ES2203202T3 - Tiras electrodo para analisis de pequeños volumenes. - Google Patents
Tiras electrodo para analisis de pequeños volumenes.Info
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Abstract
Tira de análisis que comprende un soporte que presenta un electrodo activo y un contraelectrodo, y una malla mono- filamento o membrana dentro de la cual un pequeño volumen de líquido que se va a analizar se puede distribuir proporcionando el contacto entre los electrodos, en la que se recubre la malla o membrana con un reactivo específico para la sustancia analizada, y en la que la tira de análisis incluye una zona de aplicación de la muestra en un borde de la malla o de la membrana.
Description
Tiras electrodo para análisis de pequeños
volúmenes.
Esta invención se refiere a las tiras electrodo
para análisis de pequeños volúmenes de, por ejemplo, sangre
entera.
La diabetes es una de las enfermedades endocrinas
más frecuentes. Los pacientes de diabetes tienen que controlar
frecuentemente su nivel de glucosa en la sangre. Esto se logra
normalmente por medio del uso de pequeñas tiras de análisis que
detectan la glucosa en la sangre.
Los problemas que experimentan comúnmente los
usuarios de estas tiras de análisis son una inadecuada cantidad de
sangre en la tira de análisis así como una mala colocación de la
sangre en dicha tira de análisis. Algunos dispositivos han tratado
este problema utilizando cámaras para la muestra que se llenan por
acción capilar. La muestra se retiene en la proximidad de los
electrodos que facilita la medición de la sustancia analizada en la
muestra; véanse los documentos
EP-A-0170375 y
US-A-5141868.
Los dispositivos así conocidos comprenden
electrodos depositados en un sustrato no conductor, recubiertos con
un sistema reactivo específico para la sustancia analizada en
cuestión y se aloja dentro de una cavidad cuyas dimensiones son lo
suficientemente pequeñas como para permitir la introducción de una
muestra, por ejemplo 2,5-3 \muL en volumen, por
acción capilar. La dimensión a la que estos dispositivos se pueden
miniaturizar está limitado por las tolerancias de la fabricación y
el ratio de señal-ruido dependiente de su
estructura química
El documento US-5820551 describe
una tira de análisis que comprende un soporte que lleva un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo, y una enzima y un
mediador con los cuales el electrodo activo está recubierto. Una
gota de sangre entera se constituye como un tramo conductor entre
los electrodos, y se puede determinar la concentración de glucosa
en la sangre. El electrodo activo se expone a una muestra de sangre
entera sin la intervención de una membrana u otro filtro de sangre
entera.
El documento
WO-A-98/55856 (publicado después de
la fecha de prioridad de la presente solicitud de patente) da a
conocer un reactivo específico para la sustancia analizada que
recubre la capa conductora, y una malla
mono-filamento colocada sobre el reactivo y el
electrodo de referencia. Se proporciona una zona para la aplicación
de la muestra en un borde de la malla.
Según la presente invención, una tira de análisis
comprende un soporte que lleva un electrodo activo y un
contraelectrodo, y una malla mono-filamento o
membrana en la cual se puede distribuir un pequeño volumen de
líquido a analizar y proporcionar el contacto entre los electrodos,
y en donde un reactivo específico para la sustancia analizada tal
como un componente de una reacción de
oxidación-reducción, por ejemplo una enzima, un
cofactor o un mediador, recubre la malla o la membrana. La tira de
análisis también comprende una zona de aplicación de la muestra en
un borde de la malla o de la membrana. En particular, la invención
proporciona una tira de análisis para glucosa en la sangre, en el
que la muestra requerida es muy pequeña, y se logra una eficiencia
cinética de la reacción por medio de la aplicación de los reactivos
de una manera original.
