ES2202297T3 - Proteinas antigenicas de n. meningitidis reprimibles con hierro relacionadas con la familia de toxinas hemolisina. - Google Patents

Abstract

UN POLIPEPTIDO ANTIGENICO AISLADO COMPRENDE UN SEGMENTO QUE POSEE AL MENOS CINCUENTA RESIDUOS DE AMINOACIDO. LA SECUENCIA DE AMINOACIDO DEL SEGMENTO ESTA PRESENTE EN N. MENINGITIDIS, Y ES DIFERENTE, AUNQUE BASICAMENTE HOMOLOGA, DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDO DE UN SEGMENTO DE UN MIEMBRO DE LA FAMILIA HEMOLISINA DE TOXINAS.

Description

Proteínas antigénicas de N. meningitidis reprimibles con hierro relacionadas con la familia de toxinas hemolisina.

La invención se refiere a polipéptidos antigénicos aislados de Neisseria meningitidis, anticuerpos contra los polipéptidos, vacunas que contienen los polipéptidos y al ADN que codifica los polipéptidos. Los polipéptidos son miembros de la familia de toxinas hemolisina, de las cuales la alfa-hemolisina de E. Coli es un miembro típico.

La patogéneis bacteriana es un proceso complicado y a menudo no muy comprendido. Muchas bacterias patogénicas segregan toxinas que impiden el metabolismo y la función de células animales. Diversas clases de moléculas constituyen tales toxinas.

Un ejemplo de toxina proteica se encuentra en las cepas patogénicas de E. Coli que causan infecciones extra-intestinales en humanos. Tales infecciones se caracterizan por la lisis de eritrocitos de mamíferos. La actividad hemolítica se debe a una clase de toxinas conocidas como hemolisina. La clase incluye alfa-hemolisina y beta-hemolisina; Véase Welch et al, Infection and Inmunity 42, 178 - 186 (1983).

Otra toxina proteica es la adenilato ciclasa, que se encuentra en Bordetella Pertussis y Bacillus anthracis, y que impide la función de fagocitos profesionales. Estas bacterias son responsables de la tos ferina y del carbunco, respectivamente.

Una tercera clase de toxinas proteicas de bacterias patogénicas son las leucotoxinas, que se encuentran en Actinobacillus actinomycetemcomitans, que el agente etiológico de la periodontitis juvenil localizada, y Pasteurella haemolytica, que mata los leucocitos bovinos.

Curiosamente, la adenilato ciclasa de B. pertussis y B. anthracis y las leucotoxinas de A. actinomycetemcomitans y P. haemolytica tienen secuencias de aminoácidos que muestran una homología comparable con la de la alfa-hemolisina de E. Coli; Véase Glaser et al, Molecular Biology 2, 19-30 (1988) y Kolodrubetx et al, Infection and Inmunity 57, 1465 - 1469 (1989). Aparentemente, hay una clase de toxinas que se encuentra en diversos géneros de bacterias. La secuencia de aminoácidos de esta familia de citotoxinas se caracteriza por un motivo de nueve aminoácidos muy repetido, LxGGxGNDx, donde x representa cualquier aminoácido. Para los propósitos de esta memoria descriptiva, se hará referencia a esta familia de toxinas como la familia de toxinas hemolisina.

Los especialistas en la técnica apreciarán que la "familia de toxinas hemolisina" es un nombre genérico, y no implica que todos los miembros sean hemolíticos, o por la misma razón, citotóxicos, aunque la mayoría lo sean. La pertenencia a la familia depende de la existencia de homología en la secuencia de aminoácidos, como se ha descrito anteriormente. Además de las mencionadas anteriormente, también se han encontrado proteínas homólogas en Serratia y Proteus, aunque no se sabe con certeza si estos miembros de la familia hemolisina son, de hecho, citotóxicos.

Se conoce poco sobre la intrigante, y a veces mortal, bacteria Neisseria meningitidis, que es responsable de la meningitis vertebral y el choque séptico. Paterson ha revisado la N. meningitidis y las enfermedades que causa en "Neisseria meningitidis and Meningococcal Disease" en Biologic and Clinical Basis of Infectious Diseases, W.B. Saunders Company, Capítulo 43 (1980).

El genotipo de N. meningitidis es muy similar al de N. gonorrohoeae aunque el fenotipo es bastante diferente. A menudo es importante distinguir entre estas especies de Neisseria. La especiación inmunológica es a menudo difícil debido a la falta de cantidades suficientes de antígenos específicos de grupo.

N. meningitidis existe en diversos serotipos, la prevalencia de los cuales cambia con el tiempo y el lugar. Los serotipos incluyen A, B, C, D, X, Y, Z, 29-E y W-135.

Los tres constituyentes antigénicos y/o tóxicos conocidos más importantes de las infecciones por N. meningitidis son un polisacárido capsular, un complejo de pared celular lipopolisacárido-endotoxina y una proteína específica de Neisseria. El polisacárido capsular en un factor de virulencia importante que permite a los meningococos resistir la fagocitosis por neutrófilos segmentados.

Las vacunas que contienen polisacáridos de meningococos se usan contra algunos de los serotipos de N. meningitidis. Por ejemplo, se consigue la protección contra los serotipos A, C, Y y W-135 con vacunas de polisacáridos. Sin embargo, tales vacunas no son adecuadas para la protección general contra la infección de N. meningitidis. Por ejemplo, la respuesta inmune de los serotipos A y C a las vacunas de polisacáridos es baja, especialmente en niños de menos de dos años, quienes constituyen el grupo más susceptible a las enfermedades meningocócicas. Además, no existe una vacuna eficaz para el serotipo B, posiblemente porque el polisacárido capsular del grupo B es relativamente no inmunogénico.

Es evidente que se necesita aprender mucho sobre la patología de N. meningitidis. Posiblemente, una mayor comprensión de este patógeno llevará al descubrimiento de vacunas útiles en general para más serotipos de las que están disponibles actualmente.

Por ejemplo, no se sabe porque la colonización del tracto respiratorio de la N. meningitidis progresa a una enfermedad meningocócica aguda y algunas veces muerte en un individuo ocasional, mientras que no hace lo mismo en la gran mayoría de los que tienen aparentemente un riesgo comparable. Ni la cantidad de polisacárido capsular ni la de complejo lipopolisacárido-endotoxina están relacionadas con la gravedad de la enfermedad. Se ha propuesto como explicación la exposición a microorganismos con constituyentes antigénicos que reaccionan de forma cruzada con los polisacáridos capsulares de N. meningitidis; véase Paterson, id.

También son posibles otras explicaciones. Por ejemplo, no puede descartarse la inmunidad cruzada a antígenos distintos de los polisacáridos capsulares. Es interesante apreciar en este sentido que no hay toxinas proteicas asociadas con N. meningitidis. Una razón para esto puede ser que la N. meningitidis se cultiva a menudo in vitro bajo condiciones ricas en hierro que no existen en un huésped humano. Se sabe, sin embargo, que algunas proteínas meningocócicas se reprimen con hierro y no se observan in vitro, aunque si se expresan in vivo. Véase Black et al., Infection and Immunity 54, 710-713 (1986) y Brener et al., ibid 33, 59-66 (1981). Además, se conoce una proteína de la membrana exterior de 70Da regulada con hierro (FeRP-70) de Neisseria meningitidis; Ala'Aldeen et al. (J. Med. Microbiol., vol. 32, Mayo, 1990, p. 275-281).

Un problema abordado por la presente invención es el descubrimiento de polipéptidos antigénicos y secuencias de ADN que son capaces de identificar N. meningitidis y distinguirla de N. gonorroeae. Otro problema abordado por la presente invención es el descubrimiento de proteínas capaces de producir anticuerpos eficaces contra las enfermedades meningocócicas.

