ES2201462T3

ES2201462T3 - Radicales libres de triarilmetilo como agentes mejoradores de la imagen.

Info

Publication number: ES2201462T3
Application number: ES98910833T
Authority: ES
Inventors: Mikkel Thaning; Goran Pettersson
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2018-03-06
Also published as: EP0966414A1; DE69815305D1; DE69815305T2; EP0966414B1; WO1998039277A1; AU6506598A

Abstract

NUEVOS RADICALES TRIARILMETILO LIBRES, SU USO COMO AGENTES DE REALCE DE IMAGENES EN UNA MRI, EN PARTICULAR SU USO EN UNA MRI REALZADA OVERHAUSER DE UNA MUESTRA PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION DE OXIGENO EN DICHA MUESTRA.

Description

Radicales libres de triarilmetilo como agentes mejoradores de la imagen.

La presente invención se refiere a radicales libres triarilmetil nuevos y su uso como medios para potenciar la imagen en resonancia magnética (RM), en particular a su uso en la resonancia magnética potenciada por la resonancia del espín del electrón (ERS) (ORM) de una muestra (por ejemplo, de un cuerpo humano o animal) para determinar la concentración de oxígeno de dicha muestra.

La RM es una técnica diagnóstica que se ha hecho particularmente atractiva para los médicos al ser una prueba no invasiva que no implica la exposición del paciente en estudio a una radiación potencialmente dañina (como, por ejemplo, los rayos X). Sin embargo, la técnica adolece, entre otros, del problema de conseguir un contraste eficaz en las imágenes de la resonancia magnética (RM) entre los tipos de tejido que tienen unos parámetros de imagen iguales o muy similares.

La RM potenciada por la resonancia del espín del electrón, denominada en lo sucesivo ORM (Overhauser RM), aunque también se conoce en publicaciones anteriores como ESRERM o PEDRI, es una forma particular de RM en la cual la potenciación de las señales de la resonancia magnética a partir de las cuales se generan las imágenes se consigue en virtud de una polarización dinámica del núcleo (el efecto Overhauser) que se produce con la estimulación VHF de una transición de la ESR en un material paramagnético, generalmente un radical libre persistente, en el sujeto en estudio. La potenciación de la señal de resonancia magnética puede hacerse mediante un factor de cien o más, lo que permite que las imágenes de ORM se generen rápidamente y con unos campos magnéticos primarios relativamente bajos.

Varios autores han descrito las técnicas de ORM, en particular Leunbach, Lurie, Ettinger, Grücker, Ehnholm y Sepponen, por ejemplo, en las patentes y publicaciones EP-A-296833, EP-A-361551, WO-A-90/1 3047, J. Mag. Reson. 76:366-370 (1988), EP-A-302742, SMRM 9:619 (1990), SMRM 6:24 (1987), SMRM 7:1094 (1988), SMRM 8:329 (1989), US-A-4719425, SMRM 8:816 (1989), Mag. Reson. Med. 14: 140-147 (1990), SMRM 9:617 (1990), SMRM 9:612 (1990), SMRM 9:121 (1990), GB-A-2227095, DE-A-4042212 y GB-A-2220269.

En la técnica básica de ORM, la secuencia de obtención de imágenes implica irradiar inicialmente a un sujeto situado en un campo magnético uniforme (el campo primario B_{0}) con radiación, habitualmente del tipo VHF, con una frecuencia seleccionada para excitar una transición de la ESR de ancho de banda estrecho en un medio de potenciación paramagnético (denominado en los sucesivo "medio de contraste de ORM") que existe o se ha administrado al sujeto. La polarización dinámica del núcleo da lugar a un incremento de la diferencia de población entre los estados excitados y basal del espín del núcleo de la obtención de imágenes del núcleo, es decir, de aquellos elementos del núcleo, generalmente protones, que son responsables de las señales de la resonancia magnética. Como la intensidad de la señal de la RM es proporcional a esta diferencia de población, las etapas siguientes de cada secuencia de obtención de imágenes, realizadas esencialmente con las técnicas convencionales de RM, dan lugar a la detección de señales de RM de amplitud mayor y un contraste más eficaz.

Hay varios radicales libres de oxígeno, es decir, radicales donde el electrón o electrones no emparejados se asocian con el átomo de oxígeno, que se han propuesto como medios de contraste en ORM, incluidos, por ejemplo, los radicales libres de nitróxido estable, el radical semiquinona cloranilo y la sal de Fremy (US-A-4984573) y los radicales libres estables deuterados, en particular los radicales libres estables de nitróxido deuterado (WO-A-90/00904).

En la patente WO-A-91/12024 Nycomed Innovation AB proponía el uso de los radicales libres de carbono persistentes, es decir, radicales (como, por ejemplo, radicales triarilmetil) en los cuales el electrón o electrones no emparejado se asocian primariamente con átomos de carbono, como medios de contraste en ORM.

En la patente WO-A-96/39367, Nycomed Imaging AS propuso varios radicales triarilmetil basados en azufre para su uso como medios de contraste en ORM.

En cualquier experimento de ORM en condiciones ambientales, el oxígeno paramagnético tendrá un efecto finito sobre el sistema de espín presente. En términos generales, este puede ser desestimado como un efecto secundario cuando se compara con la interacción primaria del espín del electrón del radical y el sistema del espín del núcleo. No obstante, se ha propuesto que este efecto puede usarse para determinar la concentración de oxígeno dentro de una muestra. La investigación se ha concentrado particularmente en el uso de los marcadores del espín de nitróxido; los radicales que adolecen de la desventaja inherente de tener unas resonancias de la ESR de ancho de banda amplio y, por tanto, una sensibilidad baja a los efectos del oxígeno. Por lo tanto, hasta la fecha el efecto del oxígeno se ha reconocido sólo en un sentido cualitativo y los intentos de relacionar un significado cuantitativo al efecto del oxígeno han resultado fallidos. Además, en general, las técnicas no invasivas para la determinación de oxígeno han sufrido un desarrollo lento y habitualmente no son adecuadas para el estudio de los tejidos profundos que existen bajo la superficie de una muestra.

Por ejemplo, Grücker y cols. (MRM, 34: 219-225(1995)) describieron un método para calcular la concentración de oxígeno midiendo el efecto Overhauser atribuible al radical nitróxido y relacionando el efecto no lineal del oxígeno sobre el factor Overhauser con su concentración. Para ello, se deben obtener dos imágenes, una con resonancia y otra sin resonancia, usando la aproximación de primer orden para llegar a la concentración de oxígeno. No obstante, Grücker observó que la correlación entre la concentración de oxígeno real y calculada era mala y que, por tanto, el método era inherentemente inexacto. Este efecto se atribuyó al gran número de parámetros implicados en el cálculo.

Ehnholm (US-A-5289125) propuso una técnica de ORM en la cual las señales de un material paramagnético se detectaban al menos bajo dos entornos diferentes de parámetros operativos mediante los cuales se generaban imágenes de varios parámetros físicos, químicos o biológicos. Si bien la tensión de oxígeno era uno de los muchos parámetros implicados, Ehnholm no demostró el uso de la técnica para cuantificar el oxígeno disuelto.

Se ha encontrado ahora que algunos nuevos radicales triarilmetil basados en azufre tienen propiedades ventajosas como, por ejemplo, un patrón metabólico mejorado que les hace particularmente adecuados para el uso como medios de contraste en QRM.

Visto desde un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto con un radical con la fórmula 1

1

en la cual:

cada R^{1} que puede ser igual o diferente representa un átomo de hidrógeno o un grupo con la fórmula -M o -XM;

cada X que puede ser igual o diferente representa un átomo de oxígeno o azufre o un grupo CO o S(O)_{m}, (donde m es 1 a 3);

M representa un grupo hidrosolubilizante;

cada R^{7} que puede ser igual o diferente representa un átomo de hidrógeno, o grupo hidrocarbono o como un grupo alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilo, o carbamoilo, o un grupo hidrosolubilizante M o dos grupos R^{7} junto con el átomo al que se unen representan un grupo carbonilo o un grupo cicloalquiloideno, mono- o di-oxacicloalquiloideno, mono- o di-azacicloalquiloideno o mono- o di-tiacicloalquiloideno de 5 a 8 miembros (preferiblemente no obstante en cualquier estructura espiral el átomo de anillo de unión estará unido a no más de tres heteroátomos) y R^{7}, cuando es distinto de hidrógeno, está opcionalmente sustituido por un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilado opcionalmente, un grupo aciloxi hidroxilado opcionalmente o un grupo alquilo hidrosolubilizante M;

n indica 1, 2 ó 3; y

cada un grupo Y indica CH_{2}CH_{2}OR_{22}, en el cual R_{22} es H o C_{1-6}-alquilo, (como, por ejemplo, un grupo CH_{2}CH_{2}
OH), preferiblemente H o ^{t}Bu, o uno de sus análogos deuterados,

o uno de sus análogos deuterados, un precursor o su sal.

