ES2201571T3

ES2201571T3 - Procedimiento para la inmovilizacion de moleculas mediadoras sobre materiales de implantes inorganicos y metalicos.

Info

Publication number: ES2201571T3
Application number: ES98966494T
Authority: ES
Inventors: Herbert P. Prof. Dr. Jennissen
Original assignee: Morphoplant GmbH
Current assignee: Morphoplant GmbH
Priority date: 1997-11-24
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2018-11-24
Also published as: ATE242647T1; WO1999026674A2; CA2311445A1; AU2408099A; US20040074568A1; DE19881727D2; US6635269B1; WO1999026674A3; DE59808721D1; EP1035879B1; US7255872B2; CA2311445C; AU749139B2; EP1035879A2; US20080107702A1

Abstract

Procedimiento para la inmovilización de moléculas mediadoras sobre materiales de implante, caracterizado porque en una primera etapa se fijan mediante enlace covalente moléculas de anclaje sobre la superficie activada 5 químicamente del material de implante, estas moléculas de anclaje poseen grupos funcionales que pueden unirse con enlace covalente con otros compuestos químicos, y en una segunda etapa se inmovilizan las moléculas mediadoras mediante estos grupos funcionales sobre el material del implante, dicho material de implante se elige entre los materiales del grupo siguiente: metales, aleaciones metálicas, materiales cerámicos y combinaciones de los anteriores.

Description

Procedimiento para la inmovilización de moléculas mediadoras sobre materiales de implantes inorgánicos y metálicos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la inmovilización de moléculas mediadoras sobre superficies de materiales metálicos o cerámicos, que se emplean para implantes, por ejemplo articulaciones artificiales o incluso para implantes minúsculos, p.ej. los llamados "stents", así como a los implantes fabricados con arreglo a este procedimiento.

La implantación de articulaciones o huesos artificiales ha cobrado mayor importancia en los últimos años, p.ej. para el tratamiento de displasia o luxaciones articulares o en el caso de enfermedades que pueden surgir por desgaste de articulaciones a raíz de una posición incorrecta de dichas articulaciones. Se ha mejorado constantemente el funcionamiento de los implantes y los materiales empleados para su fabricación, que además de los metales como el titanio o las aleaciones pueden abarcar también la cerámica y los materiales plásticos, por ejemplo el Teflon®, de modo que los implantes, una vez concluido con éxito el curso de la curación, pueden aguantar en servicio períodos de 10 años en el 90-95% de los casos. Prescindiendo de estos avances y de los procedimientos operativos mejorados, una implantación seguirá siendo una operación difícil y laboriosa, en especial porque está sujeta a un difícil proceso de integración del implante en el paciente, que a menudo puede comprender largos meses de permanencia en clínica y hospital, incluidas las sesiones de rehabilitación. Aparte del dolor, para el paciente en cuestión son objeto de grandes molestias la larga duración del proceso de curación y la separación del entorno familiar. Por otro lado, el laborioso proceso de curación provoca costes elevados de personal y asistencia debido a los tratamientos intensivos que se necesitan.

En los últimos se han ampliado de forma significativa los conocimientos de los procesos a nivel molecular, requeridos para alcanzar el éxito en la integración de un implante. Para la compatibilidad de un implante con los tejidos es determinante la compatibilidad estructural y la compatibilidad superficial. La biocompatibilidad en sentido estricto depende solamente de la superficie. En todos los planos de la integración, las proteínas desempeñan un papel decisivo. Tal como se explica a continuación, son decisivas ya en la misma operación de implantación por la formación de una capa proteínica absorbida inicial que marcará el curso de la integración del implante en el paciente, ya que sobre esta capa se fijarán y asentarán posteriormente las primeras células.

La interacción molecular entre el implante, que se denomina también biomaterial, y los tejidos pone en marcha un gran número de reacciones que, al parecer, están sujetas a un orden estrictamente jerárquico. La primera reacción biológica es la adsorción de proteínas sobre la superficie del biomaterial. En la capa proteínica resultante, las moléculas proteínicas individuales se convierten seguidamente en sustancias de señal por alteraciones conformacionales, que se alojan en la superficie, o bien sufren reacciones catalíticas (proteolíticas), cuyo resultado es la liberación de fragmentos proteicos que actúan como sustancias de señal. Desencadenada por las sustancias de señal tiene lugar en la fase siguiente la ocupación o colonización celular, que puede comprender un gran número de células, por ejemplo leucocitos, macrófagos, inmunocitos y finalmente incluso células de tejidos (fibroblastos, fibrocitos, osteoblastos, osteocitos). En esta fase desempeñan un papel decisivo otras sustancias de señal, los llamados mediadores, por ejemplo las citocinas, quimiocinas, morfogenos, hormonas de tejidos y hormonas verdaderas. En el caso de la biocompatibilidad tiene lugar a continuación la integración del implante en el organismo en su conjunto y, en el caso ideal, se obtiene un implante permanente.

A la luz de los trabajos, realizados durante los últimos años en el plano molecular de la osteogénesis, han conseguido una importancia creciente las sustancias de señales químicas, también llamadas proteínas morfogénicas óseas (bone morphogenic proteins, de BMP-1 a BMP-13), que influyen en el crecimiento óseo. Las BMP (en especial la BMP-2 y BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7) son proteínas osteoinductivas, que estimulan la formación de hueso nuevo y la curación de los huesos, ya que provocan la proliferación y la diferenciación de células precursoras de osteoblastos. Promueven además la formación de receptores hormonales, sustancias específicas óseas, por ejemplo el colágeno de tipo 1, la osteocalcina, la osteopontina y finalmente la mineralización. Las moléculas BMP regulan tres reacciones clave: la quimiotaxis, la mitosis y la diferenciación de las células precursoras correspondientes. Además, las BMP desempeñan un papel importante en la embriogénesis, la organogénesis del hueso y de otros tejidos, siendo conocidos como células diana los osteoblastos, los condroblastos, los mioblastos y las células musculares lisas vasculares (la BMP-2-inhibe la proliferación).

En el procedimiento de inmovilización de la invención se pretende conseguir en especial un grado de sustitución (es decir, una concentración superficial de proteína inmovilizada) que permita y facilite una interacción multivalente entre la superficie y las células, que regulan eficazmente la formación de huesos y de tejidos.

Actualmente se conocen 13 BMP, incluidas las isoformas múltiples. A excepción de la BMP-1, las demás BMP pertenecen a la superfamilia llamada "transforming growth factor beta" (TGF-\beta), de las que se han detectado receptores específicos en la superficie de las células correspondientes. Tal como se ha observado en el uso correcto de la BMP-2 y/o de la BMP-7 humanas recombinantes en ensayos de procesos de curación fracasados, realizados en ratas, perros, conejos y simios, parece que no existe ninguna especificidad de especie. Sin embargo, los ensayos realizados hasta el presente, que recurren a las propiedades desencadenantes de formación ósea de las BMP para sacar partido de ellas en especial con fines de implantación, para lo cual se fijan la BMP-2 y/o la BMP-7 con un enlace no covalente sobre biomateriales metálicos o cerámicos, se han desarrollado sin éxito prácticamente en todos los casos.

