ES2201323T3

ES2201323T3 - Nuevas sondas para la deteccion de micobacterias.

Info

Publication number: ES2201323T3
Application number: ES97943786T
Authority: ES
Inventors: Henrik Stender; Kaare Lund; Tina Andresen Mollerup
Original assignee: Dako AS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2017-10-03
Also published as: AU4549997A; DE69723096T2; WO1998015648A1; DK0941365T3; JP2001501825A; US20040265934A1; EP0941365B1; EP0941365A1; US20020137035A1; US20040063110A1; US6753421B2; DE69723096D1; ATE243761T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNAS NUEVAS SONDAS DE PRUEBA DE HIBRIDACION Y MEZCLAS DE ESTAS SONDAS, QUE SIRVEN PARA DETECTAR UNA SECUENCIA OBJETIVO DE UNA O VARIAS MICOBACTERIAS OCASIONALMENTE PRESENTES EN UNA MUESTRA. DICHAS SONDAS PUEDEN DIRIGIRSE HACIA SECUENCIAS OBJETIVO DE ADNR, DE ARNR PRECURSOR O DE ARNR MICOBACTERIANOS, PUDIENDO DICHAS SONDAS FORMAR HIBRIDOS DETECTABLES. DICHAS SONDAS SE DIRIGEN EN ESPECIAL HACIA EL ADNR, EL ARNR PRECURSOR O EL ARNR 5S, 16S O 23S MICOBACTERIANOS. SE UTILIZAN DICHAS SONDAS PARA DETECTAR ESTOS ORGANISMOS EN MUESTRAS DE ENSAYO, COMO POR EJEMPLO UN ESPUTO, UNA TORUNDA DE LARINGE, UN LAVADO GASTRICO O DE BRONQUIOS, UNA BIOPSIA, UN PRODUCTO DE ASPIRACION, UNA EXPECTORACION, UN FLUIDO CORPORAL, (ESPINAL, PLEURAL, PERICARDICO O SINOVIAL O SANGRE, PUS O MEDULA OSEA), ORINA, SECCIONES DE TEJIDOS O UNA MUESTRA DE ALIMENTOS, DE TIERRA Y DE AGUA. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LOS CULTIVOS DE DICHAS MICOBACTERIAS.

Description

Nuevas sondas para la detección de micobacterias.

La presente invención se refiere a novedosas sondas y a mezclas de tales sondas, además del diseño, la construcción y la utilización de tales sondas novedosas o mezclas de las mismas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias, dichas sondas son capaces de detectar ese tipo de organismo(s) opcionalmente presente(s) en una muestra de ensayo, por ejemplo, esputo, tapones de laringe, lavado gástrico, lavados bronquiales, biopsias, aspirados, expectoraciones, fluidos corporales (espinal, pleural, pericárdico, sinovial, sangre, pus, médula ósea), orina, secciones de tejidos como así también muestras de alimentos, tierra, aire y muestras de agua y cultivos de los mismos. La invención se refiere en particular a novedosas sondas y mezclas de las mismas para detectar la presencia de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC, Mycobacterium tuberculosis Complex) y para detectar la presencia de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MOTT, mycobacteria other than mycobacteria of the Mycobacterium tuberculosis Complex). La invención se refiere adicionalmente a equipos portátiles de diagnóstico que comprenden una o más de dichas sondas. Sorprendentemente, las sondas de la presente invención son capaces de penetrar en la pared celular de las micobacterias, haciendo posible el desarrollo de protocolos in situ de fácil y rápida realización.

Antecedentes de la invención

La tuberculosis es una enfermedad que es una amenaza para la vida y sumamente epidémica la cual es causada por la infección con Mycobacterium tuberculosis. La tuberculosis es actualmente la causa infecciosa predominante de la morbidez y mortalidad en el mundo entero, y se estima que mata a aproximadamente tres millones de personas por año. WHO estima que el número anual de casos nuevos de tuberculosis aumentará de 7,5 millones en 1990 a 10,2 millones en el 2000, una escalada que dará como resultado aproximadamente 90 millones de casos nuevos durante esta década. Adicionalmente, se estima que 30 millones de personas morirán de tuberculosis durante la década del '90, lo que equivale a un cuarto de las muertes que se pueden prevenir entre los adultos.

La ocurrencia frecuente de la tuberculosis ha sido muy alta en las partes más pobres del mundo tales como Asia, Africa y América del Sur, aunque en los años recientes también se ha observado un aumento en los países industrializados. Esto parece deberse a una interacción de diversos factores que incluyen, entre otros, patrones de migración, programas contra la tuberculosis pobremente organizados y problemas de nutrición. Por añadidura, una seria amenaza surgirá de la emergencia de nuevas cepas que son resistentes a las drogas o peor, resistentes a múltiples drogas.

Las micobacterias son frecuentemente divididas en micobacterias de tuberculosis, es decir, micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC), y micobacterias no tuberculosas, es decir, micobacterias distintas a aquellas del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT). El grupo de MTC comprende además de M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti. Las micobacterias del grupo de MOTT no son normalmente patógenas para individuos saludables aunque pueden causar la enfermedad en individuos inmunocomprometidos, por ejemplo, individuos infectados con el HIV. Las micobacterias clínicamente relevantes del grupo de MOTT son, en particular, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae, aunque también M. scrofulaceum, M. xenopi y M. fortuitum.

M. avium y M. intracellulare conjuntamente con M. paratuberculosis y M. lepraemurium constituyen el Complejo Mycobacterium avium (MAC, Mycobacterium avium Complex). Extendido con M. scrofulaceum, el grupo es denominado Complejo Mycobacterium avium - intracellulare - scrofulaceum (MAIS, Mycobacterium avium - intracellulare - scrofulaceum Complex).

Es bien sabido que el tratamiento de las infecciones micobacterianas con antibióticos puede conducir a la emergencia de cepas resistentes a la droga. Muchas drogas antibióticas ejercen sus efectos interfiriendo con la síntesis de proteínas o con la transcripción. Los estudios de los mecanismos moleculares que sirven de fundamento a ciertos fenotipos de resistencia a los antibióticos en materiales aislados de micobacteria clínicos han revelado mutaciones en los genes de ARNr. Probablemente se produce el desarrollo de resistencia debido a mutación o mutaciones ubicadas en el gen de ARNr puesto que las micobacterias de crecimiento lento tiene únicamente un solo operón de ARNr. Todas las poblaciones de micobacterias comprenden una minoría de mutantes resistentes a drogas que han surgido por mutación espontánea. Estas micobacterias mutadas normalmente no sobreviven particularmente bien, cuando se ofrece una terapia de una sola droga como tratamiento, las bacterias susceptibles a la droga son eliminadas, y solo las mutantes resistentes sobrevivirán y se multiplicarán, y, así en cierto punto, constituyen la mayoría de la población micobacteriana. La selección de bacterias resistentes a las drogas debido a una terapia farmacológica inadecuada conduce a un estado denominado "resistencia a la droga adquirida". Por el contrario, la expresión "resistencia a la droga primaria" se utiliza para caracterizar una situación en la cual las micobacterias resistentes a la droga pueden ser aisladas de un paciente quien nunca ha sido tratado por infección micobacteriana, y ha sido infectado con micobacterias resistentes a la droga de un individuo que sufre de infección con una bacteria con resistencia a la droga adquirida.

Hoy en día, la resistencia a las drogas se determina, fundamentalmente, fenotípicamente cultivando muestras clínicas, en las cuales se ha demostrado la presencia de micobacterias, en presencia de las drogas individuales. Esto es, desafortunadamente, un procedimiento muy lento y que requiere mucho tiempo ya que el resultado de los estudios de resistencia a las drogas depende del índice de crecimiento de las micobacterias, que es bien sabido que es lento. Por consiguiente, el resultado no esta disponible hasta después de varias semanas.

Si bien la incidencia de la resistencia a las drogas, es, por lo menos no todavía, muy común, no obstante, es muy importante que las cepas resistentes sean identificadas y erradicadas. Por lo tanto, es de suma importancia encontrar un método confiable y que pueda llevarse a cabo rápidamente para el diagnóstico de la resistencia a las drogas.

Actualmente, la detección de las micobacterias por microscopía es el método más frecuente para el diagnóstico. La muestra (por ejemplo, una expectoración) es teñida para determinar la presencia de bacilos a prueba de ácidos utilizando, por ejemplo, tinción de Zieht-Neelsen. Sin embargo, la tinción para determinar los bacilos a prueba de ácidos no proporciona la información necesaria acerca del tipo de infección, sólo si los bacilos a prueba de ácidos están presentes en la muestra, y esto no resulta, por si mismo, suficiente para el establecimiento de un diagnóstico. Las muestras positivas para los bacilos a prueba de ácidos, pueden ser subsiguientemente cultivadas a fin de poder llevar a cabo la identificación de la especie.

Puesto que la tinción de Ziehl-Neelsen no puede ser utilizada para determinar si la infección es causada por micobacterias del grupo de MTC o por micobacterias distintas de las micobacterias del grupo de MTC, una tinción positiva frecuentemente conduce a una aislación muy costosa de todos los pacientes con infección de M. tuberculosis sospechada como así también al tratamiento con medicamentos a los cuales el paciente incluso puede no responder.

Puesto que la sensibilidad de la tinción a prueba de ácidos es solamente de aproximadamente 10^{4} - 10^{5} por cada ml de muestra, las muestras negativas también deberían ser cultivadas ya que los ensayos basados en cultivo son sensibles, y ya que puede ser posible detectar 10-100 organismos por cada muestra, aunque el resultado no se encuentra disponible antes de las 8 semanas de cultivo. Asimismo, la información acerca de la susceptibilidad a las drogas no se encuentra disponible hasta después de 1-3 semanas de ensayo adicional.

Tradicionalmente, se han utilizado diferentes medios sólidos o líquidos (cultivos sesgados Loewenstein Jensen y caldo de cultivo Dubos) para cultivar muestras que contienen micobacterias. Los medios más nuevos incluyen el Sistema de Cultivo ESP Myco Culture System (Difco), MB/BacT (Organon Teknika), Bac Tec (Becton Dickinson) y MGIT (Becton Dickinson). Estos medios de ensayo se basan en detección colorimétrica o por fluorometría de dióxido de carbono u oxígeno producido por el metabolismo micobacteriano, y adaptada a sistemas automatizados para ensayos a gran escala.

La identificación de especies se lleva a cabo, en la actualidad, luego del cultivo utilizando métodos bioquímicos tradicionales o ensayos de hibridación de sondas (por ejemplo, AccuProbe por Gen-Probe Inc., E.U.). Por consiguiente, existe una necesidad en aumento de medios que permiten una distinción más rápida entre micobacterias del grupo de MTC y micobacterias distintas a aquellas del grupo de MTC, y para una identificación de especies adicional de aquellas especialmente micobacterias distintas a aquellas del grupo de MTC.

Una cantidad de nuevos intentos de reemplazar los métodos basados en el cultivo se basan en la tecnología de amplificación molecular. Han surgido diversos métodos, entre los cuales se encuentran la reacción en cadena de polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), la reacción en cadena de ligasa y la amplificación en la que interviene la transcripción. El principio básico de los métodos de amplificación es que una secuencia de ácidos nucleicos específica de las micobacterias es amplificada para incrementar el número de copias de la secuencia específica hasta un nivel donde pueda detectarse el amplicón. En principio, los métodos ofrecen la posibilidad de detectar solamente una secuencia objetivo, por ende, en principio, posibilitando la detección de las micobacterias presentes en bajos niveles. Sin embargo, se ha visto claramente que los métodos de amplificación objetivos no pueden reemplazar a los métodos basados en cultivo ya que solamente las muestras que son positivas por tinción para detectar los bacilos a prueba de ácidos (AFB, acid fast bacilli) dan una sensibilidad satisfactoria. Adicionalmente, existen problemas específicos para cada método. El método de PCR puede dar resultados negativos falsos debido a la presencia de inhibidores tales como hemoglobina. Otro problema surge de la contaminación cruzada de especímenes negativos y/o reactivos con el ácido nucleico amplificado presente en el ambiente de laboratorio lo cual conduce a resultados positivos falsos. Una desventaja es que se necesitan reactivos costosos para llevar a cabo estos ensayos. Por añadidura, se requiere de instrumentación especializada, tornando a estos ensayos principalmente útiles en laboratorios especializados grandes, y generalmente no aplicables en laboratorios clínicos más pequeños.

Las sondas de ácido nucleico para detectar ARNr de micobacterias se han descrito en, por ejemplo, la Patente estadounidense No. 5.547.842, la Solicitud de Patente europea No. 0 572 120 y Patente estadounidense No. 5.422.242.

Considerando la perspectiva y el impacto que tiene la enfermedad, el desarrollo de ensayos de detección de diagnóstico rápidos y preferentemente de ejecución fácil y además posibles desde el punto de vista económico son de suma importancia y serían una herramienta muy valiosa en la lucha contra el esparcimiento de la tuberculosis.

Los ácidos nucleicos peptídicos son pseudo-péptidos con capacidad de unión al ADN. Los compuestos fueron reportados, en primer lugar, en los primeros años de la década del '90 relacionados con una serie de intentos de diseñar análogos de nucleótidos capaces de hibridarse, en forma específica de secuencia, a ADN y ARN, véase el documento WO 92/20702.

La hibridación de sondas de ácido nucleico peptídico a ADN y a ARN se ha demostrado que obedece a las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick, y se ha descubierto que las sondas de ácido nucleico de péptidos se hibridan a un objetivo de ADN o de ARN con mayor afinidad y especificidad que las contrapartes de ácido nucleico. Estas propiedades son atribuidas a la estructura no cargada, en oposición a la estructura cargada del ácido nucleico peptídico y esqueletos de ADN o ARN, respectivamente, y a la alta flexibilidad conformacional de las moléculas de ácido nucleico peptídico. Estas características, conjuntamente con la estabilidad documentada del ácido nucleico peptídico hacia una variedad de nucleasas y proteasas naturales que generalmente degradan el ADN, ARN o las proteínas, invitan a la utilización de sondas de ácido nucleico peptídico como agentes terapéuticos antisentido y abre aplicaciones potencialmente importantes en diagnósticos.

Síntesis de la invención

La presente invención se refiere a novedosas sondas de ácido nucleico peptídico y a mezclas de tales sondas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias opcionalmente presentes en una muestra. De conformidad con la reivindicación 1, las sondas son dirigidas hacia secuencias objetivo de ARNr micobacteriano, secuencias genómicas que corresponden a dicho ARNr (ADNr) y ARNr precursor. El ARNr está presente en una alta cantidad de copias en cada célula, y es por ende un objetivo bien adecuado. Las sondas son, según lo definido en la reivindicación 2, dirigidas adecuadamente hacia secuencias objetivo de ADNr micobacteriano, ARNr precursor, o ARNr 23S, 16S o 5S.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención caracteriza una sonda de ensayo de hibridación y una mezcla de dichas sondas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias de conformidad con la reivindicación 1 y 2. Bajo condiciones de severidad apropiadas, dichas sondas no deberían, hasta ningún grado significativo, reaccionar en forma cruzada con ácido nucleico ribosómico de otros organismos no relevantes, presentes en la muestra de ensayo, en particular otras micobacterias. La reactividad cruzada a organismos que probablemente no estén presentes en la muestra puede no ser importancia. En ensayos in situ que implican el examen por microscopía, es además posible distinguir a las micobacterias de otras bacterias en base a la morfología de estos bacilos.

La invención también se refiere a sondas de ácido nucleico peptídico de conformidad con la reivindicación 3 para obtener una secuencia objetivo y de conformidad con la reivindicación 4 para obtener una sonda.

En otro aspecto, la invención se refiere a novedosas sondas de ácido nucleico peptídico para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del grupo de MTC, y una o más micobacterias distintas a las micobacterias del grupo de MTC, dichas sondas comprenden entre 6 y 30 porciones de ácido nucleico peptídico polimerizadas (reivindicación 5). Las sondas adecuadas de fórmula (I) son reivindicadas en la reivindicación 6.

Las reivindicaciones 7 a 10 y 15 a 24 se refieren a sondas o mezclas de ese tipo de sondas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del grupo de MTC. Las reivindicaciones 11 a 13 y 15 a 24 se refieren a sondas o mezclas de ese tipo de sondas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias que no son las micobacterias del grupo de MTC (grupo de MOTT). La reivindicación 14 se refiere específicamente a sondas para detectar micobacterias resistentes a una droga. Las reivindicaciones 25 a 27 se refieren a la utilización de ese tipo de sondas o mezclas de las mismas.

De conformidad con las reivindicaciones 28 a 34, la presente invención también se refiere a un método para detectar la presencia de micobacterias.

En aun otro aspecto, la presente invención se refiere a un equipo portátil (reivindicación 35 y 36) que comprende al menos una sonda de ácido nucleico peptídico según lo definido en las reivindicaciones 1 a 24.

Las micobacterias son caracterizadas por una pared celular compleja la cual contiene ácidos miólicos, ceras complejas y glicolípidos únicos. En general, los expertos en la técnica reconocen que esta pared provee micobacterias con resistencia extrema al esfuerzo químico y físico en comparación con otras bacterias, y, concordantemente, las hace muy difíciles de penetrar y lisar. La baja permeabilidad de la pared celular es considerada como la razón principal del hecho de que solamente muy pocas drogas son efectivas en el tratamiento de la tuberculosis y de otras infecciones micobacterianas. Según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5.582.985, parece ser que la pared evita adicionalmente la penetración por sondas de ácidos nucleicos. Incluso con sondas cortas (más cortas de 30 ácidos nucleicos), la tinción específica es baja o a menudo inexistente. Los protocolos que permiten que se utilicen sondas de ADN para la hibridación in situ a especies micobacterianas se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5.582.985. Sin embargo, estos protocolos requieren el desparafinado de la pared celular micobacteriana con xileno y el tratamiento enzimático adicional antes del paso de hibridación a fin de tornar a la pared celular micobacteriana permeable a las sondas de ADN.

Los problemas expuestos anteriormente han sido resueltos por completo, sorprendentemente, mediante la utilización de sondas de ácidos nucleicos peptídicos. Sorprendentemente, se ha descubierto que las sondas de ácidos nucleicos peptídicos son capaces de penetrar en la pared celular de las micobacterias, y adicionalmente, esto se produce rápidamente. El experto en la técnica arribaría a la convicción de que sería necesario tratar duramente a las micobacterias antes de llevarse a cabo la hibridación. Por ende, en base a la técnica anterior disponible, hay un fuerte prejuicio contra la realización de la hibridación sin la destrucción previa de la pared celular micobacteriana. Los inventores han demostrado que esto es de hecho e inesperadamente posible. Se ha demostrado que las sondas de la presente invención son capaces de hibridarse a ARNr precursor y ARNr micobacterianos sin un severo tratamiento de las células micobacterianas, evitando de ese modo un riesgo de interferir con la morfología de las células. Utilizando las presentes sondas, son así posibles la detección específica y fácil y, subsiguientemente, el diagnóstico de la tuberculosis y de otras infecciones micobacterianas.

Breve descripción de las figuras

Se han realizado alineaciones de secuencias de ADNr de M. tuberculosis (como un representante del grupo de MTC) y especies relacionadas estrechamente importantes, que incluyen M. avium (como un representante de las micobacterias distintas a aquellas del grupo de MTC) y especies relacionadas estrechamente importantes para los genes del ARNr 23S, 16S y/o 5S (Figuras 1A-1J, 2A-2D, 3, 4A-4L y 5A-B). La alineación para M. bovis y M. intracellulare se basa en parte en las secuencias disponibles al público y en parte a las secuencias obtenidas mediante la secuenciación llevada a cabo en DAKO A/S.

Alineación para el grupo de MTC (23S ADNr)

Las figuras 1A-1J muestran las alineaciones de las secuencias de 23S ADNr de M. tuberculosis (entrada en el GenBank GB:MTCY130, número de acceso Z73902), M. avium (entrada en el GenBank GB:MA23SRNA, número de acceso X74494), M. paratuberculosis (entrada en el GenBank GB:MPARRNA, número de acceso X74495), M. phlei (entrada en el GenBank GB:MP23SRNA, número de acceso X74493), M. leprae (entrada en el GenBank GB:ML5S23S, número de acceso X56657), M. gastri (entrada en el GenBank GB:MG23SRRNA, número de acceso Z17211), M. kansasii (entrada en el GenBank GB:MK23SRRNA, número de acceso Z17212), y M. smegmatis (GB:MS16S23S5, número de acceso Y08453). Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos preferidas deberían incluir por lo menos una nucleobase complementaria de una nucleobase de 23S ARNr de M. tuberculosis dentro de las posiciones 149-158, 220-221, 328-361, 453-455, 490-501, 637-660, 706-712, 762-789, 989, 1068-1072, 1148, 1311-1329, 1361-1364, 1418, 1563-1570, 1627-1638, 1675-1677, 1718, 1734-1740, 1967-1976, 2403-2420, 2457-2488, 2952- 2956, 2966-2969, 3000-3003 y 3097-3106 de la alineación (indicado por marcos gruesos). Las diferencias entre las secuencias de M. avium, M. phlei, M. leprae, M. paratuberculosis, M. gastri y M. kansasii y la de M. tuberculosis en la alineación están indicadas mediante marcos finos.

