ES2201478T3 - Utilizacion de derivados del acido betulinico para el tratamiento y la prevencion de melonomas. - Google Patents
Utilizacion de derivados del acido betulinico para el tratamiento y la prevencion de melonomas.Info
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Abstract
Se presenta una composición y un procedimiento para prevenir o inhibir el crecimiento tumoral y para tratar melanomas malignos, sin efectos colaterales tóxicos. El ácido betulínico o un derivado del ácido betulínico es el compuesto activo de la composición que se aplica tópicamente en la zona del tumor.
Description
Utilización de derivados del ácido betulínico
para el tratamiento y la prevención de melanomas.
Esta invención se refiere a composiciones para
inhibir selectivamente y tratar un melanoma maligno utilizando un
tipo específico de derivados de ácido betulínico.
En las últimas cuatro décadas, la incidencia de
melanoma se ha incrementado a una velocidad mayor que cualquier otro
tipo cáncer. Se teoriza actualmente que uno de cada 90 caucásicos
americanos desarrollará un melanoma maligno a lo largo de su vida.
Aunque una gran proporción de los melanomas es diagnosticada
suficientemente pronto para responder a un tratamiento quirúrgico, y
conseguir más del 90% de tasa de supervivencia de diez años, se
estima que casi 7.000 individuos que sufren de melanoma mestastático
morirá en Estados Unidos este año.
Para los pacientes con melanoma mestastático no
susceptible para extirpación quirúrgica, las opciones de tratamiento
están limitadas. El
5-(3,3-dimetil-1-triacenil)-1-H-imidazol-4-carboxamida
(dacarbacina, DTIC) es el único agente quimioterapéutico más eficaz
para el melanoma que tiene una velocidad de respuesta general del
24%. Pero la duración de la respuesta al DTIC es generalmente
bastante pobre. La terapia de combinación con otros agentes
sintéticos y recombinantes, incluyendo,
N,N'-bis(2-cloroetil)-N-nistrosuera
(carmustina, BCNU), cisplatina, tamoxifeno,
interferon-alfa (INF-\alpha) e
interleucina-2 (IL-2), tiene una
velocidad de respuesta mayor (por ejemplo, 30-50%)
en muchos ensayos, pero una velocidad de repuesta completa duradera
es poco común y se incrementa la toxicidad. La quimioterapia
secuencial promete, pero, claramente las opciones de tratamiento
actuales para los individuos que sufren del melanoma metastático son
poco satisfactorias.
Varios fármacos derivados de productos naturales,
tales como derivados de adriamicina (doxorubicina), bleomicina,
etoposido, y vincristina, y sus derivados se han sometido a ensayo
para eficacia con respecto al melanoma, o bien como agentes
individuales o en terapia de combinación. No obstante, similar a los
compuestos sintéticos y recombinantes, estos compuestos muestran
velocidades de respuesta bajas, respuestas completas transitorias y
alta toxicidad.
No obstante, como se demuestra por los agentes
quimioterapéuticos del cáncer conocidos y utilizados actualmente,
los productos naturales derivados de plantas son una fuente probada
de fármacos efectivos. Dos fármacos de productos naturales útiles
son paclitaxel (taxol) y camptotecina. Paclitaxel derivado
originalmente de la corteza del árbol de tejo del Pacífico Taxus
brevifolia Nutt. (Taxaceae), es utilizado actualmente para el
tratamiento de cáncer de ovario refractario o residual. Más
recientemente, se han realizado ensayos clínicos para investigar el
posible papel de paclitaxel en el tratamiento del melanoma
metastático. Como un agente individual, el taxol representa la
actividad comparable con cisplatina e IL-2. El taxol
funciona por un único modo de acción, y promueve la polimerización
de la tubulina. Por tanto, la respuesta antitumoral mediada por el
taxol es debida a su actividad antimitótica. El segundo fármaco a
resaltar, la camptotecina, fue aislado de la corteza del tronco de
un árbol Chino, Camptotheca acuminata Decaisne (Nyssaceae).
La camptotecina funciona también por un mecanismo de acción nuevo,
es decir, la inhibición de la topoisomerasa I. Los ensayos de Fase
II de un análogo pro-fármaco de camptotecina soluble
en agua, Irinotican (CPT-11) se han completado en
Japón contra una variedad de tumores con velocidades de respuesta
que oscilan desde 0% (linfoma) a 50% (pulmón de células pequeñas).
Topotecan, otro análogo de camptotecina soluble en agua, está
actualmente sometido a los ensayos clínicos de Fase II en los
Estados Unidos.
Los datos antitumorales previos procedentes de
varios modelos de animales que utilizan el ácido betulínico han sido
extremadamente variables y aparentemente poco constantes. Por
ejemplo, el ácido betulínico fue indicado para demostrar la
actividad dependiente de la dosis contra el sistema de tumor
carcinosarcoma murino Walker 256 en niveles de dosis de 300 y 500
mg/kg (miligramos por Kilogramo) de peso corporal. Por el contrario,
un informe posterior indicó que el compuesto era inactivo en el
Walker 256 (400 mg/kg) y en los modelos de leucemia
linfocíticamurina L1210 (200 mg/kg). Los ensayos realizados en el
Instituto Nacional del Cáncer confirmaron estos datos negativos.
