alveolares es de 1-5 \mum. La región alveolar ofrece la mayor superficie para la adsorción y acceso al flujo sanguíneo, y por tanto, es deseable que una formulación de polvo seco contenga una gran mayoría de partículas con estas dimensiones. Ha mostrado ser difícil producir partículas en este rango de manera reproducible mediante técnicas de micronización. Aunque preliminarmente se haya dado a conocer la utilización del secado por pulverización para producir polvos inhalables, la primera descripción de las condiciones precisas de un procedimiento que proporciona partículas para su utilización terapéutica, con rangos intercuartiles satisfactoriamente estrechos, en el rango de 1-5 \mum, se encuentra en la patente WO-A-9609814 (Andaris).

Aunque las micropartículas en el rango de 1-5 \mum son de tamaño óptimo para la penetración alveolar cuando se aerosolizan como partículas discretas, no siempre poseen las propiedades principales de flujo de polvos que son necesarias para el rellenado de dispositivos DPI y para la dispensación de dosis. Las partículas de este tamaño son altamente cohesivas y generalmente requerirán partículas de tamaño mayor para conferir las propiedades de flujo en masa requeridas; las partículas de tamaño mayor fluyen mejor. Para los fármacos de poca potencia, la dispensación y mezcla con un portador convencional; por ejemplo lactosa, presentan pocos problemas en términos de reproducibilidad y precisión. Para los fármacos altamente potentes, sin embargo, la mezcla y dispensación exacta se convierte en un verdadero problema. Cuando la dosis de fármaco requerida sea de sólo 1 \mug, contenida en una masa emitida de 12-25 mg, el problema de la dosificación exacta se convierte en un verdadero impedimento al desarrollo de tales fármacos altamente potentes.

Sumario de la invención

Las micropartículas de acuerdo con la presente invención, de las cuales por lo menos el 90% tienen un tamaño de 1-10 \mum, están destinadas a su utilización en terapia génica, y comprenden un material catiónico y una mezcla sustancialmente uniforme de ADN, como agente de terapia génica, y un excipiente.

Las micropartículas de la presente invención pueden formularse con un portador ("portador" se utiliza en este documento para distinguirlo del "excipiente" en las micropartículas). La formulación puede administrarse, por ejemplo, desde un inhalador de polvo seco. Al administrarlo, el portador se dispersa en el flujo de aire; debido a su gran tamaño, se deposita en la boca y garganta. Las micropartículas más pequeñas se dirigen a las vías respiratorias periféricas; al alcanzar el pulmón, el excipiente se disuelve y se pierde su efecto de dilución. El agente terapéutico dispersado se dosifica reproduciblemente en el lugar deseado de administración.

Descripción de la invención

Las micropartículas de la presente invención pueden obtenerse mediante secado por pulverización bajo las condiciones descritas en la patente WO-A-9609814. Las formulaciones que las contienen solucionan alguno de los problemas fundamentales asociados con polvo seco para DPI, en concreto, mezcla pobre de los polvos y limitada exactitud de mezcla y dosificación en el caso de fármacos altamente potentes.

Las partículas del mismo tamaño también son adecuadas para su administración intravenosa, por ejemplo para la administración dirigida al hígado, y para la terapia génica. Las micropartículas solubles preparadas mediante secado por pulverización pueden reticularse, por técnicas conocidas, con este fin. En comparación con, por ejemplo, la administración intravenosa de adenovirus, mediante la invención se consigue una administración dirigida.

Con mayor generalidad, un procedimiento para la preparación de microcápsulas de la invención comprende pulverizar una solución (o dispersión) de excipiente y agente terapéutico, el cual es un material formador de pared, o se utiliza conjuntamente con un material formador de pared. En particular, se ha descubierto que, bajo las condiciones descritas en este documento, y descritas con mayor generalidad en la patente WO-A-9218164, pueden producirse micropartículas esféricas notablemente lisas de diversos materiales. El tamaño de partícula y la distribución de tamaño del producto puede controlarse reproduciblemente dentro de un rango estrecho. Por ejemplo, según análisis Coulter, el 98% de partículas pueden ser menores de 6 \mum, dentro de un rango intercuartil de 2 \mum, y con una variación media del tamaño entre lotes menor a 0,5 \mum. Además, al ensayarse en un inhalador de polvo seco, se consiguió la dosificación reproducible, y la aerosolización posterior, bajo condiciones habituales pero de poco flujo (30 litros/minuto) resultó en una separación excelente de las micropartículas del portador.