Esta definición abarca los precursores de radicales que pueden sufrir convenientemente un paso de generación de radicales poco antes de su administración o incluso in situ para producir el radical libre deseado. Los precursores de radicales y los pasos de generación de los radicales son bien conocidos para los expertos en la materia.

Los compuestos preferidos con radicales de acuerdo con la invención incluyen aquellos que tienen la fórmula 1 en la cual n es al menos dos y más preferiblemente es tres.

En el compuesto con radicales de acuerdo con la invención, los grupos solubilizantes M pueden ser cualquiera de los grupos solubilizantes t que se usan convencionalmente en los productos diagnósticos y farmacéuticos. Los grupos solubilizantes particularmente preferidos M incluyen opcionalmente un grupo hidroxilado, grupos alquilo o oxo-alquilo opcionalmente alcoxilados y grupos con la fórmula R^{5}, COOR^{5}, OCOR^{5}, CHO, CN, CH_{2}S(O)R^{5} CONR^{5}_{2}, NR^{5}COR^{5}, NR^{5}_{2} SO_{2}NR^{5}_{2} OR^{5}, PO_{3}^{2-}, SOR-^{5}, SO_{2}R^{5}, SO_{3}M^{1} COOM^{1} (donde R^{5} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, oxo-alquilo, alquenil o alcarilo opcionalmente hidroxilado, opcionalmente aminado, opcionalmente alcoxilado u opcionalmente carboxilado y M^{1} es un equivalente de un catión fisiológicamente tolerable, por ejemplo un catión metálico alcalino o alcalinotérreo, un ión amonio o un catión de amina orgánica, por ejemplo un ión meglumina), -(O(CH_{2})_{n})_{m}OR^{5} (donde n es un número entero que tiene un valor entre 1 y 3 y m es un número entero que tiene un valor entre 1 y 5), -CX(CHR^{5})_{n}X o CH_{2}R^{8} (donde R^{8} es un grupo hidrofílico R^{5}) o SR^{10} o SO_{2}R^{10} donde R^{10} es un grupo R^{5} o un grupo alquilo opcionalmente sustituido por uno o más, especialmente dos o tres grupos COOR^{5}, OCOR^{5}, CHO, CN, CONR^{5}_{2}, NR^{5}COR^{5}, NR^{5}_{2}, SO_{2}NR^{5}_{2}, OR^{5}, PO_{3}^{2-}, SOR^{5}, SO_{2}R^{5}, SO_{3}M^{1}, COOM^{1}, o

\hbox{-(O(CH _{2} ) _{n} ) _{m} }

OR^{5}.

Especialmente preferidos como grupos solubilizantes M son los grupos que tienen la fórmula C(H)_{3-n}(CH_{2}OH)_{n}, R^{9}, COR^{9}, SR^{9}, SOR^{9}, SO_{2}R^{9}, CON (R^{9})_{2}, NR^{9}_{2}, NHR^{9} y CONHR^{9} [donde R^{9} puede representar a un grupo alquilo hidroxilado como grupo (aunque cualquier grupo R^{9} unido a un átomo de azufre, nitrógeno u oxígeno preferiblemente no está hidroxilado en el \alpha carbono)], y grupos con la fórmula SO_{2}R^{12} o SR^{12} donde R^{12} es un grupo CH_{2}COOR^{13}, CH(COOR^{13})_{2}, CH_{2}CONHR^{9}, CH_{2}CONR^{9}_{2}, CR^{5}(COOR^{13})_{2}, CH(CN)CO_{2}R^{13}, (CH_{2}) _{n}SO_{3}^{-}M^{1}, (CH_{2})_{n}COR^{13}, CH(COR^{9})CH_{2}COR^{9} y CH(R^{5})COR^{9} donde n, M^{1} y R^{5} son los definidos anteriormente y R^{13} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo o un grupo M^{1} o R^{9}.

2

3

En el compuesto con radicales de acuerdo con la invención, X se selecciona preferiblemente entre los átomos de oxígeno o azufre o grupos SO_{2}. Preferiblemente dos y especialmente preferiblemente todos los grupos X son idénticos, especialmente preferiblemente son todos ellos átomos de azufre.

\newpage

En el compuesto con radicales de acuerdo con la invención, las identidades preferidas del grupo R^{1} pueden seleccionarse entre un grupo formado por -H, -SCH_{2}COO^{-}Na+, -SO_{2}R^{2}, -SR^{2}, -SCH_{2}COOCH_{2}CH_{3}, -SO_{2}C(R^{2})_{2} CH_{2}CHOHCH_{2}OH, -SO_{2}NR^{2}_{2}, -SO_{2}CH_{2}CON(R^{2})_{2}, -C-(CH_{2}CH_{2}OH)_{3}, -SO_{2}-C (H) (COOCH_{2}CH_{3})_{2}, -CH_{2}CON(CH_{2}
CH_{2}OH)_{2}, -COOH, -CO_{2}Me, CO_{2}Et, -CO_{2}M^{1}

---SO_{2}---

\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{2} CH _{3} }}

---(CH_{2}CH_{2}OH)_{2}

---SO_{2}---

\delm{C}{\delm{\para}{CH _{2} OH}}

---(CH_{2}CH_{2}OH)_{2}

donde M^{1} es como se ha definido anteriormente y R^{2} es H u opcionalmente un grupo alquilo hidroxilado como, por ejemplo, CH_{2}CH_{2}OH, CH_{2}CHOHCH_{2}OH, CH_{3}, CH_{2}CH_{3}, CH_{2}(CHOH)_{4}CH_{2}OH) o los análogos deuterados de los mismos.

Los compuestos más preferidos de acuerdo con la invención son:

4

5

6

Se ha encontrado que los compuestos de acuerdo con la invención tienen un patrón metabólico mejorado, es decir, una semivida que es habitualmente mayor de 30 minutos cuando se inyecta una dosis de 0,05 mmol/kg en una rata (donde la semivida se define como el tiempo transcurrido entre la inyección y el momento en que la concentración del radical en sangre es igual a la concentración del metabolito).

Otros aspectos de la invención proporcionan el uso de un compuesto con un radical de acuerdo con la invención para la fabricación de un medio de contraste para el uso en ORM y un método de investigación en resonancia magnética de una muestra, consistiendo dicho método en la introducción en dicha muestra de un compuesto con un radical de acuerdo con la invención, la exposición de dicha muestra a una primera radiación de una frecuencia seleccionada para excitar las transiciones de espines de los electrones en dicho radical, la exposición de dicha muestra a una segunda radiación de una frecuencia seleccionada para excitar las transiciones del espín del núcleo en los componentes nucleares seleccionados (como, por ejemplo, los protones) en dicha muestra, la detección de las señales de desintegración de la inducción en dicha muestra, y, opcionalmente, la generación de una imagen o datos de flujo dinámicos a partir de dichas señales detectadas.

Visto desde otro aspecto más, la invención proporciona una composición de un medio de contraste de resonancia magnética que consiste en un compuesto con un radical de acuerdo con la invención junto con al menos un vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable.

Para la obtención de imágenes in vivo, el compuesto con un radical debe ser preferiblemente un radical fisiológicamente tolerable, o uno presentado en una forma fisiológicamente tolerable, como, por ejemplo, encapsulada.

Para el método de acuerdo con la invención, los radicales preferidos son los que tienen relativamente pocas transiciones, como, por ejemplo, menos de 15, preferiblemente menos de 10, en su espectro de la ESR y radicales que tienen transiciones estrechas en un ancho de banda ESR, como, por ejemplo, hasta 500 mG, preferiblemente menos de 150 mG, especialmente menos de 60 mG y particularmente menos de 25 mG, son los especialmente preferidos. (Los anchos de banda mencionados son por convención los anchos de banda intrínsecos (ancho completo a la mitad del máximo del espectro de absorción) bajo condiciones ambiente).

Si bien en general se prefieren líneas de transición con un número bajo de la ESR para obtener un acoplamiento más eficaz de las transiciones de ESR y RM, también se puede conseguir un buen acoplamiento (y, por tanto, la potenciación de la señal de RM) con radicales que muestren un gran número transiciones de la ESR.

