ES2201567T3 - Nuevo metodo de clonacion de dna basado en el sistema de recombinacion rece-rect de e. coli. - Google Patents

Nuevo metodo de clonacion de dna basado en el sistema de recombinacion rece-rect de e. coli.

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ES2201567T3 ES98963541T ES98963541T ES2201567T3 ES 2201567 T3 ES2201567 T3 ES 2201567T3 ES 98963541 T ES98963541 T ES 98963541T ES 98963541 T ES98963541 T ES 98963541T ES 2201567 T3 ES2201567 T3 ES 2201567T3
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Abstract

Un método para clonación de moléculas de DNA en células procariotas que comprende los pasos de: a) proporcionar una célula huésped procariota capaz de expresar genes recE y recT y capaz de realizar recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET, b) poner en contacto en dicha célula huésped una primera molécula de DNA circular que es capaz de replicarse en dicha célula huésped con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda, por la vía de un mecanismo dependiente de RecET y c) seleccionar una célula huésped en la cual ha ocurrido la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda, en el cual una segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.

Description

Nuevo método de clonación de DNA basado en el sistema de recombinación recE-recT de E. Coli.
Los métodos actuales para clonación de DNA extraño en células bacterianas comprenden usualmente los pasos de proporcionar un vector bacteriano adecuado, escindir dicho vector con una enzima de restricción e insertar in vitro un fragmento de DNA extraño en dicho vector. Los vectores recombinantes resultantes se utilizan luego para transformar bacterias. Aunque tales métodos de clonación se han utilizado satisfactoriamente desde hace aproximadamente 20 años, presentan varios inconvenientes. Estos inconvenientes son, en particular, que los pasos in vitro requeridos para insertar DNA extraño en un vector son a menudo muy complicados y requieren mucho tiempo, si no están disponibles sitios de restricción adecuados en el DNA extraño o el vector.
Adicionalmente, los métodos actuales están basados usualmente en la presencia de sitios de escisión por enzimas de restricción adecuadas en el vector en el cual se inserta el fragmento de DNA extraño. Esto impone dos limitaciones en el producto de clonación final. En primer lugar, el fragmento de DNA extraño puede insertarse usualmente sólo en el vector en la posición de un sitio o sitios de restricción de este tipo. Así, el producto de clonación está limitado por la disposición de sitios de restricción adecuados y la clonación en regiones del vector en las cuales no existe un sitio de restricción adecuado es difícil y a menudo imprecisa. En segundo lugar, dado que los sitios de restricción tienen típicamente una longitud de 4 a 8 pares de bases, los mismos se presentan un número múltiple de veces a medida que aumenta el tamaño de las moléculas de DNA que se utilizan. Esto representa una limitación práctica para el tamaño de las moléculas de DNA que pueden manipularse por la mayoría de las técnicas de clonación actuales. En particular, los tamaños mayores de DNA clonados en vectores tales como cósmidos, BACs, PACs y P1s son tales que usualmente es imposible en la práctica manipularlos directamente por técnicas basadas en enzimas de restricción. Por esta razón, existe necesidad de proporcionar un nuevo método de clonación, del cual se hayan eliminado al menos en parte los inconvenientes de la técnica anterior.
De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que un mecanismo de recombinación homóloga eficiente entre dos moléculas de DNA tiene lugar a frecuencias utilizables en una célula huésped bacteriana que es capaz de expresar los productos de los genes recE y recT o genes funcionalmente afines tales como los genes red\alpha y red\beta, o el sistema de recombinación del fago P22 (Kolod-ner et al., Mol. Microbiol. 11 (1994) 23-30; Fenton, A.C. y Poteete, A.R., Virology 34 (1984) 148-160; Poteete, A.R. y Fenton, A.C., Virology 134 (1984) 161-167. Este nuevo método de clonación de fragmentos de DNA se denomina "clonación ET".
La identificación y caracterización de las proteínas RecE y RecT de E. coli ha sido descrita por Gillen et al. (J. Bacteriol. 145 (1981), 521-532) y Hall et al. (J. Bacteriol. 175 (1993), 277-287). Hall y Kolodner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 3205-3209) describen el apareamiento homólogo in vitro y el intercambio de cadenas de DNA bicatenario lineal y DNA monocatenario circular homólogo promovidos por la proteína RecT. En dichos lugares no puede encontrarse referencia alguna al uso de este método para la clonación de moléculas de DNA en células.
El camino recET de recombinación genética en E. coli es conocido (Hall y Kolodner (1994), supra; Gillen et al. (1981), supra). Este camino requiere la expresión de dos genes, recE y recT. La secuencia de DNA de estos genes ha sido publicada (Hall et al., supra). La proteína RecE es similar a proteínas de bacteriófago, tales como \lambda exo o \lambda Red\alpha (Gillen et al., J. Mol. Biol. 113 (1977), 27-41; Little, J. Biol. Chem. 242 (1967), 679-686; Radding y Carter, J. Biol. Chem. 246 (1971), 2513-2518; Joseph y Kolodner, J. Biol. Chem. 258 (1983), 10418-10424. La proteína RecT es similar a proteínas de bacteriófago, tales como \lambda \beta-proteína o \lambda Rec\beta (Hall et al. (1993), supra; Muniyappa y Radding, J. Biol. Chem. 261 (1996), 7472-7478; Kmiec y Hollomon, J. Biol. Chem. 256 (1981), 12636-12639). El contenido de los documentos citados anteriormente se incorpora en esta memoria por referencia.
Oliner et al. (Nucl. Acids Res. 21 (1993), 5192-5197 describen la clonación in vivo de productos PCR en E. coli por recombinación homóloga intermolecular entre un producto lineal de PCR y un vector de plásmido linealizado. Otros intentos previos para desarrollar nuevos métodos de clonación basados en recombinación homóloga en procariotas, asimismo, se basaban en el uso de enzimas de restricción para linealizar el vector (Bubeck et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 3601-3602; Oliner et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 5192-5197; Degryse, Gene 170 (1996), 45-50) o en el sistema de recombinación dependiente de recA específico del huésped (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171 (1989), 4617-4622; Yang et al., Nature Biotech. 15 (1997), 859-865; Dabert y Smith, Genetics 145 (1997), 877-889). Estos métodos son de aplicabilidad muy limitada y se utilizan escasamente en la práctica.
Nussbaum et al. (Genetics 130 (1992), 37-49) describen una recombinación homóloga de plásmidos estimulada por restricción por el camino recE de E. coli. Se identificaron sucesos de recombinación homóloga por una liberación mediada por restricción de sustratos lineales de plásmido de un ensayo de recombinación por bioluminiscencia en células de E. coli infectadas con fagos quiméricos. Los fagos quiméricos como tales no eran capaces de llevar a cabo una recombinación homóloga. Así pues, tiene que generarse una molécula adecuada para recombinación homóloga dentro de la célula de un precursor no-recombinogénico utilizando escisión con una enzima de rescisión expresada en la célula.
El nuevo método de clonación de DNA de acuerdo con la presente invención no requiere tratamientos in vitro con enzimas de restricción o DNA-ligasas, y por consiguiente es fundamentalmente distinto de las metodologías estándar de clonación de DNA. El método está basado en un camino de recombinación homóloga en E. coli que implica los productos de los genes recE y recT, o los productos de los genes red\alpha y red\beta, o productos de genes funcionalmente equivalentes. El método combina covalentemente un fragmento de DNA preferiblemente lineal y preferiblemente extracromosómico, el fragmento de DNA a clonar, con una segunda molécula vectora de DNA preferiblemente circular, sea un episoma o el cromosoma o cromosomas endógeno(s) del huésped. Por consiguiente, dicho método es distinto de las descripciones previas de clonación en E. coli por recombinación homóloga que están basadas en el uso de dos fragmentos de DNA lineales o caminos de recombinación diferentes.
La presente invención proporciona un camino flexible para utilizar recombinación homóloga a fin de diseñar grandes moléculas de DNA que incluyen un plásmido intacto >76 kb y el cromosoma de E. coli. Así, prácticamente no hay limitación alguna de elección de la diana, de acuerdo con el tamaño o el sitio. Por consiguiente, cualquier DNA receptor en una célula huésped, desde un plásmido de copias altas al genoma, es susceptible de alteración precisa. Además del diseño por ingeniería genética de grandes moléculas de DNA, la invención reseña nuevos métodos independientes de las enzimas de restricción para el diseño de DNA. Por ejemplo, deleciones entre dos pares de bases seleccionados cualesquiera en un episoma diana pueden realizarse por elección de ramas de homología de oligonucleótidos. Análogamente, pueden insertarse secuencias de DNA seleccionadas en un par de bases seleccionado para crear, por ejemplo, marcos de lectura de proteínas alterados. Combinaciones concertadas de inserciones y deleciones, así como mutaciones puntuales, son también posibles. La aplicación de estas estrategias es particularmente relevante para construcciones de DNA complejas o difíciles, por ejemplo, las propuestas para recombinaciones homólogas en células eucariotas, v.g. células madre de embrión de ratón. Adicionalmente, la presente invención proporciona un camino simple para posicionar sitios diana de recombinación específica de sitio exactamente donde se desee. Esto simplificará las aplicaciones de recombinación específica de sitio en otros sistemas vivos, tales como plantas y ratones.
Una materia objeto de la presente invención es un método para clonación de moléculas de DNA en células procariotas que comprende los pasos de:
a)
proporcionar una célula huésped procariota capaz de expresar genes recE y recT y capaz de realizar recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET,
b)
poner en contacto en dicha célula huésped una primera molécula de DNA circular que es capaz de replicarse en dicha célula huésped con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda, por la vía de un mecanismo dependiente de RecET y
c)
seleccionar una célula huésped en la cual ha ocurrido la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda,
en el cual una segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
En el método de la presente invención, la recombinación homóloga ocurre por la vía de un mecanismo dependiente de recET, es decir la recombinación homóloga está mediada por los productos génicos de los genes recE y recT que se seleccionan preferentemente de los genes de E. coli recE y recT o genes funcionalmente afines tales como los genes red\alpha y red\beta del fago \lambda.
La célula huésped adecuada para el método de la presente invención es una célula bacteriana, v.g. una célula bacteriana gram-negativa. Más preferiblemente, la célula huésped es una célula enterobacteriana, tal como Salmonella, Klebsiella o Escherichia. Muy preferiblemente, la célula huésped es una célula de Escherichia coli. Debe indicarse, sin embargo, que el método de clonación de la presente invención es adecuado también para células eucariotas, tales como células de hongos, plantas o animales.