Sumario de la invención

Se han resuelto éstos y otros problemas, como se hará evidente para los expertos en la técnica, proporcionando un polipéptido antigénico, esencialmente puro, que tiene al menos 900 aminoácidos que comprenden un segmento de al menos 50 restos aminoacídicos y que tienen una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, en donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

Una realización preferida de la presente invención es un polipéptido como se ha descrito anteriormente, donde el segmento tiene al menos 100 restos aminoacídicos, y más preferiblemente, donde el segmento tiene al menos 200 restos aminoacídicos. También, una realización preferida de la presente invención es un polipéptido como se ha descrito anteriormente, donde la secuencia de aminoácidos es inmunogénica. Es más preferible un polipéptido como se ha descrito anteriormente, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la secuencia mostrada en la Figura 2. Adicionalmente, una realización de la presente invención proporciona un polipéptido como se ha descrito anteriormente, donde los anticuerpos contra el polipéptido reaccionan de forma cruzada con al menos otro miembro de la familia de toxinas hemolisina de otro género de bacterias. Los otros géneros de bacterias incluyen preferiblemente Escherichia, Serratia, Pasteurella, Proteus, Actinobacillus, y Bordetella. Mas preferiblemente, los otros miembros de la familia de toxinas hemolisina comprenden alfa-hemolisina de Escherichia coli; leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans; leucotoxina de Pasteurella heamolytica; adenilato ciclasa de Bordetella pertussis y adenilato ciclasa de Bacillus anthraces. Más preferiblemente el otro miembro de la familia de toxinas hemolisina es alfa-hemolisina de E. Coli.

Una realización más de la presente invención proporciona un método para producir un antígeno útil en la protección de un mamífero de una infección por N. meningitidis que comprende las etapas de (a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) hacer el polipéptido no tóxico para los mamíferos. Preferiblemente, una realización proporciona un método de producir un antígeno preferiblemente como se ha descrito anteriormente, donde la secuencia de aminoácidos está presente en un polipéptido encontrado en N. meningitidis. Más preferiblemente, una realización proporciona un método para producir un antígeno preferiblemente como se ha descrito anteriormente, donde el mamífero es un ser humano.

Otra realización de la invención es un método para producir una composición de vacuna útil en la protección de un mamífero de la infección por N. meningitidis que comprende las etapas de: (a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) hacer el polipéptido no tóxico para los mamíferos, y (c) combinar el polipéptido no tóxico con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida el polipéptido se aísla de N. meningitidis. En otra realización preferida el mamífero es un ser humano.

Una realización preferida de la invención proporciona una composición de vacuna capaz de inmunizar mamíferos contra infecciones de N. meningitidis, que comprende: (a) un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente la invención proporciona una composición de vacuna como se ha descrito anteriormente, donde el polipéptido está presente en N. meningitidis. Más preferiblemente el polipéptido está presente es las membranas externas de N. meningitidis. Otra realización preferida es una composición de vacuna como se ha explicado anteriormente, donde el mamífero es un ser humano.

Además, otra realización de la presente invención son anticuerpos monoclonales contra un polipéptido que tienen al menos 900 aminoácidos que comprenden un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos y que tiene una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

Otra realización de la presente invención es una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 900 aminoácidos que comprenden un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos y que tiene una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

Una realización de la presente invención es un método para detectar la presencia de anticuerpos específicos para un miembro de la familia de toxinas hemolisina en una muestra que comprende las etapas de: (a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, y donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) determinar si el polipéptido reconoce un anticuerpo en la muestra.

Otra realización más de la presente invención es un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que comprende una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo. Una realización preferida en un polipéptido como se ha explicado anteriormente, donde el segmento tiene al menos 100 restos aminoacídicos, y más preferiblemente, donde el segmento tiene al menos 200 restos aminoacídicos. También, una realización preferida es el polipéptido como se ha explicado anteriormente, donde la secuencia de aminoácidos antigénica es inmunogénica. Es más preferible un polipéptido como se ha descrito anteriormente, donde los anticuerpos contra el polipéptido reaccionan de forma cruzada con al menos otro miembro de la familia de toxinas hemolisina de otro género de bacterias. Los otros géneros de bacterias incluyen preferiblemente Escherichia, Serratia, Pasteurella, Proteus, Actinobacillus, y Bordetella. Mas preferiblemente, los otros miembros de la familia de toxinas hemolisina comprenden alfa-hemolisina de Escherichia coli; leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans; leucotoxina de Pasteurella heamolytica; adenilato ciclasa de Bordetella pertussis y adenilato ciclasa de Bacillus anthraces. Más preferiblemente el otro miembro de la familia de toxinas hemolisina es alfa- hemolisina de E. Coli.

Otra realización de la presente invención es un método para producir un antígeno útil en la protección de un mamífero de la infección por N. meningitidis que comprende las etapas de: (a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) hacer el polipéptido o fragmento no tóxico para los mamíferos. Una realización preferida es un método como se ha explicado anteriormente, donde la secuencia de aminoácidos está presente en un polipéptido encontrado en N. meningitidis.

Otra realización más de la presente invención proporciona también un método para producir una composición de vacuna útil en la protección de un mamífero de una infección de N. meningitidis que comprende las etapas de: (a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) hacer que el polipéptido no sea tóxico para los mamíferos, y (c) combinar el polipéptido no tóxico con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, el polipéptido se aísla de N. meningitidis.

Una composición de vacuna capaz de inmunizar mamíferos contra infecciones de N. meningitidis, comprendiendo la composición de vacuna: (a) un polipéptido inmunogénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, el polipéptido está presente en N. meningitidis. Más preferiblemente el polipéptido está presente es las membranas externas de N. meningitidis. Otra realización preferida el mamífero es un ser humano.

Una realización más de la presente invención son anticuerpos monoclonales contra un polipéptido esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene un segmento con una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos consiste en al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

Otra realización de la presente invención es una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene un segmento con una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos consiste en al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

También, una realización de la presente invención es un método para detectar la presencia de N. meningitidis en una muestra que comprende las etapas de: (a) preparar una prueba que reconoce un polipéptido que es un miembro de la familia de toxinas hemolisina o un fragmento del mismo, o una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido o fragmento donde el polipéptido que es miembro de la familia de toxinas hemolisina o la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido está presente en N. meningitidis ; y (b) determinar si la prueba reconoce la N. meningitidis en la muestra. En una realización preferida la prueba es un anticuerpo. En una realización más preferida el anticuerpo es monoclonal. En otra realización preferida la sonda es una molécula de ácido nucleico. Otra realización más de la presente invención es un método para detectar la presencia de anticuerpos específica para un miembro de la familia de toxinas hemolisina en una muestra que comprende las etapas de: (a) preparar un polipéptido esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos y donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, que tiene un segmento con una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1, G en la posición 3, G en la posición 4, G en la posición 6, N en la posición 7, D en la posición 8, y X en las posiciones 2, 5, y 9, donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo; y (b) determinar si el polipéptido reconoce un anticuerpo en la muestra, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

La invención incluye además fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, anticuerpos contra tales polipéptidos, secuencias de nucleótidos que codifican tales polipéptidos, y vacunas que contienen tales polipéptidos.

Descripción detallada de la invención El segmento de Polipéptido

Se ha descubierto inesperadamente que cuando N. meningitidis crece en condiciones de limitación de hierro, se expresa un polipéptido que comprende un segmento con una secuencia de aminoácidos que es diferente de, pero sustancialmente homóloga con, un segmento de la familia de toxinas hemolisina. Los anticuerpos monoclonales contra el polipéptido encontrados en N. meningitidis tales como A4.85 (véase a continuación), reaccionan de forma cruzada en transferencias Western con alfa-hemolisina (HlyA) producida por el gen hlyA en E. Coli y adenilato ciclasa producida en Bordetella pertussis.

La familia de toxinas hemolisina, como se usa en este documento, incluye los polipéptidos homólogos, citotóxicos, o proteolíticos encontrados en las bacterias del genero Escherichia, Serratia, Pasteurella, Proteus, Actinobacillus, y Bordetella. La familia incluye específicamente alfa-hemolisina, leucotoxina y adenilato ciclasa.

Las determinaciones de si dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas se basan, para el propósito de esta memoria descriptiva, en búsquedas FASTA de acuerdo con Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988). Una secuencia sustancialmente homóloga de acuerdo con la presente invención tiene al menos un 15% de igualdad, preferiblemente al menos un 20% de igualdad, y más preferiblemente, al menos un 25% de igualdad en la secuencia de aminoácidos cuando se determina de acuerdo con el método de Pearson y Lipman.

El polipéptido de la presente invención no necesita contener un segmento que sea idéntico a otros miembros de la familia de toxinas hemolisina. La identidad de acuerdo con el método FASTA puede ser tan alta como 90% o 95%, pero cuando se aísla de N. meningitidis normalmente no muestra identidades mayores de 40% o 50%.