Cuando los radicales tengan varias transiciones de la ESR, la constante de escisión hiperfina es, preferiblemente, muy pequeña. En esta conexión, por tanto, son especialmente preferidos los radicales que tienen tan pocos núcleos de espín no cero como sea posible y posicionados tan lejos como sea posible del centro paramagnético.

El compuesto con radicales de acuerdo con la invención puede estar acoplado con otras moléculas como, por ejemplo, a componentes lipofílicos como ácidos grasos de cadena larga o a macromoléculas como polímeros, proteínas, polisacáridos (como, por ejemplo, dextranos), polipéptidos y polietileniminas. La macromolécula puede ser una biomolécula específica del tejido, como un anticuerpo o un polímero de soporte,como polilisina, capaz de transportar varios grupos radicales independientes que pueden por sí mismos unirse a otra macromolécula. El acoplamiento a moléculas lipofílicas o la sustitución del radical con grupos lipofílicos es particularmente útil, ya que puede potenciar la capacidad de relajación de los radicales en determinados sistemas como la sangre. Tales derivados lipofílicos y macromoleculares del compuesto con un radical con la fórmula 1 y sus sales forman un aspecto más de la presente invención.

La unión de un compuesto de acuerdo con la invención con otra molécula más se puede efectuar por cualquiera de los métodos convencionales, como el método de carbodiimida, el procedimiento de mezcla de anhídridos de Krejcarek y cols. (véase Biochemical and Biophysical Research Communications 77: 581 (1977)), el método del anhídrido cíclico de Hnatowich y cols. (véase Science 220: 613 (1983) y en otras publicaciones), las técnicas de conjugación del soporte de Meares y cols. (véase Anal. Biochem. 142: 68 (1984) y en otras publicaciones) y Schering (véase EP-A-331616 (Deutsch/Schering) por ejemplo) y mediante el uso de moléculas de unión como las que se describen en la patente US-A-5208324 (Klaveness/Nycomed).

En vista de sus propiedades beneficiosas, un aspecto más de la presente invención es el uso de un compuesto con radicales de la invención como medios de contraste convencionales en ORM, como medio de contrastes de ESR o como marcas de espines de ESR en la obtención de imágenes de la ESR o magnetometría.

Se ha encontrado que el compuesto con radicales de acuerdo con la invención es útil proporcionando un método no invasivo basado en la ORM para determinar la concentración de oxígeno de una muestra (denominaddo en lo sucesivo método OXI) que implica la manipulación del efecto Overhauser atribuible a un compuesto con radicales de la invención. Más específicamente, el método se basa en la observación y manipulación de una potenciación variable de una señal de protones debida a unas características de saturación cambiada del radical en presencia de oxígeno.

Visto desde otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para determinar la concentración de oxígeno en una muestra de un sujeto, por ejemplo humano o no humano, preferiblemente un mamífero, consistiendo dicho método en los pasos siguientes:

introducción en dicha muestra en una cantidad eficaz de un compuesto con un radical fisiológicamente tolerable de acuerdo con la invención, preferiblemente un radical que tenga una transición ESR con un ancho de banda (medido en agua a 37ºC) de menos de 400 mG, más preferiblemente menos de 150 mG;

irradiando dicha muestra con radiación de una amplitud (es decir, potencia) y frecuencia seleccionada para estimular una transición de resonancia del espín electrónica de dicho radical;

detección de las señales de resonancia magnética potenciada por la resonancia del espín de dicha muestra bajo al menos la primera, segunda y tercera condiciones, de forma que bajo dichas primera y segunda condiciones dicha radiación es de una primera frecuencia, bajo dicha tercera condición dicha radiación es de una frecuencia diferente de dicha primera frecuencia, bajo dichas primera, segunda y tercera condiciones dicha radiación es de una primera, segunda y tercera amplitud, siendo dichas primera y segunda amplitudes al menos diferentes entre sí; y

manipulando dichas señales detectadas de forma que se determina la concentración de oxígeno en dicha muestra.

En una realización preferida, el método OXI consiste en:

(a) la introducción de un compuesto con un radical de acuerdo con la invención, como, por ejemplo, por vía parenteral, por ejemplo por inyección en el tejido corporal o en la vasculatura;

(b) la generación de una primera imagen de ORM de dicha muestra con una energía de VHF P_{A}, un periodo de irradiación T_{VHF1} y durante la resonancia (\DeltaH=O) (es decir, donde la frecuencia de la radiación se selecciona para ser la frecuencia de resonancia de la transición ESR);

(c) la generación de una segunda imagen de ORM de dicha muestra en la segunda energía de VHF P_{B}, tiempo de irradiación T_{VHF1} y durante la resonancia (\DeltaH=O);

(d) la generación de una tercera imagen ORM de dicha muestra con una potencia VHF P_{c} (por ejemplo, igual a P_{A} o P_{B}), un tiempo de irradiación T_{VHF1} y sin resonancia (\DeltaH\neqO, por ejemplo, 100-200 mG);

(e) la manipulación de las imágenes obtenidas en los pasos (b) a (d) y calibrado usando los parámetros determinados ex vivo para proporcionar una imagen del oxígeno de dicha muestra.

En una realización especialmente preferida, se generan adicionalmente una cuarta y una quinta imágenes de ORM en la secuencia de obtención de imágenes. Las condiciones de la cuarta imagen son idénticas a las de la primera, pero el tiempo de irradiación VHF T_{VHE2} es diferente (por ejemplo, el doble de largo, es decir T_{VHF2}=2T_{VHF1}) y la quinta imagen se obtiene sin irradiación VHF, como, por ejemplo, una imagen nativa de intensidad I_{o}, generada por RM convencional con un tiempo de repetición TR=T_{VHF}.

En una realización más, se puede generar una imagen nativa (es decir, una obtenida por RM convencional) de la muestra (como, por ejemplo, el cuerpo) para proporcionar una información estructural (como, por ejemplo, anátomica) sobre la cual se puede superponer la imagen del oxígeno. De esta forma, será posible la localización precisa de, por ejemplo, un tumor deficiente en oxígeno.

La medición exacta del nivel de oxígeno en los tejidos corporales es una ayuda de gran valor para el médico y el método OXI tienen varios usos finales. Por ejemplo, el dato conocido de la concentración de oxígeno disuelto en sangre se puede usar (a través de constantes cinéticas conocidas) para calcular la concentración de oxígeno que se asocia a la hemoglobina. Se trata un parámetro útil que actualmente se mide por técnicas invasivas no deseables o usando la técnica de obtención de imágenes BOLD MR que implica la obtención de imágenes de alto campo para determinar el efecto del oxígeno sobre el hierro paramagnético pero que tiene la desventaja de que para determinar la concentración de oxígeno en sangre es necesario conocer el volumen de sangre en el cual se hace la medición.

Otros usos del método de OXI serán fácilmente evidentes para una persona experta en el tema, e incluyen la obtención de imágenes con oxígeno (es decir, un mapeo) de, por ejemplo, el corazón y las arterias y de tumores malignos, por ejemplo en el cerebro, la mama, el pulmón, los tejidos linfáticos y las áreas superficiales del hígado. En el caso de la obtención de imágenes con oxígeno de tumores, el éxito del tratamiento de los tumores malignos mediante radioterapia puede reflejarse en el nivel de oxígeno en el tejido (habitualmente una concentración de oxígeno de menos de 0,01 mM indicará que el tejido es necrótico y, por tanto, que es probable que ese tratamiento sea ineficaz).

También será evidente que el método OXI será útil en cardiología, cirugía y cuidados intensivos, donde las concentraciones de oxígeno e incluso la perfusión pueden evaluarse con medios no invasivos en casi cualquier tejido.

La manipulación de las señales de RM detectadas en el método OXI se usarán generalmente para generar un juego de datos de imagen (es decir, un juego de datos a partir de los cuales se puede generar una imagen) indicativo de la concentración del radical y uno o más juegos de datos de imagen indicativos de los tiempos de relajación del electrón del radical (generalmente T_{1e}, T_{2e} o T_{1e} T_{\cdot 2e}) y la manipulación de estos juegos de datos y la calibración con los datos de calibrado obtenidos ex vivo dan como resultado un juego de datos de imagen que indican la concentración de oxígeno. Este juego de datos de la concentración de oxígeno se puede transformar en una imagen de la concentración de oxígeno o puede estar sujeta a un filtro del límite alto o bajo para identificar regiones que tengan una concentración de oxígeno alta o baja que, de nuevo, se pueden mostrar como una imagen si así se desea.

