ES2201401T3

ES2201401T3 - Lipasas recombinantes activadas por la sal biliar.

Info

Publication number: ES2201401T3
Application number: ES98200772T
Authority: ES
Inventors: Jordan J N Tang; Chi-Sun Wang
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1990-04-04
Filing date: 1991-04-04
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2011-04-04
Also published as: GR3029711T3; JP3665329B2; HK1011929A1; DK0525076T3; US5200183A; DE69130735T2; EP0525076A4; JPH05508763A; DE69133279D1; JP2001112468A; EP0861897B1; DK0861897T3; JPH09132597A; EP0861897A2; ATE242813T1; EP0861897A3; ES2129026T3; DE69130735D1; WO1991015234A1; EP0525076B1

Abstract

SE REVELA LA ESTRUCTURA COMPLETA DEL CDNA DE BAL DE LECHE HUMANA. LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DE LAS INSERCIONES DE CDNA DE DOS CLONES SE SUPERPONEN Y JUNTOS CONTIENEN 2.951 PARES DE BASES DE CDNA DE BAL QUE CODIFICAN UN CUADRO LECTOR ABIERTO DE 720 RESIDUOS AMINOACIDOS ENTRE LOS CODONES DE INICIO Y TERMINACION. EXISTE UNA SUPUESTA SECUENCIA SEÑAL DE 20 RESIDUOS SEGUIDA DE UNA SECUENCIA TERMINAL DE 61 AMINOACIDOS DE BAL. LA SECUENCIA DEL CDNA TAMBIEN CONTIENE UNA SECUENCIA DE 678 BASES SIN TRADUCCION 5 , UNA REGION DE 96 BASES SIN TRADUCCION 3 , Y UNA COLA POLI(A) DE 14 BASES. LA ESTRUCTURA DE LA PROTEINA BAL DEDUCIDA CONTIENE EN LA REGION CARBOXI - TERMINAL 14 UNIDADES DE REPETICION DE 11 AMINOACIDOS CADA UNA. LAS UNIDADES DE REPETICION POSEEN LA ESTRUCTURA BASICA DE PRO - VAL - PRO - PRO THR - GLY - ASP - SER - GLY - ALA - PRO -, SOLO CON SUSTITUCIONES MINIMAS. EL CDNA ES UTIL PARA LA EXPRESION DE LA PROTEINA, EL ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA, LA FUNCION Y EL EFECTO DE LA MODIFICACION O DELECION O ADICION DE AMINOACIDOS, INCLUIDAS UNIDADES DE REPETICION ENTERAS, Y COMO SONDAS PARA ESTUDIOS SOBRE BAL O LIPASAS RELACIONADAS, COMO LA COLINESTERASA, LA ACETILCOLINESTERASA Y LA LISOFOSFOLIPASA PANCREATICA DE RATA.

Description

Lipasas recombinantes activadas por la sal biliar.

Antecedentes de la invención

El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención en virtud de una cesión del Instituto Nacional de la Salud.

La leche humana contiene una lipasa activada por sales biliares ("BAL") a un nivel muy alto del 0,5-1% de la proteína láctea, según describen Wang, "Fat Absorption", Vol. 1, Kuksis, editor, pp. 83-117 (CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL 1986) y Olivacrona y Bengtsson, "Lipases", Borgstrom y Brockman, editores, pp. 205-261 (Elsevier, Amsterdam, Países Bajos, 1984). El papel fisiológico de la BAL es ayudar a la digestión de las grasas, especialmente de los triglicéridos, para obtener ácidos grasos y sales de ácidos grasos.

La BAL humana ha sido purificada hasta la homogeneidad, según describen Wang y Johnson, Anal. Biochem. 113, 457-461 (1983). Según se describe en la Patente EE.UU. Nº 4.944.944, se ha descubierto ahora que esta proteína es el factor limitante de la velocidad principal en la absorción de grasas y el posterior crecimiento en los niños, particularmente en niños prematuros, que son deficientes en su producción de BAL, y que la suplementación de la fórmula con la enzima purificada mejora significativamente la digestión y el crecimiento de estos niños. Esto tiene una importancia clínica en la preparación de fórmulas para bebés que contienen porcentajes relativamente elevados de triglicéridos y que se basan en fuentes de proteínas vegetales o de leche no humana, ya que los niños alimentados con estas formulaciones son incapaces de digerir las grasas en ausencia de BAL añadida.

La especificidad y las propiedades cinéticas de la BAL han sido descritas por Wang y col., J. Biol. Chem. 256, 10198-10202 (1981); J. Lipid Res. 26, 824-830 (1985); J. Biol. Chem. 258, 9197-9202 (1983), y Biochemistry 27, 4834-4840 (1988). La unión de sales biliares a la BAL es esencial para la hidrólisis específica de substratos fisiológicos. Las sales biliares participan también en la unión a substrato durante la catálisis de la BAL. Estas propiedades sugieren que la BAL procede de una clase de lipasa distinta de la lipoproteína lipasa y de otras lipasas pancreáticas.

Es, por lo tanto, un objeto de la presente invención proporcionar secuencias génicas codificantes de BAL para uso en el posterior análisis y caracterización de las relaciones de estructura y función de las lipasas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar secuencias génicas codificantes de BAL para uso en la preparación de grandes cantidades de BAL para inclusión en fórmulas infantiles de leche no humana.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar secuencias génicas codificantes de BAL para determinar su relación estructural con otras lipasas y proporcionar un medio para los estudios de mutagénesis.