Por ejemplo, en el documento WO 92/00047 se describe un procedimiento de fabricación de implantes especiales, que influyen en el crecimiento celular, pero en él, la molécula mediadora no se fija con enlace covalente. Por otro lado en el documento WO 90/09798 se describe un procedimiento en el que la inmovilización de una interleucina sobre un polímero tiene lugar mediante glutaraldehído, sin embargo en este documento no se menciona ninguna etapa de activación cuando se utilizan metales u óxidos metálicos. Por otro lado, en el documento US-A-5 330 911 se describe la modificación química de una superficie y la fijación covalente de péptidos pequeños sobre ella para facilitar la adhesión celular, en especial proteínas con una secuencia mínima de aminoácidos para el reconocimiento del receptor, que facilita la adhesión celular y es común a una serie de moléculas de adhesión celular.

El cometido de la presente invención consiste en desarrollar biomateriales mejorados que puedan utilizarse en implantes.

Este cometido se lleva a cabo según la invención con un procedimiento para la inmovilización de moléculas mediadoras sobre materiales metálicos o cerámicos. En el procedimiento de la invención, en una primera etapa se une con enlace covalente un compuesto químico a la superficie del material del implante, que actúa como molécula ancla, este compuesto químico posee un grupo funcional que puede unirse con enlace covalente por sí mismo como molécula espaciadora (spacer) o a otro compuesto químico que actúa como molécula espaciadora. En una segunda etapa se puede inmovilizar la molécula mediadora, por ejemplo un factor de crecimiento óseo, mediante grupos funcionales, por ejemplo mediante grupos amino o grupos carboxilato libres, que establecen un enlace covalente con el material del implante. De este modo es posible formar una superficie de implante quimiotáctica y/o biológicamente activa (también llamada superficie yuxtacrina), que conduce a la colonización, proliferación y diferenciación de las células óseas.

El procedimiento de la invención para la inmovilización de moléculas mediadoras se caracteriza porque el material de implante empleado está constituido por materiales metálicos, por ejemplo titanio puro o aleaciones metálicas de titanio, por ejemplo aleaciones de titanio con cromo/níquel/aluminio/vanadio/cobalto (p.ej. TiAlV4, TiAlFe2,5), aceros inoxidables (p.ej. aceros V2A, V4A, acero al cromo-níquel 316L) o materiales cerámicos, por ejemplo hidroxilapatita, óxido de aluminio o por una combinación, p.ej. un material metálico se recubre con un material cerámico. Como materiales de implante son también idóneos los materiales de polímeros plásticos.

Es también objeto de la invención impedir o mitigar terapéuticamente por recubrimiento de un apoyo vascular coronario (también llamado "stent" coronario, de unos 10 mm de longitud) mediante una biomolécula o un mediador, p.ej. la BMP-2, la complicación posterior, es decir la restenosis, provocada por la proliferación de células musculares vasculares lisas, con lo cual se facilita la integración del implante en el paciente y su compatibilidad.

Según la invención, las moléculas mediadoras pueden ser biomoléculas que son ventajosas para la biocompatibilidad del implante, ya que contrarrestan un posible rechace del implante y/o favorecen la integración de dicho implante.

En el presente procedimiento pueden utilizarse con preferencia como moléculas mediadoras las proteínas que favorecen el crecimiento óseo, pertenecientes al grupo de los factores de crecimiento óseo, también llamadas "bone morphogenic proteins", o bien la ubiquitina. Para la inmovilización puede utilizarse con ventaja una proteína de este grupo a título individual, en combinación con otros compuestos de este grupo o incluso junto con otros biomoléculas, por ejemplo proteínas de otros grupos u hormonas de bajo peso molecular o también junto con antibióticos para mejorar la defensa inmune. Estas moléculas pueden inmovilizarse sobre la superficie incluso mediante enlaces que pueden romperse o eliminarse en el medio biológico.

Según la invención se activa químicamente la superficie del material del implante, dicha activación se efectúa a través de un derivado silano, por ejemplo del \gamma-aminopropiltrietoxisilano o de un derivado de trimetilmetoxi- o de trimetilclorosilano o del 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano, y la reacción tiene lugar en medio acuoso o en un disolvente orgánico. En una segunda etapa, sobre la superficie así activada puede fijarse con enlace covalente una molécula espaciadora que actúa como distanciadora. Como espaciador (spacer) puede utilizarse por ejemplo un dialdehído, tal como el aldehído glutárico, un derivado de isotiocianato o un derivado de triazina. Como molécula espaciadora puede utilizarse también un ácido dicarboxílico o un derivado adecuado, por ejemplo el anhídrido succínico. Después de la eventual activación del grupo de fijación existente en la molécula espaciadora, por ejemplo de una función carbonilo, mediante uno de los procedimientos idóneos para ello, se fija la proteína que favorece el crecimiento óseo mediante un enlace covalente sobre el material del implante a través de los grupos amino accesibles de la superficie de dicha proteína.

Según la invención es también posible emplear como molécula espaciadora una arilamina, que se obtiene por ejemplo por reacción del material del implante, activado por un compuesto silano, con el cloruro del ácido benzoico sustituido con grupos nitro, por ejemplo el cloruro de p-nitrobenzoílo, y posterior reducción del grupo nitro. En este caso, la fijación covalente de la proteína mediadora tiene lugar mediante los grupos carboxilo libres, que pueden activarse para este fin mediante procedimientos estándar.

El procedimiento presente comprende además la fijación de la molécula mediadora solamente a través de moléculas ancla, sin previa activación, como la recién descrita a título de ejemplo, de la superficie del implante con silanos, pudiendo utilizarse para tal fin p.ej. el bromuro de cianurilo. En este caso, la inmovilización covalente de la molécula mediadora puede efectuarse mediante los grupos amino libres de la proteína.

El procedimiento de la invención comprende además la fijación de un factor de crecimiento óseo sobre la superficie del implante mediante moléculas espaciadoras, cuyos enlaces covalentes no se rompen en condiciones fisiológicas. Como variante ventajosa se fija sobre la superficie del implante un factor de crecimiento óseo mediante moléculas espaciadoras, cuyos enlaces covalentes pueden romperse en condiciones fisiológicas para lograr una liberación limitada de la proteína mediadora. Como alternativa es también posible fijar sobre la superficie activada del implante los factores de crecimiento óseo sin recurrir a una molécula espaciadora, por ejemplo empleando el método de la carbodiimida.

Según otra forma de ejecución del procedimiento se utilizan dos o más moléculas espaciadoras para inmovilizar por lo menos un factor de crecimiento óseo.

La densidad de carga de una proteína mediadora, inmovilizada sobre el material del implante con arreglo al procedimiento de la invención, se sitúa en general entre 0,03 y 2,6 \mug/cm^{2} (p.ej. de 1 a 100 pmoles/cm^{2} de BMP-2). En este intervalo de carga se puede conseguir una interacción multivalente entre una célula (p.ej. de 10 \mum de diámetro) y las moléculas de BMP sobre una superficie biologizada, ya que en el lugar de adhesión se encuentran de 10^{6} a 10^{8} moléculas de proteína inmovilizadas.