Hablando en términos amplios, la señal de potenciación del protón de RM de Overhauser depende del tiempo de relajación T_{1e} y T_{2e} de la transición de la ESR del radical usado en el método OXI. Estos tiempos de relajación dependen ellos mismos de las concentraciones del radical y del oxígeno disuelto en el líquido corporal, así como de la temperatura y naturaleza química del líquido corporal. No obstante, si bien la potenciación de Overhauser puede usarse fácilmente para determinar la concentración de oxígeno para una muestra aislada de pequeño volumen de una concentración de un radical conocido ex vivo, la determinación de la concentración de oxígeno in vivo se complica porque la potenciación de Overhauser depende también en gran medida de la estructura de la muestra en el caso de una muestra grande no aislada, como un cuerpo vivo, debido, entre otros factores, a la penetración no uniforme de la radiación en una muestra grande.

Por tanto, aunque el método OXI requiere los datos de calibración, los datos obtenidos en una gama de concentraciones del radical y de oxígeno en una muestra líquida (como, por ejemplo, sangre) que corresponde al líquido corporal en el que se va a determinar la oxigenación y a una temperatura prefijada (como, por ejemplo, 37ºC), se requiere otra manipulación de los datos para extraer las concentraciones de oxígeno in vivo oxígeno a partir de las señales de ORM detectadas para la muestra.

Los datos de calibración se generan ex vivo determinando los valores de potenciación de Overhauser para el radical en el líquido corporal seleccionado, a la temperatura seleccionada y en una gama de concentraciones de oxígeno (y preferiblemente también del radical). Los tiempos de relajación intrínseca de la ESR para el radical se pueden determinar, en igualdad de condiciones, usando un espectrómetro de ESR convencional equipado con un controlador de la temperatura, determinándose la concentración de oxígeno usando un método conocido para producir resultados exactos y reproducibles (véase Ravin y cols. J. Appl. Physiol. 18: 784-790(1964)).

En general, se deben investigar las concentraciones del radical hasta 0,2, preferiblemente hasta 1,0, especialmente hasta 1,5 mM, y las concentraciones de oxígeno de hasta 0,1, preferiblemente hasta 0,5 mM, para generar los datos de calibración.

La calibración de una muestra de sangre a 37º se puede usar para determinar la potenciación máxima de Overhauser (es decir, una potencia infinita de VHF y una concentración infinita del radical y T_{1}. Las ecuaciones que relacionan T_{1e} y T_{2e} con el radical y la concentración de oxígeno mediante una relación lineal se pueden derivar experimentalmente para cualquier radical que se utilice en el método de la invención. Las ecuaciones son:

(1)2(\surd{3} Y_{e} T_{2e})^{-1}= x + y \ C_{rad}+ z \ C_{o2}

(2)2(\surd{3} Y_{e} T_{1e})^{-1}= a + b \ C_{rad}+ c \ C_{o2}

(3)(Y_{e} \sqrt{T_{1e} T_{2e}})^{-1}= h + j \ C_{rad} + k \ C_{o2}

donde x, y, z, a, b, c, h, j y k (en m G) son los coeficientes determinables experimentalmente característicos del radical elegido. Ye es el cociente giromagnético del electrón, Crad es la concentración del radical (mM), C_{o2} es la concentración de oxígeno (mM), T_{1e} y T_{2e} son los tiempos de relajación del electrón.

Con estos datos de calibración, si se calculan T_{1e}, T_{2e} o T_{1e\text{.}}T_{2e} para un pixel en una imagen de ORM de la muestra, entonces se pueden estimar fácilmente las ecuaciones (1), (2) o (3) para determinar la concentración de oxígeno para ese pixel. La concentración del radical se puede determinar manipulando las señales de RM detectadas en el método de OXI (según se describe en la patente WO-97/09633) con las cuales se genera el juego de datos de imagen de la concentración del radical.

Hablando en términos generales, para el uso en el método OXI se prefiere que el radical sea estable en las condiciones fisiológicas con una semivida suficientemente prolongada (al menos un minuto, preferiblemente al menos 30 minutos) y un tiempo de relajación electrónica prolongado y una buena capacidad de relajación. Será evidente a partir de lo que se ha comentado sobre el método OXI que la sensibilidad de la medición de oxígeno mejorará con radicales que tengan unas transiciones de la ESR con un ancho de banda estrecho, como, por ejemplo, hasta 500 mG, preferiblemente menos de 150 mG, especialmente menos de 60 mG.

Preferiblemente, el radical seleccionado para usarse en el método OXI debe distribuirse sustancialmente en el líquido extracelular (es decir, debería ser un agente del líquido extracelular) de forma que los efectos del hierro paramagnético (como, por ejemplo, el hierro que se encuentra en el interior de los hematíes) se puedan evitar allí.

\newpage

Otra característica preferida del radical elegido para su uso en el método OXI es que debe tener un efecto de autodifusión bajo, preferiblemente menor de 100 mG, especialmente preferiblemente entre 0 y 50 mG por mM del propio radical.

Se puede preparar el compuesto con radicales de acuerdo con la invención a partir de sus compuestos precursores sin radical, utilizando los métodos convencionales de generación del radical. Los compuestos de precursores sin radical adecuados incluyen los correspondientes triaril metanos, triaril metil haluros y triaril metanoles, y sus derivados, como, por ejemplo, los éteres, de los metanoles triarilo.

En otro aspecto más, la invención proporciona un proceso para la preparación de un compuesto con radicales de acuerdo con la invención que consiste, por tanto, en someter a un precursor del radical a un paso de generación del radical, y opcionalmente a la modificación posterior de la sustitución en las estructuras aril, como, por ejemplo, mediante la oxidación o reducción. Con tal modificación, por ejemplo, los sustitutos sulfuro (como, por ejemplo, -SCH_{3} o -SCH_{2}COOEt) pueden oxidarse a las correspondientes sulfonas, con lo que se evitan problemas de la formación de hidrógenos ácidos antes de la formulación de un radical. Los sustitutos lipofílicos similares (como -SCH_{2}COOEt) se pueden reducir a los sustitutos correspondientes hidrofílicos (como, por ejemplo, -SCH_{2}CH_{2}OH).

La mezcla radical-precursor contiene convenientemente un grupo desplazable que produce un radical como, por ejemplo, un grupo OH, Hal, H, COOH, -CO.O.O.CO.C- o -C.NN.C-. Los métodos para preparar un compuesto con radicales a partir de estos precursores se revelan, entre otros, en las patentes WO-A-9/12024 y WO-A-96/39367.

Los precursores sin radicales pueden prepararse por los métodos convencionales en este campo y hay varios métodos descritos en las patentes WO-A-91/12024 y WO-A-96/39367.

Los radicales que tienen semividas largas en una solución acuosa, por ejemplo al menos una hora, preferiblemente diez días, más preferiblemente cincuenta días y especialmente preferiblemente al menos un año, son particularmente deseables para usar en la obtención de imágenes in vivo.

Para usarse en ORM en general o en el método OXI en particular, el compuesto con radicales de acuerdo con la invención que es fisiológicamente tolerable o que está en una forma fisiológicamente tolerable (como, por ejemplo, en solución, en forma encapsulada o como un precursor). Convenientemente, los compuestos están formulados en el medio de contraste junto con vehículos o excipientes farmacéuticos convencionales. Los medios de contraste fabricados o usados de acuerdo a esta invención pueden contener, además del radical (o del precursor sin radical en el cual la formación de radical se va a efectuar inmediatamente antes de la administración o in situ), otros componentes de la formulación como son las composiciones convencionales para procedimientos terapéuticos y diagnósticos en la medicina humana o veterinaria. Por lo tanto, los medios pueden, por ejemplo, incluir agentes solubilizantes, emulsionantes, potenciadores de la viscosidad, tampones, etc. Los medios pueden estar en formas adecuadas para la aplicación parenteral (como, por ejemplo, intravenosa) o enteral (como, por ejemplo, la vía oral), por ejemplo por aplicación directa en las cavidades corporales que tienen conductos de emisión hacia el exterior (como el tracto gastrointestinal, la vejiga y el útero), o por inyección o infusión en el aparato cardiovascular. No obstante, se preferirán en general las soluciones, suspensiones y dispersiones en un medio fisiológico tolerable.

Los radicales que son relativamente inestables o insolubles en el entorno de la muestra se pueden encapsular, como, por ejemplo, en cápsulas resistentes al jugo gástrico que contienen un medio en el cual son estables. Como alternativa, el radical se puede presentar como un polvo liofilizado encapsulado en una cápsula soluble. Tales formulaciones podrían disolverse convenientemente poco antes de su uso in vivo.