La célula huésped utilizada para recombinación homóloga y propagación del DNA clonado puede ser cualquier cepa bacteriana en la cual se expresan los productos de los genes recE y recT, o red\alpha y red\beta. La célula huésped puede comprender los genes recE y recT localizados en el cromosoma de la célula huésped o en DNA no cromosómico, preferiblemente en un vector, v.g. un plásmido. En un caso preferido, los productos de los genes RecE y RecT, o Red\alpha y Red\beta, se expresan a partir de dos promotores regulables diferentes, tales como el promotor BAD inducible por arabinosa o el promotor lac, o a partir de promotores no regulables. Alternativamente, los genes recE y recT, o red\alpha y red\beta, se expresan en un mRNA policistrónico a partir de un solo promotor regulable o no regulable. Preferiblemente, la expresión está controlada por promotores regulables.
Es también especialmente preferida una realización, en la cual el gen recE o red\alpha es expresado por un promotor regulable. Así, el potencial recombinogénico del sistema se suscita únicamente cuando se requiere y, en otros momentos, las posibles reacciones de recombinación no deseadas están limitadas. El gen recT o red\beta, por otra parte, está sobreexpresado preferiblemente con respecto a recE o red\alpha. Esto puede realizarse por utilización de un promotor constitutivo fuerte, v.g. el promotor EM7 y/o por utilización de un número de copias más elevado de los genes recT, o red\beta, en comparación con recE, o red\alpha.
\newpage
Para el propósito de la presente invención, cualesquiera genes recE y recT son adecuados en la medida en que los mismos permiten una recombinación homóloga de moléculas primera y segunda de DNA con eficiencia suficiente para dar lugar a productos de recombinación en más de 1 en 10^{9} células transfectadas con DNA. Los genes recE y recT pueden derivarse de cualquier cepa bacteriana o de bacteriófagos, o pueden ser mutantes y variantes de los mismos. Se prefieren genes recE y recT que se derivan de E. coli o de bacteriófagos de E. coli, tales como los genes red\alpha y red\beta procedentes de fagos lambdoides, v.g. el bacteriófago \lambda.
Más preferiblemente, el gen recE o red\alpha se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 1320 (ATG) a 2159 (GAC) como se representa en Fig. 7B,
(b) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 1320 (ATG) a 1998 (CGA) como se representa en Fig. 14B,
(c) un ácido nucleico que codifica el mismo polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(d) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas con la secuencia de ácido nucleico de (a), (b) y/o (c).
Más preferiblemente, el gen recT o red\beta se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende:
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 2155 (ATG) a 2961 (GAA) como se representa en Fig. 7B,
(b) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 2086 (ATG) a 2868 (GCA) como se representa en Fig. 14B,
(c) un ácido nucleico que codifica el mismo polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(d) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas con las secuencias de ácido nucleico de (a), (b) y/o (c).
Debe indicarse que la presente invención abarca también mutantes y variantes de las secuencias dadas, v.g. mutantes y variantes existentes naturalmente o mutantes y variantes obtenidos(as) por ingeniería genética. Adicionalmente, debe indicarse que el gen recE representado en Fig. 7B es un gen ya truncado que codifica los aminoácidos 588-866 de la proteína nativa. Los mutantes y variantes tienen preferiblemente una identidad de secuencia nucleotídica de al menos 60%, preferiblemente de al menos 70% y más preferiblemente de al menos 80% de las secuencias de recE y recT representadas en Fig. 7B y 13B, y de las secuencias red\alpha y red\beta representadas en Fig. 14B.
De acuerdo con la presente invención, la hibridación en condiciones severas se define preferiblemente de acuerdo con Sambrook et al. (1989), infra, y comprende una señal de hibridación detectable después de lavado durante 30 minutos en 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC.
En un caso preferido, los genes recE y recT se derivan de los genes endógenos correspondientes presentes en la cepa K12 de E. coli, y sus derivados, o de bacteriófagos. En particular, son adecuadas cepas que llevan la mutación sbcA. Ejemplos de tales cepas son JC8679 y JC9604 (Gillen et al. (1981), supra). Alternativamente, los genes correspondientes pueden obtenerse también a partir de otros colifagos tales como fagos lambdoides o el fago P22.
El genotipo de JC 8679 y JC 9604 es Sex (Hfr, F+, F-, o F'): F-.JC 8679 comprende las mutaciones: recBC 21, recC 22, sbcA 23, thr-1, ara-14, leu B 6, DE(gpt-proA) 62, lacY1, tsx-33, gluV44 (AS), galK2 (Oc), LAM-, his-60, relA 1, rps L31 (strR), xyl A5, mtl-1, argE3 (Oc) y thi-1. JC 9604 comprende las mismas mutaciones y adicionalmente la mutación recA 56.
Adicionalmente, debe indicarse que los genes recE y recT, o red\alpha y red\beta, pueden aislarse a partir de una primera fuente donante, v.g. una célula donante bacteriana y transformarse en una segunda fuente receptora, v.g. una célula receptora bacteriana o eucariota en la cual se expresan aquéllos por medios de DNA recombinante.
En una realización de la invención, la célula huésped utilizada es una cepa bacteriana que tiene una mutación sbcA, v.g., una de las cepas de E. coli JC 8679 y JC 9604 mencionadas anteriormente. Sin embargo, el método de la invención no está limitado a células huésped que tengan una mutación sbcA o células análogas. Sorprendentemente, se ha encontrado que el método de clonación de la invención funciona también en células sin la mutación sbcA, sea células recBC+ o recBC-, v.g. también en células huésped procariotas recBC+, v.g. en células recBC+ de E. coli. En tal caso, se usan preferiblemente aquellas células huésped en las cuales se expresa el producto de un gen inhibidor de exonucleasa de tipo recBC. Preferiblemente, el inhibidor de exonucleasa es capaz de inhibir el sistema recBC del huésped o un equivalente del mismo. Un ejemplo adecuado de un gen inhibidor de exonucleasa de este tipo es el gen red\gamma de \lambda (Murphy, J. Bacteriol. 173 (1991), 5808-5821) y equivalentes funcionales del mismo, respectivamente, que se pueden obtener, por ejemplo, a partir de otros colifagos tales como el fago P22 (Murphy, J. Biol. Chem. 269 (1994), 22507-22516).
\newpage
Más preferiblemente, el gen inhibidor de exonucleasa se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 3588 (ATG) a 4002 (GTA) como se representa en Fig. 14A,
(b) un ácido nucleico que codifica el mismo polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(c) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas (como se han definido anteriormente) con la secuencia de ácido nucleico de (a) y/o (b).
Sorprendentemente, se ha encontrado que la expresión de un gen inhibidor de exonucleasa en ambas cepas recBC+ y recBC- conduce a una mejora significativa de la eficiencia de clonación.
El método de clonación de acuerdo con la presente invención emplea una recombinación homóloga entre una primera molécula circular de DNA y una segunda molécula de DNA. La primera molécula de DNA puede ser cualquier molécula de DNA que lleve un origen de replicación que es operativo en la célula huésped, v.g. un origen de replicación de E. coli. Adicionalmente, la primera molécula de DNA está presente en una forma que es capaz de replicarse en la célula huésped. La primera molécula de DNA, es decir, el vector, puede ser cualquier molécula de DNA extracromosómico que contenga un origen de replicación que es operativo en dicha célula huésped, v.g. un plásmido con inclusión de plásmidos de número de copias único, bajo, medio o alto, u otras moléculas de DNA circular extracromosómicas basadas en tecnología de cósmidos o vectores P1, BAC o PAC. Ejemplos de tales vectores han sido descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. (Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2ª Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ioannou et al. (Nature Genet. 6 (1994), 84-89) o las referencias citadas en dicho lugar. La primera molécula de DNA puede ser también un cromosoma de la célula huésped, particularmente el cromosoma de E. coli. Preferiblemente, la primera molécula de DNA es una molécula de DNA bicatenario.
La segunda molécula de DNA es preferiblemente una molécula de DNA lineal y comprende al menos dos regiones de homología de secuencia, preferiblemente de identidad de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA. Estas regiones de homología o identidad son preferiblemente al menos de 15 nucleótidos cada una, más preferiblemente al menos de 20 nucleótidos y, muy preferiblemente, al menos de 30 nucleótidos cada una. Se obtuvieron resultados especialmente satisfactorios cuando se utilizaron regiones de homología de secuencia que tenían una longitud de aproximadamente 40 nucleótidos o más, v.g. 60 nucleótidos o más. Las dos regiones de homología de secuencia pueden estar localizadas en el fragmento de DNA lineal de tal modo que una se encuentra en un extremo y la otra se encuentra en el otro extremo; sin embargo, las mismas pueden también estar localizadas internamente. De modo preferible, también la segunda molécula de DNA es una molécula de DNA bicatenario.
Las dos regiones de homología de secuencia se seleccionan de acuerdo con el diseño experimental. No existe limitación alguna en cuanto a qué regiones de la primera molécula de DNA pueden seleccionarse para las dos regiones de homología de secuencia localizadas en la segunda molécula de DNA, excepto que el suceso de recombinación homóloga no puede delecionar el origen de replicación de la primera molécula de DNA. Las regiones de homología de secuencia pueden estar interrumpidas por regiones de secuencia no idéntica con tal que se retenga una homología de secuencia suficiente para la reacción de recombinación homóloga. Por la utilización de ramas de homología de secuencia que tengan regiones de secuencia no idéntica comparadas con el sitio diana, pueden introducirse mutaciones tales como sustituciones, v.g. mutaciones puntuales, inserciones y/o deleciones en el sitio diana por clonación ET.
La segunda molécula de DNA extraño que va a clonarse en la célula bacteriana puede derivarse de cualquier fuente. Por ejemplo, la segunda molécula de DNA puede sintetizarse por una reacción de multiplicación de ácido nucleico tal como una PCR en la cual ambos oligonucleótidos de DNA utilizados para iniciar la multiplicación contienen además de secuencias en los extremos 3' que sirven como iniciador para la multiplicación, una u otra de las dos regiones de homología. Utilizando oligonucleótidos de este diseño, el producto de DNA de la multiplicación puede ser cualquier secuencia de DNA adecuada para multiplicación y tendrá adicionalmente una región de homología de secuencia en cada extremo.