Alineación para el grupo de MTC (16S ADNr)

Las figuras 2A-2D muestran las alineaciones de las secuencias de 16S ADNr de M. tuberculosis (entrada en el GenBank GB:MTU16SRN, número de acceso X52917), M. bovis (entrada en el GenBank GB:MSGTGDA, número de acceso M20940), M. avium (entrada en el GenBank GB:MSGRRDA, número de acceso M61673), M. intracellulare (entrada en el GenBank GB:MIN16SRN, número de acceso X52927). M. paratuberculosis (entrada en el GenBank GB:MSGRRDH, número de acceso M61680), M. scrofulaceum (entrada en el GenBank GB:MSC16SRN, número de acceso X52924), M. leprae (entrada en el GenBank GB:MLEP16S1, número de acceso X55587), M. kansasii (entrada en el GenBank GB:MKRRN16, número de acceso X15916), M. gastri (entrada en el GenBank GB:MGA16SRN, número de acceso X52919), M. gordonae (entrada en el GenBank GB:MSGRR^{1}6Sl, número de acceso M29563) y M. marinum (entrada en el GenBank GB:MMA16SRN, número de acceso X52920). Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos preferidas deberían incluir por lo menos una nucleobase complementaria de una nucleobase de 16s ARNr de M. tuberculosis dentro de las posiciones 76-79, 98-101, 135-136, 194-201, 222-229, 242, 474, 1136-1145, 1271-1272, 1287-1292, 1313 y 1334 de la alineación (indicado por los marcos gruesos). Las diferencias entre las secuencias de M. bovis, M. avium, M. intracellulare, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. leprae, M. kansasii, M. gastri, M. gordonae y M. marinum y la de M. tuberculosis en la alineación están indicadas mediante marcos finos.

Alineación para el grupo de MTC (5S ADNr)

La figura 3 muestra las alineaciones de las secuencias de 5S ADNr de M. tuberculosis (entrada en el GenBank GB:MTDNA16S, número de acceso x75601), M. bovis (entrada en el GenBank GB:MBRRN5S, número de acceso X05526), M. phlei (entrada en el GenBank GB:MP5SRRNA, número de acceso X55259), M. leprae (entrada en el GenBank GB:ML5S23S, número de acceso X56657) y M. smegmatis (entrada en el GenBank GB:MS16S23S5, número de acceso Y08453). Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos preferidas deberían incluir por lo menos una nucleobase complementaria de una nucleobase de 53 ARNr de M. tuberculosis dentro de las posiciones 86-90 de la alineación (indicado por el marco grueso). Las diferencias entre las secuencias de M. bovis, M. phlei, M. leprae, M. smegmatis y M. luteus y la de M. tuberculosis en la alineación están indicadas mediante marcos finos.

Alineación para micobacterias distintas a aquellas del grupo de MTC (23S ADNr)

Las figuras 4A-4L muestran las alineaciones de las secuencias de 23S ADNr de M. avium (entrada en el GenBank GB:MA23SRNA, número de acceso X74494), M. paratuberculosis (entrada en el GenBank GB:MPARRNA, número de acceso X74495), M. tuberculosis (entrada en el GenBank GB:MTCY130, número de acceso Z73902), M. phlei (entrada en el GenBank GB:MP23SRNA, número de acceso X74493), M. leprae (entrada en el GenBank GB:ML5S23S, número de acceso X56657), M. gastri (entrada en el GenBank GB:MG23SRRNA, número de acceso Z172211), M. kansasii (entrada en el GenBank GB:MK23SRRNA, número de acceso 217212), y M. smegmatis (GB:MS16S23S5, número de acceso Y08453). Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos preferidas deberían incluir por lo menos una nucleobase complementaria de una nucleobase de 23S ARNr de M. avium dentro de las posiciones 99-101, 183, 261-271, 281-284, 290-293, 327-335, 343-357, 400-405, 453-462, 587-599, 637-660, 704-712, 763-789, 1060-1074, 1177-1185, 1259-1265, 1311-1327, 1345-1348, 1361-1364, 1556-1570, 1608-1613, 1626-1638, 1651-1659, 1675-1677, 1734-1741, 1847-1853, 1967-1976, 2006-2010, 2025-2027, 2131-2232, 2252-2255, 2396-2405, 2416-2420, 2474-2478, 2687, 2719, 2809, 3062-3068 y 3097-3106 de la alineación (indicado por los marcos gruesos). Las diferencias entre las secuencias de M. paratuberculosis, M. tuberculosis, M. phlei, M. leprae, M. gastri, M. kansasii y M. smegmatis y la de M. avium en la alineación están indicadas mediante marcos finos.

Alineación para micobacterias distintas a aquellas del grupo de MTC (16S ADNr)

Las figuras 5A-5B muestran las alineaciones de las secuencias de 16S ADNr de M. avium (entrada en el GenBank GB:MSGRRDA, número de acceso M61673), M. intracellulare (entrada en el GenBank GB:MIN16SRN, número de acceso X52927), M. paratuberculosis (entrada en el GenBank GB:MSGRRDH, número de acceso M61680), M. scrofulaceum (entrada en el GenBank GB:MSC16SRN, número de acceso X52924), M. tuberculosis (entrada en el GenBank GB:MTU16SRN, número de acceso X52917), M. bovis (entrada en el GenBank GB:MSGTGDA, número de acceso M20940), M. leprae (entrada en el GenBank GB:MLEP16S1, número de acceso X55587), M. kansasii (entrada en el GenBank GB:MKRRN16, número de acceso X15916), y M. gastri (entrada en el GenBank GB:MGA16SRN, número de acceso X52919), M. gordonae (entrada en el GenBank GB:MSGRR16SI, número de acceso M29563) y M. marinum (entrada en el GenBank GB:MMA16SRN, número de acceso X52920). Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos preferidas deberían incluir por lo menos una nucleobase complementaria de una nucleobase de 16S ARNr de M. avium dentro de las posiciones 135-136, 472-475, 1136-1144, 1287-1292, 1313 y 1334 de la alineación (indicado por los marcos gruesos). Las diferencias entre las secuencias de M. intracellulare, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. kansasii, y M. gastri y la de M. avium en la alineación están indicadas mediante marcos finos.

Resistencia a una droga

La Figura 6 muestra una secuencia de 23S ADNr de M. avium parcial que incluye las posiciones 2550 a 2589 de entrada en el GenBank X74494. Las bases en las posiciones donde las desviaciones de la secuencia del tipo salvaje han sido correlacionadas con la resistencia a macrólido están encuadradas. Las posiciones 2568 y 2569 en la figura corresponden a las posiciones 2058 y 2059, respectivamente, de 23S ARNr de E. coli.

La figura 7 muestra una secuencia de 16S ADNr de M. tuberculosis parcial que incluye las posiciones 441 a 491 y 843 a 883 de entrada en el GenBank X52917. Las bases en las posiciones donde las desviaciones de la secuencia del tipo salvaje han sido correlacionadas con la resistencia a estreptomicina están encuadradas. Las posiciones 452, 473, 474, 477, 865 y 866 en la figura corresponden a las posiciones 501, 522, 523, 526, 912 y 913, respectivamente, de 16S ARNr de E. coli.

Descripción específica

La presente invención provee novedosas sondas para utilizar en ensayos basados en hibridación, rápidos y específicos, sensibles, para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias, dicha secuencia objetivo está ubicada en el ADNr micobacteriano, ARNr precursor o en el 23S, 16S o 5S ARNr. Las sondas a ser utilizadas de conformidad con la presente invención son sondas de ácidos nucleicos peptídicos. Los ácidos nucleicos peptídicos son poliamidas o politioamidas no naturales las cuales pueden unirse a ácidos nucleicos (ADN y ARN). Tales compuestos son descritos en, por ejemplo, el documento WO 92/20702.

Hemos identificado regiones variables adecuadas del ácido nucleico objetivo mediante análisis comparativo de secuencias de ADNr generalmente disponibles y secuencias obtenidas por secuenciación según lo descrito anteriormente. Las computadoras y los programas de computación, que se han utilizado para los propósitos descritos en la presente, están disponibles en el comercio. A partir de dichas alineaciones, se pueden identificar sondas posiblemente adecuadas. Las alineaciones son, por ende, una pauta útil para diseñar sondas con características deseadas.

Cuando se diseñan las sondas, debe tenerse en cuenta las condiciones de ensayo bajo las cuales las sondas han de ser utilizadas. La severidad se selecciona de modo de aumentar al máximo la diferencia en la estabilidad entre el híbrido formado con el ácido nucleico objetivo y aquel formado con el ácido nucleico que no es objetivo. Típicamente, será necesario escoger condiciones de alta severidad para las sondas donde la especificidad depende solamente de una concordancia errónea con secuencias que no son objetivo. Cuantas más concordancias erróneas con secuencias que no son objetivo, menor demanda de condiciones de alta severidad.

Adicionalmente, las sondas deberían ser diseñadas de modo de reducir al mínimo la estabilidad de los híbridos de ácido nucleico que no son objetivo de sonda. Esto puede lograrse minimizando el grado de complementariedad con el ácido nucleico que no constituye un objetivo, es decir, diseñando la sonda para abarcar tantas concordancias erróneas desestabilizantes como sea posible, y/o para incluir tantas adiciones/ supresiones relacionadas con la secuencia objetivo como sea posible. El hecho de que una sonda sea útil para detectar una especie micobacteriana en particular depende hasta cierto grado de la diferencia entre la estabilidad térmica de los híbridos de sonda-objetivo e híbridos de sonda:que no constituyen un objetivo. Sin embargo, para los objetivos de ARNr, la estructura secundaria de la región de la molécula de ARNr en la cual la secuencia objetivo está ubicada también puede ser de importancia. La estructura secundaria de una sonda también debe ser tenida en cuenta. Las sondas deberían ser diseñadas de modo de minimizar su propensión a formar horquillas, auto-dímeros y dímeros en pares si se utiliza una mezcla de dos o más sondas.

Las bases de concordancia errónea en híbridos formados entre sondas de ácidos nucleicos peptídicos y ácidos nucleicos que dan como resultado una inestabilidad térmica superior a las bases de concordancia errónea en dúplex de ácidos nucleicos de las mismas secuencias. Por consiguiente, las sondas de ácidos nucleicos peptídicos exhiben una mayor especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos objetivo determinada que una sonda de ácidos nucleicos tradicional, lo cual es observado como una mayor diferencia en los valores de T_{m} para los híbridos sonda-objetivo y los híbridos sonda- que no constituyen un objetivo. La sensibilidad y la especificidad de una sonda de ácidos nucleicos peptídicos también dependerán de las condiciones de hibridación utilizadas.

La preocupación primaria con respecto a la longitud de las sondas de ácidos nucleicos peptídicos es la especificidad garantizada, es decir, dicha longitud provee suficiente especificidad para una aplicación en particular. La longitud óptima de una sonda de ácidos nucleicos peptídicos que comprende un sitio en particular con diferencias en la composición de bases, por ejemplo, entre las regiones seleccionadas de ARNr micobacteriano, es una concesión entre el patrón general de que sondas más largas aseguran especificidad y sondas más cortas aseguran que las diferencias desestabilizantes en la composición de las bases constituyen una mayor porción de la sonda. Asimismo, debe prestarse la adecuada atención a las condiciones bajo las cuales han de utilizarse las sondas.

Las secuencias de ácidos nucleicos peptídicos están escritas desde el extremo de terminal N de la secuencia hacia el extremo de terminal C. Un extremo de terminal N libre (no sustituido) o un extremo de terminal N que termina con un aminoácido está indicado como H, y un extremo de terminal C libre está indicado como NH_{2} (un grupo carboxamida). Los ácidos nucleicos peptídicos son capaces de hibridarse a secuencias de ácidos nucleicos en dos orientaciones, básicamente, en orientación antiparalela y en orientación paralela. Se dice que el ácido nucleico peptídico se hibrida en la orientación antiparalela cuando el extremo de terminal N del ácido nucleico peptídico está mirando hacia el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos, y que se hibrida en la orientación paralela cuando el extremo de terminal C del ácido nucleico peptídico está mirando hacia el extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos. En la mayoría de las aplicaciones, la hibridación en la orientación antiparalela es preferida ya que la hibridación en la orientación paralela ocurre más bien lentamente y ya que los dúplex formados no son tan estables como los dúplex que tienen hebras antiparalelas. La formación de tríplex con una estequiometría de dos hebras de ácido nucleico peptídico y una hebra de ácido nucleico puede ocurrir si el ácido nucleico peptídico tiene un alto contenido de pirimidina. Dichos tríplex son muy estables, y, por consiguiente, las sondas capaces de formar tríplex pueden ser adecuadas para ciertas aplicaciones.

Principalmente debido a que la hebra de ácido nucleico peptídico está sin cargar, un dúplex de ácido nucleico- ácido nucleico peptídico tendrá una T_{m} superior al correspondiente dúplex de ácido nucleico- ácido nucleico. Típicamente, habrá un aumento en la T_{m} de aproximadamente 1ºC por par de bases en 100 mM de NaCl dependiendo de la secuencia (Egholm y otros (1993), Nature, 365, 566-568).

En contraste con la formación de dúplex de ADN-ADN, no se necesita sal alguna para facilitar y estabilizar la formación de un dúplex de ácido nucleico peptídico-ADN o ácido nucleico peptídico-ARN. La T_{m} del dúplex de ácido nucleico peptídico-ADN cambia sólo un poco con el aumento de la concentración iónica. Típicamente, para un 15-mero, la T_{m} descenderá sólo 5ºC cuando la concentración de sales es elevada de 10 mM de NaCl a 1 M NaCl. A baja concentración iónica (por ejemplo, tampón de fosfato 10 mM sin nada de sal agregada), la hibridación de un ácido nucleico peptídico a una secuencia objetivo es posible bajo condiciones donde no se produce formación alguna de dúplex de ADN-ADN estable. Por añadidura, los sitios objetivo que normalmente son inaccesibles pueden tornarse más fácilmente accesibles para hibridación con sondas de ácidos nucleicos peptídicos a baja concentración de sal ya que la estructura secundaria y terciaria de los ácidos nucleicos son desestabilizadas bajo tales condiciones. El uso de sondas de ácidos nucleicos peptídicos, un paso de desestabilización separado o la utilización de sondas desestabilizantes pueden no ser necesarios.

El ARNr es esencial para el adecuado funcionamiento de los ribosomas y por ende la síntesis de proteínas. Los genes que codifican a los ARNr están en eubacterias ubicadas en un operón en el cual el gen de ARN de subunidad pequeña, el gen 16S ARNr, está ubicado lo más cercano al extremo 5' del operón, el gen para el ARN de subunidad grande, el gen 23S ARNr, está ubicado distante al gen de 16S ARNr y el gen 5S ARNr está ubicado lo más cercano al extremo 3' del operón. Los tres genes están separados por regiones espaciadoras en donde pueden encontrarse los genes de ARNt, sin embargo, no hay ninguno en M. tuberculosis. La transcripción primaria del operón de ARNr eubacteriano es clivado por RNaseIII. Este clivado da como resultado la separación del 16S, el 23S y el 5S ARNr en moléculas de ARNr precursoras (moléculas de ARNr pre) las cuales además de la especie de ARNr también contienen secuencias líderes y de cola. El clivado de RNase III primario es normalmente un proceso rápido, mientras que la maduración subsiguiente es sustancialmente más lenta. El ARNr precursor es típicamente más abundante que las especies de ARNm aun más fuertemente expresadas. Por consiguiente, para ciertas aplicaciones, el ARNr precursor puede ser un objetivo de diagnóstico atractivo. A fin de detectar en forma específica el ARNr precursor, una sonda objetivo debería ser dirigida contra secuencias que comprenden al menos parte de las secuencias líderes o de cola. Una sonda objetivo puede ser adicionalmente dirigida contra secuencias de las cuales tanto parte de las secuencias de ARNr líder/cola como maduras son constituyentes.

En general, los pacientes que han contraído una infección micobacteriana son tratados con medicamentos hasta no poder encontrarse ninguna micobacteria en el esputo. Excepto por el cultivo, los métodos actualmente disponibles no permiten una diferenciación clara entre micobacterias vivas y muertas. Esto significa que un paciente puede ser a menudo tratado con medicamentos durante un período de tiempo más largo de lo realmente necesario. Una manera de determinar el progreso del tratamiento sería una herramienta muy valiosa en la lucha de la tuberculosis y de otras enfermedades micobacterianas.

Como la transcripción y la maduración de ARNr son una medida de la viabilidad, la detección del ARNr precursor es una medición adecuada y directa de la viabilidad de las bacterias. Adicionalmente, el ARNr precursor puede ser utilizado para la identificación de drogas antibióticos las cuales reducen o inhiben la transcripción de ARNr. Un ejemplo de ese tipo es la rifampicina. Un inhibidor transcripcional eliminará, en bacterias susceptibles, la nueva síntesis de ARNr y así el grupo de ARNr precursor será evacuado. Sin embargo, en células resistentes, las transcripciones primarias como así también los ARNrs precursores seguirán produciéndose.

Si bien se prefiere la utilización de sondas de ácidos nucleicos peptídicos con direccionamiento hacia ("targeting") las secuencias específicas de ARNr, se entenderá fácilmente que las sondas de ácidos nucleicos peptídicos complementarias de las sondas con direccionamiento hacia el ARNr serán útiles para la detección de los genes que codifican a dicho ARNr (ADNr) específico de secuencia, y las sondas de ácidos nucleicos peptídicos para la detección de ADNr son por ende contempladas por la presente invención. Si bien se prefiere escoger la secuencia de la sonda de modo de permitir que la sonda se hibride a su secuencia objetivo en orientación antiparalela, debe entenderse que las sondas capaces de hibridación en orientación paralela pueden ser construidas a partir de la misma información. La presente invención tiene el propósito de cubrir ambos tipos de sondas.

En el aspecto más amplio, la presente invención se refiere a sondas de ácidos nucleicos peptídicos para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias opcionalmente presentes en una muestra de ensayo, siendo capaz dicha sonda de hibridación a una secuencia objetivo de ADNr micobacteriano, ARNr precursor o ARNr (reivindicación 1).

Las sondas de la invención pueden ser adecuadamente dirigidas a ADNr, ARNr precursor, o a 23S, 16S o 58 ARNr.

De conformidad con la reivindicación 3, las secuencias objetivo, a las cuales la o las sondas de ácidos nucleicos peptídicos son capaces de hibridarse, son obtenibles mediante

(a) comparación de las secuencias de nucleobase de dicho ARNr micobacteriano o ADNr de una o más micobacterias a ser detectadas con la correspondiente secuencia de nucleobase de organismo(s), en particular otras micobacterias, de las cuales deben distinguirse dichas una o más micobacterias,

(b) selección de una secuencia objetivo de dicho ARNr o ADNr la cual incluye al menos una nucleobase que se diferencia de la correspondiente nucleobase del o de los organismos, en particular otras micobacterias, de las cuales se deben distinguir la micobacteria o más micobacterias, y

(c) determinación de la capacidad de dicha sonda de hibridarse a la secuencia objetivo seleccionada para formar híbridos detectables.

Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos son, de conformidad con la reivindicación 4, obtenibles mediante

(b) selección de una secuencia objetivo de dicho ARNr o ADNr la cual incluye al menos una nucleobase que se diferencia de la correspondiente nucleobase del o de los organismos, en particular otras micobacterias, de las cuales se deben distinguir la micobacteria o más micobacterias,

(c) síntesis de dicha sonda, y

(4) determinación de la capacidad de dicha sonda de hibridarse a la secuencia objetivo seleccionada para formar híbridos detectables.