Según la presente invención, uno o más de los
componentes de una reacción de oxidación - reducción, por ejemplo
una enzima tal como una glucosa oxidasa o glucosa deshidrogenasa,
un cofactor y un mediador se pueden aplicar a una malla o a una
membrana que está dispuesta sobre el dispositivo. Únicamente a
título de ejemplo no limitativo, la invención se puede describir
haciendo referencia a una malla recubierta de enzimas. Cualquier
componente o componentes que se utilicen, cuando se añade la
muestra, se solubilizan rápidamente y forman un eficiente medio de
reacción que puede proporcionar el contacto entre los electrodos
separados de la tira de análisis. De esta forma, la reacción
proseguirá rápidamente y sin barreras de difusión. Esta
configuración de la reacción está particularmente indicada en los
casos donde el volumen de la muestra es pequeño, la mezcla es
viscosa (tal como la sangre entera) y se requiere que la reacción
sea rápida.
En una forma de realización de la invención, el
sensor de la tira de análisis comprende dos electrodos, uno de los
cuales actúa como un electrodo de trabajo y el otro actúa como un
contraelectrodo, un electrodo de referencia. El extremo del
electrodo de trabajo que se expone a la muestra tiene un mediador
en íntimo contacto con él. Efectivamente la tira de análisis
proporciona una cámara de reacción definida por estos dos electrodos
y una hoja adicional, sobrepuesta a los electrodos, la cual ha sido
recubierta previamente con la enzima de
oxidación-reducción y un cofactor necesario para
esta enzima. La cámara de reacción también puede comprender hojas
adicionales de material y/o agentes húmectantes, por ejemplo un
surfactante, o materiales que lisan las células (los cuales pueden
ser colocados en una cualquiera de las hojas sobrepuestas). De esta
forma, la enzima activa no se aplica sobre el conductor que forma
el electrodo de trabajo sino que está proporcionada en una capa
separada por encima, la cual, en cambio, forma efectivamente la fase
soluble de la cámara de reacción. Cuando se combina con un flujo
lateral, se crean las condiciones que se aproximan a un mezclado
eficiente en una agitada cámara de reacción.
En un ejemplo de la invención, un
contraelectrodo/electrodo de referencia de cloruro de plata/plata
está dispuesto adyacente a un electrodo de carbón. Típicamente, para
este propósito, un par de electrodos de carbón impreso se imprimen
en un sustrato no conductor y entonces el electrodo de
plata/cloruro de plata se imprime en uno de los electrodos de
carbón para que funcione como el contraelectrodo de referencia. Una
tinta no conductora se imprime sobre los electrodos de carbón y el
sustrato, para definir una porción de cada electrodo como un bloque
de contacto para insertarlo en un medidor y otra porción de cada
electrodo fuera del bloque de contacto como el área sensible en
donde se recibe la muestra.
Un mediador para la enzima cofactor NADH se
prepara entonces y se deposita sobre el electrodo desde una
solución acuosa mediante pipeta. Una capa adicional que contiene
NAD se deposita entonces sobre el electrodo de trabajo.
Un material de malla monofilamento es recubierto
con un surfactante y entonces con una solución que contiene glucosa
deshidrogenasa mediante pipeta, chorro o inmersión, y se coloca
encima de los dos electrodos para formar una cámara de reacción.
Esta cámara de reacción puede ser definida además mediante una
impresión adicional, o por el uso de una capa superior para formar
una cavidad de aplicación en el borde. Por ejemplo, una segunda
tinta no conductora impresa encima de la malla, y entonces una cinta
de cubierta se aplica encima de la malla de tal forma que deja una
extensa área de la malla expuesta para la aplicación de la
muestra.
El dispositivo permite la aplicación de un
pequeño volumen de muestra (habitualmente 1 \muL o menos) en la
extensión de la malla. Esto se sigue por el empapado del área
sensible del dispositivo, poniendo la muestra en íntimo contacto con
los electrodos de medición.
