ES2203628T3 - Metodo de deteccion particularmente sensible, de acidos nucleicos. - Google Patents

Metodo de deteccion particularmente sensible, de acidos nucleicos.

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ES2203628T3 ES95118269T ES95118269T ES2203628T3 ES 2203628 T3 ES2203628 T3 ES 2203628T3 ES 95118269 T ES95118269 T ES 95118269T ES 95118269 T ES95118269 T ES 95118269T ES 2203628 T3 ES2203628 T3 ES 2203628T3
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Abstract

PROCEDIMIENTO PARA LA COMPROBACION DE ACIDOS NUCLEICOS OBJETIVOS, DONDE EN UNA PRIMERA ETAPA SE GENERA DE FORMA DEPENDIENTE DE LA SECUENCIA OBJETIVO UNA MULTIPLICIDAD DE PRIMERS, QUE SON AMPLIFICADOS EN UNA SEGUNDA CAPA.

Description

Método de detección particularmente sensible, de ácidos nucleicos.
Es objeto de la invención un procedimiento para la detección particularmente sensible de ácidos nucleicos mediante la hibridación de un ácido nucleico sonda con un ácido nucleico diana, disgregación de la parte hibridada del ácido nucleico sonda y detección del producto de escisión así como un kit de reactivos adecuados para este propósito.
Después de que se descubriera que la utilización de la información específica de los ácidos nucleicos podía tener grandes ventajas para el reconocimiento de parámetros de una infección y las circunstancias genéticas, se investigó en busca de procedimientos de ensayo para los ácidos nucleicos. En muchos casos es necesaria para una detección la multiplicación de las secuencias de los ácidos nucleicos para poder generar una señal suficiente en el procedimiento de detección empleado. Para ello se propusieron tanto procedimientos para la multiplicación de una secuencia diana, como también procedimientos para la multiplicación de una secuencia de ácido nucleico dependiente de la secuencia diana. Un ejemplo de multiplicación de la secuencia diana es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en la patente EP-A-0 201 184, en la cual se amplifican las dos cadenas del ácido nucleico diana en una reacción de replicación in vitro. La temperatura de reacción se varía de forma cíclica para desnaturalizar el ácido nucleico diana de doble cadena, para hacer posible la hibridación con moléculas iniciadoras (cebadores) y la subsiguiente síntesis del ADN (alargamiento del cebador) y repetir estos pasos. En tanto todos los pasos de la PCR transcurren óptimamente, se obtiene una amplificación exponencial de los ácidos nucleicos. En la práctica sin embargo el factor de amplificación a menudo disminuye.
Para la multiplicación de las secuencias diana fueron también empleadas transcripciones in vitro. Un ejemplo de una reacción de este tipo está descrita en la patente WO 88/10315. En esta amplificación se emplean 2 cebadores de los cuales uno de ellos contiene una secuencia promotora. Los cebadores son complementarios como en la PCR a las diferentes cadenas de la secuencia que va a amplificarse. En la patente EP-A-0 329 822 se describe un nuevo desarrollo de este procedimiento, en la cual los ácidos ribonucleicos generados por transcripción del producto ácido nucleico de doble cadena generado como producto intermedio son disgregados en el híbrido, para facilitar una hibridación del ADN sintetizado nuevo con la molécula del cebador que contiene el promotor. Mediante la disgregación del transcripto originalmente formado, es posible formar a partir de cada molécula de ARN formada, nuevamente un ácido nucleico que contiene el promotor, de doble cadena, el cual puede ser empleado para un nuevo comienzo de transcripción.
A diferencia de los métodos antes mencionados, el reforzamiento de la señal específica de la secuencia diana sirve no para la multiplicación del ácido nucleico que hay que detectar, sinó que tiene solamente como objetivo la identificación específica de la secuencia diana. Para lograr esto, se refuerza una señal en función de la presencia de la secuencia diana. Un tal método está descrito p. ej., en la patente WO 89/09284 y WO 89/10415. En esta llamada reacción cíclica de la muestra (CPR) se emplea una molécula sonda quimera ADN-ARN-ADN, la cual híbrida con una molécula ADN diana. Mediante la hibridación se genera un híbrido ARN-ADN, el cual constituye un substrato para la H. Puesto que esta enzima disgrega específicamente la parte ARN del híbrido, se escinde la molécula sonda y los fragmentos generados se diseminan en base a la baja temperatura de fusión de la secuencia diana. Además la molécula diana puede hibridar con otra molécula sonda y el ciclo se repite. Los fragmentos de la molécula sonda se detectan mediante la marca que se encuentra en los mismos.
Es un objetivo de la presente invención el aumentar la sensibilidad del procedimiento, en el cual un ácido nucleico diana hibrida con una molécula sonda y el disgregado de la molécula sonda se emplea para la determinación del ácido nucleico diana.
Es objeto de la invención un procedimiento para la detección de ácidos nucleicos diana, el cual comprende los siguientes pasos:
a)
Creación en función de la secuencia diana de una multiplicidad de ácidos nucleicos, los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, de ácidos nucleicos con una secuencia más larga,
b)
Amplificación de los ácidos nucleicos, los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, o de partes de los mismos.
c)
Detección del ácido nucleico diana a base de productos o productos intermedios formados en la amplificación.
Es igualmente objeto de la invención un procedimiento para la creación de secuencias de ácidos nucleicos con ayuda de secuencias más largas de ácidos nucleicos las cuales contienen secuencias cortas, un procedimiento para la detección sensible de un ácido nucleico diana A, y kits para la ejecución de este procedimiento.
Con el término ácidos nucleicos diana se entienden los ácidos nucleicos que o bien directamente o bien indirectamente deben ser detectados. A continuación y en particular en los dibujos, el ácido nucleico diana se designará con la letra A. Con la denominación de procedimientos para la detección directa de ácidos nucleicos, se entienden aquellos en los cuales los ácidos nucleicos ya están preparados para los pasos del procedimiento según la invención. Con la denominación de procedimientos indirectos se entienden aquellos en los que los ácidos nucleicos se someten a un paso de tratamiento inicial, o respectivamente se preparan con el mismo. Estos pasos de pretratamiento pueden ser, por ejemplo, el aislamiento de los ácidos nucleicos, el tratamiento con reactivos, p. ej., enzimas de restricción o la preamplificación. También la transcripción inversa del ARN puede considerarse como un pretratamiento. El ácido nucleico diana puede tener cualquier origen por ejemplo vírico, bacteriano o celular. Puede encontrarse en solución, suspensión, pero también puede estar fijado en cuerpos sólidos o en medios que contienen células, frotis celulares, células fijadas, cortes de tejidos u organismos fijados. De preferencia los ácidos nucleicos se encuentran en solución.
Con la denominación de ácidos nucleicos complementarios o respectivamente homólogos, se entienden aquellos ácidos nucleicos que pueden hibridar con los correspondientes ácidos nucleicos, o respectivamente pueden hibridar con un ácido nucleico que es complementario del correspondiente ácido nucleico.