De forma similar, se ha sugerido la actividad
antitumoral del ácido betulínico en el sistema de ensayo de
linfocito murino P-388. No obstante, la actividad no
fue mantenida por los ensayos realizados por el Instituto Nacional
del Cáncer. Más recientemente, el ácido betulínico fue mostrado por
bloquear la inflamación inducida por forbol éster y la acumulación
de decarboxilasa ornitina epidermal en el modelo de oreja de ratón.
De acuerdo con estas observaciones, fue inhibida la respuesta
carcinogénica en el modelo de piel del ratón de dos etapas.
El documento WO 9629098 describe composiciones
para inhibir el crecimiento de tumores, incluyendo el melanoma
maligno, comprendiendo dichas composiciones un ácido betulínico de
compuesto activo o sus derivados. Los derivados del ácido betulínico
pueden ser ésteres de ácido betulínico, amidas de ácido betulínico,
sales de ácido betulínico o ácido betulínico que es acetilado en su
posición C-3. Los documentos adicionales que
relacionan el uso farmacéutico del ácido betulínico o sus derivados
son WO 9504526, WO 9426725, EP0542622.
\newpage
La publicación de Ryu S.Y. y col., Arch. Pharm.
Res., vol. 17, Nº 5, 1994, página 375-377, describe
el efecto antitumoral de betulina, ácido betulínico, metiléster de
ácido betulínico y ácido betulónico contra varias células tumorales,
incluyendo las células de melanoma.
El resumen Japonés (vol. 13, Nº 399
(C-632), 1989) describe el efecto cacinostático de
ciertos derivados de betulina y su uso en medicina.
Yasukawa K. y col., en Phytomedicine, Vol. 4,
1995, p. 309-313, describe la capacidad de ciertos
derivados de triterpeno del tipo lupeno que incluye betulina, ácido
betulínico y betulonaldehído para inhibir la promoción tumoral por
TPA.
Evers M. y col., en J. Med. Chem., vol. 39, pág.
1056-1068 describe la actividad
anti-VIH de ciertos derivados de ácido
betulínico.
Fuijoka T. y col., en Journal of Natural
Productos, vol. 57, Nº 2, p. 243-247, 1994 describe
la actividad anti-SIDA de los derivados de ácido
betulínico.
Kashiwada y col., en J. Med. Chem., vol. 39,
1996, pág. 1016-1017, describe el ácido betulíncio y
los derivados de ácido dihidrobetulínico como agentes
anti-VIH potentes. Por tanto, han sido indicadas
algunas indicaciones de la actividad antitumoral por el ácido
betulínico, pero, hasta la fecha, no se ha publicado ninguna
información con respecto a la actividad selectiva de derivados del
ácido betulínico contra las células de melanoma de acuerdo con la
fórmula (I) siguiente.
La presente invención se refiere a una
composición para prevenir o inhibir el melanoma, comprendiendo dicha
composición ácido betulínico modificado en su posición
C-3 donde el ácido betulínico modificado tiene la
estructura de fórmula (I)
donde R_{b} es H, alquilo de
C_{1-10}, C_{6}H_{4}Y, COC_{6}H_{4}X,
COCH_{2}Y, CH_{2}CHCH o CH_{2}CCR_{1}, y donde X es H, F,
Cl, Br, I, NO_{2}, CH_{3}, o OCH_{3}, Y es H, F, Cl, Br o I,
y R_{1} es H o alquilo de
C_{1-6}.
El compuesto activo es un derivado del ácido
betulínico. El ácido betulínico es aislado por un método que
comprende las etapas de preparar un extracto de la corteza del
tronco de Ziziphus mauritiana y aislar el ácido betulínico.
Alterantivamente, la betulina puede ser aislada del extracto y
utilizada como precursor para el ácido betulínico, que es preparado
a partir de betulina por una serie de etapas sintéticas. El ácido
betulínico puede aislarse del extracto por la mediación de un perfil
citotóxico selectivo contra el melanoma humano en un panel sujeto de
líneas celulares de cáncer humano, llevando a cabo un
fraccionamiento dirigido al bioensayo basado en el perfil de la
actividad biológica utilizando células de melanoma de humanos
cultivadas (MEL-2) como el monitor, y obteniendo de
esto ácido betulínico como el compuesto activo. El ácido betulínico
resultante puede utilizarse para prevenir o inhibir el crecimiento
del tumor, o puede convertirse en un derivado de acuerdo con la
fórmula (I) para prevenir o inhibir el melanoma. Dicho derivado
puede aplicarse en una preparación tópica.
Los derivados del ácido betulínico de acuerdo con
la fórmula (I) tienen una actividad muy selectiva contra las células
de melanoma, y tienen propiedades físicas que hacen que los
derivados sean más fáciles de incorporar en las preparaciones
tópicas útiles para la prevención o inhibición del crecimiento
celular de melanoma.
Éstos y otros aspectos de la presente invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la
invención, que no están destinados a limitar el alcance de la
invención, sino que son ofrecidos únicamente como ilustraciones de
las formas de realización preferidas de la invención.
La figura 1 es un diagrama del volumen medio del
tumor (en centímetros cúbicos (cm^{3})) con respecto al tiempo
para los tumores MEL-2 no estabilizados en los
ratones de control y ratones tratados con dosis en aumento de ácido
betulínico.
