ES2203692T3

ES2203692T3 - Uso de trifosfato de (r)-penciclovir para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades viricas.

Info

Publication number: ES2203692T3
Application number: ES96914109T
Authority: ES
Inventors: Richard Anthony Vere Hodge; Raymond F. Schinazi
Original assignee: Novartis International Pharmaceutical Ltd
Current assignee: Novartis International Pharmaceutical Ltd
Priority date: 1995-04-24
Filing date: 1996-04-23
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2016-04-23
Also published as: US7045525B1; US20060069108A1; JPH11504026A; WO1996033720A1; DE69629188T2; US20110092458A1; EP0822817B1; DE69629188D1; EP0822817A1; US20130281470A1

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO PARA EL TRATAMIENTO DE: I) INFECCIONES POR HIV IONES POR HBV EN MAMIFEROS, INCLUYENDO HUMANOS; EL CUAL METODO COMPRENDE LA ADMINISTRACION AL SER HUMANO QUE NECESITE DICHO TRATAMIENTO DE UNA CANTIDAD EFECTIVA DEL ENANTIOMERO (R) DEL TRIFOSFATO DE UN COMPUESTO DE FORMULA (A) O UNA SAL FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE DEL MISMO; Y COMPUESTOS PARA SER UTILIZADOS EN EL METODO.

Description

Uso de trifosfato de (R)-penciclovir para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades víricas.

Esta invención se refiere a la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y por el virus de la hepatitis B (VHB).

Cuando se usa en este documento, "tratamiento" incluye la profilaxis cuando sea apropiado.

El documento EP-A-141927 (Beecham Group p.l.c.) describe el penciclovir (PCV), el compuesto de fórmula (A):

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y las sales, ésteres de fosfato y derivados de acilo del mismo, como agentes antivirales. En el documento EP-A-216459 (Beecham Group p.l.c.) se describe la sal sódica hidratada de penciclovir. También se describen el penciclovir y su actividad antiviral en Abstract P. V 11-5, pág 193 de "Abstracts of 14th. Int. Congress. of Microbiology", Manchester, Inglaterra, 7-13 de septiembre de 1986 (Boyd et al.).

Los bioprecursores activos por vía oral del compuesto de fórmula (A) son de fórmula (B):

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y sales y derivados de los mismos como se definen por la fórmula (A); donde X es alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono, NH_{2} o hidrógeno. Los compuestos de fórmula (B) en la que X es alcoxi con 1 a 6 átomos de carbono o NH_{2} se describen en el documento EP-A-141927 y los compuestos de fórmula (B) en la que X es hidrógeno, descritos en el documento EP-A-182024 (Beecham Group p.l.c.) son profármacos preferidos. Un ejemplo particularmente preferido de un compuesto de fórmula (B) es aquel en el que X es hidrógeno y en el que los dos grupos OH están en forma del acetil derivado, descrito en el ejemplo 2 del documento EP-A-182024, denominado en lo sucesivo famciclovir.

El documento EP-A-388049 (Beecham Group p.l.c.) describe el uso de penciclovir/famciclovir en el tratamiento de la infección por virus de la hepatitis B.

La actividad antiviral contra el virus de la hepatitis B parece depender de la formación intracelular de trifosfato de penciclovir (PCV-TP). La polimerasa de VHB tiene muchas actividades enzimáticas, incluyendo la formación de un enlace covalente entre la polimerasa y dGMP, además de T-A-A, seguido de la polimerasa de ADN dirigida por ARN (transcriptasa inversa) y de la síntesis de ADN dirigida por ADN.

El derivado trifosfato de penciclovir inhibe la actividad polimerasa de ADN dirigida por ARN (transcriptasa inversa) del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1). La transcriptasa inversa de VIH-1 es un enzima codificado por virus esencial para la conversión del ARN genómico en ADN bicatenario proviral.

Ahora se ha demostrado que el enantiómero (R) de PCV-TP es más activo que el enantiómero (S) con respecto a la inhibición de las polimerasas de ADN de VHB y con respecto a la inhibición de la transcriptasa inversa de VIH-1.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de un bioprecursor del enantiómero (R) del trifosfato de un compuesto de fórmula (A)

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es decir, (R)-PCV-TP, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH-1 o infecciones por VHB, siendo el bioprecursor un derivado de (R)-PCV-monofosfato que libera intracelularmente (R)-PCV- monofosfato que, a su vez, se convierte en (R)-PCV-TP.