Los procedimientos de detección de ácidos nucleicos dan comienzo habitualmente con un paso para hacer accesible el ácido nucleico diana con reactivos correspondientes. Estos pueden ser variaciones del pH (alcalino), calor, repetición de cambios extremos de temperatura (congelación/descongelación), cambio de las condiciones fisiológicas de crecimiento (presión osmótica), acción de detergentes, sales caótropas, o enzimas (p. ej., proteasas, lipasas), bien solas o bien en combinación, para la liberación de los ácido nucleicos. Puesto que el procedimiento según la invención es muy sensible y selectivo, pueden detectarse también pequeñas cantidades de ácido nucleico en presencia de otras materias, por ejemplo proteínas, células, fragmentos de células, pero también se detectan los ácidos nucleicos que no hay que detectar. Acidos nucleicos diana apropiados son por ejemplo los ácidos ribonucleicos y los ácidos desoxirribonucleicos. Los ácidos nucleicos pueden también modificarse, por ejemplo mediante los pasos de acabados previamente efectuados. Particularmente preferido como ácido nucleico diana es el ácido desoxirribonucleico (ADN).
En el caso del procedimiento según la invención se trata de una forma especial de ejecución de un ensayo basado sobre un episodio de hibridación, en especial el reforzamiento de la señal específica de la secuencia diana. Los ensayos basados en episodios de hibridación son ya conocidos en sus elementos fundamentales por el experto en la especialidad del diagnóstico de ácidos nucleicos. Aunque no se dan detalles experimentales a continuación, se hace referencia de ellos integramente en "Nucleic acid hybridisation" ("Hibridación de ácidos nucleicos"), editores B.D. Hames y S.J. Higgins, IRL Press, 1986, p. ej., en el capítulo 1 (Hibridisation Strategy) ("Estrategia de la hibridación"), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybrydisation)("Análisis cuantitativo de la hibridación en solución") y 4 (Quantitative Filter Hybrydi-sation)("Hibridación cuantitativa en filtro"), Current Protocols in Molecular Biology ("Actuales Protocolos en Biología Molecular"), Edit. F.M. Ausubel y col., J. Wiley e hijo, 1987, y Molecular Cloning ("Clonación Molecular"), edit. J. Sambrook y col., CSH, 1989. A los métodos conocidos pertenece también la preparación de nucleósidos trifosfatos marcados, como se describen en la patente EP-A-0 324 474, la síntesis química de oligonucleótidos modificados y sin modificar, la escisión de ácidos nucleótidos por medio de enzimas de restricción, la selección de condiciones de hibridación, mediante las cuales puede lograrse una especificidad, la cual entre otras cosas depende del grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos a hibridar, de su contenido GC y de su longitud, así como la formación de ácidos nucleicos a partir de los nucleósidotrifosfatos con ayuda de polimerasas, eventualmente con utilización de los llamados cebadores.
Un marcado en el sentido de la presente invención consiste en un grupo detectable directa o indirectamente. Los grupos directamente detectables son por ejemplo grupos radioactivos (^{32}P), grupos coloreados o fluorescentes, o átomos metálicos, grupos indirectamente detectables son por ejemplo compuestos inmunologicamente o enzimaticamente activos, como los anticuerpos, antígenos, haptenos o enzimas o enzimas parciales enzimaticamente activas. Estas se detectan en una subsiguiente reacción o secuencia de reacciones. Son particularmente preferidos los haptenos, puesto que los nucleósidotrifosfatos marcados con ellos pueden emplearse en general particularmente bien como substratos, y puede efectuarse fácilmente una subsiguiente reacción con un anticuerpo marcado contra el hapteno o el nucleósido haptenizado. Estos nucleósidotrifosfatos son por ejemplo bromonucleósido trifosfatos o nucleósidotrifosfatos copulados con digoxigenina, digoxina, biotina o fluoresceína. Han demostrado ser particularmente adecuados los esteroides y su detección, los cuales se citan en la patente EP-A-0 324 474. Para su incorporación a los ácidos nucleicos se hace referencia a la patente EP-A-0 324 474.
Los nucleósidotrifosfatos (NTP) son los ribo- (rNTP) o los desoxirribonucleósidotrifosfatos (dNTP).
Es característico del procedimiento anterior, que con ayuda y en dependencia de la presencia de los ácidos nucleicos diana, se genera a partir de los ácidos nucleicos con una secuencia más larga, una multiplicidad de ácidos nucleicos de secuencia corta, los cuales pueden actuar como cebadores. Como secuencia más larga se entiende una secuencia que es más larga en 1 o más, de preferencia 5-1000, con particular preferencia 8-100 unidades de bases nucleicas (p. ej., mononucleótidos), que el ácido nucleico corto. Con el ácido nucleico corto van unidas dos condiciones. En primer lugar, debe poder formar híbridos con los ácidos nucleicos mediante efectos recíprocos base-base. Estas secuencias contienen en particular ácidos nucleicos, que se crean a partir de los elementos constitutivos de nucleótidos naturales. Estas secuencias pueden ser análogos de ácidos nucleicos o ácidos nucleicos modificados, p. ej., ácidos nucleicos que efectivamente presentan todavía las propiedades de hibridación de un ácido nucleico, pero sin embargo no tienen ningún trozo de cadena fosfato-azúcar o sin embargo presentan bases no naturales. Para ello son particularmente adecuadas las moléculas de las patentes WO 92/20702 o WO 86/05518. La segunda condición para la secuencia es que pueda usarse como cebador como reacción de alargamiento. Estas reacciones de alargamiento son en particular el alargamiento dependiente de la polimerasa, del cebador para las unidades de mononucleótidos mediante el empleo de mononucleósidotrifosfatos. Con ello se prolonga el extremo 3' del cebador en estado de hibridación con un ácido nucleico matriz para el ácido mononucleótido, de forma que el producto del alargamiento es esencialmente complementario al correspondiente lugar del ácido nucleico matriz.
La creación según la invención, del cebador o respectivamente de ácidos nucleicos cortos, puede tener lugar de forma arbitraria, aunque se prefiere la escisión de un ácido nucleico más largo, en particular mediante disgregación enzimática parcial de este ácido nucleico.
Los cebadores creados en el paso según la invención tienen de preferencia una longitud de más de 12 bases. Los cebadores contienen de preferencia una secuencia de 12 hasta 35 bases, la cual es imprescindible para el posterior trabajo del cebador (p. ej., la hibridación y alargamiento enzimático). Los cebadores pueden contener, en particular en su extremo 5', muchos otros nucleótidos o partes de moléculas no nucleotídicas todavía deseados.
En el segundo paso del procedimiento según la invención, se amplifican los cebadores o partes de los mismos formados en el primer paso, p. ej., una secuencia parcial. De preferencia, la amplificación del cebador comprende también una disgregación de una molécula más larga. De manera particularmente preferida la amplificación tiene lugar mediante el alargamiento, p. ej., una secuencia más larga comparada con el cebador (secuencia corta), del cebador en un ácido nucleico matriz C (a un ácido nucleico más largo), hibridación de una sonda amplificadora D con el producto de alargamiento del cebador y disgregación (escisión) de la sonda amplificadora con creación de una nueva molécula de cebador. Debido a que el producto del alargamiento de este cebador está nuevamente disponible para la escisión de una sonda de amplificación, crece el número de moléculas de cebador con cada escisión. Además el alargamiento del cebador formado por la escisión conduce nuevamente a la formación de productos de alargamiento, los cuales están disponibles de nuevo para la escisión de una sonda amplificadora.
Debido a que la primera creación de un cebador depende de la secuencia diana, la cantidad de cebadores generados o respectivamente productos del alargamiento u otros productos intermedios, es una medida de la presencia de ácidos nucleicos diana A en una sonda.
En el procedimiento según la invención se trata pues de un procedimiento en el cual un producto de alargamiento de un cebador creado primeramente, se utiliza de nuevo para la creación cíclica de uno o varios cebadores, así como también un cebador creado primeramente, se utiliza de nuevo para la creación de un producto de alargamiento.