Para el uso diagnóstico in vivo para la obtención de imágenes, el medio, que preferiblemente será sustancialmente isotónico, puede administrarse convenientemente en una concentración suficiente para obtener un rendimiento a una concentración del radical libre entre 1 micromolar y 10 mM en la zona de obtención de imágenes; no obstante, la concentración y dosis precisa dependerá, desde luego, de varios factores como la toxicidad, la capacidad de dirigirse al órgano que tenga el medio de contraste, y la vía de administración. La concentración óptima del radical libre representa un equilibrio entre varios factores. En general, las concentraciones óptimas se encontrarían en la mayoría de los casos en el rango de 0,1 a 100 mM, especialmente 0,2 a 10 mM, más especialmente 0,5 a 5 mM. Las composiciones para administración intravenosa deben contener preferiblemente el radical libre en concentraciones de 10 a 1000 mM, especialmente 50 a 500 mM. Para los materiales iónicos, la concentración se encontrará particularmente preferiblemente en el rango de 50 a 200 mM, especialmente 130 a 170 mM y para los materiales no iónicos, entre 200 y 400 mM, especialmente 290 y 330 mM. Para la obtención de las imágenes en las vías urinarias o en las vías renales o biliares, no obstante, quizá se puedan usar composiciones que tengan concentraciones de, por ejemplo, 10 a 100 mM para los materiales iónicos o 20 a 200 mM para los materiales no iónicos. Además, para a la inyección en bolo la concentración puede ser convenientemente de 0,1 a 100 mM, 5 a 25 mM, especialmente preferiblemente 6 a 15 mM.

La presente invención se ilustrará a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitativos (los porcentajes, partes y relaciones se expresan en peso y las temperaturas son grados Celsius, a menos que se indique lo contrario).

Ejemplo 1 Etiléster del ácido Benzo[1, 2-d:4,5-d'] bis(1,3) ditiol-2,2,6,6-tetraacético

La reacción se realizó en un matraz seco bajo atmósfera de argón. 1,2,4,5-benzotetratiol (74 g, 0,359 mol) y dietilacetona dicarboxilato (195,5 ml, 1,076 mol) se mezclaron con diclorometano (3500 ml) y la mezcla se enfrió a -10ºC. Se añadió ácido fluorobórico (197,7 ml, 1,434 mol) y el baño de enfriamiento se cambió a un baño de hielo. La mezcla se agitó a 0ºC durante 90 minutos y a continuación se vertió en carbonato sódico sólido (300 g) bajo agitación enérgica. El lodo se filtró y el filtrado se evaporó hasta seco. El residuo sólido se trituró con heptano (2 x 250 ml) y se secó en un chorro de aire.

Rendimiento: 138,6 g (67%)

^{1}H NMR (CDCl_{3}): 6,97 (s, 2H), 4,16 (q, J=7,2 Hz, 8H), 3,49 (s, 8H) 1,26 (t, J=7,2 Hz, 12H).

Ejemplo 2 2,2,6,6-Tetra(hidroxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo dietil éter (2600 ml) y LiAlH_{4} (21,2 g 0,56 mol). Se añadió etiléster del ácido benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético (80,2 g, 0,139 mol) y la mezcla se sometió a reflujo durante 26 h. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió despacio etanol (165 ml) seguido por agua (410 ml). El éter se decantó y el precipitado blanco se agitó con agua (3300 ml) para dar un lodo. Después de la acidificación con ácido clorhídrico, el lodo se filtró y el producto crudo se lavó con agua y se secó.

Rendimiento: 55,0 g (97%)

^{1}H NMR (DMSO-d6): 7,19 (s, 2H), 4,64 (t, J=5,7 Hz, 4H), 3,56 (q, J=5,7 Hz, 8H), 2,22 (t; J=6,3 Hz)

Ejemplo 3 2,2,6,6-Tetra(t-butoxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo 2,2,6,6-tetra(hidroxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol (50,3 g, 0,124 mol), tetrahidrofurano (1200 ml) e isobuteno (300 ml). Se añadió ácido trifluorometano sulfónico (21,8 ml, 0,248 mol) durante 1 minuto y la mezcla se agitó durante 1 h. La mezcla de reacción se vertió en carbonato sódico sólido (750 g) bajo agitación enérgica. Después de filtrar a través de una almohadilla de silica el filtrado se evaporó hasta sequedad y el residuo sólido se recristalizó a partir de etanol para dar agujas blancas.

Rendimiento: 61,6 g (79%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}): 6,05 (s, 2H), 3,56 (t, J=6,6, 8H) 2,34 (t, J=6,6 Hz, 8H) 1,18 (s, 36H)

Ejemplo 4 2,2,6,6-Tetra(t-butoxietil)4-iodo-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo 2,2,6,6-tetra(t-butoxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol (60,0 g, 95,08 mmol) y tetrahidrofurano seco (2000 ml). La mezcla se enfrió hasta -20ºC y se añadió n-butil litio (76 ml de una solución 2,5 M en hexano, 0,19 mol) durante 3 minutos. La mezcla se agitó durante 20 minutos a -20ºC y a continuación se añadió una solución de yodo (120 g, 0,475 mol) en tetrahidrofurano (500 ml). La mezcla de reacción se vertió en una solución acuosa de bisulfito sódico y se extrajo con dietiléter. La fase orgánica se lavó una vez con una solución acuosa de bisulfito sódico y una vez con solución salina concentrada, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El producto se purificó por cromatografía en silica gel usando una mezcla de CH_{2}Cl_{2} y acetato de etilo como eluyente.

Rendimiento: 36,7 g (51%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}): 6,87 (s, 1 H), 3,57 (t, J=6,6 Hz, 8H), 2,35 (t, J=6,6 Hz 12 H).

Ejemplo 5 Tris (2,2,6,6-tetra-(t-butoxi-etil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo 2,2,6,6-tetra (t- butoxietil)4-iodo-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol (29,0 g 38,3 mmol) y dietiléter seco (520 ml). La mezcla se enfrió hasta -78ºC y se añadió n-butil litio (15,3 ml de una solución 2,5 M en hexano, 38,3 mmol) y se extrajo el baño de enfriamiento. Después de 30 minutos se añadió gota a gota una solución en éter (0,319 M) de dietilcarbonato (40 ml, 12,76 mmol) a lo largo de 120 minutos. Diez minutos después de completar la adición, la mezcla se vertió en NaH_{2}PO_{4} acuoso y se extrajo con dietiléter (2 x 250 ml). La fase orgánica se lavó con agua, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El producto se purificó por cromatografía en silica gel usando una mezcla de CH_{2}Cl_{2} y acetonitrilo como el eluyente.

Rendimiento: 15,7 g (64%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}): 7,07 (s, 3H), 6,57 (s, 1H), 3,30-3,60 (m, 24H), 2, 10-2,50 (m,24H), 1,12-1,17 (m, 108H).

Ejemplo 6 Tris (8-hidroxicarbonil-2,2,6,6-tretra-(t-butoxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo N,N,N',N'-tetrametiletilen diamina (12,5 ml) y tris (2,2,6,6-tetra-(t-butoxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol (960 mg, 0,5 mmol). La mezcla se enfrió a -20ºC y se añadió n-butil litio (3,0 ml de una solución 2,5 M en hexano, 7,5 mmol) a lo largo de 2 minutos. La mezcla se dejó hasta alcanzar la temperatura ambiente y después de 1 h la mezcla se calentó a 40ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 20 minutos.

La mezcla se transfirió a continuación a un matraz seco que contenía un exceso de dióxido de carbono (s) y a continuación se dejó hasta alcanzar la temperatura ambiente. La mezcla de reacción de introdujo en agua (200 ml) y éter (150 ml) y las fases se separaron. La fase orgánica se extrajo una vez más con agua (100 ml) y las fases acuosas combinadas se acidificaron hasta pH 2 y se extrajeron con éter (100 ml). La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se evaporó y el producto se purificó mediante HPLC preparatoria.

Rendimiento: 315 mg (31%).

^{1}H NMR (DMSO): 7,03 (s, 1 H), 3,18-3,58 (m, 24H); 1,95-2,30 (m, 24 H), 0,96-1,09 (m, 108H).