El (R)-PCV-TP se administra en forma de un compuesto que es un bioprecursor para permitir la absorción y la penetración a través de la pared celular. La selectividad por la célula infectada por el virus, especialmente por las células infectadas por VIH, puede conseguirse seleccionando un bioprecursor que se active preferentemente por la proteasa codificada por el virus. El bioprecursor puede estar en forma de un derivado de (R)-PCV-MP que libera intracelularmente (R)-PCV-MP que, a su vez, se convierte en (R)-PCV-TP.

El compuesto puede administrarse por vía oral a los seres humanos y puede componerse en forma de un jarabe, comprimidos o cápsulas. Cuando se prepara en forma de un comprimido, puede usarse cualquier vehículo farmacéutico adecuado para la formulación de tales composiciones sólidas, por ejemplo estearato de magnesio, almidón, lactosa, glucosa, arroz, harina y carbonato cálcico. El compuesto también puede estar en forma de una cápsula ingerible, por ejemplo de gelatina, para contener el compuesto, o en forma de un jarabe, una solución o una suspensión. Los vehículos farmacéuticos líquidos adecuados incluyen alcohol etílico, glicerina, solución salina y agua, a los que pueden añadirse agentes aromatizantes o colorantes para formar jarabes. También se prevén formulaciones de liberación sostenida, por ejemplo, comprimidos que contienen un recubrimiento entérico.

Para la administración parenteral, se preparan formas de dosificación unitaria líquidas que contienen el compuesto y un vehículo estéril. El compuesto, dependiendo del vehículo y de la concentración, puede suspenderse o disolverse. Las soluciones parenterales normalmente se preparan disolviendo el compuesto en un vehículo y esterilizándolo a través de un filtro antes de introducirlo en un vial o ampolla adecuada y de sellar dicho vial o ampolla. Ventajosamente, en el vehículo también se disuelven adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponantes. Para aumentar la estabilidad, la composición puede congelarse después introducirse en el vial, retirándose el agua al vacío.

Las suspensiones parenterales se preparan substancialmente de la misma manera con la excepción de que el compuesto se suspende en el vehículo en lugar de disolverse y esterilizarse por exposición a óxido de etileno antes de suspenderse en el vehículo estéril. Ventajosamente, en la composición se incluye un tensioactivo o agente humectante para facilitar la distribución uniforme del compuesto de la invención.

Como es común en la práctica, las composiciones normalmente irán acompañadas de instrucciones escritas o impresas para uso en el tratamiento médico pertinente.

Una unidad de dosificación adecuada podría contener de 50 mg a 1 g de ingrediente activo, por ejemplo de 100 a 500 mg. Tales dosis pueden administrarse de 1 a 4 veces al día o, más habitualmente, 2 ó 3 veces al día. La dosis eficaz de compuesto, en general, estará en el intervalo de 0,2 a 40 mg por kilogramo de peso corporal por día o, más habitualmente, de 10 a 20 mg/kg por día.

La presente invención también proporciona el uso del enantiómero (R) del trifosfato de un compuesto de fórmula (A) o un bioprecursor del mismo, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de:

i): infecciones por VIH-1 en mamíferos, incluyendo seres humanos; o

ii): infecciones por VHB en mamíferos, incluyendo seres humanos.

Tal tratamiento puede realizarse de la manera descrita anteriormente en este documento.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de:

i): infecciones por VIH-1 en mamíferos, incluyendo seres humanos; o

ii): infecciones por VHB en mamíferos, incluyendo seres humanos;

que comprende una cantidad eficaz del enantiómero (R) del trifosfato de un compuesto de fórmula (A), o un bioprecursor del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tales composiciones pueden prepararse de la manera descrita anteriormente en este documento.

Los datos biológicos que describen la actividad de (R)-PCV-TP se describen por Shaw et al, Zoulim et al en "Abstracts of the 35th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy" 17-20 de septiembre de 1995, H13, pág 182 y H36, pág 191 y Schinazi et al en "Antiviral Research" 1995, Suplemento 1, 146, A304, y también en el borrador adjunto manuscrito por Zoulim y el extracto adjunto del cartel presentado en apoyo de la referencia de Schinazi, presentados con la Solicitud de Patente británica 9604909.3, de la que la presente solicitud reivindica la prioridad de convención.

