ES2202034T3 - Pre-acondicionamiento contra la muerte celular. - Google Patents

Abstract

Utilización de una muestra de sangre del cuerpo de un mamífero, que ha sido tomada del mismo, y se hace reaccionar ex vivo con por lo menos un factor estresante elegido dentro del grupo formado por: una temperatura por encima o por debajo de la temperatura del cuerpo, luz ultravioleta, y entorno oxidativo, para la fabricación de un medicamento que se utiliza para aliviar o proteger contra los síntomas de una alteración, que presenta elevadas tasas de apoptosis (muerte celular programada) o necrosis en un cuerpo de mamífero, eligiéndose dicha alteración dentro del grupo de: alteración por exposición a la radiación, exposición a agentes químicos y por ingestión, trastornos neurodegenerativos y por traumas físicos, mediante la reducción de la tasa de predisposición a la apoptosis o necrosis de tejidos y órganos del cuerpo de un mamífero.

Description

Pre-acondicionamiento contra la muerte celular.

Ámbito de la invención

La invención se refiere al ámbito de la medicina. Más específicamente, la invención se refiere a unos medios para pre-acondicionar el cuerpo de un mamífero, inclusive el cuerpo humano, con el fin de permitir a los órganos celulares del mismo, que resistan mejor la muerte celular con la que se encuentren ulteriormente, provocada por sucesos causantes de la apoptosis, o de la necrosis, inclusive sucesos que provocan tanto la apoptosis como la necrosis.

Antecedentes de la invención

Las dos formas conocidas de muerte celular son la necrosis y la apoptosis. La apoptosis es el proceso biológico de muerte celular programada, controlada, mediante el cual las células mueren por un proceso de condensación, sin liberar el contenido celular al entorno. Las células de la mayoría de los órganos y tejidos se dividen y multiplican con el tiempo, proceso que suele estar en equilibrio con la muerte celular por apoptosis, lo cual tiene como consecuencia unos números óptimos de células en el cuerpo sano. La apoptosis, por consiguiente, se puede considerar que actúa como control del número total de células en órganos y tejidos. Los residuos de las células sometidas a la apoptosis son consumidos en su mayor parte por otras células, en un proceso de fagocitosis. El proceso de apoptosis, proceso natural, bien regulado, mediante el cual el cuerpo procede a la eliminación de las células no deseadas se tiene que contraponer al proceso de necrosis, en el cual las células mueren, en gran parte, de forma incontrolada, como resultado de la ruptura de la membrana. No obstante, es importante señalar que en muchos casos la apoptosis y la necrosis se comportan como algo continuo. Los componentes intracelulares de las células necrosadas se liberan en el organismo de forma incontrolada, ocasionando por lo general reacciones inflamatorias, en un intento por parte del cuerpo, de ocuparse de estos componentes que surgen de repente. Las células objeto de apoptosis no ocasionan prácticamente ninguna reacción inflamatoria nociva.

Algunos trastornos médicos en un cuerpo vivo, o un órgano individual se pueden atribuir, por lo menos en parte, a una aceleración indebida en la tasa de apoptosis. Este puede ocurrir, por ejemplo, cuando un cuerpo ingiere productos químicos tóxicos o se encuentra con cantidades excesivas de radiación nociva (radioactividad, exposición a UV, etc.). Otros trastornos presentan tanto apoptosis como necrosis. Existen además otros trastornos que presentan una tasa acelerada de muerte celular, debida principalmente a necrosis.

Se piensa que la apoptosis celular se inicia debido a una alteración en el funcionamiento de las mitocondrias de la célula. Las mitocondrias, como todo el mundo sabe, son organelas limitadas por membrana, situadas dentro de la célula, y que ocupan una parte importante del volumen celular total. Contienen grandes cantidades de membrana interna. La función principal de las mitocondrias es convertir energía procedente de los alimentos en formas que se puedan utilizar para activar reacciones celulares. Esto se realiza mediante un proceso de acoplamiento quimiosmótico, mediante el cual unas bombas iónicas limitadas por membrana transfieren iones de un lado de la membrana mitocondrial a lo otro. Las bombas de protones generan un gradiente de protones electroquímico a través de la membrana, que se utiliza para activar diversas reacciones que requieren energía cuando los protones circulan a través de proteínas incrustadas en la membrana como la enzima ATP sintasa. Como proceso iónico, el potencial a través de la membrana mitocondrial es importante para el funcionamiento eficiente de este mecanismo proporcionador de energía. Las mitocondrias participan directamente en la inducción de apoptosis al liberar proteínas pro-apoptóticas. Se sabe que las reducciones en el potencial de la membrana mitocondrial son indicativas del comienzo de la apoptosis.

Los órganos objeto de apoptosis presentan fragmentación oligo nucleosomal ADN en 180-200 pares de bases, con un patrón específico, que parece un ladder tras la electrofóresis de gel. El grado de fragmentación ADN está correlacionado con la progresión de la apoptosis en el órgano y se puede medir extrayendo el ADN, radiomarcándolo, sometiéndolo a electrofóresis y cuantificando la radioactividad asociada a los diversos fragmentos de ADN. Estas técnicas se pueden utilizar para determinar el número de células objeto de apoptosis o que presentan un estado o una predisposición apoptótica, con el objeto de determinar el grado o extensión de la apoptosis en un órgano corporal o tejido.

En la necrosis, las enzimas y otros contenidos celulares normalmente contenidos en el citoplasma se liberan como resultado de la desintegración de las membranas celulares, señal de la existencia de necrosis. Una de esta es la enzima lactato dehidrogenasa (LDH), cuyos niveles se suelen utilizar para determinar el grado de necrosis.

Breve referencia al estado de la técnica

La patente US 4.968.483 Mueller et al., describe un aparato para oxigenar la sangre, tratando extracorporalmente una muestra de sangre del paciente, con una mezcla de oxígeno/ozono y luz ultravioleta, a temperatura controlada. Se propone este aparato para su utilización en terapia de oxidación hematológica.

La patente U.S. 5.591.457 Bolton, describe un método para inhibir la aglomeración de plaquetas sanguíneas en un ser humano, un método para estimular el sistema inmunológico y un método para tratar las enfermedades vasculares periféricas, tales como la enfermedad de Raynaud, extrayendo una muestra de sangre de un paciente, sometiéndola a una mezcla de gas/oxígeno y a radiación ultravioleta a una temperatura que oscila entre 37 y 43ºC aproximadamente, y volviendo a inyectar posteriormente la sangre tratada en el paciente humano.