Las sondas son en particular adecuadas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) o para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra. Dicha sonda comprende entre 6 y 30 porciones de ácidos nucleicos peptídicos polimerizados, siendo capaz dicha sonda de hibridarse a una secuencia objetivo de ADNr micobacteriano, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr que forman híbridos detectables (reivindicación 5). De conformidad con la reivindicación 6, las sondas de ese tipo pueden comprender porciones de ácidos nucleicos peptídicos de fórmula (I)

1

en la cual cada X e Y designan en forma independiente O u S,

cada Z designa en forma independiente O, S, NR^{1}, o C(R^{1})_{2}, donde cada R^{1} designa en forma independiente H, alquilo C_{1-6}, alquenilo C_{1-6}, alquinilo C_{1-6},

cada R^{2}, R^{3} y R^{4} designa en forma independiente H, la cadena lateral de un aminoácido de presentación natural, la cadena lateral de un aminoácido de presentación no natural, alquilo C_{1-4}, alquenilo C_{1-4} o alquinilo C_{1-4}, o un grupo funcional, cada Q designa en forma independiente una nucleobase de presentación natural, una nucleobase de presentación no natural, un intercalador, un grupo de unión a la nucleobase, una etiqueta o H,

y con la condición indicada en la reivindicación 6.

Las sondas pueden ser utilizadas en forma adecuada para detectar una secuencia objetivo micobacteriana específica de una especie, o secuencias objetivo de un grupo de micobacterias tales como MTC, MOTT, MAC o MAIS. Las sondas pueden ser diseñadas adicionalmente de modo de ser capaces de hibridarse a una o más micobacterias resistentes a una droga, o, alternativamente, al correspondiente tipo salvaje. En el diseño de las sondas, las secuencias entre diferentes micobacterias (una o más) pueden ser tomadas en cuenta como así también secuencias de otros organismos relacionados o no relacionados (uno o más).

Según lo mencionado anteriormente, la resistencia a las drogas es una amenaza creciente para la lucha contra la infección micobacteriana. La monoterapia con macrólidos tales como claritromicina y azitromicina a menudo conduce a una resistencia a la droga clínicamente significativa. La claritromicina y la azitromicina son drogas importantes en el tratamiento de infecciones por especialmente M. avium. La comparación entre secuencias 23S ARNr de materiales aislados de M. avium y M. intracellulare con resistencia adquirida a claritromicina y azitromicina y las secuencias 23S ARNr de cepas no resistentes ha revelado que la mayoría de las cepas resistentes tienen mutaciones de un solo punto en el 23S ARNr en las posiciones correspondientes a 2058 y 2059 en 23S ARNr de E. coli. En la secuencia de 23S ARNr de M. avium (número de acceso al GenBank X74494), las bases correspondientes están en la posición 2568 y 2569, respectivamente, según lo mostrado en la Figura 6. Las cepas más susceptibles tienen un residuo A en una de estas posiciones mientras que las cepas resistentes tienen una C, G o T en la posición 2058 (numeración de E. coli correspondiente a 2568 en M. avium con número de acceso al GenBank X74494), o G o C en la posición 2059 (numeración de E. coli correspondiente a 2569 en M. avium con número de acceso al GenBank X74494).

Las mutaciones de un solo punto en ARNr también son responsables, en cierta medida, aparentemente, de la resistencia a la estreptomicina. La estreptomicina, el primer fármaco antibiótico exitoso contra la tuberculosis, es un glicósido de aminociclitol que altera la síntesis proteica en el nivel ribosómico. La base genética para la resistencia a la estreptomicina no ha sido completamente resuelta aun. Sin embargo, ciertas cepas resistentes a la estreptomicina de M. tuberculosis tienen mutaciones de un solo punto en 16S ARNr. Estas mutaciones están situadas en las posiciones correspondientes a las bases 501, 522, 523, 526, 912 y 913 en 16S ARNr de E. coli las cuales corresponden a las bases con los números 452, 473, 474, 477, 865 y 866, respectivamente de 16S ARNr de M. tuberculosis (número de acceso al GenBank X52917) según lo mostrado en la Figura 7. La mayoría de estos nucleótidos mutados están involucrados en las interacciones estructurales dentro del bucle 530 de 16S ARNr la cual es una de las regiones más conservadas en el gen 16S ARNr entero.

Las mutaciones en una región de 81 pb del gen (rpoB) que codifica la subunidad beta de polimerasa de ARN son la causa del 96% de los casos de resistencia a la rifampicina en M. tuberculosis y M. leprae. Las moléculas precursoras de ARNr tienen dominios terminales (colas) que son eliminados durante los últimos pasos en el procesamiento de ARNr precursor para dar las moléculas de ARNr maduras. Los inhibidores transcripcionales tales como rifampicina pueden reducir el ARNr precursor en células sensibles inhibiendo la síntesis de ARNr precursor de novo permitiendo al mismo tiempo que proceda la maduración. Por consiguiente, el ARNr precursor es reducido en células de micobacteria susceptibles mientras que sigue produciéndose en células de micobacteria resistentes cuando las células son expuestas a rifampicina durante el cultivo.

Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis son definidas en las reivindicaciones 7 a 10. Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis son definidas en las reivindicaciones 11 a 13. Las sondas de ácidos nucleicos peptídicos para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias resistentes a una droga del complejo Mycobacterium tuberculosis o de una o más micobacterias resistentes a una droga distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis son definidas en la reivindicación 14.

En el presente contexto y en las reivindicaciones, el término "nucleobases de presentación natural" incluye las cuatro bases de ADN principales (es decir, timina (T), citosina (C), adenina (A) y guanina (G)) como así también otras nucleobases de presentación natural (por ejemplo, uracilo (U) e hipoxantina).

El término "nucleobases de presentación no natural" comprende, entre otras cosas, nucleobases de presentación natural modificadas. Ese tipo de nucleobases de presentación no natural puede ser modificado mediante sustitución mediante, por ejemplo, uno o más grupos alquilo C_{1-8}, alquenilo C_{1-8} o alquinilo C_{1-8} o etiquetas. Ejemplos de nucleobases de presentación no natural son purina, 2,6-diamino purina, 5-propinilcitosina (C propinilo), isocitosina (iso-C), 5-metil-isocitosina (Iso^{Me}C) (véase, por ejemplo, Tetrahedron Letters Vol. 36, No. 12, 2033-2036 (1995) o Tetrahedron Letters Vol. 36, No. 21, 3601-3604 (1995)), 7-desazaadenina, 7-desazaguanina, N^{4}-etanocitosina, N^{6}-etano-2,6-diaminopurina, 5-alquenil(C_{3-6})uracilo, 5- alquinil(C_{3-6})citosina, 5-fluoruracilo y pseudocitosina.

Ejemplos de intercaladores útiles son, por ejemplo, acridina, antraquinona, psoraleno y pireno.

Ejemplos de grupos de unión a nucleobases útiles son, por ejemplo, grupos que contienen anillos cíclicos o heterocíclicos. Ejemplos no limitativos son 3-nitro pirrol y 5-nitro indol.

Debe entenderse que grupos alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser ramificados o no ramificados, cíclicos o no cíclicos, y pueden estar además interrumpidos por uno o más heteroátomos, o pueden estar insustituidos o sustituidos con, o pueden contener, uno o más grupos funcionales. Los ejemplos no limitativos de ese tipo de grupos funcionales son grupos acetilo, grupos acilo, grupos amino, grupos carbamido, grupos carbamoílo, grupos carbamilo, grupos carbonilo, grupos carboxi, grupos ciano, grupos ditio, grupos formilo, grupos guanidino, halógenos, grupos hidrazino, grupos hidrazo, grupos hidroxamino, grupos hidroxi, grupos ceto, grupos mercapto, grupos nitro, grupos fosfo, grupos fosfono, grupos fosfoéster, grupos sulfo, grupos tiocianato, grupos cíclicos, aromáticos y heterocíclicos.

Los grupos C_{1-4} contienen entre 1 y 4 átomos de carbono, los grupos C_{1-6} contienen entre 1 y 6 átomos de carbono y los grupos C_{1-15} contienen entre 1 y 15 átomos de carbono, no incluyendo los sustituyentes opcionales, heteroátomos y/o grupos funcionales. Los ejemplos no limitativos de tales grupos son -CH_{3}, -CF_{3}, -CH_{2}-, -CH_{2}CH_{3}, -CH_{2}CH_{2}-, -CH(CH_{3})_{2}, -OCH_{3}, -OCH_{2}-, -OCH_{2}CH_{3}, -OCH_{2}CH_{2}-, -OCH(CH_{3})_{2}, -OC(O)CH_{3}, -OC(O)CH_{2}-, -C(O)H, -C(O)-, -C(O)CH_{3}, C(O)OH, -C(O)O-, -CH_{2}NH_{2}, -CH_{2}NH-, -CH_{2}OCH_{3}, -CH_{2}OCH_{2}-, -CH_{2}OC(O)OH, -CH_{2}OC(O)O-, -CH_{2}C(O)CH_{3}, -CH_{2}C(O)CH_{2}-, -C(O)NH_{2}, -CH=CH_{2}, -CH=CH-, -CH=CHCH_{2}C(O)OH, -CH=CHCH_{2}C(O)O-,
-C\equivCH, -C\equivC-, -CH_{2}C\equivCH, -CH_{2}C\equivC-, -CH_{2}C\equivCCH_{3}, -OCH_{2}C\equivCH, -OCH_{2}C\equivC-, -OCH_{2}C\equivCCH_{3}, -NHCH_{2}C(O)-, -NHCH_{2}CH_{2}C(O)-, -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-, y HO(O)CCH_{2}C(O) (NH-(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O))_{2}-, fenilo, bencilo, naftilo, oxazolilo, piridinilo, tiadiazolilo, triazolilo y tienilo.

Dentro del presente contexto, la expresión "aminoácido de presentación natural" tiene el propósito de comprender las formas D y L de aminoácidos comúnmente encontrados en la naturaleza, por ejemplo, las formas D y L de Ala (alanina), Arg (arginina), Asn (aspargina), Asp (ácido aspártico), Cys (cisteína), Gln (glutamina), Glu (ácido glutámico), His (histidina), Ile (isoleucina), Leu (leucina), Lys (lisina), Met (metionina), Phe (fenilalanina), Pro (prolina), Ser (serina), Thr (treonina), Trp (triptófano), Tyr (tirosina) y Val (valina).

En el presente contexto, la expresión "aminoácido de presentación no natural" tiene el propósito de comprender las formas D y L de aminoácidos distintos a aquellos comúnmente encontrados en la naturaleza, como así también los aminoácidos de presentación natural modificados. Los ejemplos de aminoácidos de presentación no natural útiles son las formas D y L de \beta-Ala (\beta-alanina), Cha (ciclohexilalanina), Cit (citrulina), Hci (homocitrulina), HomoCys (homocisteína), Hse (homoserina), Nle (norleucina), Nva (norvalina), Orn (ornitina), Sar (sarcosina) y Thi (tienilalanina).

En el presente contexto, el término "muestra" tiene el propósito de cubrir todos los tipos de muestras adecuadas para el propósito de la invención. Ejemplos de tales muestras son esputo, tapones de laringe, lavado gástrico, lavados bronquiales, biopsias, aspirados, expectoraciones, fluidos corporales (espinal, pleural, pericárdico, sinovial, sangre, pus, médula ósea), orina, secciones de tejidos como así también muestras de alimentos, tierra, aire y muestras de agua. El análisis de las muestras que se origina de las muestras mencionadas anteriormente (por ejemplo, cultivos y muestras tratadas) se encuentra también dentro del alcance de la invención.

En el presente contexto, el término "híbridos" tiene el propósito de incluir complejos entre una sonda y un ácido nucleico a ser determinado. Ese tipo de híbridos puede ser formado por dos o más hebras.

La fuerza de la unión entre la sonda y la secuencia de ácidos nucleicos objetivo puede ser influenciada por el ligando Q. Cuando Q designa una nucleobase, el(los) apareamiento(s) de bases de Hoogsteen y/o Watson-Crick ayuda(n) en la formación de híbridos entre una secuencia de ácido nucleico a ser detectada y una sonda. Se contempla que uno o más de los ligandos puede ser un grupo el cual contribuye poco o nada a la unión del ácido nucleico tal como hidrógeno. Se contempla que las sondas adecuadas que se van a utilizar comprenden menos del 25% en peso de porciones de ácido nucleico peptídico, donde Q designa ese tipo de grupos. Uno o más de los ligandos Q puede ser grupos que estabilizan el apilamiento de nucleobases tales como intercaladores o grupos de unión a nucleobases.

En las sondas indicadas anteriormente, uno o más de los grupos Q puede designar una etiqueta. Ejemplos de etiquetas adecuadas se proporcionan más adelante. Las porciones donde Q denota una etiqueta pueden estar ubicadas, preferentemente, en una o ambas de las porciones de terminación de la sonda. Sin embargo, las porciones donde Q denota una etiqueta también pueden estar ubicadas internamente.

Las sondas de ácido nucleico peptídico pueden comprender porciones, donde todos los grupos X son O (poliamidas) o donde todos los grupos X son S (politioamidas). Se entiende que las sondas también pueden comprender porciones mixtas (que comprenden tanto porciones amida como tioamida).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a sondas de ácido nucleico peptídico de fórmula (II), (III) y (IV) como así también mezclas de ese tipo de sondas definidas en la reivindicación 15.

En una realización preferida, las sondas de ácido nucleico peptídico o sus mezclas de acuerdo con la invención son de las fórmulas (I)-(IV) según lo definido en la reivindicación 16, Z siendo NH, NCH_{3} u O, cada R^{2}, R^{3} y R^{4} es, en forma independiente, H o la cadena lateral de un aminoácido de presentación natural, la cadena lateral de un aminoácido de presentación no natural o alquilo C_{1-4}, y cada Q es una nucleobase de presentación natural o una nucleobase de presentación no natural con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14.

Las sondas de ácido nucleico peptídico o mezclas de tales sondas de acuerdo con la invención son preferentemente aquellas de fórmula (I)-(IV) según lo definido en la reivindicación 17, Z es NH u O, y R^{2} es H o la cadena lateral de Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser o Thr, y Q es una nucleobase seleccionada entre timina, adenina, citosina, guanina, uracilo, iso-C y 2,6-diaminopurina con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14.

Las sondas de ácido nucleico peptídico o mezclas de las mismas, las cuales son de mayor interés para detectar micobacterias del grupo de MTC o una o más micobacterias distintas a las micobacterias del grupo de MTC, son sondas de fórmula (V) de acuerdo con la reivindicación 18, donde R^{4} es H o la cadena lateral de Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser o Thr, y Q es como se definió en la reivindicación 17 y con las condiciones indicadas en las reivindicaciones 6 a 14.

La sonda de ácido nucleico peptídico comprende porciones polimerizadas según lo definido anteriormente y en las reivindicaciones. A partir de la fórmula, debe entenderse que la sonda puede comprender porciones polimerizadas cuya estructura puede ser mutuamente diferente o idéntica. En ciertos casos, puede ser ventajoso que al menos una porción de la sonda, preferentemente una (o ambas) de las porciones que termine la sonda, sean de una estructura diferente. Tales porciones de terminación pueden ser adecuadamente una porción de fórmula (VI)

2

donde Q es según lo definido anteriormente. Ese tipo de porción puede estar, adecuadamente, conectada a una porción de ácido nucleico peptídico a través de un enlace amida.

La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la invención comprende entre 6 y 30 porciones polimerizadas de fórmulas (I) a (V), y, adicionalmente, en forma opcional una o dos porciones de terminación de fórmula (VI) según lo definido anteriormente. La longitud preferida de la sonda dependerá del material de la muestra y si se utilizan sondas etiquetadas. Se contempla que las sondas especialmente interesantes comprenden entre 10 y 30 porciones polimerizadas de fórmulas (I) a (V), y, adicionalmente, en forma opcional una o dos porciones de terminación de fórmula (VI) según lo definido anteriormente. Las sondas de la invención pueden comprender, adecuadamente, entre 12 y 25 porciones polimerizadas de fórmulas (I) a (V), más adecuadamente entre 14 y 22 porciones polimerizadas de fórmulas (I) a (V), más adecuadamente entre 15 y 20 porciones polimerizadas de fórmulas (I) a (V), y, adicionalmente, en forma opcional una o dos porciones de terminación de fórmula (VI).

Según lo mencionado anteriormente, las porciones polimerizadas de las sondas pueden ser mutuamente diferentes o idénticas. En ciertas realizaciones, las porciones polimerizadas de fórmulas (V) constituyen al menos un 75% en peso (calculado mediante exclusión de etiquetas y ligantes), preferentemente al menos 80% en peso y más preferentemente al menos 90% en peso de la sonda.

Los extremos en las porciones que terminan la sonda pueden ser sustituidos con sustituyentes adecuados los cuales en lo que sigue serán denominados "ligantes". Un extremo de terminación puede ser, adecuadamente, sustituido con entre 1 y 5 ligantes, más adecuadamente entre 1 y 3 ligantes. Tales ligantes pueden ser seleccionados, adecuadamente, entre grupos alquilo C_{1-15}, alquenilo C_{1-15} y alquinilo C_{1-15} según lo definido anteriormente. Los ligantes pueden ser sustituidos o insustituidos, ramificados o no ramificados o pueden estar interrumpidos por heteroátomos, o estar sustituidos o contener grupos funcionales según lo descrito anteriormente. Esto puede depender de la naturaleza química de la porción de terminación (es decir, si la porción es terminada por un átomo de carbono, oxígeno o de nitrógeno). Un extremo de terminación o un ligante en un extremo de terminación puede ser adicionalmente sustituido con una o más etiquetas, dichas etiquetas pueden ser incorporadas extremo a extremo, es decir, de modo de formar un extremo etiquetado no ramificado, o pueden ser incorporadas de modo de formar un extremo etiquetado ramificado ("zipper") ("cremallera"). Los ligantes pueden estar unidos directamente a un extremo de terminación, pueden estar unidos a una etiqueta o entre etiquetas en un extremo de terminación, o pueden estar unidos a un extremo de terminación antes de unir una etiqueta a un extremo de terminación. Debe entenderse que dos extremos de terminación pueden llevar sustituyentes, ligantes y/o etiquetas idénticos o diferentes. Debe comprenderse además que el término "una etiqueta" tiene el propósito de comprender una o más etiquetas ya que el término "ligantes" debe comprender uno o más ligantes. Para ciertas aplicaciones, puede resultar ventajoso que uno o más ligantes sean incorporados entre las porciones de ácido nucleico peptídico. Ese tipo de aplicaciones puede ser en particular aquellas basadas en formulación de tríplex.

Ejemplos de ligantes adecuados son -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}C(O)-, -NH(CHOH)_{n}C(O)-, -(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)- y -NH(CH_{2})_{n}C(O)-, NH_{2}(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}C(O)-, -NH_{2}(CHOH)_{n}(O)-, HO(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)-, -NH_{2}(CH_{2})_{n}C(O)-,
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}C(O)OH, NH(CHOH)_{n}C(O)OH, -(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)OH y C(O)OH y -NH(CH_{2})_{n}C(O)OH, donde n es 0 o un número entero de 1 a 8, preferentemente de 1 a 3. Ejemplos de ligantes muy interesantes son
-NHCH_{2}C(O)-, -NHCH_{2}CH_{2}C(O)-, -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)- y HO(O)CCH_{2}CH_{2}C(O)(NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}
C(O))_{2}-.

En el presente contexto, el término "etiqueta" se refiere a un sustituyente el cual es útil para la detección o visualización. Las etiquetas adecuadas comprenden fluoróforos, biotina, ácido dinitrobenzoico, digoxigenina, etiquetas de radioisótopos, etiquetas de péptidos o enzimas, etiquetas de quimiluminiscencia, partículas fluorescentes, hapteno, antígeno o etiquetas de anticuerpos.

La expresión "etiqueta de péptido" tiene el propósito de significar una etiqueta que comprende entre 1 y 20 aminoácidos de presentación natural o no natural, preferentemente de 1 a 10 aminoácidos de presentación natural o no natural, más preferentemente de 1 a 8 aminoácidos de presentación natural o no natural, más preferentemente aun de 1 a 4 aminoácidos de presentación natural o no natural, ligados entre sí de extremo a extremo en forma no ramificada o ramificada ("cremallera"). Ese tipo de etiqueta de péptidos puede estar formada por aminoácidos los cuales son mutuamente idénticos o diferentes. En una realización preferida, ese tipo de extremo no ramificado o ramificado comprende una o más, preferentemente entre 1 y 8 etiquetas, más preferentemente entre 1 y 4, más preferentemente 1 ó 2, etiquetas adicionales distintas a una etiqueta de péptido. Estas otras etiquetas pueden terminar, adecuadamente, un extremo no ramificado o un extremo ramificado. Uno o más ligantes pueden ser unidos, adecuadamente, al extremo de terminación antes de unirse una etiqueta de péptido y/o una etiqueta adicional. Ese tipo de unidades ligantes también puede estar unido entre una etiqueta de péptido y una etiqueta adicional. Adicionalmente, ese tipo de etiquetas de péptido pueden ser incorporadas entre las porciones de ácidos nucleicos peptídicos.