El tamaño del polipéptido no es crítico, mientras contenga al menos 900 aminoácidos y contenga un segmento que sea sustancialmente homólogo a un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina. El segmento sustancialmente homólogo tiene al menos 50 restos aminoacídicos, preferiblemente al menos 100 restos aminoacídicos, y más preferiblemente al menos 200 restos aminoácido. En esta memoria descriptiva, la palabra "polipéptido" se considerará indistinguible de palabras como "proteína" y "péptido".

El segmento del polipéptido meningocócico que es sustancialmente homólogo al segmento de la familia de toxinas hemolisina contiene el mismo motivo de nueve aminoácidos que es característico de todos los miembros de la familia de toxinas hemolisina. La secuencia de consenso es LxGGxDNFx, de aquí en adelante secuencia consenso de hemolisina. El aminoácido representado por x puede ser cualquier aminoácido sencillo.

El polipéptido de la invención puede definirse en términos de la secuencia de consenso de la hemolisina asó como el patrón de homología sustancial descrito anteriormente. Para este propósito, una secuencia de nueve aminoácidos se considera una secuencia de consenso de hemolisina si contiene al menos cuatro, preferiblemente al menos cinco, y más preferiblemente los seis de los restos aminoacídicos definidos específicamente (es decir L-GG-GND-) en la posición correcta.

En referencia a la Figura 2, que como se describe a continuación, es un polipéptido parcial aislado de N. meningitidis, el segmento homólogo comprende tres tramos de repeticiones múltiples de la secuencia de consenso de hemolisina, es decir, entre los aminoácidos 486 y 512, entre los aminoácidos 623 y 712, y del 823 al final. En la Figura 2 hay 21 secuencias consenso completas.

Los polipéptidos de la presente invención contienen segmentos que están presentes en N. meningitidis y que comprenden al menos tres, preferiblemente al menos cinco, y más preferiblemente al menos 10 secuencias de consenso de hemolisina. Los polipéptidos de la invención pueden tener tantos como al menos 21 secuencias de consenso de hemolisina.

El polipéptido se aísla, lo que significa que está esencialmente libre de otras proteínas, especialmente de otras proteínas de N. meningitidis. Esencialmente libre de otras proteínas significa que es al menos 90% ,preferiblemente al menos 95%, y más preferiblemente al menos 98% libre de otras proteínas.

Preferiblemente, el polipéptido es esencialmente puro, lo que significa que el polipéptido no esta solo libre de otras proteínas, sino también de otros materiales usados en el aislamiento e identificación del polipéptido, tales como, por ejemplo, dodecilsulfato sódico y otros detergentes así como papel de nitrocelulosa. El polipéptido es al menos 90% libre, preferiblemente al menos 95% libre, y más preferiblemente, al menos 98% de tales materiales.

El polipéptido de la presente invención es antigénico, lo que significa que el polipéptido induce anticuerpos específicos en un mamífero. Preferiblemente, el polipéptido es inmunogénico.

El polipéptido puede ser el polipéptido entero como existe en N. meningitidis o un fragmento antigénico, preferiblemente inmunogénico, del polipéptido completo. Los fragmentos antigénicos y/o inmunogénicos de polipéptidos antigénicos y/o inmunogénicos pueden identificarse con métodos conocidos en la técnica. Normalmente el fragmento antigénico comprenderá al menos una porción del segmento que tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente de, pero homóloga, a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que es un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o comprenderá al menos una porción del segmento que tiene al menos tres, preferiblemente al menos cinco, y más preferiblemente al menos diez secuencias consenso de hemolisina.

Preparación del Polipéptido

Los polipéptidos de la presente invención se preparan por métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen aislar el polipéptido directamente de la N. meningitidis; aislar o sintetizar el ADN que codifica el polipéptido y usar el ADN para producir el polipéptido recombinante; y sintetizar el polipéptido a partir de aminoácidos individuales.

El polipéptido o el ADN que codifica el polipéptido pueden aislarse de cualquier serotipo de N. meningitidis. Tales serotipos incluyen A, B, C, D, X, Y, Z, 29-E y W-135.

Hay fuentes adecuadas disponbiles de las que se puede aislar cepas meningocócicas del as cuales puede aislarse el polipéptido y el ADN que lo codifica. Tales fuentes incluyen la American Type Culture Type (Bethesda, MD) y Neisseria Repository (NAMRU, University of California, Berkeley). Cepas adecuadas incluyen FAM18 y FAM20 (Dyer et al, Microbial Pathogenesis, 3, 351-363 (1987)), y FAM19. Se describen más cepas meningocócicas en Schryvers and Morris en Infection and Immunity 56, 1144-1149 (1988).

Los polipéptidos pueden aislarse directamente de N. meningitidis mediante métodos conocidos en la técnica. Primera, se aíslan y se preparan las membranas externas meningocócicas mediante los métodos conocidos. Los métodos descritos por West y Sparling en Infect. Immun. 47, 388-392 (1985) y por Schryvers and Morris en Infect. Immun. 56, 1144-1149 (1988) son adecuados.

Las proteínas de membrana aislada pueden solubilizarse mediante métodos conocidos, tales como la adición de detergentes. Los detergentes usados normalmente incluyen Octil-B-Glucoside, Chaps, Zwittergent 3,14 o Triton-X. El uso de detergentes para mejorar la solubilidad de las proteínas de membrana se describe en Jones et al. en Finby, Solubilization and Reconstitution of Membrane Proteins: A Practical Approach, IRL Press (1986), Helenius et al. en Biochim. Biophys. Acta 415, 29 (1975), y Hjelmeland y Chrambach, Methods Enzymol. 104, 305 (1984).

Las proteínas se aíslan de la fracción de membrana solubilizada mediante métodos patrón. Algunos métodos adecuados incluyen la precipitación y los protocolos líquidos cromatográficos tales como intercambio iónico, interacción hidrófoba y filtración por gel. Véase por ejemplo, Methods Enzymol. 182 (Guide to Protein Chemistry, Deutscher, Ed. Section VII) 309 (1990) y Scopes, Protein Purification,. Springer-Verlag, New York (1987).

Alternativamente, se obtiene el material purificado separando la proteína en geles de SDS-PAGE preparativa, cortando la banda de interés y electroeluyendo en la matriz de poliacrilamida por los métodos conocidos en la técnica. El detergente SDS se retira de la proteína por métodos conocidos, tales como diálisis o el uso de una columna adecuada, tal como una columna Extracti- Gel de Pierce.

También puede producirse el polipéptido aislando el ADN que codifica el polipéptido; clonando el ADN en un hospedador adecuado; expresando el ADN en el hospedador; y recogiendo el polipéptido.

La primera codificación de ADN del polipéptido de la presente invención se aisló mediante un método de inmunoselección. Tales métodos se describen en Maniatis et al en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Brevemente, los anticuerpos monoclonales se generaron contra proteínas de la membrana exterior tratadas con hierro de la cepa de N. meningitidis FAM20. Un anticuerpo monoclonal, A4.85 reconoció varias proteínas reguladas con hierro en transferencias Western de las membranas externas de FAM20. Se usó A4.95 para aislar un clon de una librería genómica de FAM20 construida en el vector de expresión lambda-gt11. Se determinó la secuencia de este clon y se usó para clonar fragmentos adyacentes de restricción genómica. La secuencia de ADN adjunta de esta región contenía un tramo largo abierto de lectura, que se muestra como Figura 1. Se muestra como Figura 2 la secuencia de aminoácidos predecida a partir de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1.

Se realizó una búsqueda de homología FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988) de la secuencia de aminoácidos deducida del tramo largo de lectura (Figura 2). Sorprendentemente, la secuencia de aminoácidos mostró una homología sustancial con varios miembros de la familia de toxinas hemolisina, como se ha discutido anteriormente.

Como prueba adicional de que el polipéptido aislado de N. meningitidis es un miembro de la familia de toxinas hemolisina, el anticuerpo generado contra, y usado para aislar el polipéptido mostrado como Figura 2, A4.85 reaccionó fuertemente de forma cruzada con alfa-hemolisina (HlyA) de E. Coli y con adenilato ciclasa producida en Bordetella pertussis.