La figura 2 es un diagrama del volumen medio del
tumor (en cm^{3}) frente al tiempo para los tumores
MEL-2 establecidos en ratones de control y ratones
tratados con DTIC o ácido betulínico.
La figura 3(A) es un diagrama de la banda
de 50 Kbp (parejas kilobase) como % de ADN total con respecto al
tiempo para el tratamiento de células MEL-2 con
2\mug/ml (microgramos por mililitro) de ácido betulínico.
La figura 3(B) es un diagrama de la banda
de 50 Kbp como % de ADN total frente a la concentración de ácido
betulínico (\mug/ml); y
Las figuras 4 y 5 son diagramas del volumen medio
del tumor (cm^{3}) con respecto al tiempo para tumores
establecidos y no establecidos MEL-1 en ratones de
control y ratones tratados con dosis en aumento de ácido
betulínico.
Las figuras y estas partes de la descripción que
se refieren a la obtención y efectos terapéuticos del ácido
betulínico sirven como ejemplos de referencia para un mejor
entendimiento de la presente invención.
El ácido betulínico, ácido
3\beta-hidroxi-lup-20(29)-en-28-oico
es un producto natural aislado de varios géneros de plantas
superiores. A través de un fraccionamiento dirigido al
bio-ensayo de la corteza del tronco de Ziziphus
mauritiana Lam. (Rhamnaceae), el ácido betulínico, un triterpeno
pentacíclico, fue aislado como un compuesto activo que mostró una
citotoxicidad selectiva contra las células de melanoma humano
cultivadas. Las líneas de células evaluadas para citotoxicidad
fueron A431 (squamous), BC-1 (pecho),
COL-2 (colon), HT-1080 (sarcoma), KB
(carcinoma epidermoide oral humano), LNCaP (próstata),
LU-1 (pulmón), U373 (glioma), y
MEL-1, -2, -3, y -4 (melanoma). El ácido betulínico
se encontró que era un compuesto antitumoral excelente contra el
melanoma humano debido a su único perfil de citotoxicidad in
vitro e in vivo. El ácido betulínico ha mostrado una fuerte
actividad antitumoral selectiva contra el melanoma por la inducción
de apoptosis. La citotoxicidad selectiva del ácido betulínico, y su
falta de toxicidad hacia las células normales, ofrece un índice
terapéutico favorable. Además, el ácido betulínico se ha indicado
por tener una actividad anti-VIH.
La corteza del abedul blanco, Betula alba,
contiene betulina (hasta aproximadamente 25%),
lup-20(29)ene-3\beta,28-diol,
y ácido betulínico (0,025%), pero es difícil de aislar una cantidad
suficiente de ácido betulínico para realizar un bioensayo extensivo.
Se ha encontrado que podría proporcionarse una cantidad de ácido
betulínico a partir de betulina a través de un método sintético
simple. Se han indicado varias conversiones sintéticas de múltiples
etapas de betulina en ácido betulínico, pero estas secuencias
sintéticas sufren de una producción general baja. Una conversión
concisa de dos etapas de betulina en ácido betulínico, con buena
producción, se ha indicado en Synthetic Communications,
27(9), páginas 1607-1612 (1997).
Como se muestra en la Tabla 1, el crecimiento
in vitro de células MEL-2, fue inhibido por
el ácido betulínico, es decir, un valor ED_{50} de aproximadamente
2 \mug/ml. No obstante, ninguna de las otras líneas de células de
cáncer sometidas a ensayo fue afectada por el ácido betulínico, (es
decir, los valores ED50 mayores de 20 \mug/ml). La especificidad
del tipo de célula definida claramente fue demostrada por el ácido
betulínico.
Por ejemplo, como se ilustra en la Tabla 1, otros
agentes antitumorales conocidos, tales como paclitaxel, micina A,
podopilotoxina, vinblastina y vincristina, demostraron actividad
citotóxica no selectiva, relativamente intensa sin selectividad del
tipo celular discernible. Además, la respuesta citotóxica mediada
por el ácido betulínico no está limitada exclusivamente a la línea
de células de melanoma MEL-2. Los estudios de
respuesta-dosis realizados con líneas de células de
melanoma humano adicionales, designadas MEL-1,
MEL-3 y MEL-4, demostraron valores
ED50 de 1,1, 3,3, y 4,8 \mug/ml, respectivamente.