Los dispositivos que tienen un borde de
aplicación están descritos en el documento
WO-A-98/55856. Ellos se pueden
adaptar sencillamente, de acuerdo con la presente invención. En
particular, se puede hacer referencia a la Figura 1
del documento WO-A-98/55856; las
componentes de esta invención son el soporte (1), los electrodos
(2/3), el material de malla (6) y la cinta (7); adicionalmente, el
reactivo está dispuesto en el material de malla. Un dispositivo
como éste puede trabajar por la aplicación en su borde de una
muestra. Esto es particularmente valioso en los casos donde es
difícil extraer la muestra. Otras configuraciones serán evidentes
para un experto en la materia, incluyendo las combinaciones de uno
o más de los cofactores, mediadores o enzimas que recubren sobre la
malla sobrepuesta o las hojas de membrana. Se escoge la combinación
en razón de la cinética de la reacción y de los diversos
compuestos.
En otra forma de realización, la enzima o el
mediador es recubierto en la hoja, el cofactor y el otro del
mediador o de la enzima son recubiertos sobre el electrodo de
trabajo directamente, y la hoja es capaz de filtrar la sangre entera
de tal forma que el electrodo activo ve una muestra que está
efectivamente libre de células de sangre entera. En este caso, la
dependencia de hematocrito del resultado se reduce sustancialmente.
De esta forma, la función de filtrado de células de una membrana
seleccionada se puede combinar con las cinéticas rápidas como
consecuencia de tener algunos o todos los elementos activos de la
reacción (la enzima, el mediador y el cofactor) en la membrana, para
producir un dispositivo altamente efectivo.
En resumen, de acuerdo con la presente invención,
se construye un dispositivo mediante la deposición de uno o más de
los reactivos requeridos para la cuantificación de una sustancia a
analizar como una capa o pluralidad de capas en un fino material
mallado o una membrana; las áreas depositadas son de dimensiones lo
bastante pequeñas como para humedecerse con un volumen muy pequeño
de muestra. La malla o membrana se puede usar tanto en dispositivos
colorimétricos como electroquímicos.
Un aspecto de esta invención es que un reactivo
se aplica precisamente sobre una zona objetivo en un material
tejido tal como poliéster o nylon u otra membrana porosa. En la
práctica, esto proporciona una rápida disolución de los reactivos en
presencia de la muestra. El reactivo o los reactivos pueden ser
aplicados en un número de diferentes métodos que resulten en la
deposición de un volumen conocido en una localización precisa y en
una bien definida huella. Esto incluye el uso de un equipamiento
para su dispensado tal y como una bomba de émbolos, una bomba de
jeringa o una impresora de chorro de tinta hecha a medida.
También se ha descrito una tira flexible que
contiene uno o más reactivos que se puede laminar en otra tira
flexible en la cual está impresa una serie de electrodos. En lugar
de realizar sensores individuales, el laminado (incluyendo una fila
o serie de sensores) se puede usar secuencialmente, por ejemplo,
siendo dispensados a partir de un dispensador adecuado. Para este
propósito, como un laminado o no, una tira de la invención puede ser
suministrada como un rollo, y almacenada en carretes estancos los
cuales también pueden contener un desecante. En la práctica, el
carrete puede estar insertado dentro de un dispensador automático
desde el cual la tira se desenrolla automáticamente mediante un
mecanismo de indexación para resaltar secuencialmente los sensores
discretos. La acción de este instrumento es por lo tanto análogo a
la acción de una película en una cámara. En esta forma de
realización, la tira también puede contener un reactivo que lisa las
células rojas (los hematíes) de la sangre tal como una saponina,
para reducir el efecto del hematocrito y de la hemoglobina en una
muestra de sangre entera. Además la cinta se puede proteger de la
humedad cubriéndola con una película que puede desprenderse (por
ejemplo de aluminio) que se desprende automáticamente cuando la
tira se extrae del carrete. Cuando la muestra se aplica al sensor,
la cantidad de la sustancia analizada de interés en la muestra se
puede determinar electroquímicamente. Tal determinación se puede
llevar a cabo por medio de métodos conocidos.