Un ejemplo específico de la generación de la segunda molécula de DNA es la multiplicación de un gen que sirve para transmitir una diferencia fenotípica a las células huésped bacterianas, en particular, resistencia a antibióticos. Una variación simple de este procedimiento implica el uso de oligonucleótidos que incluyen otras secuencias además de la secuencia del iniciador de la PCR y la región de homología de secuencia. Una variación simple adicional es el uso de más de dos iniciadores de la multiplicación para generar el producto de multiplicación. Una variación simple adicional es el uso de más de una reacción de multiplicación para generar el producto de multiplicación. Una operación adicional es el uso de fragmentos de DNA obtenidos por métodos distintos de la PCR, por ejemplo, por escisión con endonucleasas o enzimas de restricción para linealizar fragmentos a partir de cualquier fuente de DNA.
Debe indicarse que la segunda molécula de DNA no es necesariamente una especie simple de molécula de DNA. Por supuesto, es posible utilizar una población heterogénea de segundas moléculas de DNA, v.g. para generar una genoteca de DNA, tal como una genoteca genómica o genoteca de cDNA.
El método de la presente invención puede comprender la puesta en contacto de las moléculas de DNA primera y segunda in vivo. En una realización de la presente invención, el segundo fragmento de DNA se transforma en una cepa bacteriana que aloja ya la primera molécula de DNA vector. En una realización diferente, la segunda molécula de DNA y la primera molécula de DNA se mezclan juntas in vitro antes de la co-transformación en la célula huésped bacteriana. Estas dos realizaciones de la presente invención se representan esquemáticamente en Fig. 1. El método de transformación puede ser cualquier método conocido en la técnica (v.g. Sambrook et al. supra). Sin embargo, el método de transformación o co-transformación preferido, es la electroporación.
Después de la puesta en contacto de las moléculas de DNA primera y segunda en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre las moléculas de DNA primera y segunda por la vía del mecanismo de clonación ET se selecciona una célula huésped, en la cual ha ocurrido recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda. Este procedimiento de selección puede llevarse a cabo por varios métodos diferentes. A continuación se representan tres métodos de selección preferidos en la Fig. 2, y se describen en detalle más adelante.
En un primer método de selección, se emplea un segundo fragmento de DNA que lleva un gen para un marcador situado entre las dos regiones de homología de secuencia en las cuales es detectable la recombinación homóloga por expresión del gen marcador. El gen marcador puede ser un gen para un marcador fenotípico que no se expresa en el huésped o a partir de la primera molécula de DNA. Después de la recombinación por clonación ET, el cambio en fenotipo de la cepa huésped transmitido por la adquisición estable del segundo fragmento de DNA identifica el producto de la clonación ET.
En un caso preferido, el marcador fenotípico es un gen que transmite la resistencia a un antibiótico, en particular, genes que transportan resistencia a kanamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina o cualquier otra sustancia que exhiba efectos bactericidas o bacteriostáticos en la cepa bacteriana empleada.
Una variación simple es el uso de un gen que complementa una deficiencia presente en la cepa huésped bacteriana empleada. Por ejemplo, la cepa huésped puede estar mutada de tal modo que sea incapaz de crecimiento sin un suplemento metabólico. En ausencia de este suplemento, un gen en el segundo fragmento de DNA puede complementar el efecto mutacional permitiendo de este modo el crecimiento. Únicamente crecerán aquellas células que contienen el episoma portador de la transposición de DNA deseada causada por el paso de clonación ET.
En otro ejemplo, la cepa huésped lleva un gen marcador fenotípico que está mutado de tal modo que uno de sus codones es un codón de parada que trunca el marco de lectura abierto. La expresión de la proteína de longitud total a partir de este gen marcador fenotípico requiere la introducción de un gen supresor de tRNA que, una vez expresado, reconoce el codón de parada y permite la traducción del marco de lectura abierto total. El gen de tRNA supresor es introducido por el paso de clonación ET y los recombinantes satisfactorios se identifican por selección para, o identificación de, la expresión del gen marcador fenotípico. En estos casos, únicamente crecerán aquellas células que contienen la transposición de DNA deseada causada por el paso de clonación ET.
Una variación simple adicional es el uso de un gen informador que transmite un cambio fácilmente detectable en el color o la morfología de la colonia. En un caso preferido, puede utilizarse la proteína de fluorescencia verde (GFP), y las colonias que llevan el producto de la clonación ET pueden identificarse por las emisiones de fluorescencia de GFP. En otro caso preferido, puede utilizarse el gen lacZ y las colonias que llevan el producto de la clonación ET se pueden identificar por un color azul de la colonia cuando se añade X-gal al medio de cultivo.
En un segundo método de selección, la inserción del segundo fragmento de DNA en la primera molécula de DNA por la clonación ET altera la expresión de un marcador presente en la primera molécula de DNA. En esta realización, la primera molécula de DNA contiene al menos un gen marcador entre las dos regiones de homología de secuencia y la recombinación homóloga puede detectarse por una expresión alterada, v.g. la falta de expresión del gen marcador.
En una aplicación preferida, el marcador presente en la primera molécula de DNA es un producto de un gen contra-seleccionable, tal como los genes sacB, ccdB, o de resistencia a la tetraciclina. En estos casos, las células bacterianas que llevan la primera molécula de DNA no modificada por el paso de clonación ET después de la transformación con el segundo fragmento de DNA, o co-transformación con el segundo fragmento de DNA y la primera molécula de DNA, se cultivan sobre un medio de tal modo que la expresión del marcador contra-seleccionable transmite un efecto tóxico o bacteriostático al huésped. Únicamente crecerán aquellas células bacterianas que contienen la primera molécula de DNA que lleva la transposición de DNA deseada causada por el paso de clonación ET.
En otra aplicación preferida, la primera molécula de DNA lleva un gen informador que transmite un cambio fácilmente detectable en el color o la morfología de la colonia. En un caso preferido, puede estar presente la proteína de fluorescencia verde (GFP) en la primera molécula de DNA y las colonias que llevan la primera molécula de DNA con o sin el producto de la clonación ET pueden distinguirse por diferencias en las emisiones de fluorescencia de GFP. En otro caso preferido, puede estar presente el gen lacZ en la primera molécula de DNA y las colonias que llevan la primera molécula de DNA con o sin el producto de la clonación ET pueden identificarse por un color de colonia azul o blanco cuando se añade X-gal al medio de cultivo.
En un tercer método de selección, la integración del segundo fragmento de DNA en la primera molécula de DNA por la clonación ET elimina un sitio diana para una recombinasa específica de sitio, denominada aquí RT (por recombinasa diana) presente en la primera molécula de DNA entre las dos regiones de homología de secuencia. Un suceso de recombinación homóloga puede ser detectado por la eliminación del sitio diana.
En ausencia del producto de la clonación ET, la RT está disponible para uso por la recombinasa específica de sitio correspondiente. La diferencia entre la presencia o no de esta RT es la base para la selección del producto de la clonación ET. En presencia de esta RT y de la recombinasa específica de sitio correspondiente, la recombinasa específica de sitio media la recombinación en esta RT y cambia el fenotipo del huésped de tal manera que éste no es capaz de crecer, o bien presenta un fenotipo fácilmente observable. En ausencia de esta RT, la recombinasa específica de sitio correspondiente no es capaz de mediar la recombinación.
En un caso preferido, la primera molécula de DNA a la cual se dirige el segundo fragmento de DNA, contiene dos RTs, una de las cuales es adyacente a, pero no forma parte de, un gen de resistencia a los antibióticos. El segundo fragmento de DNA está dirigido, por diseño, para eliminar esta RT. Después de exposición a la recombinasa específica de sitio correspondiente, aquellas moléculas del primer DNA que no llevan el producto de la clonación ET se someterán a una reacción de recombinación específica de sitio entre las RTs que eliminan el gen de resistencia a los antibióticos y por consiguiente la primera molécula de DNA ya no transmitirá la resistencia al antibiótico correspondiente. Únicamente aquellas primeras moléculas de DNA que contienen el producto de la clonación ET, o que han fracasado en la recombinación específica de sitio por cualquier otra razón, transmitirán la resistencia al antibiótico.
En otro caso preferido, la RT a eliminar por la clonación ET del segundo fragmento de DNA es adyacente a un gen que complementa una deficiencia presente dentro de la cepa huésped empleada. En otro caso preferido, la RT a eliminar por la clonación ET del segundo fragmento de DNA es adyacente a un gen informador que transmite un cambio fácilmente detectable en el color o la morfología de la colonia.
En otro caso preferido, la RT a eliminar por la clonación ET del segundo fragmento de DNA se encuentra en cualquier parte en una primera molécula de DNA episómico y el episoma transporta un origen de replicación incompatible con la supervivencia de la célula huésped bacteriana si el mismo se integra en el genoma del huésped. En este caso, el genoma del huésped lleva una segunda RT, que puede ser o no una RT mutada de tal manera que la recombinasa específica de sitio correspondiente puede integrar el episoma, por la vía de su RT, en la RT situada en el genoma huésped. Otras RTs preferidas incluyen RTs para recombinasas específicas de sitio de la clase de las resolvasas/transposasas. Las RTs incluyen aquéllas descritas por ejemplos existentes de recombinación específica de sitio, así como variaciones naturales o mutadas de las mismas.
Las recombinasas específicas de sitio preferidas incluyen Cre, FLP, Kw o cualquier recombinasa específica de sitio de la clase de las integrasas. Otras recombinasas específicas de sitio preferidas incluyen recombinasas específicas de sitio de la clase de las resolvasas/transposasas.
No existe limitación alguna en cuanto al método de expresión de la recombinasa específica de sitio en la célula huésped. En un método preferido, la expresión de la recombinasa específica de sitio se regula de tal manera que la expresión puede inducirse y extinguirse de acuerdo con la optimización de la eficiencia de la clonación ET. En este caso, el gen de la recombinasa específica de sitio puede estar o bien integrado en el genoma huésped o bien transportando en un episoma. En otro caso preferido, la recombinasa específica de sitio se expresa a partir de un episoma que lleva un origen de replicación condicional de tal manera que el mismo puede ser eliminado de la célula huésped.