La patente US 5.834.030 Bolton, describe un proceso similar para aumentar el contenido de óxido nítrico en la sangre de un paciente mamífero, que resulta potencialmente útil en el tratamiento de estados tales como hipertensión en pacientes mamíferos.

La solicitud de patente internacional PCT/CA
97/00564 Vasoqen Inc.,(WO98/07436) describía una vacuna autoinmunitaria para administrar a pacientes humanos, con el fin de aliviar los síntomas de enfermedades autoinmunitarias como artritis reumatoide; la vacuna comprende una muestra de la sangre del paciente que ha sido sometida, extracorporalmente, a un entorno oxidante, radiación UV y temperatura

\hbox{elevada.}

Uno de los objetos de la presente invención es ofrecer unos medios para preacondicionar a un paciente mamífero para que pueda resistir mejor las agresiones celulares externas que pueden producir la aceleración o incrementar el grado de apoptosis en los tejidos u órganos del paciente mamífero.

Otro de los objetos de la invención es ofrecer unos medios para preacondicionar a un paciente mamífero para resistir mejor agresiones celulares externas que puedan producir la aceleración o el aumento del grado de necrosis en tejidos u órganos del paciente.

Otro de los objetos de la invención es ofrecer un proceso de preacondicionamiento para pacientes mamíferos contra los efectos nocivos de intoxicación química y por radiación.

Un objeto más de la invención es ofrecer un proceso para la fabricación de un medicamento destinado a aliviar o a decelerar la progresión de los síntomas de trastornos médicos relacionados con apoptosis o necrosis.

Resumen de la invención

La presente invención ofrece un medicamento con el cual se puede preacondicionar un cuerpo de mamífero de forma que las células de los órganos y tejidos puedan resistir mejor ulteriormente los sucesos que puedan producir apoptosis y/o necrosis. El proceso incluye un tratamiento in vitro de una muestra de la sangre del cuerpo de mamífero con ciertos factores estresantes para lograr la modificación de la muestra de sangre. Luego, se vuelve a introducir la muestra de sangre tratada en el cuerpo del mamífero. El resultado es un notable aumento en la resistencia a la apoptosis y a la apoptosis/necrosis de las células del cuerpo, como lo indican los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial, la disminución de "DNA ladder" y la menor liberación de LDH cuando las células se exponen ulteriormente a factores estresantes o a agentes tóxicos.

La muestra de sangre se trata sometiéndola a la acción de uno o más factores estresantes que, según se ha podido comprobar, modifican la sangre. Según la presente invención, la muestra la sangre se puede modificar sometiendo la sangre o fracciones celulares o no celulares separadas de la sangre, o mezclas de las células separadas y/o fracciones no celulares de la sangre, a factores estresantes elegidos dentro del grupo formado por: calor, luz ultravioleta y entornos oxidantes. Los factores estresantes se pueden aplicar individualmente o en cualquier combinación de dos o más de dichos factores estresantes, de forma simultánea o secuencial.

Por consiguiente, el proceso de la invención se puede utilizar para preacondicionar el cuerpo del mamífero contra los efectos de una amplia gama de factores encontrados ulteriormente y que, según se sabe, causan estados patológicos, asociados con grados excesivos de apoptosis o necrosis de células de diversos órganos corporales.

Los trastornos médicos asociados con grados excesivos de apoptosis y/o necrosis en diversos órganos o tejidos, y para los cuales está por lo tanto indicado el proceso de la presente invención, para su utilización como tratamiento de lo anterior o pre-acondicionamiento contra los efectos de ello, se pueden clasificar en cuatro categorías generales. Estas son:

(1) Trastornos por exposición a la radiación, que incluyen la exposición a cantidades excesivas de radiación ionizante, como radiación nuclear, radiación terapéutica o rayos X; o luz ultravioleta (con las alteraciones consiguientes de la piel, como quemaduras de sol, por ejemplo). El hecho de que dichos trastornos por exposición a la radiación estén asociados con una mayor apoptosis es algo conocido, por ejemplo por Blankenberg et al., "Dying a thousand deaths. Radionuclide imaging of apoptosis" (Muriendo de mil muertes. Imagen por radionúclidos de apoptosis), O.J. Nucl.Med, 1999 junio; 43(2): 170-6 y diversas referencias citadas allí; Wong, G.H. "Protective roles of cytokines against radiation: induction of mitochondrial MnSOD" (Función protectora de las citocinas contra la radiación: Inducción de MnSOD mitocondrial), Biochim, Biophys. Acta, 24 de mayo de 1995; 1271(1): 205-209 y diversas referencias citadas allí, Zhao et al., "Mitochondrial and intracellular free-calcium regulation of radiation-induced apoptosis in human leukemic cells" (Regulación sin calcio, intracelular y mitocondrial de apoptosis causada por radiación en células leucémicas humanas), Int J. Radiat Biol. Abril de 1999; 75 (4): 493-504; y Reap E.A. et al., "Radiation and stress-inducet apoptosis : a role for Fas/Fas ligand interactions"; (Radiación y apoptosis provocada por estrés: un papel para las interacciones de ligando Fas/Fas). Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 27 de mayo de 1997; 94(11):5750-5