Resumen de la invención

La invención proporciona un mamífero no humano transgénico según la Reivindicación 1, un método para producir leche según la Reivindicación 2 y leche según la Reivindicación 3.

Se describe la estructura completa del ADNc de la BAL de la leche humana. Se identificaron dieciocho clones de ADNc de lipasa activada por sales biliares (BAL) de leche humana a partir de librerías de ADNc de mama humana en lactación en \lambdagt11 y \lambdagt10 usando anticuerpo y oligonucleótidos sintéticos como sondas. Se seleccionaron cuatro clones para la determinación de la secuencia. Las secuencias nucleotídicas de los insertos de ADNc de dos clones se solapan y contienen juntas 3.018 pares de bases de ADNc BAL que codifican para un marco abierto de lectura de 722 residuos de aminoácidos entre los codones de iniciación y de finalización. Existe una secuencia señal supuesta de 20 residuos, que va seguida de una secuencia amino-terminal de 722 residuos de la BAL madura. La secuencia de ADNc contiene también una secuencia 5'-no traducida de 678 bases, una región 3'-no traducida de 97 bases y una cola poli(A) de 14 bases. La secuencia de un clon contiene una deleción de 198 bases (Nº 1966-2163) correspondiente a 66 residuos de aminoácidos. El origen de esta versión más corta de ADNc se piensa que es debido a un ayustamiento alternativo durante el procesamiento de ARNm BAL.

La estructura proteica deducida de la BAL contiene en la región carboxilo-terminal dieciséis unidades repetitivas de 11 aminoácidos cada una. Las unidades repetitivas tienen la estructura básica Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Gly-Asp-Ser-Gly-Ala-Pro-, con sólo substituciones menores.

El ADNc es útil para la expresión de la proteína BAL, que puede ser usada para mejorar la nutrición infantil y para estudiar la estructura, la función y el efecto de la modificación o deleción o adición de aminoácidos, incluyendo unidades repetitivas completas, y como sondas para estudios que incluyen la BAL o lipasas relacionadas, incluyendo la lisofosfolipasa pancreática, la colinesterasa y la acetilcolinesterasa de rata.

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Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una presentación esquemática de la estructura del ADN de los clones de la lipasa activada por sales biliares de la leche humana procedente de la glándula mamaria en lactación. A. Se establece la estructura del ADNc BAL a partir de cuatro clones: G11-1, G10-2, G10-3 y G10-4, tal como se muestra en las líneas horizontales. La barra de la parte superior (placa A) representa el ADNc completo con diferentes regiones marcadas: la región 5'-no traducida ("5'UT"), el codon de iniciación, la secuencia líder, la región repetitiva (16 repeticiones), el codon de finalización, la región 3'-no traducida ("3'UT"), la cola poli(A) ("A's") y una región de "hueco", que es una deleción en el clon G10-4A. Las relaciones de G10-4A con otros clones están indicadas mediante líneas discontinuas. Los números de nucleótidos y los sitios de restricción están mostrados en la segunda línea. Las claves para los sitios de restricción son: T, TaqI; R, RsaI; H, HhaI; P, PstI, y S, SmaI; F, HinfI; N, NarI, 3, Sau3AI. Placa B. Presentación esquemática de los datos de la secuencia. Las flechas horizontales representan las direcciones y las regiones de cubrimiento de los datos de secuenciación.

La Figura 2 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la lipasa activada por sales biliares de la leche humana. La secuencia nucleotídica deriva de los clones G10-2 y G10-3 (Figura 1). Los números de los nucleótidos son a partir del extremo 5' y se muestran en el margen derecho de cada línea. Se numera la secuencia predicha de aminoácidos desde la posición conocida del extremo amino de la enzima madura. Un único sitio de glicosilación ligado a N potencial está marcado mediante un asterisco. La serina del sitio activo está marcada mediante un rombo. La región de 198 nucleótidos (1966 a 2163) suprimida en el clon G10-4A (región de "hueco" en la Figura 1) y la señal de poliadenilación están subrayadas. La Figura 2 difiere en sus secuencias nucleotídicas en 2821 a 2886 (aminoácidos 695 a 716) con respecto a la figura originalmente presentada el 4 de Abril de 1990 y corresponde a la secuencia originalmente presentada el 12 de Junio de 1990.