En otro caso preferido, se combinan al menos dos de los tres métodos de selección anteriores. Un caso particularmente preferido implica un uso en dos pasos del primer método de selección anterior, seguido por el uso del segundo método de selección. Este uso combinado requiere, del modo más sencillo, que el fragmento de DNA a clonar incluya un gen, o genes que permita(n) la identificación, en el primer paso, de los productos de la clonación ET correctos por la adquisición de un cambio fenotípico. En un segundo paso, la expresión del gen o genes introducido(s) en el primer paso se altera de tal manera que puede identificarse una segunda tanda de productos de clonación ET. En un ejemplo preferido, el gen empleado es el gen de resistencia a la tetraciclina y los productos del primer paso de clonación ET se identifican por la adquisición de resistencia a la tetraciclina. En el segundo paso, se identifica la pérdida de la expresión del gen de tetraciclina por pérdida de la sensibilidad al cloruro de níquel, al ácido fusárico o a cualquier otro agente que sea tóxico para la célula huésped cuando se expresa el gen de tetraciclina. Este procedimiento de dos pasos permite la identificación de los productos de la clonación ET, en primer lugar por la integración de un gen que transmite un cambio fenotípico al huésped, y en segundo lugar por la pérdida de un cambio fenotípico afín, de modo muy simple por eliminación de algunas de las secuencias de DNA integradas en el primer paso. Con ello, los genes utilizados para identificar los productos de la clonación ET pueden insertarse y eliminarse luego para dejar productos de clonación ET que están exentos de estos genes.
Una materia adicional objeto de la invención es el uso de células procariotas capaces de expresar los genes recE y recT como una célula huésped para un método de clonación que implica recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET, en el cual una primera molécula circular de DNA se recombina con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en el cual la segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
Otra materia adicional objeto de la invención es el uso de un sistema vector capaz de expresar los genes recE y recT en una célula huésped procariota para un método de clonación que implica recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET, en el cual una primera molécula circular de DNA se recombina con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en el cual la segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior. Preferiblemente, el sistema vector es capaz también de expresar un gen inhibidor de exonucleasa como se define anteriormente, v.g. el gen rec\gamma de \lambda. El sistema vector puede comprender al menos un vector. Los genes recE y recT, o red\alpha y red\beta, están localizados preferiblemente en un solo vector y más preferiblemente bajo control de un promotor regulable que puede ser el mismo para ambos genes o un promotor individual para cada gen. Es especialmente preferido un sistema vector que es capaz de sobreexpresar el gen recT o red\beta, en comparación con el gen recE o red\alpha.
Otra materia adicional objeto de la invención es un estuche de reactivos para clonación que comprende un estuche de reactivos para clonación que comprende
(a)
una célula huésped procariota capaz de realizar una recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET,
(b)
medios de expresión de los genes recE y recT en dicha célula huésped que comprenden un sistema vector capaz de expresar los genes recE y recT, y
(c)
un vehículo de clonación receptor capaz de replicarse en dicha célula, en el cual dicho vehículo de clonación receptor es una primera molécula circular de DNA, que es capaz de recombinación con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA.
Por una parte, el vehículo de clonación receptor que corresponde a la primera molécula de DNA del proceso de la invención puede estar presente ya en la célula bacteriana. Por otra parte, el mismo puede estar presente separado de la célula bacteriana.
El estuche de reactivos contiene adicionalmente, de manera preferible, medios para expresar una recombinasa específica de sitio en dicha célula huésped, en particular cuando el producto de la clonación ET receptor contiene al menos un sitio diana de recombinasa específica de sitio. Además, el estuche de reactivos puede contener también moléculas de DNA adecuadas para utilización como fuente de fragmentos de DNA lineales utilizados para la clonación ET, preferiblemente por servir como plantillas para la generación del fragmento lineal por PCR, y también como vectores de DNA diseñados específicamente a partir de los cuales se libera el fragmento lineal de DNA por escisión mediante enzimas de restricción, o como fragmentos lineales preparados incluidos en el estuche para uso como controles positivos y otras misiones. Además, el estuche de reactivos puede contener también iniciadores de la multiplicación de ácidos nucleicos que comprenden una región de homología para dicho vector. Preferiblemente, esta región de homología está localizada en el extremo 5' del iniciador de la multiplicación de ácidos nucleicos.
La invención se ilustra adicionalmente por los listados de secuencia, figuras y ejemplos siguientes.
SEQ ID No. 1:
muestra la secuencia de ácido nucleico del plásmido pBAD24-recET (Fig. 7).
SEQ ID Núms. 2/3:
muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen recE truncado (t-recE) presente en pBAD24-recET en las posiciones 1320-2162.
SEQ ID Núms. 4/5:
muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen recT presente en pBAD24-recET en las posiciones 2155-2972.
SEQ ID Núms. 6/7:
muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen araC presente en la cadena complementaria a la representada de pBAD24-recET en las posiciones 974-996.
SEQ ID Núms. 8/9:
muestras las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen bla presente en pBAD24-recET en las posiciones 3493-4353.
SEQ ID No. 10:
muestra la secuencia de ácido nucleico del plásmido pBAD-ET\gamma (Fig. 13).
SEQ ID No. 11:
muestra la secuencia de ácido nucleico del plásmido pBAD-\alpha\beta\gamma (Fig. 14) así como las regiones codificantes para los genes red\alpha (1320-200), red\beta (2086-2871) y red\gamma (3403-3819).
SEQ ID Núms. 12-14:
muestra las secuencias de aminoácidos de las proteínas Red\alpha, Red\beta y Red\gamma, respectivamente. La secuencia red\gamma está presente en cada uno de pBAD-ET\gamma (Fig. 13) y pBAD-\alpha\beta\gamma (Fig. 14)
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Figura 1
Se muestra en diagrama un método preferido para la clonación ET. El fragmento de DNA lineal a clonar se sintetiza por PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos que contienen una rama de homología izquierda seleccionada para adaptar las secuencias en el episoma receptor y una secuencia para la iniciación de la reacción PCR, y una rama de homología derecha seleccionada para adaptar otra secuencia en el episoma receptor y una secuencia para la iniciación de la reacción PCR. El producto de la reacción PCR, en este caso un gen marcador seleccionable (sm1), está flanqueado consiguientemente por las ramas de homología izquierda y derecha y puede mezclarse in vitro con el episoma antes de la co-transformación, o transformarse en una célula huésped que aloja el episoma diana. La célula huésped contiene los productos de los genes recE y recT. Los productos de la clonación ET se identifican por la combinación de dos marcadores seleccionables, sm1 y sm2 en el episoma receptor.
Figura 2
Se representan tres vías para identificar los productos de la clonación ET. La primera (en la parte izquierda de la figura), muestra la adquisición, por clonación ET, de un gen que transmite una diferencia fenotípica al huésped, en este caso un gen marcador seleccionable (sm). La segunda (en el centro de la figura) muestra la pérdida, por clonación ET, de un gen que transmite una diferencia fenotípica al huésped, en este caso un gen marcador contra-seleccionable (contra-sm). La tercera muestra la pérdida de un sitio diana (RT, mostrado como triángulos en el episoma circular) para una recombinasa específica de sitio (SSR), por clonación ET. En este caso, el producto de clonación ET correcto deleciona uno de los sitios diana requeridos por la SSR para delecionar un gen marcador seleccionable (sm). El fracaso de la SSR para delecionar el gen sm identifica el producto de clonación ET correcto.
Figura 3 Se presenta un ejemplo simple de clonación ET
(a) Panel superior - Productos PCR (pista izquierda) sintetizados a partir de oligonucleótidos diseñados como se describe en Fig. 1 para multiplicar por PCR un gen de resistencia a la kanamicina y que están flanqueados por ramas de homología presentes en el vector receptor, se mezclaron in vitro con el vector receptor (segunda pista) y se cotransformaron en un huésped E. coli recET+. El vector receptor llevaba un gen de resistencia a la ampicilina. (b) La transformación de la cepa JC9604 sbcA de E. coli con el producto de PCR solo (0,2 \mug) o el vector solo (0,3 \mug) no transmitía la resistencia a la selección doble con ampicilina y kanamicina (amp + kan); en cambio, la cotransformación conjunta del producto PCR y el vector producía colonias de resistencia doble. Más del 95% de estas colonias contenían el producto de clonación ET correcto en el cual el gen de kanamicina se había integrado de manera precisa en el vector receptor de acuerdo con la elección de las ramas de homología. Las dos pistas de la parte derecha de (a) muestran la digestión por la enzima de restricción Pvu II del vector receptor antes y después de la clonación ET. (c) Como en el caso de b, excepto que se cotransformaron seis productos PCR (0,2 \mug de cada uno) con pSVpaZ11 (0,3 \mug de cada uno) en JC9604 y se cultivaron sobre placas Amp + Kan o placas Amp. Los resultados se muestran gráficamente como colonias resistentes a Amp + Kan, que representan productos de recombinación, divididas por las colonias resistentes a Amp, que representan la eficiencia de transformación de plásmidos de la preparación de células competentes, x 10^{6}. Los productos PCR eran equivalentes al producto PCR a-b, excepto que se variaron las longitudes de las ramas de homología. Los resultados corresponden a cinco experimentos que utilizaron los mismos lotes de células competentes y DNAs. Las barras de error representan la desviación estándar. (d) Ocho productos flanqueados por ramas de homología de 50 pb se cotransformaron con pSVpaZ11 en JC9604. La totalidad de los ocho productos PCR contenían la misma rama de homología izquierda y el gen neo multiplicado. Las ramas de homología de la derecha se seleccionaron a partir de la secuencia pSVpaZ11 que era adyacente a (0), o a distancias crecientes (7-3100 pb), a partir de la izquierda. Los resultados corresponden a cuatro experimentos.
Figura 4 Clonación ET en un vector P1 de aproximadamente 100 kb para intercambiar el marcador seleccionable
Se utilizó un clon P1 que utiliza un gen de resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable y que contiene al menos 70 kb de la agrupación de genes de ratón Hox a. Antes de la clonación ET, este episoma transmite la resistencia a la kanamicina (panel superior, parte superior izquierda) a su E. coli huésped que son sensibles a la ampicilina (panel superior, parte superior derecha). Se obtuvo un fragmento lineal de DNA diseñado para reemplazar el gen de resistencia a la kanamicina con un gen de resistencia a la ampicilina por PCR como se reseña en la Fig. 1 y se transformó en células huésped E. coli en las cuales era residente el vector receptor Hox a/P1. La clonación ET dio como resultado la deleción del gen de resistencia a la kanamicina, y la restauración de la sensibilidad a la kanamicina (panel superior, parte inferior izquierda) y la adquisición de la resistencia a la ampicilina (panel superior, parte inferior derecha). La recombinación de DNA precisa se comprobó por digestión mediante restricción y análisis de transferencia Southern del DNA aislado antes y después de la clonación ET (panel inferior).