El método de inmunoselección puede repetirse para obtener fragmentos adicionales de los genes que codifican el polipéptido de la invención o para obtener los genes que codifican todo el polipéptido. Por supuesto, no es necesario repetir el proceso de inmunoselección. Los genes completos o los fragmentos adicionales de los genes se aíslan preferiblemente usando como sonda la secuencia de ADN conocida o fragmentos de la misma. Para hacer esto, los fragmentos meningocócicos de ADN de restricción, que bordean los extremos de la región ya clonada, o que contienen la región completa, se identifican mediante hibridación Southern usando sondas de oligonucleótidos marcados derivadas de una secuencia determinada previamente, tal como la mostrada como Figura 1, o un fragmento de la misma.

El ADN puede amplificarse por métodos conocidos en la técnica. Un método adecuado es el método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) descrito por Mullis et al en la Patente de Estados Unidos 4.683.195 y por Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Es conveniente amplificar los clones en los vectores lambda-gt11 usando oligómeros específicos de lambda-gt11 como amplímeros (disponibles en Stratagene).

Los fragmentos de restricción se clonan en un vector adecuado, tales como un plásmido o bacteriófago, y se secuencian de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Un método de secuenciación adecuado en el método de terminación de cadena didesoxi descrito por Sanger et al en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977). Se conocen vectores adecuados y polimerasas para la secuenciación. Un vector adecuado es el vector Bluescript de Strategene. Una polimerasa adecuada es Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH)

El ADN que codifica el polipéptido de la invención puede usarse para expresar el polipéptido recombinante en una amplia variedad de células hospedador usando una amplia variedad de vectores. El hospedador puede ser procariótico o eucariótico. El ADN puede obtenerse de fuentes naturales, y opcionalmente, modificarse. Los genes también pueden sintetizarse en total o en parte.

Los vectores de clonación pueden comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas, y sintéticas. Algunos vectores procarióticos adecuados incluyen plásmidos de E. Coli, tales como colE1, pCR1, pBR322, pMB9 y RP4. Los vectores procarióticos incluyen también derivados de fagos ADN tales como M13, fd, y otros fagos filamentosos de una sola hebra de ADN.

También se conocen vectores para expresar proteínas en bacterias, especialmente E. Coli. Tales vectores incluyen pK233 (o cualquiera de la familia tac de plásmidos), T7, y lambda P_{L}. Ejemplos de vectores que expresan proteínas de fusión incluyen los vectores PATH descritos por Dieckmann y Tzagoloff en J. Biol. Chem. 260, 1513-1520 (1985).

Estos vectores contienen secuencias de ADN que codifican la antranilato sintetasa (TrpE) seguidas de un poliengarce en el extremo carboxi. Otros sistemas de vectores de expresión se basan en beta-galactosidasa (peC); proteína de unión de maltosa (pMAL); y glutation S-transferasa (pGST) - véase Gene 67, 31 (1988) y Peptide Research 3, 167 (1990).

Hay disponibles vectores útiles en levadura. Un ejemplo adecuado en el plásmido 2u.

También se conocen vectores adecuados para el uso en células de mamíferos. Tales vectores incluyen derivados bien conocidos de SV-40, adenovirus, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores derivados de la combinación de plásmidos y ADN fagos.

Se conocen más vectores de expresión eucariótica (por ejemplo, P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 )1982); S. Subramani et al, Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981); R.J. Kaufmann and P.A. Sharp, "Amplification And Expression Of sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); R.J. Kaufmann and P.A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); S.I. Scahill et al, "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); G. Urlaub and L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, (1980).

Los anfitriones de expresión útiles incluyen células procarióticas y eucarióticas conocidas. Algunas anfitriones procarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, E. Coli tales como E. Coli SG936, E. Coli W3110, E. Coli X1776, E. Coli X2282, E. Coli DHI, E. Coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces. Células eucarióticas adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, insectos, células animales tales como células COS y células CHO, células humanas y células de plantas en cultivo de tejido.

Los vectores de expresión útiles en la invención contienen al menos una secuencia de control de expresión que está unida operativamente a la secuencia de ADN o fragmento a expresar. La secuencia de control se inserta en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN clonada. Ejemplos de secuencias de control útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las grandes regiones operadoras y promotoras del fago lambda, la región de control de la proteína de recubrimiento fd, los promotores glicolíticos de la levadura, por ejemplo, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la ácido fosfatasa de la levadura, por ejemplo Ph05, los promotores de los factores alfa-acoplamiento de la levadura, y los promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus y virus simianos, por ejemplo, los promotores iniciales y posteriores de SV40, y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de los genes de las células procarióticas o eucarióticas y sus virus o combinaciones de los mismos.

El polipéptido recombinante se purifica por métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados se describen en F.A.O. Marston, "The Purification of Eukaryotic Polypetides Expressed in Escherichia coli," en DNA Cloning, D.M. Cloger, Ed., Vol. III, IRL Press Limited, England (1987).

El polipéptido de la invención y el ADN que codifica el polipéptido también pueden sintetizarse químicamente a partir de restos aminoacídicos individuales y nucleótidos, respectivamente, por métodos conocidos en la técnica. En Stuart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Second Edition, Pierce Chemical Company (1984) se describe métodos adecuados para sintetizar el polipéptido. Caruthers describe métodos adecuados para sintetizar ADN en Science 230, 281 - 285 (1985).

Vacunas

De forma inesperada, un polipéptido que comprende un segmento con una secuencia de aminoácidos que es diferente de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de toxinas hemolisina es un antígeno útil para proteger a un mamífero de enfermedades infecciosas causadas por N. meningitidis. El mamífero es típicamente un ser humano.

Para ser útil, el antígeno no es tóxico para el mamífero que se está inmunizando. Si el antígeno es tóxico, puede destoxificarse por métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, proporcionar fragmentos antigénicos, no tóxicos, del polipéptido completo o destoxificar un polipéptido por ejemplo, uniendo la toxina a una molécula vehículo que destruya la toxicidad, pero no afecte la antigenicidad. La molécula vehículo en típicamente otro polipéptido.

Preferiblemente, hay presente una secuencia de aminoácidos del antígeno en un polipéptido encontrado en N. meningitidis. El polipéptido o los fragmentos no tóxicos, antigénicos útiles para inmunizar mamíferos pueden fabricarse por métodos conocidos en la técnica, tales como aislamiento de N. meningitidis, producción mediante técnicas de ADN recombinante o síntesis química, como se ha descrito anteriormente.

La longitud del fragmento no es crítica mientras el fragmento tenga al menos 900 aminoácidos y sea antigénica y no tóxica. Por lo tanto, el fragmento debería contener suficientes restos aminoacídicos para definir el epítopo. Se describen métodos para aislar e identificar fragmentos antigénicos de polipéptidos antigénicos conocidos en Salfeld et al. en J. Virol. 63, 798-808 (1989) y en Isola et al. en J. Virol. 63, 2325-2334 (1989).

Si el fragmento define el epítopo, pero es demasiado corto para ser antigénico, puede conjugarse con una molécula vehículo. Algunas moléculas vehículo adecuadas incluyen hemocianina de lapa californiana y albúmina de suero bovino. La conjugación puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica. Un método, por ejemplo, es la combinación de un resto cisteína del fragmento con un resto cisteína de la molécula vehículo.

La presente invención incluye además composiciones de vacunas para inmunizar mamíferos, incluyendo humanos contra infecciones de N. meningitidis. La vacuna comprende un antígeno inmunogénico como se ha descrito anteriormente en un vehículo adecuado. Vehículos adecuados incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina regulada con fosfato, y emulsiones. La vacuna puede incluir adyuvantes, tales como péptidos muramilo, y linfoqcinas, tales como interferón, interleuquina-1 e interleuquina-6. El antígeno puede adsorberse en partículas adecuadas, tales como partículas de óxido de aluminio, o encapsularse en liposomas, como se conoce en la técnica.

Las vacunas pueden administrarse a un mamífero por métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.

Anticuerpos

La presente invención proporciona anticuerpos contra un polipéptido de la invención. El polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que define un epítopo, y es diferente de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de la familia de toxinas hemolisina. Los anticuerpos se levantan contra un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que está presente en N. meningitidis, y que es diferente de polipéptidos que son miembros de la familia de toxinas hemolisina de otros géneros de bacterias.