En la siguiente Tabla 1, el ácido betulínico
extraído y los otros compuestos puros fueron sometidos a ensayo para
citotoxicidad contra las siguientes líneas de células humanas
cultivadas: A431 (células squamous), BC-1 (pecho),
COL-2 (colon), HT-1080 (sarcoma), KB
(carcinoma epidermoide oral humano), LNCaP (próstata),
LU-1 (pulmon), MEL-2 (melanoma),
U373 (glioma), y ZR-75-1
(pecho).
| ED_{50}(\mug/ml) | ||||||||||
| Compuesto | A431 | BC-1 | COL-2 | HI-1080 | KB | LNCaP | LU-1 | MEL-2 | U373 | ZR75-1 |
| Extracto crudo | >20 | >20 | >20 | 9,5 | >20 | >20 | 5,2 | 3,7 | >20 | 15,8 |
| Ziziphus | ||||||||||
| mauritania | ||||||||||
| Acido Betulínico | >20 | >20 | >20 | >20 | >20 | >20 | >20 | 2,0 | >20 | >20 |
| Taxol | 0,00 | 0,02 | 0,02 | 0,00 | 0,02 | 0,02 | 0,00 | 0,06 | 0,008 | 0,02 |
| Camptothecina | 0,00 | 0,07 | 0,005 | 0,01 | 0,00 | 0,006 | 0,00 | 0,02 | 0,000 | 0,001 |
| Elipticina | 0,5 | 0,2 | 0,3 | 1,8 | 0,04 | 0,8 | 0,02 | 0,9 | 1,6 | 0,9 |
| Hemoharringtonina | 0,02 | 0,03 | 0,1 | 0,01 | 0,00 | 0,03 | 0,03 | 0,04 | 0,2 | 0,06 |
| Mitramicina A | 0,09 | 0,3 | 0,06 | 1,5 | 0,09 | 0,05 | 0,2 | 1,2 | 0,04 | 0,2 |
| Podofilotoxina | 0,03 | 0,03 | 0,005 | 0,00 | 0,08 | 0,04 | 0,00 | 0,003 | 0,004 | 0,4 |
| Vinblastina | 0,05 | 0,06 | 0,01 | 0,02 | 0,04 | 0,1 | 0,02 | 0,01 | 1,1 | 0,3 |
| Vincristina | 0,01 | 0,01 | 0,02 | 0,02 | 0,00 | 0,1 | 0,05 | 0,02 | 0,06 | 0,4 |
El ácido betulínico (1) tiene la fórmula
estructural:
El ácido betulínico está perfectamente dispersado
en el reino vegetal, y, como un compuesto encontrado frecuentemente,
se han indicado varias actividades biológicas previas.
El ácido betulínico fue obtenido por la
extracción de una muestra de corteza de tronco triturada, secada al
aire (450 g) de Z. Mauritiana con 80% de metanol acuoso. El
extracto de metanol acuoso fue dividido entonces sucesivamente con
hexano y acetato de etilo para proporcionar hexano, acetato de etilo
y extractos acuosos. Entre estos extractos, el extracto de acetato
de etilo (13,5 g) mostró actividad citotóxica contra una línea de
células de melanoma cultivadas (MEL-2) con un
ED_{50} de 3,7 \mug/ml. El extracto de acetato de etilo fue
cromatografiado sobre una columna de gel de sílice utilizando
acetato de hexanol-etil (4:1 a 1:4) como eluyente
para dar 10 fracciones. Las fracciones 3 y 4 fueron combinadas y
sometidas a fraccionamiento adicional para ofrecer una fracción
activa (fracción 16) que muestra un punto principal mayor por
cromatografía de capa fina [R_{f} 0,67: CHCl_{3}: MeOH
(cloroformo: metanol) (10:1)], que produjeron 72 mg de agujas sin
color después de cristalización repetida del metanol (producción
general del material de planta seca: 0,016% p/p).
Como se confirmó por los datos resumidos en la
Tabla 1, el ácido betulínico ha sido indicado como nocitotóxico con
respecto a las células KB cultivadas. La citotoxicidad de los
extractos crudos y los compuestos purificados fue determinada en un
número de líneas de células cultivadas de cáncer humano. La Tabla 1
indica los varios tipos de células de cáncer evaluadas. Las células
fueron cultivadas en medios adecuados y bajo condiciones estándar.
Para mantener el crecimiento logarítmico, los medios fueron
cambiados 24 horas antes de los ensayos citotóxicos. En el día del
ensayo, las células fueron recogidas por tripsinización, calculadas,
diluidas en medios, y añadidas a placas de
cavidad-96 que contienen compuestos de ensayo
disueltos en DMSO; la concentración final DMSO fue 0,05%.
Las placas fueron incubadas durante tres días.
Siguiendo el periodo de incubación, las células fueron fijadas y
teñidas con sulforhodamina B (SRB). El tinte adherido fue liberado
con base Tris, y OD_{515} fue medido sobre un electro ELISA. El
crecimiento de las células tratadas con ácido betulínico fue
determinado por los valores de OD_{515}, y el crecimiento fue
comparado con los valores OD_{515} de células de control tratadas
con DMSO. Se realizaron estudios de respuesta de dosis para generar
valores ED_{50}.
El compuesto activo aislado, ácido betulínico,
(ED_{50} de 2,0 \mug/ml para MEL-2) tiene una
fórmula molecular de C_{30}H_{48}O_{3}, como se determinó por
el análisis de espectro de masas de alta resolución, un intervalo de
punto de fundición de 292-293ºC (descomposición). El
intervalo de punto de fundición de bibliografía para el ácido
betulínico es 290-293ºC. No fue rebajado un
intervalo de punto de fundición mixto con una muestra conocida de
ácido betulínico. La rotación óptica del compuesto fue medida como
+7,3º (c=1,2; piridina) (lit. +7,5º). La identidad del compuesto
aislado como ácido betulínico fue confirmada comparando las
propiedades físicas anteriormentse, así como
^{1}H-rmn, ^{13}C-rmn y datos
espectrales de masa del compuesto aislado, con datos físicos y
espectros de una muestra conocida de ácido betulínico como se indica
en la bibliografía.
