ES2202860T3 - Ensayos que emplean marcadores electroquimiluminiscentes y atenuadores de electroquimiluminiscencia. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION CORRESPONDE AL CAMPO GENERAL DE LOS ENSAYOS QUIMICOS Y BIOLOGICOS QUE EMPLEAN LA ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (EQL), DENOMINADA TAMBIEN QUIMIOLUMINISCENCIA ELECTROGENERADA. MAS PARTICULARMENTE, LA PRESENTE INVENCION PERTENECE A CIERTAS CLASES DE MITADES QUIMICAS QUE ENFRIAN FUERTEMENTE LA EQL, Y EL USO DE ESTOS ENFRIADORES DE LA EQL EN COMBINACION CON ETIQUETAS EQL, POR EJEMPLO, EN PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO EQL QUE EMPLEAN UN ENFRIADOR EQL Y UNA ETIQUETA DE ESTE TIPO. UNA CLASE DE ESTAS MITADES DE ENFRIAMIENTO RAPIDO SON LAS QUE COMPRENDEN AL MENOS UNA MITAD DE BENCENO. LAS SUBCLASES DE ESTAS MITADES DE ENFRIAMIENTO RAPIDO SON LAS QUE COMPRENDEN AL MENOS UNA MITAD FENOL, MITAD QUINONA, ACIDO BENCEN - CARBOXILICO Y/O MITAD DE CARBOXILATO DE BENCENO.

Description

Ensayo que emplean marcadores electroquimiluminiscentes y atenuadores de electroquimiluminiscencia.

Campo técnico

Esta invención se refiere al campo general de ensayos químicos y biológicos que usan electroquimiluminiscencia (ECL), también denominada quimiluminiscencia electrogenerada. Más particularmente, la presente invención se refiere a ciertas clases de restos químicos que atenúan fuertemente la ECL, y al uso de estos atenuadores de ECL combinados con marcadores ECL, por ejemplo, en métodos de ensayo de ECL que usan un atenuador de ECL y un marcador ECL. Una clase de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto benceno. Son subclases de dichos restos atenuadores los que comprenden al menos un resto fenol, resto quinona, resto ácido benceno-carboxílico y/o benceno-carboxilato.

Antecedentes

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diferentes publicaciones, patentes y solicitudes de patentes publicadas por una cita identificativa; las citas completas de estos documentos se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva inmediatamente antes de las reivindicaciones. Las descripciones de las publicaciones, patentes y memorias descriptivas de patentes publicadas en esta solicitud se incorporan en esta memoria como referencia en la presente descripción para describir más completamente el estado de la técnica a la que se refiere esta invención.

Luminiscencia es el término que se usa normalmente para referirse a la emisión de luz de una sustancia por cualquier razón distinta de una subida de su temperatura. En general, los átomos o moléculas emiten fotones de energía electromagnética (por ejemplo, luz) cuando se mueven de un "estado excitado" a un estado de menor energía (normalmente el estado fundamental); este proceso a menudo se denomina "desintegración radiactiva". Hay muchas causas de excitación. Si la causa de la excitación es un fotón, el proceso de luminiscencia se denomina "fotoluminiscencia". Si la causa de la excitación es un electrón, el proceso de luminiscencia se denomina "electroluminiscencia". Más específicamente, la electroluminiscencia resulta de la inyección directa y eliminación de electrones para formar una pareja electrón-agujero, y posterior recombinación de la pareja electrón-agujero para emitir un fotón. La luminiscencia que resulta de una reacción química normalmente se denomina "quimiluminiscencia". La luminiscencia producida por un organismo vivo se denomina normalmente "bioluminiscencia". Si la fotoluminiscencia es el resultado de una transición de espín permitida (por ejemplo, una transición singlete-singlete, transición triplete-triplete), el proceso de fotoluminiscencia se denomina normalmente "fluorescencia". Típicamente las emisiones de fluorescencia no persisten después de eliminar la causa de la excitación como resultado de estados excitados de vida corta, que se pueden relajar rápidamente mediante dichas transiciones de espín permitidas. Si la fotoluminiscencia es el resultado de una transición de espín prohibida (por ejemplo, una transición triplete-singlete), el proceso de fotoluminiscencia se denomina normalmente "fosforescencia". Típicamente, las emisiones de fosforescencia persisten mucho después de eliminar la causa de la excitación como resultado de estados excitado de vida larga, que sólo pueden relajarse mediante dichas transiciones de espín prohibidas.

La electroquimiluminiscencia ("ECL"), también denominada quimiluminiscencia electrogenerada, en general está relacionada con la emisión de fotones de radiación electromagnética (por ejemplo, luz) de una especie química electrónicamente excitada, que ha sido generada electroquímicamente. En un ejemplo sencillo, la especie A, en el estado fundamental, se reduce primero electroquímicamente para formar una especie reducida A^{-} que después puede difundir desde la superficie del electrodo. Igualmente, una especie A se oxida electroquímicamente para formar una especie oxidada A^{+}. Después, la especie reducida A^{-} y la especie oxidada A^{+} difunden juntas y reaccionan para formar una especie electrónicamente excitada, A*, y una especie en estado fundamental, A. Después, la especie electrónicamente excitada, A*, se relaja al estado fundamental emitiendo un fotón.

A + e^{-} \rightarrow A^{-}

A - e^{-} \rightarrow A^{+}

A^{-} + A^{+} \rightarrow A* + A

A* \rightarrow A + h\nu

En ejemplos similares comunes, un correaccionante, CR, reacciona con una especie reducida u oxidada electroquímicamente generada, A^{+} o A^{-}, para formar una especie electrónicamente excitada A*, que después se relaja al estado fundamental emitiendo un fotón.

A + e^{-} \rightarrow A^{-}	A - e^{-} \rightarrow A^{+}
A^{-} + CR \rightarrow A* + CR'	A^{+} + CR \rightarrow A* + CR'
A* \rightarrow A + h\nu	A* \rightarrow A + h\nu

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La ECL se observó por primera vez a finales de 1920 y se investigó con detalle durante finales de 1960 y 1970. Se han publicado una serie de revisiones bibliográficas relacionadas con la naturaleza de la ECL (por ejemplo, el estado que emite, el mecanismo de emisión, la eficacia de emisión). Véase, por ejemplo, Knight et al., 1994 y las referencias citadas en éste.

La ECL de hidrocarburos poliaromáticos tanto en medio acuoso como no acuoso, se ha estudiado ampliamente. Entre los ejemplos de dichos compuestos se incluyen naftaleno, antraceno, fenantreno, pireno, criseno, perileno, coroneno, y rubreno.

Un ejemplo típico es la ECL del 9,10-difenilantraceno ("DPA"). Se aplica una etapa doble de potencial a un electrodo de platino, que produce productos de oxidación anódica (es decir, el catión radical, DPA^{\bullet +}) en el potencial positivo y productos de reducción catódicos (es decir, el anión radical, DPA^{\bullet -}) en el potencial negativo. Los productos sufren transferencia de electrones para dar DPA y ^{1}DPA* en estado electrónicamente excitado (singlete), que emite un fotón por quimiluminiscencia (en este caso, fluorescencia). En este ejemplo, el estado que emite se forma directamente por la transferencia de electrón (llamada "vía S").

DPA - e^{-} \rightarrow DPA^{\bullet +} (electro-oxidación)

DPA + e^{-} \rightarrow DPA^{\bullet -} (electro-reducción)

DPA^{\bullet +} + DPA^{\bullet -} \rightarrow DPA + ^{1}DPA* (transferencia de electrón)

^{1}DPA^{\bullet}\rightarrow DPA^{\bullet -} + h\nu (quimiluminiscencia)

La ECL también se puede generar usando hidrocarburos poliaromáticos combinados con otras especies químicas que pueden actuar como moléculas donadoras o aceptoras adecuadas en la etapa de transferencia de electrón. Por ejemplo, otro sistema de ECL común implica DPA y la especie donadora, N,N',N'', N'''-tetrametil-para-fenilendiamina ("TMPD"). En este caso, el estado que emite se forma en una segunda etapa de aniquilación triplete-triplete (ineficaz) a partir del producto de la primera etapa de transferencia de electrón (llamada "vía T").

TMPD - e^{-} \rightarrow TMPD^{\bullet +} (electro-oxidación)

DPA + e^{-} \rightarrow DPA^{\bullet -} (electro-reducción)

TMPD^{\bullet +} + DAP^{\bullet -} \rightarrow TMPD + ^{3}DPA^{\bullet} (transferencia de electrón 1)

^{3}DPA* + ^{3}DPA* \rightarrow DPA + ^{1}DPA* (transferencia de electrón 2)

^{1}DPA* \rightarrow DPA^{\bullet -} + h\nu (quimiluminiscencia)

También se ha estudiado ampliamente la ECL de compuestos inorgánicos y/u organometálicos. Una clase importante de dichos compuestos son los complejos de 2,2'-bipiridina ("bpy") de rutenio y osmio, tales como Ru(bpy)_{3}^{2+} y Os(bpy)_{3}^{2+}. Entre otros ejemplos de dichos compuestos se incluyen tricarbonil(cloro)(1,10-fenantrolina)renio (I), complejos de platino (II) plano-cuadrados, Cr(bpy)_{3}^{2+}, complejos multinucleares tales como Pt_{2}(difosfonato)_{4}^{4-}, y agregados tales como Mo_{6}Cl_{12}^{2-}. Véase, por ejemplo, Knight et al., 1994.

La mayoría de las investigaciones de compuestos inorgánicos y/o organometálicos se han centrado en el

\hbox{Ru(bpy) _{3}  ^{2+} }

y compuestos relacionados, debido principalmente a sus propiedades intrínsecas, y algo excepcionales, incluyendo su capacidad de emitir luminiscencia a temperatura ambiente en solución acuosa, la capacidad de sufrir reacciones de transferencia de un electrón reversibles a potenciales fácilmente alcanzables, conduciendo a especies reducidas u oxidadas suficientemente estables, insensibilidad frente a la presencia de oxígeno, y una eficacia de aniquilación cercana a 100% en ciertas condiciones. Por ejemplo, si una solución de Ru(bpy)_{3}^{2+} se somete a un potencial de doble etapa cíclico alternando entre el potencial de oxidación y reducción del complejo, se observa una emisión naranja (a \sim620 nm).

Ru(bpy)_{3}^{2+} - e^{-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{3+} (electro-oxidación)

Ru(bpy)_{3}^{2+} + e^{-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{+} (electro-reducción)

Ru(bpy)_{3}^{+} + Ru(bpy)_{3}^{3+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + Ru(bpy)_{3}^{2+}* (transferencia de electrón)

Ru(bpy)_{3}^{2+}* \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + h\nu (quimiluminiscencia)

La ECL también se puede generar usando Ru(bpy)_{3}^{2+} combinado con especies oxidantes o reductoras fuertes en solución; de esta forma, sólo es necesario aplicar la mitad del ciclo de oxidación-reducción de doble etapa. Por ejemplo, los correaccionantes peroxidisulfato (es decir, S_{2}O_{8}^{2-}, persulfato) y oxalato (es decir, C_{2}O_{4}^{2-}), se reducen u oxidan irreversiblemente, respectivamente, para formar iones SO_{4}^{\bullet -} oxidantes o CO_{2}^{\bullet -} reductores. Por ejemplo,

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Ru(bpy)_{3}^{2+} + e^{-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{+} (electro-reducción)

S_{2}O_{8}^{2-} + e^{-} \rightarrow SO_{4}^{2-} + SO_{4}^{\bullet -} (electro-reducción)

SO_{4}^{\bullet -} + Ru(bpy)_{3}^{+} \rightarrow SO_{4}^{2-} + Ru(bpy)_{3}^{2+}* (transferencia de electrón)

SO_{4}^{\bullet -} + Ru(bpy)_{3}^{2+} \rightarrow SO_{4}^{2-} + Ru(bpy)_{3}^{3+} (transferencia de electrón)

Ru(bpy)_{3}^{+} + Ru(bpy)_{3}^{3+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + Ru(bpy)_{3}^{2+}* (transferencia de electrón)

Ru(bpy)_{3}^{2+}* \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + h\nu (quimiluminiscencia)

De una forma similar, la ECL también se puede generar usando Ru(bpy)_{3}^{2+} combinado con correaccionantes tales como aminas, o compuestos que contienen grupos amina, que actúan como agentes de reducción. En general, la emisión de la reacción de ECL de Ru(bpy)_{3}^{2+} con aminas aumenta en el orden, primaria < secundaria < terciaria. En general las aminas alifáticas o alicíclicas son más eficaces que las aminas aromáticas. Un ejemplo de una amina usada normalmente es la tri-n-propilamina (es decir, N(CH_{2}CH_{2}CH_{3})_{3}, "TPAH"). Véase, por ejemplo, Leland et al., 1990. Se cree normalmente que se pierde un protón de un carbono \alpha de un grupo propilo por electro-oxidación y posterior reacción, para dar TPA^{\bullet} (es decir, (CH_{3}CH_{2}CH_{2})_{2}N(CHCH_{2}CH_{3})^{\bullet}). La secuencia de ECL se resume en las siguientes reacciones.

Ru(bpy)_{3}^{2+} - e^{-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{3+} (electro-oxidación)

TPAH - e^{-} \rightarrow [TPAH]^{+} \rightarrow TPA^{\bullet} + H^{+} (electro-oxidación y reacción)

Ru(bpy)_{3}^{3+} + TPA^{\bullet} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+}* + productos (transferencia de electrón)

Ru(bpy)_{3}^{2+}* \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + h\nu (quimiluminiscencia)

De esta forma, se ha usado la ECL de Ru(bpy)_{3}^{2+} en la determinación una amplia variedad de correaccionantes. Por ejemplo, la ECL de Ru(bpy)_{3}^{2+} se ha usado eficazmente para determinar el oxalato y persulfato a niveles tan bajos como 10^{-13} moles/litro. Igualmente, se ha usado la ECL de Ru(bpy)_{3}^{2+} en la determinación de aminas alifáticas, aminas alicíclicas (tales como asparteína, nicotina, y atropina), fármacos tales como eritromicina (que tiene un grupo trialquilamina), aminoácidos (tales como valina y prolina), y proteínas. Esto ha su vez ha conducido a la aplicación de Ru(bpy)_{3}^{2+}, así como de otros quelatos de rutenio y osmio, como marcadores de ECL sensibles para ensayos químicos y biológicos.

Los ensayos químicos y biológicos generalmente implican poner en contacto el analito de interés con una cantidad predeterminada no limitante de uno o más reactivos de ensayo, medir una o más propiedades de un producto resultante (producto(s) de detección), y correlacionar el valor medido con la cantidad de analito presente en la muestra original, típicamente usando una relación determinada a partir de muestras patrón que contienen cantidades conocidas del analito de interés en el intervalo esperado para la muestra que se va a ensayar. Típicamente, el producto de detección incorpora uno o más marcadores detectables, que son proporcionados por uno o más reactivos de ensayo. Entre los ejemplos de marcadores usados normalmente se incluyen marcadores de isótopo radiactivo, tales como ^{125}I y ^{32}P; enzima (por ejemplo, peroxidasa, \beta-galactosidasa) y marcadores de sustrato de enzimas; marcadores fluorescentes (por ejemplo fluoresceínas, rodaminas); marcadores de resonancia de espín electrónico (por ejemplo, radicales libres nitróxido); marcadores inmunorreactivos (por ejemplo, anticuerpos, antígenos); y marcadores que son un miembro de una pareja de unión (por ejemplo, biotina-avidina, biotina-estreptavidina). Los ensayos tipo sándwich típicamente implican formar un complejo en el que el analito de interés se interpone entre un reactivo de ensayo que finalmente se usa para la separación (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, un miembro de una pareja de unión) y un segundo reactivo de ensayo que proporciona un marcador detectable. Los ensayos de competición típicamente implican un sistema en el que tanto el analito de interés como un análogo del analito compiten por un sitio de unión en otro reactivo (por ejemplo, un anticuerpo), en el que el analito, el análogo o el reactivo de unión tiene un marcador detectable.