Los inventores han realizado numerosos ensayos para clarificar el mecanismo de fijación de las moléculas de proteína sobre la superficie. Como resultado han encontrado que, en el caso de superficies metálicas, por ejemplo de titanio, la fijación tiene lugar mediante enlaces covalentes con las moléculas de dióxido de titanio que se forman en la superficie metálica, dichas moléculas pueden convertirse mediante un tratamiento con ácido nítrico diluido en grupos hidroxilo.

A diferencia de los procedimientos conocidos del estado de la técnica, en los que se depositan biomoléculas p.ej. sobre superficies poliméricas o materiales óseos inorgánicos y permanecen sobre la superficie del sustrato únicamente por interacciones afines con las moléculas del polímero, los inventores han conseguido anclar las biomoléculas sobre la superficie mediante enlaces covalentes y de este modo mantenerlas disponibles sobre la superficie del implante por más tiempo.

Los amplios estudios del inventor han puesto de manifiesto que el anclaje de las moléculas mediadoras sobre la superficie puede mejorarse cualitativa y cuantitativamente aumentando el número de unidades de óxido metálico disponibles sobre la superficie. El inventor ha constatado que el número de grupos óxido puede aumentarse de modo sorprendente tratando la superficie del metal con ácido cromosulfúrico caliente, con preferencia libre de poso. A diferencia de lo esperado, que sería que el metal de disolviera en estas condiciones, ocurre que utilizando este ácido se forma sobre la superficie del metal una capa de óxido relativamente uniforme. El procedimiento es tan suave que permite recubrir incluso los apoyos vasculares coronarios, también llamados "stents" (que pueden fabricarse p.ej. de acero inoxidable o de titanio) sin destruir su fina red (diámetro de 50 a 150 \mum). La capa de óxido puede alcanzar un grosor de 10 \mum a 100 \mum y aumentar su estructura de forma relativamente "fácil", sin formar depresiones ni agujeros. Como metal de implante puede utilizarse el titanio puro o aleaciones de titanio (p.ej. el TiAlV4, el TiAlFe2,5), el aluminio o el acero inoxidable (p.ej. el V2A, el V4A, el acero al cromo-níquel 316L). Un ácido cromosulfúrico comercial con un 92% en peso de H_{2}SO_{4}, un 1,3 % en peso de CrO_{3} y una densidad de 1,8 g/cm^{3}, que puede adquirirse por ejemplo de la empresa Merck, es el que se utiliza con preferencia para conseguir una capa de óxido metálico fina y lisa. Para ello se sumerge el sustrato metálico en el ácido cromosulfúrico y se trata a una temperatura entre 100 y 250ºC durante un período de tiempo de 1 a 3 horas, con preferencia a 240ºC durante 30 minutos, después se enjuaga cuidadosamente con agua, a continuación se mantiene en ebullición en agua o en una solución de EDTA 1-4 mM (etilendiaminotetraacetato), con preferencia EDTA 4 mM, durante 30 minutos, con el fin de eliminar los iones cromo que pudieran haber quedado sobre la superficie y después se seca.

Si sobre la superficie metálica se quiere lograr una capa de óxido metálico más gruesa o una capa de óxido con pequeños micro- o nanoporos, entonces se diluye el ácido cromosulfúrico recién descrito con agua hasta dejarlo con una densidad de 1,5 a 1,6 g/cm^{3}. Durante el siguiente tratamiento la superficie del implante metálico, realizado del modo recién descrito, con el ácido diluido de esta manera se forma una capa superficial "rugosa" con depresiones y poros, es decir, aumenta la superficie disponible para la carga de moléculas mediadoras. Ajustando la densidad del ácido cromosulfúrico a distintos valores se puede aplicar sobre la superficie metálica un gran número de capas diversas de óxido con muy buen anclaje. La invención se refiere, pues, también a un procedimiento de este tipo para formar capas de óxido metálico termodinámicamente unitarias (sin histéresis de ángulo de contacto) sobre el material de implante mediante el tratamiento con ácido cromosulfúrico caliente.

La capa de óxido metálico sobre el material del implante fabricado con los materiales mencionados anteriormente puede activarse seguidamente por tratamiento con ácido nítrico diluido (aprox. del 5% en peso) y posterior fijación de un derivado de silano, eventualmente con fijación de una molécula espaciadora del modo descrito anteriormente.

Gracias a las moléculas del derivado de silano o del espaciador (spacer) pueden anclarse seguidamente sobre la superficie del implante las moléculas mediadoras por un procedimiento de fijación, p.ej. con carbonildiimidazol.

Para descartar la adsorción inespecífica de las moléculas mediadoras, que podría llegar hasta el 30% de las moléculas mediadoras adsorbidas, sobre la superficie metálica, es también preferido en el marco de la presente invención fijar en primer lugar sobre la superficie del implante, provista de una capa de óxido metálico, una capa de moléculas espaciadoras, p.ej. agarosa, que impidan dicha adsorción, sobre esta capa de moléculas espaciadoras se fijan a su vez las moléculas mediadoras. Impedir la adsorción inespecífica puede ser conveniente por ejemplo para prevenir el bloqueo de los receptores de BMP después de las alteraciones conformacionales de las proteínas BMP, sufridas a raíz de la adsorción inespecífica sobre la superficie. La invención se refiere, pues, también a dicho procedimiento de formación de un recubrimiento que impida la fijación inespecífica sobre la capa de óxido metálico y a la posterior fijación de las moléculas mediadoras. Para este fin es preferido el uso de un recubrimiento de agarosa.

Como material de implante puede utilizarse también un material cerámico, por ejemplo hidroxilapatita. La hidroxilapatita debería activarse en primer lugar por tratamiento con aminoalquilsilano y después hacerse reaccionar con un agente de fijación, tal como el carbodiimidazol. En la etapa siguiente puede tener lugar una fijación de las moléculas mediadoras, por ejemplo la BMP o la ubiquitina, sobre la superficie. En caso de utilizar la hidroxilapatita no es imprescindible usar moléculas espaciadoras.

En caso de que, en las condiciones de fijación, los mediadores empleados resulten difícilmente solubles en el medio, puede aumentarse su solubilidad con la adición de tensioactivos/detergentes y después efectuar la reacción. Por ejemplo, en valores de pH > 6 pueden mantenerse en solución sin pérdida de actividad biológica los factores de crecimiento óseo, difícilmente solubles, y otros mediadores gracias a detergentes iónicos o no iónicos, en un intervalo de concentraciones comprendido entre el 0,05 y el 10%, con preferencia entre el 1 y el 5% en peso, en especial en un 0,066% de SDS (dodecilsulfato sódico) cuando los valores de pH son > 6, en especial cuando los valores de pH están entre 8 y 10 para el procedimiento de fijación covalente en el intervalo básico del pH.

En un sistema de cultivo celular se ha estudiado la influencia de los materiales modificados con arreglo al procedimiento de la invención en las células óseas o en líneas celulares de osteoblastos (MC3T3-E1), utilizando para tal fin materiales modificados en forma de plaquitas. Se observa que después de aportar las células se forman céspedes celulares confluyentes y ocurren modificaciones funcionales provocadas por la BMP-2 (p.ej. síntesis de fosfatasa alcalina) en los materiales.

La invención se ilustra con los ejemplos siguientes. Los ensayos se efectúan con BMP-2 humana de gran pureza, fabricada por los inventores con técnicas de ingeniería genética o adquirida de proveedores (p.ej. empresa Biochrom KG/Seromed, Berlín), o con ubiquitina.