Para someter a ensayo la capacidad in vivo
del ácido betulínico para que sirva como un agente antineoplástico
contra el melanoma maligno, se realizó una serie de estudios con
ratones (desnudos) atímicos inyectados de forma subcutánea con
células de melanoma humano (MEL-2). El estudio
inicial investigó la actividad del ácido betulínico contra los
tumores establecidos. El tratamiento con ácido betulínico comenzó el
día 1, es decir, 24 horas, siguiendo la inyección de células de
tumor. En las dosis 50, 250 y 500 mg/kg (miligramo por kilogramo) de
peso corporal, el ácido betulínico demostró una inhibición efectiva
de crecimiento tumoral con valores p de 0,001 para cada dosis contra
un control (figura 1). Estos resultados indican que el ácido
betulínico puede utilizarse para prevenir el melanoma por aplicación
tópica del melanoma. Un descubrimiento de este tipo es importante
para individuos que están predispuestos a melanoma debido a factores
hereditarios o medioambientales.
En particular, los datos representados en la
figura 1 fueron derivados de experimentos donde ratones atímicos de
cuatro semanas de edad fueron inyectados de forma subcutánea en el
lado derecho con 3,0 x 10^{8} células UISO MEL-2.
UISO MEL-2 es una línea de células derivada de
melanoma metastático de fluido pleural humano. El tratamiento con
fármaco fue iniciado el día siguiente a la inyección de células de
tumor y continuó cada cuatro días para un total de seis dosis.
Cuatro animales de control recibieron 0,5 ml intraperitoneal (IP) de
solución de control PVP, mientras que los animales tratados (4 por
grupo) recibieron 50, 250 ó 500 mg/kg/dosis IP de ácido
betulínico/PVP en H_{2}O ionizada. El ácido betulínico fue
coprecipitado con PVP para incrementar la solubilidad y
biodisponibilidad. Los ratones fueron pesados, y los tumores medidos
con un micrómetro cada día a lo largo del estudio. Todos los
animales fueron sacrificados y se realizaron las autopsias el día 33
cuando el volumen medio del tumor en los animales de control fue
aproximadamente de 1 cm^{3}.
Existió mayor inhibición de crecimiento tumoral
en la dosis más alta de ácido betulínico frente a la dosis más baja
(p = 0,04). La toxicidad no estaba asociada con el tratamiento del
ácido betulínico debido a que la toxicidad es indicada por la
pérdida de peso corporal u otras formas de toxicidad aguda. No se
observó ninguna pérdida de peso.
A continuación, se realizó el ensayo in
vivo del ácido betulínico sobre los melanomas establecidos. En
este estudio, se mantuvo el tratamiento hasta el día 13, en cuyo
tiempo se presentó una masa de tumor palpable en todos los ratones.
Como se ilustra en la figura 2, bajo estas condiciones, el ácido
betulínico abrogó con éxito el crecimiento del tumo (p = 0,0001).
Adicionalmente, el crecimiento del tumor no fue paralelo al del
grupo de control (no tratado) incluso 14 días después de la
finalización del tratamiento.
En particular, con respecto a la figura 2,
ratones atímicos de cuatro semanas de edad fueron inyectados con 5 x
10^{8} de células MEL-2 de forma subcutánea en el
lado derecho. Se estudiaron cuatro grupos de tratamiento de cinco
ratones cada uno. En un grupo, los ratones recibieron 250
mg/kg/dosis de ácido betulínico IP/PVP cada tres días durante seis
dosis en total iniciadas el día siguiente a la inyección de células
de tumor. El grupo de control recibió 0,5 ml de solución salina IP.
Un grupo de tratamiento DTIC recibió 4 mg/kg/dosis de IP DTIC cada
tercer día desde el día 13 al día 28 del estudio. El grupo de
tratamiento con ácido betulínico recibió 250 mg/kg/dosis de ácido
betulínico IP/PVP cada tercer día desde el día 13 hasta el día 27.
Los ratones de control y los tratados con DTIC fueron sacrificados y
se realizaron la autopsias el día 36 debido al gran peso del tumor.
Los ratones restantes fueron sacrificados y se realizaron sus
autopsias el día 41.
Como se ilustra en la figura 2, la eficacia del
ácido betulínico fue comparada también con DTIC, que está disponible
clínicamente para el tratamiento de melanoma metastático. La dosis
de DTIC, que está limitada por la toxicidad, fue seleccionada por
ser equivalente a la administrada a los pacientes humanos. El
crecimiento el tumor en el grupo tratado con ácido betulínico fue
significativamente menor que el observado en los animales tratados
con DTIC (p=0,0001). Comparado con los controles, DTIC produjo una
reducción significativa, pero menos pronunciada en el crecimiento
del tumor con un valor p de 0,01. Un cuarto grupo en este estudio
fue tratado con un esquema similar del estudio inicial. Bajo estas
condiciones, el ácido betulínico, como se demostró anteriormente,
inhibió significativamente el desarrollo del tumor (p=0,0001) y
provocó una reducción prolongada en el crecimiento del tumor de
hasta tres semanas siguiendo la terminación del tratamiento.