El agente terapéutico utilizado en la presente invención está concebido para la terapia génica. Puede ser un gen desnudo o encapsulado. Alternativamente, puede ser una partícula vírica estabilizada por la presencia del excipiente. Son agentes adecuados para su utilización en terapia génica los complejos dirigidos a receptores, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, parvovirus, virus vaccinia, virus herpes y virus Sindbis. Pueden utilizarse complejos de lípido catiónico-ADN.

También pueden administrarse oligonucleótidos antisentido mediante la presente invención. Por ejemplo, puede seleccionarse el oligonucleótido para reducir la actividad de molde de los ARN molde. Nyce y Metzger demostraron que los oligonucleótidos antisentido fosforotioato aerosolizados dirigidos al receptor adenosina A_{1} desensibilizaban a conejos frente a desafíos posteriores con adenosina o alérgeno del ácaro del polvo, y es por tanto, potencialmente útil en el tratamiento del asma, Nature 385:721-5 (1997).

Debido a que el ADN es aniónico, las micropartículas de la invención pueden comprender un material catiónico. En particular, los lípidos catiónicos capaces de formar liposomas cargados positivamente tienen la capacidad de unirse a ADN y pueden utilizarse para la administración de genes a células de mamífero in vitro e in vivo. A modo de ejemplo, el ADN puede encapsularse mediante su unión a dominios lipídicos en una lactosa u otro portador. Idealmente, los dominios lipídicos deberían ser de <1 \mum, y las microcápsulas del orden de 2-5 \mum, para su deposición en las vías respiratorias periféricas. Se ha ensayado el principio utilizando lípidos de control y ADN de control, y aplicando la metodología con el fin de producir una microcápsula activa de plásmido de ADN/lípido/lactosa utilizando los lípidos DC-Chol y DOPE y plásmido marcador.

Otros materiales catiónicos adecuados son el quitosano y la lisina. La lisina tiene una cadena lateral muy polar que está cargada positivamente a pH neutro y que es altamente hidrofílica. Estas propiedades la hacen adecuada para el secado por pulverización conjuntamente con HSA (albúmina de suero humana) con el fin de formar microcápsulas. Se ha conseguido la unión de ADN con éxito en micropartículas que contienen un 5% p/p de 25% lisina:75% HSA.

El quitosano es un polisacárido natural adecuado para aplicaciones biomédicas. La lisozima biodegradará el quitosano in vivo. Mediante la reticulación de la matriz del polímero utilizando calor o métodos químicos, por ejemplo, glicolaldehído, el quitosano se hace menos susceptible a la degradación lisosomal y, de esta manera, adecuado para la administración prolongada de fármacos. El carácter catiónica del quitosano ha demostrado su capacidad de unión al ADN.

El excipiente habitualmente se seleccionará sobre la base de su capacidad de diluir/estabilizar el agente terapéutico, y por sus propiedades como formador de pared. Puede formularse para su secado por pulverización. Entre los excipientes adecuados se incluyen hidratos de carbono, por ejemplo azúcares, tal como glucosa, lactosa y manitol. La \alpha-lactosa y el manitol pueden tener la propiedad particularmente deseable de resistir la absorción de humedad. Ver también la patente EP-A-0372777.

Habitualmente, se seleccionará la cantidad de excipiente en la mezcla de las micropartículas teniendo en cuenta el grado deseado de, por ejemplo, dilución o estabilización. Puede ser de por lo menos el 50% en peso de la mezcla y, a menudo, de por lo menos 70% u 80%.

Puede utilizarse también otro material inerte formador de pared, si se desea, para formar las micropartículas. Tales materiales adecuados son solubles en agua.