Ejemplo 1 Inmovilización de la BMP sobre titanio pulverulento con espaciador (spacer) a) Preparación de una superficie reactiva de implante

Se añaden 0,5 g de titanio en polvo (diámetro de partícula 50-100 \mum) sobre 9 ml de agua destilada y, según el grado de sustitución, de 0,2 a 2,0 ml de \gamma- aminopropiltrietiletoxisilano del 10% (v/v) y con agitación se ajusta el pH de la mezcla reaccionante entre 3 y 4 por adición de HCl 6 N. Una vez ajustado el pH se incuba la solución reaccionante en un baño de agua a 75ºC durante 2 h. A continuación se separa el metal activado con un filtro conectado al vacío, se lava con 10 ml de agua dest. y se seca en una estufa a 115ºC.

b) Activación de la superficie del implante e inclusión de una molécula espaciadora (spacer)

Se añaden 0,5 g del metal en polvo derivatizado con el aminoalquilsilano a 12,5 ml de glutaraldehído del 2,5% en NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0. Se prosigue la reacción hasta que se completa o se observa un viraje del color. A continuación se separa el producto de la reacción mediante un filtro y se lava con agua dest. abundante.

c) Inmovilización de la proteína

Al producto de reacción lavado con glutaraldehído se le añade la BMP en una cantidad de 0,1 a 3,0 mg/g de titanio en polvo, 0,066% de dodecilsulfato sódico (SDS) a pH neutro y se incuba a 4ºC durante una noche.

Ejemplo 2 a) Preparación de una superficie reactiva de implante

La preparación de una superficie reactiva de implante se lleva a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1.

b) Activación de la superficie del implante

Se añade 1,0 g del metal derivatizado con el derivado aminoalquilsilano a 50 ml de H_{3}PO_{4} 0,03 M con el pH ajustado a 4,0. Se añaden de 100 a 200 mg de una carbodiimida soluble en agua, por ejemplo de carbodiimida-metoxi-p-toluenosulfonato de 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetilo).

c) Inmovilización de la proteína

Al titanio en polvo activa, recién mencionado, se le añade la BMP directamente en una cantidad de 0,1 a 0,3 mg/g de titanio en polvo y se incuba a 4ºC durante una noche.

Ejemplo 3 Inmovilización de la BMP sobre titanio en forma de plaquita con espaciador (spacer) a) Preparación de una superficie reactiva de implante

La activación de la superficie del implante se realiza de igual manera que en el ejemplo 1. En lugar de titanio en polvo se utiliza únicamente la misma cantidad de titanio en forma de plaquita.

b) Activación de la superficie del implante e inclusión de una molécula espaciadora

Se añaden las plaquitas del metal activadas con un derivado de aminoalquilsilano a 12,5 ml de glutaraldehído del 2,5% en NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0. Se prosigue la reacción hasta que se observa un viraje del color. A continuación se separa el producto de la reacción mediante un filtro y se lava con agua dest. abundante.

c) Inmovilización de la proteína

Al producto de reacción lavado con glutaraldehído se le añade la BMP en una cantidad de 0,1 a 3,0 mg/g de titanio en forma de plaquita a pH neutro y se incuba a 4ºC durante una noche.

Ejemplo 4 Inmovilización de la BMP sobre titanio en forma de plaquita sin espaciador a) Preparación de una superficie reactiva de implante

b) Activación de la superficie del implante

Se añade la plaquita del metal derivatizado de aminoalquilsilano a 50 ml de H_{3}PO_{4} 0,03 M, con el pH ajustado a 4,0. Después se añaden de 100 a 200 mg de una carbodiimida soluble en agua, por ejemplo el carbodiimida-metoxi-p-toluenosulfonato de 1- ciclohexil-3-(2-morfolinoetilo).

c) Inmovilización de la proteína

Al producto de fijación anterior se le añade directamente la BMP en una cantidad de 0,3 a 3,0 mg/g de plaquita de titanio a pH de 4,0 y se incuba a 4ºC durante una noche.

Ejemplo 5 Inmovilización de liberación lenta (slow release) de la BMP sobre titanio en forma de plaquita sin espaciador a) Activación de la superficie del implante

Se añade 1 plaquita de titanio (0,5 x 1,0 cm) de un grosor de 0,1 a 0,5 mm a 25 ml de agua dest. Se ajusta el pH entre 10 y 11 y se añade 1 g de CNBr manteniendo constante el pH entre 10 y 11 y manteniendo constante la temperatura entre 15 y 20ºC. Si el pH permanece constante, la reacción ha finalizado y se lava la plaquita metálica con 100 ml de H_{2}O.

b) Inmovilización de la proteína

A la plaquita metálica activada con CNBr se le añade BMP en una cantidad de 0,1 a 3,0 mg/g de plaquita en SDS del 0,066 % y se incuba durante una noche a 4ºC y pH 9,0. La reacción de fijación puede efectuarse también a pH 7,0. Una vez finalizada la fijación se lava la plaquita con agua abundante. En enlace covalente entre la plaquita metálica y la BMP se hidroliza con un período de vida media de 1-4 semanas, de modo que se desprende la BMP soluble.

Ejemplo 6 Inmovilización de la BMP sobre hidroxilapatita en forma de plaquita sin espaciador a) Preparación de una superficie reactiva de implante

Se hace reaccionar durante una noche en condiciones de ebullición a reflujo la hidroxilapatita con una solución de \gamma-aminopropiltrietiletoxisilano al 10% en tolueno. A continuación se lava la hidroxilapatita con tolueno y se seca.

b) Activación de la superficie del implante

Se añade 1,0 g de la apatita hecha reactiva con el derivado de aminoalquilsilano a 50 ml de H_{3}PO_{4} 0,03 M, con el pH ajustado a 4,0. Después se añaden de 100 a 200 mg de una carbodiimida soluble en agua, por ejemplo el carbodiimida-metoxi-p- toluenosulfonato de 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetilo).

c) Inmovilización de la proteína

Al producto de reacción recién citado se le añade directamente la BMP en una cantidad de 1 a 10 mg/g de hidroxilapatita y se incuba a 4ºC durante una noche.

Ejemplo 7 Inmovilización de la BMP sobre hidroxilapatita en forma de plaquita con espaciador a) Preparación de una superficie reactiva de implante

Se hace reaccionar durante una noche en condiciones de ebullición a reflujo la hidroxilapatita con una solución de \gamma-aminopropiltrietiletoxisilano al 10% en tolueno seco. A continuación se lava la hidroxilapatita con tolueno y se seca.

Se añaden 0,5 g de la apatita hecha reactiva con el derivado de aminoalquilsilano a 12,5 ml de glutaraldehído del 2,5% en NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0. Se prosigue la reacción hasta que finaliza la reacción o se observa un viraje del color. A continuación se separa el producto de la reacción mediante un filtro y se lava con agua dest. abundante.

c) Inmovilización de la proteína

Al producto de reacción recién obtenido se le añade directamente la BMP en una cantidad de 1 a 10 mg/g de hidroxilapatita y se incuba a 4ºC y pH 7,0 durante una noche.