Las figuras 4 y 5 ilustran que el ácido
betulínico mostró también la actividad contra las células
MEL-1. En particular, con respecto a las figuras 4 y
5, ratones atímicos de cuatro semanas de edad fueron inyectadas de
forma subcutánea en el lado derecho con 5,0 x 10^{8} de células
UISO MEL-1. El tratamiento de fármaco fue iniciado
en el día siguiente a la inyección de células tumorales y se
continuó cada cuatro días para un total de seis dosis. Cuatro
animales de control recibieron 0,5 ml de solución salina
intraperitoneal (IP), mientras que los animales tratados (4 por
grupo) recibieron 5, 50 ó 250 mg/kg/dosis de ácido betulínico IP/PVP
en dd H_{2}O. Los ratones fueron pesados, y se midieron los
tumores con un micrómetro cada tercer día a lo largo del estudio.
Los animales tratados fueron sacrificados y se realizaron las
autopsias en el día 41, cuando el volumen medio del tumor en los
ratones de control fue aproximadamente 0,5 cm^{3}. Los ratones de
control recibieron entonces seis dosis de 50 mg/kg cada cuarto día
comenzando el día 41 y fueron sacrificados y se realizaron sus
autopsias el día 71.
Los resultados ilustrados en las figuras 4 y 5
con respecto a las células MEL-1 fueron similares a
los resultados ilustrados en las figuras 1 y 2. Por tanto, el ácido
betulínico está activado tanto contra las células
MEL-1 como MEL-2.
El mecanismo por el que los agentes antitumorales
mediaron su actividad es de gran importancia teórica y clínica. Por
tanto, fue investigado el modo de acción por el que el ácido
betulínico media el efecto específico del melanoma. La inspección
visual de las células de melanoma tratadas con ácido betulínico
reveló numerosas vesículas flácidas superficiales. Esta observación
en oposición al humdimiento de la membrana celular, sugirió una
inducción de apoptosis. Uno de los marcados celulares molecular y
celular más común de la apoptosis es la formación de "mallas de
ADN", que corresponde con los productos de digestión
endonucleóatica aleatoria de ADN internucleosomal. Aunque los
últimos estudios han mostrado que una falta de mallado de ADN no
indica necesariamente un fallo para someterse a apoptosis, se ha
mostrado que una escisión de ADN de trenza doble produce un
fragmento de aproximadamente 50 parejas de kilobases (Kbp) para
hacer una correlación constante con inducción de apoptosis por
varios tratamientos en una variedad de líneas celulares. Por tanto,
la generación del fragmento de 50 Kbp es un indicador fiable y
general de apoptosis. La generación del fragmento se produce aguas
arriba del proceso que conduce a las mallas de ADN y representa una
etapa clave en el compromiso a la apoptosis.
Por tanto, una característica importante es un
método de análisis y cuantificación de la formación del fragmento de
50 kbp como un biomarcador para la inducción de apoptosis en líneas
celulares de cáncer humano. Este método comprende el tratamiento de
células en cultivo, seguido por el análisis del contenido de ADN
celular total utilizando electroforesis de gel de inversión de campo
de agarosa. Bajo estas condiciones, se resuelve un fragmento de 50
kbp como una banda difusa. La fracción del ADN celular total
representada por el fragmento de 50 kbp es determinada por el
densiómetro en el contorno de esta banda.
Para investigar la capacidad del ácido betulínico
para inducir la apoptosis, el método descrito anteriormente fue
adaptado para uso con la línea de células MEL-2.
Como se muestra en la figura 3A, la formación que depende del tiempo
de un fragmento 50 kbp de ADN fue inducida por el ácido betulínico
con las células MEL-2. La inducción estaba en el
máximo después de 56 horas de periodo de tratamiento. Después de
este periodo de tiempo, se observó un descenso en la cantidad
relativa del fragmento de 50 kbp, debido probablemente a la
degradación interna. Además, se observaron en el gel de agarosa los
fragmentos de ADN de aproximadamente 146 y aproximadamente 194 kbp,
que son teorizados por ser precursores en el proceso que conduce a
la formación del fragmento de 50 kbp. Adicionalmente, la inducción
de apoptosis (fragmento de 50 kbp) mediada por el ácido betulínico
fue dependiente de la dosis (figura 3B) y el valor ED_{50}
(aproximadamente, 1,5 \mug/ml) observado en la repuesta apoptótica
aproximadamente estrechamente al valor ED_{50} determinado
previamente por la respuesta citotóxica (Tabla 1).
