ES2201603T3 - Celulas humanas recombinantes para la formacion de celulas oseas y cartilaginosas. - Google Patents
Celulas humanas recombinantes para la formacion de celulas oseas y cartilaginosas.Info
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Abstract
Célula humana recombinante para la formación de células óseas y cartilaginosas, a partir del mesénquima indeferenciado, la cual célula humana posee la capacidad de expresar el Brachyury recombinante, escogiéndose dicha célula de una célula del siguiente grupo: - célula primaria humana del estroma de médula ósea, - célula primaria humana troncal del mesénquima, - condrocito articular primario humano, - condorcito primario humano a partir de la epífisis de huesos, y - osteoplasto primario humano.
Description
Células humanas recombinantes para la formación
de células óseas y cartilaginosas.
Internacionalmente existe, a pesar de la intensa
investigación efectuada, solamente un factor de transcripción que
puede provocar a nivel genético la formación de osteoblastos
formadores del hueso. Las propiedades de los últimos factores han
sido descritas recientemente con distintos nombres: Osf2, Aml3 o
Cbfa1, en los cuales se trata siempre del mismo factor. Un factor de
transcripción para los condrocitos formadores de cartílago no existe
actualmente.
El Brachyury ("T") es un factor de
transcripción, que pertenece a la llamada familia
T-box. Sus propiedades y las de la familia
T-box han sido recientemente descritas en varios
artículos de visión general (Papaioannou & Silver, 1998; Smith,
1997). El Brachyury y otros miembros de esta familia (Tbx1 a
Tbx6) están presentes en el temprano desarrollo activo embrionario
(Herrmann y col., 1990; Kispert y col., 1994; De Angelis y col.,
1995; Chapman y col., 1996).
El Brachyury se ha caracterizado con más
detalle como factor de transcripción, y recientemente se ha
desentrañado la estructura tridimensional proteínica de su dominio
formador del ADN, el T-box (Kispert y col., 1995;
Müller & Herrmann, 1997). El propio Brachyury es
responsable de la aparición y proliferación de células precursoras
indiferenciadas del mesodermo. Otros miembros de la familia
T-box tienen influencia sobre los tubos neurales
embrionarios (Tbx6) (Chapman & Papaioannou, 1998), o
respectivamente sobre el desarrollo cardíaco (Tbx5) (Li y col.,
1997; Spranger y col., 1997). Otros miembros de esta familia
intervienen también probablemente en la formación de muestras
embrionarias del desarrollo de las extremidades (Simon y col, 1997)
y del cerebro (T-br1) (Bulfone y col., 1995).
De este factor (Brachyury) se sabe desde
hace varios años, que juega un papel en el temprano desarrollo
embrionario y que está involucrado en la formación de la llamada
"tercera hoja germinal" del mesodermo. La completa inactivación
de este factor Brachyury en el ratón (del griego: cola corta;
los ratones heterocigotos tienen una cola corta; otro nombre de este
factor es "T" puesto que el locus génico también se llama
"locus T"), es letal en el temprano desarrollo embrionario y
por ello no pueden analizarse sin más, otras influencias p. ej., en
la formación de hueso y del cartílago.
Es tarea de la presente invención tener previsto
un factor de transcripción con propiedades formadoras de células
cartilaginosas y células óseas, o respectivamente una célula humana
para la expresión de dicho factor.
Este objetivo se ha solucionado mediante una
célula humana recombinante para la formación de células óseas y
cartilaginosas de mesénquima indiferenciadas, de forma que esta
célula humana posee la capacidad de expresar el Brachyury
recombinante.
Además, la célula humana recombinante se
caracteriza por el hecho de que ha sido obtenida recombinantemente a
partir de una célula del siguiente grupo:
- células primarias humanas del estroma de la
médula ósea
- células troncales mesenquimales primarias
humanas,
- condrocitos articulares primarios humanos,
- condrocitos primarios humanos de epífisis de
huesos y osteoblastos primarios humanos.
Además, la célula humana recombinante se
caracteriza por el hecho de que la célula humana se obtiene mediante
una biopsia, se expande y se modifica en forma recombinante, de por
sí ya conocida, para la expresión del Brachyury.
En ensayos críticos hemos podido demostrar que en
una célula precursora del mesénquima (C3H10T½), el Brachyury
expresado recombinantemente puede provocar la formación de células
formadoras de huesos y cartílagos, los osteoblastos y condrocitos.
Este ensayo es crítico por la razón siguiente, a saber, que las
células parentales normales C3H10T½ constituyen células estables de
tejidos, que solamente a partir de señales exógenas muy
diferenciadas, poseen la posibilidad de formación en cuatro
distintas formas de tejido conjuntivo: los mioblastos formadores de
músculo, los osteoblastos formadores de hueso, los condrocitos
formadores de cartílago y los adipositos formadores de grasa.
Las figuras 1 y 2 documentan el hecho de que el
Brachyury está en situación de provocar la formación de
osteoblastos y condrocitos en estas células C3H10T½ :
Osteoblastos histológicamente comprobables,
fueron comprobados con ayuda de la actividad enzimática de la
fosfatasa alcalina, un marcador genético de estas células. En el
cultivo in vitro tiene lugar la maduración de los
osteoblastos poco tiempo después de alcanzar la confluencia a partir
del día 4 (la confluencia se alcanza el día 0). Una semana más tarde
pueden comprobarse distintos condrocitos teñidos con azul
Alcian.
Esencialmente, para la formación de condrocitos y
osteoblastos, está también la comprobación de la expresión de
determinados genes marcadores de ambas formas de células. Esta
comprobación se ha efectuado aquí mediante un procedimiento llamado
RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
de la transcripción invertida. En este procedimiento se obtiene en
primer lugar el ADNc a partir del total de ARNm mediante
transcripción invertida, y a continuación se amplifica con ayuda de
la PCR y determinados cebadores, el ADNc para determinados genes
marcadores de la formación de los osteoblastos o condorcitos, y a
continuación se comprueba por electroforesis sobre gel.
De acuerdo con la invención, ha podido ser
demostrado que los genes marcadores altamente específicos para la
formación de osteoblastos, como p. ej., el gen de la osteocalcina y
el gen del receptor PTH/PTHrP, son altamente regulados en células
con una superexpresión del Brachyury. También el colágeno (I)
muestra el transcurso típicamente bifásico de la diferenciación de
los osteoblastos. La formación de condrocitos se confirma mediante
la temprana alta proporción de expresión del colágeno II, además, es
también probable la maduración de los condrocitos, puesto que la
formación de colágeno (II)-ARNm disminuye a partir
del día 7 de cultivo, y a continuación se expresan probablemente
otros colágenos.
Referencias
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Claims (2)
1. Célula humana recombinante para la formación
de células óseas y cartilaginosas, a partir del mesénquima
indeferenciado, la cual célula humana posee la capacidad de expresar
el Brachyury recombinante, escogiéndose dicha célula de una
célula del siguiente grupo:
- -
- célula primaria humana del estroma de médula ósea,
- -
- célula primaria humana troncal del mesénquima,
- -
- condrocito articular primario humano,
- -
- condorcito primario humano a partir de la epífisis de huesos, y
- -
- osteoplasto primario humano.
2. Célula humana recombinante según la
reivindicación 1, caracterizada porque dicha célula humana ha
sido obtenida por biopsia, ha sido expandida y ha sido transformada,
en forma recombinante de por sí ya conocida, para la expresión del
Brachyury.
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