La sonda, como tal, también puede comprender una o más etiquetas tales como entre 1 y 8, preferentemente entre 1 y 4, más preferentemente 1 ó 2, etiquetas y/o una o más unidades ligantes, que pueden estar unidas internamente, es decir, a la estructura de la sonda. Las unidades ligantes y etiquetas pueden estar mutuamente unidas según lo descrito anteriormente.

Ejemplos de etiquetas interesantes en particular son biotina, etiquetas de fluoresceína, por ejemplo, 5-( y 6)-carboxifluoresceína, 5- o 6-carboxifluoresceína, ácido 6-(fluorescein)-5-(y 6)-carboxamido hexanoico e isotiocianato de fluoresceína, etiquetas de péptidos que consisten en entre 1 y 20 aminoácidos de presentación natural o aminoácidos de presentación no natural, etiquetas de enzimas tales como peroxidasas, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP, horse radish peroxidase), fosfatasa alcalina y peroxidasa de semilla de soja, ácido dinitrobenzoico, rodamina, tetrametilrodamina, tintes de cianina tales como Cy2, Cy3 y Cy5, cumarina, R-ficoeritrina (RPE, R-phycoerythrin), aloficoeritrina, Rojo Texas, Rojo Princeton y Verde Oregon como así también conjugados de R-ficoeritrina y, por ejemplo, Cy5 o Rojo Texas.

Ejemplos de etiquetas preferidas son biotina, etiquetas fluorescentes, etiquetas de péptidos, etiquetas de enzimas y ácido dinitrobenzoico. Las etiquetas de péptidos pueden estar formadas por, preferentemente, entre 1 y 10, más preferentemente entre 1 y 8, más preferentemente entre 1 y 4, aminoácidos de presentación natural o no natural. Puede ser particularmente ventajoso incorporar una o más etiquetas diferentes como así también una etiqueta de péptido tal como entre 1 y 8 o entre 1 y 4 etiquetas diferentes, preferentemente 1 ó 2 etiquetas diferentes.

Preferentemente, las etiquetas de péptidos adecuadas pueden estar formadas por cisteína, glicina, lisina u ornitina.

En una realización adicional, el sustituyente Q según lo definido anteriormente puede estar etiquetado. Las etiquetas adecuadas son como se definieron anteriormente. Entre Q y ese tipo de etiqueta, puede incorporarse un ligante según lo definido anteriormente. Se prefiere que ese tipo de ligandos Q etiquetados sea seleccionado entre timina y uracilo etiquetados en la posición 5 y 7-desazaguanina y 7-desazaadenina etiquetados en la posición 7.

Una mezcla de sondas de ácidos nucleicos peptídicos es también parte de la presente invención. Ese tipo de mezcla puede comprender más de una sonda capaz de hibridarse a 23S ARNr, y/o más de una sonda capaz de hibridarse a 16S ARNr, y/o o más de una sonda capaz de hibridarse a 5S ARNr. Una mezcla de sondas puede comprender además sonda(s) dirigida(s) hacia ARNr precursor y/o ADNr. La mezcla también puede comprender ácidos nucleicos peptídicos para detectar más de una micobacteria en el mismo ensayo.

En una realización preferida, la secuencia de nucleobases de la sonda de ácidos nucleicos peptídicos se selecciona de modo que sea sustancialmente complementaria de la secuencia de nucleobases de la secuencia objetivo en cuestión. En una realización especialmente preferida, la secuencia de nucleobases de la sonda de ácidos nucleicos peptídicos se selecciona de modo que sea complementaria de la secuencia de nucleobases de la secuencia objetivo en cuestión. Por "complementaria" se quiere decir que las nucleobases son seleccionadas de modo de permitir una concordancia perfecta entre las nucleobases de la sonda y las nucleobases del objetivo, es decir, A con T o G con C. Por sustancialmente complementaria se quiere decir que la sonda de ácidos nucleicos peptídicos es capaz de hibridarse a la secuencia objetivo, no obstante, la sonda no tiene necesariamente que ser perfectamente complementaria del objetivo. Por ejemplo, las sondas que comprenden una o más bases no complementarias de la secuencia objetivo y las secuencias no objetivo,especialmente base(s) ubicada(s) en el extremo de la sonda, donde el efecto sobre la estabilidad de los híbridos de ácidos nucleicos sonda-objetivo es bajo. Otro ejemplo son las sondas que comprenden otras bases de presentación natural. Por ende, siempre que la sonda sea capaz dehibridarse a la secuencia objetivo, la(s) diferencia(s) en nucleobases entre las secuencias objetivo y las secuencias que no constituyen un objetivo asegura que la estabilidad de los híbridos de ácidos nucleicos sonda- no objetivo sea inferior a la estabilidad de los híbridos de ácidos nucleicos sonda-objetivo y, por consiguiente, torna a dichas sondas sustancialmente complementarias aplicables para la detección de micobacterias.

Las sondas pueden ser sintetizadas de acuerdo con los procedimientos descritos en "PNA Information Package" obtenido de Millipore Corporation (Bedford, MA, E.U.), o pueden ser sintetizadas en un Sistema de Síntesis de Acidos Nucleicos Rápido Expedite Nucleic Acid Synthesis System (PerSeptive BioSystems, E.U.).

Si se utiliza la estrategia Fmoc para alargamiento de la sonda con ligantes o aminoácidos, es posible retener los grupos amino de cadenas laterales protegidos con grupos de protección sensibles al ácido tales como el grupo Boc o Mtt. Este método permite la introducción de un ligante que contiene diversos grupos amino protegidos con Boc los cuales pueden ser disociados y etiquetados en su totalidad en el mismo ciclo de síntesis.

Una manera de etiquetar una sonda consiste en utilizar una etiqueta fluorescente, tal como 5-(y 6)-carboxifluoresceína, 5- ó 6-carboxifluoresceína, o ácido 6-(fluorescein)-5-(y 6)-carboxamidohexanoico. El grupo ácido es activado con HATU (hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) o HBTU (hexafluorfosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) y se hace reaccionar con el grupo amino de terminal N del ácido nucleico peptídico. La misma técnica puede ser aplicada a otros grupos de etiquetado que contienen una función ácida. Alternativamente, el succinimidiléster de las etiquetas mencionadas anteriormente puede ser utilizado, adecuadamente, o puede utilizarse directamente el isotiocianato de fluoresceína.

Después de la síntesis, las sondas pueden ser disociadas de la resina utilizando procedimientos convencionales según lo descrito por Millipore Corporation o PerSeptive BioSystems. Las sondas son posteriormente purificadas y analizadas utilizando técnicas de HPLC de fase inversa a 50ºC y fueron caracterizadas mediante desabsorción/ ionización por láser asistida por matriz - tiempo de espectrometría de masa de vuelo (MALDI-TOFMS, matrix-assisted laser desorption/ionisation time of flight mass spectrometry), espectrometría de masa por desabsorción plasmática (PDMS, plasma desorption mass spectrometry), espectrometría de masa por pulverización de electrones (ESMS, electron spray mass spectrometry), o bombardeo de átomos rápido (FAB-MS).

En general, las sondas tales como sondas que comprenden porciones polimerizadas de fórmula (IV) y (V) también se pueden preparar como se describe, por ejemplo, en Angewandte Chemie, International Edition in English 35, 1939-1942 (1996) y Bioorganic & Medical Chemistry Letters, Vol 4, No 8, 1077- 1080 (1994). Las propiedades químicas de algunas sondas son descritas en, por ejemplo, Nature, 365, 566- 568 (1993).

El método según lo reivindicado puede ser utilizado para la detección de una secuencia objetivo de una o más micobacterias opcionalmente presentes en una muestra. El método y las sondas proveen una herramienta valiosa para analizar muestras para determinar la presencia de ese tipo de secuencias objetivo, por ende proporcionando información para establecer un diagnóstico.

En el método de ensayo de acuerdo con la invención, la muestra a ser analizada para determinar la presencia de micobacterias se pone en contacto con una o más sondas o una mezcla de tales sondas de acuerdo con la invención bajo condiciones por las cuales puede producirse la hibridación entre la o las sondas y cualquier ARNr o ADNr de muestra que se origine de micobacterias, y los híbridos formados, si los hay, son observados o medidos, y la observación o medición se relaciona con la presencia de una secuencia objetivo de una o más micobacterias. La observación o medición puede lograrse visualmente o por medio de instrumentación.

Antes del contacto con sonda(s) de acuerdo con la invención, las muestras pueden pasar por diversos tipos de procesamiento de muestras los cuales incluyen purificación, descontaminación y/o concentración. La muestra puede ser adecuadamente descontaminada mediante tratamiento con hipoclorito de sodio y posteriormente centrifugada para concentración de las micobacterias. Las muestras por ejemplo muestras de esputo pueden ser tratadas con un agente mucolítico tal como N-Acetil-L-cisteína el cual reduce la viscosidad de la muestra como así también pueden ser tratadas con hidróxido de sodio lo cual descontamina la muestra, y posteriormente centrifugadas. Otros procedimientos de descontaminación y concentración bien conocidos incluyen el método de Zephiran-fosfato trisódico, método de hidróxido de sodio de Petroff, el método de ácido oxálico como así también el método de cloruro de cetilpiridinio cloruro de sodio. Las muestras pueden ser también purificadas y concentradas aplicando métodos de preparación de muestras tales como filtración, inmunocaptura, separación en dos fases ya sea solos o en combinación. Los métodos de preparación de las muestras también se pueden utilizar conjuntamente con los métodos de centrifugación y descontaminación mencionados anteriormente.

Las muestras pueden ser analizadas, ya sea directamente o después de haber pasado por uno o más pasos de procesamiento, en primariamente dos tipos principales de ensayos, ensayos basados in situ y en ensayos basados in vitro. En este contexto, los ensayos basados in situ deben entenderse como ensayos, en los cuales los ácidos nucleicos objetivo permanecen dentro de la célula bacteriana durante el proceso de hibridación. Ejemplos son los ensayos de hibridación in situ (ISH, in situ hybridisation) en extensiones y biopsias como así también hibridación a células enteras las cuales pueden estar en suspensión y las cuales posteriormente pueden ser analizadas por, por ejemplo, citometría de flujo opcionalmente después de captura de las bacterias sobre partículas (con mismo o diferente tipo y tamaño), o por análisis por imágenes después de esparcimiento de las bacterias sobre un medio sólido, membrana de filtro u otra superficie sustancialmente plana.

Los ensayos in vitro deben ser entendidos como ensayos, en los cuales los ácidos nucleicos objetivo son liberados de la célula bacteriana antes de la hibridación. Ejemplos de ese tipo de ensayos son ensayos basados en placas de microtítulo. Muchos otros tipos de ensayos, en los cuales los ácidos nucleicos objetivo liberados por algún medio son capturados sobre una fase sólida y subsiguientemente analizados mediante una sonda detectora, son posibles y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Aun más, los ensayos basados en in vitro incluyen ensayos, en los cuales los ácidos nucleicos objetivo no son capturados sobre una fase sólida, sino en los cuales la hibridación y generación de señales se producen enteramente en solución.

Las muestras para los ensayos basados in situ pueden aplicarse, adecuadamente, y opcionalmente ser inmovilizadas a un soporte. Las técnicas para aplicar una muestra sobre un soporte sólido dependen del tipo de muestra en cuestión e incluyen manchado y citocentrifugación para muestras líquidas y licuadas y seccionamiento de tejidos para materiales de biopsias. El soporte sólido puede adoptar una amplia variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como un portaobjeto para microscopio, una membrana de filtro, una membrana polimérica o una placa de diversos materiales.

En el caso de los ensayos basados en in vitro, el ácido nucleico objetivo puede ser liberado de las células micobacterianas en diversas formas. La mayoría de los métodos para liberar los ácidos nucleicos causan el estallido de la pared celular (lisis) seguido por extracción de los ácidos nucleicos en una solución tamponada. Como las micobacterias tienen paredes celulares complejas que contienen peptidoglicanos, arabinogalactanos y en particular ácidos micólicos asociados covalentemente, no pueden ser fácilmente desgajadas mediante métodos convencionales utilizados para la lisis rápida de otras bacterias. Los métodos posibles que son conocidos que dan lisis satisfactoria de la pared celular micobacteriana incluyen métodos los cuales involucran el tratamiento con disolventes orgánicos, el tratamiento con reactivos caotrópicos fuertes tales como altas concentraciones de tiocianato de guanidina, tratamiento enzimático, golpe de perlas, tratamiento térmico, sonicación y/o aplicación de una prensa French (Francesa).

Las muestras a ser analizadas mediante ensayos in situ pueden ser fijadas antes de la hibridación. El experto en la técnica reconocerá fácilmente que el procedimiento apropiado dependerá del tipo de muestra a ser examinada. La fijación y/o inmovilización deberían preservar, preferentemente, la integridad morfológica de la matriz celular y de los ácidos nucleicos. Ejemplos de los métodos para la fijación son fijación por llama, fijación térmica, fijación química y congelamiento. La fijación por llama puede lograrse pasando el portaobjeto a través del cono azul de un quemador Bunsen 3 ó 4 veces; la fijación térmica puede lograrse calentando la muestra hasta 80ºC durante 2 horas; la fijación química puede lograrse mediante inmersión de la muestra en un fijador (por ejemplo, formamida, metanol o etanol). El congelamiento es particularmente relevante para biopsias y secciones de tejidos y se lleva a cabo, en general, en nitrógeno líquido.

En una realización de ensayo de hibridación in situ, la muestra a ser analizada es extendida sobre un soporte sólido sustancialmente plano el cual puede ser un portaobjeto para microscopio, una membrana de filtro, una membrana de polímero u otro tipo de soporte sólido con una superficie plana. El soporte sólido preferido es un portaobjeto para microscopio. Después de prepararse la muestra, puede opcionalmente sufrir un pre-tratamiento adicional como por ejemplo tratamiento con agentes bactericidas o fijación adicional mediante inmersión en, por ejemplo, etanol. La muestra también puede ser pretratada con enzima(s) las cuales como función primaria permeabilizan las células y/o reducen la viscosidad de la muestra. Puede ser adicionalmente ventajoso llevar a cabo un paso de pre-hibridación a fin de bloquear los sitios los cuales podrían, de otro modo, originar una unión no específica. Con este fin, pueden utilizarse adecuadamente agentes bloqueadores tal como leche descremada y sondas que no constituyen un objetivo. Los componentes de la mezcla de pre-hibridación deberían ser seleccionados de modo de obtener una saturación efectiva de los sitios en la muestra que de otro modo unirían la sonda en forma no específica. El tampón de pre-hibridación puede comprender, adecuadamente, un tampón apropiado, agente(s) bloqueador(es) y detergentes.

Durante la hibridación in situ, una o más sondas de acuerdo con la presente invención se ponen en contacto con cualquier ARNr o ADNr objetivo dentro de las células en una solución de hibridación bajo condiciones de severidad adecuadas. La concentración de la sonda aplicada puede variar dependiendo de la naturaleza química de la sonda y de las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la hibridación. Típicamente, una concentración de sonda entre 1 nM y 1 uM es adecuada. La solución de hibridación puede comprender un agente desnaturalizante el cual permite que se lleve a cabo la hibridación a una temperatura más baja que la que correspondería en caso de no haber agente. El agente desnaturalizante debería estar presente en una cantidad efectiva para aumentar la relación entre la unión específica y la unión no específica. La cantidad efectiva de agente desnaturalizante depende del tipo utilizado y de la sonda o combinación de sondas. Ejemplos de agentes desnaturalizantes son formamida, etilenglicol y glicerol, y estos pueden ser utilizados, preferentemente, en una concentración por encima de 10% y por debajo del 70%. El agente desnaturalizante preferido es formamida la cual se utiliza más preferentemente en concentraciones entre 20% y 60%, más preferentemente entre 30% y 50%. Debería señalarse que en varios casos puede ser necesario o ventajoso incluir un agente desnaturalizante.

Antes de la hibridación o durante la hibridación, una mezcla de sondas al azar (sondas con secuencias no seleccionadas, aleatorias de longitud opcionalmente diferente) puede ser agregada en exceso para reducir la unión no específica. Asimismo, una o más sondas sin sentido (sondas con una secuencia de nucleobases definida y longitud que difiere de la secuencia de nucleobases de la secuencia objetivo) pueden agregarse en exceso a fin de reducir la unión no específica. Asimismo, la unión no específica de sondas detectables a una o más secuencias de ácidos nucleicos que no constituyen un objetivo puede ser suprimida mediante la adición de una o más sondas no etiquetadas o independientemente detectables, dichas sondas tienen una secuencia que es complementaria de la o las secuencias que no constituyen un objetivo. Es particularmente ventajoso agregar dichas sondas bloqueadoras cuando la secuencia que no es objetivo difiere de la secuencia objetivo por sólo un error de concordancia.

Puede resultar ventajoso incluir polímeros inertes los cuales se cree que aumentan la concentración efectiva de la o las sondas en la solución de hibridación. Una macromolécula de ese tipo es sulfato de dextrano el cual se puede utilizar en concentraciones entre 2,5% y 15%. El rango de concentración preferido es del 8% al 12% en el caso del sulfato de dextrano. Otras macromoléculas útiles son polivinilpirrolidona y ficoll, los cuales se utilizan, típicamente, a concentraciones más bajas, por ejemplo, 0,2%. Puede ser adicionalmente ventajoso agregar uno o más detergentes los cuales pueden reducir el grado de unión no específica de las sondas de ácidos nucleicos peptídicos. Ejemplos de detergentes útiles son el dodecilsulfato de sodio, Tween 20® o Triton X-100®. Los detergentes se utilizan, en general, en concentraciones entre 0,05% y 1,0%, preferentemente entre 0,05% y 0,25%. La solución de hibridación puede contener adicionalmente sal. Si bien no es necesario incluir sal a fin de obtener hibridación apropiada, puede ser ventajoso incluir sal en concentraciones entre 2 y 500 mM, o adecuadamente entre 5 y 100 mM.

Durante la hibridación, otros parámetros importantes son la temperatura de hibridación, la concentración de la sonda y el tiempo de hibridación. El experto en la técnica reconocerá fácilmente que se deben determinar las condiciones óptimas para cada uno de los parámetros antes mencionados de acuerdo con la situación específica, por ejemplo, la elección de la o las sondas y el tipo y concentración de los componentes del tampón de hibridación, en particular la concentración de agente desnaturalizante. La presencia de excluyentes de volumen también puede tener un efecto.

Luego de la hibridación, la muestra se lava para eliminar cualquier sonda sin unir y cualquier sonda no específicamente unida, y por consiguiente, deberían utilizarse condiciones de severidad apropiadas. Por severidad se quiere decir el grado al cual las condiciones de reacción favorecen el clivado de los híbridos formados. La severidad puede ser incrementada típicamente aumentando la temperatura del lavado y/o el tiempo del lavado. Típicamente, los tiempos de lavado de 5 a 40 minutos pueden ser suficientes. Dos o más períodos de lavado de tiempo más corto también pueden dar buenos resultados. Se puede utilizar un rango de tampones, incluyendo tampones biológicos, tampones de fosfato y tampones de citrato convencionales. La demanda de baja concentración de sal en los tampones no es tan pertinente como para los ensayos con sondas de ADN debido a la respuesta diferente a la concentración de sal. En ciertos casos, resulta ventajoso aumentar el pH del tampón de lavado ya que puede proporcionar una relación de señal a ruido aumentada (véase, el documento WO 97/18325). Esto es concebiblemente debido a una reducción significativa de la unión no específica. Por lo tanto, puede ser ventajoso utilizar una solución de lavado con un valor de pH entre 8 y 10,5, preferentemente entre 9 y 10.

La visualización de sonda(s) unida(s) debe llevarse a cabo teniendo en cuenta en forma debida el tipo de etiqueta elegido. Existe un amplio rango de etiquetas de sondas útiles, en particular diversas etiquetas fluorescentes tales como fluoresceína, rodamina y derivados de las mismas. Adicionalmente, las etiquetas tales como (por ejemplo peroxidasas y fosfatasas) y haptenos (por ejemplo, biotina, digoxigenina, ácido dinitrobenzoico) pueden aplicarse adecuadamente. En el caso de etiquetas fluorescentes, los híbridos formados pueden ser visualizados utilizando un microscopio con una ampliación de por lo menos X 250, preferentemente X 1000. La visualización puede llevarse a cabo adicionalmente utilizando una cámara CCD (charge coupled device [dispositivo de carga acoplada]) opcionalmente controlada por una computadora. Cuando se utilizan haptenos como etiquetas, los híbridos pueden ser detectados utilizando un anticuerpo conjugado con una enzima. En estos casos, el paso de detección puede estar basado en colorimetría, fluorescencia o luminiscencia.