Con respecto adicionalmente a la figura 3A, las
células MEL-2 cultivadas (106 células inoculadas por
matraz de 25 cm^{2}) fueron tratadas con 2 g/ml de ácido
betulínico (200 \mug/ml DMSO, diluido en medios 1:100) para 24,
32, 48, 56 y 72 horas. Después del tratamiento, las células fueron
recolectadas, recogidas por centrifugación, después congeladas de
forma instantánea en nitrógeno líquido para posterior análisis. Las
muestras fueron analizadas en un gel al 1% de agarosa en un aparato
Hoefer HE100 SuperSub refrigerado a 10ºC, por un baño en agua en
circulación. El tampón de electrodo fue tampón de 0,5X TBE que
contiene 0,25 \mul/ml de bromuro de etidio y fue puesto en
circulación durante la electroforesis. Cada gel incluyó 20 uL de
marcadores tamaño de ADN Sigma Pulse Marker 0,1-200
Kbp. Antes de la carga de la muestra, se añadieron 50 \muL de 2%
de SDS a cada cavidad de muestra. Cada tubo de muestra fue
descongelado repetidamente, después las células aglomeradas fueron
transferidas inmediatamente en un volumen de aproximadamente 50
\muL a la cavidad que contiene SDS. Cada cavidad fue colocada
entonces con agarosa LMP fundida, que se dejó gelificar antes de
colocar la bandeja de gel en el Aparato SuperSub.
Se realizó la electroforesis a 172 voltios
durante un total de 18 horas utilizando dos programas de inversión
de campo secuencia con pendiente de impulsos. La fluorescencia de
ADN/bromuro de etidio fue excitada sobre un transiluminador de UV y
se fotografió utilizando la película de 55 P/N de tipo Polaroid. El
negativo fue analizado utilizando un densiómetro de exploración PDI
y software Quantity One. La intensidad del fragmento de 50 Kpb fue
determinada por la medición de la densidad óptica contorno (OD x
mm^{2}) como un porcentaje de la densidad óptica total en la ruta
de la muestra, incluyendo la cavidad de la muestra. El descenso en
la definición de banda de 50 Kbp provocado por la degradación
interna, y no representa una inversión del proceso.
Adicionalmente, con respecto a la figura 3B, las
células MEL-2 cultivadas fueron tratadas durante 56
horas con las siguientes concentraciones de ácido betulínico: 0,
0,1, 1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 \mug/ml. Las células fueron recogidas y
medidas por apoptosis como se describe para la figura 3A. El
experimento fue repetido y se observó una curva de respuesta de
dosis similar (datos no mostrados).
Estos datos sugieren una relación casual, y es
teorizado que la apoptosis mediada por ácido betulínico es sensible
al efecto antitumoral observado con ratones atímicos. Los
experimentos en curso-tiempo con linfocitos humanos
tratados de la misma manera con ácido betulínico a concentraciones
de 2 y 20 \mug/ml no demostró la formación del fragmento de 50 Kbp
(los datos no mostrados) indicando la especificidad y la posible
seguridad del compuesto de ensayo.
Teniendo en cuenta un perfil de citotoxicidad in
vitro, una actividad in vivo significativo, y modo de acción,
el ácido betulínico es un compuesto excepcionalmente atractivo para
el tratamiento del melanoma humano. El ácido betulínico es también
de toxocidad relativamente inocua, como es evidente por la
administración repetida de 500 mg/kg de dosis de ácido betulínico
sin provocar signos agudos de toxicidad o un descenso de peso
corporal. El ácido betulínico fue encontrado previamente por ser
inactivo en una pantalla Hipocrática a dosis de 200 y 400 mg/kg.
El ácido betulínicono no adolece del
inconveniente de insuficiencia. El ácido betulínico es un triterpeno
común disponible de muchas especies a través del reino de las
plantas. De manera más importante, un análogo del ácido betulínico,
la betulina, es el principal constituyente de las especies de abedul
de corteza blanca (hasta 22% de producción), y la betulina puede
convertirse en ácido betulínico.
Además del ácido betulínico, los derivados del
ácido betulínico de acuerdo con la fórmula (I) pueden utilizarse en
una composición aplicada tópicamente para tratar selectivamente, o
prevenir o inhibir un melanoma.
Los derivados del ácido betulínico han sido
sintetizados y evaluados biológicamente para ilustrar que los
derivados del ácido betulínico posee actividad antitumoral selectiva
contra las líneas de células de melanoma de humano in vitro.
Se ha demostrado que la modificación de la estructura madre del
ácido betulínico proporciona numerosos derivados de ácido betulínico
que no pueden utilizarse para prevenir o inhibir el crecimiento de
tumor maligno, especialmente con repescto al melanoma humano. La
actividad antitumoral de los derivados del ácido betulínico es
importante debido al ácido betulínico, aunque mostrando una
actividad muy selectiva contra los melanomas, posee también una baja
solubilidad al agua. No obstante, la solubilidad al agua baja del
ácido betulínico puede solucionarse para proporcionar un derivado
adecuado del ácido betulínico. La modificación de la estructura
madre de la estructura del ácido betulínico puede mejorar también
adicionalmente la actividad antitumoral contra el melanoma
humano.
Un examen de la estructura del ácido betulínico,
es decir, el compuesto (1), revela que el ácido betulínico contiene
tres posiciones, es decir, las posiciones C-3,
C-20 y C-28, donde pueden
introducirse los grupos funcionales. Adicionalmente, pueden entonces
modificarse los grupos funcionales introducidos, si se desea. A
través de una serie de reacciones en estas tres posiciones, fueron
preparados un gran número de derivados de ácido betulínico y fueron
evaluados para determinar la bio-eficacia contra una
serie de líneas celulares de tumor humano, especialmente contra
líneas de células de melanoma humano.