Deberían seleccionarse el material formador de pared y las condiciones durante el procedimiento de tal manera que el producto sea suficientemente no tóxico y no inmunogénico bajo las condiciones de utilización, las cuales claramente dependerán de la dosis administrada y de la duración del tratamiento. El material formador de pared puede ser un derivado de almidón, un polímero sintético, tal como tert-butiloxi-carbonilmetil poliglutamato (patente US-A-4888398), o un polisacárido, tal como polidextrosa. En general, el material formador de pared puede seleccionarse entre la mayoría de polímeros hidrofílicos biodegradables y fisiológicamente compatibles, como se describe en mayor detalle en la patente WO-A-9218164.

Las micropartículas son preferentemente solubles en especial para la administración a los pulmones, y preferentemente comprenden un excipiente de hidrato de carbono. Un azúcar puede facilitar la disolución de las micropartículas sobre la superficie pulmonar.

Las micropartículas preferentemente están estabilizadas, en especial para su administración parenteral, por ejemplo se reticulan, por medios químicos o por calor. En este caso, un material formador de pared a utilizar para terapia génica puede ser proteináceo. Por ejemplo, podría ser colágeno, gelatina o (suero) albúmina, en cada caso preferentemente de origen humano (es decir, derivado de humanos, o correspondiente en estructura a la proteína humana). Con la mayor preferencia, es HSA derivado de donaciones sanguíneas o, idealmente, derivado por recombinación a partir de la fermentación de microorganismos (incluyendo líneas celulares), las cuales han sido transformadas o transfectadas con el fin de expresar suero de albúmina recombinante. Se proporcionan detalles adicionales en la patente WO-A-9218164.

Para su utilización en un DPI, pueden mezclarse las micropartículas de la invención con un portador convencional, tal como manitol, lactosa o glucosa (el cual puede ser igual al excipiente). El portador tendrá un tamaño de partícula, y estará en una cantidad, seleccionadas de acuerdo con la utilización aprobada del dispositivo. A modo de ejemplo, pueden mezclarse micropartículas de la invención de 3 \mum, con partículas de lactosa de 80 \mum.

Existen diversas consideraciones al determinar un porcentaje apropiado del agente sobre el total de sólidos en el medio de secado por pulverización. Estos criterios incluyen la dosis del agente en una administración del dispositivo; el peso dispensado de la formulación, es decir, la cantidad de polvos en una administración; y la razón de micropartícula:portador, es decir, la proporción entre microcápsulas y portador.

El procedimiento de secado por pulverización puede controlarse con el fin de obtener microesferas de las características deseadas. De esta manera, puede variarse la presión a la cual se suministra la solución inicial al pulverizador, por ejemplo entre 1,0 x 10^{5} y 10,0 x 10^{5} Pa, preferentemente entre 2 x 10^{5} y 8 x 10^{5} Pa, y con la mayor preferencia, aproximadamente 7,5 x 10^{5} Pa. Pueden variarse otras variables, como se da a conocer posteriormente.

Más del 30%, preferentemente más del 40%, 50%, ó 60%, de las microesferas tienen un diámetro dentro de un rango de 2 \mum, y por lo menos 90%, preferentemente 95% ó 99% como mínimo, tienen un diámetro dentro del rango 1,0-8,0 \mum. El rango intercuartil puede ser de 2 \mum, con una mediana de diámetro de 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ó
6,5 \mum.

De esta manera, por lo menos 30%, 40%, 50% ó 60% de las microesferas pueden tener diámetros dentro del rango 1,5-3,5 \mum, 2,0-4,0 \mum, 3,0-5,0 \mum, 4,0-6,0 \mum, 5,0-7,0 \mum, 6,0-8,0 \mum. Preferentemente, uno de los mencionados porcentajes de microesferas tienen diámetros dentro de un rango de 1,0 \mum, tal como 1,5-2,5 \mum, 2,0-3,0 \mum, 3,0-4,0 \mum, 4,0-5,0 \mum, 5,0-6,0 \mum, 6,0-7,0 \mum ó 7,0-8,0 \mum.