Los anticuerpos son preferiblemente monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen el método inmunológico descrito por Kohler y Milstein en Nature 256, 495-497 (1975) y el método del ADN recombinante descrito por Huse et al en Science 246, 1275-1281 (1989).

Los mamíferos, incluyendo humanos, que padecen enfermedades causadas por infección con N. meningitidis pueden tratarse administrando anticuerpos específicos de un miembro de la familia de toxinas hemolisina. Son adecuados los anticuerpos contra un miembro de la familia de toxinas hemolisina de cualquier género de bacterias, aunque se prefieren los anticuerpos contra un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos presente en la N. meningitidis.

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Para propósitos terapéuticos, es necesario que los polipéptidos antigénicos de la invención produzcan anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes son anticuerpos que inhiben significativamente el crecimiento o matan las células bacterianas y/o neutralizan significativamente la función de toxina del polipéptido in vitro o in vivo. Se inhibe significativamente el crecimiento de la bacteria o se neutraliza significativamente la función de toxina del polipéptido si la inhibición o neutralización es suficiente para prevenir o reducir los síntomas de la enfermedad de un mamífero infectado con la enfermedad.

Los anticuerpos neutralizantes también pueden usarse para producir anticuerpos anti-idiotípicos útiles como vacunas para inmunizar mamíferos, incluyendo humanos, que padecen enfermedades causadas por infección con N. meningitidis. Los anticuerpos anti-idiotípicos se preparan de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Moléculas de ácido nucleico

La presente invención también incluye moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de la invención descrita anteriormente. La molécula de ácido nucleico puede ser de ADN o ARN.

La utilidad de la molécula de ácido nucleico reside en su capacidad para usarse como sonda para detectar N. meningitidis, como se explica a continuación, o para producir un polipéptido de la invención, como se ha descrito anteriormente. La molécula de ácido nucleico puede prepararse por métodos conocidos en la técnica. Métodos adecuados incluyen aislar el ADN de la N. meningitidis o sintetizar el ADN de acuerdo con los procedimientos conocidos como se ha explicado anteriormente.

Sondas

La presente invención proporciona además un método para detectar la presencia de N. meningitidis en una muestra. El método implica el uso de una sonda que reconoce un polipéptido que es miembro de la familia de toxinas hemolisina, y, en particular, un miembro de la familia de toxinas hemolisina presente en N. meningitidis, o un gen que codifica tal polipéptido. La sonda reconoce N. meningitidis si está presente en la muestra.

La sonda puede ser un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpo pueden prepararse como se ha descrito anteriormente.

Se conocen métodos para detectar polipéptidos con anticuerpos. Por ejemplo, puede inmovilizarse un polipéptido en un vehículo sólido. La inmovilización del polipéptido puede ocurrir mediante un primer anticuerpo inmovilizado específico para el polipéptido. El anticuerpo inmovilizado primero se incuba con una muestra sospechosa de contener el polipéptido. Si está presente, el polipéptido se une al primer anticuerpo.

Un segundo anticuerpo, también específico del polipéptido, se une al polipéptido inmovilizado. El segundo anticuerpo puede marcarse por métodos conocidos en la técnica. Se lavan los materiales no inmovilizados, y la presencia de la marca inmovilizada indica la presencia del polipéptido. Éste y otros bioanálisis se describen en David, et al., en la Patente de Estados Unidos 4.376.110 asignada a Hybritech, Inc., La Jolla, California.

La sonda puede ser también una molécula de ácido nucleico que reconoce una molécula de ARN o ADN que codifica un miembro de la familia de toxinas hemolisina presente en N. meningitidis. En la técnica se conocen métodos para determinar si una sonda de una molécula de ácido nucleico reconoce una molécula de ácido nucleico específica en una muestra. Generalmente, se prepara una sonda marcada que es complementaria con una secuencia de aminoácidos sospechosa de estar en la muestra. La presencia de la sonda hibridada con la molécula de ácido nucleico diana indica la presencia de la molécula de ácido nucleico. Se describen algunos métodos adecuados por Schneider et al en la Patente de Estados Unidos 4.882.269, que está asignada a la Universidad de Princeton, y por Segev en la Solicitud PCT WO 90/01069. La patente de Schneider y la solicitud de Segev están licenciadas en ImClone Systems Inc., New York City.

Las sondas descritas anteriormente se marcan de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Se han descrito métodos para marcar anticuerpos, por ejemplo, por Hunter y Greenwood en Nature 144, 945 (1962), y por David et al en Biochemistry 13, 1014-1021 (1974). Se han descrito más métodos para marcar anticuerpos en las Patentes de Estados Unidos No. 3.940.475 y 3.645.090. Se han descrito métodos para marcar sondas de oligonucleótidos, por ejemplo, por Leary et al, Nucl. Acids Res. (1984) 12:3435; Richardson y Gumport, Nucl. Acids. Res. (1983) 11:6167; Smith et al, Nucl. Acids Res. (1985) 13:2399; y Meinkoth y Wahl Anal. Biochem (1984) 138:267.

La marca puede ser radioactiva. Algunos ejemplos de marcadores radioactivos útiles incluyen ^{32}P, ^{125}I, ^{131}I, y ^{3}H. El uso de marcadores radioactivos se ha descrito en los documentos U.K. 2.034.323, U.S. 4.358.535, y U.S. 4.302.204.

Algunos ejemplos de marcadores no radioactivos incluyen enzimas, cromóforos, átomos y moléculas detectables mediante microscopio de electrones, e iones metálicos detectables por sus propiedades magnéticas.

Algunos marcadores enzimáticos incluyen enzimas que causan un cambio detectable en un sustrato, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (pirogalol y o-fenilenodiamina), beta-galactosidasa (beta-D-galactopiranosido de fluoresceína), y alcalina fosfatasa (5-bromo-4-cloro-3-indolilo fosfato/azul de nitro tetrazolio). El uso de marcadores enzimáticos se ha descrito en los documentos U.K. 2.019.404, EP 63.879, y por Rotman, Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 1981- 1991 (1961).

Algunos cromóforos útiles incluyen, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, y bioluminiscentes, así como tintes. Algunos cromóforos específicos útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, Texas red, ficoeritrina, umbeliferón, luminol.

Los marcadores pueden conjugarse con el anticuerpo o sonda de nucleótido por métodos conocidos en la técnica. Los marcadores pueden acoplarse directamente mediante un grupo funcional en la sonda. La sonda contiene o se puede hacer que contenga tal grupo funcional. Algunos ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, amino, carboxilo, sulfhidrilo, maleimida, isocianato, isotiocianato.

El marcaje puede conjugarse también con la sonda mediante un ligando acoplado a la sonda por un método descrito anteriormente y un receptor para ese ligando acoplado al marcaje. Cualquiera de las combinaciones ligando-receptor conocidas es adecuada. Se prefiere la combinación biotina-avidina.

El polipéptido de la invención puede usarse para detectar la presencia de anticuerpos específicos para N. meningitidis en una muestra. El método comprende preparar un polipéptido que contiene un segmento que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a un miembro de la familia de toxinas hemolisina. El polipéptido puede preparase como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, el polipéptido comprende un segmento que tiene una secuencia de aminoácidos que está presente en N. meningitidis.

La muestra puede, por ejemplo, ser de un paciente sospechoso de estar infectado con N. meningitidis. Se conocen análisis adecuados en la técnica, tales como el protocolo patrón ELISA descrito por R.H. Kenneth, "Enzyme-Linked Antibody Assay with Cells Attached to Polyvinyl Chloride Plates" en Kenneth et al, Monoclonal Antibodies, Plenum Press, N.Y., página 376 (1981).

Brevemente, las placas se recubren con polipéptido antigénico a una concentración suficiente para unir cantidades detectables del anticuerpo. Después de incubar las placas con el polipéptido, las placas se bloquean con un agente de bloqueo adecuado, tal como, por ejemplo, suero de cabra al 10%. La muestra, tal como suero del paciente, se añade y se titula para determinar el punto final. Se añaden simultáneamente controles positivos y negativos para cuantificar la cantidad de anticuerpo relevante presente en las muestras desconocidas. Después de la incubación, las muestras se sondean con Ig de cabra anti-humana conjugada a una enzima adecuada. La presencia de anti-polipéptido en la muestra se indica con la presencia de la enzima.