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Figura 5 Clonación ET para eliminar un marcador contra-seleccionable
Un fragmento PCR (panel superior, parte izquierda, pista tercera) obtenido como se reseña en Figs. 1 y 2 para contener el gen de resistencia a la kanamicina se dirigió por sus ramas de homología seleccionadas para delecionar el gen contra-seleccionable ccdB presente en el vector, pZero-2.1. El producto PCR y el vector pZero se mezclaron in vitro (panel superior, parte izquierda, primera pista) antes de la cotransformación en un huésped E.coli recE/recT+. La transformación de pZero-2.1 solo y el cultivo en placa sobre un medio de selección de kanamicina dio como resultado un crecimiento de colonias pequeño (panel inferior, parte izquierda). La cotransformación de pZero-2.1 y el producto PCR presentó productos de la clonación ET (panel inferior, parte derecha) que mostraban el suceso molecular deseado como se visualizó por digestión con Pvu II (panel superior, parte derecha).
Figura 6 Clonación ET mediada por la expresión inducible de recE y recT a partir de un episoma
RecE/RecT median la recombinación homóloga entre moléculas de DNA lineales y circulares. (a) El plásmido pBAD24-recET se transformó en E. coli JC5547, y después de ello se prepararon lotes de células competentes después de inducción de la expresión RecE/RecT por adición de L-arabinosa el número de veces indicado antes de la cosecha. Un producto PCR, obtenido utilizando los oligonucleótidos e y f para contener el gen de resistencia al cloranfenicol (cm) de pMAK705 y ramas de homología de 50 pb seleccionadas para flanquear el gen de resistencia a la ampicilina (bla) de pBAD24-recET, se transformó luego y se identificaron los recombinantes en placas de cloranfenicol. (b) Se añadió arabinosa a cultivos de JC5547 transformado con pBAD24-recET diferentes veces inmediatamente antes de la cosecha para la preparación de células competentes. La expresión total de proteínas se analizó por SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie. (c) El número de colonias resistentes al cloranfenicol por \mug de producto PCR se normalizó contra un control para eficiencia de transformación, determinada por inclusión de 5 pg de pZero 2.1, que transmite la resistencia a la kanamicina, en la transformación y cultivo de una parte alícuota sobre placas Kan.
Figura 7A
Se muestra en diagrama el plásmido pBAD24-recET. El plásmido contiene los genes recE (en una forma truncada) y recT bajo control del promotor inducible BAD (P_{BAD}). El plásmido contiene además un gen de resistencia a la ampicilina (Amp') y un gen araC.
Figura 7B
Se representa la secuencia de ácido nucleico y las porciones codificantes de proteína de pBAD24-recET.
Figura 8
Manipulación de un episoma grande de E. coli por pasos de recombinación múltiples a Esquema de las reacciones de recombinación. Un clon P1 del complejo Hoxa de Ratón, residente en JC9604, se modificó por recombinación con productos PCR que contenían el gen neo y dos dianas de recombinación Flp (FRTs). Los dos productos PCR eran idénticos excepto que uno estaba flanqueado por ramas de homología g y h (inserción), y el otro estaba flanqueado por ramas de homología i y h (deleción). En un segundo paso, el gen neo se eliminó por recombinación Flp entre los FRTs por transformación transitoria de un plásmido de expresión Flp basado en el origen de pSC101 sensible a la temperatura (ts ori). b Panel superior; gel de agarosa teñido con hidrobromuro de etidio que muestra digestiones con EcoR1 de preparaciones de DNA de P1 a partir de tres colonias independientes para cada paso. Panel central; una transferencia Southern del panel superior hibridada con una sonda del gel neo. Panel inferior; una transferencia Southern del panel superior hibridada con una sonda Hoxa3 para visualizar el sitio de recombinación. Pistas 1, el clon Hoxa3 P1 original cultivado en la cepa NS3145 de E. coli. Pistas 2, reemplazamiento del gen de resistencia a la kanamicina Tn903 residente en el vector P1 con un gen de resistencia a la ampicilina incrementaba la banda de 8,1 kb (pistas 1), hasta 9,0 kb. Pistas 3, la inserción del gen Tn5-neo con ramas de homología g-h aguas arriba de Hoxa3, aumentaba la banda de 6,7 kb (pistas 1, 2) hasta 9,0 kb. Pistas 4, la recombinasa Flp delecionaba el gen neo g-h reduciendo la banda de 9,0 kb (pistas 3) a 6,7 kb. Pistas 5, la deleción de 6 kb del DNA intergénico Hoxa3-4 por reemplazamiento con el gen i-h neo, disminuía la banda de 6,7 kb (pista 2) hasta 4,5 kb. Pista 6: la recombinasa Flp delecionaba el gen neo i-h reduciendo la banda de 4,5 kb a 2,3 kb.
Figura 9
Manipulación del cromosoma de E. coli. a Esquema de las reacciones de recombinación. El gen lacZ endógeno de JC9604 en 7.8' del cromosoma de E. coli, representado en forma expandida con sitios relevantes Ava I y coordenadas, fue bombardeado por un fragmento FR que contenía el gen neo flanqueado por ramas de homología j y k, y sitios loxP, como se representa. La integración del gen neo eliminaba la mayor parte del gen lacZ con inclusión de un sitio Ava I para alterar las bandas de 1443 y 3027 pb a una banda de 3277 pb. En un segundo paso, el gen neo se eliminó por recombinación Cre entre los loxPs por transformación transitoria de un plásmido de expresión Cre basado en el origen sensible a la temperatura de pSC101 (ts ori). La eliminación del gen neo por la recombinasa Cre reduce la banda de 3277 a 2111 pb. b Expresión de \beta-galactosidasa evaluada por aplicación en estrías de colonias sobre placas X-Gal. La fila superior de tres estrías muestra la expresión de \beta-galactosidasa en la cepa huésped JC9604 (w.t.), las tres filas inferiores (Km) muestran 24 colonias primarias independientes, 20 de las cuales exhiben una pérdida de expresión de \beta-galactosidasa indicativa del suceso de recombinación deseado. c Análisis Southern del DNA cromosómico de E. coli digerido con AvaI utilizando una sonda aleatoria cebada obtenida a partir de la región codificante lacZ entera; pistas 1, 2, w.t.; pistas 3-6, cuatro colonias blancas independientes después de integración del gen j-k neo; pistas 7-10, las mismas cuatro colonias después de transformación transitoria con el plásmido de expresión Cre.
Figura 10
Dos tandas de clonación ET para introducir una mutación puntual a Esquema de las reacciones de recombinación. El gen lacZ de pSVpaX1 se interrumpió en JC9604 lacZ, una cepa preparada por el experimento de Fig. 9 para suprimir la expresión endógena de lacZ y eliminar las secuencias competitivas, por una casete del gen sacB-neo, sintetizada por PCR hasta pIB279 y flanqueada por las ramas de homología l y m. Los recombinantes, denominados pSV-sacB-neo, se seleccionaron sobre placas Amp+Kan. El gen lacZ de pSV-sacB-neo se reparó luego por un fragmento PCR obtenido a partir del gen lacZ intacto utilizando ramas de homología l\cdot y m\cdot. La rama de homología m\cdot incluía un cambio silencioso de C a G que creaba un sitio BamHI. Los recombinantes, denominados pSVpaX1\cdot, se identificaron por contra-selección contra el gen sacB utilizando sacarosa al 7%. b La expresión de \beta-galactosidasa a partir de pSVpaX1 se interrumpió en pSV-sacB-neo y se restauró en pSVpaX1\cdot. La expresión se analizó sobre placas X-gal. Se muestran tres colonias independientes de cada uno de pSV-sacB-neo y pSVpaX1\cdot. c Geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio de DNA digerido con BamHI preparado a partir de colonias independientes recogidas después de contra-selección con sacarosa. Todas las colonias que expresaban \beta-galactosidasa (azules) contenían el sitio de restricción BamHI introducido (panel superior). Todas las colonias blancas presentaban grandes transposiciones y ningún producto transportaba el fragmento de restricción de diagnóstico de 1.5 kb BamHI (panel inferior).
Figura 11
Transferencia de la clonación ET a un huésped recBC+ para modificar un episoma grande a Esquema del plásmido, pBAD-ET\gamma, que transporta el sistema ET móvil, y la estrategia empleada para bombardeo del episoma Hoxa P1. pBAD-ET\gamma está basado en pABD24 e incluye (i) el gen recE truncado (t-recE) bajo el promotor P_{BAD} inducible por arabinosa; (ii) el gen recT bajo el promotor EM7; y (iii) el gen red\gamma bajo el promotor Tn5. Se transformó en NS3145, una cepa de E. coli recA que contenía el episoma Hoxa P1. Después de la inducción por arabinosa, se prepararon células competentes y se transformaron con un producto PCR que llevaba el gen de resistencia al cloranfenicol (cm) flanqueado por ramas de homología n y p. Se seleccionaron n y p de modo que se recombinaran con un segmento del vector P1. b Transferencias Southern de DNAs digeridos con Pvu II hibridados con una sonda obtenida a partir del vector P1 para visualizar el sitio diana de la recombinación (panel superior) y una sonda obtenida a partir del gen de resistencia al cloranfenicol (panel inferior). Pista 1, DNA preparado a partir de células que alojaban el episoma Hoxa P1 antes de la clonación en T. Pistas 2-17, DNA preparado a partir de 16 colonias independientes resistentes al cloranfenicol.
Figura 12 Comparación de la clonación ET utilizando los genes recE/recT en pBAD-ET\gamma con genes red\alpha/red\beta en pBAD-\alpha\beta\gamma
Los plásmidos pBAD-ET\gamma o pBAD\alpha\beta\gamma, representados, se transformaron en la cepa de E. coli recA-, recBC+, DK1 y fueron bombardeados por un gen de resistencia al cloranfenicol con se describe en Fig. 6 para evaluar las eficiencias de la clonación ET. La inducción por arabinosa de la expresión de proteína tuvo una duración de 1 hora.
Figura 13A
Se muestra en diagrama el plásmido pBAD-ET\gamma.
Figura 13B
Se representan la secuencia de ácido nucleico y las porciones codificantes de proteína de pBAD-ET\gamma.
Figura 14A
Se muestra en diagrama el plásmido pBAD-\alpha\beta\gamma. Este plásmido corresponde sustancialmente al plásmido que se muestra en Fig. 13 excepto que los genes recE y recT están sustituidos por los genes red\alpha y red\beta.