Recientemente, los marcadores de ECL se han hecho más comunes en ensayos químicos y biológicos. Por ejemplo, los marcadores de ECL (por ejemplo, los que contienen un resto Ru(bpy)_{3}^{2+}) se pueden modificar uniendo grupos reactivos (por ejemplo, a uno o mas de los ligandos bipiridilo) para formar reactivos marcadores activados para proteínas, ácidos nucleicos, y otras moléculas. Este enfoque ofrece muchas ventajas frente a otros sistemas de detección, tales como radiomarcaje con ^{32}P, incluyendo, pero sin limitar, muchas de las siguientes: (1) la ausencia de isótopos radiactivos reduciendo así los problemas asociados con el manejo y eliminación de la muestra; (2) límites de detección muy bajos para el marcador ECL, a menudo tan bajos como 0,2 picomolar (2 x 10^{-13} M), puesto que cada marcador puede emitir varios fotones por ciclo de medición; (3) un intervalo dinámico de cuantificación del marcador que a menudo se extiende a seis órdenes de magnitud; (4) marcadores extremadamente estables, a menudo con periodos de caducidad largos; (5) marcadores de bajo peso molecular (\sim1000 unidades atómicas) que se pueden acoplar a proteínas, oligonucleótidos, etc., a menudo sin afectar a la inmunorreactividad, solubilidad, capacidad de hibridar, etc.; (6) alta selectividad y poco ruido de fondo, puesto que la secuencia de reacciones de ECL es iniciada electroquímicamente y sólo se detectan las especies con adecuadas propiedades electroquímicas en las cercanías del electrodo; y (7) medición sencilla y rápida, que típicamente sólo requiere unos segundos.

En los últimos años, se ha explotado la ECL en el desarrollo de inmunoensayos y análisis con sondas de DNA. Véase, por ejemplo, Blackburn et al., 1991, Kenten et al., 1991, 1992, Leland et al., 1992, y Yost, 1993.

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En un ensayo de separación de DNA típico y conocido que usa ECL, el oligonucleótido objetivo se amplifica (por ejemplo, usando PCR) usando un oligonucleótido cebador que contienen biotina para dar una mayor concentración de los oligonucleótidos objetivo que comprenden un resto de biotina; después se añade un exceso de una sonda de hibridación de oligonucleótido a la que se ha unido un marcador ECL, y que hibrida con los oligonucleótidos objetivo para formar dúplex de sonda-objetivo; se añaden perlas revestidas con estreptavidina, que se unen fuertemente y selectivamente a los dúplex que contienen biotina; se separan las perlas de la mezcla (por ejemplo, magnéticamente, gravimétricamente), separando así el exceso de sonda de hibridación de oligonucleótido marcado; y el oligonucleótido objetivo, que está unido a las perlas y que está hibridada con una sonda de hibridación marcada con ECL, se detecta y/o se cuantifica usando ECL.

Balckburn et al. (1991), según parece, describen el uso de un derivado de éster de N-succinimidlilo de

\hbox{Ru(bpy) _{3}  ^{2+} }

como medio para unir un marcador ECL a una sonda de hibridación de oligonucleótido. Usando un cebador de oligonucleótido marcado con biotina, los productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") se podían separar por unión a perlas magnéticas revestidas con estreptavidina. Una vez separada, la sonda de oligonucleótido marcada con Ru(bpy)_{3}^{2+} se hibridaba a los productos de la PCR unidos, y detectaba por ECL.

Kenten et al. (1991) según parece describen igualmente el uso de ensayos de ECL de productos amplificados por la PCR de oncogenes, virus, y genes clonado. En un ensayo, un marcador de Ru(bpy)_{3}^{2+} se unía a uno o ambos cebadores oligonucleótidos; después de amplificación, unión y separación, los productos de la PCR eran detectados por ECL. En otro ensayo, una sonda de oligonucleótidos que tenía un marcador de Ru(bpy)_{3}^{2+} unido se hibridaba con productos de la PCR unidos a perlas magnéticas, se separaba el exceso de sonda lavando, y se detectaba el producto hibridado por ECL. En un tercer ensayo, una sonda de oligonucleótido que tenía una marcador de Ru(bpy)_{3}^{2+} unido se hibridaba a productos de la PCR no unidos, el producto hibridado se unía a perlas magnéticas, el exceso de sonda se separaba lavando, y el producto hibridado se detectaba por ECL. En cada caso, el producto deseado se detectó por la presencia de un marcador ECL.

Kenten et al. (1992) según parece describen "ensayos de unión" que usan marcadores de ECL. Según parece, se forma un complejo que comprende el analito de interés, un marcador ECL, y una partícula, y posteriormente la presencia de este complejo se detecta por ECL.

Los ensayos químicos y biológicos a menudo se pueden clasificar convenientemente como "ensayos de separación" o "ensayos sin separación". En general, en los ensayos de separación, el(los) producto(s) de detección se separa(n) físicamente de otros productos y/o analitos de interés sin reaccionar y los reactivos de ensayo sin reaccionar. (Por ejemplo, a menudo es necesario separar físicamente el producto de detección de forma que sólo se detecten los marcadores que son parte del producto de detección, y no los del reactivo marcado en exceso). Después, la cantidad de analito se puede determinar directamente a partir de la cantidad de producto de detección marcado, o indirectamente a partir de la cantidad de reactivo marcado no usado. La separación se puede lograr a menudo explotando una reacción de unión selectiva entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo, biotina-avidina, anticuerpo-antígeno, sonda de hibridación de oligonucleótido-oligonucleótido). Por ejemplo, primero se puede formar un producto de detección marcado que tiene un miembro de una pareja de unión en una fase fluida (por ejemplo, en solución), y después la separación se puede realizar, por ejemplo, por captura del producto de detección marcado con ECL por un reactivo en fase sólida que tiene el otro miembro de la par de unión; después el producto de detección se puede recuperar lavando la fase sólida libre del analito y reactivos sin reaccionar. Se conocen muchas otras estrategias de separación que usan parejas de unión.

Son muy convenientes los ensayos que no requieren una etapa de separación, ya que típicamente requieren menos manipulación de la muestra, y a menudo se adaptan fácilmente a ensayos "en tiempo real". Dichos ensayos se pueden clasificar a menudo como "ensayos sin separación". En los ensayos sin separación, el producto de detección típicamente no se separa físicamente de los reactivos de ensayo no usados y el analito no usado. En su lugar, la presencia del producto de detección típicamente se detecta por una propiedad que al menos uno de los reaccionantes de ensayo adquiere o pierde sólo como resultado del contacto con el analito de interés. Se han desarrollado una serie de dichos ensayos sin separación.

En un ejemplo de un ensayo sin separación, se usa tanto una enzima como un inhibidor de enzima. Cuando se ponen en contacto con el analito de interés, la enzima y el inhibidor de enzima quedan juntos (para reducir la actividad de la enzima) o separados (para aumentar la actividad de la enzima). Después cualquier cambio de la actividad de la enzima se correlaciona con la presencia y/o cantidad del analito de interés. Véase, por ejemplo, Yoshida et al., 1980, y Zuk et al., 1980.

En otro ejemplo de un ensayo sin separación, se usa tanto un cromóforo como un modificador de cromóforo. Otra vez, cuando se ponen en contacto con el analito de interés, el cromóforo y modificador de cromóforo quedan juntos o separados, dando así un cambio de color o un cambio de intensidad de un color especificado. Después cualquier cambio de color y/o intensidad de color se correlaciona con la presencia y/o cantidad de analito de interés. Véase, por ejemplo, Zuk, et al., 1980.

Todavía en otro ejemplo de ensayo sin separación, se usa tanto un fluoróforo como un atenuador de fluoróforo. Cuando se ponen en contacto con el analito de interés, el fluoróforo y atenuador de fluoróforo quedan juntos (para reducir la fluorescencia) o separados (para aumentar la fluorescencia). Véase, por ejemplo, Ullman et al., 1976; Ullman, 1979; Zuk et al., 1981; y Ullman et al., 1981. A continuación se discuten ejemplos más recientes de ensayos de fotoluminiscencia (por ejemplo, ensayos de fluorescencia) que explotan los atenuadores de fotoluminiscencia.

Tyagi et al. (1996) según parece, describen un ensayo para oligonucleótidos que usa una sonda de oligonucleótido particular (denominada "guía molecular") que tiene tanto un fluoróforo (es decir, un marcador) como un atenuador de fluorescencia. En ausencia del oligonucleótido objetivo, partes de la sonda de oligonucleótido se hibridan consigo mismo, dejando el fluoróforo y el atenuador de fluorescencia muy cerca; de esta forma, no se observa señal de fluorescencia. En presencia del oligonucleótido objetivo, la sonda de oligonucleótido se deshibrida y se hibrida preferiblemente con el oligonucleótido objetivo, y al hacer esto, separa el fluoróforo y atenuador de fluorescencia; de esta forma se observa una señal de fluorescencia. Por lo tanto, la fluorescencia sólo se observa con las sondas de oligonucleótidos que se hibridan con el oligonucleótido objetivo. De esta forma, no es necesario separar las sondas de oligonucleótido sin hibridar para medir la señal de fluorescencia.

Heid et al. (1996) según parece, describen un ensayo cuantitativo en tiempo real para análisis de DNA usando sondas de hibridación fluorogénicas doblemente marcadas. Se prepara una sonda de oligonucleótido que tiene un primer colorante fluorescente (FAM, 6-carboxifluoresceína) que actúa como informador, y un segundo colorante fluorescente (TAMRA, 6-carboxi-tetrametilrodamina) que atenúa el espectro de emisión del primer colorante fluorescente. La actividad de la exo-nucleasa específica de 5' de la polimerasa Taq hace que se degraden sólo las sondas que se han hibridado con el oligonucleótido objetivo, liberando los dos colorantes, y dando como resultado un aumento de la emisión de fluorescencia de la FAM.

Wittwer et al. (1997) según parece, describen métodos para controlar continuamente la fluorescencia de los productos de la PCR durante la amplificación. En un ensayo, se hibridan sondas de oligonucleótidos doblemente marcados disponibles en el comercio, que tienen tanto un resto "donador" (por ejemplo, fluoresceína) como un resto "aceptor" (por ejemplo, rodamina), con un oligonucleótido objetivo. Según parece, la cercanía del aceptor atenúa la señal de fluorescencia del donador. Se añade una polimerasa que tiene actividad de exo-nucleasa específica de 5', y durante la polimerización, la sonda de oligonucleótido se degrada, liberando tanto el donador como el aceptor. Puesto que ya no está cerca del aceptor, entonces el donador da una mayor señal de fluorescencia. En otro ensayo, basado en transferencia de energía de resonancia, se preparan dos sondas de oligonucleótidos diferentes, una que tiene un resto "donador" (por ejemplo, fluoresceína), y uno que tiene un resto "aceptor" (por ejemplo, el colorante cianina Cy5®). Las dos sondas de oligonucleótidos eran seleccionadas de forma que, cuando hibridaban con el oligonucleótido objetivo, los restos donador y aceptor quedan cerca. Cuando el donador es fotoexcitado, parte o toda su energía es transferida al aceptor, y la señal de fluorescencia del aceptor aumenta. (Véase también, por ejemplo, Maliwal et al., 1995). De esta forma, se detecta y cuantifica el oligonucleótido objetivo por un aumento de la señal de fluorescencia del aceptor.

A diferencia de la atenuación de la ECL, la atenuación de la fotoluminiscencia ha sido ampliamente estudiada, y se conocen muchos compuestos que atenúan la fotoluminiscencia en una variedad de condiciones. En la patente de EE.UU. nº 5.332.662 por ejemplo, se describe un método para determinar una sustancia activa peroxidativa detectando la señal de fluorescencia producida al escindir una sustancia que comprende un grupo fluorescente y un atenuador. A diferencia de esto, sólo se conocen algunos compuestos que atenúen eficazmente la ECL, y muchos de los que son conocidos (por ejemplo metilviologen-carboxilato) sólo atenúan pobremente la ECL o son impracticables para usar en ensayos.

Los autores de la invención han descubierto ciertas clases de compuestos distintos atenúan fuertemente la ECL, tal como compuestos que comprenden al menos un resto benceno, y más particularmente, compuestos que comprenden al menos un resto fenol, resto quinona, resto ácido benceno-carboxílico, y/o benceno-carboxilato.

Las propiedades de ECL de dichos compuestos no se han estudiado ampliamente. Se conoce el uso de compuestos fuertemente fluorescentes, tales como antracenos, para aumentar la emisión de ECL, y son realmente ampliamente usados en ensayos de ECL comunes. Chmura et al. (1994) según parece, examinaron ensayos para depuradores de antioxidantes y radicales libres, tales como citrato, que se basan en la capacidad de estos compuestos para atenuar la ECL sensibilizada del antraceno. Kricka et al. (1991) según parece describen el uso de p-yodofenol como un potenciador de la quimiluminiscencia, más que un atenuador. Hill et al. (1988) según parece, examinaron la emisión de ECL de una serie de derivados dansilados en un intento de adaptar la ECL a la cromatografía líquida de fase inversa (RPLC). Según parece, examinaron el efecto del grupo dansilo (es decir, 5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo), que es un marcador fluorescente conocido, en la emisión de ECL de una serie de compuestos aminoácidos y fenólicos, y encontraron que la presencia de un grupo dansilo aumentaba la emisión de ECL de muchos de los compuestos probados. En su estudio de la ECL de complejos de osmio, Abruna et al. (1985) según parece, describen la atenuación de la ECL de una especia Os(bpy)_{2}diphos^{+2} por una especie ferriceno (la forma oxidada de un ferroceno), una especie que consta de dos iones ciclopentadienilo (es decir, C_{5}H_{5}^{-}) y un ion ferroso (es decir, Fe^{2+}) interpuesto.

Usando los atenuadores de ECL eficaces descritos en la presente memoria, se pueden desarrollar ensayos que usan un marcador ECL y un atenuador de ECL y que permiten, entre otros, ensayos tales como ensayos sin separación, que ofrecen muchas, si no todas, las ventajas ofrecidas por los métodos de detección de ECL frente a otros métodos de detección. Por lo tanto, la presente invención se refiere ampliamente a ciertas clases de restos químicos que atenúan fuertemente la ECL, y al uso de estos atenuadores de ECL, por ejemplo, en ensayos de ECL, que usan un marcador ECL y un atenuador de ECL. Una clase de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto benceno. Subclases de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto fenol, resto quinona, resto ácido benceno-carboxílico, y/o benceno-carboxilato.

Breve descripición de la invención

La presente invención se refiere en general a ciertas clases de restos químicos que atenúan fuertemente la ECL, y al uso de estos atenuadores de ECL combinados con marcadores de ECL, por ejemplo, en métodos de ensayo de ECL que usan un atenuador de ECL y un marcador ECL. Una clase de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto benceno. Subclases de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto fenol, resto quinona, resto ácido benceno-carboxílico, y/o benceno-carboxilato.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para detectar un oligonucleótido en una composición muestra que comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla de ensayo que comprende: dicha composición muestra; un reactivo que tiene un resto químico que tiene propiedades electroquimiluminiscentes (marcador ECL), y un reactivo que tiene un resto químico que cuando está en contacto de atenuación con un marcador ECL atenúa la emisión de ECL observada (resto atenuador de ECL), comprendiendo dicho resto atenuador de ECL al menos un resto benceno; b) determinar cualquier diferencia entre las emisiones de ECL de: (i) el mezcla de ensayo preparada en la etapa (a); y (ii) una mezcla de ensayo que comprende: dicho reactivo que tiene un marcador ECL; dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL; y una cantidad conocida de dicho oligonucleótido, y (c) correlacionar cualquier diferencia determinada en la etapa (b) con la cantidad de oligonucleótido en dicha muestra.

En una realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto seleccionado del grupo que consta de restos fenol, restos quinona, restos ácido benceno-carboxílico y restos benceno-carboxilato. En una realización, dicho atenuador de ECL comprende al menos un resto fenol. En una realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto quinona. En una realización, dicho atenuador de ECL comprende al menos un resto ácido benceno-carboxílico. En una realización, dicho atenuador de ECL comprende al menos un resto benceno-carboxilato.

En una realización, dicho marcador ECL comprende rutenio. En una realización, dicho marcador ECL comprende osmio. En una realización, dicho marcador ECL comprende un hidrocarburo poliaromático.