Los siguientes ejemplos ilustran bioprecursores del enantiómero (R) del trifosfato de un compuesto de fórmula (A). Los ejemplos 1, 2 y 5 tienen un interés potencial en el tratamiento de VHB y los ejemplos 3 y 4 tienen un interés potencial en el tratamiento de VIH-1.

Ejemplo 1 Derivado de PL-ASOR

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El enantiómero (S) de un derivado de PCV con un grupo protector sobre un grupo hidroxilo se fosforila y después el grupo protector se retira para producir (R)-PCV-MP. El (R)-PCV-MP se activa y se acopla a PL-ASOR mediante un procedimiento tal como el descrito en Drug Delivery 2, 136, 1995. El conjugado resultante puede tener múltiples restos (R)-PCV-MP por molécula de proteína.

Ejemplo 2 Derivado de fosfolípido

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El (R)-PCV-MP o una forma protegida del mismo (preparada como en el ejemplo 1) se convierte en este derivado por alquilación, o el grupo fosfato se activa y se acopla a una forma protegida del lípido, seguido de desprotección.

Ejemplo 3 Derivado de (R)-MP bis(POM)

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El (R)-PCV-MP o una forma protegida del mismo (preparada como en el ejemplo 1) se convierte en el derivado de bis(POM) por alquilación con cloruro de pivaliloximetilo mediante el procedimiento de J. Pharmaceutical Sci. 72, 324-5, 1983 o de J. Med. Chem. 38, 1372-9, 1995 y el grupo protector presente opcionalmente se retira.

Ejemplo 4 Éster difenílico de (R)-MP

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El enantiómero (S) de un derivado de PCV con un grupo protector sobre un grupo hidroxilo se trata con fosforocloridato de difenilo y el grupo protector se retira.

Ejemplo 5 Derivado de difosfato de dimiristoilglicerol

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El (R)-PCV-MP o una forma protegida del mismo (preparada como en el ejemplo 1) se acopla con una forma activada de fosfato de sn-1,2-dimiristoilglicerol y el grupo protector presente opcionalmente se retira.

Descripción 1

Preparación de fosfato de (R)-PCV

El análisis retrosintético de trifosfato de (R)-penciclovir 1a produce el sintón mono-protegido 2a, esquema 1. La desconexión adicional produce el fragmento quiral 3a y 2-amino-6-cloropurina 4. El equivalente sintético del sintón 3a es el uretano 5a usado por Kishi et al en la síntesis total de monensina^{2}. Por analogía, para la síntesis de trifosfato de (S)-penciclovir 1b se requiere el uretano 5b como material de partida. Los uretanos 5a y 5b también se han empleado en la síntesis de (R)- y (S)-1-(3-hidroximetilpirrolidin-1-il)citosina^{3}.

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Donde: R_{1} y R_{2} son grupos protectores ortogonales y X = grupo saliente adecuado.

Los uretanos diastereoméricos 5a y 5b se separaron por cromatografía en columna a media presión y por cromatografía analítica de fase normal se demostró que tenían un d.e. del 86%. La reducción de los uretanos 5a y 5b con LAH dio los mono-bencil éteres 6a y 6b^{2}. La rotación óptica del mono-bencil éter levorrotatorio 6a (\alpha_{D}^{22} - 12,4ºC (c = 1,00, cloroformo)); lit.^{2} \alpha_{D}^{22} - 12,1ºC (c = 0,68, cloroformo)) se había establecido previamente como que poseía la configuración S. Los mono-bencil éteres 6a y 6b se sililaron con el grupo t-butildifenilsililo voluminoso desde el punto de vista estérico para dar 7a y 7b con el fin de evitar la posible migración del sililo en etapas posteriores. Las olefinas 7a y 7b se ozonizaron primero con un buen rendimiento para dar los aldehídos 8a (78%) y 8b (91%) y después se redujeron para dar los alcoholes 9a y 9b con Dibal-H.