Figura 14B
Se representan la secuencia de ácido nucleico y las porciones codificantes de proteína de pBAD-\alpha\beta\gamma.
1. Métodos 1.1. Preparación de fragmentos lineales
Se utilizaron condiciones de reacción PCR estándar para multiplicar fragmentos lineales de DNA. Las secuencias de los iniciadores utilizados se representan en la Tabla 1.
Tabla 1
El gen Tn5-neo de pJP5603 (Penfold y Pemberton, Gene 118 (1992), 145-146) se multiplicó por utilización de pares de oligonucleótidos a/b y c/d. El gen resistente al cloranfenicol (cm) de pMAK705 (Hashimoto-Gotoh y Sekiguchi, J. Bacteriol. 131 (1977), 405-412) se multiplicó por utilización de los pares de iniciadores e/f y n/p. El gen Tn5-neo flanqueado por sitios FRT o loxP se multiplicó a partir de pKaZ o pKaX (http://www.embl-heidel-berg.de/ExternalInfo/stewart) utilizando los pares de oligonucleótidos i/h, g/h y j/k. La casete sacB-neo procedente de pIP279 (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5 (1991), 1447-1457) se multiplicó por utilización del par de oligonucleótidos l/m). El fragmento del gen lacZ procedente de pSVpaZ11 (Buchholz et al., Nucleic Acids Res. 24 (1996), 4256-4262) se multiplicó utilizando el par de oligonucleótidos l\cdot/m\cdot. Los productos PCR se purificaron utilizando el Estuche de Purificación QIAGEN PCR y se eluyeron con H_{2}O_{2}, seguido por digestión de cualquier plantilla de DNA residual con DpnI. Después de la digestión, los productos de la PCR se extrajeron una sola vez con fenol:CHCl_{3}, se precipitaron con etanol y se suspendieron de nuevo en H_{2}O a aproximadamente 0,5 \mug/\mul.
1.2 Preparación de células competentes y electroporación
Cultivos saturados de una sola noche se diluyeron 50 veces en medio LB, y se dejaron crecer hasta un valor DO600 de 0,5, seguido por enfriamiento en hielo durante 15 minutos. Las células bacterianas se centrifugaron a 7000 rpm durante 10 min a 0ºC. El sedimento se resuspendió en glicerol al 10% enfriado en hielo y se centrifugó de nuevo (7000 rpm, -5ºC, 10 min). Esto se repitió dos veces más y el sedimento de células se suspendió en un volumen igual de glicerol al 10% enfriado en hielo. Partes alícuotas de 50 \mul se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -80ºC. Las células se descongelaron en hielo y se añadió 1 \mul de solución de DNA (que contenía, para la co-transformación, 0,3 \mug de plásmido y 0,2 \mug de productos PCR; o bien, para la transformación, 0,2 \mug de productos PCR). La electroporación se realizó utilizó cubetas enfriadas en hielo y un equipo Bio-Rad Gene Pulser ajustado a 25 \muFD, 2,3 kV con el Controlador de Impulsos ajustado a 200 ohms. Se añadió medio LB (1 ml) después de la electroporación. Las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora con sacudidas y se extendieron luego sobre placas de antibióticos.
1.3 Inducción de la expresión de RecE y RecT
E. coli JC5547 que llevaba pBAD24-recET se cultivó durante una noche en medio LB más 0,2% de glucosa, y 100 \mug/ml de ampicilina. Se iniciaron cinco cultivos LB paralelos, uno de los cuales (0) incluía 0,2% de glucosa, por una inoculación 1/100. Los cultivos se incubaron a 37ºC con sacudidas durante 4 horas y se añadió 0,1% de L-arabinosa 3, 2, 1 ó 1/2 horas antes de la cosecha y el procesamiento como anteriormente. Inmediatamente antes de la cosecha, se apartaron 100 \mul para análisis sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 10%. E. coli NS3145 que llevaba Hoxa-P1 y pBAD-ET\gamma se indujo con L-arabinosa al 0,1% durante 90 min antes de la cosecha.
1.4 Transformación transitoria de los plásmidos de expresión FLP y Cre
Los plásmidos de expresión FLP y Cre, 705-Cr y 705-FLP (Buchholz et al, Nucleic Acids Res. 24 (1996), 3318-3319), basados en el origen de pSC101 sensible a la temperatura, se transformaron en células bacterianas competentes con cloruro de rubidio. Las células se extendieron sobre placas con 25 \mug/ml de cloranfenicol, y se dejaron crecer durante 2 días a 30ºC, después de lo cual se seleccionaron las colonias, se extendieron nuevamente en placas de L-agar sin antibiótico alguno y se incubaron a 40ºC durante una noche. Se analizaron colonias simples sobre diversas placas de antibióticos y todas ellas mostraban la pérdida esperada de la resistencia al cloranfenicol y la kanamicina.
1.5 Contra-selección con sacarosa de la expresión de sacB
La cepa de E. coli JC9604 lacZ, generada como se describe en Fig. 11, se cotransformó con un fragmento PCR de sacB-neo y pSVpaX1 (Buchhold et al., Nucleic Acids Res. 24 (1996), 4256-4262). Después de selección sobre placas con 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de kanamicina, se aislaron plásmidos pSVpaX-sacB-neo y se cotransformaron en células JC9604lacZ nuevas con un fragmento PCR multiplicado a partir de pSVpaX1 utilizando los iniciadores l\cdot/m\cdot. El oligo m\cdot llevaba una mutación puntual silenciosa que generaba un sitio BamHI. Las células se cultivaron en placas con 7% de sacarosa, 100 \mug/ml de ampicilina, y 40 \mug/ml de X-gal y se incubaron a 28ºC durante 2 días. Las colonias azules y blancas que crecieron en las placas de sacarosa se contaron y se comprobaron ulteriormente por análisis de restricción.
1.6 Otros métodos
Se realizaron la preparación de DNA y el análisis Southern de acuerdo con procedimientos estándar. Se generaron sondas de hibridación por cebado aleatorio de fragmentos aislados a partir del gen Tn5 neo (PvuII), el gen Hoxa3 (ambos fragmentos HindIII), los genes lacZ (fragmentos EcoRI y BamHI procedentes de pSVpaX1), el gen cm (fragmentos BstBI procedentes de pMAK705) y fragmentos del vector P1 (fragmentos EcoRI de 2,2 kb, procedentes del vector P1).
2. Resultados 2.1 Identificación de sucesos de recombinación en E. coli
Para identificar una reacción de recombinación homóloga flexible en E. coli, se diseñó un ensayo basado en la recombinación entre DNAs lineales y circulares (Fig. 1, Fig. 3). Se preparó por PCR un DNA lineal que llevaba el gen Tn5 de resistencia a la kanamicina (neo) (Fig. 3a). Inicialmente, los oligonucleótidos utilizados para la multiplicación por PCR de neo eran 60-meros constituidos por 42 nucleótidos en sus extremos 5' idénticos a regiones seleccionadas en el plásmido y, en los extremos 3', 18 nucleótidos para servir como iniciadores de la PCR. Se mezclaron DNAs lineales y circulares en proporciones equimolares y se co-transformaron en una diversidad de huéspedes E. coli. La recombinación homóloga se detectó únicamente en los huéspedes de E. coli sbcA. Más del 95% de las colonias de doble resistencia a ampicilina/kanamicina (Fig. 3b) contenían el plásmido esperado recombinado homólogamente como se determinó por digestión con restricción y secuenciación. Únicamente se apreciaba un ruido de fondo bajo de resistencia a la kanamicina, debido a la integración genómica del gen neo (no representado).
La reacción de recombinación lineal más circular se caracterizó de dos maneras. La relación entre la longitud de las ramas de homología y la eficiencia de recombinación era simple, recombinándose más eficientemente las ramas más largas (Fig. 3c). La eficiencia aumentaba con la gama ensayada, hasta 60 pb. Se examinó el efecto de la distancia entre los dos sitios de homología seleccionados en el plásmido receptor (Fig. 3d). Se generó una serie de ocho fragmentos PCR por el uso de una rama izquierda constante de homología con ramas de homología derecha diferentes. Las ramas de homología derecha se seleccionaron a partir de la secuencia del plásmido que eran 0-3100 pb desde la izquierda. Se obtuvieron fácilmente productos correctos de todas ellas, con una diferencia menor que 4 veces entre los mismos, aunque el producto de inserción (0) era menos eficiente. Los productos correctos dependían también de la presencia de ambas ramas de homología, dado que los fragmentos PCR que contenían solamente una rama no eran activos.
2.2 Implicación de RecE y RecT
La relación entre el genotipo del huésped y esta reacción de recombinación homóloga se examinó más sistemáticamente utilizando un panel de cepas de E. coli deficientes en diversos componentes de recombinación (Tabla 2).
Tabla 2
Únicamente las dos cepas sbcA, JC8679 y JC9604 presentaban los productos de recombinación deseados, y no se requería RecA. En las cepas sbcA, la expresión de RecE y RecT está activada. La dependencia de recE puede deducirse de la comparación de JC8679 con JC8691. Es notable que no se observó producto de recombinación alguno en JC9387, lo que sugiere que el ruido de fondo de sbcBC no es capaz de soportar la recombinación homóloga basada en ramas de homología de 50 nucleótidos.
Para demostrar que RecE y RecT están implicados, parte del operón recET se clonó a un vector de expresión inducible para crear pBAD24-recET (Fig. 6a). El gen recE se truncó en su extremo N-terminal, dado que los primeros 588 aminoácidos de RecE son prescindibles. La cepa recBC, JC5547, se transformó con pBAD24-recET y se realizó una inducción a lo largo del tiempo de RecE/RecT por adición de arabinosa a los medios de cultivo en diversos momentos antes de la cosecha de células competentes. Los lotes de células competentes cosechados se evaluaron respecto a la expresión de proteínas por electroforesis en gel (Fig. 6b) y respecto a la recombinación entre un fragmento de DNA lineal y el plásmido pBAD24-recET endógeno (Fig. 6c). Sin inducción de RecE/RecT, no se encontró producto recombinante alguno, mientras que la recombinación aumentaba en concordancia aproximada con la expresión incrementada de RecE/RecT. Este experimento muestra también que la co-transformación de DNAs lineales y circulares no es esencial y que el receptor circular puede ser endógeno en el huésped. A partir de los resultados que se muestran en las Figs. 3 y 6 y en la Tabla 2, se llega a la conclusión de que RecE y RecT median una reacción de recombinación homóloga muy útil en recBC E. coli a las frecuencias prácticas. Dado que están implicados RecE y RecT, se hace referencia a este modo de recombinación de fragmentos lineales y circulares de DNA como "clonación ET".