La Figura 3 es una comparación de las secuencias de aminoácidos de diversas lipasas. Placa A. Alineación de las secuencias de aminoácidos de la lipasa activada por sales biliares de la leche humana (BAL), de la lisofosfolipasa pancreática de rata (RPLL) y de la colinesterasa (CE). Los residuos idénticos a la BAL están marcados con puntos en las secuencias de la RPLL y de la CE y los espacios alineados están representados por guiones. Placa B. alineación de dieciséis secuencias repetitivas internas de la BAL de la leche humana con las cuatro repeticiones internas correspondientes en la RPLL. C. Comparación de la estructura primaria y secundaria de la lipasa activada por sales biliares humana (BAL, residuos 1 a 571) y una región de la tiroglobulina de rata ("TG", residuos 396 a 967). Se hizo la alineación de las dos secuencias con un programa informático, desarrollado por Devereux y col., Nucleic Acids Res. 12(1), 387-395 (1984), en base a la creación de relaciones máximas. Se muestran cuatro niveles de relación entre los correspondientes residuos en dos secuencias entre las secuencias: residuos idénticos, líneas verticales; muy similares, dos puntos; débilmente similares, un punto; no relacionados, sin marcar. La predicción secundaria generada por ordenador basada en Chou y Fasman, Adv. in Enzymology 47, 45-148 (1978), es mostrada encima de la secuencia de la BAL y debajo de la secuencia de la TG. Claves para las estructuras secundarias: \alpha-hélice, "squiggle"; estructura \beta, línea continua; giro, v invertida, y arrollamiento aleatorio, punto. Las áreas enmarcadas representan regiones de las dos secuencias con fuertes similitudes de la estructura secundaria.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con la identificación y la caracterización de al menos dos ADNc's codificantes de la lipasa activada por sales biliares. La identificación de los ADNc's proporciona el medio para producir cantidades a gran escala de BAL para la suplementación de fórmulas de leche no humana, el medio para modificar selectivamente los genes y las proteínas expresadas a partir de ellos y el medio para estudiar y manipular la estructura y la función de las proteínas. Se describe la estructura completa del ADNc de la BAL de la leche humana y su relación con la lisofosfolipasa pancreática de rata (RPLL), la acetilcolinesterasa y la tiroglobulina.

La Patente EE.UU. Nº 4.944.944, concedida el 31 de Julio de 1990, describe cómo se utiliza la BAL en la preparación de formulaciones nutricionales que contienen grasa para ayudar a la digestión y a la utilización de la grasa.

Procedimiento experimental Materiales

Se purificó BAL de leche humana como describen Wang y Johnson, Anal. Biochem. 133, 457-461 (1983). Se preparó antisuero de conejo frente a la BAL humana según describe Wang, J. Biol. Chem. 256, 10198-10202 (1981). Se compraron librerías de ADNc de tejido de mama humana en lactación en \lambdagt11 y \lambdagt10 a Clontech. Se compró yodógeno a Pierce Chemical Co. Se compraron los radioisótopos, ^{125}I, ^{32}P-ATP, ^{32}P-dATP y ^{35}S-dATP y los filtros de nilón (Hybond-N) a Amersham. Las enzimas usadas en las manipulaciones del ADN recombinante fueron obtenidas de Bethesda Research Laboratory. Los kits y los reactivos para la secuenciación del ADN fueron obtenidos de United States Biochemical y Boehringer. Otros reactivos eran del grado más alto comercialmente disponible y fueron usados sin mayor purificación.

Métodos Aislamiento del fragmento CNBr amino-terminal de BAL de leche humana y determinación de la secuencia amino-terminal

Se llevó a cabo la escisión de BAL (70 mg) con bromuro de cianógeno usando las condiciones descritas por Steers y col., J. Biol. Chem. 240, 2478-2484 (1965). Se purificó el CNBr-péptido de unión a heparina usando cromatografía de afinidad en una columna de heparina-Sepharose, según describen Wang y Johnson, Anal. Biochem. 133, 457-461 (1983). En este procedimiento, se aplicaron los fragmentos CNBr a una columna de heparina-Sepharose (2 x 10 cm) preequilibrada con tampón NH_{4}OH-HCl 50 mM, pH 8,5. Se eluyó la fracción no retenida con 200 ml del mismo tampón. Se eluyó entonces el péptido de unión a heparina, que fue monitorizado por la absorbancia a 280 nm, con el mismo tampón que contenía NaCl 0,3 M. Se juntaron las fracciones que contenían el péptido de unión a heparina, se liofilizaron, se redisolvieron con 1 ml de agua destilada y se desalaron en una columna de Sephadex G-50 (2 x 25 cm). El rendimiento final de péptido de unión a heparina liofilizado fue de aproximadamente 4 mg. Se juzgó que el fragmento de unión a heparina era puro por electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida usando el método de Wang y Johnson (1983), con un peso molecular aparente de 12.000. Se determinó la secuencia amino-terminal de este fragmento por degradación de Edman automatizada en un Secuenciador Beckman Modelo 890C. Se identificaron los PTH-aminoácidos usando un HPLC de Waters Associates con una columna C-18 de fase invertida de 5 \mum según describen Takahashi y col., J. Biol. Chem. 258, 2819-2830 (1983). Se determinó la secuencia amino-terminal de 61 residuos del péptido como: A K L G A V Y T E G G F V E G V N K K L G L L G D S V D I F K G I P F A A P T K A L E N P Q P H P G W Q G T L K A K N F K. Los 23 primeros residuos de esta secuencia son idénticos a la secuencia amino-terminal para la BAL descrita por Wang y Johnson (1983), excepto por el hecho de que el 11º residuo es glicina en lugar de la lisina encontrada en el análisis actual. Los anteriores resultados indican también que la secuencia de unión a heparina se localiza en la región amino-terminal de BAL.