Para la síntesis de trifosfato de (R)-penciclovir 1a, el alcohol 9a se convirtió en el bromuro 10a (Br_{2}, PPh_{3}, DMF, 47%) con un rendimiento moderado. La alquilación de 2-amino-6-cloropurina 4 con el bromuro 10a, en condiciones bibliográficas^{4},

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dio como el producto mayoritario el nucleósido N-9 alquilado 11a (75%) que se separó del isómero N-7 indeseado 12a (14%) por cromatografía en columna. La regioquímica de la adición se confirmó simplemente a partir del espectro de ^{13}C RMN no desacoplado de (12a)^{5}. La pureza óptica de 11a no pudo analizarse por HPLC quiral. Sin embargo, la retirada del grupo protector sililo de 11a por hidrólisis ácida dio no sólo la cloropurina 13a (42%, e.e del 93%) sino también algo del nucleósido de guanosina deseado 14a (23%, H94/e.e del 0223%), los cuales pudieron analizarse por HPLC quiral. La hidrólisis ácida prolongada convirtió sin problemas la cloropurina 13a en el nucleósido de guanosina 14a (75%). El agente fosfitilante 2-cloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforin-4-ona (reactivo de van Boom) se había usado previamente para la preparación de H-fosfonatos de nucleósido como sintones en la síntesis de oligonucleótidos^{6}. La fosfitilación del nucleósido 14a (e.e del 90%) se realizó usando el reactivo de van Boom utilizando condiciones similares a las bibliográficas^{8} para la síntesis de trifosfatos de nucleósidos^{7}. Después, el intermedio fosfitilado se hizo reaccionar con pirofosfato de n-butilamonio seguido de oxidación con yodo para dar el trifosfato de nucleótido protegido con bencilo bruto 15a. Eventualmente, las condiciones que permiten la retirada del grupo protector de bencilo de 15a y que evitan la hidrólisis completa del grupo trifosfato se descubrieron usando un procedimiento de hidrogenación por transferencia. Casualmente, la hidrogenolisis del grupo bencilo de 15a pudo controlarse por HPLC analítica de intercambio aniónico que produjo, no sólo trifosfato de (R)-penciclovir 1a, sino también el (R)-difosfato 16a y el (R)-monofosfato 17a. Los dos últimos nucleótidos de penciclovir se formaron como resultado de la hidrólisis del grupo trifosfato en condiciones de reacción de hidrogenación por transferencia.

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La síntesis del (S)-trifosfato 1b se realizó en condiciones esencialmente idénticas a las descritas para la síntesis del (R)-trifosfato 1a, con la excepción de que el alcohol 9b se convirtió en primer lugar en el mesilato 9c y después en el yoduro 10b. La alquilación de 2-amino-6-cloropurina 4 con 10b produjo de nuevo el aducto N-9 11b como el producto mayoritario junto con una pequeña cantidad del aducto N-7 indeseado 12b. La hidrólisis ácida de 11b produjo una pequeña cantidad de la 6- cloropurina 13b (6%), pero principalmente el nucleósido de guanosina deseado 14b (85%).

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La fosfitilación de 14b (e.e del 90%) con el reactivo de van Boom, seguido de la reacción con pirofosfato de tri-n-butilamonio y después yodo dio el trifosfato bruto 15b. De nuevo, la hidrogenación por transferencia de 15b se controló por HPLC analítica de intercambio aniónico para producir no sólo el trifosfato de (S)-penciclovir deseado 1b sino también el (S)-difosfato 16b y el (S)-monofosfato 17b. La rotación óptica producida de todos los fosfatos de (R)- y (S)-penciclovir se muestra en la Tabla 1. Para cada par enantiomérico la magnitud y la señal de las rotaciones ópticas es esencialmente igual y opuesta. Esto sugiere que ha habido una pérdida de integridad quiral muy pequeña o nula de los precursores 14a y 14b, e.e del 90% en ambos casos, durante las condiciones de hidrogenación por transferencia y por lo tanto la pureza óptica de 1a, 1b, 16a, 16b, 17a y 17b es de aproximadamente un e.e del 90% en cada caso.

Método A

Sílice Spherisorb (250 x 5,0 mm). Tampón A, hexano; tampón B, hexano:cloruro de metileno (1:1); tampón C, hexano:etanol (80:20. Eluyente isocrático 40%A: 59%: 1%C, 1,00 ml/min. Detección U.V. 220 n.m. Tiempo de retención 5a (principal 9,48 min., minoritario 8,98 min.), 5b (principal 9,23 min., minoritario 9,69 min.).