Con respecto a las modificaciones en la posición
C-3 del ácido betulínico, el grupo hidroxilo en la
posición C-3 puede convertirse en un grupo carbonilo
por una reacción de oxidación. El compuesto resultante es ácido
betulónico, es decir, compuesto (2). La funcionalidad cetona del
ácido betulónico puede convertirse en oxima (3) por los
procedimientos sintéticos humanos. Adicionalmente, puede prepararse
un gran número de derivados (4) a través de las reacciones de
substitución realizadas sobre el grupo hidroxilo de oxima (3), con
electrófilos como se indica en la ecuación (a):
donde R_{a}= H o alquilo de
C_{1}-C_{16}, o R_{a}=COC_{6}H_{4}X, donde
X=H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, CH_{3}, o OCH_{3}, o
R_{a}=COCH_{2}Y, donde Y=H, F, Cl, Br, o I, o
R_{a}=CH_{2}CHCH_{2} o CH_{2}CCR_{1}, donde R_{1} es H o
alquilo de C_{1}-C_{6}. Cuando R_{a} es
alquilo de C_{1}-C_{16}, los grupos alquilo
preferidos son grupos alquilo de
C_{1}-C_{16}.
La funcionalidad de cetona del ácido betulónico
puede someterse a una reacción de aminación reductora con varias
aminas alifáticas y aromáticas en la presencia de cianoborohidrato
de sodio (NaBH_{3}CN) para proporcionar las correspondientes
aminas substituidas (5) en la posición C-3, como se
indica en la ecuación (b).
donde R_{b}=H o alquilo de
C_{1}-C_{10}, o R_{b}=C_{6}H_{4}X. Un
derivado de amina primaria, es decir, R_{b}=H, en la posición
C-3 puede reaccionar con una serie de cloruros de
acilo o anhídridos, o haluros de alquilo, para proporcionar amidas y
aminas secundarias (6), respectivamente, como se indica en la
ecuación
(c).
donde R_{c}=COC_{6}H_{4}X, o
R_{c}=COCH_{2}Y, o R_{c}=CH_{2}CHCH_{2} o
CH_{2}CCR_{1}.
Con el fin de demostrar que los derivados del
ácido betulínico tienen una bio-eficacia potente,
varios derivados fueron sometidos a una serie de ensayos de
evaluación biológica. La evaluación biológica de los derivados
enfocados sobre la actividad contra las líneas de células de
melanoma humano. En particular, se prepararon los siguientes
derivados de ácido betulínico y se sometieron a ensayo para perfil
de citotoxicidad contra líneas de células de melanoma humano y
contra un número de líneas de células sin melanoma seleccionadas.
Los resultados se resumieron en la Tabla 2. Los datos muestran que
algunos derivados hidrogenados, es decir, los compuestos 5 y 11, son
menos activos que los derivados no hidrogenados 13 y 10,
respectivamente. No obstante, otros derivados hidrogenados, es
decir, los compuestos 7 y 6 mostraron una actividad biológica
comparable con los derivados no hidrogenados 2 y 8, respectivamente.
Por tanto, es posible mejorar la modificación de la posición
C-20 para producir derivados de ácido betulínico
más potentes.
(Tabla pasa a página
siguiente)
La modificación del ácido betulínico en la
posición C-3 mostró que todos los compuestos,
excepto metoxi oxima 13, expresó una actividad biológica comparable
hacia las líneas de células de melanoma (Tabla 3). El compuesto
amino 9 mostró una citotoxicidad mejorada comparada con el ácido
betulínico 10. Los compuestos 2, 8 y 13 mostraron un descenso en la
citotoxicidad selectiva comparado con el ácido betulínico.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los ensayos anteriores muestran que la
modificación de la estructura madre del ácido betulínico puede
proporcionar derivados que pueden utilizarse como fármacos
antitumorales potentes contra melanoma. Se han preparado derivados
de ácido betulínico que tienen una actividad antitumoral comparable
o mejor que el ácido betulíncio contra el melanoma humano.
Adicionalmente, incluso aunque el ácido betulínico tiene una
actividad antitumoral selectiva notablemente, el ácido betulínico
tiene también una solubilidad al agua pobre. La baja solubilidad del
ácido betulínico en agua puede solucionarse por la introducción de
un substituyente adecuado sobre la estructura madre, lo que a su vez
puede mejorar adicionalmente la actividad antitumoral selectiva.
Claims (4)
1. Composición para el tratamiento de melanoma,
que comprende ácido betulínico modificado en su posición
C-3, donde el ácido betulínico modificado tiene la
estructura
donde R_{b} es H, alquilo de
C_{1-10}, C_{6}H_{4}Y, COC_{6}H_{4}X,
COCH_{2}Y, CH_{2}CHCH, o CH_{2}CCR_{1}, y donde X es H, F,
Cl, Br, I, NO_{2}, CH_{3}, o OCH_{3}, Y es H, F, Cl, Br o I,
y R1 es H o alquilo de
C_{1-6}.
2. Composición de acuerdo con la reivindicación
1, donde R_{b} es H.
3. Uso de un ácido betulínico modificado como se
define en la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un
medicamento tópico para el tratamiento de melanoma.
4. Uso de un ácido betulínico modificado como se
define en la reivindicación 1 ó 2, para la fabricación de un
medicamento tópico para la prevención de melanoma.
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