El siguiente ejemplo ilustra la invención.
Se imprime una tinta de material conductor sobre
una hoja de material poliéster no conductor mediante un proceso de
impresión discriminadora. El material de la tinta conductora
consiste en una mezcla de grafito y partículas de carbón y un
aglutinante de polímero en un disolvente orgánico. Después de la
deposición de la tinta conductora, los disolventes se sacan en un
horno de aire forzado. Un contraelectrodo/electrodo de referencia
de plata/cloruro de plata se imprime sobre uno de cada par de
electrodos de carbón impresos seguido por una capa de tinta no
conductora para definir las zonas de contacto y la zona del
sensor.
Un mediador como el Meldola Blue, Nile Blue u
otro tinte apropiado y la enzima cofactor nicotinamida adenina
dinucleótido (NAD) se deposita sobre el electrodo de carbón.
Alternativamente, el NAD se aplica separadamente sobre el mediador a
partir de una tinta acuosa.
La enzima glucosa deshidrogenasa se deposita como
puntos uniformes en una cinta de malla de poliéster de
mono-filamento. Esto se logra como sigue:
- a) en un modo de contacto, en el que se permite que una gota formada en una punta dispensadora muy cerca de la malla sea transferida a la malla por la descarga de la gota sobre la superficie de la malla; o
- b) en un modo sin contacto, en el que la gota formada en un cabezal de impresión de chorro de tinta u otro orificio por encima de la malla se deja caer sobre la malla desde una distancia bajo condiciones que no provocan que dicha gota penetre en la malla
Durante el secado, los puntos se dilatan para
cubrir un área parcialmente definida por las características del
tejido de la malla y parcialmente por las condiciones de
aplicación. Las zonas típicamente cubiertas por una gota de 500 nL
es de 1,3 x 1,2 mm. La cinta de malla está secada a temperatura
ambiente.
La cinta de malla con la enzima modificada se
lamina entonces sobre la hoja modificada de dispositivos y fijada
adicionalmente por una impresión no conductora. Finalmente, una
cinta de cubierta se lamina encima de la malla. Las hojas de los
dispositivos son discos se cortan en discos que comprenden los
dispositivos individuales. En un formato alternativo del
dispositivo, las hojas laminadas están enrolladas e incluidas en una
unidad a modo de carrete, permitiendo que sea utilizado un
dispositivo individual mediante un mecanismo de bobinado similar a
un sistema de enrollado de carretes de películas.
Claims (7)
1. Tira de análisis que comprende un soporte que
presenta un electrodo activo y un contraelectrodo, y una malla
monofilamento o membrana dentro de la cual un pequeño volumen de
líquido que se va a analizar se puede distribuir proporcionando el
contacto entre los electrodos, en la que se recubre la malla o
membrana con un reactivo específico para la sustancia analizada, y
en la que la tira de análisis incluye una zona de aplicación de la
muestra en un borde de la malla o de la membrana.
2. Tira de análisis según la reivindicación 1, en
la que el reactivo es por lo menos un componente de una reacción de
oxidación-reducción.
3. Tira de análisis según la reivindicación 2, en
la que por lo menos un compuesto es una enzima o más de una, un
mediador y/o un cofactor para la enzima.
4. Tira de análisis según la reivindicación 2, en
la que por lo menos un componente comprende una enzima.
5. Tira de análisis según la reivindicación 3 ó
4, en la que la enzima es glucosa oxidasa o glucosa
deshidrogenasa.
6. Método para ensayar un líquido para la
presencia de una sustancia a analizar, el cual comprende el
contacto del líquido con una tira de análisis según una cualquiera
de la reivindicaciones 1 a 5, y la detección de la corriente.
7. Método según la reivindicación 6, en el que el
líquido es sangre y la sustancia a analizar es glucosa.
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