Con la expresión ácido nucleico más largo, se entiende aquí un ácido nucleico que contiene una parte inactiva del cebador, y una parte que cuando se disgrega, conduce a una activación del cebador. Después de la activación del cebador éste está disponible para la ejecución de una reacción de alargamiento. Un aspecto de la invención se ocupa de la amplificación de ácidos nucleicos cortos, en particular de cebadores, mediante la disgregación de ácidos nucleicos más largos con formación del cebador. En el sentido de la presente invención los ácidos nucleicos sonda B son también estos ácidos nucleicos más largos.
Acidos nucleicos cortos en el sentido de la invención son los productos de disgregación de los ácidos nucleicos más largos citados más arriba, en particular los ácidos nucleicos cortos son ácidos nucleicos que pueden actuar como cebadores, es decir, pueden ser alargados en una región de alargamiento.
Como ácidos nucleicos sonda B son apropiadas aquellas moléculas que contienen dos partes B1 y B2 unidas entre sí. La parte B se caracteriza porque puede hibridar con el ácido nucleico diana o respectivamente con una parte del mismo. Para ello, esta parte es lo suficientemente complementaria. Además, la parte B1 debe poderse escindir cuando está en forma hibridada con el ácido nucleico diana. Por disgregación o escisión se entiende aquí la división de la parte B1 en dos o más partes que ya no se unen más entre sí, o la escisión de la parte B1 de B2, en donde de preferencia el ácido nucleico diana no está escindido. Por consiguiente, la parte B1 puede contener p. ej., secuencias ribonucleotídicas o no básicas. En un caso preferido, la parte B1 contiene dos, con particular preferencia, cuatro, o más unidades monorribonucleótidas unidas entre sí de la manera habitual en los ácidos nucleicos, mientras que la parte complementaria del ácido nucleico diana representa un ácido desoxirribonucleico. En este caso, puede tener lugar una escisión del ácido nucleico sonda B en la parte B1, poniendo en contacto el híbrido formado con la ARNasa H. En caso de que existan secuencias no básicas puede tener lugar la disgregación mediante la endonucleasa AP.
En caso de una suficiente sensibilidad puede ocurrir eventualmente una escisión también del ácido nucleico diana, es decir, para cada molécula diana se genera un cebador en lugar de varios.
Con ello, se escinde por lo menos una parte de la parte B1 hibridada. Con ello se forma un producto de escisión B' el cual contiene la parte B2 específica del ácido nucleico no escindible en el híbrido de B con el ácido nucleico diana y de preferencia no hibridable con el ácido nucleico diana, así como eventualmente contiene partes de la parte B1 originalmente hibridada con el ácido nucleico diana.
Las condiciones para la hibridación del ácido nucleico diana con el ácido nucleico sonda se escogen de preferencia de tal forma que tiene lugar todavía una hibridación selectiva del ácido nucleico sonda mediante la parte B1 con el ácido nucleico diana, pero sin embargo no tiene lugar ninguna hibridación no selectiva del ácido nucleico sonda con otros ácidos nucleicos de la muestra que no hay que detectar. Los fragmentos aparecidos por la escisión del ácido nucleico sonda entre los cuales está también el producto de escisión B', son más cortos que el ácido nucleico sonda original y por lo tanto ya no podrán formar en las condiciones escogidas, ningún híbrido estable más con el ácido nucleico diana. En las condiciones escogidas se liberará por lo tanto el ácido nucleico diana A. Este está dispuesto para una hibridación con otro ácido nucleico sonda.
Mediante la escisión del ácido nucleico sonda pueden aparecer también diferentes fragmentos B', los cuales o bien contienen la parte B2 sola o bien contienen adicionalmente la parte B1. Esto depende de las condiciones empleadas cada vez.
Con la expresión parte específica del ácido nucleico, de un ácido nucleico se entiende de ahora en adelante, una secuencia la cual puede hibridar con otra secuencia como el ácido nucleico diana en donde, en las condiciones escogidas, tiene lugar una hibridación específica, es decir, no tiene lugar ninguna hibridación importante para el procedimiento en su conjunto, con otros ácidos nucleicos que se encuentran en la mezcla de reacción y que no participan en el paso de reacción correspondiente. Partes específicas típicas del ácido nucleico son la parte B2 del ácido nucleico sonda, la parte C2 del ácido nucleico matriz y la parte D2 de la sonda de amplificación.
La parte B2 específica del ácido nucleico, de preferencia no hibridante con el ácido nucleico diana, del ácido nucleico sonda, debe cumplir la condición de que en las condiciones de disgregación específicas de la secuencia diana de la parte B1, no se disgrega. Además, debe poderse hibridar con el oligonucleótido matriz definido más adelante. La secuencia de la parte B2 puede escogerse en principio, libre. Con ello hay que tener en cuenta que la hibridación del producto de escisión B' con el oligonucleótido matriz mediante una complementariedad con el ácido nucleico diana se hace más difícil, con lo cual previsiblemente la sensibilidad frente al caso óptimo, disminuye. B2 puede ser igualmente un ácido ribonucleico, un ácido desoxirribonucleico o un ácido nucleico modificado. En el caso de que la parte B contenga un ácido ribonucleico y la escisión se efectúe con una ARNasa, la parte B2 no constituye de preferencia ningún ácido nucleico escindible en estas condiciones, de preferencia constituye un ácido desoxirribonucleico. B2 puede sin embargo también ser un ácido ribonucleico modificado de tal forma que ya no puede ser escindido por una ARNasa. Otra posibilidad es el empleo de análogos de ácidos nucleicos los cuales presentan efectivamente las propiedades de hibridación de un ácido nucleico, pero sin embargo no tienen ningún trozo de cadena fosfato-azúcar o ninguna base no natural. Para ello son apropiadas en particular las moléculas APN de la patente W92/20702 o las moléculas de la patente WO 86/05518. La condición preferida, de que este componente no debe hibridar con el ácido nucleico diana, se refiere en particular a las condiciones impuestas durante la hibridación del ácido nucleico sonda con el ácido nucleico diana. Se prefiere escoger la parte B2 de forma que tampoco hibride con los ácidos nucleicos de la muestra que no hay que detectar. La parte B2 debe contener sin embargo una secuencia, que pueda hibridar con un ácido nucleico matriz C. Las condiciones de la hibridación del ácido nucleico diana con el ácido nucleico sonda y el ácido nucleico matriz con el producto B' de escisión pueden ser escogidos independientemente uno de otro.
El ácido nucleico matriz C según la invención contiene una parte C2 la cual puede hibridar con el producto de escisión B' y en particular su parte B2 específica del ácido nucleico o una parte de la misma y eventualmente todavía restos presentes de B1. Como ácido nucleico matriz C son apropiadas todas las moléculas que permiten una tal hibridación, es decir, ácidos nucleicos los cuales están construídos a partir de elementos nucleótidos naturales, aunque también análogos de ácido nucleico que se construyen a partir de elementos de construcción presentes no naturales, o contienen dichos elementos y pueden actuar como moldes/matrices. Además, el ácido nucleico matriz debe ser estable frente a la disgregación en las condiciones escogidas. En el caso de que la escisión del ácido nucleico sonda se efectúe con la ARNasa, se trata en el caso del ácido nucleico matriz con particular preferencia del ácido desoxirribonucleico. Junto a la parte C2 presenta el ácido nucleico matriz una parte C1, el cual no puede hibridar con la parte B1 o respectivamente con restos presentes de la parte B1 del ácido nucleico sonda. Con particular preferencia esta parte C1 forma también con los ácidos nucleicos de la muestra que no hay que detectar, y con el propio ácido nucleico diana, ningún híbrido estable bajo las condiciones escogidas. Se prefiere que la parte C1 esté en la dirección 5' vista desde la parte C2.