Estudio selectivo de librerías de ADNc

Se estudiaron aproximadamente 5 x 10^{5} placas de una librería de ADNc \lambdagt11 de tejido de mama humana en lactancia a 22ºC con anticuerpos de conejo contra la BAL humana. Se purificó antisuero de conejo frente a la BAL en una columna de afinidad de BAL de leche humana inmovilizada en Sepharose 4B usando el método de Wang y col., Amer. J. Clin. Nutr. 49, 457-463 (1983). Se yodaron los anticuerpos recuperados con ^{125}yodo y Iodógeno usando el método de Markwell y col., Biochem 17, 4807-4817 (1978) y se usaron para estudiar la librería usando el procedimiento de Huynh y col., DNA Cloning, Glover, D.M., editor, Vol. I, pp. 49-78 (IRL Press, Oxford 1985). Para el estudio de la librería \lambdagt10, se transfirieron aproximadamente 10^{5} placas a membranas Hybond-N y se sondaron con oligonucleótidos sintéticos usando la hibridación de placas de Huynh y col. (1985). La sonda RP tenía la secuencia unitaria repetitiva del clon G11-1 de la librería \lambdagt11. Se diseñaron varias sondas diferentes y se sintetizaron en base a una secuencia de aminoácidos de 61 residuos del fragmento CNBr amino-terminal. Los oligonucleótidos que producían resultados positivos eran: sonda RP, 5'- C C C C G G G C C T C A G T G G C A C C C G C G T -3' y sonda NTI, 5'- C T G C A G C A A A T G G G A T G C C C T T G / A A A G / A A T G / A T C C / G A C -3' (en base a los residuos de la secuencia amino-terminal 30-37). Se llevó a cabo un segundo estudio de 6 x 10^{4} placas de la librería \lambdagt10 usando un fragmento Sau3AI del clon G10-4A.

Subclonación y determinación de la secuencia de ADN

Se preparó ADN de fago de los clones positivos obtenidos del estudio por el método del lisado de placas de Maniatis y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, pp. 63-66 (Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY 1982), seguido del procedimiento de Bensen y Taylor, BioTechniques 126-127 (Mayo/Junio de 1984). Se subclonaron los insertos de ADNc y sus fragmentos de restricción de los clones positivos usando el método de Maniatis y col., pp. 150-178 (1982) en los vectores pUC18, pUC19, M13mp18 y M13mp19. Se llevó a cabo la secuenciación del ADN usando plantillas de hélice sencilla o doble usando el método de finalización de cadena de didesoxinucleótidos de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5468 (1977).

Se identificó un total de 18 clones positivos en 3 estudios diferentes. Se obtuvieron cinco clones positivos de la librería de ADNc de glándula mamaria humana en \lambdagt11 usando anticuerpo BAL como sonda. A partir de la librería \lambdagt10, las sondas RP y NT1 produjeron tres y dos clones positivos, respectivamente. Se obtuvieron ocho clones positivos de la misma librería \lambdagt10 usando como sonda un fragmento Sau3AI de 402 pares de bases (nucleótidos 1638 a 2237, sin la región de "hueco", según se describe a continuación) de un ADNc BAL parcial obtenido anteriormente (clon G10-4A). El mapeo de restricción, combinado con Southern blots, de estos clones sugería que los cinco clones \lambdagt11 estaban relacionados. El clon más largo entre estos cinco, el G11-1, tenía aproximadamente 0,8 kpb. De los dos estudios de la librería \lambdagt10, los clones más largos de cada sonda eran: GT-2 (1,9 kpb, positivo con la sonda NT1), el clon G10-4 (4 kpb, positivo con la sonda RP) y G10-3 (1,1 kpb, positivo con el fragmento Sau3AI de G10-4A). Los cuatro clones se solapaban entre sí, según se juzgó por los resultados del mapeo y de los Southern blots. Estos clones y varios fragmentos de ellos fueron subclonados y las secuencias nucleotídicas determinadas, según se resume en la Figura 1. Los clones G10-2, G10-3 y el lado 5' de un fragmento EcoRI de G10-4 (G10-4A, 1,8 kpb) fueron completamente secuenciados (Figura 1).

El fragmento 3' EcoRI de G10-4 (G10-4B, 2,2 kpb) estaba aguas debajo de la secuencia poli(A) de BAL y se conecta con G10-4A por una secuencia ligante EcoRI. Como la secuencia G10-4B está totalmente no relacionada con la de BAL, está claro que G10-4A y G10-4B fueron insertados juntos en el clon G10-4 durante la etapa de ligación de la construcción de la librería, por lo que no se siguió estudiando la secuencia de G10-4B. La secuencia parcial de G11-1 era idéntica a la secuencia de la región 3' de G10-3. Como este último fue completamente secuenciado, no se continuó con la secuenciación del clon G11-1.

Los datos de secuencia indicaron que la secuencia de ADNc de la BAL humana está contenida en la secuencia combinada de los clones G10-2 y G10-3 (Figs. 1 y 2). Esta secuencia (Fig. 2) contiene un marco abierto de lectura que codifica para 742 residuos de aminoácidos entre el codon de iniciación (nucleótidos 669-671) y el codon de parada (nucleótidos 2905-2907). La razón de que este codon Met particular sea elegido como sitio de iniciación sobre otro sitio potencial aguas arriba se basa en la presencia de una secuencia flanqueante de iniciación óptima, ACCATGG (nucleótidos 666-672). Además, hay veinte residuos predominantemente hidrofóbicos entre este sitio Met y la posición amino-terminal de la BAL madura (residuo 1 en la Figura 2). La longitud de esta región de 20 residuos es apropiada para la secuencia señal de BAL. Los 61 residuos amino-terminales determinados por degradación de Edman están en completo acuerdo con la secuencia deducida de aminoácidos (Figura 2, residuos 1 a 61). Hay 97 bases en la región 3'-no traducida entre el codon de finalización y la cola poli(A) de 14 bases.