En lugar del método indicado en los ejemplos de obtención 2a, 4a y 6a se puede preparar una superficie reactiva de implante mediante el procedimiento siguiente. Se hacen reaccionar en condiciones de reflujo durante una noche 0,5 g de metal en polvo, 1 plaquita de metal o 1 g de apatita en una solución de 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPS) al 2% en tolueno seco. A continuación se lava el material resultante con tolueno y se seca con vacío. Para obtener un derivado hidroxi primario reactivo partiendo del derivado epoxi se añaden a las cantidades recién citadas de los derivados GPS 15 ml de ácido acético/H_{2}O (90:10) que contienen 0,83 g de peryodato sódico. Se mezcla bien esta material a temperatura ambiente durante 2 horas y se incuba. Después se quita la fase líquida y se lava con agua, acetona y éter de dietilo (20 ml en cada caso). A continuación puede efectuarse una de las reacciones de activación que se han mencionado anteriormente.

En lugar de los métodos indicados en los ejemplos de obtención 2b, 4b y 6b se puede emplear el procedimiento siguiente para activar la superficie del implante. Para ello se lavan 0,5 g del polvo metálico (2a) derivatizado con aminoalquilsilano o una plaquita metálica derivatizada con aminoalquilsilano (4a) o 1,0 g de la apatita (6a) hecha reactiva con el derivado de aminoalquilsilano con 50 ml de acetona anhidra (<0,3%). A continuación se añade 10 ml de una solución de carbonildiimidazol al 3% en acetona sobre el material derivatizado con silano y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se vuelve a lavar con 20 ml de acetona y se puede efectuar la fijación con la proteína BMP.

Ejemplo 8 Comprobación de la actividad biológica de la BMP inmovilizada en cultivo celular, según Bingmann

En este ensayo se estudia la actividad biológica de la BMP in vitro en cultivos primarios de explantes óseos (células de bóveda del cráneo (calvario) de cobayas): índice de adhesión, crecimiento inicial, proliferación, alteraciones funcionales en la estimulabilidad hormonal y en la propagación de señales iónicos inducidos por irritación (p.ej. iones calcio y H^{+}). Las probetas metálicas (plaquitas) se recubren con la BMP de tal manera que la mitad de la plaquita está biologizada y la segunda mitad no lo está, actuando como referencia o control. Los primeros resultados ponen de manifiesto que las plaquitas recubiertas con BMP provocan una alteración funcional clara de las células óseas.

Ejemplo 9 Recubrimiento de titanio en polvo con proteína a) Hidroxilación con ácido nítrico

Se agitan en ebullición a reflujo a 80ºC durante 2 h 2 g de titanio en polvo (atomizado a <60 \mum) en HNO_{3} del 5%. A continuación se filtra el polvo a través de una frita y se lava con 500 ml de agua (pH = 6-7). Después se lava el polvo con 30 ml de etanol seco.

b) Silanización con 3-aminopropiltrietoxisilano (APS)

Se suspende 1 g de titanio en polvo hidroxilado en 45 ml de tolueno seco y se trata con 5 ml de APS en atmósfera de gas inerte (se trabaja en bolsa "Atmosbag"). Se mantiene la suspensión en ebullición a reflujo durante 4 h. Después se filtra a través de una frita y se lava con 200 ml de tolueno y con 100 ml de etanol. Se seca la sustancia con acetona.

c) Activación del silano en polvo con carbonildiimidazol (CDI)

Se disuelven 750 mg de CDI en 15 ml de acetona seca y se les añaden 300 mg del producto del apartado b). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 3 h y después se filtra. A continuación se lava con 50 ml de acetona y 50 ml de agua.

d1) Fijación con 125I-ubiquitina

La ubiquitina se yoda con yodo 125 con la Cloramina T según un método ya conocido. Se suspenden 100 mg del silano en polvo del apartado c) en 1 ml de una solución de tampón fosfato Na 50 mM, pH 10,0, en el que se halla disuelto 1 mg/ml de 125I-ubiquitina de una radiactividad específica de 5000-20000 cpm/\mug. La concentración de ubiquitina puede situarse entre 0,01 y 1,0 mg/ml. Se agita la mezcla en la rueda a temperatura ambiente durante 2 h y después durante una noche. Se retira el líquido sobrenadante con la pipeta. Después se lava 3 veces con 1 ml de tampón. A continuación se lava 4 veces con una solución 0,1 M de NaOH, con un 1% de dodecilsulfato sódico (SDS) y se lava dos veces más con tampón y 2 veces con agua. El titanio en polvo, recubierto con la 125I-ubiquitina, se mezcla con 1 ml de acetona en un pequeño recipiente Eppendorf. Se retira el líquido sobrenadante con pipeta y se seca el polvo durante una noche con el vacío generado por una bomba de aceite.

Los controles se efectúan en las mismas condiciones con el producto activado y/o no activado del apartado b) (ver tabla 1).

d2) Fijación con 125I-BMP-2

La fijación de la BMP-2 se lleva a cabo de modo similar al de la ubiquitina, pero con la diferencia de que como tampón se emplea borato Na 50 mM, con un 0,066% de SDS, pH 10. La concentración de la BMP-2 se sitúa entre 0,01 y 1 mg/ml.

TABLA 1 Fijación de proteína sobre titanio en polvo en el ejemplo de la proteína 125I-ubiquitina

	125I-ubiquitina inmovilizada sobre
	titanio en polvo (2400 cm^{2}/g)
	\mug/cm^{2}
A. Adsorción
ubiquitina sobre titanio en polvo	0,638
ubiquitina sobre titanio en polvo modificado con APS	0,417
después del tratamiento con NaOH/SDS	0,107
B. Fijación covalente de la ubiquitina*
Experimento del método 1:
control	0,107
fijación covalente	0,122
Experimento del método 2:
control	0,035
fijación covalente	0,094
* Definición de la proteína unida con enlace covalente: la cantidad de proteína
determinada después de lavado con NaOH 0,1 M/1% de SDS (ver método).

Ejemplo 10 Recubrimiento de plaquitas de titanio con una capa de óxido para aumentar la capacidad de fijación de proteínas

Se efectúa la oxidación de las plaquitas de titanio (en cada caso 0,5 x 1 cm) en ácido cromosulfúrico en ebullición a una temperatura de 190-200ºC durante 1,5 h. Las plaquitas se vuelven de color gris durante la oxidación y después se enjuagan a fondo con agua. A continuación se sumergen las plaquitas en agua hirviente durante 30 min. Se guardan las plaquitas en el aire a temperatura ambiente (TA) (ver figuras 1 y 2. Las plaquitas de la figura 1 son plaquitas 1 y 2 sin tratar, las plaquitas 3 y 4 se han tratado con ácido cromosulfúrico de una densidad de 1,8 g/cm^{3} y las plaquitas 5 y 6 se han tratado con el mismo ácido de una densidad de 1,6). El análisis EDX (energy dispersive analysis of X-rays) de la nueva capa, controlado con microscopio electrónico, indica un 99% de TiO_{2}.

Tal como se observa en la figura 1, las plaquitas de TiO_{2} oxidado tienen una coloración más oscura y han perdido por completo el brillo metálico.