(2) Trastornos por ingestión de productos químicos y exposición a los mismos, que incluye intoxicación por productos químicos; intoxicación alimentaria por toxinas bacterianas; sobredosis por ingestión de drogas y efectos secundarios; trastornos por exposición a agentes químicos de guerra, como gases nerviosos y gas mostaza; trastornos hepáticos por productos químicos y toxinas (inclusive alcohol); trastornos renales, como por ejemplo, los resultantes de la ingestión de antibióticos a base de aminoglucásido, tintes para contraste radiográfico o nefrotoxicidad por ciclosporina; trastornos hematopoyéticos y de inmunodeficiencia, derivados de la supresión de médula ósea causada por toxina o droga; infecciones por toxinas bacterianas; exposición al ozono; exposición a agentes disolventes; y los efectos de inmunosupresores, tales como ciclosporina, ciclofosfamida, o azatioprina; el hecho de que estos trastornos por exposición e ingestión de productos químicos esté asociado con aumentos en la apoptosis es algo conocido, por ejemplo: Losser M R y Payen D, "Mechanisms of liver damage" (Mecanismos de daños hepáticos), Semin
Liver Dis. Noviembre de 1996; 16(4) 357-67; Smith K.J. et al., "Immunohistochemical studies of basement membrane proteins and proliferation and apoptosis markers in sulfur mustard induced cutaneous lesions in weanling pigs" (Estudios inmuno-cito-químicos de proteínas de membrana basal y proliferación y marcadores de apoptosis en lesiones cutáneas provocadas por sulfuro de mostaza en cerdos destetados), J. Dermaol. Sci., septiembre de 1997; 15(3): 173-82; Dabrowska M.I. et. Al., Sulfur mustard induces apoptosis and necrosis in endotelial cells (El sulfuro de mostaza provoca apoptosis y necrosis en células endoteliales), Toxicol Appl Pharmacol diciembre de 1966; (14(2): 569-83; Muller et.al "Anthracycline derived chemotherapeutics in apoptosis and free radical cytotoxicity (Review)" (Quimioterapias derivadas de antraciclina en apoptosis y citotoxicidad de radical libre (Revisión)), Int.J. Mol. Med febrero de 1998: 1(2): 491-4, y diversas referencias citadas en el mismo; Healey et. Al., "Apoptosis and necrosis: mechanisms of cell death induced by ciclosporine A in a renal proximal tubular cell line", (Apoptosis y necrosis: Mecanismos de muerte celular provocada por ciclosporina A en un linaje celular tubular proximal renal) Kidney Int. Diciembre de 1998; 54(6): 1955-56; Hatake K, et. Al., "Apoptosis -gene expression in hematopoietic system: normal and pathologic Al condictions (Review)", (Expresión génica de apoptosis en sistema hematopoyético: condiciones normales y patológicas Al (Revisión)), Int J. Mol Med enero de 1998; 1(1): 121-9 y varias referencias mencionadas allí; Banker D.E. et. Al., "Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expresión in acute myeloid leukemia", (Medida de apoptosis provocada de forma espontánea y por agente terapéutico con expresión de proteína BCL-2 en leucemia mieloide aguda), Blood, 1 de enero de 1997; (1): 243-55; Boetberg B.J. et. Al., "Apoptosis accompanies a change in the phenotypic...." (La apoptosis acompaña un cambio en el.... fenotípico), Clin Immunol Immunopathol mayo de 1994; 71(2): 190-8; y Mountz J.D. et. Al. "Autoimmune disease. A problem of defective apoptosis ", (Enfermedad autoinmunitaria. Un problema de apoptosis deficiente),
Artritis Rheum, octubre de 1994; 37(10): 1415-20;

(3) Trastornos neurológicos, como la enfermedad de Parkinson, que supone la apoptosis de células específicas del cerebro, la demencia senil y la enfermedad de Alzheimer así como otras enfermedades similares. El hecho de que dichos trastornos neurológicos estén asociados con un aumento de la apoptosis es algo conocido, por ejemplo en Desjardin P. Ledoux S. "The role of apoptosis in neurodegenerative diseases," (El papel de la apoptosis en las enfermedades neurodegenerativas), Metab. Brain Dis. Junio de 1998; 13(2):79-96; Dragunow M. McGibbon G.A. et. al. "Apoptosis neurotrophic factors and neurodegeneration", (Apoptosis, factores neurotróficos y neurodegeneración), Rev. Neurosci. Julio-diciembre 1997; 8(3-4) 223-265; Kitamura Y., Taniguchi T Shimoham S. "Apoptotic cell death in neurons and glial cells; implications for Alzheimer disease" (Muerte celular apoptótica en neuronas y células gliales: implicaciones para la enfermedad de Alzheimer) Jpn. J

\hbox{ Pharmacol ,}

enero de 1999; 79(1): 1-5; y Budd S.L. y Nicholls D. G. "Mitochondria in the life and death of neurons"; (Mitocondrias en la vida y muerte de las neuronas) Essays Biochem 1998; 33-43-52 ; y otras publicaciones anteriores y ulteriores a las mencionadas anteriormente.

(4) Trastornos debidos a trauma físico, tales como heridas por accidente físico, heridas, quemaduras y pérdidas de sangre, como por ejemplo las que se producen en cirugía. El hecho de que estos trastornos estén asociados con un aumento de la apoptosis, es algo conocido, como por ejemplo por Wilson S.E.
"Molecular cell biology for the refractive corneal surgeon: programmed cell death and wound healing", (Biología celular molecular para la cirugía corneal refractiva: Muerte celular programada y cicatrización). J. Refract Surq. Marzo-abril 1997, 13(2): 171-5.

La determinación de si un medicamento particular incide en la apoptosis en tejidos u órganos de cuerpos de mamíferos vivos está bien clara a nivel celular, por ejemplo determinando el potencial de la membrana mitocondrial o el grado de fragmentación de ADN. Estas medidas se describen de forma más detallada en los ejemplos específicos que siguen. La determinación mediante una de estas medidas, de que un proceso o procedimiento conduce a una reducción de la apoptosis, indica que dicho proceso o procedimiento es eficaz en el tratamiento o el pre-acondicionamiento contra alguno de los trastornos relacionados con apoptosis, mencionados en las cuatro categorías anteriores. Esta determinación de los efectos inhibidores de la apoptosis de un proceso o procedimiento, a nivel celular, junto con la eficacia demostrada por dicho proceso en aliviar o pre-acondicionar contra un trastorno de una de las categorías descritas anteriormente, supone una prueba clara del éxito clínico potencial de dicho proceso o procedimiento en aliviar o pre-acondicionar contra otros trastornos de la misma categoría.

Por consiguiente, el medicamento de la invención resulta principalmente indicado para su utilización en personas que pueden encontrarse en situaciones en las que están expuestas a dichos factores, como los trabajadores de fábricas químicas, instalaciones nucleares y similares, o a situaciones peligrosas para la integridad física, como en los equipos de respuesta de emergencia. Resultarán evidentes las aplicaciones militares potenciales, en las que las tropas pueden ser pre-acondicionadas contra una amplia variedad de riesgos. Unas indicaciones más específicas de utilización del proceso están relacionadas con los pacientes sometidos a tratamientos médicos, en los que se les administra sustancias tóxicas, con los consiguientes efectos secundarios. Por ejemplo, la administración de inmuno supresores tales como ciclosporina, ciclofosfamida y azatioprina en los casos de transplantes de órganos y para otros fines, suele causar trastornos asociados con la aceleración de la apoptosis y/o la necrosis. La utilización del proceso de la presente invención en pacientes sometidos a dichos tratamientos puede resultar particularmente beneficiosa, ya que el plan de tratamiento para dichos pacientes, con medicamentos o radiaciones y con el proceso de la invención, se puede planificar cuidadosamente de antemano y realizar siguiendo un programa cuidadosamente controlado.