El analito comprende un oligonucleótido. En una realización, dicho analito comprende DNA. En una realización, dicho analito comprende RNA.

En una realización, dicha cantidad conocida de analito es cero.

En una realización, dicho reactivo que tiene un marcador ECL y dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL son el mismo reactivo. En una realización, dicho reactivo que tiene un marcador ECL y dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL son diferentes reactivos.

En una realización, el método además comprende las etapas de: llevar a cabo una reacción química en un sustrato presente en una composición muestra inicial, para producir dicho analito en dicha composición muestra antes de la etapa (a); y, correlacionar cualquier diferencia determinada en la etapa (b) con la cantidad de sustrato en dicha composición de muestra inicial. En una realización, el método además comprende las etapas de: llevar a cabo una reacción química con la mezcla de ensayo preparada en la etapa (a) antes de determinar la etapa (b).

Como se hará evidente, las propiedades y características preferidas de un aspecto de la invención se pueden aplicar a cualquier otro aspecto de la invención.

Breve descripición de los dibujos

La figura 1 es un grafica que representa la intensidad de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH frente a la concentración de fenol (como un agente atenuador), como se describe en el siguiente Ejemplo 1.

La figura 2 es un grafica que representa la intensidad de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/C_{2}O_{8}^{-2} frente a la concentración de fenol (como un agente atenuador), como se describe en el siguiente Ejemplo 2.

La figura 3 es un grafica que representa la intensidad de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH frente a la concentración de fenol, ácido p-hidroxibenzoico (PHBA) y ácido p-aminobenzoico (PABA) (como agentes atenuadores), como se describe en el siguiente Ejemplo 3.

La figura 4 es un grafica que representa la intensidad de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH frente a la concentración de fenol, catecol, hidroxiquinona y quinona (como agentes atenuadores), como se describe en el siguiente Ejemplo 7.

La figura 5 es un grafica que representa la intensidad de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH frente a la concentración de fenol, quinona, y 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ) (como agentes atenuadores), como se describe en el siguiente Ejemplo 8.

La figura 6 es un grafico que representa la intensidad de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH frente a la concentración de fenol (como un agente atenuador), y viologen-carboxilato de metilo (como comparación) como se describe en el siguiente Ejemplo comparativo 1.

Descripición detallada de la invención

La presente invención se refiere en general a ciertas clases de restos químicos que atenúan fuertemente la ECL, y al uso de dichos atenuadores de la ECL combinados con marcadores de ECL, por ejemplo, en ensayos de ECL que usan un atenuador de ECL y un marcador ECL.

A. Marcadores electroquimiluminiscentes

Como se ha descrito antes, la ECL es la emisión de fotones de radiación electromagnética (por ejemplo, luz) de una especie química electrónicamente excitada que ha sido generada electroquímicamente.

Las expresiones "marcador electroquimiluminiscente" y "marcador ECL", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a un resto químico que tiene propiedades electroquimiluminiscentes. Más específicamente, un marcador ECL es un resto químico que se puede convertir electroquímicamente en una especie electrónicamente excitada la cual, directamente o después de posterior reacción química, emite uno o más fotones (por ejemplo, luz) cuando se relaja a un estado de menor energía.

Varios restos químicos pueden servir como un marcador ECL. Una clase importante de dichos restos derivan de quelatos metálicos, que comprenden uno o más iones metálicos, que pueden ser iguales o diferentes, y uno o más ligandos, que pueden ser iguales o diferentes.

En una realización, el ion metálico del quelato metálico se selecciona del grupo que consta de iones de metales de transición e iones de metales de tierras raras en cualquiera de sus estados de oxidación. En otra realización, el ion metálico se selecciona del grupo que consta de iones de rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnecio, cobre, cromo y tungsteno en cualquier de sus estados de oxidación. En otra realización, el ion metálico se selecciona del grupo que consta de iones de rutenio y osmio en cualquiera de sus estados de oxidación.

Los ligandos del quelato metálico pueden ser monodentados o polidentados, y pueden ser orgánicos (es decir, que comprenden al menos un átomo de carbono) o inorgánicos. Entre los ejemplos de ligandos monodentados se incluyen monóxido de carbono (es decir, CO), ion cianuro (es decir, CN^{-}), ion isocianato (es decir, NC^{-}), haluros (por ejemplo, F^{-}, Cl^{-}, Br^{-}, I^{-}), fosfinas (por ejemplo, PR_{3}), aminas (por ejemplo, NR_{3}), estilbenos (por ejemplo, SbR_{3}), y arsinas (por ejemplo, AsR_{3}). Entre los ejemplos de ligandos polidentados se incluyen ligandos heterocíclicos aromáticos tales como ligandos heterocíclicos aromáticos que contienen nitrógeno. Entre los ejemplos de ligandos heterocíclicos aromáticos que contienen nitrógeno, se incluyen bipiridilos, bipirazilos, terpiridilos y fenantroilos sustituidos o no sustituidos. Entre los ejemplos de sustituyentes se incluyen alquilo C_{1-6}, alquilo C_{1-6} sustituido, arilo y heteroarilo C_{6-15}, arilo y heteroarilo C_{6-15} sustituido, aralquilo y heteroaralquilo C_{7-15}, aralquilo y heteroaralquilo C_{7-15} sustituido, carboxi (es decir, -COOH), carboxilato (es decir, -COO^{-}), carboxiésteres (es decir, -COOR, tales como el éster de N-hidroxisuccinimidilo), carboxaldehído (es decir, -CHO), carboxamida (es decir, -CONH_{2}), hidroxi (es decir, -OH), ciano (es decir, -CN), isociano (es decir, -NC), amino (es decir, -NH_{2}), imino (es decir, =NH), sulfhidrilo (es decir, -SH), y fosfino (es decir, -PH_{2}).

En una realización, el marcador ECL deriva de un catión tris(2,2'-bipiridil)rutenio (II), Ru(bpy)_{3}^{2+}, mostrado a continuación, o uno de sus derivados.

1

Las sales de Ru(bpy)_{3}^{2+} y sus derivados normalmente son compuestos solubles en agua muy estables, que se pueden modificar químicamente para que tengan grupos reactivos (es decir, formar especies químicamente activadas). Por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos reactivos a uno o más de los ligandos bipiridilo, que luego permitan la unión del resto de tipo Ru(bpy)_{3}^{2+} (como un marcador ECL) a otras moléculas. Véase, por ejemplo, Bard et al., 1993 y Blackburn et al., 1991.

Por ejemplo, uno de los tres ligandos bipiridilo se puede derivatizar para que tenga un éster de N-succinimidilo de un grupo ácido carboxílico unido a uno de los ligandos bipiridilo por un grupo conector. Dicho compuesto es el dihexafluorofosfato de 4-(N-succinimidiloxicarbonilpropil)-4'-metil-2,2'-bipiridina-bis(2,2'-bipiridina)rutenio (II), cuyo catión se muestra a continuación, y que está disponible en el comercio en IGEN Inc. (Rockville, Maryland) con el nombre de producto marcador ECL Origen®. Este éster activado, mostrado a continuación, permite la unión fácil del marcador ECL de tipo Ru(bpy)_{3}^{2+} a moléculas que tienen, por ejemplo, un grupo amina (por ejemplo, -NH_{2}).

2

En otro ejemplo, uno de los tres ligandos bipiridilo se puede derivatizar para que tenga un grupo maleimida, opcionalmente por un grupo conector. Esto se puede lograr, por ejemplo, haciendo reaccionar un derivado de éster activo, tal como el mostrado antes, con una maleimido-alquilamina (por ejemplo, maleimidoetilamina). Dicho compuesto es el dihexafluorofosfato de 4-(maleimido-etilaminocarbonilpropil)-4'-metil-2,2'-bipiridina-bis(2,2'-bipiridina)rutenio (II), cuyo catión se muestra continuación. Esta maleimida permite la unión fácil del marcador ECL de tipo

\hbox{Ru(bpy) _{3}  ^{2+} }

a moléculas que tienen, por ejemplo, un grupo tiol (por ejemplo, -SH).

3

Otros ejemplos de quelatos metálicos a partir de los cuales se pueden derivar marcadores ECL de tipo Ru(bpy)_{3}^{2+}, incluyen:

bis[(4,4'-carbometoxi)-2,2'-bipiridina]-2-[3-(4-metil-2,2'-bipiridina-4'-il)propil]-1,3-dioxolano-rutenio (II);

bis(2,2'-bipiridina)-[4-(butan-1-al)-4'-metil-2,2'-bipiridina]-rutenio (II);

bis(2,2'-bipiridina)-[ácido 4-(4'-metil-2,2'-bipiridina-4'-il)-butírico]-rutenio (II);

bis(2,2'-bipiridina)-[4-(4'-metil-2,2'-bipiridina-4'-il)-butilamina]-rutenio (II);

bis(2,2'-bipiridina)-[1-bromo-4-(4'-metil-2,2'-bipiridina-4'-il)-butano]-rutenio (II); y

bis[ácido (2,2'-bipiridina)maleimidohexanoico]-4-metil-2,2'-bipiridina-4'-butilamida-rutenio (II).

Entre otros ejemplos de quelatos metálicos de los cuales pueden derivar marcadores ECL se incluyen otros complejos de 2,2'-bipiridilo, tales como Os(bpy)_{3}^{2+} y sus derivados; fenantrolina (phen) y sus derivados; otros fluoróforos de metal de transición, tales como tricarbonil(cloro)(1,10-fenantrolina)renio (I), complejos de platino (II) plano-cuadrados, Cr(bpy)_{3}^{2+}; complejos multinucleares tales como Pt_{2}(difosfonato)_{4}^{4-}; y agregados tales como Mo_{6}Cl_{12}^{2-}.

Otra clase importante de restos químicos que pueden servir como un marcador ECL son los derivados de hidrocarburos poliaromáticos, tales como naftaleno, antraceno, 9,10-difenilantraceno, fenantreno, pireno, criseno, perileno, coroneno, rubreno, y similares, y de colorantes láser orgánicos, tales como fluoresceína, rodamina y similares, que pueden emitir luz por excitación electroquímica.

Típicamente, se unen uno o más marcadores ECL (por ejemplo, conjugados) a otra molécula (por ejemplo, un anticuerpo, una sonda de oligonucleótido). Los marcadores ECL se pueden unir a moléculas (para formar moléculas marcadas) usando métodos sintéticos patrón que son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, como se ha discutido antes, una molécula que comprende marcador ECL (por ejemplo, Ru(bpy)_{3}^{2+} o uno de sus derivados) se puede derivatizar para formar una especie químicamente activada (por ejemplo, un éster activado, una maleimida) que después se puede hacer reaccionar con, y por lo tanto unir covalentemente a, una molécula (por ejemplo, para dar un reactivo de ensayo marcado).

B. Restos atenuadores

Como se ha descrito antes, la ECL es la emisión de fotones de radiación electromagnética (por ejemplo, luz) de una especie química electrónicamente excitada que ha sido generada directa o indirectamente, electroquímicamente. La emisión de ECL observada puede ser parcialmente o completamente atenuada por un resto atenuador que está en contacto de atenuación con un marcador ECL. Las expresiones "resto atenuador" y "atenuador" tal como se usan en la presente memoria, se refieren a un resto químico, que cuando está en contacto de atenuación con un marcador ECL, atenúa la emisión de ECL observada.

La expresión "en contacto de atenuación con", tal como se usa en la presente memoria, se refiere al estado en el que la emisión ECL observada de un marcador ECL es atenuada por la presencia de un resto atenuador de ECL. Un resto atenuador en contacto de atenuación con un marcador ECL atenúa la emisión ECL observada de este marcador al menos en 10%. Preferiblemente, un resto atenuador en contacto de atenuación con un marcador ECL atenúa la emisión ECL observada de este marcador en al menos 20%, más preferiblemente al menos 30%, todavía más preferiblemente al menos 40%, incluso más preferiblemente al menos 50%. Típicamente, un resto atenuador en contacto de atenuación con un marcador ECL, está físicamente presente, espacialmente cerca del marcador ECL. Por ejemplo, un resto atenuador en contacto de atenuación con un marcador ECL está típicamente separado de un marcador ECL por una distancia de menos de aproximadamente 100 nm, más típicamente menos de aproximadamente 50 nm, todavía más típicamente menos de aproximadamente 30 nm, todavía más típicamente menos de aproximadamente 10 nm. Usando métodos conocidos y patrón, un experto en la técnica puede determinar fácilmente si un posible resto atenuador de hecho atenuará la emisión ECL observada, y también si un resto atenuador especificado está o no, de hecho, en contacto de atenuación, con un marcador ECL.

Sin querer ligarse por ninguna teoría particular, los autores de la invención indican que se han postulado varios mecanismos posibles para el efecto de atenuación. En un mecanismo, el marcador electrónicamente excitado se relaja transfiriendo un electrón al atenuador (quizás por efecto túnel cuantomecánico), para dar un atenuador electrónicamente excitado, que se relaja no radiactivamente (por ejemplo, por vibración, rotación). En otro mecanismo, el marcador electrónicamente excitado se relaja emitiendo un fotón que es absorbido por el atenuador, para dar un atenuador electrónicamente excitado, que otra vez se relaja no radiactivamente. Todavía en otro mecanismo, el resto atenuador se convierte electroquímicamente en un producto de electro-oxidación o electro-reducción (típicamente durante la medición de ECL), y este producto (o posterior producto de reacción) atenúa la ECL, por ejemplo, por uno de los mecanismos precedentes. Todavía en otro mecanismo, el resto atenuador, o un producto de electro-oxidación o electro-reducción del resto atenuador (o posterior producto de reacción) actúa como un depurador de radicales libres e intercepta una o más especies implicadas en la secuencia de reacciones de ECL (por ejemplo, TPA^{\bullet} puede ser interceptado antes de la reacción con Ru(bpy)_{3}^{2+}, evitando la formación de Ru(bpy)_{3}^{2+}*) y por lo tanto atenuando la ECL.

Varios restos químicos pueden servir como un resto atenuador. Una clase importante de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto fenol. Otra subclase de restos atenuadores preferidos son los que comprenden al menos un resto quinona (es decir, 1,4-benzoquinona o 1,2-benzoquinona). Todavía otra subclase de restos atenuadores preferidos son los que comprenden al menos un resto ácido benceno-carboxílico o benceno-carboxilato.

4

La expresión "agente atenuador", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto químico que comprende un resto atenuador. Entre los ejemplos de agentes atenuadores que constan de al menos un resto fenol, y a partir de los cuales se pueden derivar restos atenuadores que comprende al menos un resto fenol, se incluyen, pero no se limita:

fenol;

alquil-fenoles, tales como alquil(C_{1-6})-fenoles incluyendo o-alquil-fenol, m-alquil-fenol, y p-alquil-fenol, tales como o-metil-fenol (es decir, o-cresol), m-metil-fenol (es decir, m-cresol), p-metil-fenol (es decir, p-fenol), o etil-fenol, m-etil-fenol, p-etil-fenol, o-propil-fenol, m-propil-fenol, y p-propil-fenol;

aril-fenoles, tales como aril(C_{7-10})-fenoles, incluyendo o-aril-fenol, m-aril-fenol, y p-aril-fenol, tal como p-fenil-fenol;

halógeno-fenoles, incluyendo o-halógeno-fenol, m-halógeno-fenol, y p-halógeno-fenol, tal como o-fluoro-fenol, m-fluoro-fenol, y p-fluoro-fenol;

hidroxi-fenoles, incluyendo o-hidroxi-fenol (es decir, catecol), m-hidroxi-fenol (es decir, resorcinol), y p-hidroxi-fenol (es decir, hidroxiquinona); y

bifenoles, tales como 4,4'-bifenol.