Los diagramas de histéresis representados en la figura 2 permiten constatar que el tratamiento de oxidación se ha realizado con éxito. La detección de las distintas superficies de las plaquitas de titanio se efectúa por el método llamado "Wilhelmy Plate Methode". Las mediciones efectuadas en las distintas plaquitas A, B y C arrojan los resultados siguientes:

A. sin purificar	\theta_{avance} = 76,2º, \theta_{retroceso} = 18,2º, histéresis: grande
B. purificada	\theta_{avance} = 36,5º, \theta_{retroceso} = 21,1º, histéresis: pequeña
C. oxidada	\theta_{avance} = 20,0º, \theta_{retroceso} = 15,0º, histéresis: ninguna

Lo decisivo es el ángulo de avance (\theta_{avance}) y la histéresis. Se observa que la plaquita sin purificar (A), cuyo ángulo de contacto (\theta_{avance}) es de 76º, es muy hidrófoba. Esta gran superficie de histéresis indica la existencia de impurezas. Las plaquitas purificas y pulidas (B) presentan ya mejores propiedades, un ángulo de contacto mucho menor situado en 36,5º y una fuerte disminución de la histéresis. Los mejores resultados corresponden a las plaquitas oxidadas (C), cuyo ángulo de contacto es de solo 20º, sin histéresis visible, es decir, poseen una superficie termodinámicamente uniforme.

Ejemplo 11 Recubrimiento covalente de muestras de plaquitas de titanio a) Hidroxilación con ácido nítrico

A efectos comparativos se calientan a ebullición con reflujo a 80ºC durante 2 h plaquitas de titanio oxidadas y no oxidadas en HNO_{3} del 5%. A continuación se lavan las plaquitas con 500 ml de agua (pH = 6-7). Después se lavan las plaquitas con 30 ml de etanol seco.

b) Silanización

Se colocan las plaquitas de titanio no oxidadas u oxidadas (tal como se ha descrito anteriormente) en recipientes calefactados para la reacción de silanización. Los recipientes deberían enfriarse previamente en una atmósfera seca, con preferencia en atmósfera de nitrógeno, en un desecador. En atmósfera de gas inerte se mezclan dentro de una bolsa "Atmosbag" (nitrógeno) 50 ml de tolueno seco y 2,5 ml de APS. En el aire se llena el recipiente con el mayor número posible de plaquitas y se introduce en un matraz de fondo redondo en atmósfera de gas inerte con la mezcla de APS/tolueno. Se cierra y se mantiene en ebullición a reflujo durante 3 h (termómetro de contacto: 140ºC). Se enjuagan las plaquitas tres veces con 10 ml de triclorometano, acetona y metanol. Se secan las plaquitas en el aire.

c) Activación con carbonildiimidazol

A continuación se añade a las plaquitas en su recipiente una solución de acetona (seca) y carbonildiimidazol. La solución contiene 50 ml de acetona y 2,5 g de CDI: se cierra el matraz de fondo redondo en atmósfera de gas inerte y se agita a TA durante 4 h. Después se enjugan las plaquitas tres veces con 10 ml de acetona y agua. Se secan las plaquitas en el aire.

d1) Recubrimiento proteínico con 125I-ubiquitina

A continuación se introducen las plaquitas individualmente en una solución de tampón fosfato Na 50 mM, pH 10, en el que existe una concentración de 1 mg/ml de 125I-ubiquitina de una radiactividad específica de 5000-20000 cpm/\mug. (La concentración de ubiquitina puede situarse entre 0,01 y 1,0 mg/ml, con o sin el 0,066% de SDS.) Se agitan las plaquitas a TA durante 12-14 h. Después se lavan las plaquitas cuatro veces en tampón fosfato, en una solución 0,1 M de NaOH, en dodecilsulfato sódico (SDS) del 1% a temperatura ambiente y después se incuban a 60ºC durante 15 min en una solución 0,1 M de NaOH, con un 1% de dodecilsulfato sódico. Seguidamente se lava con agua abundante (ver tabla 2 y figuras 3-4).

d2) Recubrimiento proteínico con 125I-BMP-2

Se marca radiactivamente la BMP-2 mediante el ya conocido método de Bolton-Hunter en un tampón borato Na 125 mM, un 0,066 % de SDS, pH 8,4 (radiactividad específica de 5000-20000 cpm/\mug). La fijación de la 125I-BMP-2 se realiza en un tampón borato Na 50 mM, un 0,066% de SDS, pH 10. La concentración de la 125I-BMP-2 puede situarse entre 0,01 y 1,0 mg/ml. Se agitan las plaquitas a TA durante 12-14 h. Después se lavan las plaquitas cuatro veces en tampón fosfato, en una solución 0,1 M de NaOH, en dodecilsulfato sódico (SDS) del 1% a temperatura ambiente y después se incuban a 60ºC durante 15 min en una solución 0,1 M de NaOH, con un 1% de dodecilsulfato sódico. Seguidamente se lava con agua abundante.

TABLA 2 Fijación de proteína sobre plaquitas de titanio en el ejemplo de la proteína 125I-ubiquitina

	Inmovilización de la 125I-ubiquitina
	plaquitas de titanio	plaquitas de titanio revestidas
	pulidas \mug/cm^{2}	de óxido \mug/cm^{2}
		A	B
Experimento de adsorción
plaquitas con APS	0,800	1,06	0,914
Experimento de fijación covalente
Adsorción "irreversible" inespecífica	0,040	0,177	0,114
(control)		0,146	0,103
fijación covalente ap.	0,114	0,500	0,604
	0,106	0,446	0,589

TABLA 3 Fijación comparativa de las proteínas 125I-ubiquitina y 125I-BMP-2 sobre plaquitas de titanio oxidadas (tratadas con ácido cromosulfúrico de densidad 1,84) en presencia de un 0,066 % de SDS

	Inmovilización de 125I-ubiquitina sobre plaquitas de
	titanio recubiertas de óxido \mug/cm^{2}
Experimento de fijación covalente
A. Adsorción inespecífica
"irreversible" (control)
125I-ubiquitina (0,01 mg/ml)	0,003
125I-BMP-2 (0,01 mg/ml)	0,005
125I-ubiquitina (1,0 mg/ml)	0,172
125I-BMP-2 (1,0 mg/ml)	0,1-0,2*
B. covalente
125I-ubiquitina (0,01 mg/ml)	0,009
125I-BMP-2 (0,01 mg/ml)	0,010
125I-ubiquitina (1,0 mg/ml)	0,570
125I-BMP-2 (1,0 mg/ml)	0,4-0,6*
* estimado

Todos los derivados de las plaquitas de titanio recogidos en la tabla 2 se han comprobado en cultivo celular con derivados de osteoblastos (células MC3T3). En todas las plaquitas se han formado céspedes confluyentes de células, que podían estimularse con BMP-2. Las plaquitas oxidadas proporcionan valores de estimulación dobles. Los resultados obtenidos permiten afirmar que las plaquitas no presentan toxicidad alguna y que las plaquitas oxidadas son claramente mejores que las plaquitas no oxidadas.