La secuencia de ADNc BAL contiene una región de dieciséis secuencias internamente repetitivas altamente similares próxima al extremo carboxilo (nucleótidos 2353 y 2880). La estructura proteica deducida de esta región forma 16 unidades repetitivas altamente similares de once residuos cada una (Figuras 2 y 3). Aproximadamente un tercio de los aminoácidos de esta región son prolinas, lo que explica el alto contenido en prolina de la BAL. La composición de aminoácidos de la secuencia deducida de la BAL es comparada con la del análisis de aminoácidos de la Tabla I. Se sabe que la BAL humana es una glicoproteína; se observa un sitio potencial de N-glicosilación en el residuo 187. El peso molecular de la BAL madura calculado por la secuencia deducida es de 76.282.

La secuencia nucleotídica del clon G10-4A es idéntica a la región correspondiente de la secuencia combinada de los clones G10-2 y G10-3, tal como se muestra en la Figura 2, excepto por la ausencia de una sección de 198 bases (nucleótidos 1966 a 2163) (Figuras 1 y 2). Esto representa una deleción de 66 aminoácidos (residuos 410 a 475). Se han considerado varios orígenes posibles de este ADNc más corto. Como las secuencias nucleotídicas de los ADNc's largos y cortos son por lo demás idénticas, ello sugiere que son productos de un mismo gen. Una búsqueda de la estructura secundaria del ARNm cerca de las uniones de "hueco" no dio razón alguna para sospechar de una copia errónea por parte de la transcriptasa inversa durante la construcción de ADNc. Además, la introducción del "hueco" en el ADNc más corto no cambió la fase de lectura. Estos hechos parecen argumentar frente a la posibilidad de que el ADNc más corto sea un artefacto de la clonación. Las dos versiones de los ADNc's derivan probablemente de una diferencia en el ayustamiento de la BAL y del precursor de ARNm. Aunque la estructura génica de la BAL humana es desconocida, la secuencia AAG (nucleótidos 1963-1965) justo antes del "hueco" y las G's a ambos lados de la unión en el extremo del "hueco" (nucleótidos 2163 y 2164) son los nucleótidos más favorables para su aparición en las uniones intrón/exón, tal como describen Padgett y col., Ann. Rev. Biochem. 55, 119-1150 (1986). Estas estructuras apoyan la explicación de ayustamiento alternativa.

TABLA I Composiciones de aminoácidos de la BAL humana predichas por la secuencia de ADNc

Aminoácido	Derivada de la secuencia	Derivada de la secuencia	BAL purificada^{c}
	larga de ADNc^{a}	corta de ADNc^{b}
	Nº de res.	% mol	Nº de res.	% mol	% mol
Lys	37	5,1	32	4,9	4,2
His	9	1,2	7	1,1	1,4
Arg	20	2,8	17	2,6	2,8
Asp	48 }	10,5	44 }	10,8	10,7
Asn	28 }		27 }
Thr	59	8,2	53	8,1	8,5
Ser	41	5,7	37	5,6	5,1
Glu	25	6,0	25 }	6,3	4,9
Gln	18 }		16 }
Pro	93	12,9	87	13,3	12,7
Gly	73	10,1	69	10,5	10,5
Ala	69	9,6	61	9,3	9,4
Cys	4	0,6	4	0,6	0,8

TABLA I (continuación)

Aminoácido	Derivada de la secuencia	Derivada de la secuencia	BAL purificada^{c}
	larga de ADNc^{a}	corta de ADNc^{b}
	Nº de res.	% mol	Nº de res.	% mol	% mol
Val	53	7,3	49	7,5	8,0
Met	13	1,8	11	1,7	1,6
Iso	28	3,9	26	4,0	4,1
Leu	42	5,8	41	6,3	6,8
Tyr	26	3,6	20	3,0	3,3
Phe	25	3,5	21	3,2	3,9
Trp	11	1,5	9	1,4	1,3
Total	722		656
^{a} Basada en la secuencia de ADNc sin la deleción de 66 residuos de aminoácido.
^{b} Basada en la secuencia de ADNc con la deleción de 66 aminoácidos.
^{c} Datos tomados de Wang, J. Biol. Chem. 256, 10198-10202 (1981).

Comparación de la secuencia de ADNc de la BAL con otras lipasas

La secuencia de la BAL humana es altamente similar a la secuencia de la lisofosfolipasa pancreática de rata (RPLL), descrita por Han, J.H., Stratowa, C. y Rutter, W.J. (Biochemistry 26: 1617-1625 (1987)). Existe una identidad del 67% entre los residuos de aminoácidos de las dos enzimas. La mayor diferencia está en la longitud de la región repetitiva. La proximidad en la homología estructural de las dos enzimas sugería que la RPLL es la lipasa activada por sales biliares presente en el páncreas. La limitada secuencia amino-terminal de la lipasa de éster carboxílico ("CEL") pancreática humana indica que es también homóloga a la BAL. Además, BAL y CEL de diferentes especies tienen reactividad cruzada de anticuerpos, lo que es consistente con las estrechas relaciones estructurales. En base a los datos de secuencia amino- terminal, la colesterol esterasa ("CHE") pancreática porcina también parece ser idéntica a la CEL. Estas comparaciones estructurales sugieren la posibilidad de que la CHE y la CEL pancreáticas sean la misma enzima que la RPLL, que parece ser la misma que la lipasa activada por sales biliares presente en el páncreas. La información estructural también sugiere que BAL y RPLL representan una clase única de lipasas, ya que sus estructuras no están relacionadas con las estructuras conocidas de otras lipasas, incluida la lipasa hepática, la lipoproteína lipasa y la lipasa pancreática.