Además de utilizar el medicamento de la invención, para el pre-acondicionamiento de un cuerpo o de un órgano corporal contra factores encontrados ulteriormente, el proceso también se puede utilizar para controlar o aliviar los síntomas de un trastorno médico, que lleva consigo un aumento de apoptosis y 1 o necrosis. El término "aliviar o proteger contra los síntomas" en la forma en que se utiliza aquí se refiere tanto al pre-acondicionado para ofrecer protección, como al tratamiento de los síntomas manifestados.

En situaciones en las que el factor causante del trastorno médico está asociado con la edad (enfermedad de Parkinson o demencia senil, por ejemplo), el uso más práctico del proceso de la invención es en pacientes que padecen dicha enfermedad, con el objeto de controlarla o aliviar sus síntomas. Las pruebas clínicas han demostrado efectivamente una mejora en la capacidad cognitiva y en el bienestar general de los pacientes de más edad.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención ofrece un medicamento para aliviar o proteger contra los síntomas de un trastorno médico que lleva consigo tasas aceleradas de apoptosis o necrosis en un cuerpo mamífero, pudiendo ser dicho trastorno alguno de los siguientes: por exposición a la radiación; ingestión o exposición a productos químicos; trastornos neurológicos y trastornos producidos por trauma físico, el cual reduce la tasa o la predisposición a la apoptosis o necrosis de tejidos y órganos del cuerpo mamífero (a) haciendo reaccionar una muestra de sangre del cuerpo mamífero sobre el ex vivo con por lo menos un factor estresante elegido dentro del grupo siguiente: temperatura por encima o por debajo de la temperatura corporal, luz ultravioleta, y entorno oxidativo, y (b) administrando la muestra de sangre tratada en la etapa (a) al cuerpo del mamífero.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una presentación gráfica de los resultados obtenidos en el ejemplo 1, descrito a continuación;

Las figuras 2 y 3 son presentaciones gráficas de los resultados obtenidos en el ejemplo 2, descrito a continuación.

La figura 4 es la presentación gráfica de los resultados obtenidos según el ejemplo 3 siguiente.

Descripción de las realizaciones preferidas

Según un proceso preferido de la presente invención, se extrae una muestra de sangre de un mamífero, de preferencia humano, y la muestra de sangre se trata ex vivo con ciertos factores estresantes, descritos con mayor detalle en lo que sigue. Los términos "muestra", "muestra de sangre" o términos similares, utilizados aquí, se refieren a sangre completa, fracciones celulares separadas de la sangre, inclusive plaquetas, fracciones no celulares separadas de la sangre, inclusive plasma y combinaciones de lo anterior. El efecto de los factores estresantes es modificar la sangre y/o las fracciones celulares o no celulares de la misma, contenidas en la muestra. La muestra modificada se vuelve a introducir entonces en el cuerpo del sujeto, mediante algún método adecuado, de preferencia por inyección intramuscular, aunque también se puede hacer por inyección subcutánea, inyección intraperitoneal, administración oral, nasal o rectal, inyección intra-arterial o intravenosa.

Los factores estresantes a los que se somete ex vivo la muestra de sangre, según el método de la presente invención, se eligen dentro de los siguientes: estrés térmico (temperatura de la sangre por encima o por debajo de la temperatura del cuerpo), entorno oxidativo y luz ultravioleta, de forma individual o en cualquier combinación, simultánea o secuencial. La muestra tiene un volumen suficiente que, al volverse a introducir en el cuerpo del sujeto, produce en el mismo un pre-acondicionamiento contra el nivel de apoptosis. De preferencia, en pacientes humanos, el volumen de la muestra es de hasta 400 ml aproximadamente, de preferencia entre 0,1 y 100 ml aproximadamente, todavía mejor entre 5 y 15 ml, y todavía mucho mejor entre 8 y 12 ml aproximadamente, aunque de forma óptima 10 ml aproximadamente.

Se prefiere aplicar, según la invención, los tres factores estresantes antes citados de forma simultanea a la muestra bajo tratamiento, con el fin de garantizar que se produce la modificación adecuada de la sangre. También puede preferirse, en algunas realizaciones de la invención, aplicar cualquiera de los dos factores estresantes antes citados, por ejemplo, aplicar estrés térmico y oxidativo, estrés térmico y luz ultravioleta, o luz ultravioleta y estrés oxidativo. Hay que llevar cuidado y utilizar un nivel adecuado de factores estresantes para modificar de forma eficaz la sangre y obtener el efecto deseado.

El factor estresante de temperatura calienta la muestra que se está tratando hasta una temperatura por encima de la temperatura normal del cuerpo o enfría la muestra por debajo de la temperatura normal del cuerpo. La temperatura se elige de forma que el factor estresante de temperatura no cause excesiva hemólisis en la sangre contenida en la muestra, de forma que, cuando se inyecte en un sujeto la muestra tratada, se logre un pre-acondicionamiento eficaz contra la apoptosis y/o la necrosis. De preferencia, el factor estresante de temperatura se aplica de modo que la temperatura de la totalidad o parte de la muestra llegue hasta 55ºC aproximadamente, y todavía mejor entre -5ºC y 55ºC aproximadamente.

En algunas realizaciones preferidas de la invención, la temperatura de la muestra se eleva por encima de la temperatura normal del cuerpo, de forma que la temperatura media de la muestra no exceda de aproximadamente 55ºC, de preferencia de 40ºC a 50ºC aproximadamente, incluso mejor de 40ºC a 44ºC aproximadamente y de forma óptima, en torno a 42,5 ± 1ºC.

En otras realizaciones preferidas, la muestra se enfría por debajo de la temperatura normal del cuerpo, de forma que la temperatura media de la muestra se encuentra comprendida entre 4ºC y 36,5ºC aproximadamente, de preferencia entre 10ºC y 30ºC aproximadamente, y todavía mejor de 15ºC a 25ºC aproximadamente.