Las sondas puede alternativamente ser etiquetadas con partículas fluorescentes que tienen la etiqueta fluorescente incrustada en las partículas, (por ejemplo, microesferas coloreadas con Estapor K), ubicadas en la superficie de las partículas y/o acopladas a las superficies de las partículas. Como las partículas tienen que ponerse en contacto con los ácidos nucleicos objetivo dentro de las células, el uso de partículas fluorescentes puede necesitar pretratamiento de las bacterias. Pueden utilizarse adecuadamente partículas relativamente pequeñas por ejemplo aproximadamente 20 nm.

En otra realización de hibridación in situ, el tejido congelado o las muestras de biopsias se cortan en secciones delgadas y se transfieren a una superficie sustancialmente plana, preferentemente platinas de microscopio. Antes de la hibridación, el tejido o la biopsia puede ser tratado con un fijador, preferentemente un fijador de precipitación tal como acetona, o la muestra es incubada en una solución de formaldehído tamponado. Alternativamente, la biopsia o sección de tejido puede ser transferida a un fijador tal como formaldehído tamponado durante 12 a 24 horas y luego de la fijación, el tejido puede ser incrustado en parafina formando un bloque del cual pueden cortarse secciones finas. Antes de la hibridación, la sección de tejido es desparafinada y rehidratada utilizando procedimientos convencionales. La permeabilización (por ejemplo, el tratamiento con proteasas, ácidos diluidos, detergentes, alcohol y/o calor) puede ser ventosa en ciertos casos. El método seleccionado para la permeabilización depende de diversos factores, por ejemplo, en el fijador utilizado, el grado de fijación, el tipo y tamaño de muestra, y de la sonda aplicada. Para estos tipos de muestras, el procesamiento de la muestra, la prehibridación, la hibridación, el lavado y la visualización pueden llevarse a cabo utilizando condiciones iguales o ajustadas según lo descrito anteriormente.

En una realización adicional de los ensayos in situ, las células bacterianas se mantienen en suspensión durante la fijación, la pre-hibridación, la hibridación y el lavado se llevan a cabo bajo las mismas o similares condiciones a las descritas anteriormente. El tipo preferido de etiqueta para esta realización es etiquetas fluorescentes. Esto permite la detección de células hibridadas mediante citometría de flujo, registrando la intensidad de la fluorescencia por cada célula. Las células bacterianas en suspensión pueden ser adicionalmente acopladas a partículas, preferentemente con un tamaño entre 20 nm y 10 um. Las partículas pueden estar hechas de materiales bien conocidos en la técnica tales como el látex, dextrano, celulosa y/o agarosa, y pueden ser opcionalmente paramagnéticas o pueden contener una etiqueta fluorescente. Normalmente, las células bacterianas son acopladas a partículas utilizando anticuerpos contra las bacterias objetivo, aunque también pueden utilizarse otros medios tales como impresión molecular. El acoplamiento de las células bacterianas a partículas puede ser ventajoso en el manipuleo de muestras y/o durante la detección.

En las realizaciones de hibridación in situ antes descritas, las sondas de acuerdo con la invención se utilizan para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias. En una realización preferida, las sondas son adecuadas para detectar una secuencia objetivo de micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTC), micobacterias que no son las micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MOTT) o micobacterias del Complejo de Mycobacterium avium (MAC). Las sondas son adicionalmente adecuadas para detectar secuencias objetivo simultáneamente diferentes que se originan de las mismas micobacterias.

Las muestras a ser analizadas utilizando ensayos basados in vitro deben pasar por un tratamiento mediante el cual los ácidos nucleicos son liberados de las células bacterianas. Los ácidos nucleicos pueden ser liberados utilizando disolventes orgánicos, reactivos caotrópicos fuertes, tales como, altas concentraciones de tiocianato de guanidina, enzimas, golpe de perlas, calentamiento, sonicación y/o aplicación de una prensa Francesa. Los ácidos nucleicos obtenidos pueden sufrir purificación adicional antes de hibridación.

En una realización de hibridación in vitro, la muestra que comprende el ácido nucleico objetivo se agrega a un envase que comprende sonda(s) de captura inmovilizada(s) y una o más sonda(s) etiquetada(s) para funcionar como sonda(s) de detección. La hibridación debería llevarse a cabo bajo condiciones de severidad adecuadas. La solución de hibridación puede comprender además un agente desnaturalizante, sondas de bloqueo, polímeros inertes, detergentes y sal como se describió para los ensayos del tipo in situ. Asimismo, la temperatura de hibridación, la concentración de la sonda y el tiempo de hibridación son parámetros importantes que deben ser controlados de acuerdo con las condiciones específicas del ensayo, por ejemplo, la selección de la o las sonda(s) de ácido nucleico peptídico y la concentración de algunos de los ingredientes del tampón de hibridación. Si la hibridación del ácido nucleico objetivo a la o las sondas de captura y a la o las sondas de detección, respectivamente, se lleva a cabo en dos pasos por separado, pueden utilizarse en estos pasos diferentes parámetros, en particular, diferentes condiciones de severidad. La concentración de la sonda de captura puede ser superior para ensayos in situ ya que la hibridación puede ser controlada mejor y el lavado puede realizarse más eficientemente.

Las sondas de captura pueden ser inmovilizadas sobre un soporte sólido mediante cualquier medio, por ejemplo, mediante una reacción de acoplamiento entre un ácido carboxílico en un ligante y un soporte amino derivado. La sonda de captura puede ser adicionalmente acoplada sobre el soporte sólido mediante activación fotoquímica de grupos fotorreactivos los cuales han sido unidos en forma absorbente al soporte sólido antes de la activación fotoquímica. Ese tipo de grupos fotorreactivos se describe en el documento estadounidense US 5 316 784 A. Las sondas de captura pueden ser adicionalmente acopladas a un hapteno el cual permite una inmovilización basada en la afinidad al soporte sólido. Un ejemplo de ese tipo es el acoplamiento de una biotina a la o las sondas e inmovilización por medio de unión a una superficie revestida con estreptavidina.

El soporte sólido puede adoptar una amplia variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como una placa de microtitulación que tiene uno o más pocillos, una membrana de filtro, una membrana polimérica, un tubo, un palillo de inmersión, una tira y partículas. Las membranas de filtro pueden estar hechas de celulosa, acetato de celulosa, fluoruro de polivinilideno o cualquier otro material bien conocido en la técnica. Las membranas poliméricas pueden ser de poliestireno, nilón, polipropileno o de cualquier otro material bien conocido en la técnica. Las partículas pueden ser perlas paramagnéticas, perlas hechas de poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilón, amilosas, celulosas, poliacrilamidas y agarosa. Cuando el soporte sólido tiene la forma de un filtro, una membrana, una tira o perlas, se puede(n) incorporar en un dispositivo de un solo uso.

La selección de la etiqueta de la o las sondas de detección depende del formato de ensayo específico y posible instrumentación. Cuando se utilizan sondas etiquetadas con biotina, los híbridos pueden ser detectados utilizando estreptavidina o un anticuerpo contra la etiqueta de biotina, anticuerpo o estreptavidina que puede ser conjugado con una enzima y la detección real depende de la elección de la enzima específica, preferentemente una fosfatasa o una peroxidasa, y el sustrato para la enzima seleccionada. La señal puede ser aumentada, en algunos casos, utilizando sistemas de amplificación comercialmente disponibles tales como el sistema de amplificación de señales catalizado para sondas biotiniladas (CSA por DAKO). También pueden utilizarse diversos sistemas de intensificación basados en polímeros. Un ejemplo es un polímero de dextrano al cual se acopla tanto un anticuerpo específico de hapteno como una enzima. La o las sondas de detección pueden ser adicionalmente etiquetadas con otros haptenos, por ejemplo, digoxigenina, ácido dinitrobenzoico y fluoresceína, en cuyo caso los híbridos pueden ser detectados utilizando un anticuerpo contra el hapteno, anticuerpo que puede ser conjugado con una enzima. Es aun posible aplicar sonda(s) de detección la(s) cual(es) tiene(n) enzimas acopladas directamente sobre las sondas. Existe un amplio rango de posibilidades para la selección de sustratos de enzimas lo cual permite la detección colorimétrica (sustratos por ejemplo p-nitro-fenilfosfato o tetra-metil-bencidina), fluorogénica (sustratos por ejemplo 4-metilumbilliferilfosfato) o quimiluminiscentes (sustratos por ejemplo 1,2-dioxetanos).

Las sondas de detección pueden ser adicionalmente etiquetadas con diversas etiquetas fluorescentes, preferentemente fluoresceína o rodamina, en cuyo caso los híbridos pueden ser detectados midiendo la fluorescencia.

La o las sondas de detección serán típicamente diferentes de la o las sondas de captura, asegurando así una especificidad de especie dual. La especificidad dual a menudo permitirá que al menos una de las sondas sea más corta, por ejemplo una sonda de 10 meros.

Adicionalmente, la captura de secuencias ricas en purina puede ser mejorada utilizando ácidos nucleicos bi-peptídicos como sondas de captura. Tales ácidos nucleicos bis-peptídicos son descritos en el documento WO 96/02558. Los ácidos nucleicos bis-peptídicos comprenden una primera hebra de ácido nucleico peptídico capaz de hibridarse en forma paralela al ácido nucleico objetivo, y una segunda hebra de ácido nucleico peptídico capaz de hibridarse en forma antiparalela a la secuencia rica en purina del ácido nucleico a ser capturado. Las dos hebras de ácido nucleico peptídico están conectadas mediante un ligante y son de este modo capaces de formar una estructura de tríplex con dicho ácido nucleico de la secuencia rica en purina. La cantidad de porciones polimerizadas de cada ácido nucleico peptídico separado por ligante puede ser como se definió previamente para ácidos nucleicos no bis-peptídicos. Sin embargo, debido a la alta estabilidad de los tríplex formados, los ácidos nucleicos bis-peptídicos con primera y segunda hebras cortas pueden utilizarse haciendo más fácil el diseño de una sonda rica en pirimidina.

En lugar de utilizar una sonda detectora, sonda de captura, los complejos de ácidos nucleicos pueden ser detectados utilizando un sistema de detección basado en un anticuerpo que reacciona específicamente con complejos formados entre ácidos nucleicos peptídicos y ácidos nucleicos (tales como los descritos en el documento WO 95/17430), en dicho sistema de detección el anticuerpo primario puede comprender una etiqueta, o dicho sistema de detección comprende un anticuerpo secundario etiquetado, el cual se une específicamente al anticuerpo primario. La detección específica nuevamente depende del sustrato seleccionado el cual puede ser de cualquier tipo de aquellos antes mencionados.

Dependiendo del tipo de formato de ensayo específico, etiqueta y principio de detección, pueden utilizarse diversos tipos de instrumentación incluyendo lectores de microplacas convencionales, luminómetros y citómetros de flujo. La adaptación de instrumentación adecuada puede permitir la automatización del ensayo.

En un ejemplo de esta realización, una sonda de captura de la presente invención es acoplada a una placa de microtitulación mediante una reacción fotoquímica entre una sonda de captura etiquetada con antraquinona y poliestireno del micropocillo. El ARNr objetivo es agregado a los micropocillos e incubado bajo condiciones de severidad. El ARNr no unido es eliminado por lavado y el micropocillo son incubados con una sonda detectora etiquetada con hapteno bajo condiciones de severidad. La visualización se lleva a cabo utilizando un anticuerpo etiquetado con enzimas contra el hapteno, el cual después de la remoción del anticuerpo no unido es detectado utilizando un sustrato de quimiluminiscencia.

En otro ejemplo de esta realización, las sondas de captura son acopladas a partículas de látex, y la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones adecuadas en presencia de por ejemplo sonda(s) detectora(s) etiquetada(s) con fluoresceína. Después de la hibridación y opcionalmente lavado, los híbridos son detectados mediante citometría de flujo. Un rango de perlas diferentes (por ejemplo por tamaño o por colores) puede llevar diferentes sondas de captura para diferentes objetivos, permitiendo de ese modo un sistema de detección múltiple.

En una realización adicional del formato de ensayos in vitro, la sonda de captura, el ácido nucleico objetivo y la sonda detectora pueden hibridarse en solución, y posteriormente la sonda de captura es adherida a una fase sólida. La fase sólida, las condiciones de hibridación y los medios de detección pueden seleccionarse de acuerdo con el método específico según lo descrito anteriormente.

En una realización adicional de ensayos in vitro, el ácido nucleico objetivo puede ser inmovilizado sobre filtro o membranas de polímero u otros tipos de fases sólidas bien conocidas en la técnica. Las condiciones de hibridación y los medios de detección pueden seleccionarse de acuerdo con el ambiente específico según lo descrito anteriormente.

En una realización adicional del ensayo in vitro, un grupo de hasta 100 o incluso más sondas diferentes dirigidas contra diferentes secuencias objetivo puede ser inmovilizado sobre una superficie sólida y la hibridación de las secuencias objetivo a todas las sondas se lleva a cabo en forma simultánea. La fase sólida, las condiciones de hibridación y los medios de detección pueden ser según lo descrito anteriormente. Esto permite la detección simultánea o identificación de un rango de parámetros, es decir, identificación de especie y patrones de resistencia.

Las presentes sondas proveen además un método para el diagnóstico de la infección por micobacterias y un método para determinar la etapa de la infección y el tratamiento apropiado, mediante dichos métodos una o más sondas opcionalmente etiquetadas de acuerdo con la invención se ponen en contacto con una muestra de un paciente y se evalúa el tipo de tratamiento y/o el efecto de un tratamiento.

Equipos portátiles que comprenden al menos una sonda de ácido nucleico peptídico según lo definido en la presente son también parte de la presente invención. Ese tipo de equipo portátil puede comprender además un sistema de detección con al menos un reactivo de detección y/o un sistema de captura de fase sólida.

Descripción de las realizaciones específicas

Ejemplos de Qs adecuados de porciones adyacentes son proporcionados más adelante. Las sondas de ácido nucleico peptídico que comprenden ese tipo de Qs serán adecuadas para detectar micobacterias, en particular micobacterias del grupo de MTC o micobacterias distintas a las del grupo de MTC. Las sondas están escritas de izquierda a derecha correspondiente a del extremo de terminal N hacia el extremo de terminal C. Las subsecuencias Q adecuadas para detectar 23S y 16S ARNr como así también 5S ARNr del grupo de MTC se proporcionan a continuación. Las subsecuencias Q adecuadas para detectar 23S y 16S ARNr de micobacterias distintas a las micobacterias del grupo de MTC son adicionalmente proporcionadas a continuación. Las subsecuencias Q incluyen al menos una nucleobase complementaria de una nucleobase seleccionada de las posiciones proporcionadas en paréntesis. Las subsecuencias Q son brindadas como ejemplos no limitativos de construcción de secuencias de nucleobases de sonda adecuadas. Debe entenderse que las sondas pueden comprender menos o más porciones de ácido nucleico peptídico de lo indicado.

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Otros ejemplos de subsecuencias Q adecuadas son proporcionados a continuación.

CAT GTG TCC TGT GGT y	(Sec ID no 117)
CGT CAG CCC GAG AAA	(Sec ID no 118)

se seleccionan de modo que sean complementarias de 16S ARNr de M. gordonae (posiciones 174 - 188 y 452 - 466, respectivamente, de la entrada al GenBank GB:MSGRR16SI, no. de acceso M29563). Estas posiciones corresponden a las posiciones 192 - 206 y 473 - 487, respectivamente, de las alineaciones mostradas en la Figura 2 y 5. Las sondas que tienen esta o una secuencia de nucleobase similar son adecuadas para detectar M. gordonae.

CAC TAC ACA CGC TCG, y	(Sec ID no 119)
TGG CGT TGA GGT TTC	(Sec ID no 120)

se seleccionan de modo que sean complementarias de las posiciones 781 - 795 y 2369 - 2383, respectivamente, de 23S ARNr de M. kansasii (entrada al GenBank MK23SRRNA, no. de acceso Z17212). Estas posiciones corresponden a las posiciones 774 - 794 y 2398 - 2412, respectivamente, de las alineaciones mostradas en la Figura 1 y 4. Las sondas que tienen esta o una secuencia de nucleobases similar son adecuadas para detectar M. kansasii.

ARNr precursor

AAC ACT CCC TTT GGA

(Sec ID no 123)

Una sonda de ácido nucleico peptídico que tiene la secuencia de nucleobase antes indicada es dirigida a ARNr precursor de M. tuberculosis. La sonda es complementaria de las posiciones 602 a 616 del número de acceso al GenBank X58890.

Especialmente, las sondas basadas en aquellas secuencias de nucleobase con números de identificación de secuencia SEC ID no 62, 79 y 80 (y otras sondas seleccionadas entre las posiciones 1361 - 1364 en la Figura 1F, 2719 en la Figura 4K y 2809 en la Figura 4L) son adecuadas para detectar M. avium. Las sondas basadas en la secuencia de nucleobase con número de identificación de secuencia Sec ID no 55 (y otras sondas seleccionadas entre las posiciones 763 - 789 en la Figura 4E) son adecuadas para detectar M. avium, M. intracellulare y M. scrofulaceum como un grupo (los organismos denominados el grupo MAIS de micobacterias). Adicionalmente, las sondas basadas en las secuencias de nucleobase con números de identificación de secuencias Sec ID nos 77 y 81 son adecuadas para detectar M. avium, M. intracellulare y M. paratuberculosis como un grupo.

La invención es adicionalmente ilustrada mediante los ejemplos no limitativos proporcionados a continuación.

Ejemplos Ejemplo 1

Los 23S ADNr de la especie Mycobacterium (M. bovis y M. intracellulare) fueron amplificados parcialmente mediante PCR, y los productos de la PCR fueron secuenciados (ambas hebras) utilizando los cebadores de oligonucleótidos Cy5-rotulados (DNA Technology, Aarhus, Dinamarca) y el equipo portátil de secuenciado de ciclo 7-deaza-dGTP Thermo Sequenase de Amersham, Little Chalfont, Inglaterra. Se leyeron las secuencias utilizando un secuenciador automático ALFexpress y software ALFwin (versión 1.10) de Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia. Las secuencias de 23S ARNr de M. bovis y M. intracellulare son incluidas en las siguientes posiciones de las alineaciones de secuencia de 23S ADNr: posiciones 681-729 (Figuras 1C y 4D), posiciones 761-800 (Figuras 1D y 4E), posiciones 2401-2440 (Figuras 1H y 4K), posiciones 2441- 2480 (Figuras 1l y 4K), posiciones 2481-2520 (Figura 1l), posiciones 3041-3080 (Figura 4L) y posiciones 3081-3120 (Figuras 1J y 4L).

Ejemplo 2

Las alineaciones de secuencias (ver las Figuras 1 a 5) de 23S, 16S y 5S ADNr de micobacterias del grupo MTC, y 23S y 16S ADNr de micobacterias distintas a aquellas del grupo de MTC (MOTT) se efectuaron utilizando la herramienta de alineación Megalign (versión 3.12) de DNASTAR (Madison, WI, E.U.). Se alinearon hasta cien secuencias a la vez.