Ejemplo 7 Sal sódica de Tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra-(hidroxietil)benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metilo

A una solución de ácido trifluorometano sulfónico (8,48 ml) en acetonitrilo (64,0 ml) y diclorometano (50,0 ml) a temperatura ambiente se añadió una solución de tris (8-hidroxicarbonil-2,2,6,6-tetra-(t-butoxietil)benzo[1,2-d: 4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol (300 mg, 0,15 mmol) en acetonitrilo (8,0 ml) y diclorometano (8,0 ml). La mezcla se agitó durante 7 minutos y se añadió una solución 26 mM de cloruro de estaño (5,2 ml, 0,14 mmol). Después de 4 minutos se añadió una solución acuosa 1 M de hidróxido sódico en agua de hielo (96 ml) y las fases se separaron y se recogió la fase acuosa que contenía el producto. El pH se ajustó a pH 2 y la solución se sometió a una HPLC preparativa. Las fracciones recogidas se evaporaron hasta eliminar el acetonitrilo y la solución acuosa se vertió en una almohadilla rellena con material C-18. La almohadilla se lavó con agua desionizada y el producto se eluyó con etanol y se evaporó hasta sequedad. Al residuo se añadió agua (5 ml) y el pH se ajustó cuidadosamente a pH 7 con ácido clorhídrico diluido y la mezcla se liofilizó.

Rendimiento: 37,6 mg (18%).

ESR (1,0 mM en H_{2}O, 100 G): sencillo, ancho de banda 160 mG.

Ejemplo 8 Tris (8-carboximetiltio-2,2,6,6-tetra-(2-(1-t-butoxietil))benzo[1,2-d:4, 5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol

En un matraz seco se introdujo tris(2,2,6,6-tetra-(2-(1-t-butoxietil))benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il) metanol (1,0 g, 0,521 mmol) y N,N,N',N'-tetrametil-etilenediamina (TMEDA, 10,4 ml). La solución se agitó a -20ºC y se añadió s-BuLi (6 ml, 7,8 mmol) gota a gota. La temperatura se ajustó a -10ºC, se mantuvo allí durante 14 minutos, y a continuación se ajustó a -25ºC. Se añadió azufre (0,58 g, 18,1 mmol) y se extrajo del baño de enfriamiento. Después de 90 minutos, la mezcla de reacción se evaporó hasta seco. El residuo se trató con HCl 2 M (50 ml) y CH_{2}Cl_{2} (40 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó hasta seco. Se añadió sobre el residuo seco etanol (99,5%, 40 ml), K_{2}CO_{3} (4 g, 28,9 mmol) y bromoacetato de etilo (1,73 g,10,4 mmol). La suspensión se agitó durante 2 horas, se filtró y se evaporó hasta seco. El residuo se lavó con metanol/agua (90/10, v/v, 20 ml) y se secó. Se añadió etanol (25 ml) y KOH 2 M (10 ml), y después de agitar durante una hora se ajustó el pH a 4.5 usando HCl 2 M. El precipitado se filtró y a continuación se disolvió en dietil éter (250 ml). Se añadió agua (300 ml) y el pH se ajustó a 10.2 usando HCl 2 M. La fase acuosa se aisló, el pH se ajustó a 2.5 usando HCl 2 M y el producto se extrajo en dietil éter (100 ml). Después de la evaporación, 0,58 g (51%) del producto residual con una pureza del 90% según se verificó por análisis por HPLC.

MS (ESP, m/e): 2187,2 (M-2).

Ejemplo 9 Sal sódica de tris (8-carboximetiltio-2,2,6,6-(2-(1-hidroxietil)) benzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)ditiol-4-il)metilo

En un matraz se introdujo tris (8-carboximetiltio-2,2,6,6-tetra-(2-(1-t-butoxietil))benzo-[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol (0,452 g, 0,244 mmol) y ácido fórmico (25 ml). La solución se dejó toda la noche y a continuación se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetonitrilo (17 ml) y se añadió ácido trifluorometanosulfónico (0,215 ml, 2,44 mmol). Después de agitar durante dos minutos, se añadió cloruro de estaño (II) (26,8 mg, 0,141 mmol) disuelto en acetonitrilo (2,7 ml). Después de agitar durante otros 1,5 minutos, la mezcla de reacción se vertió en agua agitada (500 ml). La solución se extrajo con etil acetato (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua (50 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó hasta sequedad. El producto se purificó mediante HPLC preparatoria (RP-18, CH_{3}CN/HCl 0,01 M en agua, 20:80). Después de extraer los disolventes, el ácido se neutralizó NaOH 1 M en agua y la solución se liofilizó a continuación.

Rendimiento: 0,172 g (45%).

MS (ESP, m/e): 1499 (M+)

ESR (100 G, 2,5 mM una solución acuosa): sencillo, ancho de banda 195 mG.

Ejemplo 10 Tris (8-N,N-bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metil)aminocarbonilmetiltiol-2,2,6,6-tetra-(2-(1-t-butoxietil)) benzo[1,2-d:4;5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol

En un matraz seco se introdujo tris(2,2,6,6-tetra-(2-(1-t-butoxietil))benzo(1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol (3,0 g, 1,56 mmol) y TMEDA (31,2 ml). La solución se agitó a -20ºC y se añadió gota a gota sec-BuLi (18 ml, 23,4 mmol). La temperatura se ajustó a -10ºC y se mantuvo allí durante 14 minutos y a continuación se ajustó a -25ºC. Se añadió azufre (1,74 g, 54,4 mmol) y se extrajo del baño de enfriamiento. Después de 90 minutos, la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se trató con HCl 2 M en agua (100 ml) y diclorometano (100 ml). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó hasta sequedad. Se añadió etanol (99,5%, 80 ml), K_{2}CO_{3} (8 g, 57,9 mmol) y 2-bromo-N,N-bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metil)-acetamida (5,14 g, 14,0 mmol) al producto crudo intermedio. La suspensión resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente, se filtró y se evaporó hasta sequedad. La purificación se realizó mediante HPLC preparatoria (RP-18, CH_{3}CN/CH_{2}Cl_{2}, 3:1).

Rendimiento: 1,68 g (37,5%).

MS (ESP, m/e): 2869 (M+).

Ejemplo 11 Tris (8-[N,N-bis(2,3-dihidroxipropil)aminocarbonilmetiltiol-2,2,6,6-tetra-(2-(1-hidroxietil))benzo[1,2-d:4,5-d'] bis (1,3)ditiol-4-il)metil

Se introdujo en un matraz tris (8-[N,N-bis (2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metil)aminocarbonilmetiltio] 2,2,6,6-(2-(1-t-butoxietil))benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol (0,50 g, 0,174 mmol) y diclorometano (46 ml) a temperatura ambiente. A la solución agitada se añadió una solución de ácido trifluorometanosulfónico (0,62 ml) en diclorometano (46 ml). Después de agitar durante dos minutos, se añadió una solución de cloruro de estaño (II) (33 mg, 0,174 mmol) en acetonitrilo (4,6 ml). La mezcla de reacción se vertió en agua (460 ml) después de otros 2 minutos. El radical se purificó mediante HPLC preparatoria (RP-18, CH_{3}CN/agua, 5:95), se neutralizó con NaOH 1 M y se liofilizó.

Rendimiento: 200 mg (59%).

MS (ESP, m/e): 1941 ((M+1)+).

ESR (100 G, 1 mM en agua): sencillo, ancho de banda 274 mG.

Ejemplo 12 Metiléster del ácido Benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético

La reacción se realizó en un matraz seco bajo atmósfera de argón. Se mezclaron 1,2,4,5-benzotetratiol (20,45 g, 0,097 mol) y dimetilacetona dicarboxilato (50,68 g, 0,291 mol) con diclorometano (250 ml) y la mezcla se enfrió hasta -10ºC. Se añadió eterato del ácido fluorobórico (53 ml, 0,388 mol) y el baño de enfriamiento se cambió a un baño de hielo. La mezcla se agitó a 0ºC durante 90 minutos y a continuación se vertió en carbonato sódico sólido (100 g) bajo agitación enérgica. El lodo se filtró y el filtrado se evaporó hasta sequedad. El residuo sólido se trituró con dietil éter (300 ml) y se secó en un chorro de aire.

Rendimiento: 30,4 g (60%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 6,97 (s, 2H), 3,70 (s, 12H), 3,51 (s, 8H).

Ejemplo 13 Metiléster del ácido 4,8-Dibromobenzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético

Se introdujo en un matraz metiléstel del ácido benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético (30 g, 0,058 mol) y diclorometano (300 ml). Se añadieron yodo (14,7 g, 0,0578 mol) y monobromuro de yodo (83,7 g, 0,405 mol) y la mezcla se calentó hasta reflujo durante 3 horas. La mezcla se enfrió y se vertió en una solución agitada de etanol (75 ml) y bisulfito sódico (75 g) en agua (600 ml). La fase orgánica se separó, se añadieron 100 ml de agua y la mezcla bifásica se evaporó en vacío para eliminar el diclorometano. El lodo acuoso resultante se filtró y la pasta filtrada se lavó con agua (3 x 200 ml) y recristalizó a partir de n-butanol (450 ml).