2.3 Aplicación de la clonación ET a DNAs diana grandes
Para demostrar que podrían manipularse grandes episomas de DNA en E. coli, un clon P1 mayor que 76 kb que contiene al menos 59 kb del complejo intacto Hoxa de ratón (confirmado por secuenciación de DNA y transferencia Southern), se transfirió a una cepa de E. coli que tenía un ruido de fondo de sbcA (JC9604) y se sometió a dos tandas de clonación ET. En la primera tanda, el gen de resistencia a la kanamicina Tn903 residente el vector P1 se reemplazó por un gen de resistencia a la ampicilina (Fig. 4). En la segunda tanda, se direccionó el intervalo entre los genes Hoxa3 y a4 por inserción del gen neo entre dos pares de bases aguas arriba del promotor proximal Hoxa3, o por deleción de 6203 pb entre los genes Hoxa3 y a4 (Fig. 8a). Ambos productos de clonación ET por inserción y por deleción se obtuvieron fácilmente (Fig. 8b, pistas 2, 3 y 5), lo que demostraba que las dos tandas de clonación ET tenían lugar en este gran episoma de E. coli con precisión y sin recombinación indeseada aparente.
La aplicabilidad general de la clonación ET se examinó ulteriormente por direccionamiento de un gen en el cromosoma de E. coli (Fig. 9a). Se seleccionó el gen de \beta-galactosidasa (lacZ) de JC9604 a fin de que la relación entre los recombinantes correctos e incorrectos pudiera determinarse por evaluación de la expresión de \beta-galactosidasa. Las condiciones estándar (0,2 \mug de fragmento PCR; 50 \mul ce células competentes), produjeron 24 colonias primarias, 20 de las cuales eran correctas como se determinó por expresión de \beta-galactosidasa (Fig. 9b), y análisis de DNA (Fig. 9c, pistas 3-6).
2.4 Reacciones de recombinación secundaria para eliminar las secuencias operativas
Los productos de la clonación ET como se ha descrito anteriormente están limitados por la inclusión necesaria de genes marcadores seleccionables. Se desarrollaron dos vías diferentes de utilización de un paso de recombinación adicional a fin de eliminar esta limitación. En la primera vía se empleó la recombinación específica de sitio mediada por la recombinasa Flp o Cre. En los experimentos de las Figs. 8 y 9 se incluyeron sitios diana de recombinación Flp (FRTs) o sitios diana de recombinación Cre (loxPs) para flanquear el gen neo en los sustratos lineales. La recombinación entre los FRTs o loxPs se realizó por Flp o Cre, respectivamente, expresados a partir de plásmidos con el origen de replicación de pSC101 sensible a la temperatura (Hashimoto-Gotoh y Sekiguchi J. Bacteriol. 131 (1977), 405-412) para permitir la eliminación simple de estos plásmidos después de la recombinación específica de sitio por desplazamiento de temperatura. El vector HoxaP1 recombinado con precisión se recuperó después de ambas recombinaciones ET y Flp sin ningún otro producto de recombinación aparente (Fig. 8, pistas 4 y 6). Análogamente, la recombinasa Cre recombinaba con precisión el alelo lacZ diana (Fig. 9, pistas 7-10). Así pues, la recombinación específica de sitio puede acoplarse fácilmente con la clonación ET para eliminar secuencias operativas y dejar un sitio diana de recombinación específica de sitio de 34 pb en el punto de la manipulación del DNA.
En la segunda vía para eliminar el gen marcador seleccionable, se utilizaron dos tandas de clonación ET, que combinaban pasos de selección positiva y de contra-selección, para dejar el producto de DNA exento de cualesquiera secuencias operativas (Fig. 10a).
Adicionalmente, este experimento se diseñó para evaluar, por un ensayo funcional basado en la actividad de \beta-galactosidasa, si la clonación ET promovía pequeñas mutaciones tales como mutaciones de desplazamiento de marco o mutaciones puntuales dentro de la región que se manipulaba. En la primera tanda, el gen lacZ de pSVpaX1 se interrumpió con un fragmento PCR de 3,3 kb que llevaba el gen neo y el gen sacB de B. subtilis (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5 (1991), 1447-1457), por selección en cuanto a resistencia a la kanamicina (Fig. 10a). Como se ha mostrado anteriormente para otros productos de recombinación seleccionados positivamente, virtualmente todas las colonias seleccionadas eran blancas (Fig. 10b), lo que indicaba la interrupción con éxito de lacZ, y 17 de 17 se confirmaron como recombinantes correctos por análisis de DNA. En la segunda tanda, se introdujo un fragmento PCR de 1,5 kb diseñado para reparar lacZ por contra-selección contra el gen sacB. La reparación de lacZ incluía una mutación puntual silenciosa para crear un sitio de restricción BamHI. Aproximadamente una cuarta parte de las colonias resistentes a la sacarosa expresaban \beta-galactosidasa, y todas las analizadas (17 de 17; Fig. 10c) llevaban el gen lacZ reparado con la mutación puntual BamHI. Las tres cuartas partes restantes de las colonias resistentes a la sacarosa no expresaban \beta-galactosidasa, y todas las analizadas (17 de 17; Fig. 10c) habían sufrido una diversidad de sucesos de mutación grandes, ninguno de los cuales se asemejaba al producto de la clonación ET. Así pues, en dos tandas de clonación ET dirigidas al gen lacZ, no se observó alteración alguna de la actividad de \beta-galactosidasa por las mutaciones pequeñas, lo que indicaba que la recombinación RecE/RecT actúa con alta fidelidad. La presencia significativa de productos incorrectos observada en el paso de contra-selección es una limitación inherente del uso de la contra-selección, dado que será seleccionada cualquier mutación que anule la expresión del gen de contra-selección. Es notable que todos los productos incorrectos eran mutaciones grandes y por consiguiente se distinguían fácilmente del producto ET correcto por análisis de DNA. En un experimento diferente (Fig. 5), se observó que la clonación ET en pZero2.1 (InVitroGen) por contra-selección contra el gen ccdB daba un ruido de fondo de productos incorrectos menor (8%), lo que indicaba que el ruido de fondo de la contra-selección es variable de acuerdo con parámetros que difieren de aquéllos que influyen en las eficiencias de la clonación ET.
2.5 Transferencia de la clonación ET entre huéspedes E. coli
Los experimentos mostrados anteriormente se realizaron en huéspedes E. coli recBC- dado que la mutación sbcA se había identificado como un supresor de recBC (Barbour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67 (1970), 128-135; Clark, Genetics 78 (1974), 259-271). Sin embargo, muchas cepas E. coli útiles son recBC+, incluyendo las cepas utilizadas comúnmente para propagación de los episomas P1, BAC o PAC. Para transferir la clonación ET a cepas recBC+, los autores de la invención desarrollaron pBAD-ET\gamma y pBAD-\alpha\beta\gamma (Figs. 13 y 14). Estos plásmidos incorporan tres características importantes para la movilidad de la clonación ET. En primer lugar, RecBC es la exonucleasa principal de E. coli y degrada los fragmentos lineales introducidos. Por esta razón, se incluyó el inhibidor RecBC, Red\gamma (Murphy, J. Bacteriol. 173 (1991), 5808-5821). En segundo lugar, se reguló el potencial recombinogénico de RecE/RecT, o Red\alpha/Red\beta, poniendo recE o red\alpha bajo un promotor inducible. Por consiguiente, la clonación ET puede inducirse en sucesos de recombinación requeridos y no deseados que están restringidos en otras ocasiones. En tercer lugar, se observó que las eficiencias de la clonación ET se mejoran cuando se sobreexpresa RecT, o Red\beta, pero no RecE, o Red\alpha. Por esta razón, los autores de la invención pusieron recT, o red\beta, bajo el promotor constitutivo fuerte EM7.
Se transformó pBAD-ET\gamma en E. coli NS3145 que alojaba el episoma P1 original Hoxa (Fig. 11a). Una región en la cadena principal del vector P1 se direccionó por multiplicación PCR del gen de resistencia al cloranfenicol (cm) flanqueado por ramas de homología n y p. Como se ha descrito anteriormente para las reacciones de clonación ET seleccionadas positivamente, la mayoría (más del 90%) de las colonias resistentes al cloranfenicol eran correctas. Notablemente, la eficiencia global de la clonación ET, en términos de DNA lineal transformado, era aproximadamente tres veces mejor utilizando pBAD-ET\gamma que con experimentos similares basados en el direccionamiento del mismo episoma en el huésped sbcA, JC9604. Esto es consistente con la observación de los autores de la invención de que la sobreexpresión de RecT aumenta las eficiencias de la clonación ET.
Se realizó una comparación entre las eficiencias de la clonación ET mediadas por RecE/RecT, expresados a partir de pBAD-ET\gamma, y Red\alpha/Red\beta, expresados a partir de pBAD-\alpha\beta\gamma en la cepa de E. coli recA-, recBC+, DK1 (Fig. 12). Después de la transformación de E. coli DK1 con pBAD-ET\gamma o pBAD-\alpha\beta\gamma, se llevó a cabo el mismo experimento que se ha descrito en la Figura 6a,c, para reemplazar el gen bla del vector pBAD con un gen de cloranfenicol. Tanto pBAD-ET\gamma como pBAD-\alpha\beta\gamma presentaban eficiencias de clonación ET similares en términos de sensibilidad a la inducción por arabinosa de RecE y Red\alpha, y número de sucesos direccionados.