Un producto de la invención puede estar en la forma de microesferas huecas, en las cuales por lo menos 90%, preferentemente 95% ó 99% como mínimo, de las microesferas tienen un diámetro en el rango de 1,0-8,0 \mum.

Para el secado por pulverización, una solución, suspensión, emulsión o dispersión contiene preferentemente 0,1 a 50% p/v, con mayor preferencia aproximadamente 5,0-25,0% de los materiales de las microcápsulas. Aproximadamente 20% es óptimo.

La solución o dispersión (preferentemente solución), a la cual se hace referencia en este documento como "solución inicial", se pulveriza y seca por pulverización por cualquier técnica adecuada que resulte en microesferas o microcápsulas discretas de 1 a 10 \mum de diámetro. Estos valores se refieren a, como mínimo, el 90% de la población de microcápsulas, según mediciones de diámetros con un Coulter Multisizer II. El término "microcápsulas" se refiere a partículas huecas que delimitan un espacio, el cual está lleno de un gas o vapor, pero de ningún material sólido.

La pulverización comprende formar un aerosol de la preparación mediante, por ejemplo, el forzado bajo presión de la preparación a través del interior de, como mínimo, un orificio, o mediante la utilización de un pulverizador centrífugo en un cámara de aire, u otro gas inerte, templado. La cámara debería ser suficientemente grande para que las gotas eyectadas de mayor tamaño no colisionasen contra las paredes antes de su secado. El gas o vapor en la cámara debería estar limpio (es decir, preferentemente estéril y libre de pirógenos), y no ser tóxico al administrarlo al flujo sanguíneo en las cantidades que resultan de la administración de las microcápsulas al utilizarlas. La tasa de evaporación del líquido de la preparación debería ser suficientemente elevada como para formar microcápsulas huecas, pero no tan elevada como para hacer explotar a éstas. Puede controlarse la tasa de evaporación variando la tasa de flujo de gas, la concentración de fármaco y excipiente en la solución inicial, la naturaleza del portador líquido, la tasa de alimentación de la solución y, siendo de mayor importancia, la temperatura del gas con la que se encuentra el aerosol. Con una concentración de albúmina de 15-25% en agua, una temperatura de gas de entrada de, como mínimo, aproximadamente 100ºC, es generalmente suficiente para asegurar que sean huecas, y la temperatura puede alcanzar los 250ºC sin que exploten las cápsulas. Es óptima una temperatura de, aproximadamente, 180-240ºC, con preferencia de, aproximadamente, 210-230ºC, y con la mayor preferencia de, aproximadamente, 220ºC, por lo menos en el caso de la albúmina. Debido a que la temperatura del gas con la que se encuentra el aerosol dependerá también de la tasa a la que se administración el aerosol y del contenido líquido de la preparación proteinácea, la temperatura de salida puede seguirse para asegurar una temperatura adecuada en la cámara. Se ha descubierto que una temperatura de salida de 40-150ºC es adecuada. El control de la tasa de flujo se ha descubierto que es útil para el control de otras variables, tal como el número de partículas huecas intactas.

Debido a la naturaleza termosensible del ADN, sería ventajoso el secado por pulverización con una temperatura de salida baja. Al reducir la temperatura se ha observado un incremento de tamaño. Este incremento de tamaño puede ser debido al mayor contenido en vapor de agua de las microcápsulas, lo cual resulta, a su vez, en la aglomeración de las partículas. Para evitar tal aglomeración es favorable una temperatura de salida de 70ºC.

Más concretamente, las micropartículas de la invención tienen un rango intercuartil máximo de, preferentemente, 3 \mum, más preferentemente de 2 \mum, y con la mayor preferencia, de 1,5 \mum, con respecto a la mediana del tamaño en volumen de partícula. Éste se determina utilizando un contador Coulter. Esto se consigue secando por pulverización en una combinación de tasa de flujo de carga de alimentación baja y altos niveles de pulverización y aire secante. El efecto es el de producir microcápsulas de tamaño muy definido y distribución de tamaño estrecha.