El factor estresante de entorno oxidativo puede consistir en la aplicación a la muestra de agentes oxidantes sólidos, líquidos o gaseosos. De preferencia, se trata de exponer la muestra a una mezcla de oxígeno de calidad médica y gas ozono, de preferencia introduciendo por borboteo a través de la muestra, dentro de las temperaturas antes citadas, una corriente de gas oxígeno de calidad médica, que tenga ozono como componente de menor importancia. El contenido de ozono de la corriente de gas y la velocidad de circulación de la corriente de gas se eligen de preferencia de forma que la cantidad de ozono introducida en la muestra de sangre, ya sea por sí sola o en combinación con otros factores estresantes, no produzca niveles excesivos de daño celular. La corriente de gas tiene, convenientemente, un contenido de ozono de hasta 300 \mug/ml aproximadamente, de preferencia entre 10 y 100 \mug/ml aproximadamente, todavía mejor 30 \mug/ml aproximadamente, todavía mejor hasta 20 \mug/ml aproximadamente, de forma particularmente preferible entre 10 \mug/mf y 20 \mug/ml aproximadamente, y de forma óptima, aproximadamente 14,5 ± 1,0 \mug/ml. La corriente de gas se suministra adecuadamente a la muestra a una velocidad de hasta 2,0 litros/minuto aproximadamente, de preferencia hasta 0,5 litros/minuto aproximadamente, todavía mejor hasta 0,4 litros/minuto aproximadamente, todavía mejor 0,33 litros/minuto aproximadamente y de forma óptima 0,24 ± 0,024 litros/minuto aproximadamente. El límite inferior de la velocidad de la corriente de gas será de preferencia no inferior a 0,01 litros/minuto, de preferencia no inferior a 0,1 litro/minuto y todavía mejor no inferior a 0,2 litros/minuto.

El factor estresante de luz ultravioleta se aplica adecuadamente, irradiando la muestra bajo tratamiento desde una fuente de luz UV, mientras se mantiene la muestra a la temperatura antes citada y se introduce por borboteo a través de la muestra la mezcla gaseosa de oxígeno/ozono. Las fuentes preferidas UV son lámparas UV que emiten en longitudes de onda de banda UV-C, es decir longitudes de ondas inferiores a 280 nm aproximadamente. Se puede utilizar también luz ultravioleta correspondiente a fuentes normales UV-A (longitudes de onda de 315 a 400 nm) y UV-B (longitudes de onda entre 280 y 315 aproximadamente). Por ejemplo, una dosificación adecuada de esta luz UV, aplicada simultáneamente con los factores estresantes antes citados de temperatura y entorno oxidativo, se puede obtener a partir de lámparas con una potencia consumida de 15 a 30 vatios aproximadamente y una potencia útil UV de aproximadamente 5-10 vatios, dispuestas para rodear el contenedor que sujeta la muestra. Se pueden utilizar ventajosamente hasta 8 lámparas de este tipo, que rodean la botella de la muestra, con una intensidad para suministrar una energía luminosa total UV a 253,7 nm en la superficie de la sangre de 0,025 a 10 julios/cm^{2} aproximadamente, de preferencia de 0,1 a 3,0 julios/cm^{2} aproximadamente. Este tratamiento ofrece una muestra de sangre modificada, lista para inyectar en el sujeto.

El tiempo durante el cual se somete la muestra a los factores estresantes oscila por lo general entere 0,5 y 60 minutos aproximadamente. El tiempo depende, en cierto modo, de la intensidad de luz UV elegida, la temperatura, la concentración del agente oxidante y la velocidad a la que se suministra a la muestra. Puede ser necesario realizar alguna experimentación para establecer los tiempos óptimos, por parte del operario, una vez que se han establecido los demás niveles de los factores estresantes. En la mayoría de los estados estresantes, los tiempos preferidos oscilaran aproximadamente entre 2 y 5 minutos, de preferencia a en torno a 3 minutos. La temperatura inicial de la sangre y la velocidad a la que se puede calentar o enfriar hasta una temperatura predeterminada tiende a variar de un sujeto a otro. Se utilizan de preferencia 4 lámparas de este tipo.

En la práctica del medicamento preferido de la presente invención, la muestra de sangre se puede tratar con los agentes estresantes utilizando un aparato del tipo descrito en la patente US antes citada nº. 4.968.483 de Mueller. La muestra se coloca en un contenedor adecuado, estéril, que deja pasar la luz UV, que se monta dentro de la máquina. Las lámparas UV se encienden durante un período determinado antes de que la corriente de gas se aplique a la muestra, proporcionando el estrés oxidativo, para permitir que se estabilice la potencia de las lámparas UV. Las lámparas UV suelen estar encendidas mientras se ajusta la temperatura de la muestra al valor predeterminado, por ejemplo 42,5 ± 1ºC. Seguidamente, se aplica a la muestra la mezcla de gas oxígeno/ozono, de composición conocida y caudal controlado, durante el período predeterminado de aproximadamente 60 minutos, de preferencia 2 a 5 minutos y todavía mejor en torno a 3 minutos según lo indicado anteriormente, de forma que la muestra es sometida a los tres factores estresantes de modo simultáneo. De esta forma, la sangre se modifica adecuadamente, según la presente invención, para lograr los efectos deseados. Cuando se vaya a utilizar el medicamento de la invención, se preferirá someter al paciente a una tanda de tratamientos, que comprende un tratamiento diario o alterno durante un período de 1 ó 2 semanas. Cada tratamiento es prácticamente idéntico, con extracción del mismo volumen de muestra, estrés y nueva inyección. La tanda de tratamientos se programa para que termine justo antes de que el paciente se exponga a un factor que acelera la apoptosis, según se describe anteriormente, para lograr un pre-acondicionamiento más eficaz contra los efectos de la misma.

La invención se ilustrará y describirá con referencia a los ejemplos específicos siguientes, es decir estudios de animales realizados de forma adecuada.

Los experimentos mencionados en los ejemplos demuestran, utilizando un sistema de modelo animal que incluye isquemia y reperfusión ulterior de varios órganos corporales, que el proceso de la presente invención tiene el efecto de reducir la apoptosis y la necrosis. Se sabe que las heridas de revascularización de isquemia implican un aumento de la apoptosis y la necrosis en los órganos y tejidos afectados - véase por ejemplo "Saikumar p, et., al. ``Mechanisms of cell death in hypoxial/reoxigenation Injury'' (Mecanismos de muerte celular en heridas de hipoxia/reoxigenación", Oncogene 24 de diciembre de 1998; 24-17(25):3341-9; y Burns A.T. et. Al., "Apoptosis in Ischemia/reperfusión Injury of human renal allografs" (Apoptosis en heridas de isquemia/reperfusión de alo-injertos renales humanos), Transplantation 15 de octubre de 1998; 66(7):872-6, y otras publicaciones anteriores y ulteriores a las mismas. En los ejemplos se utilizan conocidas técnicas de determinación de apoptosis a nivel celular. El hecho de que el proceso de la invención reduzca la apoptosis y la necrosis en este modelo, es indicativo de su utilidad en las diversas categorías de trastornos relacionados con la apoptosis, mencionados