En la figura 3 se representan los cambios en los ángulos de contacto y en la histéresis de plaquitas de titanio (pulidas) no oxidadas después de la modificación con APS y la fijación de la proteína. Se puede hacer un seguimiento cualitativo del recubrimiento, pero no se pueden sacar conclusiones cuantitativas. Las determinaciones realizadas en las distintas plaquitas A, B y C arrojan los valores siguientes:

\newpage

A. purificadas: \theta_{avance} = 36,5º, \theta_{retroceso} = 21,1º, histéresis: pequeña

B. modificadas con APS: \theta_{avance} = 68,6º, \theta_{retroceso} = 22,6º, histéresis: grande

C. 125I-ubiquitina: \theta_{avance} = 46,1º, \theta_{retroceso} = 17,4º, histéresis: ninguna.

En la figura 4 se representan los cambios en los ángulos de contacto y en la histéresis de plaquitas de titanio oxidadas después de la modificación con APS y la fijación de la proteína. Se puede hacer un seguimiento cualitativo del recubrimiento, pero no se pueden sacar conclusiones cuantitativas. Las determinaciones realizadas en las distintas plaquitas A, B y C arrojan los valores siguientes:

B. modificadas con APS: \theta_{avance} = 76,7º, \theta_{retroceso} = 15,9º, histéresis: grande

C. 125I-ubiquitina: \theta_{avance} = 76,9º, \theta_{retroceso} = 48,2º, histéresis: grande.

Ejemplo 12 Recubrimiento de las plaquitas de titanio con agarosa para reducir la adsorción proteínica inespecífica (= capa repelente de proteínas) a) Oxidación de la agarosa con peryodato sódico para obtener la dialdehído-agarosa

Se trata una mezcla reaccionante de 19 g de bolas de gel de agarosa al 4% (diámetro: 40-190 \mum), p.ej. Sepharose 4B, empresa Pharmacia, 100 ml de agua dest., 2,5 ml de una solución 0,4 M de peryodato sódico del modo siguiente:

En primer lugar se lavan las bolas de agarosa en un embudo Büchner con agua destilada y después se secan brevemente con succión sobre dicho embudo. Se recoge la torta de gel húmeda en 100 ml de agua. Se añaden 2,5 ml de peryodato sódico 0,4 M y se agita la suspensión de gel de agarosa durante 4 horas con exclusión de la luz en un baño de hielo y después durante una noche a temperatura ambiente. A continuación se lava el producto con agua destilada, con una solución de tiosulfato sódico del 3% y otra vez con agua destilada y finalmente se deshidrata con acetona. A continuación se seca la agarosa obtenida a 30ºC con el vacío generado por una bomba de aceite. Al igual que la agarosa nativa, también la dialdehído-agarosa tiene la capacidad de gelificar. En estas condiciones se oxida el 1% de todas las unidades de agarobiosa.

b) Fijación de la dialdehído-agarosa sobre plaquitas de aminopropilsilil-titanio

Mezcla reaccionante por plaquita:

4 ml de una solución de dialdehído-agarosa seca en tampón fosfato potásico (0,1 M; pH 7,0) a 80ºC

mezcla reaccionante a): solución al 0,7%

mezcla reaccionante a): solución al 1,4%

mezcla reaccionante a): solución al 2,1%

mezcla reaccionante a): solución al 4,0%

En primer lugar se disuelve a 80ºC la dialdehído-agarosa seca en el tampón en la concentración deseada (del 0,7 al 4%). Después se añaden las plaquitas de aminopropilsilil-titanio (preparación: ver páginas anteriores) en un soporte en la solución y se agita a 80ºC durante dos horas. Pasados 20 minutos se añaden 400 mg de cianoborhidruro sódico para reducir la base de Schiff que se ha formado. Para eliminar el exceso de agarosa se lava el producto seguidamente a 80ºC en cada caso con 15 ml de una solución 4M de cloruro sódico y agua y después con agua a temperatura ambiente. Se deshidratan las plaquitas con acetona y después se secan a 30ºC con vacío durante una noche. A continuación puede activarse la capa de agarosa existente sobre las plaquitas de titanio del modo descrito con carbonildiimidazol para fijar las aminas primarias (p.ej. aminoácidos o proteínas).

c) Activación de la capa de agarosa con carbonildiimidazol

Se disuelven 150 mg de carbonildiimidazol en 3 ml de acetona y después se añaden a la plaquita de titanio recubierta de agarosa. Se incuba la plaquita a temperatura ambiente durante 2 horas y después se enjuaga a fondo con acetona y con agua dest.

\newpage

d1) Recubrimiento proteínico con 125I-ubiquitina

A continuación se introducen las plaquitas de agarosa individualmente en una solución de tampón fosfato Na 50 mM, pH 10, en el que existe una concentración de 1 mg/ml de 125I-ubiquitina (de una radiactividad específica de 5000-20000 cpm/\mug). (La concentración de ubiquitina puede situarse entre 0,01 y 1,0 mg/ml.) Se agitan las plaquitas a TA durante 12-14 h. Seguidamente se interrumpe la reacción de las plaquitas por incubación con 40 mg/ml de glicina en tampón fosfato Na 50 mM, pH 10, a temperatura ambiente durante 4 horas. Después se lava en cada caso con 15 ml de agua, una solución 1 M de NaCl y agua. En caso necesario puede lavarse también con una solución de SDS al 1% a temperatura ambiente.

d2) Recubrimiento proteínico con 125I-BMP-2

Se marca radiactivamente la BMP-2 mediante el ya conocido método de Bolton-Hunter en un tampón borato Na 125 mM, un 0,066 % de SDS, pH 8,4 (radiactividad específica de 5000-20000 cpm/\mug). La fijación de la 125I-BMP-2 se realiza en un tampón borato Na 50 mM, un 0,066% de SDS, pH 10. La concentración de la 125I-BMP-2 puede situarse entre 0,01 y 1,0 mg/ml. Se agitan las plaquitas a TA durante 12-14 h. Seguidamente se interrumpe la reacción de las plaquitas por incubación con 40 mg/ml de glicina en tampón fosfato Na 50 mM, pH 10, a temperatura ambiente durante 4 horas. Después se lava en cada caso con 15 ml de agua, una solución 1 M de NaCl y agua. En caso necesario puede lavarse también con una solución de SDS al 1% a temperatura ambiente.

d3) Derivatización de plaquitas de cristal de cuarzo

En un procedimiento similar pueden recubrirse también con agarosa las plaquitas de cristal de cuarzo. En estas plaquitas puede observarse bien el efecto de repulsión de proteínas (adsorción de fibrinógeno, procedimiento TIRF (espectroscopía de reflexión interna total)). En la figura 5 se representa la disminución de la adsorción inespecífica del fibrinógeno por el recubrimiento de agarosa sobre las plaquitas de cristal de cuarzo en función del tiempo, en un procedimiento TIRF "on line". La adsorción de fibrinógeno (concentración: 0,01 mg/ml) se lleva a cabo en un tampón Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4. Se excita la fluorescencia del triptofano a 290 nm y se mide la emisión a 350 nm con un espetrofotómetro de fluorescencia (Spex Fluorolog 112XI) en condiciones TIRF. La agarosa en forma monomérica se fija de modo covalente sobre la función amino del resto aminopropilsililo. Las siglas cps significan: counted photons per second. En la figura:

la curva 1 corresponde a la placa de cristal de cuarzo modificada con aminopropilsililo

la curva 2 corresponde a la placa de cristal de cuarzo sin modificar (control)

la curva 3 corresponde a la placa de cristal de cuarzo recubierta con un 0,7% de agarosa

la curva 4 corresponde a la placa de cristal de cuarzo recubierta con un 4% de agarosa.