Entre los ejemplos de agentes atenuadores que comprenden al menos un resto quinona, y a partir de los cuales se pueden derivar restos atenuadores que constan de al menos un resto quinona, se incluyen, pero no se limita:

quinonas (es decir, benzoquinonas), tales como o-quinona (es decir, 1,2-benzoquinona) y p-quinona (es decir, 1,4-benzoquinona);

alquil-quinonas, tales como alquil(C_{1-6})-quinonas, incluyendo alquil(C_{1-6})-1,4-benzoquinonas, tales como 2-metil-1,4-benzoquinona, 2-etil-1,4-benzoquinona, 2-n-propil-1,4-benzoquinona, 2,6-dimetil-1,4-benzoquinona, y 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona;

halógeno-quinonas, tales como halógeno-1,4-benzoquinonas, incluyendo 2-fluoro-1,4-benzoquinona, 2-cloro-1,4-benzoquinona, 2-bromo-1,4-benzoquinona, 2-yodo-1,4-benzoquinona, 2,6-difluoro-1,4-benzoquinona, 2,5-difluoro-1,4-benzoquinona, 2,6-dicloro-1,4-benzoquinona, 2,5-dicloro-1,4-benzoquinona; 2,6-dibromo-1,4-benzoquinona, y 2,5-dibromo-1,4-benzoquinona;

naftoquinonas, tales como 1,2-naftoquinonas y 1,4-naftoquinonas, incluyendo 2-metoxi-3-metil-1,4-naftoquinona;

antraquinonas, tales como 1,2-antraquinonas, 1,4-antraquinonas, 9,10-antraquinonas, incluyendo 1,5-dihidroxi-9,10-antraquinona, 1,2,3,4-tetrafluoro-5,8-dihidroxi-9,10-antraquinona, ácido 9,10-antraquinona-2-carboxílico, ácido 9,10-antraquinona-2-sulfónico, ácido 9,10-antraquinona-1,5-disulfónico, y ácido 9,10-antraquinona-2,6-disulfónico.

Entre los ejemplos de agentes atenuadores que comprenden al menos un resto ácido benceno-carboxílico o benceno-carboxilato, y a partir de los cuales se pueden derivar restos atenuadores que comprenden un resto ácido benceno-carboxílico y benceno-carboxilato, se incluyen, pero no se limita:

ácido benzoico;

ácidos aminobenzoicos, tales como o-aminofenol, m-aminofenol y p- aminofenol.

ácidos hidroxibenzoicos, tales como o-hidroxifenol, m-hidroxifenol y p- hidroxifenol; y

ácidos nitrobenzoicos, tales como o-nitrofenol, m-nitrofenol y p-nitrofenol.

En una realización, el resto atenuador es una quinona o uno de sus derivados. Las quinonas y sus derivados normalmente se pueden modificar químicamente para que tengan grupos reactivos (es decir, para formar especies químicamente activadas). Por ejemplo, se pueden unir uno o más reactivos (por ejemplo, en las posiciones orto o meta de la 1,4-benzoquinona) opcionalmente por un grupo conector, que después permitan la unión del resto tipo quinona (como un resto atenuador) a otras moléculas.

Por ejemplo, la 1,4-benzoquinona se puede derivatizar para que tenga un grupo ácido carboxílico (es decir,

\hbox{-COOH}

) unido a un carbono orto o meta por un grupo conector, tal como un grupo alquilo. Dicho compuesto es la 2-(1-carboxi-but-2-il)-5-metil-1,4-benzoquinona. Este derivado de ácido carboxílico se puede derivatizar para formar el éster de N-succinimidilo (mostrado a continuación), que permite la unión fácilmente del resto atenuador de tipo quinona a moléculas que tienen, por ejemplo, un grupo amino.

5

Los restos atenuadores se pueden unir a moléculas usando métodos sintéticos patrón y conocidos. Por ejemplo, como se ha discutido antes, una molécula que comprende un resto atenuador (por ejemplo, benceno o un derivado, tal como fenol, quinona, ácido benceno-carboxílico, benceno-carboxilato) se puede derivatizar para formar una especie químicamente activada (por ejemplo, un éster activo, una maleimida) que después se puede hacer reaccionar con, y así unir covalentemente a, una molécula.

C. Ensayos que usan un marcador ECL y un atenuador de ECL

La presente invención proporciona nuevos métodos de ensayo para detectar, y preferiblemente cuantificar, uno o más analitos de interés, que estén presentes en una composición muestra. Los términos "ensayo" y "método de ensayo", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a un método para detectar la presencia (por ejemplo, ensayo cualitativo), y preferiblemente cuantificar (por ejemplo, ensayos cuantitativos), uno o más analitos de interés.

Los ensayos de la presente invención generalmente implican poner en contacto el analito de interés (que típicamente es un componente de una composición muestra) con una cantidad predeterminada no limitante de uno o más reactivos de ensayo, medir las propiedades ECL de un producto resultante (el(los) producto(s) de detección), y correlacionar la ECL medida con la cantidad de analito presente en la muestra original, típicamente usando una relación determinada a partir de muestras patrón que contienen cantidades conocidas de analito de interés en el intervalo esperado para la muestra que se va a ensayar. En un ensayo cualitativo, simplemente determinando si la ECL medida está por encima o por debajo de un valor umbral (establecido, por ejemplo, usando muestras que se sabe que contienen o no tienen el analito de interés) puede ser suficiente para establecer el resultado del ensayo. Por lo tanto, salvo que se indique otra cosa, el término "medida" se puede referir a determinación cualitativa o cuantitativa. Los ensayos de la presente invención pueden ser ensayos heterogéneos (separación) o ensayos homogéneos (sin separación).

Las expresiones "analito" y "analito de interés", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a un oligonucleótido que se va a detectar y preferiblemente cuantificar.

Las expresiones "muestra" y "composición muestra", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a una composición que comprende uno o más analitos de interés, o que se puede procesar para que comprenda uno o más analitos de interés. La muestra puede estar en forma sólida, emulsión, suspensión, líquido o gas. Típicamente, la muestra se procesa (por ejemplo, por adición de un electrolito líquido) para que sea una forma de fluido (es decir, fluido) (por ejemplo, emulsión, suspensión, solución) con el fin de permitir fácilmente y simplificar la detección y cuantificación de los analitos de interés usando métodos de ECL. Típicamente, el analito de interés está presente en la composición muestra con una concentración de 10^{-3} M (micromolar) o menos, por ejemplo, a menudo tan bajo como 10^{-12} M (picomolar), e incluso tan bajo como 10^{-13} M (sub-picomolar).

Los ensayos de la presente invención se pueden caracterizar como ensayos de ECL; es decir, en los ensayos de la presente invención, la presencia de analitos de interés, y preferiblemente la cantidad de analitos de interés, se determina usando ECL. Además, los ensayos de la presente invención se basan en el uso de marcador ECL combinado con ciertas clases de atenuadores de ECL. Una clase de dichos restos atenuadores son los que comprenden al menos un resto benceno. Subclases de dichos restos atenuadores, son los que comprenden al menos un resto fenol, resto quinona, resto ácido benceno-carboxílico y/o benceno-carboxilato, como se ha descrito antes.

Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para detectar un analito en una composición muestra, que comprende las etapas de:

(a)

preparar una mezcla de ensayo que comprende: dicha composición muestra; un reactivo que tiene un marcador ECL; y un reactivo que tiene un resto atenuador de ECL, comprendiendo dicho resto atenuador de ECL al menos un resto benceno;

(b)

determinar cualquier diferencia entre las emisiones de ECL de

(i)

la mezcla de ensayo preparada en la etapa (a); y

\newpage

(ii)

una mezcla de ensayo que comprende:

dicho reactivo que tiene un marcador ECL;

dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL; y

una cantidad conocida de dicho analito; y

(c)

correlacionar cualquier diferencia determinada en la etapa (b) con la cantidad de analito en dicha muestra.

En una realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto seleccionado del grupo que consta de restos fenol, restos quinona, restos ácido benceno-carboxílico, y restos benceno-carboxilato, como se ha descrito antes. En otra realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto fenol. En otra realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto quinona. En otra realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto ácido benceno-carboxílico. En otra realización, dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto benceno-carboxilato.

En una realización, dicha cantidad conocida de analito es cero.

En una realización dicho reactivo que tiene un marcador ECL y dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL son el mismo reactivo. En otra realización, dicho reactivo que tiene un marcador ECL y dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL son reactivos diferentes.

En una realización, el método comprende además la etapa inicial de llevar a cabo una reacción química en un sustrato presente en una composición muestra inicial para producir dicho analito en dicha composición muestra, y la etapa final de correlacionar cualquier diferencia determinada en la etapa (b) con la cantidad de sustrato en dicha composición muestra inicial.

En una realización, el método además comprende la etapa de llevar a cabo una reacción química con la muestra de ensayo preparada en la etapa (a) antes de determinar la etapa (b).

En una realización, la presencia de un analito de interés particular da como resultado una disminución de la emisión de ECL que resulta, por ejemplo, de una disminución en una emisión de ECL particular de un marcador ECL. Dicho cambio en la emisión de ECL puede resultar, por ejemplo, de introducir un resto atenuador en contacto de atenuación con un marcador ECL. Alternativamente, en otra realización, la presencia de un analito de interés particular da como resultado un aumento de la emisión de ECL que resulta, por ejemplo, de un aumento de una emisión de ECL particular de un marcador ECL. Dicho cambio en la emisión de ECL puede resultar, por ejemplo, de eliminar un resto atenuador del contacto de atenuación con un marcador ECL.

En una realización, los ensayos de la presente invención, explotan parejas de unión con el fin de poner juntos (en contacto de atenuación) o separar (fuera del contacto de atenuación) marcadores de ECL y restos atenuadores de ECL. Entre los ejemplos de parejas de unión se incluyen oligonucleótidos y sondas de hibridación de oligonucleótidos; anticuerpos y antígenos; enzimas y sustratos; y parejas de unión fuertes tales como biotina-avidina. Típicamente dichas parejas de unión se pueden usar en ensayos de la presente invención, para permitir la detección de un analito de interés, que es un miembro de una pareja de unión, o que está conjugado con un miembro de una pareja de unión.

Los ensayos de la presente invención se usan para detectar oligonucleótidos (por ejemplo, DNA, RNA). El ácido desoxirribonucleico (DNA) es un polinucleótido, más específicamente, un polímero de unidades de desoxirribonucleótido. Un desoxirribonucleótido típicamente consta de una base nitrogenada, un azúcar, y uno o más grupos fosfato. Un desoxirribonucleótido típicamente consta de una base nitrogenada y un azúcar. En el DNA natural, el grupo azúcar típicamente es la \beta-D-2'-desoxirribofuranosa y la base nitrogenada típicamente es una purina (por ejemplo, adenina, A, y guanina, G) o una pirimidina (por ejemplo, timina, T, o citosina, C). Más comúnmente, el carbono C-1 de la D-2'-desoxirribosa está unido al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina; la configuración de esta unión N-glicosídica es \beta (la base cae encima del plano del azúcar). Los cuatro desoxirribonucleótidos naturales se llaman desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG), desoxitimidina (dT), y desoxicitidina (dC). Los desoxinucleótidos son ésteres fosfato de desoxinucleósidos. Más comúnmente, el éster fosfato está formado en el grupo 5'-OH del grupo azúcar (es decir, el 5'-OH se convierte en 5'-OPO_{3}^{2-}); el compuesto resultante se denomina un 5'-fosfato de nucleósido o un 5'-nucleótido. Puede haber más de un grupo fosfato unido (por ejemplo, difosfato, 5'-OPO_{2}OPO_{3}^{-3}; trifosfato, 5'-OPO_{2}OPO_{2}PO_{3}^{-4}). Por ejemplo, un precursor activado importante en la síntesis de DNA es la 5'-trifosfato de desoxiadenosina (dATP).

Como se ha mencionado antes, el DNA es un polímero de unidades de desoxirribonucleótido. Más comúnmente, la cadena principal polímera de DNA es constante y consta de grupos desoxirribosa unidos por grupos fosfato; más específicamente, la posición 3' de un grupo desoxirribosa (era 3'-OH) está unido a la posición 5' del grupo de desoxirribosa adyacente (era 5'-OH) por un grupo fosfodiéster (es decir, -OP(=O)(O^{-})O-). El aspecto variable del DNA es su secuencia de bases (por ejemplo, A, G, C y T) unidas a la posición 1' de cada grupo desoxirribosa. Por lo tanto, las cuatro unidades que se repiten (denominadas a menudo restos) que se encuentran más comúnmente en el DNA se denominan desoxiadenilato, desoxiguanilato, desoxicitidilato y desoxitimidilato.

Un polímero de DNA se puede representar convenientemente por sus bases componentes, a menudo denominado su "secuencia". Puesto que un extremo de la molécula de DNA termina con un grupo azúcar que tiene un grupo 3' libre (por ejemplo, 3'-OH, 3'-OPO_{3}^{2-}) y el otro extremo termina con un grupo azúcar que tiene un grupo 5' libre (por ejemplo, 5'-OH, -OPO_{3}^{-2}), es necesario identificar sin ambigüedad que extremo es cada uno. Como convenio universal, el DNA se cita de izquierda a derecha, desde el extremo 5' al extremo 3'. Por lo tanto, ACG indica 5'-ACG-3' o %'-A-3'-5'-C-3'-5'-G-5'. En algunos casos, un polímero de DNA puede ser cíclico y por lo tanto no tener extremo; en dichos casos la secuencia se cita de 5' a 3', desde un punto de partida adecuada, arbitrariamente posible.

Normalmente el DNA se encuentra en una forma de doble hélice (Watson-Crick), en la que dos cadenas de polinucleótido helicoidales (por ejemplo, hebras) están enrolladas alrededor de un eje común, yendo cada cadena en direcciones opuestas ("antiparalelo") con respecto a sus polaridades 5'-3', como se ha discuto antes. Las bases de purina y pirimidina están en el interior de la hélice, mientras que los grupos fosfato y desoxirribosa están en el exterior. Los planos de las bases son más o menos perpendiculares al eje de la hélice y los planos de los azúcares son casi paralelos al eje de la hélice. El diámetro de la hélice es aproximadamente 20 \ring{A}. Las bases adyacentes están separadas aproximadamente 3,4 \ring{A} a lo largo del eje de la hélice y están relacionadas por una rotación de aproximadamente 36º. Por lo tanto, la estructura helicoidal se repite después de diez restos en cada cadena, es decir, a intervalos de 34 \ring{A}. Una hélice de DNA relativamente pequeña en la que cada hebra tiene 1000 restos tiene aproximadamente 3,4 \mum de extremo a extremo.

Las dos cadenas están sujetas juntas por enlaces de hidrógeno entre los pares de bases (a menudo denominados "pare de bases") y por interacción de apilamiento (se comparten electrones \pi) entre pares de bases adyacentes. Debido a razones estéricas y de enlaces de hidrógeno, una purina siempre está emparejada con una pirimidina; más específicamente, la adenina siempre está emparejada con la timina (por dos enlaces de hidrógeno), y la guanina siempre está emparejada con la citosina (por tres enlaces de hidrógeno). Por lo tanto, cada par de bases contribuye con aproximadamente 620 daltons al peso molecular de la doble hélice. Sin embargo, hay que indicar que no hay restricciones en la secuencia de bases a lo largo de la cadena de polinucleótido. Es la secuencia exacta de bases la que lleva la información genética.

Las dos hebras de una doble hélice de DNA se separan fácilmente cuando los enlaces de hidrógeno entre sus pare de bases se rompen, y se puede llevar a cabo calentando una solución de DNA o añadiendo ácido o álcali para ionizar las bases. El desenrollamiento resultante de la doble hélice se denomina a menudo "fusión" o "desnaturalización", y se caracteriza por una temperatura de fusión a la que la mitad de las moléculas se convierten en hebras simples. La fusión normalmente es reversible, y las cadenas desenrolladas pueden volver a juntarse para formar la hélice, en un procedimiento normalmente denominado "anelación" o "renaturalización", o "hibridación".

El ácido ribonucleico (RNA) es otro ejemplo de un polinucleótido. Como el DNA, el RNA es un polímero que consta de nucleótidos unidos por enlaces 3'-5' fosfodiéster. La estructura covalente del RNA difiere de la del DNA en dos aspectos importantes. En el RNA el grupo azúcar es la \beta-D-ribosa (en lugar de \beta-D-2'-desoxirribosa). También, una de las cuatro bases principales en el RNA es la pirimidina uracilo, U (que sustituye a la timina encontrada en el DNA). Por lo tanto, en el RNA, los pares de bases son AU y GC (en lugar de AT y GC encontrados en el DNA). El RNA puede ser monocatenario o bicatenario, aunque normalmente es monocatenario. Aunque el RNA no puede formar una doble hélice del tipo B-DNA, el RNA a menudo forma regiones de estructura de doble hélice producida por autohibridación y formación de horquilla.