Las sondas de ácido nucleico peptídico en las cuales la secuencia de nucleobases era complementaria de ARNr micobacteriano distintivo se diseñaron con la debida atención a las estructuras secundarias utilizando el programa PrimerSelect (versión 3.04) de DNASTAR. Como un control de la especificidad de secuencia, todas las secuencias sondas se hicieron corresponder, posteriormente, con las bases de datos de GenBank y EMBL utilizando la búsqueda de similitud de secuencias BLAST en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Como ejemplos, se seleccionaron las siguientes secuencias:

MTC 23S
TCA CCA CCC TCC TCC	(Sec ID no 6)
CCA CCC TCC TCC	(Sec ID no 6 modificada)
ACT ATT CAC ACG CGC	(Sec ID no 8)
CCA CAC CCA CCA CAA	(Sec ID no 12)

AAC TCC ACA CCC CCG	(Sec ID no 16)
ACT CCA CAC CCC CGA	(Sec ID no 17)
ACT CCG CCC CAA CTG	(Sec ID no 22)
CTG TCC CTA AAC CCG	(Sec ID no 23)
TTC GAG GTT AGA TGC	(Sec ID no 24)
GTC CCT AAA CCC GAT	(Sec ID no 25)
GAC CTA TTG AAC CCG	(Sec ID no 29)

MTC 16S
GCA TCC CGT GGT CCT	(Sec ID no 33)
CAC AAG ACA TGC ATC	(Sec ID no 34)
GGC TTT TAA GGA TTC	(Sec ID no 40)

MOTT 23S
GAT CAA TGC TCG GTT	(Sec ID no 44)
CGA CTC CAC ACA AAC	(Sec ID no 76)

MOTT 16S
GCA TTA CCC GCT GGC	(Sec ID no 85)

Resistencia a las Drogas
GTC TTA TCG TCC TGC	(Sec ID no 90)
GTC TTC TCG TCC TGC	(Sec ID no 91)
GTC TTG TCG TCC TGC	(Sec ID no 92)
GTC TAT TCG TCC TGC	(Sec ID no 93)
GTC TCT TCG TCC TGC	(Sec ID no 94)
GTC TGT TCG TCC TGC	(Sec ID no 95)

ARNr Precursor
AAC ACT CCC TTT GGA	(Sec ID no 123)

Sondas sin sentido
GTC CGT GAA CCC GAT	(Sec ID no 121)
TAC GCT CTT TGA GCT	(Sec ID no 122)

Ejemplo 3

Las sondas de ácido nucleico peptídico fueron sintetizadas utilizando un sistema Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesis System adquirido de PerSeptive Biosystems (Framingham, E.U.). Las sondas de ácido nucleico peptídico fueron terminadas con dos moléculas de \beta-alanina o con una o dos moléculas de lisina y, antes del clivado de la resina, se rotularon con 5-(o 6)-carboxifluoresceína (Flu) o con rodamina (Rho) en el grupo \beta- amino de alanina (etiqueta peptídica) o grupo \varepsilon-amino de lisina (etiqueta peptídica), respectivamente. Las sondas fueron purificadas utilizando HPLC de fase inversa a 50ºC y caracterizadas utilizando un instrumento G2025 A MALDI-TOF MS (Hewlett Packard, San Fernando, California, E.U.). Los pesos moleculares determinados estaban dentro del 0,1% de los pesos moleculares calculados.

Se sintetizaron las siguientes sondas de ácido nucleico peptídico etiquetadas:

MTC 23S
Lys(Flu)-Lys(Flu)-TCA CCA CCC TCC TCC-NH_{2}	(OK 446/ Sec ID no 6 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-CCA CCC TCC TCC-NH_{2}	(OK 575/ Sec ID no 6 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-ACT ATT CAC ACG CGC-NH_{2}	(OK 447/ Sec ID no 8 modificada)
Lys(Flu)-ACT ATT CAC ACG CGC-NH_{2}	(OK 688/ Sec ID no 8 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-CCA CAC CCA CCA CAA-NH_{2}	(OK 448/ Sec ID no 12 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-AAC TCC ACA CCC CCG-NH_{2}	(OK 449/ Sec ID no 16 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-ACT CCA CAC CCC CGA-NH_{2}	(OK 309/ Sec ID no 17 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-ACT CCG CCC CAA CTG-NH_{2}	(OK 450/ Sec ID no 22 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-CTG TCC CTA AAC CCG-NH_{2}	(OK 305/ Sec ID no 23 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-TTC GAG GTT AGA TGC-NH_{2}	(OK 306/ Sec ID no 24 modificada)
Lys(Flu)-TTC GAG GTT AGA TGC-NH_{2}	(OK 682/ Sec ID no 24 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-GTC CCT AAA CCC GAT-NH_{2}	(OK 307/ Sec ID no 25 modificada)
Lys(Flu)-GTC CCT AAA CCC GAT-NH_{2}	(OK 654/ Sec ID no 25 modificada)
Lys(Flu)-GAC CTA TTG AAC CCG-NH_{2}	(OK 660/ Sec ID no 29 modificada)

MTC 16S
Lys(Flu)-Lys(Flu)-Gly-GCA TCC CGT GGT CCT-NH_{2}	(OK 223/ Sec ID no 33 modificada)
Lys(Flu)-Lys(Flu)-CAC AAG ACA TGC ATC-NH_{2}	(OK 310/ Sec ID no 34 modificada)
Lys(Flu)-CAC AAG ACA TGC ATC-NH_{2}	(OK 655/ Sec ID no 34 modificada)
Lys(Flu)-GGC TTT TAA GGA TTC-NH_{2}	(OK 689/ Sec ID no 40 modificada)
Lys(Rho)-GGC TTT TAA GGA TTC-NH_{2}	(OK 702/ Sec ID no 40 modificada)

MOTT 23S
Flu-\beta-Ala-\beta-Ala-GAT CAA TGC TCG GTT-NH_{2}	(OK 624/ Sec ID no 44 modificada)
Flu-\beta-Ala-\beta-Ala-CGA CTC CAC ACA AAC-NH_{2}	(OK 612/ Sec ID no 76 modificada)

MOTT 16S
Flu-\beta-Ala-\beta-Ala-GCA TTA CCC GCT GGC-NH_{2}	(OK 623/ Sec ID no 85 modificada)

Resistencia a las drogas
Lys(Flu)-GTC TTT TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 745/ Sec ID no 89 modificada)
Lys(Rho)-GTC TTA TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 746/ Sec ID no 90 modificada)
Lys(Rho)-GTC TTC TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 746/ Sec ID no 91 modificada)
Lys(Rho)-GTC TTG TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 746/ Sec ID no 92 modificada)
Lys(Rho)-GTC TAT TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 747/ Sec ID no 93 modificada)
Lys(Rho)-GTC TCT TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 747/ Sec ID no 94 modificada)
Lys(Rho)-GTC TGT TCG TCC TGC-NH_{2}	(OK 747/ Sec ID no 95 modificada)

ARNr precursor
Lys(Flu)-AAC ACT CCC TTT GGA-NH_{2}	(OK 749/ Sec ID no 123 modificada)

Reducción de unión no específica
GTC CGT GAA CCC GAT-NH_{2}	(OK 507/ Sec ID no 121 modificada)
Gly-TAC GCT CTT TGA GCT-NH_{2}	(OK 714/ Sec ID no 122 modificada)

Ejemplo 4

Inicialmente, se ensayó la capacidad de las sondas de ácido nucleico peptídico para reaccionar con secuencias objetivo de ARNr micobacteriano mediante hibridación puntual llevada a cabo con ARNr de M. bovis BCG, M. avium y E. coli.

Se cultivaron M. bovis BCG (Statens Serum Institut, Dinamarca) y M. intracellulare (generosamente provisto por Statens Serum Institut) en caldo de cultivo Dubos (Statens Serum Institut) o sobre medio de Löwenstein-Jensen (Statens Serum Institut) a 37ºC. Se aisló el ARN de las células bacterianas utilizando reactivo TRI (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se adquirió el ARNr de E. coli de Boehringer Mannheim, Alemania.

Se sometieron a hibridación puntual 200 ng de ARN de M. bovis, ARN de M. intracellulare y ARNr de E. coli sobre membranas (Schleicher & Schüel, NY 13 N), y las membranas se secaron y se fijaron bajo luz UV durante 2 minutos.

Protocolo para ensayo de hibridación puntual

Cada una de las sondas (70 nM de sonda en solución de hibridación (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, 10% (p/v) Sulfato de dextrano, 50% (v/v) glicerol, EDTA 5 mM, 0,1% (p/v) pirofosfato de sodio, 0,2% (p/v) de polivinilpirrolidona, 0,2% (p/v) Ficoll, pH 7,6)) fue colocada sobre una membrana. La hibridación fue continuada durante 1,5 horas a 55 ó 65ºC, respectivamente. Las membranas fueron enjuagadas 2 veces durante 15 minutos en tampón 2 x SSPE (1 x SSPE: NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) que contenía 0,1% SDS a temperatura ambiente, y posteriormente 2 veces durante 15 minutos en tampón 0,1 X SSPE que contenía 0,1% SDS a 55 ó 65ºC (véase la Tabla 1). La membrana fue bloqueada con 0,5% (p/v) de caseína disuelta en NaCl 0,5M, Tris 0,05M/HCl pH 9,0. A continuación, las membranas fueron incubadas durante 1 hora con anticuerpo anti FITC de conejo etiquetado con fosfatasa alcalina (AP) (DAKO K0046 frasco A) diluido 1:2000 en caseína 0,5% disuelta en NaCl 0,5M, Tris 0,05M/HCl pH 9,0. Después de incubación, las membranas se lavaron 3 veces 5 minutos con tampón TST (Tris 0,05M, NaCl 0,5M, 0,5% (p/v) Tween 20®, pH 9) a temperatura ambiente. Las sondas unidas fueron visualizadas siguiendo procedimientos convencionales utilizando BCIP/NBT y la visualización se detuvo mediante incubación durante 10 minutos con EDTA 10 mM. La hibridación se secó a 50ºC.

Los resultados son proporcionados en la Tabla 1 que aparece a continuación.

TABLA 1

	ARNr de E. coli	BCG ARN de M. bovis	ARN de M. intracellulare
Sonda	55ºC	65ºC	55ºC	65ºC	55ºC	65ºC
OK 305	negativo	negativo	positivo	positivo	negativo	débil
OK 307	negativo	negativo	positivo	positivo	negativo	débil
OK 309	negativo	negativo	positivo	positivo	negativo	débil
OK 223	negativo	negativo	positivo	positivo	nd	nd
OK 310	negativo	negativo	negativo	positivo	negativo	negativo
nd: No determinado

Los resultados indican que todas las cinco sondas de ácido nucleico peptídico son capaces de hibridarse a secuencia objetivo de BCG ARNr de M. bovis (como un representante del grupo de MTC), mientras que no se observó hibridación alguna a ARNr de E. coli (como un representante de organismos diferentes de las micobacterias) y no se observó hibridación detectable alguna a ARNr de M. intracellulare (como un representante del grupo MOTT).

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la capacidad de las sondas de ácido nucleico peptídico de penetrar en la pared celular micobacteriana y posteriormente de hibridarse a una secuencia objetivo de micobacterias del grupo de MTC y no micobacterias del grupo de MOTT, en particular no micobacterias del grupo de MAC, o Neisseria gonorrhoeae, mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH, fluorescence in situ hybridisation).

Preparación de medios bacterianos

Se cultivaron BCG de M. bovis (Statens Serum Institut, Dinamarca), M. avium (generosamente provisto por Statens Serum Institut, Dinamarca), y M. intracellulare (generosamente provisto por Statens Serum Institut, Dinamarca) en caldo de cultivo Dubos (Statens Serum Institut, Dinamarca) o sobre medios de Löwenstein-Jensen (Statens Serum Institut, Dinamarca) a 37ºC. Se cultivó N. gonorrhoeae (Statens Serum Institut, Dinamarca) sobre agar de chocolate (Statens Serum Institut, Dinamarca) a 37ºC con CO_{2} al 5% adicional.

Los cultivos fueron colocados sobre portaobjetos microscópicos y fijados de acuerdo con procedimientos estándares. Antes de la hibridación, las muestras fueron sumergidas en 80% de etanol durante 15 minutos, y posteriormente enjuagadas con agua y secadas al aire. Este paso no es esencial para el siguiente paso de hibridación, aunque se anticipa que matará cualquier micobacteria viable en los portaobjetos, y pueden servir adicionalmente como un paso de fijación adicional.

Protocolo para hibridación in situ por fluorescencia (FISH)

1. Se cubrió el portaobjeto bacteriano con una solución de hibridación que contenía la sonda en cuestión.

2. El portaobjeto se incubó en una cámara de incubación húmeda a 45ºC o 55ºC durante 90 minutos.

3. El portaobjeto se lavó 25 minutos a 45ºC o 55ºC en solución de lavado precalentada (Tris 5 mM, NaCl 145 mM, pH 10) seguido por 30 segundos en agua.

4. el portaobjeto se secó y se montó con fluido IMAGEN Mounting Fluid (DAKO, Copenhague, Dinamarca)

La solución de hibridación contiene Tris 50 mM, NaCl 10 mM, 10% (p/v) Sulfato de dextrano, 30% (v/v) formamida, 0,1% (v/v) Triton X-100®, EDTA 5 mM, 0,1% (p/v) pirofosfato de sodio, 0,2% (p/v) polivinilpirrolidona, 0,2% (p/v) Ficoll, pH 7,6.

Siempre que fue posible, el equipo aplicado se trató con calor, y las soluciones fueron expuestas a 1 ul/ml de dietilpirocarbonato (Sigma Chemical Co.) a fin de inactivar nucleasas.

Se llevaron a cabo exámenes microscópicos utilizando un microscopio de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de agua 100x/1.20, una lámpara de 100 W HBO y un conjunto de filtro FITC. Se identificaron las micobacterias como bacilos con forma de bastoncito. 1 - 10 um ligeros, fluorescentes.

Se ensayaron las sondas de ácido nucleico peptídico etiquetadas con fluoresceína con direccionamiento hacia el 23S ARNr de las micobacterias del grupo de MTC (OK 306, OK 309, OK 446, OK 449) y 16S ARNr de las micobacterias del grupo de MTC (OK 310). Las concentraciones de sondas individuales y las temperaturas de incubación son indicadas junto con los resultados en la Tabla 2 y 3.

TABLA 2

	OK 306	OK 309	OK 446	OK449
	250nM 45ºC	250nM 45ºC	500nM 55ºC	500nM 55ºC
BCG de M. bovis	positiva	positiva	positiva	positiva
M. avium	negativa	negativa	negativa	negativa
M. intracellulare	negativa	negativa	no determinado	no determinado
N. gonorrhoeae	negativa	negativa	no determinado	no determinado

TABLA 3

	OK 447	OK 310	OK 306/OK 310
	1uM 55ºC	250nM 45ºC	500/500nM 55ºC
BCG de M. bovis	positiva	positiva	positiva
M. avium	negativa	negativa	negativa
M. intracellulare	no determinado	negativa	negativa
N. gonorrhoeae	no determinado	negativa	no determinado

Puede concluirse que las sondas son capaces de penetrar en la pared celular micobacteriana de cultivos de micobacteria y posteriormente se hibridan a secuencia de ARNr objetivo. Esto hace posible el desarrollo de protocolos de hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para la detección específica de micobacterias.

Ejemplo 6 Ensayo de sondas en muestras clínicas de esputo

Se ensayó la capacidad del ácido nucleico peptídico de penetrar en la pared celular de micobacterias del grupo de MTC en muestras clínicas, en muestras de esputo de casos sospechados de tuberculosis (generosamente provisto por la División de biología, del Hospital Ramathibodi, Bangkok, Tailandia) mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Las muestras del mismo paciente fueron evaluadas, inicialmente, positivas mediante tinción Ziehl-Neelsen, lo cual muestra solamente la presencia de bacilos carentes de ácido, no si estos son micobacterias del grupo de MTC.

Se utilizaron sondas de ácido nucleico peptídico etiquetadas con fluoresceína con direccionamiento hacia 23S ARNr de las micobacterias del grupo de MTC (OK 306, OK 446, OK 449) y 16S ARNr de las micobacterias del grupo de MTC (OK 310). Adicionalmente, una sonda de ácido nucleico peptídico aleatoria un 15-mero donde cada posición puede ser A, T, C o G (obtenida de Millipore Corporation, Bedford, MA, E.U.) se agregó a la solución de hibridación a fin de aumentar la relación de señal a ruido.

Se llevó a cabo la FISH a 55ºC según lo descrito en el Ejemplo 5. Las concentraciones de sonda aplicadas son indicadas junto con los resultados en la Tabla 4 y 5.

TABLA 4

Número de muestra	OK 446/Aleatoria	OK 449/Aleatoria	Tinción
	1uM/50uM	1uM/50uM	Ziehl-Neelsen
285	Positiva	Positiva	4+
335	Positiva	Eq.	2+
345	Positiva	Positiva	3+
224	Positiva	Positiva	3+
297	Negativa	Eq.	2+
179	Negativa	Negativa	4+
247	Negativa	Negativa	2+
255	Positiva	Positiva	2+
202	Eq.	Positiva	2+

TABLA 5

Número de muestra	OK 306/OK 310 500/500 nM	Tinción Ziehl-Neelsen
213	Positiva	4+
292	Positiva	4+
159	Positiva	3+
287	Positiva	3+

Las muestras teñidas mediante tinción Ziehl-Neelsen fueron examinadas con un objetivo 100x y calificadas de acuerdo con el siguiente método: -: 0 bacilos, +/-: 1-200 por cada 300 campos, 2+: 1-9 por cada 10 campos, 3+: 1-9 por cada campo, 4+: >9 por cada campo.

Positiva: Diversas micobacterias fueron identificadas en la muestra. Negativa: No se identificaron micobacterias fluorescentes en la muestra. Eq: Se identificaron pocas (1-3) micobacterias fluorescentes en la muestra.

Da la impresión que, de acuerdo con los observado en la tabla, las sondas de ácido nucleico peptídico son capaces de penetrar y posteriormente hibridarse a una secuencia objetivo de micobacterias del grupo de MTC en muestras de esputo AFB-positivas. El hecho de que no todas las muestras de esputo AFB-positivas son encontradas positivas con las sondas aplicadas indica que no todas las muestras de esputo AFB-positivas contienen micobacterias del grupo de MTC.

Ejemplo 7

Se evaluaron la reactividad y especificidad de las sondas de ácido nucleico peptídico seleccionadas para detectar micobacterias del grupo de MTC como así también sondas para detectar micobacterias del grupo de MOTT mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH) en muestras control preparadas a partir de cultivos de diferentes especies de micobacterias. Se seleccionaron las especies de micobacterias de modo que sean representativas para el género mycobacterium como así también para incluir especies clínicamente relevantes.

Se cultivaron M. tuberculosis (ATCC 25177), M. bovis BCG (ATCC 35734), M. intracellulare (ATCC 13950), M. avium (ATCC 25292), M. kansasii (ATCC 12479), M. gordonae (ATCC 14470), M. scrofulaceum (ATCC 19981), M. abscessus (ATCC19977), M. marinum (ATCC 927), M. simiae (ATCC 25575), M. szulgai (ATCC 35799), M. flavescens (ATCC 23033), M. fortuitum (ATCC 43266) y M. xenopi (ATCC19250) en caldo de cultivo Dubos (Statens Serum Institut) a 37ºC con la excepción de M. marinum que se cultivó a 32ºC.

Las muestras se prepararon según lo descrito en el Ejemplo 5. Se llevó a cabo la FISH según lo descrito a continuación.

Protocolo para la hibridación in situ por fluorescencia (FISH)

1. El portaobjeto bacteriano se cubrió con una solución de hibridación que contenía la sonda en cuestión.

2. El portaobjeto se incubó en una cámara de incubación húmeda a 55ºC durante 90 minutos.

3. El portaobjeto se lavó durante 30 minutos a 55ºC en solución de lavado precalentada (Tris 5 mM, NaCl 15 mM, 0,1% (v/v), Triton X-100®, pH 10) seguido por 30 segundos en agua.

La solución de hibridación contenía Tris 50 mM, NaCl 10 mM, 10% (p/v) Sulfato de dextrano, 30% (v/v) formamida, 0,1% (v/v) Triton X-100®, EDTA 5 mM, 0,1% (p/v) pirofosfato de sodio, 0,2% (p/v) polivinilpirrolidona y 0,2% (p/v) Ficoll, pH 7,6. Para evitar una unión no específica de la sonda de ácido nucleico peptídico etiquetada, 1-5 uM de sonda de ácido nucleico peptídico sin sentido, no etiquetada se agregó a la solución de hibridación (OK 507/Sec ID no 121 modificada y/o OK 714/Sec ID no 122 modificada).

Siempre que fue posible, el equipo aplicado se trató con calor, y las soluciones fueron expuestas a 1 ul/ml de dietilpirocarbonato (Sigma Chemical Co.) a fin de inactivar a las nucleasas.

Se llevaron a cabo exámenes microscópicos utilizando un microscopio de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de aceite 100x/1.30, una lámpara de 100 W HBO y un conjunto de filtro de doble banda FITC/TRITC. Las micobacterias fueron identificadas sobre la base de fluorescencia (fuerte, mediana, débil, ninguna) y de morfología (bacilos 1-10 um ligeros, con forma de bastoncitos. Las micobacterias del grupo de MOTT pueden parecer pleomórficas, con una apariencia que va desde bastoncitos largos a formas cocoides).