Varios autores han diseñado ecuaciones para definir el tamaño medio de gotita de los pulverizadores neumáticos; una versión simple de las diversas variables que afectan al tamaño medio de gotita es la siguiente:

D = A/(V^{2}\cdot d) ^{a} + B\cdot (M_{aire}/M_{liq})^{-b}

donde

: D = Tamaño medio de gotita

: A = Constante relacionada con el diseño del pulverizador

: B = Constante relacionada con la viscosidad del líquido

: V = Velocidad relativa del aire entre líquido y pulverizador

: d = Densidad del aire

: M_{aire} y M_{liq} = Masa de aire y de líquido

: a y b = Constantes relacionadas con el diseño del pulverizador

Claramente, para cualquier diseño dado de pulverizador, el tamaño de gotita se ve más afectado por la velocidad relativa en el pulverizador y, a la vez, por la relación másica entre aire y líquido. En su uso más habitual de secado, la relación de aire a líquido está en el rango de 0,1-10 y, con estas relaciones, el tamaño medio de gotita es de 15-20 \mum. Para la producción de micropartículas en el rango de tamaños descrito en este documento, la relación de aire a líquido es de, preferentemente, 20:1 a 1000:1. El efecto es la producción, a las relaciones elevadas, de partículas extremadamente pequeñas, en términos comparativos, con distribuciones de tamaño muy estrechas. En el caso de las micropartículas, producidas a las relaciones más bajas de aire a líquido, se producen partículas ligeramente más grandes, aunque, aún así, todavía tienen distribuciones de tamaño estrechas, las cuales son mejores a las de micropartículas producidas mediante técnicas emulsivas.

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La invención permite la manipulación de la naturaleza de las microcápsulas secas, con el fin de optimizar el flujo o propiedades del vehículo, cambiando y reduciendo las fuerzas cohesivas y de adhesión dentro de la preparación de microcápsulas. Por ejemplo, si así se requiere, las microcápsulas pueden hacerse predominantemente positivas o negativas mediante la utilización de materiales monoméricos o poliméricos altamente cargados, por ejemplo, de lisina o polilisina, y de glutamato o poliglutamato, en sistemas sin HSA o en sistemas heterogéneos con HSA y principios activos.

En los Ejemplos, se prepararon formulaciones de polvo seco de vectores génicos adecuados para la administración pulmonar, mediante secado por pulverización utilizando dispositivos de inhalación de polvo seco. Las micropartículas resultantes comprendían el vector génico (complejos de lípidos catiónicos: ADN, o adenovirus) dispersados en el interior de la cáscara del excipiente de azúcar. El componente excipiente de azúcar de las micropartículas permite su disolución sobre la superficie pulmonar, liberando, de esta manera, el vector génico en el sitio óptimo dentro del pulmón.

Los vectores génicos portaban genes "informadores" que codificaban para luciferasa de \beta-galactosidasa para investigar la actividad de ADN mediante el procedimiento de secado por pulverización. Se llevaron a cabo ensayos de transfección génica sobre las formulaciones de polvo seco de ambos tipos de vectores, utilizando métodos de cultivo celular in vitro.

Ejemplo 1

Se reconstituyó el plásmido pCMVLuc (gen promotor CMV:luciferasa) con los lípidos DC-Chol/DOPE a una relación de carga de 5:1.DC-Chol es 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol; DOPE es dioleoil fosfatidiletanol-amina.

Se preparó una carga de alimentación para el secado por pulverización que contenía 1 mg de plásmido ADN, 8 mg de DC-Chol, 8 mg de DOPE y 700 mg de lactosa como excipiente, en 7 ml de agua. La solución de alimentación se secó por pulverización utilizando un secador por pulverización de laboratorio, bajo las siguientes condiciones:

Temperatura de entrada	130ºC
Temperatura de salida	70,1ºC
Presión de pulverización	3,0 bar
Tasa de alimentación	0,75 g/minuto

Se obtuvieron 200 mg de producto secado por pulverización, equivalente a una recuperación del 35%. El análisis del producto acabado con un Coulter LS230 Laser Sizer demostró que las micropartículas de lactosa:lípido catiónico:ADN tenían una mediana de diámetro de partícula (volumen) de 3,8 \mum. Típicamente, los dominios de lípido catiónico:ADN tenían un tamaño inferior a 200 nm.