La característica más interesante de la BAL y de la RPLL son las repeticiones de once residuos de secuencias ricas en prolina cerca del extremo carboxilo de las enzimas. Existen dieciséis repeticiones en la BAL y cuatro repeticiones en la RPLL (Figura 3B). Este tipo de estructura repetitiva parece ser única para estas dos enzimas, ya que ninguna otra proteína, incluidas otras lipasas, en la base de datos de proteínas contiene esta estructura repetitiva. Entre las dieciséis repeticiones de la BAL, los números de repeticiones tres a diez están altamente conservados, con la secuencia base de P V P P T G D S G A P. Dos repeticiones al comienzo y tres de cuatro repeticiones al final contienen más substituciones. Además, la secuencia de los extremos amino-terminales de cada unidad de once residuos está más conservada que la de los extremos carboxilo-terminales (Figuras 3B). La predicción de la estructura secundaria de esta región revela una fuerte tendencia de arrollamientos aleatorios abiertos. Aunque la función de esta región estructural es desconocida, la asociación de esta estructura única con la función única de la activación por sales biliares de BAL y RPLL parece probable.

La secuencia de aminoácidos de la BAL está también relacionada con la de la acetilcolinesterasa, la colinesterasa y la tiroglobulina. La alineación de la colinesterasa frente a la BAL produce un 72% de residuos idénticos (Figura 3A). La alineación de la BAL con la acetilcolinesterasa produce resultados similares. La homología más intensa en estas comparaciones de secuencia se produce en la región próxima al sitio activo de las esterasas (Figura 3A). La secuencia alrededor de la serina del sitio activo, F G E S A G, en la acetilcolinesterasa está completamente conservada en la BAL (residuo 194) y en la RPLL. Estas comparaciones sugieren que la serina 194 tanto en BAL como en RPLL es el residuo del sitio activo y el mecanismo hidrolítico de las dos lipasas puede estar también relacionado con el de las esterasas. Es también interesante observar que el ARNm múltiple de la acetilcolinesterasa era el resultado de un ayustamiento alternativo, lo que sugiere una posible relación en la regulación de actividades en esta familia de enzimas.

La alineación de la BAL frente a una región de la tiroglobulina (residuos 396 a 967) produce una clara homología en varios tramos cortos (Figura 3C). Sin embargo, la comparación de las dos proteínas en cuanto a su estructura secundaria predicha produce una estrecha relación a lo largo de toda la longitud de la BAL (Figura 3C). Estas observaciones implican que esta región de la tiroglobulina está relacionada con la BAL en la estructura terciaria y que es también un dominio plegado independientemente. Las cinco proteínas antes discutidas han divergido probablemente de una proteína ancestral común a lo largo de la evolución.

Caracterización de la región de unión a heparina

Se vio que el fragmento CNBr amino-terminal contenía el sitio de unión a heparina de la BAL, como se ha descrito antes. Se examinó la secuencia de aminoácidos de este fragmento (residuos 1-101) en cuanto a la secuencia de unión a heparina potencial en base a la secuencia de unión a heparina consenso conocida de las apolipoproteínas y de las lipasas descritas por Martin y col., J. Biol. Chem. 263, 10907-10914 (1988). No se halló ninguna correspondencia directa de los motivos BBBXXB y BBXB (B = residuos básicos; X = residuos no cargados). Sin embargo, una región altamente básica con el patrón BXBXXBBB se localiza entre los residuos 56 y 63. Éste parece ser un sitio potencial de unión a heparina de la BAL.

Caracterización de las dos variantes estructurales del ADNc de la BAL

Las dos variantes estructurales del ADNc de la BAL humana, si derivan de ayustamiento alternativo y representan dos longitudes diferentes de ARNm, predecirían la presencia de dos tamaños de proteínas BAL en la leche humana. Se ha observado una banda menor de movimiento más rápido que es consistente con la diferencia predicha de peso molecular en la electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida de BAL de leche humana individual. La CEL pancreática porcina también contiene una versión de peso molecular más bajo que tiene una diferencia de tamaño de aproximadamente 9 kD. Las dos formas de las enzimas del cerdo tienen la misma secuencia amino-terminal y su diferencia no era debida al contenido en carbohidratos o en lípidos de las preparaciones de enzima purificada, según describieron Rudd y col., Biochim. Biophys. Acta 918, 106-114 (1987). Es, por lo tanto, posible que la diferencia en estas dos formas de CEL porcina sea debida al mismo "hueco" observado en la BAL.

Aplicaciones del ADNc aislado para la BAL humana

El ADNc puede ser marcado para uso como sondas en ensayos o para el estudio de ADN codificante de proteínas relacionadas o de proteínas que contienen secuencias similares. Los métodos para marcar ADN son conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo los descritos por Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Los reactivos para marcar las secuencias con marcajes fluorescentes, radiactivos y enzimáticos están todos comercializados.