Las concentraciones de las sondas son indicadas junto con los resultados en la Tabla 6 y 7 (sondas con direccionamiento hacia las micobacterias del grupo de MTC) y la Tabla 8 (sondas con direccionamiento hacia las micobacterias del grupo de MOTT).

TABLA 6

	OK 450 25 nM	OK 682 100 nM	OK 689 100 nM	OK 688 250 nM	OK 660 100 nM
M. tuberculosis	+++	+++	+++	+++	+++
M. bovis BCG	+++	+++	+++	+++	+++
M. intracellulare	-	-	-	-	-
M. avium	-	-	-	-	-
M. kansasii	++	-	-	-	-
M. gordonae	-	-	-	-	-
M. scrofulaceum	+++	-	-	-	-
M. abscessus	-	-	-	-	+
M. marinum	+++	-	+	+	+++
M. simiae	-	-	-	-	-
M. szulgai	+++	-	-	-	-
M. flavescens	-	++	-	-	-
M. fortuitum	-	+	-	-	-
M. xenopi	-	++	-	-	-
+++ fluorescencia fuerte,
++ fluorescencia media,
+ fluorescencia débil,
- sin fluorescencia

TABLA 7

Micobacterias	OK 655 150 nM	OK 448 50 nM	OK 654 100 nM	OK 446 25 nM
M. tuberculosis	+++	+++	+++	+++
M. bovis BCG	+++	+++	+++	+++
M. intracellulare	-	-	-	-
M. avium	-	-	-	-
M. kansasii	-	-	-	-
M. gordonae	-	-	-	-
M. scrofulaceum	-	-	-	-
M. abscessus	-	-	+	-
M. marinum	-	-	+	+++
M. simiae	-	-	-	-
M. szulgai	-	-	-	-
M. flavescens	-	-	-	-
M. fortuitum	-	-	-	-
M. xenopi	-	-	-	-
+++ fluorescencia fuerte,
++ fluorescencia media,
+ fluorescencia débil
- sin fluorescencia

TABLA 8

Micobacterias	OK 612 100 nM	OK 624 100 nM	OK 623 100 nM
M. tuberculosis	-	-	-
M. bovis BCG	-	-	-
M. intracellulare	-	++	++
M. avium	+++	+++	+++
M. kansasii	-	-	+++
M. gordonae	-	++	++
M. scrofulaceum	-	++	++
M. abscessus	-	++	+++
M. marinum	-	-	-
M. simiae	-	++	+++
M. szulgai	-	-	+++

TABLA 8 (continuación)

Micobacterias	OK 612 100 nM	OK 624 100 nM	OK 623 100 nM
M. flavescens	-	-	-
M. fortuitum	-	++	-
M. xenopi	-	-	-
+++ fluorescencia fuerte,
++ fluorescencia media,
+ fluorescencia débil
- sin fluorescencia

Cada una de las sondas indicadas en la Tabla 6, 7 y 8 fue investigada aun más en lo que respecta a la hibridación a otras bacterias respiratorias comunes, básicamente Corynebacterium spp., Fusobacterium nucleatum, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Streptococcuc pneumoniae, Staphylococcus aureus, Brahamella catarrahalis, Escherichia coli, Neisseria spp., Actinobacter calcoaceticus, Actinomyces spp., Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas maltophilia, Streptocussuc viridans y Norcardia asteroides. No se observó hibridación cruzada alguna mediante hibridación in situ por fluorescencia a ninguna de estas bacterias en el caso de OK 682, OK 654, OK 655, OK 688, OK 660, OK 612, OK 624 y OK 623. Se observó cierta reactividad cruzada en el caso de OK 446 (a P. acnes), OK 448 (a P. acnes y B. catarrhalis) y OK 450 (a P. acnes y B. catarrhalis).

La Tabla 6 y 7 muestran que ninguna de las sondas de MTC reacciona en forma cruzada con M. intracellulare y/o M. avium, aunque, de hecho, fuertemente con M. tuberculosis y M. bovis BCG. Como se muestra en la Tabla 8, tanto OK 624 como OK 623 se hibridan a M. intracellulare y M. avium las cuales ambas son miembros del grupo de MAC, mientras que ninguna de ellas se hibrida a M. tuberculosis o M. bovis BCG. OK 612 se hibrida a M. avium solamente. Debería señalarse que la secuencia alineada de M. intracellulare tiene solamente una diferencia de nucleobase con la secuencia objetivo de M. avium, véase la Figura 4K.

La información sustenta el uso de la metodología descrita en la reivindicación 3 y 4 y ejemplificada en el Ejemplo 2 para diseñar sondas de ácido nucleico peptídico que son capaces de hibridarse a una secuencia objetivo de una o más especies mycobacterium y no a otras especies mycobacterium que tienen por lo menos una diferencia de nucleobase a la secuencia objetivo.

Ejemplo 8

Para estudiar la utilidad de las sondas de ácido nucleico peptídico en la distinción entre micobacterias del grupo de MTC y micobacterias del grupo de MOTT, las sondas se ensayaron en muestras de cultivos mycobacterium-positivos preparados de 34 + 28 muestras clínicas (muestras de esputo, otras muestras respiratorias y muestras extrapulmonares) de individuos sospechados de tener tuberculosis u otras infecciones micobacterianas (generosamente provistas por el Mycobacterium Department, Statens Serum Institut, Dinamarca). Los datos de identificación de complejo/ especie obtenidos con los ensayos AccuProbe de Gen-Probe Inc., Estados Unidos de América, estaban disponibles para cada muestra.

La Tabla 9 muestra los resultados obtenidos con cuatro sondas de ácido nucleico peptídico diferentes con direccionamiento hacia micobacterias del grupo de MTC (OK 682, OK 660, OK 688 y OK 689) y una sonda con direccionamiento hacia micobacterias del grupo de MOTT (OK 623) y la Tabla 10 muestra los resultados obtenidos con dos sondas de ácido nucleico peptídico con direccionamiento hacia micobacterias del grupo de MOTT (OK 623 y OK 612) y una mezcla de dos sondas con direccionamiento hacia micobacterias del grupo de MTC (OK 688 y OK 689). Los datos son organizados de acuerdo con los resultados obtenidos mediante AccuProbe. La preparación, la hibridación y la visualización de las muestras se llevaron a cabo según lo descrito en el Ejemplo 7.

TABLA 9

Complejo/Especie	OK 623 23 nM	OK 682 100 nM	OK 660 100 nM	OK 688 250 nM	OK 689 100 nM
(n)	n_{p}	n_{p}	n_{p}	n_{p}	n_{p}
MTC (23)	0	23	23	23	23
M. avium (5)	5	0	0	0	0
M. gordonae (3)	3	0	0	0	0
Desconocido *(3)	3	0	0	0	0
n_{p} denota número de muestras positivas.
* El término "desconocido" significa que la muestra no contiene micobacterias del grupo de MTC, o micobacterias
del grupo de MAC de acuerdo con el ensayo AccuProbe, aunque no se llevó a cabo una identificación de otras es-
pecies.

TABLA 10

Complejo/Especie	OK 623 25 nM	OK 612 100 nM	OK 688/OK 689
(n)	n_{p}	n_{p}	50 nM/50 nM
			n_{p}
MTC (17)	0		16
M. avium (2)	2	2	0
M. gordonae (4)	3	0	0
Desconocido* (5)	5	0	0
n_{p} denota el número de muestras positivas.
* El término "desconocido" significa que la muestra no contiene micobacterias del grupo de MTC, o micobacterias
del grupo de MAC de acuerdo con el ensayo AccuProbe, aunque no se llevó a cabo una identificación de otras es-
pecies.

Los resultados mostrados en la Tabla 9 están en conformidad con la identificación de complejo/ especie llevada a cabo con los ensayos AccuProbe, y de ese modo confirman que las sondas de ácido nucleico peptídico se pueden utilizar para determinar si una infección es causada por micobacterias del grupo de MTC o por micobacterias del grupo de MOTT.

A partir de los resultados de la Tabla 10, puede verse que es posible diferenciar entre micobacterias del grupo de MTC y micobacterias del grupo de MOTT con un 100% de especificidad y 91-94% de sensibilidad con relación a los resultados obtenidos por los ensayos AccuProbe. Por añadidura, OK 612 es muy adecuada para la identificación específica de M. avium entre las que son positivas para micobacterias del grupo de MOTT ya que el resultado es positivo en el caso de M. avium y negativo en los otros casos de micobacterias del grupo de MOTT.

Ejemplo 9 Detección directa de micobacterias en muestras clínicas de esputo

Este ejemplo demuestra la capacidad del ácido nucleico peptídico de detectar e identificar micobacterias directamente en muestras de esputo AFB-positivas a partir de casos sospechados de tuberculosis (generosamente provistos por la División de biología, del Hospital Ramathibodi, Bangkok, Tailandia) y se muestra casos sospechados de otras infecciones micobacterianas (generosamente provisto por el Depto de Microbiología Clínica, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca) por FISH.

Las muestras clínicas fueron preparadas de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, y se llevó a cabo FISH según lo descrito en el Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11

No. de muestra	OK 623	OK 654	OK 655	OK 682	OK 688	OK 689
	25 nM	100 nM	150 nM	100 nM	250 nM	100 nM
1	-	++	++	++	++	++
175	-	++	nd	nd	++	++
459	-	-	nd	nd	-	-
166	-	-	-	nd	-	-
268	-	++	++	++	++	++
34267	++	-	-	-	-	-
nd: no determinado
+++ fluorescencia fuerte,
++ fluorescencia media,
+ fluorescencia débil
- sin fluorescencia

Surge a partir de los ejemplos en la Tabla 11 que las muestras de esputo AFB-positivas fueron evaluadas positivas para micobacterias del grupo de MTC (números de muestras 1, 175 y 268), positivas para micobacterias del grupo de MOTT (número de muestra 37267), o negativas para micobacterias (números de muestras, 459 y 166) por las sondas aplicadas. Por consiguiente, las sondas de ácido nucleico peptídico son reactivos útiles para la identificación específica de micobacterias directamente en muestras de esputo mediante hibridación in situ por fluorescencia. Las muestras de esputo AFB-positivas que son negativas con todas las sondas pueden ser explicadas de tres maneras: a) la muestra puede contener micobacterias no detectadas por las sondas, por ejemplo, M. fortuitum, b) la muestra puede contener otras bacterias a prueba de ácido diferentes a las micobacterias, o c) las micobacterias en la muestra carecen o tienen un contenido fuertemente reducido de ARNr debido a, por ejemplo, tratamiento con antibióticos.

Como conclusión, la identificación directa de micobacterias en muestras de esputo positivas mediante hibridación in situ por fluorescencia a base de ácido nucleico peptídico combina simplicidad y las ventajas morfológicas de los métodos de tinción actuales con la identificación de especies concomitante, y así permitirá que los laboratorios de microbiología clínica se beneficien de las ventajas ofrecidas por las técnicas moleculares para proporcionar información crucial perteneciente a la terapia y manejo del paciente.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra la detección e identificación simultáneas de micobacterias del grupo de MTC y micobacterias del grupo de MOTT utilizando sondas etiquetadas en forma diferente con direccionamiento hacia micobacterias del grupo de MTC y micobacterias del grupo de MOTT, respectivamente, mediante hibridación in situ por fluorescencia.

Las muestras control de diferentes especies de micobacterias se prepararon según lo descrito en el Ejemplo 5. Adicionalmente, se prepararon muestras que contenían una mezcla de M. tuberculosis y M. avium (Tabla 8, última fila). Se llevó a cabo la FISH según lo descrito en el Ejemplo 7.

Una sonda de ácido nucleico peptídico etiquetada con rodamina con direccionamiento hacia 16S ARNr de micobacterias del grupo de MTC (OK 702) y una sonda de ácido nucleico peptídico etiquetada con fluoresceína con direccionamiento hacia 16S ARNr de micobacterias del grupo de MOTT (OK 623) se aplicaron simultáneamente en las concentraciones indicadas en la Tabla 12 junto con los resultados.

TABLA 12

Especie de micobacteria	OK 623/OK 702 25/250 nM
M. tuberculosis	- (G) / +++(R)
M. bovis BCG	- (G) / +++(R)
M. avium	+++ (G) / - (R)
M. intracellulare	+++ (G) / - (R)
M. kansasii	+++ (G) / - (R)
M. avium / M. tuberculosis	+++ (G) / +++ (R)
+++ fluorescencia fuerte - sin fluorescencia
G fluorescencia verde, R fluorescencia roja

Las micobacterias del grupo de MTC, es decir M. tuberculosis y M. bovis, fueron observadas como micobacterias fluorescentes verdes, mientras que las micobacterias del grupo de MOTT, es decir M. avium, M. intracellulare y M. kansasii, fueron observadas como micobacterias fluorescentes rojas. Las micobacterias en la mezcla de M. avium / M. tuberculosis fueron identificadas mediante una mezcla tanto de micobacterias fluorescentes verdes como de micobacterias fluorescentes rojas.

Los resultados muestran que es posible distinguir entre diferentes especies de micobacterias en una muestra utilizando una mezcla de sondas diferentemente etiquetadas. Ese tipo de detección e identificación simultáneas de micobacterias puede extenderse adicionalmente para comprometer tres o más sondas de ácido nucleico peptídico etiquetadas en forma diferente.

Ejemplo 11

La capacidad de una sonda de ácido nucleico peptídico de hibridarse a ARNr precursor y además de distinguir entre ARNr precursor de M. tuberculosis y ARNr precursor de M. avium se investigó mediante hibridación in situ por fluorescencia.

Se prepararon muestras según lo descrito en el Ejemplo 5 y se llevó a cabo FISH según lo descrito en el Ejemplo 7 utilizando una sonda etiquetada con fluoresceína con direccionamiento hacia ARNr precursor de M. tuberculosis (OK 749). Los resultados se brindan en la Tabla 13.

TABLA 13

Micobacteria	OK 749 1000 nM
M. tuberculosis	+
M. avium	-
+ fluorescencia débil
- sin fluorescencia

A partir de los resultados, puede concluirse que es posible detectar ARNr precursor, y adicionalmente que es posible distinguir entre ARNr precursor de diferentes especies de micobacterias. La aplicación de ácido nucleico peptídico con direccionamiento hacia ARNr precursor puede ser especialmente útil para medir el crecimiento micobacteriano y así ser un indicador de la viabilidad de las micobacterias. Esto sería especialmente importante para el monitoreo del efecto de los antibióticos con relación tanto al tratamiento de la tuberculosis como a los estudios de susceptibilidad a las drogas.

Ejemplo 12

La capacidad de las sondas de ácido nucleico peptídico para la diferenciación de micobacterias susceptibles a las drogas y resistentes a las drogas fue evaluada utilizando una sonda etiquetada con fluoresceína con direccionamiento a la secuencia del tipo salvaje de 23S ARNr de M. avium y M. intracellulare conjuntamente con sondas etiquetadas con rodamina con direccionamiento a mutaciones de un solo punto asociadas con la resistencia a los macrólidos en M. avium y M. intracellulare.

Las muestras se prepararon según lo descrito en el Ejemplo 5 a partir de cultivos de M. avium (ATCC no. 25292) y M. intracellulare (ATCC no. 13950). Estas cepas se piensa que contienen la secuencia del tipo salvaje de ARNr. Las variantes resistentes a los macrólidos no se encontraban disponibles. Se llevó a cabo FISH según lo descrito en el Ejemplo 7 utilizando una sonda de ácido nucleico peptídico etiquetada con fluoresceína con direccionamiento a 23S ARNr del tipo salvaje (OK 745) y una mezcla de sondas de ácido nucleico peptídico etiquetadas con rodamina con direccionamiento hacia las tres mutaciones posibles en la posición 2568 (OK 746) y en la posición 2569 (OK 747) de 23S ADNr de M. avium de la entrada al GenBank X52917 (véase la Figura 6). Los resultados son proporcionados en la Tabla 14.

TABLA 14

Especie de micobacteria	OK 745/OK 746/OK 747 500/500/500 nM
M. avium (tipo salvaje)	+++ (G) / - (R)
+++ fluorescencia fuerte - sin fluorescencia
G fluorescencia verde, R fluorescencia roja
OK 746 y OK 747 son individualmente una mezcla de tres sondas de mutaciones de un solo punto

Los resultados en la Tabla 14 muestran que M. avium y M. intracellulare son detectados con la sonda etiquetada con fluoresceína (OK 745) con direccionamiento hacia los tipos salvajes de M. avium y M. intracellulare y no son detectados con la mezcla de sondas etiquetadas con rodamina (OK 746 y OK 747) con direccionamiento hacia mutaciones de un solo punto asociadas con la resistencia a los macrólidos. Ese tipo de sondas de ácido nucleico peptídico con direccionamiento hacia el tipo salvaje y las variantes resistentes a las drogas, respectivamente, pueden ser herramientas importantes tanto para la predicción de una terapia eficiente como así también para el control del efecto del tratamiento.

Ejemplo 13

Para ilustrar la velocidad con la cual las sondas de ácido nucleico peptídico penetran en la pared celular micobacteriana y posteriormente se hibridan a su secuencia objetivo se modificó el protocolo descrito en el Ejemplo 7 a tiempo de hibridación de 15 minutos y los resultados se compararon con el tiempo de hibridación de 90 minutos. Las muestras se prepararon según lo descrito en el Ejemplo 5. Los resultados se proporcionan en la Tabla 15.

TABLA 15

	OK 623 25 nM	OK 689 100 nM
	15 min	90 min	15 min	90 min
M. tuberculosis			++	++
M. avium	++	+++
+++ fluorescencia fuerte ++ fluorescencia media
+ fluorescencia débil - sin fluorescencia

Los datos presentados en la Tabla 15 muestran que la hibridación por las sondas de ácido nucleico peptídico dentro de las células micobacterianas se logra en un muy corto tiempo dando como resultado una señal detectable después de sólo 15 minutos de incubación. Por lo tanto, el uso de sondas de ácido nucleico peptídico hace posible el desarrollo de protocolos de hibridación in situ por fluorescencia muy rápidos.

Ejemplo 14

Para describir la capacidad de las sondas de ácido nucleico peptídico muy cortas para hibridarse a secuencias objetivo, se ensayó una sonda de ácido nucleico peptídico de 12-meros etiquetada con fluoresceína (OK 575) mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH).

Se prepararon muestras según lo descrito en el Ejemplo 5 y se llevó a cabo la FISH según lo descrito en el Ejemplo 7. Los resultados se proporcionan en la Tabla 16.

TABLA 16

Micobacteria	OK 575 50 nM
M. tuberculosis	+
M. bovis BCG	++
M. avium	-
M. intracellulare	-
M. kansasii	-
++ fluorescencia media
+ fluorescencia débil
- sin fluorescencia

Los resultados de la tabla 17 muestran que una sonda de ácido nucleico peptídico de 12-meros es capaz de hibridarse específicamente a secuencias objetivo bajo las mismas condiciones de severidad que 15-meros. Se obtiene una intensidad de fluorescencia inferior a medida que el T_{m} para una sonda de ácido nucleico peptídico de 12-meros sea inferior al T_{m} para una sonda de ácido nucleico peptídico de 15-meros.

Los datos sugieren claramente que bajando la condición de severidad, por ejemplo, disminuyendo la temperatura de hibridación/ lavado y/o la concentración de formamida, pueden aplicarse sondas aun más cortas para la detección de micobacterias siempre que puedan diseñarse secuencias específicas de ese tipo.

Claims

1. Una sonda de ácido nucleico peptídico para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias presentes opcionalmente en una muestra, siendo dicha sonda capaz de hibridarse a una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o ARNr micobacteriano que forman híbridos detectables, y una mezcla de ese tipo de sondas.

2. Una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1, siendo dicha sonda capaz de hibridarse a una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr micobacteriano que forman híbridos detectables, y una mezcla de ese tipo de sondas.

3. Una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, siendo dicha sonda capaz de hibridarse a una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr micobacteriano que forman híbridos detectables, siendo dicha secuencia objetivo obtenible

(a) comparando las secuencias de nucleobases de dicho ARNr o ADNr micobacteriano de una o más micobacterias a ser detectadas con la correspondiente secuencia de nucleobases de organismo(s), en particular otras micobacterias, en particular otras micobacterias, de las cuales se deben distinguir dicha una o más micobacterias,

(b) seleccionando una secuencia objetivo de dicho ARNr o ADNr que incluye al menos una nucleobase que difiere de la nucleobase correspondiente del organismo o de los organismos, en particular otras micobacterias, de las cuales se deben distinguir dicha una o más micobacterias, y

(c) determinando la capacidad de dicha sonda de hibridarse a la secuencia objetivo seleccionada para formar híbridos detectables, y una mezcla de ese tipo de sondas.