En todo caso debe garantizarse que el o los productos de escisión B' puedan hibridar con el ácido nucleico matriz, de tal forma que B' hibride también con el ácido nucleico matriz en el extremo aparecido por la escisión.
En el paso siguiente el híbrido del producto de escisión B' y el ácido nucleico matriz C, se prolonga en una parte B3 de ácido nucleico complementaria de la parte C1. Por ello B' debe poder servir como cebador, es decir, debe poder ser prolongado en el extremo 3' de la matriz. Esto puede efectuarse de manera arbitraria, aunque de preferencia mediante un alargamiento enzimático. Como alargamiento enzimático se entiende la particularmente preferida condensación de mononucleosidotrifosfatos con utilización del C1 como ácido nucleico molde. Las condiciones utilizadas son conocidas por el experto. Por ejemplo el alargamiento puede efectuarse con ayuda de la ADN-polimerasa del Thermus aquaticus según la patente EP-A-0 258 018. Como mononucleósidotrifosfatos preferidos hay que considerar los dNTPs. En este caso el producto de escisión B' actúa como cebador y ácido nucleico corto, el cual se alarga. Otra posibilidad del alargamiento enzimático es el empleo de una ligasa. En este caso hay que tener en cuenta que el producto de alargamiento formado en las condiciones de la escisión del ácido nucleico sonda sea estable. Esto se cumple por ejemplo cuando se trata de ADN tanto en el cebador como también en el fragmento de alargamiento, cuando como medio para la escisión del ácido nucleico sonda se emplea la ARNasa H.
En las condiciones del alargamiento del producto de escisión B', no tiene lugar un alargamiento del híbrido eventualmente formado, a partir del ácido nucleico sonda B sin escindir y del ácido nucleico matriz C, puesto que p. ej., el extremo 3' del ácido nucleico sonda no hibrida con el ácido nucleico matriz.
El alargamiento de los ácido nucleicos sonda B sin escindir en el ácido nucleico diana como matriz no influye en la producción del cebador B', y puede inhibirse mediante el bloqueo del extremo 3' del ácido nucleico sonda B por ejemplo mediante el empleo de un didesoxinucleótido como último nucleótido.
En una forma de ejecución del procedimiento según la invención, se efectúa la amplificación del cebador de manera que de preferencia después de la desnaturalización del híbrido del ácido nucleico matriz y del cebador B' alargado para formar el B3, se emplea la formación de una zona B3 para la hibridación del B3 con una sonda amplificadora D.
Bajo la denominación de sonda amplificadora D se entiende un ácido nucleico que contiene una parte D1, la cual sobre toda su longitud o solo en parte es complementaria de B3, o sea, la parte aparecida por alargamiento del producto de alargamiento del cebador (producto de escisión B'). La nueva parte engarzada al cebador se designará en adelante como B3. Una característica esencial de la sonda amplificadora D es que en su parte D1 es de nuevo escindible. De preferencia esta constituída de forma que las condiciones de escisión para la sonda amplificadora y el ácido nucleico sonda B son esencialmente idénticas por lo que respecta a los reactivos empleados. Por ello, D1 se prefiere igual que un ácido ribonucleico. Además, la sonda amplificadora D contiene una parte D2 la cual cumple las condiciones de una secuencia específica del ácido nucleico.
El particular efecto de amplificación del procedimiento se produce porque por la disgregación de la sonda amplificadora se crea de nuevo, directa o indirectamente, un producto de escisión el cual hibrida con un ácido nucleico matriz, y con ello (como cebador) puede conducir a un nuevo ciclo de amplificación.
Adicionalmente pueden formarse en condiciones apropiadas por producto de alargamiento varias sondas amplificadoras una después de otra, de manera que aparecen varios productos de escisión puesto que análogamente al ácido nucleico sonda B los productos de escisión no forman ningún híbrido estable con el producto de alargamiento.
En el caso de una directa creación se escoge la sonda amplificadora de forma que la otra parte D2 sea complementaria en toda la longitud, o solamente en parte, a C2 y con ello sea esencialmente idéntica con los productos de escisión B' formados originalmente. Con ello, los productos de escisión D' formados en la reacción de disgregación de D, pueden ser empleados nuevamente como moldes en la reacción de alargamiento mediante el empleo de los ácidos nucleicos matriz C.
Con respecto a la clase y disposición de las partes D1 y D2 son válidas para las sondas amplificadoras las condiciones para el ácido nucleico sonda B.
En un procedimiento indirecto, la sonda amplificadora D se escoge de forma que contenga además de la parte D1 una parte D2 específica para ácidos nucleicos, la cual sin embargo no sea complementaria a C2 ni tampoco hibride con otros ácidos nucleicos que estén contenidos en la mezcla de reacción, con excepción de otros ácidos nucleicos matriz E, los cuales presentan una parte E2 hibridable con D2 y una parte E1 que actúa como molde para el alargamiento de D'. Después de la hibridación del fragmento escindido D' con el segundo ácido nucleico matriz E y el alargamiento del fragmento escindido y el cebador en una parte D3, está preparada la parte D3 nueva, formada análogamente a la parte B3, de preferencia después de la separación de los híbridos, para la escisión de otra sonda amplificadora F.
Esta sonda amplificadora F puede contener de nuevo una parte F1 complementaria a D3 y una parte F2 específica de un ácido nucleico. Después de la escisión en la parte F1, aparece un fragmento de escisión F, el cual según la elección de la secuencia tiene el mismo efecto con el producto de escisión D' o el producto de escisión B'. Todavía puede lograrse un grado de amplificación más alto, si el fragmento escindido se introduce de nuevo en un ciclo de alargamiento/desdoblamiento mediante el empleo de otra sonda matriz y amplificadora. El sistema según la invención es por ello muy flexible mediante la elección de la secuencia de la parte específica del ácido nucleico del ácido nucleico sonda o respectivamente de la sonda amplificadora. Por lo tanto, es de esperar que con un número creciente de ácidos nucleicos sondas y matrices empleados aparezca una gran multiplicidad de diversas moléculas, y una complejidad por la creciente cantidad de diferentes ácidos nucleicos sondas o respectivamente matrices. Por ello se prefiere el caso de que la parte D2 de la sonda amplificadora sea complementaria con C2 o una parte de la misma.
La separación del híbrido del ácido nucleico matriz C y el producto de alargamiento del producto de escisión B' así como eventualmente el ácido nucleico matriz C o E y el producto de alargamiento del producto de escisión D' así como eventualmente otros híbridos (p. ej., empleando otros ácidos nucleicos matriz), puede realizarse por ejemplo mediante desnaturalización por el calor. En principio son sin embargo también adecuados los procedimientos de desnaturalización no térmicos.
El alargamiento de las sondas amplificadoras no escindidas p. ej., en los productos de alargamiento, puede inhibirse análogamente a los ácidos nucleicos sonda B, mediante el bloqueo del extremo 3' de las sondas amplificadoras por ejemplo mediante un didesoxinucleótido.