\hbox{anteriormente.}

Ejemplo 1

Los animales utilizados en el experimento fueron sabuesos normales de pura sangre, de edades comprendidas entre 1 y 2 años, mismo número de machos que de hembras. Los animales se separaron en cuatro grupos, A, B, C y D, formado cada uno de ellos por seis animales, tres machos y tres hembras. Los animales de los grupos A y C se sometieron al proceso de la invención, sometiéndose a dos tandas de 10 días, en las que se tomó diariamente una muestra de sangre de 8 ml y se sometió a tratamiento extracorporal la muestra con oxígeno/ozono, radiación UV y calor, volviéndose a administrar 5 ml de la muestra tratada al mismo animal, por medio de inyección

\hbox{intramuscular.}

Cada uno de estos tratamientos se realizó del siguiente modo.

Se extrajo del animal una muestra de sangre de 8 ml, se trató con citrato sódico (2 ml) y se colocó en un contenedor estéril. Se sometió simultáneamente a los factores estresantes de radiación UV, entorno oxidativo de gas ozono/oxígeno y temperatura elevada, en un aparato como el que se describe en general en la patente US 4.969.483 de Mueller antes citada. Más específicamente, la muestra de sangre en el contenedor estéril, transparente a los rayos UV, se calentó utilizando lámparas infrarrojas hasta 42,5ºC y, manteniéndose a dicha temperatura, se sometió a una radiación UV de 253,7 nm de longitud de onda en las condiciones preferidas, descritas anteriormente. Simultáneamente, se introdujo por borboteo a través de la mezcla de sangre una mezcla de oxígeno de calidad médica y ozono, con un contenido de ozono de 13,5-15,5 \mug/ml, a una velocidad comprendida entre 60 y 240 mis/min. El tiempo de la exposición simultánea a los rayos UV y la alimentación de la mezcla de gas fue de 3 minutos. Se volvió a inyectar intramuscularmente en cada animal de la prueba una porción de 5 ml de la sangre tratada.

Cada uno de los animales de los grupos A y C, que recibió las tandas de tratamiento según la invención, se sometió durante tres semanas a un período de descanso entre las tandas de tratamiento de 10 días. Los grupos B y C eran los grupos de control y se sometieron a dos tandas de diez días con inyecciones diarias de 5 ml de solución salina fisiológica, con un período de descanso de tres semanas entre las tandas de diez días.

Un día después de la segunda tanda de inyecciones, los animales se anestesiaron con anestesia gaseosa ligera y se extirpó el riñón derecho de cada animal mediante una incisión en la parte posterior. Se puso una grapa oclusiva en la arteria y la vena renal restante para exponer el riñón izquierdo a isquemia transitoria durante 60 minutos. Se quitó luego la grapa para permitir la reperfusión del riñón por el flujo sanguíneo normal.

Los animales se observaron durante seis días después del procedimiento de isquemia y luego se sacrificaron. El riñón isquémico de cada animal se extirpó quirúrgicamente y se dividió en dos partes. Una parte se mantuvo congelada a -80ºC y la otra parte se puso en formalina al 10% para realizar estudios histopatológicos de rutina e inmunológicos.

Se midió el potencial de la membrana mitocondrial en células tubulares proximales aisladas de los riñones isquémicos y de control, en el momento de quitar el riñón de control y después del sacrificio. A tal efecto, se purificaron tubos proximales de riñón de perro a partir de córtex de riñón normal or isquémico, mediante el procedimiento del tratamiento con colagenasa descrito por Marshansky et. al., "Isolation of heavy endosomes from dog proximal tubes in suspensión" (Aislamiento de endosomas pesados de tubos proximales de perro en suspensión), J. Membr. Biol. 153(1), 59-73, 1996. Se aislaron mitocondrias renales en suspensión por centrifugación diferencial (véase Marshansky, "Organic hidroperoxides at high concentrations cause energization and activation of AATP síntesis in mitochondria", (Los hidroperóxidos orgánicos a concentraciones elevadas causan la energización y la activación de la síntesis AATP en mitocondrias), J. Biol..Chem. 264(7), 3670-3673. 1989 después de homogenizar el tejido en un amortiguador (buffer) que contenía 250 mM de sucrosa, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,5), y 250 \muM EDTA. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos. Las mitocondrias se lavaron con el amortiguador (buffer) de sucrosa / HEPES sin

\hbox{EDTA.}

Se midió el potencial de la membrana mitocondrial según lo descrito por Kroemer, G., Zamzam, N. y Susin, S.A., "Mitochondrial control of apoptosis", (Control mitocondrial de la apoptosis) (Revisión) Immunology today (1997) v.18, p 4-51; - con JC-1 - véase Salvioli et., al,, "JC-1, pero no DiOC6(3) o rodamina 123, es una sonda fluorescente fiable para evaluar cambios delta psi en células intactas: implicaciones para estudios de la funcionalidad mitocondrial durante la apoptosis", FEBS Letters 411 (1), 77-82, 1987. La fluorescencia JC-1 en la suspensión de mitocondria purificada de riñones normales e isquémicos se controló y siguió de forma continua en un espectro fluorímetro Deltascan modelo RFM-2001(Photon Technology International, South Brunswick, NJ). La longitud de onda de excitación era de 490 nm (anchura de corte 2 nm) y la longitud de onda de emisión era de 590 nm (anchura de corte 4 nm) Las señales se registraron utilizando software Felix® (versión 1.1). Todas las medidas se realizaron agitando continuamente a 37ºC. El amortiguador de incubación para medir el potencial de la membrana mitocondrial contenía 200 mM de sucrosa, 5 mM MgCl_{2}, 5 mM KH_{2}PO_{4}, 0,1 \muM de JC-1 y 30 Mn HEPES-Tris (pH 7.5). Las concentraciones del sustrato y los inhibidores fueron de 10 mM de succinato, 0,1 \muM de rotenona con o sin 0,1 \muM FCCP. El potencial de la membrana mitocondrial tubular proximal se estimó en el riñón derecho (de control) antes de la isquemia y en el riñón izquierdo (isquémico) después de sacrificar los perros el día 6 siguiente a la isquemia y se estimó como diferencia de la fluorescencia JC-1 después de desacoplar las mitocondrias con FCCP según se muestra en la figura 1A adjunta. Para cada medida se utilizó 50 µg de proteína de material purificado.