Método B

Merck RP tipo B (125 x 4 mm) uM. Tampón A, TFA (0,1%) en agua, tampón B TFA (0,1%) en acetonitrilo. Eluyente, gradiente variando del 5% al 80%B durante 40 minutos, después 10 minutos a 80%B. Flujo 2,0 ml/min. Detección U.V. a 215 n.m.

Método C

Chiralpak AD (250 x 4,6 m). Eluyente isocrático hexano:etanol (7:3), 1,00 ml/min, detección u.v. a 220 n.m.

\newpage

Método D

Chiralpak AD (250 x 4,6 mm). Eluyente isocrático hexano:etanol (1:1) que contiene DEA al 0,1%, 1,0 ml/min. Detección U.V. a 240 n.m.

Método E

Chiracel OB (250 x 4,6 mm). Eluyente isocrático hexano:etanol (98:2), 1,00 ml/min. Detección U.V. 220 n.m.

Método F

Chiracel OC (250 x 4,6 mm). Isocrático hexano:etanol (95:5) que contiene DEA al 0,1%, 1,00 ml/min. Detección U.V. a 220 n.m.

Método G

Rainin Hydropore SAX (100 x 4,6 mm más precolumna) 12 \mum. Tampón A, fosfato amónico:metanol (9:1, 10 mM, pH 5,7), tampón B, fosfato amónico:metanol (9:1, 125 mM, pH 5,7). Gradiente de elución del 0% al 100%B durante 25 minutos, 1,00 ml/min. Detección U.V. 254 n.m.

2-Benciloximetil-4-penten-1-ol (6)

A una solución agitada de hidruro sódico (4,765 g, 119,1 mmol) en dimetilformamida (50 ml) en una atmósfera de argón con refrigeración en un baño de hielo se le añadió gota a gota una solución de 2-hidroximetil-4-penten-1-ol^{8} (11,07 g, 95,3 mmol) en dimetilformamida (75 ml) durante 20 minutos. El baño de refrigeración se retiró y se agitó durante 1 h antes de enfriar de nuevo la solución en un baño de hielo. Se añadió una solución de bromuro de bencilo (11,34 ml, 95,3 mmol) en dimetilformamida (75 ml) durante 5 minutos, y después de agitar durante 18 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió en salmuera (1,5 l) y se extrajo con éter dietílico (4 x 300 ml). La fracción orgánica se lavó con agua (2 x 1,0l), se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para producir un aceite pardo claro (17,40g). El aceite bruto en gel de sílice (500g) se purificó por cromatografía en columna usando un gradiente en incremento de éter dietílico al 10%:hexano a éter dietílico al 100% para producir (11,30 g, 57,5%) en forma de un aceite. ^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,53 a 7,37 (5H, m) aromático, 5,90 (1H, ddt), 5,15 (2H, m), 4,67 (1H, d), 4,62 (1H, d), 3,89 a 3,69 (3H, m), 3,62 (1H, dd), 2,38 (1H, s a), 2,23 (2H, ddd), 2,09 (1H, m); ^{13}(\delta (67,8 MHz, CDCl_{3}) 138,00, 136,26, 128,48, 127,76, 127,63, 116,56, 73,47, 73,34, 65,73, 40,37,32,79; m/z (Cl) 207 (MH^{+}); C_{13}H_{18}O_{2} requiere C 75,69, H 8,80 encontrado^{c} 75,30, H 8,84.