La temperatura del procedimiento según la invención se escoge de tal forma que las actividades de la enzima empleada sean lo más óptimas posible y al mismo tiempo permita la suficiente especificidad de las condiciones de hibridación. En el caso de emplear la ARNasa no termostable, es conveniente por ejemplo un margen de temperatura entre 30º y 60º, con particular preferencia 42º. En caso de emplear una ARNasa termoestable son posibles temperaturas más altas. Para la reacción de alargamiento se ajusta la temperatura igualmente después de la enzima empleada para el alargamiento. A este respecto, si se emplean enzimas termoestables, p. ej., Taq-ADN-polimerasa, se prefiere un margen entre 50º y 80º, y con particular preferencia aproximadamente 60-70º. Mediante el aumento de la probabilidad de permanencia de la enzima en las diferentes clases de reacción debería ser posible aumentar el tanto por ciento de rendimiento y con ello disminuir el tiempo de reacción necesario o aumentar la sensibilidad.
Los ácidos nucleicos matriz pueden también constituir una molécula circular. En este caso, es preferible el empleo de una enzima de alargamiento que tenga una actividad supresora de la cadena.
El ácido nucleico sonda, los ácidos nucleicos matriz y los ácidos nucleicos amplificadores pueden obtenerse mediante procedimientos en principio ya conocidos, en cuanto se haya determinado la secuencia de sus partes. Para el caso preferido de que se trate de un oligonucleótido con una longitud de menos de 100 elementos mononucleótidos, se prefiere que la síntesis se efectúe de preferencia mediante procedimientos químicos corrientes (p. ej., la síntesis en fase sólida análogamente a Merrifield). Esto hace posible también la sencilla síntesis de oligonucleótidos mixtos (quimeras ARN/ADN). Para ácidos nucleicos grandes, se prefieren procedimientos de obtención recombinantes o procedimientos químicos/enzimáticos, como se describen en la patente EP-A-325970. La parte B1 tiene de preferencia 12-35 nucleótidos, la parte B2 de preferencia 15-50, la parte C1 de preferencia 10-100 y la parte C2, 15-50 nucleótidos de largo. Lo mismo es válido para el resto de ácidos nucleicos matriz así como para las sondas amplificadoras.
La figura 1 muestra una ejecución básica del procedimiento según la invención, en el cual la parte D2 de la sonda amplificadora es complementaria de la parte C2 del ácido nucleico matriz con lo cual el producto de escisión D' puede ser prolongado en el ácido nucleico matriz C.
La figura 2 muestra esquemáticamente una forma de ejecución en la cual el producto de escisión D' se hibrida con un nuevo ácido nucleico matriz E. Mediante el empleo de un ácido nucleico sonda F puede crearse un fragmento de escisión F, el cual se escoge de manera que pueda hibridar o bien con el ácido nucleico matriz C (camino 1), o bien con el ácido nucleico matriz E (camino 2), o bien con otro ácido nucleico matriz G (camino 3).
La figura 3 y 4 muestran geles con los productos intermedios de la reacción.
La figura 5 muestra los productos de amplificación en el gel.
Los pasos mostrados en las figuras pueden efectuarse sucesivamente con adición de los reactivos necesarios en cada caso. Todos los componentes necesarios pueden añadirse, mediante el correspondiente diseño de los componentes, al principio de la reacción, de forma que el proceso transcurra simultáneamente.
Cuando la desnaturalización del ácido nucleico matriz del producto de alargamiento tiene lugar térmicamente, todos los componentes no termoestables deben añadirse de nuevo cada vez después de la desnaturalización. En este caso es ventajoso el empleo de enzimas termoestables, p. ej., la polimerasa del Thermus-aquaticus y la ARNasa H termoestable.
La detección del ácido nucleico diana A puede efectuarse en base a un producto o respectivamente productos intermedios formados en la amplificación. De preferencia tiene lugar en la detección un marcado por lo menos de uno de los ácidos nucleicos sonda o matriz utilizados o de los productos de escisión o alargamiento formados. Se prefiere el caso de que un oligonucleótido matriz se hace reaccionar con un producto de escisión en condiciones de hibridación apropiadas juntamente con una ADN polimerasa y desoxirribonucleosidotrifosfatos. La construcción del mononucleótido marcado puede comprobarse por ejemplo después de la separación de los ácidos nucleicos de los desoxirribonucleosidotrifosfatos marcados que no han reaccionado. El empleo de dos nucleótidos marcados de diferente manera hace posible la detección directa de la unión en fase sólida.
La alta flexibilidad y un posible marcado doble, es decir, la construcción simultánea durante la reacción de alargamiento de desoxinucleótidos marcados de manera distinta, hacen posible el empleo del procedimiento en tiras de análisis o en placas de microtitulación o la detección mediante citometría de flujo o electroforesis capilar.
Cuando en la muestra no hay ningún ácido nucleico diana existente, el oligonucleótido matriz híbrida solamente con la molécula sonda quimera ARN-ADN. Un alargamiento de la molécula sonda puede no tener lugar puesto que el extremo 3' no híbrida con el oligonucleótido matriz.
El procedimiento según la invención proporciona un procedimiento de detección en el cual tanto el producto de alargamiento como el cebador generado pueden ser introducidos de nuevo en el ciclo de amplificación. Como ciclo de amplificación se entiende una serie de reacciones mediante las cuales se emplea de nuevo un producto de una reacción o para generar uno o varios de estos productos. En los dibujos estos ciclos están representados por una flecha que conduce a un paso de reacción anterior. Esto produce una amplificación con un factor teórico de amplificación de más de 2^{x}, en donde x representa la cantidad de ciclos. El procedimiento según la invención tiene tendencia a superar el procedimiento basado en la PCR. Además, mediante un diseño adecuado, pueden todavía alcanzarse mayores grados de amplificación.
Objeto de la invención es además un procedimiento para la producción de secuencias de ácidos nucleicos, que comprende los siguientes pasos:
a) alargamiento de una primera secuencia de ácido nucleico para una obtener una zona de alargamiento,
\newpage
b) hibridación de una segunda secuencia de ácido nucleico, la cual es más larga que la primera secuencia de ácido nucleico, y contiene una secuencia que es homóloga a la primera secuencia de ácido nucleico, con el producto de alargamiento en la zona de alargamiento.
c) disgregación de la segunda secuencia de ácido nucleico para obtener una parte o la totalidad de la secuencia hibridada,
d) repetición de los pasos a) - c) con los productos de disgregación del paso c).
A este respecto, representan las primeras secuencias del ácido nucleico de preferencia los cebadores o respectivamente los productos de escisión citados más arriba. La secuencia más larga de ácidos nucleicos es de preferencia un ácido nucleico sonda o respectivamente un ácido nucleico amplificador. La zona de alargamiento es de preferencia con ello, la zona D3. La disgregación del ácido nucleico más largo corresponde de preferencia a la escisión del ácido nucleico sonda o respectivamente a la sonda amplificadora en la parte B1 o respectivamente D1 o F1. La repetición del paso a) a c) corresponde de preferencia a la conducción del ciclo de los productos de escisión.