Clonación y determinación estructural del gen de la BAL humana

Los ADNc's de la BAL humana pueden ser también usados para la clonación y la determinación estructural del gen o de los genes de la BAL humana usando métodos conocidos para los expertos en la técnica. Una ruta típica para conseguirlo es estudiar una librería genómica humana (típicamente en el bacteriófago lambda, comercializado por Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) usando oligonucleótidos que contienen la secuencia del ADNc de la BAL humana. La sonda puede ser un fragmento de enzima de restricción del ADNc de la BAL humana. Existen varias proteínas con homología de secuencia de aminoácidos con la BAL, tales como la lipasa pancreática o la colinesterasa, por lo que el fragmento de sonda puede ser utilizado para reconocer los genes de las proteínas homólogas, Como las secuencias de aminoácidos o las secuencias nucleotídicas de la mayoría de estas proteínas homólogas son conocidas, como se ha discutido en relación a la Fig. 3, es posible seleccionar como sonda regiones de la secuencia del ADNc de la BAL donde las diferencias con los genes de proteínas homólogas sean las mayores. Estas sondas pueden ser químicamente sintetizadas y usadas como sondas para la librería lambda genómica humana. Se pueden purificar los clones lambda positivos por plaqueo secundario y terciario y estudio selectivo. El mapeo de restricción y las determinaciones de secuencia de ADN revelarán (a) cuántos genes de la BAL humana hay, (b) las estructuras del gen de la BAL (intrones, exones y elementos reguladores) y (c) las posiciones de unión intrón/exón en los ADNc's de la BAL. Los métodos necesarios para llevar a cabo estos trabajos están descritos en su mayor parte en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, N.Y., 1987).

Aislamiento del ADN codificante de proteínas o regiones homólogas

Es posible que se pueda encontrar más de un gen de la BAL humana, ya que muchas proteínas tienen múltiples copias de genes. Estos genes, si existen, deberían dirigir la síntesis de enzimas con estructuras y actividades muy próximas. El gen o genes de la BAL pueden ser también homólogos a algún otro gen, tal como el de la acetilcolinesterasa, el de la colinesterasa, el de la BAL pancreática y el de la tiroglobulina, que tienen secuencias de aminoácidos similares a la de la BAL de la leche humana. Sin embargo, las estructuras de estas proteínas deben de ser bastante diferentes de las de los productos génicos de la BAL.

Puede haber enzimas similares a la BAL que no hayan sido aún descritas. Sería posible localizar el ADNc o los genes de estas nuevas enzimas estudiando librerías genómicas con fragmentos del ADNc de la BAL humana como sondas. Es también posible que otras proteínas aún no descritas puedan contener segmentos muy similares a las 16 repeticiones de la BAL de la leche humana para llevar a cabo alguna función biológica aún no especificada. El ADNc y los genes de estas proteínas pueden ser también identificados usando fragmentos de ADNc generados de la región repetitiva como sondas para estudiar librerías. Los clones positivos pueden ser aislados y secuenciados para estimar sus relaciones con la BAL. Los ADNc's o los genes de cualquier proteína interesante pueden ser expresados y valorados en cuanto a sus posibles funciones biológicas. Todo ello requiere la utilización de tecnología estándar de ADN recombinante y se puede encontrar en la referencia antes citada.

Expresión de la BAL humana recombinante

Como en muchos sistemas de expresión eucarióticos los exones son escindidos correctamente, se puede usar tanto el ADNc de la BAL humana como el ADN genómico de la BAL humana para dirigir la síntesis de proteína(s) BAL humana(s) recombinante(s). Se espera que el(los) gen(es) de la BAL humana contenga(n) en región no traducida secuencias que regulen la expresión de la enzima. Estas secuencias reguladoras pueden incluso ser usadas directamente en la expresión en animales transgénicos.

Utilizando ADN recombinante y tecnología de ingeniería genética, se puede producir proteína BAL recombinante a partir de ADNc o de genes de la BAL humana por muchos métodos diferentes. La presente invención se dirige a la expresión de BAL en animales transgénicos. Cuando se usan células eucarióticas como hospedadores, se pueden usar o bien los genes o bien el ADNc de la BAL humana para dirigir la síntesis de la enzima. También pueden glicosilar apropiadamente la BAL, siempre que esté presente una secuencia "líder" o "señal" para dirigir la BAL recién sintetizada al interior del retículo endoplásmico rugoso. Como la BAL nativa es una glicoproteina (Wang, C.S., J. Biol. Chem. 256: 10198-10202, 1983), puede ser importante usar un sistema hospedador que pueda glicosilar la proteína apropiadamente.

Es posible poder derivar la actividad BAL activa de leche humana expresando sólo parte del ADNc o de los genes. Es bien sabido que las proteínas contienen alguna estructura no esencial para sus actividades biológicas, incluidas las enzimáticas. Es también posible que algunos de los aminoácidos de la BAL de leche humana puedan ser cambiados y la BAL mutada aún conservaría actividades enzimáticas similares. Se pueden estudiar los fragmentos activos empleando los mismos ensayos que los utilizados para medir la actividad de la enzima intacta. Es un procedimiento rutinario sintetizar fragmentos y determinar luego qué fragmentos tienen actividad. Es igualmente rutinario alterar los nucleótidos dentro de las secuencias, expresar la proteína y estudiar la proteína en cuanto a su actividad. Esto sirve como medio útil para producir mutantes de BAL que tengan propiedades (actividades enzimáticas, especificidades de substrato, propiedades físicas, estabilidades, etc.) que proporcionen ventajas en el uso comercial de la enzima.