La fluorescencia JC-1 es proporcional al potencial de membrana mitocondrial. El riñón contralateral nefrectomizado sirvió de control. Como se puede ver claramente en la figura 1B, el proceso-tratamiento de la invención no modificó el potencial de la membrana del riñón derecho de control no isquémico (p = 0,445 para tratado frente a salino). Sin embargo, el riñón isquémico en los animales inyectados con solución salina mostraron una fluorescencia notablemente inferior (p<0,05) comparado con el riñón de control. El tratamiento de estrés según la invención evitó el desacoplamiento de las mitocondrias durante la isquemia/reperfusión y el potencial de membrana no mostró ninguna diferencia notable (p=0,244) entre los riñones isquémicos y de control. Este parámetro permaneció notablemente elevado (p=0,0006 frente a perros inyectados con solución salina) en los riñones isquémicos de perros tratados previamente según el proceso de la invención durante por lo menos 6 días tras la reperfusión.

Estos resultados indican que el proceso de la invención protege el riñón contra la apoptosis y/o acelera la recuperación a nivel mitocondrial. Por lo tanto, el proceso de la invención resulta indicado para pre-acondicionar las células, tejidos y órganos de un cuerpo mamífero contra factores que se puedan encontrar ulteriormente, que normalmente aceleran la apoptosis.

Específicamente, la conservación del potencial de membrana mitocondrial pone de manifiesto la capacidad de la terapia para proteger las mitocondrias y pre-acondicionar las células contra la apoptosis.

Ejemplo 2

Se trató un grupo de 12 ratas machos SHR con inyecciones de sangre recogida y estresada según lo descrito en el ejemplo 1 anterior o, en animales de control, con inyecciones de solución salina. Como la sangre de todos los animales de este linaje genético es idéntica, se trató la sangre de un animal de este mismo linaje mediante el proceso de la invención, para administrarla al animal de prueba. La sangre se trató con citrato sódico como anticoagulante y se colocó en un contenedor estéril. Recibieron inyecciones de 150 ml de sangre estresada en los días -14 y -13, seguido de un período de descanso de 11 días y una tercera inyección el día antes de la cirugía isquémica, o inyecciones en paralelo con la solución salina. El día de la cirugía, las ratas se anestesiaron con flurano ligero y se extirpó el riñón derecho mediante una incisión abdominal-central. El riñón izquierdo se sometió entonces a isquemia transitoria con oclusión de la arteria y vena renal izquierda utilizando una micro-grapa. La piel se cerró entonces temporalmente. A los 60 minutos de la oclusión, se quitó la grapa y se cerró la herida con una sutura. Los animales se sacrificaron 12 horas después de la reperfusión.

Los riñones isquémicos y no isquémicos de los animales de prueba se quitaron y se sometieron a pruebas de "ADN ladder". La fragmentación oligonucleosomal de ADN en 180 a 200 pares de bases es un patrón específico que aparece como ladder después de la electrofóresis en gel agarosa, en diversos órganos sometidos a apoptosis. Para evaluar el grado de fragmentación de ADN en el cortex del riñón, se pesó una muestra de córtex de riñón pulverizada y se extrajo el ADN del tejido total mediante el procedimiento de fenol-cloroformo tras la digestión del tejido con proteínas K y RnasaA en presencia de EDTA. Se marcó un \mug de ADN extraído por análisis enzimático utilizando deoxinucleotidil transferasa terminal con P^{32}. dCTP (véase Teiger et.al.,, "Apoptosis in pressure overload induced heart hypertrophy in the rat"(Apoptosis en hipertrofia cardiaca en la rata inducida por sobrecarga de presión), J. Clin. Invest. 97, 2891-2897, 1996). Se cargaron cantidades cada vez mayores de ADN radiomarcado sobre geles de agarosa 1,5%. Tras la electrofóresis, se transfirió el ADN a membranas de nylon (Hybond) y se cuantificó la radiactividad asociada con 150 a 1500 bp fragmentos ADN en un Phosphorlomager (Molecular Dynamics). Se sacó una línea de regresión para cada muestra para la radiactividad como función del ADN cargado en el gel (véase deBlois et.,al., "Smooth muscle cell apoptosis during vascular regression in spontaneously hypertensive rast", (Apoptosis celular músculo liso durante la regresión vascular en ratas espontáneamente hipertensas) Hypertension 29, 340-349, 1997). La pendiente de la línea de regresión lineal sirvió de índice de fragmentación del ADN (cpm/píxel por \mug ADN).

Los resultados de los riñones con reperfusión isquémica (I/R) y de riñones normales no I/R, todos ellos de animales que no recibieron inyecciones de sangre estresada, se muestran gráficamente en la figura 2 - pendiente de las líneas de regresión para las diversas muestras (eje vertical) con respecto al tiempo después de iniciar la reperfusión. El laddering del ADN, indicativo de la fragmentación del ADN, aumentó claramente en el cortex del riñón isquémico comparado con el órgano no isquémico contralateral y el máximo alcanzado a las 12 horas volvió a valores casi basales a las 48 horas. Se eligió por lo tanto como tiempo, 12 horas, para estudiar el efecto de la sangre estresada de la invención en la apoptosis renal causada por isquemia.

La figura 3A adjunta representa el gel de electrofóresis del ADN fragmentado, en la gama 150-1550 bp, radiomarcado, según se describe para fijar marcadores de radioactividad a los fragmentos de ADN. La huella S procede de ADN de riñones de animales que recibieron inyecciones salinas antes de la reperfusión-isquemia del riñón, y la huella V se debe al ADN de riñones de animales que recibieron inyecciones de la sangre estresada antes de la reperfusión-isquemia del riñón. La figura muestra que 60 minutos de isquemia renal produjeron una clara acumulación de ADN fragmentado en ambos grupos de ratas a las 12 horas, aunque el nivel de este parámetro era notablemente inferior (p<0,05) en los animales que recibieron la sangre tratada. La figura 3B cuantifica la cantidad de radiación de las muestras, en unidades arbitrarias y muestra que la fragmentación-laddering de ADN se produce tanto en las muestras S como V como resultado de la reperfusión/isquemia, aunque la magnitud está notablemente reducida en las muestras V si se compara con las muestras S. Los resultados presentados en la figura 3B constituyen la media de seis animales en cada caso.

Estos resultados confirman que el efecto citoprotector de la administración de sangre estresada según la invención en heridas de reperfusión renal supone la inhibición de la apoptosis temprana o tardía.