Un objeto preferido de la invención es un procedimiento para la detección sensible, de un ácido nucleico diana A mediante:
a) hibridación del ácido nucleico diana A con un ácido nucleico de una sonda B, el cual contiene una parte B1 capaz de hibridar con el ácido nucleico diana y una parte B2 específica de un ácido nucleico.
b) escisión del ácido nucleico sonda B en la parte B1,
c) hibridación de un producto de escisión B' del ácido nucleico sonda, el cual contiene la parte B2 que no híbrida con el ácido nucleico diana, con un ácido nucleico matriz C, el cual contiene una parte C2 que híbrida con el producto de escisión B' en la parte B2, y una parte C1 que no híbrida con la parte B1 del ácido nucleico sonda,
d) alargamiento del producto de escisión B' con una parte de ácido nucleico B3 complementaria, completa o parcialmente, con la parte C1, y
e) hibridación de una sonda amplificadora D con el producto de alargamiento del producto de escisión B' en la parte B3, en donde la sonda D contiene una parte D1, la cual es homóloga a C1 o a una parte de la misma, y la cual es escindible.
Para el procedimiento directo citado más arriba se escinde la sonda amplificadora D en la parte D1, con lo que se forma un producto de escisión D'. Este contiene en el caso del procedimiento directo una secuencia la cual hace posible la hibridación en el ácido nucleico matriz C y el alargamiento análogamente al alargamiento de B'. Con ello se habría cerrado el ciclo de amplificación. Para el procedimiento directo contiene por consiguiente la sonda amplificadora D adicionalmente a la parte D1 una parte específica de ácido nucleico, la cual es homóloga a B2 o a una parte de la misma.
Con ello es particularmente preferido que la parte B2 específica del ácido nucleico no hibride lo máximo posible con el ácido nucleico diana. De preferencia tiene lugar entre el paso d) y e), la desnaturalización del híbrido del producto de alargamiento del producto de escisión B' con el ácido nucleico matriz C.
En el caso del procedimiento indirecto mencionado más arriba, el procedimiento contiene además con particular preferencia, los siguientes pasos:
f) escisión de la sonda amplificadora D en la parte D1, de preferencia con ARNasa H,
g) hibridación del producto de escisión D' generado por la escisión, con un ácido nucleico matriz E, el cual contiene una parte E2 hibridable con el producto de escisión en la parte D2, y una parte E1 no hibridable con la parte D1,
h) alargamiento del producto de escisión D' con una parte de ácidos nucleicos D3 complementaria de la parte E1, y opcionalmente
i) hibridación de una sonda amplificadora F con el producto de alargamiento del producto de escisión D' en la parte D3 en donde la sonda F contiene una parte F1, en donde F1 es homóloga a C1 o a una parte de la misma o es homóloga a E1 o a una parte de la misma y en donde F1 es escindible.
En este caso la sonda amplificadora D se escoge de manera que adicionalmente a la parte D1 contiene una parte D2 específica de ácido nucleico, la cual sin embargo no es homóloga a B2 o a una parte de la misma. Es particularmente preferido que la parte D2 sea específica para la parte E2 del ácido nucleico matriz E.
Además, es objeto de la invención un kit de ácidos nucleicos para la detección sensible de ácidos nucleicos diana, el cual kit contiene:
a) un ácido nucleico B con las partes B1 y B2, en donde B1 representa una parte disgregable y complementaria de una parte del ácido nucleico diana, y B2 representa una parte no hibridable con el ácido nucleico diana,
b) un ácido nucleico C con las partes C1 y C2, en donde C1 representa otra parte específica del ácido nucleico y C2 representa una parte complementaria a B2,
c) un ácido nucleico D con una parte D1, en donde D1 es homóloga de C1 o una parte de la misma, y es escindible.
De preferencia, el ácido nucleico D contiene adicionalmente una parte D2 que es homóloga a B2 o a una parte de la misma, o en otras palabras, D2 es complementaria de C2.
Esto significa que la parte D1 es también complementaria de B3.
Los kits según la invención pueden contener además los reactivos necesarios par la detección, en particular enzimas disgregadoras, p. ej., ARNasa H, una enzima de alargamiento de ácido nucleico, p. ej., una ADN-polimerasa o una transcriptasa inversa, mononucleótidos, así como un tampón apropiado para las reacciones enzimáticas.
El procedimiento según la invención se describe con más detalle mediante los siguientes ejemplos.
En adelante, se emplean en los oligonucleótidos, letras mayúsculas para las unidades de desoxirribonucleótidos, y letras minúsculas para las unidades de ribonucleótidos.
Ejemplo 1 Modo operativo para la detección radioactiva
1 pmol de la molécula de la sonda ARN-ADN (B: 5'- GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgauacuaacauugagauucccg-3', SEQ. ID.NO.1) se incuban con cada vez cantidades diferentes del ADN a detectar (A: 5'-ATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCGG-3', SEQ.ID.NO 2) en un volumen de 20 \mul a 42ºV durante 3 horas en tampón P2 (10 mM de Hepes, 1 mM de MgCl_{2}, pH 8,0) con adición de 3 \mug de RSA, 20 U de RNasin y 4 U de ARNasa H. A continuación se añade a la mezcla en cada caso, 1 pmol del oligonucleótido matriz (C: 5'-CGACGCCGCGTCGCAGAAGATCGGTGAGTCGTATTACTTCCAGTCCGATC-3', SEQ.ID.NO.3), se calienta durante 1 minuto a 100ºC y se enfría enseguida con hielo. A continuación se añade a cada mezcla 3 \mul de 10 x tampón Taq (100 mM de Tris pH 8,3, 500 mM de KCl, 15 mM de MgCl_{2}, 1 mg/ml de gelatina), dNTPs (concentración final 1 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y 1 U de Taq-polimerasa, se completan las mezclas hasta 30 \mul, y se incuba a 60ºC durante 30 minutos. Se añade a las mezclas cada vez 10 pmoles de la sonda amplificadora marcada radioactivamente en el terminal 5' mediante gamma-[32P]-ATP y polinucleotidoquinasa: (D: 5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagauc-3', SEQ.ID.NO.4). (*) Después de una nueva desnaturalización (1 minuto, 100ºC) se añade a cada mezcla 4 U de ARNasa H y se incuba a 42ºC durante 3 horas. Se continúa con otro paso de incubación a 60ºC durante 30 minutos. Esta disgregación catalizada por ARNasa H y la reacción de alargamiento catalizada por la Taq-ADN-polimerasa, se repiten todavía dos veces (a partir de *).
Para la detección se aplican los oligonucleótidos (entre ellos los productos acumulados de alargamiento marcados radioactivamente en el extremo 5' del producto de escisión D' de la sonda amplificadora) sobre un gel de secuencia al 12% (Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 6.36 y siguientes), y se separan electroforéticamente. La identificación del cebador alargado D' y con ello la conclusión sobre la presencia de la secuencia diana A, se logra mediante autorradiografía.