En todos los casos, el ADNc o gen de la BAL humana puede ser insertado en vectores de expresión apropiados que contengan elementos reguladores de la expresión (tales como señales de iniciación de la transcripción, señales de iniciación de la traducción, codon de iniciación, codon de finalización, señales de finalización de la transcripción, señales de poliadenilación y otros). Se dispone comercialmente de vectores adecuados de una variedad de compañías. Después de transfectar los vectores recombinantes que contienen el ADNc o el gen de la BAL en las células huésped, pueden permanecer como ADN extracromosómico o pueden integrarse en el genoma huésped. En cualquiera de los casos, pueden dirigir la síntesis de BAL recombinante en las células huésped. Se describen algunos ejemplos de la expresión de genes heterólogos en Methods in Enzymology, Vol. 153, Capítulos 23 a 34 (Editores, R. Wu y L. Grossman, Academic Press, 1987). El cultivo a gran escala de células hospedadoras sintetizadoras de BAL y la purificación de la enzima pueden formar un medio comercial efectivo en cuanto a costes de producción de BAL.

(1) Células de mamífero como hospedadores: Como información, se han realizado con éxito muchas expresiones en células de mamíferos de genes heterólogos con fines comerciales. La producción comercial de activador del plasminógeno de los tejidos humano recombinante es un ejemplo. La mayoría de estos vectores de expresión contienen promotor de mamíferos (tal como metalocianina u hormona del crecimiento) o promotores víricos (tales como el promotor precoz SV40 o las largas repeticiones terminales de los genes víricos), señales de poliadenilación y elementos reguladores apropiados para la clonación en E. coli, incluyendo genes de resistencia a antibióticos. Después de la inserción de BAL aguas abajo del promotor, el vector puede ser primeramente clonado en E. coli, aislado y transfectado en células de mamífero. Se pueden cotransfectar marcadores de selección resistentes a neomicina o similares en otro vector o en el mismo vector. Para la expresión de alto nivel, el vector de expresión (o cotransfecto) puede contener el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr). Cuando se usa la cepa dhfr- de células de ovario de hámster Chino ("CHO"), el gen clonado puede ser coamplificado con el de dhfr adaptando las células transformadas a una concentración creciente de metotrexato. Los clones transformantes que segregan BAL pueden ser identificados por ensayos enzimáticos o por Western blots. Como ejemplos exitosos de esta aproximación se incluyen la síntesis de prorrenina recombinante glicosilada (Poorman y col., Proteins 1: 139-145 (1986)) y de inmunointerferon humano (Scahill, S.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4654-4658 (1983)).

(2) Expresión de BAL en animales transgénicos: Ya existe tecnología para transferir el gen de la BAL humana a los genomas de otros animales para la expresión específica de tejidos (Jaenisch, R., Science 240: 1468-1474 (1988); Westphal, H., FESEB J. 3: 117-120 (1989)). Algunos trabajos están ya en marcha para alterar la composición de la leche usando tecnología transgénica (para una revisión, véase: Bremel, R.D., Yom, H.C. y Bleck, G.T., J. Dairy Sci. 72: 2826-2833 (1989)). Las aproximaciones generales, resumidas en las tres revisiones antes citadas, consisten en construir vectores que contienen promotores de proteínas (lácteas) de la glándula mamaria secretora (tales como caseína o lisozima de la leche) ADNc o gen de la BAL humana y elementos complementantes apropiados. El vector clonado es entonces microinyectado en un huevo recién fertilizado de vaca u oveja y el huevo transferido a una "madre adoptiva" para el desarrollo fetal y el nacimiento. La descendencia transgénica es analizada en cuanto a transferencia génica por Southern blots y en cuanto a la producción de BAL humana en la leche (la vaca y la oveja no producen BAL en la leche). Los animales transgénicos pueden ser cruzados entre sí para producir una raza de alto rendimiento.

Aplicaciones comerciales de la BAL de leche humana recombinante

La BAL de leche humana recombinante tiene una variedad de usos. La enzima puede ser usada para suplementar la dieta infantil, como se describe en la Patente EE.UU. Nº 4.944.944. la enzima puede ser usada para tratar enfermedades. La enzima puede ser usada en procedimientos industriales que implican la digestión de lípidos. La enzima puede ser usada en procedimientos médicos o clínicos implicados en la digestión de lípidos. La enzima puede ser usada como reactivo (químico) de investigación o como herramienta de investigación (para el estudio de la digestión de lípidos). Muchas de estas aplicaciones no eran posibles con anterioridad debido a las cantidades extremadamente limitadas de BAL humana que podían ser extraídas de la leche humana.

Claims

1. Un mamífero transgénico no humano que contiene un transgén, donde el transgén consiste en un polinucleótido codificante de lipasa activada por sales biliares que tiene la secuencia de aminoácidos definida en la Figura 2 o una porción o variante polipeptídica de la misma efectiva para permitir la absorción de grasas por un humano y tiene una repetición que tiene la estructura Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Gly- Asp-Ser-Gly-Ala-Pro, o con substituciones sólo menores, o un polinucleótido codificante de una lipasa activada por sales biliares según se muestra en la Figura 2 o una porción de la misma que afecta a la absorción de grasas operativamente unido a un promotor específico de la glándula mamaria.

2. Un método de producción de leche que contiene lipasa activada por sales biliares consistente en obtener leche de un mamífero transgénico según se define en la Reivindicación 1.

3. Leche de un mamífero transgénico según se define en la Reivindicación 1.

4. Leche según la Reivindicación 3, donde el mamífero transgénico es una oveja o una vaca.