El DNA se puede replicar con ayuda de una enzima, denominada una DNA-polimerasa (por ejemplo, DNA-pol \alpha, \beta, \gamma, \delta, \varepsilon). Típicamente, una DNA-polimerasa cataliza la adición paso por paso de unidades de desoxirribonucleótido al extremo 3' de una cadena de DNA preexistente (a menudo denominada un cebador) de acuerdo con un molde (normalmente una hebra de DNA) con la que se ha hibridado el cebador. Típicamente, la reacción de elongación de la cadena catalizada por la DNA-polimerasa es un ataque nucleófilo del extremo 3'-OH del cebador al átomo de fósforo más interior (es decir, fósforo \alpha) de un trifosfato de desoxirribonucleósido; se forma un puente fosfodiéster y se libera pirofosfato de forma concomitante. La DNA-polimerasa cataliza la formación del enlace fosfodiéster sólo la base del nucleótido que entra es complementaria a la base de la hebra molde; de hecho, los pares de bases mal emparejadas son eliminadas. De esta forma, la replicación dirigida por el molde avanza con una alta fidelidad y con una tasa de error menor que 10^{-8} por par de bases.

Los genes comprenden DNA. Una secuencia de DNA particular codifica una secuencia de aminoácidos particular. De esta forma, las proteínas (poliaminoácidos, polipéptidos) son codificados por el DNA. El DNA, preferiblemente DNA bicatenario, se usa como un molde para una RNA-polimerasa (por ejemplo, RNA-pol I, II, III) para producir RNA mensajero (mRNA) que codifica una proteína particular. De esta forma, el DNA se transcribe al mRNA. Los tripletes de los restos del mRNA, denominados "codones", representan cada uno de los 20 aminoácidos naturales de acuerdo con el código genético. Después el mRNA se usa a sí mismo como un molde y es "ensartado" a través de un ribosoma (compuesto de RNA ribosómico, r-RNA, y proteínas ribosómicas) para producir la proteína codificada por el mRNA particular. De esta forma, el mRNA se traduce en proteína. Los aminoácidos individuales, que se están unidos a un trozo corto de RNA de transferencia (tRNA) que también reconoce un codón específico en el mRNA, son incorporados a la proteína en crecimiento por el ribosoma. El DNA complementario (cDNA) se puede obtener a partir del mRNA (que actúa como molde) usando la enzima transcriptasa inversa. De esta forma, se puede obtener la codificación de una proteína particular en forma de DNA, que a menudo es más adecuado para la clonación y otras manipulaciones genéticas.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada a mediados de 1980, permite la producción sencilla y rápida de grandes cantidades de una secuencia de DNA especificada sin recurrir a la clonación. La PCR explota la capacidad de las DNA-plimerasas (por ejemplo, polimerasa Taq ) para replicar el DNA a partir de un DNA molde monocatenario. Ambas hebras de DNA pueden servir como moldes; los moldes monocatenarios se pueden producir fácilmente, por ejemplo, calentando el DNA bicatenario a una temperatura cercana a la ebullición. La PCR requiere que ciertos reactivos estén presentes en la mezcla de reacción, incluyendo monómeros nucleótidos activados (por ejemplo, ATP, GTP, CTP, TTP) y Mg^{2+}. La PCR también requiere un pequeño trozo de DNA bicatenario en el cual iniciar la replicación (es decir, cebador), que normalmente se proporciona por anelación (hibridación) de un "cebador" oligonucleótido adecuado en el lado en el que se va a iniciar la replicación. Puesto que la DNA-polimerasa replica el DNA en la dirección 3' a 5', ambas hebras pueden actuar como moldes si se proporcionan dos cebadores, uno que se hibridará con una hebra, y otro que se hibridará con la otra hebra. Después de la replicación, el nuevo DNA bicatenario recién formado (que comprende la hebra molde y la hebra recién formada) se funde (por ejemplo, por calentamiento a temperatura cercana a la de ebullición), y cada una de las hebras simples resultantes puede actuar como un molde en el siguiente ciclo. De esta forma, cada ciclo duplica eficazmente el número de fragmentos DNA monocatenarios deseados, y aumenta la proporción de fragmentos de DNA que son idénticos (definidos por las posiciones de los dos cebadores).

La PCR se adapta fácilmente a la automatización. Típicamente, una muestra de DNA se calienta inicialmente (por ejemplo, 94ºC, 5 min) para separar las hebras, y los reactivos (por ejemplo, polimerasa Taq, cebadores, monómeros nucleótidos activados en exceso, Mg^{+2}, etc.). En una primera etapa de calentamiento (por ejemplo, 30-65ºC, 30 s), los cebadores se unen a las hebras de DNA. En una segunda etapa de calentamiento (por ejemplo, 65-75ºC, 2-5 min), la polimerasa sintetiza nuevas hebras de DNA. En un tercera etapa (por ejemplo, 94ºC, 30 s), las hebras del DNA bicatenario resultante se separan. Las tres etapas se repiten en cada ciclo. Típicamente, se llevan a cabo 10-60 ciclos. Teóricamente, 32 ciclos darán aproximadamente 10^{9} copias del fragmento de DNA bicatenario deseado.

A menudo se pueden sintetizar oligonucleótidos específicos (por ejemplo, DNA, RNA) directamente a partir de monómeros, dímeros, etc, sin ayuda de una polimerasa y sin necesidad de una hebra molde. Ttípicamente, se usa un método en fase sólida en el que los nucleótidos se añaden a un oligonucleótido naciente que está unido a un soporte sólido. Se conocen varias síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, incluyendo los métodos de triéster, fosfito y fosforamidato, de los cuales a menudo se prefiere el último.

Típicamente, la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida por el método de fosforamidato implica la síntesis por pasos del oligonucleótido en la dirección 5' llevando a cabo cuatro pasos de forma reiterativa: desprotección, acoplamiento, remate, y oxidación. En la primera etapa ("desprotección"), el oligonucleótido en crecimiento, que está unido al extremo 3' por un grupo 3'-O- a un soporte sólido, se desprotege en 5' para proporcionar un grupo reactivo (es decir, un grupo 5'-OH). En una segunda etapa ("acoplamiento"), el oligonucleótido soportado 5'-desprotegido se hace reaccionar con el monómero nucleótido deseado, el cual primero se ha convertido en 5'-protegido, 3'-fosforamidito. Por ejemplo, el grupo 5'-OH se puede proteger en forma de un grupo 5'-ODMT (donde DMT es 4,4'-dimetoxitritilo) y el grupo 3'-OH se puede convertir en un 3'-fosforamidito, tal como -OP(OR')NR_{2}, donde R es el grupo isopropilo, -CH(CH_{3})_{2}, y R' es, por ejemplo, -H (que da un diéster fosforamidito), o -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, o el grupo beta-cianoetilo, -CH_{2}CH_{2}CN (que da un triéster fosforamidito). El grupo 3'-fosforamidito del monómero reacciona con el grupo 5'-OH desprotegido del oligonucleótido en crecimiento para dar el enlace fosfito 5'-OP(OR')O-3'. No todos los oligonucleótidos en crecimiento se acoplarán con el monómero proporcionado; los que no "crecen" darán oligonucleótidos incompletos y por lo tanto se deben extraer de la síntesis posterior. Esto se logra por la tercera etapa ("rematado"), en la que todos los grupos -OH que quedan (es decir, grupos 5'-OH sin reaccionar) son rematados, por ejemplo, en forma de acetatos (5'-OC(O)CH_{3}) por reacción con anhídrido acético. Finalmente, en la etapa de oxidación, el grupo fosfito recién formado (es decir, 5'-OP(OR')O-3') del oligonucleótido en crecimiento se convierte en un grupo fosfato (es decir, 5'-OP(=O)(OR')O-3'), por ejemplo, por reacción con yodo acuoso y piridina. Después se puede repetir el procedimiento de cuatro etapas, puesto que el oligonucleótido obtenido después de oxidación sigue estando 5'-protegido y está listo para usar en la primera etapa de desprotección antes descrita. Cuando se ha obtenido el oligonucleótido deseado, se puede escindir del soporte sólido, por ejemplo, por tratamiento con álcali o calor. Esta etapa también puede servir para convertir triésteres de fosfato (es decir, cuando R' no es -H) en los diésteres de fosfato (-OP(=O)_{2}O-), así como para desproteger grupos amino protegidos lábiles frente a bases de las bases nucleótidas.

La mayoría de los métodos para detectar secuencias específicas de DNA y RNA se basan en la hibridación de ácido nucleico. Típicamente, dichos métodos se basan en la formación de un dúplex entre una secuencia de DNA o RNA objetivo y una sonda de hibridación de ácido nucleido marcado. Las sondas de hibridación normalmente son complementarias de una parte específica del ácido nucleico objetivo. Sin embargo, hay que indicar que una sonda de hibridación puede ser sólo parcialmente complementaria, y todavía formar un dúplex estable con la secuencia objetivo. Típicamente, las sondas de hibridación son al menos 70% complementarias, y menos a menudo al menos 90% complementarias con la secuencia objetivo. Las sondas de hibridación normalmente tienen una secuencia que es suficientemente larga para asegurar la hibridación tanto selectiva como estable. Típicamente, las sondas de hibridación tienen de 6 a 500 unidades de monómero (por ejemplo, nucleótidos), aunque más típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 unidades de monómero. Las sondas de hibridación específicas que tienen la secuencia deseada, a menudo se sintetizan directamente usando métodos de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. Las sondas de ácido nucleico marcado se usan en una variedad de formatos de ensayos incluyendo transferencia en mancha, transferencia Southern (objetivo DNA), transferencia Northern (objetivo RNA), hibridación in situ, hibridación en placa, e hibridación en colonia. Se han usado varias sustancias diferentes para marcar una sonda de ácido nucleico, y se han usado varios métodos diferentes para detectar estas marcas. Véase, por ejemplo, Kricka, 1992.

En una realización, los ensayos de la presente invención se pueden usar para detectar DNA usando dos sondas de hibridación de oligonucleótidos, una con un marcador ECL unido y la otra con un resto atenuador de ECL unido. Las sondas se pueden elegir específicamente para que, por anelación con el DNA objetivo, el marcador ECL y el resto atenuador de ECL se pongan en contacto de atenuación, reduciendo así la emisión de ECL observada. Por lo tanto, una disminución de la emisión de ECL se puede correlacionar con el aumento del DNA objetivo presente en la muestra.

En otra realización, los ensayos de la presente invención se pueden usar para detectar DNA usando una sonda de hibridación de oligonucleótido que contenga tanto un marcador ECL como un resto atenuador de ECL, combinado con una DNA-polimerasa (típicamente en un ensayo sin separación). Por ejemplo, un DNA objetivo en una muestra se puede detectar formando una mezcla que comprende la muestra, una sonda de hibridación de oligonucleótido adecuada que tiene tanto un marcador ECL (L) como un resto atenuador de ECL (Q), un cebador de oligonucleótido adecuado que hibrida con el DNA objetivo en una posición corriente arriba de la sonda de hibridación, una DNA-exo-polimerasa específica de 5', tal como la conocida polimerasa Taq (derivada de Thermus Aquaticus), y concentraciones adecuadas de monómeros nucleótidos activados (por ejemplo, ATP, GTP, CTP, TTP) y otros reactivos (por ejemplo, KCl, Tris HCl, MgCl_{2}). Típicamente, el marcador ECL y el resto atenuador de ECL de la sonda de hibridación de oligonucleótido no hibridada están en contacto de atenuación, y se observa una baja emisión de ECL. La mezcla se procesa para permitir que la sonda de hibridación y el cebador se anelen al DNA objetivo. Típicamente, el marcador ECL y el resto atenuador de ECL de la sonda hibridada están en contacto de atenuación, y otra vez se observa una baja emisión de ECL. Después se deja avanzar la reacción de la polimerasa. Empezando por el extremo 3' del cebador, la DNA-exo-polimerasa específica de 5' alarga el cebador en la dirección 5', con un nucleótido cada vez, usando el DNA objetivo como molde. Si cuando, la polimerasa avanza corriente abajo en dirección 5', encuentra una sonda de hibridación unida, la polimerasa degradará la sonda unida cuando alarga el cebador. La sonda de hibridación se convierte en fragmentos de oligonucleótidos cortos (típicamente monómeros), que son liberados del DNA objetivo y pasan a la mezcla de solución. Puesto que el marcador ECL y el resto atenuador de ECL estban unidos a diferentes unidades de monómero, cuando se degrada están libres en solución y por lo tanto ya no son mantenidos en contacto de atenuación. Por lo tanto, un aumento de la emisión de ECL se puede correlacionar con la cantidad de DNA objetivo presente en la muestra. Se ha ilustrado un método análogo para marcadores de fluorescencia y atenuadores de fluorescencia. Véase, por ejemplo, Wittwer, 1997.

Todavía en otra realización, los ensayos de la presente invención se pueden usar para detectar DNA usando una sonda de hibridación de oligonucleótido que tiene tanto un marcador ECL como un resto atenuador de ECL, y que tiene secuencias de autohibridación. En ausencia del DNA objetivo, la sonda se autohibrida (típicamente formando una horquilla o estructura de horquilla), poniendo el marcador ECL y el resto atenuador de ECL en contacto de atenuación. En presencia del DNA objetivo, la sonda preferentemente anela con el DNA objetivo, y al hacerlo, separa el marcador ECL del resto atenuador de ECL, de forma que ya no están en contacto de atenuación, y la emisión de ECL aumenta. Por lo tanto, un aumento de la emisión de ECL se puede correlacionar con el aumento de DNA objetivo presente en la muestra.

En una realización, los ensayos de la invención se pueden usar para detectar materiales que se pueden derivatizar selectivamente para tener un miembro de una pareja de unión fuerte. Entre los ejemplos de parejas de unión fuertes se incluyen biotina-avidina y análogos de biotina-avidina, tales como biotina-estreptavidina. La biotina, también conocida como vitamina H del complejo de vitaminas B, es un ácido imidazol-pentanoico de fórmula empírica C_{10}H_{15}O_{3}N_{2}S. La avidina, una proteína de 70 kilodaltons encontrada en la clara de huevo, tiene una afinidad de unión muy alta por la biotina. La estreptavidina, una proteína similar encontrada en las bacterias, Sterptomyces avidina, tiene una afinidad de unión incluso mayor por la biotina, parcialmente debido a sus cuatro sitios de unión con la biotina.

Por ejemplo, una molécula objetivo (que se va a detectar) se puede derivatizar selectivamente para que tenga un resto biotina (usando, por ejemplo, un agente de biotinilación disponible en el comercio) y un marcador ECL. Se puede preparar un derivado de estreptavidina para que tenga uno o más restos atenuadores. Cuando se mezclan, se forman complejos de biotina-estreptavidina en los que el marcador ECL y uno o más restos atenuadores de ECL se ponen en contacto de atenuación, reduciendo así la emisión de ECL observada. Por lo tanto, una disminución de la emisión de ECL se puede correlacionar con la cantidad de molécula objetivo presente en el muestra. Alternativamente, la molécula objetivo se pude derivatizar selectivamente para que tenga, por ejemplo, biotina/resto atenuador de ECL, avidina/marcador ECL, o avidina/resto atenuador de ECL; y los reactivos de la pareja correspondiente comprenderán entonces avidina/marcador ECL, biotina/resto atenuador de ECL y biotina/marcador ECL, respectivamente.