Ejemplo 2 Modo operativo para la detección no radioactiva
1 pmol de la molécula de la sonda ARN-ADN (B: 5'- GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgauacuaacauugagauucccg-3', SEQ. ID.NO.1) se incuban con cada vez cantidades diferentes del ADN a detectar (A: 5'-ATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCGG-3', SEQ. ID.NO 2) en un volumen de 20 \mul a 42ºC durante 3 horas en tampón P2 (10 mM de Hepes, 1 mM de MgCl_{2}, pH 8,0) con adición de 3 \mug de RSA, 20 U de RNasin y 4 U de ARNasa H. A continuación se añade a la mezcla en cada caso, 10 pmoles del oligonucleótido matriz (C: 5'-CGACGCCGCGTCGCAGAAGATCGGTGAGTCGTATTACTTCCAGTCCGATC-3', SEQ.ID.NO.3), se calienta durante 1 minuto a 100ºC y se enfría enseguida con hielo. A continuación se añade a cada mezcla 3 \mul de 10 x tampón Taq (100 mM de Tris pH 8,3, 500 mM de KCl, 15 mM de MgCl_{2}, 1 mg/ml de gelatina), dNTPs (concentración final 1 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, DIG-dUTP, BIO-dUTP) y 1 U de Taq-polimerasa, se completan las mezclas hasta 30 \mul, y se incuba a 60ºC durante 30 minutos. Se añade a cada una de las mezclas 100 pmoles de la sonda de amplificación (D: 5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagauc-3', SEQ.ID. NO.4). (*) Después de una nueva desnaturalización (1 minuto, 100ºC) se añade a cada mezcla 4 U de ARNasa H y se incuba a 42ºC durante 3 horas. Se continúa con otro paso de incubación a 60ºC durante 30 minutos. Esta disgregación catalizada por ARNasa H y la reacción de alargamiento catalizada por la Taq-ADN-polimerasa, se repiten todavía dos veces (a partir de *).
\newpage
A continuación, se separan los nucleótidos no incorporados, mediante precipitación de los oligonucleótidos con etanol.
Para la detección se disuelven los oligonucleótidos precipitados (entre ellos los productos de alargamiento acumulados marcados con BIO-DIG), cada uno en 210 \mul de tampón D (10 mM de Hepes pH 8,3, 30 mM de NaCl, 1 mM de MnCl_{2}). Los productos de la síntesis doblemente marcados se inmovilizan en una placa de microtitulación (MTP) recubierta de estreptavidina (placa de microtitulación recubierta de estreptavidina del ensayo de transcriptasa inversa, no radioactiva, Boehringer Mannheim 1468 120) pipeteando cada vez dos veces 100 \mul de las soluciones de oligonucleótido en los pocillos de una MTP lavada previamente con tampón de lavado (0,5%(V/V) de Tween 20 en PBS (solución salina tamponada con fosfato). La MTP se incuba con agitación (Well-Wamt1, de la firma Denley Instruments GmbH) durante 1 hora a 37ºC.
La MTP con las moléculas de ácido nucleico inmovilizadas se lava cinco veces con 200 \mul cada vez de tampón de lavado. A continuación, se añaden cada vez 100 \mul de la dilución del conjugado (policlonal <DIG>S-Fab-PODpoli-conjugado (Boehringer Mannheim GmbH), 200 mU/ml en tampón de conjugado (100 mM de fosfato de Na pH 7,5, 0,9% (P/V) de NaCl, 1% (P/V) de Ralufon F4J o fracción V de RSA; el tampón de conjugado se trata con pirocarbonato de dietilo, se esteriliza (filtro de 0,2 \mul, Nalgene) y se guarda a 4ºC) y se incuba de nuevo la MTP en las mismas condiciones.
Las moléculas de conjugado que no se han unido, se eliminan mediante lavado cinco veces. A continuación se añaden a cada pocillo 100 \mul de solución de substrato (2,2'-azino-di-[3-etilbenztiazolinsulfonato (6)], ABTS). La reacción coloreada tiene lugar a 37ºC con agitación. Se mide la "densidad óptica" a 405 nm del ABTS reaccionado después de una breve agitación de la MTP inmediatamente antes de la medición mediante un lector de ELISA (SLT) frente al filtro de referencia de 492 nm, y se determinan los valores medios después de substraer el valor cero (solamente ABTS) de las determinaciones dobles (SLT Easy-Base Versión 4.01).
Ejemplo 3 Ensayo con incorporación de digoxigenina
Se incubaron 50 pmoles de ADN diana A (5'-ATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCGG-3', 28mero, SEQ.ID.
NO 2) con 50 pmoles de moléculas sonda de ARN-ADN B (5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgauacuaacauugagauucccg-3', 50mero, oligo ADN-ARN con 23 ribos en el extremo 3', SEQ:ID:NO:1) y 4 \mul de tampón 10x (100 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 15 mM de MgCl_{2}, pH 8,3) en un volumen de 40 \mul con adición de 6 \mug de RSA, 40 U de Rnasin y 4 U de ARNasa H durante 3 horas a 42ºC.
Después de la incubación se extrajeron 20 \mul para el análisis de gelatina y se interrumpió con 2 \mul de tampón de aplicación (6 x TBE, 30% de glicerina, azul de bromofenol).
Para la "reacción de relleno" se añadieron a los restantes 20 \mul de la ARNasa H-Verdaus 25 pmoles de oligomatriz C (5'-CGACGCCGCGTCGCAGAAGATCGGTGAGTCGTATTACTTCCAGTCCGATC-3', 50mero, SEQ.ID.NO.3), se desnaturalizó 1 minuto a 95ºC y se enfrió rápidamente con hielo. Después de añadir 0,5 \mul de tampón 10x (ver más arriba), 100 \muM de cada dATP, dCTP y dGTP, 65 \muM de dTTP, 35 \muM de DIG-dUTP (en cada caso, concentración final) y 2,5 U de Taq-ADN polimerasa, se completa la mezcla hasta 25 \mul. Después de una incubación de 30 minutos a 60ºC se interrumpuió con 3 \mul de tampón de aplicación (ver más arriba).
Las muestras se aplicaron completamente sobre un gel del 20% de poliacrilamida (Biometra-Minigelkammer)
Tampón de recorrido = 1 x TBE, tiempo de recorrido aproximadamente 1 hora a 250 V.
A continuación se efectuó una tintura en 1 x TBE + EtBr (1 \mug/ml). Después de observar con UV, se transfirió el gel sobre una membrana de nylon y ésta se fijó con UV.
La detección se efectuó siguiendo las prescripciones del sistema DIG (Boehringer Mannheim GmbH).
Análogamente a esta mezcla se efectuó una mezcla sin DIG-dUTP (con 100 \muM de dTTP) y las muestras se aplicaron sobre un segundo gel. De este gel se recortaron después del recorrido y la tintura con EtBr, las bandas de la pista 6 y el ADN It Maniatis (método "crush and soak" ("triturar y embeber") de Maxam y Gilbert, 1977) se eluyó (en 20 \mul de tampón TE).
La figura 3 muestra estadios individuales de la reacción (tintura con bromuro de etidio).
La figura 4 muestra la reacción de transferencia.
\newpage
Pista 1 25 pmoles de B Pista 6 como 3 + 25 pmoles de C \rightarrow reacción completa
Pista 2 20 pmoles de C Pista 7 como 4 \rightarrow reacción completa
Pista 3 25 pmoles de A + 25 pmoles de
B + ARNasa H Pista 8 como 5 + 25 pmoles de C \rightarrow reacción completa
Pista 4 25 pmoles de A + 25 pmoles de
B + ARNasa H Pista 9 25 pmoles de C \rightarrow reacción completa
Pista 5 25 pmoles de A + 25 pmoles de
B sin ARNasa H Pista 10 25 pmoles de C + 25 pmoles de A \rightarrow reacción completa
"Ciclo" del ensayo
2 \mul del ADN eluido con 20 moles de la matriz C, 20 pmoles de la sonda de amplificación (5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCAG cgccgcgucgcagaagauc-3', 46 mero, oligo ADN-ARN con 19 ribos en el extremo 3', SEQ.ID.NO.4), 5 \mul de tampón 10x (ver más arriba), 100 \muM de cada dATP, dCTP y dGTP, 65 \muM de dTTP, 35 \muM de DIG-dUTP (concentración final en cada caso), 40 U de RNasin, 5 U de ARNasa H termoestable y 2,5 U de Taq-ADN-polimerasa en una mezcla, se completaron hasta 50 \mul. Después de un paso de desnaturalización de 3 minutos se repitió el siguiente ciclo 10 veces: 20 minutos a 42ºC-10 minutos a 60ºC-1 minuto a 95ºC.