TABLA 2
E. coli
Cepas Genotipos Amp + Kan Amp
X 10^{8}/\mug
JC8679 recBC sbcA 318 2.30
JC9604 recA recBC sbcA 0 0.30
JC8691 recBC sbcA recE 0 0.37
JC5547 recA recBC 0 0.37
JC5519 recBC 0 1.80
JC15329 recA recBC sbcBC 0 0.03
JC9387 recBC sbcBC 0 2.20
JC8111 recBC sbcBC recF 0 2.40
JC9366 recA 0 0.37
JC13031 recJ 0 0.45
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Meyerhofstrasse 1
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Heidelberg
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: DE
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-69117
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo método de clonación de DNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.666000\baselineskip
(EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97121562.2
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-DIC-1997
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 98118756.0
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-OCT-1998
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6150 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: pBAD24-recET
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: complemento (96...974)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "araC"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: complemento (1320...2162)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "t-recE"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: complemento (2155...2972)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "recT"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: complemento (3493..4353)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "bla"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
1
2
3
4 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 843 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: t-recE
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..843
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "t-recE"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
5
6 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 281 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
7 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 810 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: recT
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..810
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "recT"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
8
9 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 270 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
10
11 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 876 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: araC
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: complemento (1...876)
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "araC"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
12
13 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 292 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
14
15 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 861 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: bla
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..861
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "bla"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
16
17 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 287 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
18 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7195 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: pBAD-ETgamma
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3588..4004
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red gamma"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
19
20
21
22 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7010 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: pBAD-alfa-beta-gamma
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1320..2000
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red alfa"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2086..2871
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red beta"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3403..3819
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red gamma"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
23
24
25
26
27
28 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 227 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
29
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 262 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
31
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
33
34
35
350
36
360
37
370

Claims (53)

1. Un método para clonación de moléculas de DNA en células procariotas que comprende los pasos de:
a)
proporcionar una célula huésped procariota capaz de expresar genes recE y recT y capaz de realizar recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET,
b)
poner en contacto en dicha célula huésped una primera molécula de DNA circular que es capaz de replicarse en dicha célula huésped con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda, por la vía de un mecanismo dependiente de RecET y
c)
seleccionar una célula huésped en la cual ha ocurrido la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda,
en el cual una segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual los genes recE y recT se seleccionan de genes recE y recT de E. coli o de genes red\alpha y red\beta de \lambda.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual la célula huésped se transforma con al menos un vector capaz de expresar los genes recE y/o recT.
4. El método de la reivindicación 1, 2, ó 3, en el cual la expresión de los genes recE y/o recT está bajo el control de un promotor regulable.
5. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el cual el gen recT se sobreexpresa con respecto al gen recE.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el cual el gen recE se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 1320 (ATG) a 2159 (GAC) como se representa en Fig. 7B,
(b) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 1320 (ATG) a 1998 (CGA) como se representa en Fig. 13B,
(c) un ácido nucleico que codifica el mismo polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(d) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas con la secuencia de ácido nucleico de (a), (b) y/o (c).
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el cual el gen recT se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 2155 (ATG) a 2961 (GAA) como se representa en Fig. 7B,
(b) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 2086 (ATG) a 2868 (GCA) como se representa en Fig. 13B,
(c) un ácido nucleico que codifica el mismo polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(d) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas con las secuencias de ácido nucleico de (a), (b) y/o (c).
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la célula huésped es una célula bacteriana gram-negativa.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la célula huésped es una célula de Escherichia coli.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual la célula huésped es una cepa K12 de Escherichia coli.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual la cepa de E. coli se selecciona de JC 8679 y JC 9604.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la célula huésped es capaz adicionalmente de expresar un gen inhibidor recBC.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la célula huésped se transforma con un vector que expresa el gen inhibidor recBC.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el cual el gen inhibidor recBC se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la posición 3588 (ATG) a 4002 (GTA) como se representa en Fig. 13B,
(b) un ácido nucleico que codifica el mismo polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(c) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas (como se han definido anteriormente) con la secuencia de ácido nucleico de (a) y/o (b).
15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el cual la célula huésped es una célula procariota recBC+.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el cual se utiliza un sistema vector capaz de expresar los genes recE y recT y el gen inhibidor recBC bajo control de un promotor regulable.
17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la primera molécula de DNA es una molécula de DNA extracromosómico que contiene un origen de replicación que es operativo en la célula huésped.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual la primera molécula de DNA se selecciona de plásmidos, cósmidos, vectores P1, vectores BAC y vectores PAC.
19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el cual la primera molécula de DNA es un cromosoma de la célula huésped.
20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la segunda molécula de DNA es lineal.
21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual las regiones de homología de secuencia tienen al menos 15 nucleótidos cada una.
22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el cual la segunda molécula de DNA se obtiene por una reacción de multiplicación.
23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual las moléculas primera y/o segunda de DNA se introducen en las células huésped por transformación.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual el método de transformación es electroporación.
25. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 24, en el cual las moléculas primera y segunda de DNA se introducen en la célula huésped simultáneamente por co-transformación.
26. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 24, en el cual la segunda molécula de DNA se introduce en una célula huésped en la cual está ya presente la primera molécula de DNA.
27. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el cual la segunda molécula de DNA contiene al menos un gen marcador situado entre las dos regiones de homología de secuencia y en el cual la recombinación homóloga se detecta por expresión de dicho gen marcador.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual el gen marcador se selecciona de genes de resistencia a los antibióticos, genes de complementación de deficiencias y genes informadores.
29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el cual la primera molécula de DNA contiene al menos un gen marcador entre las dos regiones de homología de secuencia y en el cual la recombinación homóloga se detecta por ausencia de expresión de dicho gen marcador.
30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el cual dicho gen marcador se selecciona de genes que, en condiciones seleccionadas, transmiten un efecto tóxico o bacteriostático a la célula, y genes informadores.
31. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la primera molécula de DNA contiene al menos un sitio diana para una recombinasa específica de sitio entre las dos regiones de homología de secuencia y en el cual la recombinación homóloga se detecta por eliminación de dicho sitio diana.
32. El método de la reivindicación 1 para obtener una molécula de DNA recombinante que comprende introducir en una célula huésped procariota una primera molécula circular de DNA que es capaz de replicarse en dicha célula huésped, e introducir una segunda molécula de DNA que comprende una primera y una segunda región de homología de secuencia para una tercera y una cuarta región, respectivamente, en la primera molécula de DNA, siendo capaz dicha célula huésped de realizar la recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de recRT, de tal modo que se obtiene una molécula de DNA recombinante, comprendiendo dicha molécula de DNA recombinante la primera molécula de DNA, en la cual las secuencias comprendidas entre dichas regiones tercera y cuarta se han reemplazado por secuencias comprendidas entre las regiones primera y segunda de la segunda molécula de DNA, en el cual se introduce una segunda molécula de DNA en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende adicionalmente detectar la molécula de DNA recombinante.
34. El método de la reivindicación 1, para obtener una molécula de DNA recombinante que comprende introducir en una célula huésped procariota, que contiene una primera molécula de DNA cromosómico, una segunda molécula de DNA que comprende una primera y una segunda región de homología de secuencia para una tercera y una cuarta región, respectivamente, en la primera molécula de DNA cromosómico del huésped, siendo capaz dicha célula huésped de realizar la recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET, de tal modo que se obtiene una molécula de DNA recombinante, comprendiendo dicha molécula de DNA recombinante la primera molécula de DNA cromosómico, en la cual las secuencias entre dichas regiones tercera y cuarta se han reemplazado por secuencias comprendidas entre las regiones primera y segunda de la segunda molécula de DNA, en el cual se introduce una segunda molécula de DNA en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, que comprende adicionalmente detectar la molécula de DNA recombinante.
36. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 35, en el cual la célula huésped es capaz de expresar las proteínas RecE y RecT o las proteínas \lambdaRed\alpha y \lambdaRed\beta.
37. El uso de células procariotas capaces de expresar los genes recE y recT como una célula huésped para un método de clonación que implica recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET, en el cual una primera molécula circular de DNA se recombina con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en el cual la segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
38. El uso de la reivindicación 37, en el cual la primera molécula circular de DNA es el cromosoma de la célula huésped.
39. El uso de un sistema vector capaz de expresar los genes recE y recT en una célula huésped procariota para un método de clonación que implica recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET, en el cual una primera molécula circular de DNA se recombina con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en el cual la segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped en una forma que permite recombinación sin modificación ulterior.
40. El uso de la reivindicación 39, en el cual la primera molécula circular de DNA es el cromosoma de la célula huésped.
41. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 37-39, en el cual los genes recE y recT se seleccionan de genes recE y recT de E. coli o de genes red\alpha y red\beta de \lambda.
42. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 39-41, en el cual el sistema vector es capaz adicionalmente de expresar un gen inhibidor recBC.
43. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 39-42, en el cual la expresión se encuentra bajo control de un promotor regulable.
44. Un estuche de reactivos para clonación que comprende
(a) una célula huésped procariota capaz de realizar una recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET,
(b) medios de expresión de los genes recE y recT en dicha célula huésped que comprenden un sistema vector capaz de expresar los genes recE y recT, y
(c) un vehículo de clonación receptor capaz de replicarse en dicha célula, en el cual dicho vehículo de clonación receptor es una primera molécula circular de DNA, que es capaz de recombinación con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA.
\newpage
45. El estuche de reactivos de acuerdo con la reivindicación 44, en el cual los genes recE y recT se seleccionan de genes recE y recT de E. coli o de genes red\alpha y red\beta de \lambda.
46. El estuche de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 44-45, que comprende adicionalmente medios para expresar una recombinasa específica de sitio en dicha célula huésped.
47. El estuche de reactivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 44-46 que comprende adicionalmente iniciadores de multiplicación de ácido nucleico que comprenden una región de homología para dicho vehículo de clonación receptor.
48. El estuche de reactivos para clonación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 44-47, que comprende adicionalmente iniciadores primero y segundo de multiplicación de DNA, teniendo dicho primer iniciador de la multiplicación de DNA una primera región de homología de secuencia para una tercera región en el vehículo de clonación receptor circular, y teniendo dicho segundo iniciador de la multiplicación de DNA una segunda región de homología de secuencia para una cuarta región en el vehículo de clonación receptor circular.
49. El estuche de reactivos de una cualquiera de las reivindicaciones 44-48, en el cual dicho sistema vector es capaz adicionalmente de expresar un gen inhibidor recBC.
50. El estuche de reactivos de una cualquiera de las reivindicaciones 44-49, en el cual la expresión se encuentra bajo control de un promotor regulable.
51. El estuche de reactivos de acuerdo con la reivindicación 48, que comprende adicionalmente un marcador fenotípico localizado en el vehículo de clonación receptor entre las regiones tercera y cuarta de homología de secuencia.
52. El estuche de reactivos de acuerdo con la reivindicación 48, en el cual el vehículo de clonación receptor comprende adicionalmente un sitio de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio en el vehículo de clonación receptor entre las regiones tercera y cuarta de homología de secuencia.
53. El estuche de reactivos de la reivindicación 48, que comprende adicionalmente medios para expresar una recombinasa específica de sitio en dicha célula huésped.
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