Ejemplo 3 Estudios cardiacos-protección de órganos quitados

Los experimentos se realizaron en ratas, más específicamente en ratas macho Sprague-Dawley. para demostrar la protección de los órganos quitados, privados de la sangre del donante frente a una agresión isquémica sostenida como se observa típicamente con el protocolo de pre-acondicionamiento isquémico clásico (K.Przylenk y R.A. Kloner, Progress in Cardiovasc. Dis. Vol 40: 517-574, 1998).

Se utilizaron dos grupos de 4 ratas, de 270-285 g de peso corporal. Un grupo de ratas (n=4) recibió una inyección de solución salina y sirvió de control. El otro grupo de ratas recibió sangre tratada mediante un protocolo según la invención. Como la sangre de todos los animales de esta estirpe genética es idéntica, se trató la sangre de un animal de esta misma estirpe mediante el proceso de la invención para su administración al animal de prueba. La sangre se trató con citrato sódico como anticoagulante, y se colocó en un contenedor estéril. Se calentó y sometió simultáneamente al factor estresante UV así como al oxígeno/ozono en las cantidades y en las condiciones indicadas en el ejemplo 1 anterior.

Cada animal de prueba recibió el día 1 una inyección de 150 \mul de la sangre tratada, seguido de un período de descanso de 10 días. Entonces, cada animal recibió una inyección de 150 \mul de sangre tratada los días 12 y 13. Cada animal de control recibió inyecciones similares, siguiendo el mismo programa, de solución salina fisiológica. Los animales se sacrificaron el día 14.

Se quitó el corazón de cada animal y se realizó la perfusión ex vivo según el modo Langendorf con amortiguador (buffer) no recirculante Krebs

\hbox{Henseleit}

gaseado con 95% de oxígeno /5% de dióxido de carbono pH 7.4, que contenía glucosa como sustrato energético. El corazón se sometió a un ataque de reperfusión-isquemia tal como se suele utilizar en los estudios de pre-acondicionamiento isquémico cardiaco (véase por ejemplo R.T. Rowland et. al., Am.J.Physiol, 272, H2708-H2715; E.O. Weselcouth et. Al., Cardiovasc. Res. 29; 126-132, 197). Después de 20 minutos de período de equilibrio bajo normoxia, se sometió brevemente el corazón a una isquemia global durante 25 minutos a 37ºC. Seguidamente se procedió a una reperfusión durante 45 minutos, de la forma siguiente: (i) para los 25 minutos iniciales de reperfusión, se permitió que el corazón latiera espontáneamente, (ii) se reguló el paso utilizando unos alambres de regulación (pacing wires) fijados a la aurícula derecha para lograr un ritmo de 300 latidos/minutos.

La figura 4 indica los datos de medición del protocolo de perfusión para el lactato dehidrogenasa liberado en el perfusado efluyente, índice de necrosis celular, según se evaluó en un análisis enzimático standard. En la figura 4, la curva basada en los puntos de forma triangular se tomó de órganos de animales que recibieron sangre tratada con factores estresantes según lo indicado. La curva basada en puntos en forma de cuadrado se desprende de los órganos de los animales de control que recibieron solución salina. La figura 4 indica una notable reducción en la liberación de LDH (liberación acumulada de LDH durante el período de reperfusión de 45 minutos; p<0,05; tratada frente a salina), indicativa de necrosis celular notablemente reducida en los órganos tratados con factor estresante según lo descrito.

Claims (17)

1. Utilización de una muestra de sangre del cuerpo de un mamífero, que ha sido tomada del mismo, y se hace reaccionar ex vivo con por lo menos un factor estresante elegido dentro del grupo formado por: una temperatura por encima o por debajo de la temperatura del cuerpo, luz ultravioleta, y entorno oxidativo, para la fabricación de un medicamento que se utiliza para aliviar o proteger contra los síntomas de una alteración, que presenta elevadas tasas de apoptosis (muerte celular programada) o necrosis en un cuerpo de mamífero, eligiéndose dicha alteración dentro del grupo de: alteración por exposición a la radiación, exposición a agentes químicos y por ingestión, trastornos neurodegenerativos y por traumas físicos, mediante la reducción de la tasa de predisposición a la apoptosis o necrosis de tejidos y órganos del cuerpo de un mamífero.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la muestra de sangre que se hace reaccionar ex vivo tiene un volumen de 0,1-100 ml.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que los tres factores estresantes mencionados se aplican simultáneamente a la muestra.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que dichos factores estresantes se aplican durante un período de tiempo de 0,5 a 60 minutos.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que dichos factores estresantes se aplican durante un período de tiempo de 2-5 minutos.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el factor estresante de temperatura es una temperatura que oscila entre -5º-55ºC.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que el factor estresante de temperatura es una temperatura comprendida entre 40º-50ºC.

8. Utilización según cualquier de las reivindicaciones anteriores, en la que el factor estresante de entorno oxidativo es un entorno oxidativo que comprende una mezcla de ozono y de oxígeno de calidad médica, introducida por borboteo a través de la muestra de sangre.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que la mezcla gaseosa tiene un contenido de ozono de
10-100 \mug por ml.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el factor estresante de luz ultravioleta es luz ultravioleta en la banda UV-O.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la fabricación de un medicamento que se utiliza para aliviar o proteger contra los síntomas de una enfermedad neurodegenerativa.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson, demencia senil o enfermedad de Alzheimer.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la alteración médica es una alteración por exposición a la radiación.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la alteración es una alteración por exposición a radiación ionizante o enfermedad de la piel por exposición a la luz ultravioleta.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la alteración médica es una alteración debida a la exposición a agentes químicos o a la ingestión de agentes químicos; intoxicación alimentaria por toxinas bacterianas; sobredosis de drogas y efectos secundarios; alteraciones por la exposición a gases enervantes y gases mostaza; trastornos hepáticos debidos a productos químicos y toxinas; trastornos renales debidos a la ingestión de antibióticos aminoglucósidos; trastornos por colorantes de contraste radiográfico o nefrotoxicidad por ciclosporina, trastornos hematopoyéticos y trastornos de inmunodeficiencia por drogas o supresión de médula ósea causada por toxina; infecciones por toxinas bacterianas; exposición al ozono; exposición a disolventes o los efectos de inmunosupresores.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el trastorno médico es un trastorno por trauma físico.

17. Utilización según la reivindicación 16, en la que el trauma físico es el resultado de una herida, quemadura, pérdida de sangre o accidente físico.