Rendimiento: 31,8 g (81%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 3,72 (s, 12H), 3,55 (s, 8H).

Ejemplo 14 2-d_{2}-Metiléster del ácido 4,8-Dibromobenzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético

En un matraz seco se introdujo THF (120 ml) y metanol-d_{1} (200 ml). Se disolvió sodio (0,64 g, 0,0278 mol) en la mezcla y se añadió metiléster del ácido 4,8-dibromobenzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético (40,0 g, 0,0546 mol). La mezcla se calentó hasta reflujo durante 12 horas y a continuación se evaporó al vacío. El residuo se suspendió en NaH_{2}PO_{4} 0,1 M en agua (500 ml) y el lodo se filtró y se lavó con NaH_{2}PO_{4} 0,1 M en agua (2 x 50 ml). El producto se secó en un chorro de aire.

Rendimiento: 31,1 g (83%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 3,72 (s, 12H).

Ejemplo 15 2,2,6,6-Tetra(2-(1-hidroxi-2,2-d_{2}-etil))-4,8-dibromobenzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol

En un matraz bajo atmósfera de argón en el que se había ajustado un condensador de reflujo se introdujo THF (210 ml) y borohidruro de litio (3,22 g, 0,15 mol). Se añadió metanol (5,99 ml, 0,15 mol) gota a gota con agitación y 15 minutos después de completar la adición se añadió 2-d_{2}-metiléster del ácido 4,8-dibromobenzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-2,2,6,6-tetraacético (20 g, 0,0296 mol) en porciones durante 15 minutos. La mezcla se agitó a continuación durante 2 horas y a continuación se calentó hasta reflujo durante otras 2 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la reacción se neutralizó añadiendo gota a gota ácido acético al 20% en solución acuosa (75 ml). La mezcla se evaporó en vacío hasta extraer el THF y el pH se ajustó a 3 usando ácido clorhídrico 3 M. El lodo obtenido se filtró y la pasta filtrada se lavó con agua (3 x 100 ml) y se secó en un chorro de aire.

Rendimiento: 16,4 g, (98%)

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 4,71 (s ancho, 4H), 3,57 (s, 8H).

Ejemplo 16 2,2,6,6-Tetra(2-(1-hidroxi-2,2-d_{2}-etil))-4-bromo-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol

Se introdujo en un matraz dimetil formamida (290 ml) y 2,2,6,6-tetra (2-(1-hidroxi-2,2-d_{2}-etil))-4,8-dibromobenzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol (32 g, 0,056 mol). El material de partida se disolvió con un suave calentamiento y la solución se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadió Zn (7,5 g, 0,115 mol), CuSO_{4} -5 H_{2}O (5,7 g, 0,023 mol) y formato amónico (39,7 g, 0,629 mol) a la mezcla de reacción agitada enérgicamente. Después de 50 minutos la mezcla se filtró y el filtrado se vertió en agua (1500 ml) y el pH se ajustó a 4 usando ácido clorhídrico 3 M. El precipitado se filtró y se lavó con agua (2 x 300 ml) y dietil éter (2 x 60 ml). El material crudo se recristalizó a partir de una mezcla de etanol y agua (1:1) y se secó en vacío.

Rendimiento: 18,1 g, (70%)

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 7,18 (s, 1 H), 4,66 (t, J = 5,1 Hz, 4H) 3,55 (d, J = 5,1 Hz, 8H).

Ejemplo 17 2,2,6,6-Tetra(2-(1-t-butoxi-2,2-d_{2}-etil))-4-bromobenzo[1,2-d:4,5-d']bis(1,3)ditiol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo 2,2,6,6-tetra (2-(1-hidroxi-2,2-d_{2}-etil))-4-bromobenzo[1,2-d: 4,5-d'] bis(1,3)ditiol (31,0 g, 0,063 mol), THF(300 ml) y el espacio libre se purgó con isobuteno. Se añadió ácido trifluorometano sulfónico (3,0 ml, 0,0349 mol) a la mezcla agitada y se aplicó una ligera presión de isobuteno al matraz. La mezcla se agitó durante 4,5 horas y a continuación se vertió en una mezcla de NaOH 1 M en agua (40 ml) y agua (300 ml). Las fases se separaron y la fase orgánica se diluyó con dietil éter (150 ml) y se lavó con agua (3 x 200 ml). La fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y se evaporó y el producto crudo se disolvió en heptano (100ml) y se vertió en una almohadilla de silica (300 g). La almohadilla se eluyó con una mezcla de heptano y éter (4:1, v/v) y el eluido se evaporó hasta dar un sólido blanco céreo.

Rendimiento: 33,8 g, (75%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 6,85 (s, 1 H), 3,56 (s, 8H), 1,18 (s, 36H).

Ejemplo 18 Tris(2,2,6,6-tetra (2-(1-t-butoxi-2,2-d_{2}-etil))benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo 2,2,6,6-tetra(2-(1-butoxi-2,2-d_{2}-etil))-4-bromo-benzo[1,2-d: 4,5-d'] bis(1,3)ditiol (10,0 g, 0,0139 mol) y dietil éter seco (140 ml). La mezcla se enfrió hasta -20ºC y se añadió n-butil litio (5,6 ml de una solución 2,5 M en hexano, 0,014 mol) y se extrajo del baño de enfriamiento. Después de 30 minutos, se añadió una solución de dietil carbonato (546 mg, 4,63 mmol) en dietil éter gota a gota a lo largo de 2 horas. Después de completar la adición la mezcla se agitó durante otros 10 minutos y a continuación se vertió en una solución acuosa de NaH_{2}PO_{4} (125 ml, 0,2 M). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó dos veces con solución salina concentrada y se secó sobre MgSO_{4}. La fase orgánica se evaporó y el residuo oleoso rojo se disolvió en etanol (56 ml) y se dejó toda la noche. Al día siguiente, el producto cristalino amarillo se recogió y se secó en vacío.

Rendimiento: 5,54 g, (62%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 7,07 (s, 3H), 6,57 (s, 1H), 3,60-3,30 (m, 24H), 1,18-1,04 (m, 108H).

Ejemplo 19 Tris (8-carboxil-2,2,6,6-tetra(2-(1-t-butoxi-2,2-d_{2}-etil))-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol

En un matraz seco bajo atmósfera de argón se introdujo TMEDA (89 ml) y tris(2,2,6,6-tetra(2-(1-t-butoxi-2,2-d_{2}-etil))benzo[1,2-d:4;5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metanol (8,65 g, 4,45 mmol). La mezcla se enfrió hasta -20ºC y se añadió sec-BuLi (51,5 ml, 0,067 mol, 1,3 M en ciclohexano) a lo largo de 4 minutos mientras la temperatura se mantuvo por debajo de -10ºC. Después de completar la adición la mezcla de reacción se agitó a -10ºC durante 25 minutos y a continuación se transfirió sobre CO_{2} sólido y se dejó hasta alcanzar la temperatura ambiente. La mezcla grosera se introdujo en dietil éter (445 ml) y agua (445 ml) y se acidificó con ácido clorhídrico 6 M hasta pH 1.5. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo una vez más con dietil éter (445 ml). La fase orgánica combinada se secó (MgSO_{4}) y se evaporó hasta sequedad para dar una espuma amarilla.

Rendimiento: 5,80 g (63%).

^{1}H NMR (CD_{3}CN, 300 MHz): 7,18 (s, 1H), 3,60 -3,25 (m, 24H), 1,15 - 1,02 (m, 108H).

Ejemplo 20 Tris (8-carboxil-2,2,6,6-tetra(2-(1-hidroxi-2,2-d_{2}-etil))benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metilo

Se introdujo en un matraz tris(8-carboxi-2,2,6,6-tetra(2-(1-t-butoxi-2,2-d_{2}-etil))-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3) ditiol-4-il)metanol (5,80 g, 0,0028 mol) y ácido fórmico (60ml) y la mezcla se agitó toda la noche. La mezcla se evaporó hasta sequedad, el residuo se disolvió en acetonitrilo (30 ml) y de nuevo se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetonitrilo (12 ml) y se añadió una solución de ácido trifluorometano sulfónico (4,87 ml, 0,0558 mol) en acetonitrilo (22,5 ml) con agitación. Después de 6 minutos se añadió una solución de SnCl_{2} (0,529 g, 0,00279 mol) en THF (2,87 ml) a la mezcla de la reacción agitada. Después de agitar durante 2 minutos se añadió etil acetato (29 ml) directamente seguido por la adición de NaH_{2}PO_{4} en agua (140 ml, 2 M). La mezcla bifásica se agitó enérgicamente durante 5 minutos y las fases se separaron. La fase orgánica se evaporó y se trató con hidróxido sódico en agua (55,8 ml, 1 M). Después de 15 minutos la fase acuosa se añadió gota a gota en ácido clorhídrico (112 ml 1,5 M). Después de 15 minutos se recogió el precipitado oscuro y se lavó con ácido clorhídrico diluido (2 x 10 ml, 0,1 M) seguido por dietil éter (10 ml).