Ejemplo 13 Recubrimiento proteínico de hidroxilapatita porosa (un material sustitutivo óseo) a) Preparación de la hidroxilapatita

Se utilizan los materiales siguientes:

a.: hidroxilapatita porosa (obtenida de huesos de ternera), p.ej. Endobon, Merck, densidad: 1,289 g/cm^{3}

b.: 125I-ubiquitina o 125I-BMP-2

En atmósfera de nitrógeno se mezclan 3 ml de tolueno seco con 0,15 ml de aminopropilsilano (APS). A continuación se añade la hidroxilapatita porosa (150 mg) y se mantiene en ebullición a reflujo durante 5 horas. Seguidamente se enjuaga la hidroxilapatita 3 veces con acetona, 3 veces con cloroformo y 3 veces con metanol. Después en atmósfera de nitrógeno se carga la hidroxilapatita porosa en una solución de acetona seca (3 ml) y 150 mg de carbonildiimidazol y se agita a TA durante 3 horas. Finalmente se enjuaga 3 veces con 10 ml de acetona.

b1) Fijación de proteínas con 125I-ubiquitina

Se mezcla la hidroxilapatita de a) con 1 ml de tampón fosfato (50 mM), pH 10. A este tampón fosfato se añaden 20 \mul de ubiquitina (aprox. 50 mg/ml) y se agregan 10 \mul de ubiquitina radiactiva (radiactividad específica de la solución final: 32600 cps/\mug). Se mezcla la solución y se agita en la rueda a TA en primer lugar durante 2 horas. Después se agita a 4ºC durante 24 h más. Seguidamente se enjuaga la hidroxilapatita modificada 3 veces con agua, después 4 veces con una solución 0,1 M de NaOH, con un 1% de dodecilsulfato sódico (SDS) y después 3 veces con agua. Se mide la radiactividad en un contador gamma (Gammacounter) y se determina el grado de sustitución. Los controles se efectúan con la hidroxilapatita lavada y/o con hidroxilapatita recubierta con APS (ver tabla 4).

b2) Fijación de proteínas con 125I-BMP-2

Se mezcla la hidroxilapatita de a) con 1 ml de tampón borato Na 50 mM, con un 0,066% de SDS, pH 10. La fijación de la 125I-BMP-2 (radiactividad específica: ver más arriba) se realiza en el mismo tampón (borato Na 50 mM, con un 0,066% de SDS, pH 10), incubando a temperatura ambiente durante 2 horas. Después se agita a 4ºC durante 24 h más. Seguidamente se enjuaga la hidroxilapatita modificada 3 veces con agua, después 4 veces con una solución 0,1 M de NaOH, con un 1% de dodecilsulfato sódico (SDS) y después 3 veces con agua. Se mide la radiactividad en un contador gamma (Gammacounter) y se determina el grado de sustitución. Los controles se efectúan con la hidroxilapatita lavada y/o con hidroxilapatita recubierta con APS. Durante la fijación, la concentración de la 125I-BMP-2 puede situarse entre 0,01 y 1,0 mg/ml.

TABLA 4 Fijación de proteína sobre hidroxilapatita porosa en el ejemplo de la proteína 125I-ubiquitina

	Ubiquitina fijada sobre hidroxilapatita porosa, \mug/g
Control	6
125I-ubiquitina	24
	30

Claims

1. Procedimiento para la inmovilización de moléculas mediadoras sobre materiales de implante, caracterizado porque en una primera etapa se fijan mediante enlace covalente moléculas de anclaje sobre la superficie activada químicamente del material de implante, estas moléculas de anclaje poseen grupos funcionales que pueden unirse con enlace covalente con otros compuestos químicos, y en una segunda etapa se inmovilizan las moléculas mediadoras mediante estos grupos funcionales sobre el material del implante, dicho material de implante se elige entre los materiales del grupo siguiente: metales, aleaciones metálicas, materiales cerámicos y combinaciones de los anteriores.

2. Procedimiento para la inmovilización de moléculas mediadoras sobre materiales de implante, caracterizado porque en una primera etapa se fijan mediante enlace covalente moléculas de anclaje sobre la superficie activada químicamente del material de implante, estas moléculas de anclaje poseen grupos funcionales que pueden unirse con enlace covalente con otros compuestos químicos, y en una segunda etapa se inmovilizan las moléculas mediadoras mediante estos grupos funcionales sobre el material del implante, en calidad de moléculas mediadoras pueden utilizarse factores de crecimiento óseo elegidos entre el grupo de las proteínas BMP, la ubiquitina, los antibióticos y las mezclas de los anteriores.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el material de implante se elige entre el grupo siguiente: metales, aleaciones metálicas, materiales cerámicos y combinaciones de los anteriores.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque en una etapa intermedia entre la primera etapa y la segunda se fijan moléculas espaciadoras sobre las moléculas de anclaje de la primera etapa y estas moléculas espaciadoras poseen otros grupos funcionales para establecer enlaces covalentes con otros moléculas y en la segunda etapa se inmovilizan las moléculas mediadoras mediante los grupos funcionales de las moléculas espaciadoras sobre el material de implante.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, caracterizado porque por lo menos una parte de los enlaces químicos de las moléculas mediadoras sobre la superficie del material de implante está modificada de tal manera que los enlaces pueden romperse en condiciones fisiológicas.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque como factor de crecimiento óseo se emplea la BMP-2 o la BMP-7.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la superficie del material del implante se dota de una capa de óxido antes de establecer el enlace covalente con las moléculas de anclaje.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la superficie del material del implante, que se elige entre titanio, aleaciones de titanio, aluminio y acero inoxidable, se trata con ácido cromosulfúrico a una temperatura de 100 a 250ºC durante un tiempo de 0,5 a 3 horas para dotarla de una capa de óxido antes de establecer el enlace covalente con las moléculas de anclaje.

9. Procedimiento de creación de una capa de óxido sobre sustratos metálicos, caracterizado porque se trata la superficie del sustrato metálico con ácido cromosulfúrico caliente a una temperatura de 100 a 250ºC durante un tiempo de 0,5 a 3 horas.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el ácido cromosulfúrico tiene una densidad superior a 1,40 g/cm^{3}.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el sustrato metálico es un implante.

12. Procedimiento según la reivindicación 4, 7 ú 8, caracterizado porque en una primera etapa se fijan sobre la superficie del implante moléculas de aminoalquilsilano en calidad de moléculas de anclaje, en una etapa intermedia se fijan sobre las moléculas de anclaje mediante enlace covalente moléculas de agarosa que actúan como moléculas espaciadoras y en una segunda etapa se fija sobre la agarosa mediante enlace covalente un factor de crecimiento óseo, perteneciente al grupo de las proteínas BMP o la ubiquitina, que actúan como moléculas mediadoras.

13. Implante que puede obtenerse con arreglo a una de las reivindicaciones de 1 a 8 ó 12.

14. Implante según la reivindicación 13, caracterizado porque el material del implante es titanio, una aleación de titanio, aluminio, acero inoxidable o hidroxilapatita.