Los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención se capaces de reconocer N. meningitidis y de distinguir células meningocócicas de células gonocócicas en una muestra. El anticuerpo monoclonal A4.85, por ejemplo, reconoce un polipéptido expresado en células meningocócicas tratadas con hierro. Sin embargo, el A4.85 no reconoce proteínas en N. gonorrohoeae tratadas con hierro.

Los anticuerpos pueden marcarse por métodos conocidos como se ha descrito anteriormente. Los análisis para distinguir células meningocócicas tratadas con hierro de células gonocócicas tratadas con hierro siguen formatos conocidos, tales como formatos patrón de transferencia y ELISA.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de A4.85 Mab

Las membranas externas bactrianas se preparan con cultivos tratados con hierro de N. meningitidis cepa FAM20 como se indica a continuación. Se inocula FAM20 en medio quelado definido (CDM, West et al, J. Bacteriology 169, 3414 (1987)). Este medio permite el crecimiento solo hasta que las reservas de hierro se agotan. Durante este tiempo, se expresan un conjunto de proteínas que se regulan mediante la disponibilidad de hierro. Se recogen las bacterias y se preparan las membranas externas como se describe en Dyer et al en Infection and Immunity 56, 977 (1988).

Se inmunizan de tres a cinco ratones hembra BALB/c con membranas externas tratadas con hierro FAM20 por vía intramuscular (im) o intraperitoneal (ip). Con la vía im, se emulsionan 100 \mug de antígeno (Ag) en adyuvante completo de Freund y se inyecta en dos sitios distintos en el día cero, seguido de dosis estímulo cada dos semanas con el Ag emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. La vía ip implica inmunizar con 100 \mug de Ag en los días 0, 7, 14 y 28. Los niveles de anticuerpos en suero se comprueban mediante ELISA o transferencia Western tres días después del último estímulo para determinar los niveles de anticuerpo en el suero. Los ratones reciben una última inyección ip en cada uno de los tres días consecutivos antes de la fusión. En el día de la fusión, los ratones se sacrifican por dislocación cervical y se les retira el bazo de forma aséptica. Las células del bazo se extraen usando dos agujas de 19ga dobladas. Las células extraídas se resuspenden para dar suspensiones de una única célula.

Se usan células de mieloma de ratón, SP2-O-AG14 (ATCC CRL 1581), que han crecido en Medio Eagle Modificado de Dulbecco/Ham F-12 (DMEM/F12) suplementado con suero de ternero fetal (FCS) al 15% como pareja para la fusión. Las células se mezclan en una relación 10:1 de células de bazo:mieloma y se vierten juntas en un tubo de centrifugación de 50 ml. El sobrenadante se aspira dejando una bola seca a la cual se le añade 1 ml de polietilenglicol (PEG) (precalentado a 37ºC). Las células se resuspenden suavemente y se dejan reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos, después de los cuales se añade 1 ml de DMEM/F12 sin suero añadido y las células se resuspenden suavemente. Después, las células se diluyen y se resuspenden con 2, 4, 8, y 16 ml de DMEM/F12 añadido en intervalos de dos minutos. Las células se hacen bolas y se aspira el sobrenadante. Se añade con precaución 2 ml de DMEM/F12 suplementado con FCS al 15% para evitar la resuspensión de la bola y después se incuba durante una hora a 37ºC.

Al final de una hora de incubación, la suspensión se diluye a una concentración final de 1x10^{6} células/ml. La suspensión se vierte en matraces de cultivo de tejido y se incuban durante una noche. El día siguiente se pone un volumen igual de medio de cultivo suplementado con componentes HAT 2x (hipoxantina, aminopterina, timidina) en placas de 96 pocillos con 200 \mul /pocillo con 1x10^{5} células de bazo/pocillo. Las células de la placa se alimentan cada 4-5 días después de la fusión aspirando la mitad del medio de los pocillos y añadiendo medio 1xHAT fresco. Se observa los pocillos que han crecido después de 10-14 días, y en los que crecen se prueba la presencia de anticuerpo segregrado seleccionando los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA o transferencia Western; Los pocillos que dan positivo en el análisis se expanden para que crezcan en platos de cultivo de 24 pocillos en medio de cultivo con suplemento HT (sin aminopterina) y se vuelven a probar. Los que dan positivo en la segunda prueba se expanden más en recipientes de cultivo mayores y después se clonan dos veces limitando la dilución.

Se aisló una línea celular (A4.855) que venía de una sola célula de bazo de ratón. El A4.85 produce un anticuerpo monoclonal (Mab) que reacciona con varias especies de proteínas (de 70 kilodaltons a varios cientos de kilodaltons en masa) en una transferencia Western de membranas externas de FAM20, cuya síntesis se reprime por la presencia de hierro en el medio de crecimiento bacteriano.

Ejemplo 2A

Aislamiento de Clones Genómicos A. Construcción de la biblioteca

Se construye una biblioteca del ADN cromosómico de la cepa de N. meningitidis FAM20 en el vector bacteriófago lambda-gt11 como se indica a continuación. Se aísla el ADN cromosómico de FAM20 por métodos patrón (Maniatis et al, 1982). El ADN se corta por sonicación a tamaños de fragmento de aproximadamente 300-1000 pb. Se unen engarces sintéticos EcoRI a los extremos de estas moléculas, seguido de la escisión con endonucleasas de restricción EcoRI para generar las posiciones de restricción EcoRI al final de cada molécula. Los fragmentos resultantes se ligan con ADN escindido con EcoRI lambda-gt11 (Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1982)). El ADN ligado se empaqueta en cabezas de fagos lambda usando extractos de empaquetamiento lambda (Promega Corp., Madison, Wisconsin), de acuerdo de las instrucciones del fabricante.

B. Selección de la biblioteca y aislamiento del ADN.

La biblioteca creada anteriormente se selecciona con el A4.85 para detectar clones que expresan el epítopo reconocido por A4.85. Se seleccionan 500.000 placas recombinantes de la biblioteca de expresión lambda por el método de Maniatis et al (1982). Se aísla un clon puro que reacciona con el A4.85 Mab volviendo a ponerlo en la placa y seleccionando la placa reactiva dos veces. El ADN meningocócico insertado del clon lambda puro (lambda 4,85) se amplifica con la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un kit de Perkin-Elmer/Cetus. El ADN amplificado con PCR se clona en el vector de secuenciación M13mp19 (Maniatis et al, 1982) y se determina la secuencia de ADN mediante el método de terminación de cadena didesoxi de Sanger et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) (19877)) usando el kit Sequenase (Stratagene, La Jolla, CA).

El ADN meningocócico clonado se marca con ^{32}Pby con un kit de Boehringer-Mannheim (Indianapolis, IN) y se usa en hibridaciones Southern (Maniatis et al, 1982) para identificar fragmentos de restricción de ADN en el cromosoma FAM20 adyacente al ADN clonado en lambda 4.85. Los fragmentos de cromosomas Sau3A I de aproximadamente 560 y 1600 pb hibridan con el ADN meningocócico clonado. El ADN FAM20 se escinde con Sau3A y se fracciona en un gel preparativo de agarosa. Se aíslan dos fracciones de tamaño, una de 400-700 pb y una de 1400-1800 pb.

El fragmento de 560 pb Sau3A se clona ligando la fracción de 400-700 pb de los fragmentos de FAM20-Sau3A con plásmido pBR322 escindido con BamHI (Maniatis et al, 1982). Los clones deseados del fragmento de 560 pb se identifican por hibridación de colonias bacterianas que contienen plásmidos recombinantes con ADN insertado lambda 4.85 marcando con ^{32}P (Maniatis et al, 1982). Se prepara el plásmido ADN (pUNCH201) de una colonia pura hibridando con la sonda de ADN y se determina su secuencia usando Sequenase modificada como se usa el secuenciación de doble hebra (Kraft et al, BioTechniques 6, 544 (1988)). Se usa la hibridación Southern para verificar que el fragmento clonado es representativo del fragmento intacto en el genoma del FAM20.