Rendimiento: 3,56 g, (92%).

Ejemplo 21 Sal sódica de tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra (2-(1-hidroxi-2,2-d_{2}-etil))-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metil

A una muestra del radical triácido sólido, obtenido en el Ejemplo 20, se añadió agua y la solución se neutralizó hasta pH 7 usando hidróxido sódico 0,05 M y la solución se liofilizó.

ESR (1,0 mM en H_{2}O, 100 G): sencillo, ancho de banda 70 mG.

Ejemplo 22 N,N-Bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metil)-2-bromo-acetamida

En un matraz se introdujo N,N-bis(2,3-dihidroxiprop-1-il)-amina (30,0 g, 0,1816 mol), 2,2-dimetoxipropano (120 ml), dimetil formamida (100 ml) y ácido sulfúrico concentrado (20 ml). La mezcla se agitó toda la noche y a continuación se vertió en una mezcla de NaHCO_{3} saturado (500 ml) e hidróxido sódico (16,0 g, 0,4 mol) con agitación. La fase acuosa se extrajo con dietil éter (3 x 200 ml) y la fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para dar un aceite amarillo claro. El aceite se disolvió en una mezcla de diclorometano (75 ml) e hidróxido sódico 0,03 M en agua (2000 ml). Se añadió una solución de bromuro de bromoacetilo (11,81 g, 0,0585 mol) en diclorometano (75 ml) gota a gota a lo largo de 20 minutos y el pH de la mezcla de reacción se monitorizó continuamente durante la adición y se mantuvo cercano a 7 añadiendo hidróxido sódico 1 M en agua. Después de completar la adición la fase orgánica se separó y se lavó con agua (2 x 150 ml), se secó (MgSO_{4}) y se evaporó para dar un aceite amarillo claro.

Rendimiento: 30,7 g (79%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 300 MHz): 4,35-4,25 (m, 2H), 4,16-4,02 (m, 3H), 3,93-3,85 (m, 2H), 3,75-3,55 (m, 4H), 3,25-3,17 (m, 1 H), 1,42-1,40 (m, 6H), 1,33-1,31 (m, 6H).

Ejemplo 23 2-il-éster de tris (8-carboxil-2,2,6,6-tetra(hidroxietil)-benzo[1,2-d:4,5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metil N,N-bis(1,2-dihidroxiprop-3-il)-acetamida

Se introdujo en un matraz dimetil formamida (600 ml) y sal sódica de tris (8-carboxil-2,2,6,6-tetra(hidroxietil)-benzo[1,2-d:4;5-d'] bis(1,3)ditiol-4-il)metil (2,57 g,1,8 mmol). Se añadió N,N-bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metil)2-bromo-acetamida (6,60 g, 18 mmol) seguida por una segunda porción (6,60 g, 18 mmol) después de 15 minutos. La mezcla se agitó durante 60 minutos y el disolvente se extrajo por evaporación. El residuo se disolvió en una mezcla de acetonitrilo (100 ml) y agua (150 ml) y se añadió ácido clorhídrico 2 M (10 ml). Después de 2 horas el acetonitrilo se extrajo por evaporación y el producto se purificó mediante HPLC preparatoria.

Rendimiento: 2,70 g (76%).

ESR (1,0 mM en H_{2}O, 100 G): sencillo, ancho de banda 226 mG.

Claims

1. Un compuesto con un radical con la fórmula 1

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donde:

cada R^{1} que puede ser igual o diferente representa un átomo de hidrógeno o un grupo con la fórmula -M o -XM; cada X que puede ser igual o diferente representa un átomo de oxígeno o azufre o a un grupo CO o S(O)_{m}

(donde m es 1 a 3);

M representa un grupo hidrosolubilizante;

cada R^{7} que puede ser igual o diferente representa un átomo de hidrógeno, o un grupo hidrocarbono, o un grupo hidrosolubilizante M o dos grupos R^{7} junto con el átomo al que están unidos representan un grupo carbonilo o un grupo cicloalquiloideno, mono- o di-oxacicloalquiloideno, mono- o di- azacicloalquiloideno o mono- o di-tiacicloalquiloideno de 5 a 8 miembros y R^{7}, cuando es distinto de hidrógeno, está opcionalmente sustituido por un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilado opcionalmente, un grupo aciloxi hidroxilado opcionalmente o un grupo alquilo hidrosolubilizante M;

n indica 1, 2 ó 3;

y cada un grupo Y indica CH_{2}CH_{2}OR_{22}, en el cual R_{22} es H o C_{1-6}-alquilo, o uno de sus análogos deuterados,

o uno de sus análogos deuterados, un precursor o su sal.

2. Un compuesto con un radical según se reivindica en la reivindicación 1 donde en R_{22} es hidrógeno o t-Bu.

3. Un compuesto con un radical según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el cual n indica 3.

4. Un compuesto con un radical según se reivindica en la reivindicación 1 siendo

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5. Un medio de contraste de resonancia magnética que consiste en un compuesto con un radical según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con al menos un vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable.

6. Un método de investigación en resonancia magnética de una muestra, consistiendo dicho método en la introducción en dicha muestra de un compuesto con un radical según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la exposición de dicha muestra a una primera radiación de una frecuencia seleccionada para excitar las transiciones de espines de los electrones en dicho radical, la exposición de dicha muestra a una segunda radiación de una frecuencia seleccionada para excitar las transiciones del espín del núcleo en los componentes nucleares seleccionados en dicha muestra, la detección de las señales de desintegración de la inducción en dicha muestra, y, opcionalmente, la generación de una imagen o datos de flujo dinámicos a partir de dichas señales detectadas.

7. Un método para determinar la concentración de oxígeno en una muestra, consistiendo dicho método en los pasos siguientes:

: introducción en dicha muestra en una cantidad eficaz de un compuesto con un radical fisiológicamente tolerable según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;

: irradiación de dicha muestra con radiación de una amplitud y frecuencia seleccionada para estimular una transición de resonancia del espín electrónica de dicho radical;

: detección de las señales de resonancia magnética potenciada por la resonancia del espín de dicha muestra bajo al menos la primera, segunda y tercera condiciones, de forma que bajo dichas primera y segunda condiciones dicha radiación es de una primera frecuencia, bajo dicha tercera condición dicha radiación es de una segunda frecuencia diferente de dicha primera frecuencia, bajo dichas primera, segunda y tercera condiciones dicha radiación es de una primera, segunda y tercera amplitud, siendo dichas primera y segunda amplitudes al menos diferentes entre sí; y

: manipulación de dichas señales detectadas de forma que se determina la concentración de oxígeno en dicha muestra.

8. Un método según se reivindica en la reivindicación 7 que consiste en:

(a): introducción de un compuesto con un radical según se reivindica en la reivindicación 1 en un tejido corporal o la vasculatura;

(b): la generación de una primera imagen de ORM de dicha muestra con una energía de VHF P_{A}, un periodo de irradiación T_{VHF1} y durante la resonancia;

(c): la generación de una segunda imagen de ORM de dicha muestra en la segunda energía de VHF P_{B}, tiempo de irradiación T_{VHF1} y durante la resonancia;

(d): la generación de una tercera imagen ORM de dicha muestra con una potencia VHF P_{c}, un tiempo de irradiación T_{VHF1} y sin resonancia;

(e): la manipulación de las imágenes obtenidas en los pasos (b) a (d) y calibrado usando los parámetros determinados ex vivo para proporcionar una imagen del oxígeno de dicha muestra.

9. Un método según se reivindica en la reivindicación 8 en el cual se generan una cuarta y quinta imágenes en la secuencia de obtención de imágenes.

10. Un proceso para preparar un compuesto con un radical según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que consiste en someter a un precursor del radical a un paso de generación del radical y, opcionalmente, modificando posteriormente la sustitución de las estructuras arilo.

11. El uso de un compuesto con un radical según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en ORM.

12. El uso de un compuesto con un radical según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en oximetría.