El análisis de restricción del plásmido ADN extraído de las micropartículas utilizando procedimientos estándar demostró que el patrón de restricción del ADN secado por pulverización era idéntico al del plásmido de control.

Se prepararon dos de tales muestras (1A y 1B). También se prepararon microcápsulas que comprendían solo lactosa (1C) y lactosa:lípido catiónico (1D).

Se cultivaron células A549 (derivadas de un tumor pulmonar humano) en placas de cultivo celular de 60 mm de diámetro. Se sembraron con 5 x 10^{5} células el día antes de la transfección. Para imitar la administración a los pulmones, es decir, la utilización de aerosolización intra-traqueal de polvos, se pulverizaron las micropartículas/microcápsulas como polvo seco sobre la superficie de las células utilizando una jeringa, tras aspiración de medio de cultivo tisular. Se estimó que se había añadido menos de 10 \mug de pCMVLuc ADN a cada placa. Después de 30 minutos, se añadieron 2 ml de medio fresco de cultivo celular. 48 horas después de la transfección, se lisaron las células en 500 \mul de tampón de lisis (Promega), y se midió la actividad luciferasa en alícuotas de 20 \mul de lisado celular.

Los controles positivos fueron DC-Chol/DOPE (40 \mug):pCMVLuc (10 \mug) en el Experimento 1, y Espermidina-Chol/DOPE (40 \mug):pCMVLuc (10 \mug) en el Experimento 2. En la Tabla 1 se muestran los datos de transfección génica, expresados en términos de actividad luciferasa (RLU/minuto). Se proporcionan dos valores en los casos en los que se midió la actividad luciferasa en dos placas independientes.

TABLA 1

Muestra	Experimento 1 (RLU/minuto)	Experimento 2 (RLU/minuto)
Células de control	826	792
	776
Lactosa	830
	736
pCMVLuc	760
	810
Control positivo	8636412	4192473
	9896528	3490039
1A	125984	32084
	180776	241805
1B	2051592	7505
		31604
1C	1392
	1394
1D	878	771

Ejemplo 2

Se reconstituyó un plásmido que portaba el gen de la \beta-galactosidasa (promotor CMV) como "informador" con el lípido DOTAP, es decir, con N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio metilsulfato, y se secó por pulverización con manitol como excipiente. La carga de alimentación contenía 2 mg de plásmido ADN, 10 mg de DOPE y 388 mg de manitol, en 4 ml de diluyente. La solución de alimentación se secó por pulverización utilizando un secador por pulverización de laboratorio bajo las condiciones siguientes:

Temperatura de entrada	130ºC
Temperatura de salida	78ºC
Presión de pulverización	3,0 bar
Tasa de alimentación	0,72 g/minuto

Se obtuvieron 175 mg de producto secado por pulverización, equivalentes a una recuperación del 43,8%. Los análisis del producto secado por pulverización, utilizando un Coulter LS230 Laser Sizer demostraron que las micropartículas tenían una mediana de diámetro (volumen) de 3-6 \mum.

Se utilizaron procedimientos estándar para evaluar la eficiencia de transfección génica. Se sembraron 10^{5} células de melanoma de ratón B16 por pocillo y se incubaron durante 24 horas. Se disolvieron en agua muestras de micropartículas de lípido catiónico:plásmido ADN:manitol que contenían 2 \mug de plásmido ADN y se utilizaron para transfectar las células confluyentes. Los controles fueron 2 \mug de plásmido ADN solo y DOTAP/ADN a 2 \mug de ADN. Se incubaron las células en la solución de transfección durante 4 horas y, a continuación, se cultivaron durante 48 horas adicionales antes de su recolección. Se prepararon extractos de proteínas y se midió en éstos la actividad \beta-galactosidasa. Se muestran las eficiencias de transfección en términos de actividad \beta-galactosidasa en la Tabla 2.