La presente invención también proporciona reactivos, conjuntos de reactivos que comprenden uno o más reactivos y kits de reactivos que comprenden uno o más reactivos, para usar en los métodos de ensayo de la presente invención. Los reactivos pueden estar en forma sólida, líquida o gaseosa, aunque típicamente están en forma sólida o líquida. Entre los ejemplos de reactivos se incluyen, pero no se limitan, reactivos para el marcaje ECL, reactivos para unir restos atenuadores de ECL, composiciones de electrolitos, disolventes y tampones. Los reactivos y/o conjunto de reactivos para usar en los ensayos de la presente invención se proporcionan típicamente en uno o más envases o dispositivos adecuados. Los conjuntos de reactivos típicamente se presentan en una forma empaquetada comercial, en forma de una composición o mezcla cuando la computabilidad de los reactivos lo permita, en forma de un kit de reactivos; por ejemplo, como una combinación empaquetada de uno o más envases, dispositivos, o similar, que contienen uno o más reactivos, y que normalmente incluyen instrucciones escritas para la realización de los ensayos.

D. Métodos para medir la ECL

Se conocen en la técnica una variedad de aparatos para medir la ECL de una muestra. Véase, por ejemplo, Blackburn et al., 1991; Leland et al., 1990; Hall et al., 1991. Típicamente, la ECL se mide usando un aparato que comprende (i) un receptáculo para la muestra (que típicamente es líquida); (ii) dos o más electrodos dispuestos en el receptáculo y el contacto con la composición que se va a examinar, uno de los cuales es el "electrodo de trabajo" en el que se produce la especie electroquimiluminiscente, y (iii) un detector, que detecta alguna fracción de los fotones emitidos durante la electroquimiluminiscencia.

Por conveniencia, el aparato de ECL típicamente tiene tres electrodos: un electrodo de trabajo, un electrodo contador, y un electrodo de referencia. A menudo el electrodo de referencia (por ejemplo, un electrodo de Ag/AgCl patrón) se sitúa a cierta distanciade, pero en contacto (a través del electrolito) con los electrodos de trabajo y contador. Los electrodos de trabajo y contador típicamente son metales nobles o relativamente inertes tales como platino y oro.

El detector puede ser cualquier dispositivo que detecte (y preferiblemente cuantifique) fotones, tal como un tubo fotomultiplicador (PMT), un fotodiodo, un dispositivo de carga acoplada, película o emulsión fotográfica o sensible a la luz. Típicamente, el detector es un PMT, que se puede elegir para que sea particularmente sensible para una cierta variedad de fotones, por ejemplo, ultravioleta, visible, o infrarroja. Típicamente el detector se coloca de forma que pueda detectar fácilmente y eficazmente los fotones emitidos durante la ECL. Por ejemplo, en una realización, el electrodo de trabajo es un disco de oro o platino, el detector de PMT se coloca directamente al otro lado de la superficie plana delantera del electrodo de trabajo, y la composición que se va a examinar fluye lateralmente sobre el disco, entre el disco y el detector de PMT.

Por conveniencia, el aparato de ECL típicamente incorpora medios para el manejo de fluidos, incluyendo, por ejemplo, entradas a y salidas del receptáculo de la muestra que están conectadas a los depósitos (por ejemplo, por tubería) para reactivos, eletrolito/tampones, y la composición muestra, y bombas (por ejemplo, una bomba peristáltica) para mover líquidos entre el receptáculo y los depósitos. De esta forma, el aparato se puede usar para medir la ECL en una configuración estática o a través de flujo.

Una aparato de ECL conocido y disponible en el comercio es el Origen I Analyzer®, que integra un fotómetro (como detector), una celda electroquímica (receptáculo y electrodos), un potenciostato (para hacer funcionar la celda electroquímica), y medios para manejar el fluido y la muestra. El analizador usa un sistema de inyección de flujo que permite las determinaciones rápidas y reproducibles de muestras secuenciales. El fotómetro es un tubo fotomultiplicador (típicamente sensible al rojo para la detección óptima de marcadores de Ru(bpy)_{3}^{2+}) colocados directamente encima del electrodo de trabajo de forma que la luz del electrodo se registra e integra durante cada medición.

Como se ha discutido antes, la ECL es la emisión de fotones de radiación electromagnética (por ejemplo, luz) de una especie química electrónicamente excitada que se ha generado electroquímicamente. Por lo tanto, para medir la ECL de una muestra particular, la muestra se debe electrolizar para producir especies electro-oxidadas y/o electro-reducidas, que directamente y después de posterior reacción, emite fotones. La muestra se electroliza típicamente aplicando un potencial eléctrico al electrodo de trabajo, por ejemplo, con una batería u otra fuente de fuerza electromotriz (FEM). Por conveniencia, la diferencia de potencial se da como el potencial del electrodo trabajo con respecto al electrodo de referencia, con corriente electroquímica (corriente faradaica) fluyendo entre los electrodos de trabajo y auxiliar. Por lo tanto, el potencial del electrodo de trabajo típicamente está en el intervalo de -10,00 a +10,00 V, aunque más comúnmente de -6,00 a +6,00 V, e incluso más comúnmente de -3,00 a +3,00 V. El potencial del electrodo de trabajo puede ser estático, puede alternar, o puede reflejar una función más compleja. Los medios para aplicar un potencial eléctrico particular (por ejemplo, forma de onda) son conocidos en la técnica electroquímica. Véase, por ejemplo, Kamin et al., 1992. El potencial que se debe aplicar al electrodo de trabajo con el fin de producir ECL es una función de la especie química exacta que está implicada en la secuencia de reacciones de ECL, así como de otros factores tales como el pH de la composición muestra y la naturaleza del electrodo. Los expertos en la técnica de la ECL saben como determinar tanto el potencial óptimo para producir ECL como la longitud de onda óptima a la que se detecta la ECL.

Otra vez, con el fin de medir la ECL de una muestra particular, la muestra se debe electrolizar para producir especies electro-oxidadas y/o electro-reducidas, las cuales directamente o después de posterior reacción, emiten fotones. Para realizar la electrólisis óptima, los iones deben estar presentes en la composición muestra la cual puede migrar entre el electrodo de trabajo y el electrodo contador, efectuando así la transferencia de carga. Por lo tanto, con el fin de facilitar la medición de ECL, la muestra se mezcla típicamente con un medio de ensayo de ECL (por ejemplo, tampón de ensayo de ECL) que comprende iones que realizarán la transferencia de carga durante la medición de ECL pero no interferirán con la secuencia de reacciones de ECL.

La expresión "medio de ensayo de ECL", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una composición que se mezcla opcionalmente (aunque normalmente) con la muestra antes de llevar a cabo la medición de ECL. Generalmente, el medio de ensayo de ECL es un fluido, aunque más típicamente es un líquido, y comprende una o más sales disueltas. Típicamente, el medio de ensayo de ECL es un líquido y comprende uno o más disolventes y una o más sales disueltas. Típicamente, las sales están presentes en concentraciones milimolares.

En una realización, el medio de ensayo de ECL comprende agua (es decir, H_{2}O) y una o más sales disueltas. Entre los ejemplos de sales solubles en agua se incluyen, sales de cloruro tales como NaCl, KCl, N(C_{4}H_{9})_{4}Cl; sales de bromuro tales como NaBr, KBr, N(C_{4}H_{9})_{4}Br,; sales de nitrato tales como KNO_{3}, NaNO_{3}, y N(C_{4}H_{9})_{4}NO_{3}; sales de fosfato tales como Na_{3}PO_{4}, K_{3}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, K_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, y KH_{2}PO_{4}; y sales de sulfato tales como Na_{2}SO_{4}, y K_{2}SO_{4}.

En otra realización el medio de ensayo de ECL comprende uno o más disolventes orgánicos y una o más sales disueltas. Entre los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados se incluyen acetonitrilo (es decir, CH_{3}CN, ACN), dimetilsulfóxido (es decir, (CH_{3})_{2}SO, DMSO), N,N-dimetilformamida (es decir, (CH_{3})_{2}NCHO, DMF), metanol (es decir, CH_{3}OH), y etanol (es decir, C_{2}H_{5}OH). Entre los ejemplos de sales que son solubles en disolventes orgánicos típicos se incluyen sales de tetrabutilamonio, tales como tetrafluoroborato de tetrabutilamonio (es decir, (C_{4}H_{9})_{4}NBF_{4}).

En algunas realizaciones, y particularmente en aquellas en las que el medio de ensayo de ECL comprende agua, el medio de ensayo de ECL tiene pH tamponado. Por ejemplo, un medio de ensayo de ECL acuoso se puede tamponar el pH convenientemente por adición de un fosfato (por ejemplo, KH_{2}PO_{4}, típicamente aproximadamente 0,01 a 0,05 M) seguido de ajuste del pH a un valor deseado (por ejemplo, fisiológico pH 7,2) por adición de una cantidad adecuada de un ácido fuerte adecuado (por ejemplo, HCl) o base fuerte (por ejemplo, NaOH). Una vez tamponado, el pH del medio de ensayo de ECL es relativamente insensible a pequeños cambios en su composición química, tales como los que se producen durante la medición de la ECL.

El medio de ensayo de ECL también puede comprender uno o más correaccionantes de ECL, que toman parte en las reacciones químicas que implican especies electro-oxidadas y/o electro-reducidas, siendo el resultado final la emisión de un fotón (es decir, ECL). La expresión "correaccionante de ECL" o más simplemente "correaccionante", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto químico que, él mismo o su(s) producto(s) de reducción/oxidación electroquímica, juega(n) un papel en la secuencia de reacciones de ECL.

A menudo, los correaccionantes permiten el uso de un medio más simple para generar ECL (por ejemplo, el uso de sólo la mitad del ciclo de doble etapa de oxidación-reducción) y/o mejorar la intensidad de ECL. En una realización, los correaccionantes son compuestos químico, que por oxidación/reducción electroquímica, dan, directamente o por posterior reacción, especies fuertemente oxidantes o reductoras en solución. Un ejemplo de un correaccionante es peroxodisulfato (es decir, S_{2}O_{8}^{2-}, persulfato) que se electro-reduce irreversiblemente para formar los iones SO_{4}^{\bullet -} oxidantes. Otro ejemplo de un correaccionante es oxalato (es decir, C_{2}O_{4}^{2-}) que se electro-oxida irreversiblemente para formar iones CO_{2}^{\bullet -} reductores. Un ejemplo de una clase de correaccionantes que actúan como agentes de reducción son aminas o compuestos que contienen grupos amina, incluyendo, por ejemplo tri-n-propilamina (es decir, N(CH_{2}CH_{2}CH_{3})_{3}, TPAH).

Entre los ejemplos de correaccionantes se incluyen, pero no se limita, lincomicina; clindamicin-2-fosfato; esparteína; eritromicina; 1-metilpirrolidona; N-etilmorfolina; difenidol; atropina; trazodona; 1-etilpiperidina; hidroflumetiazida; hidroclorotiazida; clindamicina; tetraciclina; estreptomicina; gentamicina; reserpina; trimetilamina; tri-n-butilamina; trietanolamina; piperidina; 1,4-piperazina-bis(ácido etanosulfónico); tri-n-butilfosfina; N,N-dimetilanilina; feniramina; bromofeniramina; clorofeniramina; difenilhidramina; di-n-propilamina; 2-dimetilaminopiridina; pirilamina; 2-bencilaminopiridina; leucina; valina; ácido glutámico; fenilalanina; alanina; arginina; histidina; cisteína; triptófano; tirosina; hidroxiproplina; asparagina; metionina; treonina; serina; ciclotiazina; triclorometiazida; 1,3-diaminopropano; piperazina; clorotiazida; hidrozinotalanzina; ácido barbitúrico; persulfato; dinucleótido de nicotinamida y adenina; penicilina; 1-piperidinil-etanol; 1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano; 1,4-diaminobutano; 1,5-diaminopentano; 1,6-diaminohexano; etilendiamina; ácido etilendiaminotetracético; bencenosulfonamida; tetrametilsulfona; etilamina; n-propilamina; n-butilamina; s-butilamina; t-butilamina; n-pentilamina; n-hexilamina; ácido oxálico; sulfato de hidrazina; glucosa; metilacetamida; ácido fosforoacético.

La concentración de correaccionantes en la composición muestra varía de acuerdo con el correaccionante específico elegido, y un experto en la técnica puede determinar fácilmente una concentración adecuada. Típicamente, la concentración de correaccionante se elige para que sea aproximadamente 1000 veces mayor que la concentración de marcador ECL.

El medio de ensayo de ECL también puede comprender uno o más potenciadores de ECL, que pueden aumentar la emisión de ECL y también pueden servir como tensioactivos o agentes humectantes para prevenir o reducir la adsorción sobre el electrodo y/o paredes interiores del aparato de ECL. Se conocen varios potenciadores de ECL en la técnica. Véase, por ejemplo, Shah et al., 1990. Un grupo de potenciadores de ECL se puede describir como bencenos sustituidos en para, en los que un sustituyente (R_{1}) es hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-20}y el otro sustituyente (para) (R_{2}) es un poli(alcoxi)-alcohol de fórmula -[O-(CH_{2})_{n}]_{m}OH donde n es un número entero de 1 a 20 y m es un número entero de 0 a 70. Un potenciador de ECL, que está disponible en el comercio con el nombre Triton X-100®, tiene R_{1} como -C(CH_{3})_{2}CH_{2}C(CH_{3})_{3} y R_{2} como -(O-CH_{2}CH_{2})_{9-10}OH. Otro potenciador de ECL, que esta disponible en el comercio con el nombre Triton X-401®, tiene R_{1} como -C_{9}H_{19} y R_{2} como -(O-CH_{2}CH_{2})_{40}OH. Cuando se usa, el potenciador de ECL generalmente está presente en una cantidad que aumenta la emisión de ECL. Típicamente, la cantidad es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5% (vol/vol), y a menudo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1% (vol/vol).

E. Ejemplos

En los siguientes ejemplos se describen algunas realizaciones de la presente invención, que se ofrecen como medio de ilustración y no como medio de limitación.

Ejemplo 1 Atenuación de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH por el fenol

Se disolvió una cantidad adecuada de hexahidrato de cloruro de tris(2,2'-bipiridil)rutenio (II) (es decir,

\hbox{Ru(bpy) _{3} }

Cl_{2}.6H_{2}O, Aldrich® Chemical Co.) en solución tampón Elecsys® (número de tampón de ensayo de ECL ultrarrápido 1518-001; un tampón basado en fosfato con tri-n-propilamina (TPAH) 0,18 M y Thesit® como un agente humectante y potenciador de ECL), y la solución se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 0,4 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,18 M (como correaccionante) a pH = 6,8. Se añadieron cantidades de microlitros de fenol 1 M (es decir, C_{6}H_{5}OH, ultrapuro, Clontech®) (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 2 a 15 mM.

Se midió y registró la intensidad de ECL (en unidades arbitrarias, por ejemplo, recuentos) para cada una de las muestras usando un analizador de electroquimiluminiscencia disponible en el comercio, el Origen I Analyzer®, que integra un fotómetro, un potenciostato, una celda electroquímica, y medios para manejar el fluido y la muestra. El analizador usa un sistema de inyección de flujo que permite las determinaciones rápidas y reproducibles de muestras secuenciales. El fotómetro es un tubo fotomultiplicador sensible al rojo colocado directamente encima del electrodo de trabajo de forma que la luz generada en o cerca del electrodo se registra e integra durante cada medición. Típicamente, se aplicó una secuencia/potencial electroquímico oxidante al electrodo de trabajo, y se midió la intensidad de luz con un tubo fotomultiplicador usando parámetros Origen® patrón. Típicamente, el potencial se subió de 0 a 2800 mV con una velocidad de barrido de 4800 mV/s (frecuencia = 0,58 s^{-1}). El electrodo se limpió antes y después de cada experimento usando una solución limpiadora tamponada de KOH 0,176 M (Flash-ECL CS, de Boehringer Mannheim®, número de identificación 1518470). Se usó un potenciostato/galvanostato EG&G PAR modelo 263A® para las mediciones electroquímicas.

Los datos se ilustran en la Figura 1. Hay que indicar que la señal de ECL para la muestra que no tenía fenol era mayor que la capacidad de detección del instrumento, 10 millones de unidades arbitrarias. El fenol sólo 2 mM dio como resultado que la ECL se redujera a menos de 7% de la ECL de la muestra testigo. El fenol sólo 5 mM dio como resultado que la ECL se redujera a menos de aproximadamente 0,01% de la ECL de la muestra testigo.