Después de 1,5 y 10 ciclos se extrajeron 15 \mul de cada uno para el análisis y se interrumpieron con 2 \mul de tampón de aplicación (ver más arriba).
Las muestras se aplicaron por completo sobre un gel de poliacrilamida al 20%, tampón de recorrido = 1 x TBE, tiempo de recorrido aproximadamente 1 hora a 250 V.
A continuación se efectuó la transferencia sobre una membrana de nylón. Después de fijar mediante UV, se detectó el transfer según la prescripción del sistema DIG (figura 5).
Pista 1 Oligo 46mero, marcado con DIG
Pista 2 1 ciclo
Pista 3 5 ciclos
Pista 4 10 ciclos
(1) DATOS GENERALES:
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(i)
SOLICITANTE
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Sandhoferstr. 116
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
POBLACIÓN: Mannheim
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: DE
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
DISTRITO POSTAL: 68298
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 0621 759 4348
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
FAX: 0621 759 4457
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: procedimiento para la detección particularmente sensible de ácidos nucleicos
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ORDENADOR - VERSIÓN PARA LECTURA
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release # 1.0. versión # 1.30 (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: ácido nucleico distinto
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / desc. = "oligonucleótido"
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..27
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS:/ nota = "ADN"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28..50
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS:/ nota = "ARN"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGA UACUAACAUU GAGAUUCCCG 
\hfill
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: ácido nucleico distinto
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / desc. = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ATCTCGGGAA TCTCAATGTT AGTATCGG 
\hfill
28 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: ácido nucleico distinto
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / desc. = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACGCCGCG TCGCAGAAGA TCGGTGAGTC GTATTACTTC CAGTCCGATC 
\hfill
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: ácido nucleico distinto
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: / desc. = "oligorribonucleótido"
\vskip0.333000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..270
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS:/ nota = "ADN"
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28..46
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS:/ nota = "ARN"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUC 
\hfill
46

Claims (11)

1. Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos diana, el cual comprende los pasos:
a) creación en función de la secuencia diana, de una multiplicidad de ácidos nucleicos, los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, de ácidos nucleicos con una secuencia más larga,
b) amplificación de los ácidos nucleicos, los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz o partes de los mismos,
c) Detección del ácido nucleico diana a base de uno de los productos o productos intermedios formados en la amplificación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la creación de una multiplicidad de ácidos nucleicos los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, tiene lugar por escisión de ácidos nucleicos que contienen dos partes B1 y B2 y ácidos nucleicos, los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, en donde la parte B1 puede hibridar con el ácido nucleico diana o una parte del mismo, y puede ser escindido cuando está en forma hibridada con el ácido nucleico diana, y la parte B2 no hibridada con el ácido nucleico diana que no puede ser escindida, cuando la parte B1 está en forma hibridada con el ácido nucleico diana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizada porque la amplificación de los ácidos nucleicos los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, se efectúa por hibridación del cebador con un ácido nucleico matriz, alargamiento de los ácidos nucleicos los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz, mediante la utilización del ácido nucleico matriz como molde, hibridación del producto de alargamiento con un ácido nucleico el cual contiene una parte D1 no escindible, la cual es complementaria en toda su longitud o parcialmente, al producto de alargamiento del ácido nucleico generado por alargamiento, el cual puede actuar como cebador en un ácido nucleico matriz, y contiene una parte D2 no hibridable con el ácido nucleico diana, y escisión del ácido nucleico que contiene una parte D1 y D2, con liberación de ácidos nucleicos los cuales pueden actuar como cebadores en un ácido nucleico matriz.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 para la detección sensible de un ácido nucleico diana A, mediante:
a) hibridación del ácido nucleico diana A con un ácido nucleico sonda B, el cual contiene una parte B1 hibridable con el ácido nucleico diana, y una parte B2 que no es hibridable con el ácido nucleico diana.
b) escisión del ácido nucleico sonda B en la parte B1,
c) hibridación de un producto de escisión B' del ácido nucleico sonda, el cual contiene la parte B2 no hibridable con el ácido nucleico diana, con un ácido nucleico matriz C, el cual contiene una parte C2 hibridable con el producto de escisión B' en la parte B2, y una parte C1 no hibridable con la parte B1 del ácido nucleico sonda.
d) alargamiento del producto de escisión B' de una parte B3 de ácido nucleico la cual es complementaria total o parcialmente con la parte C1, y
e) hibridación de una sonda amplificadora D con el producto de alargamiento del producto de escisión B' en la parte B3, en donde la sonda D contiene una parte D1 la cual es homóloga con C1 o una parte de la misma y la cual es escindible,
f) detección del ácido nucleico diana A en base a los productos formados en los pasos b) hasta e).
5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la escisión del ácido nucleico sonda B tiene lugar con ayuda de la ARNasa H.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la sonda amplificadora D además de la parte D1 tiene una parte D2 que no es hibridable con el ácido nucleico diana, la cual es homóloga a B2 o a una parte de la misma.
7. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por otros pasos adicionales:
f) escisión de la sonda amplificadora D en la parte D1,
g) hibridación del producto de escisión D' creado por escisión, con un ácido nucleico matriz E, el cual contiene una parte E2 hibridable en la parte D2 con el producto de escisión, y una parte E1 no hibridable con la parte D1,
h) alargamiento del producto de escisión D' en una parte de ácido nucleico D3 complementaria a la parte E1, y
\newpage
i) hibridación opcional de una sonda amplificadora F con el producto de alargamiento del producto de escisión D' en la parte D3, en donde la sonda F contiene una parte F1 que es homóloga a C1 o a una parte de la misma, u homóloga a E1 ó a una parte de la misma, y en donde F1 es escindible.
8. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la sonda amplificadora D se escinde en la parte D1 con ARNasa H.
9. Procedimiento para la creación de secuencias de ácido nucleico, el cual comprende los pasos:
a) alargamiento de una primera secuencia de ácido nucleico para una región de alargamiento,
b) hibridación de una segunda secuencia de ácido nucleico, la cual es más larga que la primera secuencia de ácido nucleico y que contiene una secuencia la cual es homóloga a la primera secuencia de ácido nucleico, con el producto de alargamiento en la región de alargamiento,
c) disgregación de la segunda secuencia de ácido nucleico para una parte o la totalidad de la secuencia hibridable,
d) repetición de los pasos a) - c) con los productos de disgregación del paso c).
10. Kit para la detección sensible de ácidos nucleicos diana, el cual contiene:
a) un ácido nucleico B con las partes B1 y B2, en donde B1 representa una parte complementaria del ácido nucleico diana, y una parte disgregable, y B2 representa una parte no hibridable con el ácido nucleico diana,
b) un ácido nucleico C con las partes C1 y C2, en donde C1 representa otra parte específica de ácido nucleico y C2 representa una parte complementaria a B2,
c) un ácido nucleico D con una parte D1, en donde D1 es homóloga a C1 o una parte de la misma y es escindible.
11. Kit según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico D contiene adicionalmente una parte D2, la cual es homóloga a B2 o respectivamente es complementaria a C2 o a una parte de la misma.
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