Para clonar el fragmento de 1600 pb, los extremos de la fracción de 1400- 1800 pb de FAM20-Sau3A se truncan por reacción con una enzima Klenow y nucleótidos de ADN. Se añaden engarces EcoRI sintéticos a estas moléculas, seguido de ligación con ADN escindido con EcoRI, tratado con alcalino-fosfatasa lambda ZAP (Strategene, La Jolla, Ca) de acuerdo con la información técnica suministrada con el kit lambda ZAP. El ADN ligado se empaqueta en cabezas lambda usando extractos de empaquetamiento lambda Packagene (Promega). La biblioteca de fragmentos 1400-1800 pb FAM20-Sau3A I se selecciona con un oligonucleótido marcado con ^{32}P (SAT1); que se sintetiza para corresponder secuencias de ADN en un extremo del inserto lambda 4.85 (5'GCCATTGCCACTGTAGATA 3'). Se purifica una placa lambda ZAP en hibridación con el oligonucleótido SAT1 como se ha descrito anteriormente. La porción interior de este clon lambda ZAP (lambda ZAP202) se "escinde" añadiendo un bacteriófago de ayuda. La escisión resulta en un plásmido multicopia (pUNCH202) que contiene el inserto meningocócico clonado. Se usa hibridación Southern para verificar que el fragmento clonado es representativo del fragmento intacto en el genoma de FAM20. La secuencia del fragmento de ADN clonado se determina mediante secuenciación de doble hebra como se ha descrito anteriormente.

La secuencia adjunta de pUNCH201, pUNCH202 y el inserto lambda 4.85 revela la presencia de un tramo abierto de lectura que contiene la totalidad del ADN clonado. Ni el comienzo ni el final del gen está presente en este ADN clonado. La secuencia de ADN se muestra como Figura 1. La secuencia de aminoácidos predecida en el tramo abierto de lectura contiene 835 aminoácidos (91kD). La secuencia se muestra como Figura 2.

Como se determina mediante búsquedas de comparación de secuencias FASTA (véase arriba), el ADN y la secuencia del polipéptido deducida de esta región tiene un alto grado de similitud con una familia de toxinas hemolisina. Por ejemplo, la secuencia de ADN mostrada en la Figura 1 exhibe 54% de identidad con el gen cya (adenilato ciclasa) de B. pertussis; 60% de identidad con los genes hlYa, hlyB, hlyC, y hlyD (hemolisina) de E. Coli; 65% de identidad con los genes hlyA, hlyB, y hlyC (hemolisina) de E. Coli; 56% de identidad con el gen de leucotoxina de A. actinomycetemcomitans; 56% de identidad con el gen hemolisina de A. pleuropneumoniae; 60% de identidad con el gen leucotoxina de P. haemolytica; 62% de identidad con el gen leucotoxina A1 de P. haemolytica; y 57% de identidad con el gen proteasa B de E. chrysanthemi.

La secuencia de aminoácidos predecida con la secuencia de ADN mostró 25%-28% de identidad con la leucotoxina, 22%-28% de identidad con hemolisina; y 30% de identidad con adenilato ciclasa.

La cepa meningocócica FAM20 contiene al menos dos copias del ADN que codifica los polipéptidos de la invención. Esto puede demostrarse digiriendo ADN genómico con los cortadores no frecuentes BG1II, SpeI, NheI, y combinaciones de NheI y SpeI. Las transferencias Southern del ADN digerido separados por electroforesis por campo pulsado con gradiente revelan dos bandas principales que hibridan en condiciones astringentes a sondas de genes que contienen fragmentos de la secuencia del gen que codifica el polipéptido de la invención.

El resto del gen que codifica el polipéptido regulado con hierro de la invención se aísla de una forma similar a la descrita anteriormente para aislar pUNCH201 y pUNCH202. Los fragmentos de restricción de ADN que bordean los extremos de la región ya clonada o que contienen la región completa se identifican por hibridación Southern usando sondas de oligonucleótido derivadas de secuencias de ADN determinadas previamente. Estos fragmentos se clonan es plásmido o vectores bacteriófagos como se ha descrito anteriormente para pUNCH201 y pUNCH202. La secuencia de ADN de fragmentos clonados nuevamente se determina como se ha descrito anteriormente, y revela cuando se alcanza cualquier extremo del gen. Si el gen se aísla en un solo fragmento de ADN, se expresa en un análisis in vitro para verificar que la proteína que codifica el gen reacciona con el A4.85 Mab. Si el gen no se clona en un solo fragmento de ADN, se reconstruye mediante técnicas patrón de biología molecular para dar el gen intacto. (Carbonetti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9084 (1987)).

Por ejemplo, los fragmentos de ADN de una de las dos copias de los genes estructurales que codifican el polipéptido de la invención se purificaron en geles de agarosa, se clonaron y se secuenciaron. La Figura 3 muestra la secuencia de ADN, que se completa en el extremo 5' del gen. En la Figura 3 aparece subrayado un promotor típico con una región -35 y -10, un recuadro forrado, que se encuentra típicamente en muchos promotores regulados con hierro gram negativos.

Ejemplo 2B

Transferencia Western y peso molecular

El polipéptido de longitud completa obtenido de la cepa meningocócica FAM20 exhibe un peso molecular de 230-250 kD cuando se somete a análisis de transferencia Western. La transferencia Western puede realizarse como se indica a continuación:

Se preparan células completas de FAM20 a las que no se les ha administrado hierro de acuerdo con el método de West y Sparling, J. Bacteriol. 169, 3414-3421 (1987). Las células se lavaron en medio Mínimo A de Davis enfriado con hielo (Lederberg, Methods in Med. Res., 3:5 (1950)), se refrigeraron inmediatamente en hielo, y se rompieron en una célula de presión French a 0ºC y 20.000 psi. La mezcla resultante se centrifuga a 10 minutos a 20.000G y la bola se solubiliza en SDS hirviendo. Las proteínas de membrana solubilizadas se separan por SDS-PAGE al 7,5% en una solución tampón Laemmli, que se describió por Lemmli en Nature 227, 680-685 (1970). Las proteínas se pasan (16 horas, 80 uA) a membranas de nitrocelulosa unidas ópticamente (disponibles en Schleciher & Schuell). Las membranas se bloquean durante 1 hora en BSA al 5% en TBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5); se aclaran durante 5 minutos en TBS; se incuban durante 1 hora con una dilución 1:2 de anticuerpo monoclonal A4.85 (véase la explicación anterior) en BSA al 5%; se lavaron dos veces durante 5 minutos en TBS y Tween 20 al 0,05%; se incubaron durante 1 hora en un anticuerpo secundario (conjugado de alcalina fosfatasa IgG de cabra anti-ratón) diluido en BSA al 5%, disponible de BioRad (dilución = 1:3000) o Sigma (dilución = 1:1000); se lavaron dos veces durante 5 minutos en TBS/Tween; se lavaron otra vez durante 5 minutos en TBS; y se revelaron con un sustrato de alcalina fosfatasa que comprendía 45\mul de Azul de nitro tetrazolina, disponible en Sigma (75 mg/ml); 35 \mul de 5-bromo-4-cloro-4-indolilfosfato, sal p-toluidina (50 mg/ml) en 10 ml de solución tampón carbonato, pH 9,8 (NaHCO_{3} 0,1 M; MgCl_{2} 1mM).

Ejemplo 3 Análisis de Anticuerpos en Muestra.

Se usa un procedimiento patrón ELISA para seleccionar la presencia de anticuerpos contra el polipéptido en las proteínas. Brevemente, se recubren las placas de microvaloración de 96 pocillos con el antígeno a concentraciones que varían de 50-1000 ng por pocillo en una solución tampón de carbonato a un pH alto (9,6. Las placas se incuban durante una noche a 9ºC y se bloquean con suero de cabra normal al 10% durante una hora a 37ºC. Se añade el suero del paciente y se titula para determinar el extremo. Se añade suero de control positivo y negativo al mismo tiempo para cuantificar la cantidad de anticuerpo relevante presente en las muestras desconocidas. Después de una incubación de 2-3 horas a 37ºC, las muestras se sondean con Ig de cabra anti-humana conjugadas con peroxidasa de rábano. Las muestras positivas se determinan usando TMB.

La invención se reivindica de acuerdo con la memoria descriptiva y los materiales de partida y referencias fácilmente disponibles. Sin embargo, las siguientes líneas celulares se han depositado en la American Type Culture Collection, Bethesda, Maryland a 12 de Julio de 1990 para facilitar la fabricación y uso de la invención:

Línea celular meningocócica FAM18 (Número de adquisición 55071)

Línea celular meningocócica FAM20 (Número de adquisición 55072)

Línea celular hybridoma A4.85 (Número de adquisición HB10504)

Además, los siguientes artículos que contienen protocolos e información útiles están disponibles en el archivo histórico de esta memoria descriptiva.