4. Una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, siendo dicha sonda capaz de hibridarse a una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr micobacteriano que forman híbridos detectables, siendo dicha sonda obtenible

(b) seleccionando una secuencia objetivo de dicho ARNr o ADNr que incluye al menos una nucleobase que difiere de la nucleobase correspondiente del organismo o de los organismos, en particular otras micobacterias, de las cuales se deben distinguir dicha una o más micobacterias,

(c) sintetizando dicha sonda, y

(d) determinando la capacidad de dicha sonda de hibridarse a la secuencia objetivo seleccionada para formar híbridos detectables, y una mezcla de ese tipo de sondas.

5. Una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) o para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 6 y 30 porciones de ácido nucleico peptídico polimerizadas, siendo dicha sonda capaz de hibridarse a una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr micobacteriano que forman híbridos detectables, y una mezcla de ese tipo de sondas.

6. Una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para detectar una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) o para detectar una secuencia objetivo de ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de fórmula (I)

3

donde

cada X e Y designa en forma independiente O u S,

con la condición de que la sonda que comprende ese tipo de subsecuencia sea capaz de formar híbridos detectables con la secuencia objetivo de dicho ADNr, ARNr precursor o 23S, 16S o 5S ARNr micobacteriano, y una mezcla de ese tipo de sondas.

7. Una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar una secuencia objetivo de 23S ARNr de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6,

con la condición de que las Qs de porciones adyacentes sean seleccionadas de modo de formar una secuencia de la cual una subsecuencia incluye al menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 23S ARNr de M. tuberculosis que difiere de la correspondiente nucleobase de por lo menos M. avium situada dentro de los siguiente dominios

Las posiciones 149-158 en la Figura 1A,

Las posiciones 220-221 en la Figura 1A,

Las posiciones 328-361 en la Figura 1A y Figura 1B,

Las posiciones 453-455 en la Figura 1B,

Las posiciones 490-501 en la Figura 1B,

Las posiciones 637-660 en la Figura 1C,

Las posiciones 706-712 en la Figura 1D,

Las posiciones 762-789 en la Figura 1D,

La posición 989 en la Figura 1D,

Las posiciones 1068-1072 en la Figura 1D,

La posición 1148 en la Figura 1E,

Las posiciones 1311-1329 en la Figura 1E,

Las posiciones 1361-1364 en la Figura 1F,

La posición 1418 en la Figura 1F,

Las posiciones 1563-1570 en la Figura 1F,

Las posiciones 1627-1638 en la Figura 1G,

Las posiciones 1675-1677 en la Figura 1G,

La posición 1718 en la Figura 1G,

Las posiciones 1734-1740 en la Figura 1H,

Las posiciones 1967-1976 en la Figura 1H,

Las posiciones 2403-2420 en la Figura 1H,

Las posiciones 2457-2488 en la Figura 1I,

Las posiciones 2952-2956 en la Figura 1I,

Las posiciones 2966-2969 en la Figura 1J,

Las posiciones 3000-3003 en la Figura 1J o

Las posiciones 3097-3106 en la Figura 1J,

y adicionalmente con la condición de que la sonda que comprende ese tipo de subsecuencia es capaz de formar híbidos detectables con una secuencia objetivo de dicho 23S ARNr micobacteriano, y una mezcla de ese tipo de sondas.

8. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar una secuencia objetivo de 16S ARNr de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 16S ARNr de M. tuberculosis que difiere de la nucleobase correspondiente de por lo menos M. avium situada dentro de los siguientes dominios

Las posiciones 76-79 en la Figura 2A,

Las posiciones 98-101 en la Figura 2A,

Las posiciones 135-136 en la Figura 2A,

Las posiciones 194-201 en la Figura 2B,

Las posiciones 222-229 en la Figura 2B,

La posición 242 en la Figura 2B,

La posición 474-en la Figura 2C,

Las posiciones 1136-1145 en la Figura 2C,

Las posiciones 1271-1272 en la Figura 2C,

Las posiciones 1287-1292 en la Figura 2D,

La posición 1313 en la Figura 2D, o

La posición 1334 en la Figura 2D,

y adicionalmente con la condición de que la sonda que comprende ese tipo de subsecuencia es capaz de formar híbidos detectables con una secuencia objetivo de dicho 16S ARNr micobacteriano, y una mezcla de ese tipo de sondas.

9. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar una secuencia objetivo de 5S ARNr de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 5S ARNr de M. tuberculosis que difiere de la nucleobase correspondiente de por lo menos M. avium situada dentro del siguiente dominio

Las posiciones 86-90 en la Figura 3

y adicionalmente con la condición de que la sonda que comprende ese tipo de subsecuencia es capaz de formar híbidos detectables con una secuencia objetivo de dicho 5S ARNr micobacteriano, y una mezcla de ese tipo de sondas.

10. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para detectar una secuencia objetivo de 23S o 16S ARNr de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 23S o 16S ARNr de M. tuberculosis que difiere de la nucleobase correspondiente de por lo menos M. avium situada dentro de los siguientes dominios

Las posiciones 149-158 en la Figura 1A,

Las posiciones 328-361 en la Figura 1A y Figura 1B,

Las posiciones 490-501 en la Figura 1B,

Las posiciones 637-660 en la Figura 1C,

Las posiciones 762-789 en la Figura 1D,

Las posiciones 1068-1072 en la Figura 1D,

Las posiciones 1311-1329 en la Figura 1E,

Las posiciones 1361-1364 en la Figura 1F,

Las posiciones 1563-1570 en la Figura 1F,

Las posiciones 1627-1638 en la Figura 1G,

Las posiciones 1734-1740 en la Figura 1H,

Las posiciones 2457-2488 en la Figura 1I,

Las posiciones 2952-2956 en la Figura 1I,

Las posiciones 3097-3106 en la Figura 1J,

Las posiciones 135-136 en la Figura 2A, o

Las posiciones 1287-1292 en la Figura 2D,

y adicionalmente con la condición de que la sonda que comprende ese tipo de subsecuencia es capaz de formar híbidos detectables con una secuencia objetivo de dicho 23S o 16S ARNr micobacteriano, y una mezcla de ese tipo de sondas.

11. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar una secuencia objetivo de 23S ARNr de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 23S ARNr de M. avium que difiere de la nucleobase correspondiente de por lo menos M. tuberculosis situada dentro de los siguientes dominios

Las posiciones 99-101 en la Figura 4A,

La posición 183 en la Figura 4A,

Las posiciones 261-271 en la Figura 4A,

Las posiciones 281-284 en la Figura 4B,

Las posiciones 290-293 en la Figura 4B,

Las posiciones 327-335 en la Figura 4B,

Las posiciones 343-357 en la Figura 4B,

Las posiciones 400-405 en la Figura 4B y Figura 4C,

Las posiciones 453-462 en la Figura 4C,

Las posiciones 587-599 en la Figura 4C,

Las posiciones 637-660 en la Figura 4D,

Las posiciones 704-712 en la Figura 4D,

Las posiciones 763-789 en la Figura 4E,

Las posiciones 1060-1074 en la Figura 4E,

Las posiciones 1177-1185 en la Figura 4E,

Las posiciones 1259-1265 en la Figura 4F,

Las posiciones 1311-1327 en la Figura 4F,

Las posiciones 1345-1348 en la Figura 4F,

Las posiciones 1361-1364 en la Figura 4G,

Las posiciones 1556-1570 en la Figura 4G,

Las posiciones 1608-1613 en la Figura 4H,

Las posiciones 1626-1638 en la Figura 4H,

Las posiciones 1651-1659 en la Figura 4H,

Las posiciones 1675-1677 en la Figura 4H,

Las posiciones 1734-1741 en la Figura 4H,

Las posiciones 1847-1853 en la Figura 4I,

Las posiciones 1967-1976 en la Figura 4I,

Las posiciones 2006-2010 en la Figura 4I,

Las posiciones 2025-2027 en la Figura 4I,

Las posiciones 2131-2132 en la Figura 4J,

Las posiciones 2252-2255 en la Figura 4J,

Las posiciones 2396-2405 en la Figura 4J y Figura 4K,

Las posiciones 2416-2420 en la Figura 4K,

Las posiciones 2474-2478 en la Figura 4K,

La posición 2687 en la Figura 4K,

La posición 2719 en la Figura 4K,

La posición 2809 en la Figura 4L,

Las posiciones 3062-2068 en la Figura 4L, o

Las posiciones 3097-3106 en la Figura 4L,

12. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar una secuencia objetivo de 16S ARNr de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 16S ARNr de M. avium que difiere de la nucleobase correspondiente de por lo menos M. tuberculosis situada dentro de los siguientes dominios

Las posiciones 135-136 en la Figura 5A,

Las posiciones 472-475 en la Figura 5A,

Las posiciones 1136-1144 en la Figura 5A,

Las posiciones 1287-1292 en la Figura 5B,

La posición 1313 en la Figura 5B, ó

La posición 1334 en la Figura 5B,

13. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 11 y 12 para detectar una secuencia objetivo de 23S o 16S ARNr de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase de 23S o 16S ARNr de M. avium que difiere de la nucleobase correspondiente de por lo menos M. tuberculosis situada dentro de los siguientes dominios

Las posiciones 99-101 en la Figura 4A,

Las posiciones 290-293 en la Figura 4B,

Las posiciones 400-405 en la Figura 4B y Figura 4C,

Las posiciones 453-462 en la Figura 4C,

Las posiciones 637-660 en la Figura 4D,

Las posiciones 763-789 en la Figura 4E,

Las posiciones 1311-1327 en la Figura 4F,

Las posiciones 1361-1364 en la Figura 4G,

Las posiciones 1734-1741 en la Figura 4H,

Las posiciones 2025-2027 en la Figura 4I,

Las posiciones 2474-2478 en la Figura 4K,

Las posiciones 3062-2068 en la Figura 4L, o

Las posiciones 1287-1292 en la Figura 5B,

14. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar una secuencia objetivo de 23S, 16S o 5S ARNr de una o más micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) o para detectar una secuencia objetivo de 23S, 16S o 5S ARNr de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (MOTT) opcionalmente presentes en una muestra, dicha sonda comprende entre 10 y 30 porciones polimerizadas de la fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 6, con la condición de que las Qs de porciones adyacentes son seleccionadas de modo que formen una secuencia de la cual una subsecuencia incluye por lo menos una nucleobase que es complementaria de una nucleobase que difiere de la nucleobase correspondiente de 23S, 16S o 5S ARNr de dicha una o más micobacterias situadas dentro de los siguientes dominios

Las posiciones 2568-2569 en la Figura 6,

La posición 452 en la Figura 7,

Las posiciones 473-477 en la Figura 7, o

Las posiciones 865-866 en la Figura 7,

y adicionalmente con la condición de que la sonda que comprende ese tipo de subsecuencia es capaz de formar híbidos detectables con una secuencia objetivo de dicho 23S, 16S o 5S ARNr micobacteriano, y una mezcla de ese tipo de sondas.

15. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 de fórmula (II), (III) o (IV)

4

5

6

donde Z, R^{2}, R^{3} y R^{4}, y Q son como se definieron en la reivindicación 6 con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14, y una mezcla de ese tipo de sondas.

16. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde Z es NH, NCH_{3} u O, cada R^{2}, R^{3} y R^{4} designa en forma independiente H o la cadena lateral de un aminoácido de presentación natural, la cadena lateral de un aminoácido que no es de presentación natural, o alquilo C_{1-4}, y cada Q es una nucleobase de presentación natural o una nucleobase de presentación no natural con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14, y una mezcla de ese tipo de sondas.

17. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde Z es NH u O, y R^{2} es H o la cadena lateral de Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser o Thr, y Q es una nucleobase seleccionada entre timina, adenina, citosina, guanina, uracilo, iso-C y 2,6-diaminopurina con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14, y una mezcla de ese tipo de sondas.

18. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 de fórmula (V)

7

donde R^{4} es H o la cadena lateral de Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser o Thr, y Q es como se definió en la reivindicación 17 con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14, y una mezcla de ese tipo de sondas.

19. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende además una o más etiquetas y una mezcla de ese tipo de sondas, dichas etiquetas pueden ser mutuamente idénticas o diferentes, dichas sondas pueden comprender, opcionalmente, uno o más ligantes, y dichas sondas pueden ser mutuamente idénticas o diferentes con las condiciones definidas en las reivindicaciones 6 a 14.

20. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias, siendo la secuencia de la nucleobase de dicha sonda sustancialmente complementaria de la secuencia de la nucleobase de dicha secuencia objetivo.

21. La sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias, siendo la secuencia de la nucleobase de dicha sonda complementaria de la secuencia de la nucleobase de dicha secuencia objetivo.

22. Las sondas de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde las Qs de porciones adyacentes se seleccionan de modo de formar las siguientes subsecuencias

(Secuencias pasa a página siguiente)

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CAT GTG TCC TGT GGT y (Sec ID no 117) CGT CAG CCC GAG AAA (Sec ID no 118) CAC TAC ACA CGC TCG (Sec ID no 119) TGG CGT TGA GGT TTC y (Sec ID no 120) AAC ACT CCC TTT GGA (Sec ID no 123)

y una mezcla de ese tipo de sondas.

23. Las sondas de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 22, donde las Qs de porciones adyacentes se seleccionan de modo de formar las siguientes subsecuencias

TCA CCA CCC TCC TCC (Sec ID no 6) CCA CCC TCC TCC (Sec ID no 6 modificada) ACT ATT CAC ACG CGC (Sec ID no 8) CCA CAC CCA CCA CAA (Sec ID no 12) AAC TCC ACA CCC CCG (Sec ID no 16) ACT CCA CAC CCC CGA (Sec ID no 17) ACT CCG CCC CAA CTG (Sec ID no 22) CTG TCC CTA AAC CCG (Sec ID no 23) TTC GAG GTT AGA TGC (Sec ID no 24) GTC CCT AAA CCC GAT (Sec ID no 25) GAC CTA TTG AAC CCG (Sec ID no 29)

GCA TCC CGT GGT CCT (Sec ID no 33) CAC AAG ACA TGC ATC (Sec ID no 34) GGC TTT TAA GGA TTC (Sec ID no 40)

GAT CAA TGC TCG GTT (Sec ID no 44) CGA CTC CAC ACA AAC (Sec ID no 76)

GCA TTA CCC GCT GGC (Sec ID no 85)

GTC TTA TCG TCC TGC (Sec ID no 90) GTC TTC TCG TCC TGC (Sec ID no 91) GTC TTG TCG TCC TGC (Sec ID no 92) GTC TAT TCG TCC TGC (Sec ID no 93) GTC TCT TCG TCC TGC (Sec ID no 94) GTC TGT TCG TCC TGC (Sec ID no 95)

AAC ACT CCC TTT GGA (Sec ID no 123)

CAT GTG TCC TGT GGT (Sec ID no 117) CGT CAG CCC GAG AAA (Sec ID no 118)

CAC TAC ACA CGC TCG, (Sec ID no 119) TGG CGT TGA GGT TTC (Sec ID no 120)

y una mezcla de ese tipo de sondas.

24. Sondas de ácido nucleico peptídico de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 seleccionadas entre

Lys(Flu)-Lys(Flu)-TCA CCA CCC TCC TCC-NH_{2} (OK 446/ Sec ID no 6 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-CCA CCC TCC TCC-NH_{2} (OK 575/ Sec ID no 6 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-ACT ATT CAC ACG CGC-NH_{2} (OK 447/ Sec ID no 8 modificada) Lys(Flu)-ACT ATT CAC ACG CGC-NH_{2} (OK 688/ Sec ID no 8 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-CCA CAC CCA CCA CAA-NH_{2} (OK 448/ Sec ID no 12 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-AAC TCC ACA CCC CCG-NH_{2} (OK 449/ Sec ID no 16 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-ACT CCA CAC CCC CGA-NH_{2} (OK 309/ Sec ID no 17 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-ACT CCG CCC CAA CTG-NH_{2} (OK 450/ Sec ID no 22 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-CTG TCC CTA AAC CCG-NH_{2} (OK 305/ Sec ID no 23 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-TTC GAG GTT AGA TGC-NH_{2} (OK 306/ Sec ID no 24 modificada)

Lys(Flu)-TTC GAG GTT AGA TGC-NH_{2} (OK 682/ Sec ID no 24 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-GTC CCT AAA CCC GAT-NH_{2} (OK 307/ Sec ID no 25 modificada) Lys(Flu)-GTC CCT AAA CCC GAT-NH_{2} (OK 654/ Sec ID no 25 modificada) Lys(Flu)-GAC CTA TTG AAC CCG-NH_{2} (OK 660/ Sec ID no 29 modificada)

Lys(Flu)-Lys(Flu)-Gly-GCA TCC CGT GGT CCT-NH_{2} (OK 223/ Sec ID no 33 modificada) Lys(Flu)-Lys(Flu)-CAC AAG ACA TGC ATC-NH_{2} (OK 310/ Sec ID no 34 modificada) Lys(Flu)-CAC AAG ACA TGC ATC-NH_{2} (OK 655/ Sec ID no 34 modificada) Lys(Flu)-GGC TTT TAA GGA TTC-NH_{2} (OK 689/ Sec ID no 40 modificada) Lys(Rho)-GGC TTT TAA GGA TTC-NH_{2} (OK 702/ Sec ID no 40 modificada)

Flu-\beta-Ala-\beta-Ala-GAT CAA TGC TCG GTT-NH_{2} (OK 624/ Sec ID no 44 modificada) Flu-\beta-Ala-\beta-Ala-CGA CTC CAC ACA AAC-NH_{2} (OK 612/ Sec ID no 76 modificada)

Flu-\beta-Ala-\beta-Ala-GCA TTA CCC GCT GGC-NH_{2} (OK 623/ Sec ID no 85 modificada)

Lys(Flu)-GTC TTT TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 745/ Sec ID no 89 modificada) Lys(Rho)-GTC TTA TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 746/ Sec ID no 90 modificada) Lys(Rho)-GTC TTC TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 746/ Sec ID no 91 modificada) Lys(Rho)-GTC TTG TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 746/ Sec ID no 92 modificada) Lys(Rho)-GTC TAT TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 747/ Sec ID no 93 modificada)

Lys(Rho)-GTC TCT TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 747/ Sec ID no 94 modificada) Lys(Rho)-GTC TGT TCG TCC TGC-NH_{2} (OK 747/ Sec ID no 95 modificada)

Lys(Flu)-AAC ACT CCC TTT GGA-NH_{2} (OK 749/ Sec ID no 123 modificada)

donde Flu denota una etiqueta de 5-(y 6)-carboxifluoresceína y Rho denota una etiqueta de rodamina, y una mezcla de ese tipo de sondas.

25. El uso de una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o una mezcla de las mismas para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias opcionalmente presentes en una muestra.

26. El uso de una sonda de ácido nucleico peptídico o de su mezcla de acuerdo con la reivindicación 25 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis(MTC), en particular una secuencia objetivo de M. tuberculosis.

27. El uso de una sonda de ácido nucleico peptídico o de su mezcla de acuerdo con la reivindicación 25 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis, en particular una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo de Mycobacterium avium.

28. Un método para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias opcionalmente presentes en una muestra que comprende

(1) poner en contacto cualquier ARNr o ADNr en dicha muestra con una o más sondas de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o una mezcla de las mismas bajo condiciones, por lo cual se produce la hibridación entre dicha(s) sonda(s) y dicho ARNr o ADNr, y

(2) observar o medir cualquier híbrido detectable formado, y relacionar dicha observación o medición con la presencia de una secuencia objetivo de una o más micobacterias en dicha muestra.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTC), en particular una secuencia objetivo de M. tuberculosis.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 28 para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis.

31. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, donde la hibridación se produce in situ.

32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, donde la hibridación se produce in vitro.

33. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, caracterizado porque se utiliza un sistema de amplificación de señal para medir la hibridación resultante.

34. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, donde la muestra es una muestra de esputo.

35. Un equipo portátil para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias, en particular una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTC), en particular una secuencia objetivo de M. tuberculosis y/o para detectar una secuencia objetivo de una o más micobacterias distintas a las micobacterias del Complejo de Mycobacterium tuberculosis (MOTT), en particular una secuencia objetivo de una o más micobacterias del Complejo de Mycobacterium avium, caracterizado porque dicho equipo portátil comprende por lo menos una sonda de ácido nucleico peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, y opcionalmente un sistema de detección con por lo menos un reactivo de detección.

36. El equipo portátil de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende además un sistema de captura en fase sólida.