TABLA 2

Muestra	Actividad \beta-galactosidasa	Media	Desviación estándar
	(mU/mg proteína)
Plásmido ADN solo	3,41
	2,32	2,60	0,71
	2,08
DOTAP/ADN	10000,18
	9803,90	9982,33	170,21
	10142,92
Micropartículas de	6530,99
DOTAP/ADN/manitol	5043,20	5546,01	853,08
	5063,85

Ejemplo 3

Se preparó un medio nutritivo que contenía un vector adenoviral (gen luciferasa como molécula indicadora -"informadora"-) a una concentración de 5,3 x 10^{10} IU/ml (7,8 x 10^{10} PFU/ml) en Tris 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, Tween 80 (54 mg/ml) 150 mM, y sacarosa 1 M, a pH 8,5. El medio nutritivo (50 ml), a una concentración de 0,352 g/ml, se secó por pulverización utilizando un secador por pulverización de laboratorio, bajo las condiciones siguientes:

Temperatura de entrada	56ºC
Temperatura de salida	39,9ºC
Presión de pulverización	3,0 bar
Tasa de alimentación	0,75 g/minuto

En la Tabla 3 se resume la recuperación de producto tras el secado por pulverización.

TABLA 3

	Antes del secado por	Después del secado	Recuperación
	pulverización	por pulverización
Masa (g)	17,62	6,46	36,6%
Concentración (IU/ml)	5,3 x 10^{10}	2,6 x 10^{10}	49,0%

Se midió la actividad de transfección génica en la formulación de micropartículas de polvo seco de adenovirus, en un ensayo de cultivo celular in vitro con células A549. Se disolvieron las micropartículas en agua, y se utilizaron muestras equivalentes a 0,5 mg, 2 mg, 5 mg y 20 mg de polvo seco para transfectar las células. Como control se utilizaron adenovirus a una MOI (multiplicidad de infección) de 100 PFU/célula. Todas las muestras se ensayaron por duplicado. Se muestra en la Tabla 4 la eficiencia de transfección génica medida como actividad luciferasa.

TABLA 4

Muestra	Actividad luciferasa (RLU/minuto)
Control adenovirus	17473732	17949356
Control adenovirus	26138380	27845016
+20 mg polvo seco	42104272	42878048
+2 mg polvo seco	13697072	13401940
+0,5 mg polvo seco	5214460	5816246
+5 mg polvo seco	24963076	24989568
Control	760	574
Control	203	183

Estos datos demuestran que el adenovirus conserva una actividad significativa de transfección génica.

Claims

1. Micropartículas, las cuales son lisas y esféricas, de las que por lo menos el 90%, tienen un tamaño de partícula de 1 a 10 \mum, y que comprenden un material catiónico y una mezcla sustancialmente uniforme de ADN como agente para terapia génica, y un excipiente.

2. Micropartículas según la reivindicación 1, en las que el excipiente constituye la mayor parte de la mezcla.

3. Micropartículas según la reivindicación 1 ó 2, susceptibles de ser obtenidas por secado por pulverización de una solución del material catiónico, el agente y el excipiente.

4. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que dicho tamaño de partícula es de 1 a 5 \mum.

5. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tienen un rango intercuartil máximo de 3 \mum.

6. Micropartículas según la reivindicación 5, que tienen un rango intercuartil máximo de 2 \mum.

7. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, susceptibles de ser obtenidas mediante un procedimiento aséptico.

8. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que el excipiente comprende un hidrato de carbono.

9. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que dicho agente es un gen desnudo o encapsulado, o una partícula vírica.

10. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que el material catiónico comprende dominios lipídicos.

11. Composición en partículas de flujo libre que comprende micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y partículas relativamente grandes de un material portador, el cual puede ser igual o diferente al excipiente.

12. Dispositivo inhalador adaptado para la administración de un agente terapéutico a través de las vías respiratorias pulmonares, que comprende una composición según la reivindicación 11.

13. Utilización de ADN capaz de realizar terapia génica, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una dolencia en el que dicho agente actúa desde su administración a través de las vías respiratorias pulmonares, caracterizado porque el medicamento está en forma de micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o en forma de una composición según la reivindicación 11.