"Predigested Lambda ZAP/Eco RI Cloning Kit Instruction Manual," Stratagene, La Jolla, California, (20 de Noviembre, 1987);

"Gigapack Plus," (para empaquetar fago lambda recombinante), Stratagene, La Jolla, California, (25 de abril, 1988);

"picoBlue Immunoscreening Kit, Instruction Manual," Stratagene, La Jolla, California, (19 de mayo, 1989).

1

11

2

20

3

30

4

5

6

7

8

Claims (45)

1. Un polipéptido antigénico, esencialmente puro, que tiene al menos 900 aminoácidos que comprenden un segmento de al menos 50 restos aminoacídicos y que tienen una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, en donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el segmento tiene al menos 100 restos aminoacídicos.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el segmento tiene al menos 200 restos aminoacídicos.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos es inmunogénica.

5. El polipéptido de la reivindicación 1 donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la secuencia mostrada en la Figura 2.

6. El polipéptido de la reivindicación 1, donde los anticuerpos contra el polipéptido reaccionan de forma cruzada con al menos otro miembro de la familia de toxinas hemolisina de otro género de bacterias.

7. El polipéptido de la reivindicación 6, donde los otros géneros de bacterias incluyen Escherichia, Serratia, Pasteurella, Proteus, Actinobacillus, y Bordetella.

8. El polipéptido de la reivindicación 6, donde los otros miembros de la familia de toxinas hemolisina comprenden alfa-hemolisina de Escherichia coli; leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans; leucotoxina de Pasteurella heamolytica; adenilato ciclasa de Bordetella pertussis y adenilato ciclasa de Bacillus anthracis.

9. El polipéptido de la reivindicación 6, donde el otro miembro de la familia de toxinas hemolisina es alfa-hemolisina de E. Coli.

10. Un método para producir un antígeno útil en la protección de un mamífero de una infección por N. meningitidis que comprende las etapas de

(a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

(b) hacer el polipéptido no tóxico para los mamíferos.

11. El método de la reivindicación 10 donde la secuencia de aminoácidos está presente en un polipéptido encontrado en N. meningitidis.

12. El método de la reivindicación 10, donde el mamífero es un ser humano.

13. Un método para producir una composición de vacuna útil en la protección de un mamífero de la infección por N. meningitidis que comprende las etapas de:

(a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo;

(b) hacer el polipéptido no tóxico para los mamíferos; y

(c) combinar el polipéptido no tóxico con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. El método de la reivindicación 13, donde el polipéptido se aísla de N. meningitidis.

15. El método de la reivindicación 13, donde el mamífero es un ser humano.

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16. Una composición de vacuna capaz de inmunizar mamíferos contra infecciones de N. meningitidis, que comprende:

(a) un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. La composición de vacuna de la reivindicación 16, donde el polipéptido está presente en N. meningitidis.

18. La composición de vacuna de la reivindicación 16, donde el polipéptido está presente es las membranas externas de N. meningitidis.

19. La composición de vacuna de la reivindicación 16, donde el mamífero es un ser humano.

20. Anticuerpos monoclonales contra un polipéptido que tienen al menos 900 aminoácidos que comprenden un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos y que tiene una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

21. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 900 aminoácidos que comprenden un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos y que tiene una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

22. Un método para detectar la presencia de anticuerpos específicos para un miembro de la familia de toxinas hemolisina en una muestra que comprende las etapas de:

(a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que tiene al menos 50 restos aminoacídicos, y donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos del segmento es distinta de, pero sustancialmente homóloga con la secuencia de aminoácidos de un segmento de un miembro de la familia de toxinas hemolisina, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y

(b) determinar si el polipéptido reconoce un anticuerpo en la muestra.

23. Un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que comprende un segmento que comprende una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de:

L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

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donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, y fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

24. El polipéptido de la reivindicación 23, donde el segmento tiene al menos 100 restos aminoacídicos

25. El polipéptido de la reivindicación 23, donde el segmento tiene al menos 200 restos aminoacídicos.

26. El polipéptido de la reivindicación 23, donde la secuencia de aminoácidos antigénica es inmunogénica.

27. El polipéptido de la reivindicación 23, donde los anticuerpos contra el polipéptido reaccionan de forma cruzada con al menos otro miembro de la familia de toxinas hemolisina de otro género de bacterias.

28. El polipéptido de la reivindicación 23, donde los otros géneros de bacterias incluyen preferiblemente Escherichia, Serratia, Pasteurella, Proteus, Actinobacillus, y Bordetella.

29. El polipéptido de la reivindicación 27, donde los otros miembros de la familia de toxinas hemolisina comprenden alfa-hemolisina de Escherichia coli; leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans; leucotoxina de Pasteurella heamolytica; adenilato ciclasa de Bordetella pertussis y adenilato ciclasa de Bacillus anthraces.

30. El polipéptido de la reivindicación 27, donde el otro miembro de la familia de toxinas hemolisina es alfa-hemolisina de E. Coli.

31. Un método para producir un antígeno útil en la protección de un mamífero de la infección por N. meningitidis que comprende las etapas de:

(a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de:

L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde
los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina
LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y

(b) hacer el polipéptido o fragmento no tóxico para los mamíferos.

32. El método de la reivindicación 31, donde la secuencia de aminoácidos está presente en un polipéptido encontrado en N. meningitidis.

33. Un método para producir una composición de vacuna útil en la protección de un mamífero de una infección de N. meningitidis que comprende las etapas de:

(a) preparar un polipéptido antigénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de: L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde
los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina
LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y

(b) hacer que el polipéptido no sea tóxico para los mamíferos, y

(c) combinar el polipéptido no tóxico con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, donde el polipéptido se aísla de N. meningitidis.

35. Una composición de vacuna capaz de inmunizar mamíferos contra infecciones de N. meningitidis, comprendiendo la composición de vacuna:

(a) un polipéptido inmunogénico esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de:

L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde
los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina
LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo, y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

36. La composición de vacuna de la reivindicación 35, donde el polipéptido está presente en N. meningitidis.

37. La composición de vacuna de la reivindicación 36 donde el polipéptido está presente es las membranas externas de N. meningitidis.

38. La composición de vacuna de la reivindicación 35, donde el mamífero es un ser humano.

39. Anticuerpos monoclonales contra un polipéptido esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene un segmento con una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos consiste en al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de:

L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

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donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde
los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina
LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

40. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 900 aminoácidos que tiene un segmento con una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, donde la secuencia de aminoácidos consiste en al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de:

L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde
los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina
LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.

41. Un método para detectar la presencia de N. meningitidis en una muestra que comprende las etapas de:

(a) preparar una prueba que reconoce un polipéptido que es un miembro de la familia de toxinas hemolisina o un fragmento del mismo, o una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido o fragmento donde el polipéptido que es miembro de la familia de toxinas hemolisina o la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido está presente en N. meningitidis; y

(b) determinar si la sonda reconoce la N. meningitidis en la muestra.

42. El método de acuerdo con la reivindicación 41, donde la sonda es un anticuerpo.

43. El método de acuerdo con la reivindicación 42, donde el anticuerpo es monoclonal.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 41, donde la sonda es una molécula de ácido nucleico.

45. Un método para detectar la presencia de anticuerpos específica para un miembro de la familia de toxinas hemolisina en una muestra que comprende las etapas de:

(a) preparar un polipéptido esencialmente puro que tiene al menos 900 aminoácidos y donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos presente en N. meningitidis, que tiene un segmento con una secuencia de aminoácidos que consta de al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos, comprendiendo la secuencia consenso de hemolisina de nueve aminoácidos al menos cuatro de:

L en la posición 1;

G en la posición 3;

G en la posición 4;

G en la posición 6;

N en la posición 7;

D en la posición 8; y

X en las posiciones 2, 5, y 9;

donde x representa cualquier resto aminoacídico sencillo; y

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(b) determinar si el polipéptido reconoce un anticuerpo en la muestra, o fragmentos antigénicos de tales polipéptidos, donde los fragmentos antigénicos comprenden al menos tres repeticiones de la secuencia consenso de hemolisina LXGGXGNDX, donde X, independientemente, es cualquier resto aminoacídico sencillo.