Este ejemplo demuestra que las concentraciones micromolares de fenol atenúan eficazmente la ECL de la solución de concentraciones micromolares de Ru(bpy)_{3}^{+2} en la secuencia de reacciones de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH. Es decir por la oxidación electroquímica, la especie en estado excitado resultante, Ru(bpy)_{3}^{2+}*, es atenuada eficazmente, de forma que se observa menos intensidad de ECL comparada con el caso en el que la especie atenuadora está ausente.

Ejemplo 2 Atenuación de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/C_{2}O_{8}^{-2} por el fenol

Se disolvieron cantidades adecuadas de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O y Na_{2}C_{2}O_{8} (Aldrich Chemical Company) en solución salina tamponada con fosfato (es decir, "PBS"; Na_{3}PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0, filtrado por 0,2 \mum) y se diluyeron para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 0,4 \muM (como luminóforo) y de C_{2}O_{8}^{-2} 200 mM (como correaccionante) a pH 0 7,0. Se añadieron cantidades de microlitros de fenol 1 M (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 2 a 20 mM. La intensidad de ECL se midió y registró (en unidades arbitrarias) para cada una de las muestras. Los datos se ilustran en la Figura 2. El fenol 2 mM dio como resultado que la ECL se redujera a menos de 6% de la ECL de la muestra testigo. El fenol 8 mM dio como resultado que la ECL se redujera a menos de aproximadamente 0,1% de la ECL de la muestra testigo.

Este ejemplo demuestra que las concentraciones micromolares de fenol atenúan eficazmente la ECL de la solución de concentraciones sub-micromolares de Ru(bpy)_{3}^{+2} en la secuencia de reacción de ECL Ru(bpy)_{3}^{+2}/C_{2}O_{8}^{-2}. Aunque la intensidad de ECL del sistema Ru(bpy)_{3}^{+2}/C_{2}O_{8}^{-2} es intrínsecamente menor que la del sistema Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH (en un factor de aproximadamente 10-50), el uso de fenol en el sistema de C_{2}O_{8}^{-2} dio una eficacia de atenuación aproximadamente 5% mayor.

Ejemplo 3 Atenuación de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2} por ácido p-hidroxibenzoico y ácido p-aminobenzoico.

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O en solución tampón Elecsys® y se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 0,3 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,18 M (como correaccionante ) a pH = 6,8. Se añadieron cantidades de microlitros de ácido p-hidroxibenzoico 1 M (es decir, HOC_{6}H_{4}COOH, PHBA, pureza 99+%, Aldrich Chemical Company) o ácido p-aminobenzoico 1 M (es decir, H_{2}NC_{6}H_{4}COOH, PABA, pureza 99+%, Aldrich Chemical Company) (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de agente atenuador en el intervalo de 2 a 10 mM. Para comparar, se añadieron cantidades de microlitros de fenol 1 M (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 2 a 10 mM. Se midió y registró la intensidad de ECL (en unidades arbitrarias) para cada una de las muestras. Los datos se ilustran en la Figura 3.

Este ejemplo demuestra que, con concentraciones comparables, el fenol atenúa la ECL de concentraciones micromolares de Ru(bpy)_{3}^{+2} en la secuencia de reacciones de ECL Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH de forma mucho más eficaz que el PHBA (en un factor de al menos aproximadamente 8) o el PABA (en un factor de al menos aproximadamente 2). Este ejemplo también demuestra, por los depuradores de radicales libres PHBA y PABA, que la interceptación del producto intermedio TPA^{\bullet} antes de la formación del estado excitado Ru(bpy)_{3}^{+2}*, es menos probable que la atenuación del estado excitado.

Ejemplo 4 Atenuación de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2} por derivados de fenol.

Se probó la eficacia de atenuación de una serie de derivados de fenol, que tenían uno o más grupos atractores de electrones y/o donadores de electrones, de una forma análoga a la usada en el Ejemplo 3. Los agentes atenuadores (todos de pureza >98%, de Aldrich Chemical Company) se disolvieron en la concentración adecuada en etanol, y se transfirieron partes alícuotas adecuadas a partes alícuotas de 1 ml de una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH. Entre los derivados de fenol que se probaron como agentes atenuadores, se incluyen: o-cresol (es decir, 2-metil-fenol), m-cresol (es decir, 3-metil-fenol), p-cresol (es decir, 4-metil-fenol), p-fluorofenol, m-fluorofenol, o-fluorofenol, o-propilfenol, p-propilfenol, p-fenilfenil, o-trifluorometilfenol, m-trifluorometilfenol, p-trifluorometilfenol, p-nitrofenol, ácido p-nitrobenzoico, ácido p-hidroxibenzoico, y 4,4'-bifenol.

Se observaron tendencias en la eficacia de atenuación de la ECL de los diferentes derivados de fenol. Más particularmente, se observó la atenuación de ECL más eficaz cuando los sustituyentes estaban en meta del grupo hidroxilo del fenol. Por ejemplo, el m-fluorofenol presentó atenuación de ECL más eficaz comparado con el o-fluorofenol o p-fluorofenol. Sorprendentemente, el fenol era más eficaz en un factor de aproximadamente 3 en la atenuación de la ECL que cualquiera de los derivados de fenol probados.

Ejemplo 5 Efecto del fenol en la fotoluminiscencia de Ru(bpy)_{3}^{+2}

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O en solución tampón Elecsys® y se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 30 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,18 M (como correaccionante ) a pH = 6,8. Se añadieron cantidades de fenol 0,2-0,3 M disuelto en etanol a partes alícuotas de 10 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 0 a 0,3 M. Se midió la fotoluminiscencia para cada una de las muestras (sin electrólisis) usando un fluorímetro Perkin Elmer LS-50B con el potencial del PMT aplicado a 850 V. La excitación era a 452 nm, el pico máximo de la absorción de la transferencia de carga de metal a ligando (TCML) de más baja energía para el luminóforo Ru(bpy)_{3}^{+2}, con detección entre 550 y 650 nm (\lambda_{em} = 620 nm). Los datos mostraba que la fotoluminiscencia aumentaba constantemente al aumentar la concentración de fenol. Hay que indicar que esta tendencia es opuesta al efecto para el aumento de la concentración de fenol observado con la ECL. También, los datos mostraban que el efecto del fenol en la fluorescencia era mucho menos espectacular que el efecto en la ECL.

Ejemplo 6 Efecto del fenol en la fotoluminiscencia de Ru(bpy)_{3}^{+2}: electrólisis de volumen.

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O y TPAH en solución tampón Elecsys® y la solución se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 30 \muM y de TPAH 0,18 M a pH = 6,8. A una parte alícuota de 100 ml de solución madre se añadieron 6 ml de fenol 1 M, dando una concentración de fenol 60 mM. Se tomó una medición del valor inicial de fotoluminiscencia para esta solución inicial. Después se llevó a cabo la colorimetría de potencial controlado (electrólisis de volumen) durante 3 horas con agitación continua usando un sistema de 3 electrodos patrón disponible en BioAnalytical Systems® Inc. Se aplicó un electrodo de trabajo de carbón vítreo reticulado a un potencial oxidante de +1,3 V (frente a un electrodo de gel de Ag/AgCl usado como referencia) para realizar la electrólisis. Un electrodo contador de alambre de platino estaba separado de la solución de trabajo por una frita porosa Vycor®, y sumergido en una solución de electrolito adecuada. Durante la electrólisis de volumen de 3 horas, se tomaron muestras de 1 ml a intervalos de 30 minutos para probar la fotoluminiscencia (\lambda_{exc}= 452 nm; \lambda_{em}= 610 nm), como en el Ejemplo 5. Aproximadamente 50% de la señal de fotoluminiscencia se había perdido después de 2 h 45 min, indicando que un producto de oxidación es directamente responsable de la atenuación de la fotoluminiscencia. Es de suponer, que este producto de oxidación también es responsable de la atenuación de ECL observada.

Ejemplo 7 Atenuación de la ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2} por catecol, hidroquinona y 1,4-benzoquinona.

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O y TPAH en solución tampón Elecsys® y la solución se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 0,3 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,05 M (como correaccionante) a pH = 6,8. Se añadieron cantidades de microlitros de catecol (es decir, 1,2-dihidroxibenceno), hidroquinona (es decir, 1,4-dihidroxibenceno), o 1,4-benzoquinona 1 M (todos de Aldrich Chemical Company) (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de agente atenuador de 2 a 11 mM. Para comparar, se añadieron cantidades de microlitros de fenol 1 M (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 2 a 11 mM. Se midió y registró la intensidad de ECL (en unidades arbitrarias) para cada una de las muestras. Los datos se ilustran en la Figura 4.

Este ejemplo demuestra que, con concentraciones comparables, el catecol, hidroquinona y 1,4-benzoquinona (los supuestos productos de electro-oxidación del fenol) atenúan la ECL de concentraciones micromolares de Ru(bpy)_{3}^{+2} en la secuencia de reacciones de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH más eficazmente que el fenol, siendo la benzoquinona, el más eficaz de los tres derivados, aproximadamente 6 veces más eficaz que el fenol.

Ejemplo 8 Atenuación de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2} por derivados de 1,4-benzoquinona.

Se probó la eficacia de atenuación de una serie de derivados de benzoquinona de una forma análoga a la usada en el Ejemplo 7. Se disolvieron los agentes atenuadores en la concentración adecuada en etanol, y se transfirieron partes alícuotas adecuada a partes alícuotas de 1 ml de solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH. Entre los derivados de benzoquinona que se probaron como agentes atenuadores se incluyen: 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ); 2,5-dibromo-1,4-benzoquinona (BRBQ); 1,2,3,4-tetrafluoro-5,8-dihidroxi-antraquinona (TFDAQ); 2-metoxi-3-metil-1,4-naftoquinona (MMNQ); y ácido antraquinona-1,5-disulfónico (todos de pureza >98%, de Aldrich Chemical Company).

Los datos de atenuación de la ECL para el fenol, BQ, y DDQ se muestran en la Figura 5. La DDQ, igual que muchos de los derivados de benzoquinona, era más eficaz en la atenuación de la ECL que el fenol en un factor de aproximadamente 5. La benzoquinona era más eficaz en la atenuación de la ECL que cualquiera de los derivados de benzoquinona probados en un factor de al menos 3.

Ejemplo 9 Efecto de la hidroquinona, catecol, y benzoquinona en la fotoluminiscencia de Ru(bpy)_{3}^{+2}.

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O en solución tampón Elecsys® y se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 30 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,18 M (como correaccionante) a pH = 6,8. A una muestra de 1,2 ml de solución madre se añadieron partes alícuotas de 0,15 ml de hidroquinona 1 M (Aldrich Chemical Company) disuelta en etanol. Se midió la fotoluminiscencia después de añadir cada parte alícuota (sin electrólisis y antes de cualquier electrólisis de volumen) usando los métodos antes descritos en el Ejemplo 5. Los datos mostraban un aumento de aproximadamente 10% de la fotoluminiscencia al añadir 0,45 ml de la solución de hidroquinona 1 M. Hay que indicar que esta tendencia es opuesta al efecto observado para el aumento de la concentración de hidroquinona con la ECL.

Se llevó a cabo un experimento similar usando catecol 1 M (Aldrich Chemical Company) en lugar de hidroquinona. Sorprendentemente, el aumento gradual del catecol dio como resultado una disminución de la fotoluminiscencia, y aproximadamente 70% de la señal de fotoluminiscencia se había perdido después de añadir 1,2 ml de catecol 1 M.

Se llevó a cabo otro experimento similar usando benzoquinona 0,333 M (Aldrich Chemical Company) en lugar de hidroquinona. Otra vez, el aumento gradual de benzoquinona dio como resultado una disminución de la fotoluminiscencia, y aproximadamente 100% de la señal de fotoluminiscencia se había perdido después de añadir 0,3 ml de benzoquinona 0,333 M. Estos resultados demuestran claramente la eficacia de la benzoquinona como atenuador de la quimiluminiscencia.

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Ejemplo 10 Efecto de la hidroquinona, catecol y benzoquinona en la fotoluminiscencia de Ru(bpy)_{3}^{+2}: electrólisis de volumen

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O y TPAH en solución tampón Elecsys® y la solución se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 30 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,05 M (como correaccionante) a pH = 6,8. A una parte alícuota de 100 ml de solución madre se añadieron 6 ml de hidroquinona 1 M (Aldrich Chemical Company), dando una concentración de fenol 60 mM. Se llevó a cabo la colorimetría de potencial controlado (electrólisis volumétrica) como se ha descrito antes en el Ejemplo 6. Después de 45 minutos, la solución se volvió marrón-rojizo, indicativo de la formación de benzoquinona o algún derivado. También, se observó atenuación completa de la fotoluminiscencia en 45 minutos. Estos datos son similares a los observados para el fenol, donde una sustancia que potencia la luminiscencia de Ru(bpy)_{3}^{+2} es oxidada eletroquímicamente para formar un producto que atenúa eficazmente la luminiscencia.

Se llevó a cabo un experimento similar usando 6 ml de catecol 1 M en lugar de hidroquinona. Se observó una pérdida completa de la luminiscencia en 30 minutos, con la formación concomitante de una solución marrón-rojiza. Aunque el propio catecol no atenúa la fotoluminiscencia con estas concentraciones (véase Ejemplo X), el producto de electro-oxidación del catecol es mucho más eficaz en la atenuación de la fotoluminiscencia.

Se llevó a cabo otro experimento similar usando 1 ml de benzoquinona 0,333 M en lugar de hidroquinona. Se observó poca o no se observó atenuación de la fotoluminiscencia potenciada por la electro-oxidación de volumen. Este resultado está de acuerdo con la conclusión de que la benzoquinona es responsable de la atenuación observada. De hecho, se observó un pequeño aumento de la intensidad de la fotoluminiscencia, indicando que después de oxidación prolongada, la benzoquinona empieza a descomponerse para formar productos no atenuadores.

Ejemplo 11 Atenuación de la ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH por el fenol: Estudios de potencial eléctrico.

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O yTPAH en solución tampón Elecsys® y la solución se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 0,3 \muM (como luminóforo) y de TPAH 0,05 M (como correaccionante) a pH = 6,8. Se añadieron cantidades de microlitros de fenol 1 M (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 2 a 6 mM. Se midió y registró la intensidad de ECL (en unidades arbitrarias) para cada una de las muestras usando los métodos antes descritos, pero con potenciales de 600, 1000 y 2800 mV, con el fin de evaluar el grado de atenuación de la ECL y los potenciales a los que se produce la atenuación completa de la ECL.

Se sabe que la oxidación de Ru(bpy)_{3}^{+2} a Ru(bpy)_{3}^{3+} se produce a +1,3 V frente a Ag/AgCl. La oxidación del fenol a productos se produce a aproximadamente +1,0 V frente a Ag/AgCl. Como se esperaba, se observó poca ECL con potenciales menores de +1,3 V frente a Ag/AgCl, puesto que a potenciales menores el Ru(bpy)_{3}^{+2} no es oxidado. Como se esperaba, con concentraciones mayores de fenol y con potenciales mayores, se observó mayor atenuación, apoyando la conclusión de que la oxidación tanto del fenol como de Ru(bpy)_{3}^{+2} son necesarias para la atenuación eficaz de la ECL.

Ejemplo comparativo 1

Atenuación de la ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2} por el metilviologen-carboxilato.

Se disolvió una cantidad adecuada de Ru(bpy)_{3}Cl_{2}.6H_{2}O en solución tampón Elecsys® y se diluyó para dar una solución madre de Ru(bpy)_{3}^{+2} 0,3 \muM (como luminóforo) a pH = 6,8. Se añadieron cantidades de microlitros de solución acuosa de metilviologen-carboxilato 10 mM (MV^{+2}, dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridinio-carboxilato) (como atenuador de ECL), a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de MV^{+2} en el intervalo de 2 a 10 mM. Para comparar, se añadieron cantidades de microlitros de fenol 1 M (como atenuador de ECL) disuelto en etanol, a partes alícuotas de 1 ml de solución madre, para dar muestras con concentraciones de fenol en el intervalo de 2 a 6 mM. Se midió la ECL para cada una de las muestras, y se registró la intensidad de ECL (en unidades arbitrarias). Los datos se ilustran en la Figura 6.

Este ejemplo demuestra que, con concentraciones comparables, el fenol atenúa la ECL de concentraciones micromolares de Ru(bpy)_{3}^{+2} en la secuencia de reacciones de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH aproximadamente 10 veces más eficazmente que el metilviologen-carboxilato, el "patrón de oro" de la atenuación de la ECL del Ru(bpy)_{3}^{+2}.

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Ejemplo 12 Atenuación de ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH por el fenol: luminóforo inmovilizado (mediante partículas magnéticas) y agente atenuador en solución.

Este ejemplo ilustra la atenuación de un complejo marcado inmovilizado, en este caso, un oligonucleótido, que se ha marcado con el luminóforo Ru(bpy)_{3}^{+2} y posteriormente se ha unido a partículas paramagnéticas, por un agente atenuador, en este caso el fenol, que está presente en solución.

Se preparó un oligonucleótido de prueba que consta de 20 restos de nucleótido, usando métodos de fase sólida patrón con un Perkin Elmer ABI 394 Synthesizer® usando la química del beta-cianoetil-fosforamidito. Usando un soporte de vidrio de poro controlado derivatizado disponible en el comercio (de Glen Research), ilustrado a continuación, que tiene tanto un grupo biotina-TEG como un grupo hidroxilo protegido con DMT (es decir, -ODMT), el oligonucleótido resultante tiene, en el extremo 3' un grupo biotina unido.

6

El oligonucleótido se sintetizó usando métodos patrón. Una vez sintetizado el oligonucleótido de 20-mer (que tiene un grupo 5'-hidroxilo protegido), se llevó a cabo una secuencia de reacciones final usando el sintetizador pero usando un derivado de fosforamidito de un Ru(bpy)_{3}^{+2} mostrado a continuación, en lugar de un reactivo de monómero nucleótido.

7

De esta forma, se obtuvo el oligonucléotido de 20-mer (mostrado a continuación), que tenia, en el extremo 3', un grupo biotina unido, y en el extremo 5' un resto Ru(bpy)_{3}^{+2} unido.

8

El oligonucleótido derivatizado se puede indicar como se muestra a continuación, en el que R indica el grupo que contiene Ru(bpy)_{3}^{+2} y B indica el grupo que contiene biotina.

5' - R -AT CGT GCG GTG GTT GAA CTG - B - 3'

Se revistieron partículas superparamagnéticas (de Dynal Corp., Lake Success, NY) que comprenden un núcleo de magnetita (Fe_{3}O_{4}) y un revestimiento exterior de poliestireno, y que tienen un tamaño de aproximadamente 2,8 \mum, con poli-estreptavidina (una proteína preparada a partir del líquido sobrenadante del cultivo de Sterptomyces avidinni, que tiene cuatro sitios de unión de alta afinidad por la biotina). Se añadió una solución del oligonucleótido marcado a una suspensión de perlas magnéticas revestidas con estreptavidina, para dar perlas magnéticas marcadas que tienen unido oligonucleótido marcado.

Puesto que había que añadir fenol a algunas muestras, se preparó una solución tampón basada en la solución tampón Elecsys® y se formuló para que tuviera fosfato potásico monobásico 27,19 g/l (KH_{2}PO_{4}); Triton X-100 0,2 g/l (t-octilfenoxi-polioxietanol); y TPAH 0,05 M. El pH de la solución tampón se ajustó a 7,0 con NaOH acuoso 4 M. Para los casos en los que había que añadir fenol a la solución tampón, se disolvieron 1,2 \mul de fenol 1 M en etanol para dar fenol 1 mM, y el pH se ajustó otra vez a 7,0 con NaOH acuoso 4 M.

Se añadió una parte alícuota de 3 \mul de una suspensión de perlas magnéticas marcadas (546 pmoles de marcador Ru(bpy)_{3}^{+2}), a 1 ml de solución tampón, para dar una solución de trabajo de perlas. Esta solución de trabajo de perlas se puso en la celda de ECL y las partículas magnéticas marcadas se inmovilizaron sobre la superficie del electrodo de trabajo. La solución tampón que contenía correaccionante (y, en algunos casos, fenol) se dejó entrar en la celda, y se aplicó un potencial adecuado para generar señal. Se midió y registró la ECL (en unidades arbitrarias) para cinco casos testigo (usando tampón sin fenol) y diez casos de atenuación (usando tampón con fenol añadido). En los casos de los testigos, se observaron señales de ECL de aproximadamente 75.000 unidades arbitrarias de las perlas marcadas en ausencia de fenol. Casi no se observó señal de ECL para las perlas marcadas en presencia de fenol.

Este ejemplo demuestra claramente que en un formato de perla magnética donde el luminóforo ECL está inmovilizado (en este caso, unido a un oligonucleótido, y el oligonucleótido unido a una perla magnética), todavía se produce la atenuación de la ECL del luminóforo.

Ejemplo 13 Atenuación de la ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH por una benzoquinona: tanto el luminóforo como el agente atenuador inmovilizados (mediante partículas magnéticas).

Este ejemplo ilustra la atenuación de un complejo marcado inmovilizado, en este caso, un oligonucléotido que se ha marcado con el luminóforo Ru(bpy)_{3}^{+2} y unido a partículas paramagnéticas, por un agente atenuador, en este caso una benzoquinona, que también se ha unido al oligonucleótido.

Se prepararon tres oligonucleótidos que constaban de 21 restos de nucleótido, usando métodos en fase sólida patrón, con un Perkin Elmer ABI 394 Synthesizer® usando la química del beta-cianoetil-fosforamidito, de una forma análoga a la descrita en el Ejemplo 12. Los tres oligonucleótidos derivatizados resultantes se ilustran a continuación, donde R indica el grupo que contiene Ru(bpy)_{3}^{+2} y B indica el grupo que contiene biotina.

9

En las fórmulas anteriores, T indica "C_{6}-dT modificado con amina", un resto de nucleótido timina modificado disponible en el comercio (de Glen Research), ilustrado a continuación, que se introdujo durante la síntesis del oligonucleótido.

10

También en las fórmulas anteriores, L indica "Marcador", un reactivo disponible en el comercio (de Glen Research), ilustrado a continuación, que permite la unión de marcadores comunes, y que se introdujo durante la síntesis del oligonucleótido.

11

Los tres oligonucleótidos derivatizados anteriores (que tiene cada uno un grupo Ru(bpy)_{3}^{+2}) se usaron como testigos. Se prepararon tres oligonucleótidos, mostrados a continuación, uniendo un resto benzoquinona en la posición marcada con T y en cada posición marcada con L .

12

Para T , se desprotegió primero el grupo amina protegido (es decir, -NHC(=O)CF_{3})), y posteriormente el grupo amina libre se hizo reaccionar con el éster de N-succinimidilo de un derivado de benzoquinona, mostrado a continuación. Para L , primero se desprotegió el grupo amina (es decir, -NHFMOC), y posteriormente la amina libre se hizo reaccionar con el mismo éster de N-succinimidilo del derivado de benzoquinona.

120

Los tres oligonucleótidos de prueba (y sus patrones) se cuantificaron por espectroscopía de absorción UV-VIS, usando la absorbancia del resto Ru(bpy)_{3}^{+2} a 456 nm (\varepsilon = 13000 M^{-1}cm^{-1}), de forma que se pudieran usar cantidades equivalentes de cada oligonucleótido de prueba para el análisis de ECL. De una forma análoga a la del Ejemplo 12, se añadieron cantidades adecuadas de cada oligonucleótido de prueba a suspensiones de perlas magnéticas revestidas con estreptavidina, para dar perlas magnéticas marcadas que tienen unido oligonucleótido marcado, de forma que se alcance la saturación de 1/3 de los sitios de la estreptavidina (576 pmoles sondas marcadas de Biotina/DNA).

Se examinó cada suspensión de perlas magnéticas marcadas. Se puso una parte alícuota de 3 \mul de la suspensión de perlas magnéticas marcadas en 1 ml de solución tampón Elecsys® para dar una solución de trabajo de perlas. Esta solución de trabajo de perlas se puso en la celda de ECL del Origen Analyzer y las partículas magnéticas marcadas se inmovilizaron sobre la superficie del electrodo de trabajo. La solución tampón Elecsys® que contenía el correaccionante se dejó entrar en la celda, y se aplicó un potencial adecuado para generar señal. Se midió y registró la ECL (en unidades arbitrarias) para cinco repeticiones para cada uno de los cuatro oligonucleótidos de prueba.

Para el oligonucleótido de prueba 13-1-RQ, en el que el luminóforo Ru(bpy)_{3}^{+2} está separado del grupo atenuador benzoquinona por 4 restos de nucleótidos, la intensidad de ECL observada era aproximadamente 53% menor que la observada para el oligonucleótido testigo 13-1-R que no tiene resto atenuador.

Para el oligonucleótido de prueba 13-2-RQ, en el que el luminóforo Ru(bpy)_{3}^{+2} está separado del grupo atenuador benzoquinona por 21 restos nucleótidos, la intensidad de ECL observada era aproximadamente 49% menor que la observada para el oligonucleótido testigo 13-2-R que no tiene resto atenuador.

Para el oligonucleótido de prueba 13-3-RQ, en el que el luminóforo Ru(bpy)_{3}^{+2} está separado de los grupos (cinco) atenuadores benzoquinona por 21 restos nucleótidos, la intensidad de ECL observada era aproximadamente 20% menor que la observada para el oligonucleótido testigo 13-3-R que no tiene resto atenuador.

Este ejemplo demuestra claramente que en un formato de perla magnética donde tanto el luminóforo ECL como el resto atenuador están inmovilizados (en esta caso, ambos están unidos a un oligonucleótido, y el oligonucléotido unido a una perla magnética), todavía se produce la atenuación de la ECL del luminóforo.

Ejemplo 14 Atenuación de la ECL de Ru(bpy)_{3}^{+2}/TPAH por una benzoquinona: métodos de enzimas de restricción.

Este ejemplo ilustra el uso de enzimas de restricción acoplado con captura con perlas y posterior detección de ECL. En este caso, las sondas de hibridación de oligonucléotido están marcadas con Ru(bpy)_{3}^{+2} y biotina en el extremo 3', y con un resto atenuador en el extremo 5'. Se sintetizan dos pares de oligonucleótidos que tienen grupos biotina unidos en el extremo 3' usando métodos de fase sólida patrón, como se ha descrito en el Ejemplo 12.

13

Cada par se refiere a un ejemplo separado y cada miembro de un par dado comprende la misma secuencia de sonda específica que es complementaria a una secuencia en un DNA objetivo que se va a detectar. El segundo miembro de cada par, que no se derivatizará para tener un resto atenuador, se usa con propósitos de comparación para verificar la atenuación; el segundo miembro proporciona una señal de la emisión de ECL en ausencia de un resto atenuador. Los restos subrayados, CCT AGG, identifican parte del sitio de restricción de la enzima BamHI, como se discute a continuación.

En las fórmulas anteriores, T es como se ha definido antes en el Ejemplo 13 y N indica "modificador de 5'-amino", un reactivo disponible en el comercio (de Glen Research), ilustrado a continuación (donde MMT es 4-monometoxitritilo) que se ha introducido durante la síntesis del oligonucléotido.

14

También en las fórmulas anteriores, Tc indica "dT modificado con carboxi", un resto de nucleótido timina modificado disponible en el comercio (de Glen Research), ilustrado a continuación, que se introdujo durante la síntesis del oligonucleótido.

15

Después de escindir los oligonucleótidos del soporte en fase sólida, se une covalentemente un grupo Ru(bpy)_{3}^{+2} al extremo 3', haciendo reaccionar el siguiente derivado de éster de N-hidroxisuccinimidilo con el grupo carboxi de Tc .

16

Después se une covalentemente un resto atenuador al extremo 5' del primer miembro de cada par por los grupos amino de N y T , usando el derivado de benzoquinona activado ilustrado en el Ejemplo 13. De esta forma, se obtienen los siguientes pares de sondas de hibridación de oligonucleótidos derivatizadas. La emisión de ECL del primer miembro de cada par es atenuada por la presencia del resto atenuador, como se ilustra por comparación con la emisión de ECL del correspondiente segundo miembro, que no tiene resto atenuador.

17

Después, se añade el primer miembro de un par de sondas de hibridación de oligonucleótidos derivatizados (por ejemplo, 14-A-1-BRQ o 14-B-1-BRQ), a una muestra que contiene DNA monocatenario. La sonda de oligonucleótido derivatizado se hibridará sólo con la secuencia objetivo complementaria. Se añade la enzima de restricción BamHI. Esta enzima reconoce sólo una secuencia de DNA bicatenario específica, como se muestra a continuación.

18

La enzima de restricción escinde esta secuencia entre los restos GG para dar dos fragmentos, cada uno con un extremo saliente 5', como se muestra a continuación.

19

De esta forma, cada secuencia de DNA objetivo conduce a un suceso de escisión, y la formación de un fragmento escindido que contiene un marcador ECL que ya no está en contacto de atenuación con el resto atenuador de la ECL. Estos fragmentos de escisión también tienen un grupo biotina (así como un marcador ECL no atenuado), que permite su captura (y separación opcional) con ayuda de perlas magnéticas revestidas con estreptavidina, como en el Ejemplo 12. Después se mide la emisión de ECL y se correlaciona con la cantidad de DNA objetivo en la muestra original. Por supuesto, la captura con perlas se puede realizar antes o después de la escisión enzimática.

Otra vez, con propósitos de comparación, se mide la emisión de ECL después de hibridación y antes de escisión enzimática para el primer y segundo miembro de un par dado. Cuando la sonda ha hibridado con el DNA objetivo, la emisión de ECL del primer miembro de cada par permanece atenuada por la presencia del resto atenuador, como se ilustra por comparación con la emisión de ECL del segundo miembro correspondiente, que no tiene resto atenuador.

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Claims (13)

1. Un método para detectar un oligonucleótido en una composición muestra que comprende las etapas de:

(a) preparar una mezcla de ensayo que comprende:

dicha composición muestra;

un reactivo que tiene un resto químico que tiene propiedades electroquimiluminiscentes (marcador ECL), y

un reactivo que tiene un resto químico que cuando está en contacto de atenuación con un marcador ECL atenúa la emisión de ECL observada (resto atenuador de ECL), comprendiendo dicho resto atenuador de ECL al menos un resto benceno;

b) determinar cualquier diferencia entre las emisiones de ECL de:

(i)

el mezcla de ensayo preparada en la etapa (a); y

(ii)

una mezcla de ensayo que comprende:

dicho reactivo que tiene un resto químico que tiene propiedades electroquimiluminiscentes (marcador ECL);

dicho reactivo que tiene un resto químico que cuando está en contacto de atenuación con un marcador ECL atenúa la emisión de ECL observada (atenuador de ECL); y

una cantidad conocida de dicho oligonucleótido, y

(c) correlacionar cualquier diferencia determinada en la etapa (b) con la cantidad de oligonucleótido en dicha muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho resto atenuador de ECL comprende al menos un resto seleccionado del grupo que consta de restos fenol, restos quinona, restos ácido benceno-carboxílico, y restos benceno-carboxilato.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho marcador ECL comprende rutenio.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho marcador ECL comprende osmio.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho marcador ECL comprende un hidrocarburo poliaromático.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido comprende DNA.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido comprende RNA.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha cantidad de oligonucleótido es cero.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho reactivo que tiene un marcador ECL y dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL son el mismo reactivo.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho reactivo que tiene un marcador ECL y dicho reactivo que tiene un resto atenuador de ECL son distintos reactivos.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende las etapas de:

llevar a cabo una reacción química en un sustrato presente en una composición muestra inicial, para producir dicho oligonucleótido en dicha composición muestra antes de la etapa (a); y,

correlacionar cualquier diferencia determinada en el etapa (b) con la cantidad de sustrato en dicha composición muestra inicial.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende la etapa de:

llevar a cabo una reacción química con la mezcla de ensayo preparada en la etapa (a) antes de determinar la etapa (b).

13. Un kit de reactivos de ensayo para usar en el método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho kit de reactivos de ensayo un reactivo de ensayo en un envase adecuado, comprendiendo dicho reactivo de ensayo un resto atenuador de ECL y un marcador ECL, e instrucciones para llevar a cabo dicho método.