(R)-(+) y (S)-(-)-2-benciloximetil-4-penten-1-ol

A una solución agitada de (\pm)-2-benciloximetil-4-penten-1-ol (8,52 g, 41,3 mmol) en trietilamina (40 ml, P_{2}O_{5} recién retirado por destilación) en una atmósfera de nitrógeno se le añadió isocianato de (R)-(-)-1-(1-naftil)etilo (8,00 g, 40,56 mmol). Después de 16 horas, la mezcla se filtró y el sólido se lavó con hexano. El filtrado se concentró al vacío para producir 15,46 g en forma de un producto amarillo pálido. La cromatografía en columna exhaustiva sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno:hexano:éter dietílico (10:10:1) dio el diastereómero de elución más rápida (5a) (5,15 g, 30,9%) que mostró por HPLC analítica de fase normal (Método A) que tenía un d.e. del 86%. El diastereómero de elución más lenta (5b) (5,49 g, 32,9%) también mostró que tenía un d.e. del 86% por HPLC (Método A). A una solución del diastereómero de elución más rápida (5a) (5,15 g, 12,76 mmol) en éter dietílico (250 ml) se le añadió hidruro de litio y aluminio sólido (484 mg, 12,76 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 24 h. La mezcla se enfrió en un baño de agua y se añadió agua (0,43 ml), después una solución de hidróxido sódico (2,5 M, 0,85 ml) y finalmente más agua (1,06 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla se filtró a través de celite y el filtrado se concentró al vacío para producir un aceite transparente (4,89 g). La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de cloruro de metileno:hexano:éter dietílico (5:5:1) a (5:5:2) para producir (S)-(-)-2-benciloximetil-4-penten-1-ol (6a) (1,97 g, 75%). De una manera similar se redujo el diastereómero más lento (5b) (5,49 g, 13,6 mmol) con hidruro de litio y aluminio para producir R-(+)-2-benciloximetil-4-penten-1-ol (6b) (2,535 g, 90,3%).

(S)-(-)-2-Benciloximetil-4-penten-1-ol (6a)

Se produjo a partir de la reducción con hidruro de litio y aluminio del diastereómero de elución más rápida (5a) por TLC en éter dietílico. [\delta^{22}_{D} - 12,44ºC (cloroformo, c = 1,00)], [bibliográf. \alpha^{22}_{D} -12,1ºC (c = 0,68, cloroformo)]. Pureza óptica por HPLC quiral (Método E), tiempo de retención.

(R)-(+)-2-Benciloximetil-4-penten-1-ol (6b)

Se produjo a partir de la reducción con hidruro de litio y aluminio del diastereómero de elución más lenta (5b) por TLC en éter dietílico. Pureza óptica por HPLC quiral (Método E) % tiempo de retención. Véanse los comentarios anteriores.

(S)-2-benciloximetil-1-O-(1-butildifenilsilil)-4-penteno (7b)

A una solución agitada del (R)-(+)-alcohol (1,67 g, e.e del %, 8,1 mmol), en una atmósfera de argón, en dimetilformamida (25 ml) se le añadió imidazol (1,213 g, 17,8 mmol) y después t-butildifenilclorosilano (2,448 g, 8,9 mmol). La mezcla se agitó a T.A. durante 16 h y después se vertió en salmuera diluida y se extrajo con cloruro de metileno. La fracción orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para producir un aceite incoloro (4,18 g). La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con éter dietílico al 1% en hexano produjo (7b) (3,43 g, 95%) en forma de un aceite transparente.

(R)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-4-penteno (7a)

Mediante un procedimiento similar al descrito anteriormente, se sililó el (S)-(-)-alcohol (6a) (1,71 g, 8,90 mmol) que después de la cromatografía en columna sobre gel de sílice produjo (7a) (2,07 g, 83%) en forma de un aceite transparente. ^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta véase anteriormente.

(R)-2Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)butan-4-al (8a)

A una solución de la olefina protegida con sililo (1,32 g, 2,99 mmol) (7a) en cloruro de metileno (60 ml) a -70ºC se le burbujeó gas ozono. Después de 10 minutos, la TLC indicó que todo el material de partida se había consumido y se burbujeó argón a través de la solución hasta que el gas de salida no tenía ozono. Después se añadió una solución de trifenilfosfina (0,94 g, 3,59 mmol) en DCM (10 ml) y se dejó calentar lentamente a T.A. Después de 16 h, la mezcla se concentró al vacío para producir un aceite amarillo pálido (3,606 g). La cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de éter dietílico al 2% en hexano a éter dietílico al 10% en hexano produjo el compuesto del título (8a) (1,03 g, 78%) en forma de un aceite. ^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,75 (1H, t), 7,61 (4H, d a), 7,42 a 7,22 (11H, m), 4,45 (2H, s), 3,67 (2H, m), 3,55 (1H, dd), 3,45 (1H, dd), 2,52 (3H, s a), 1,03 (9H, s).

(S)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-butan-4-al (8b)

Mediante un método similar, a una solución de la olefina (7b) (3,315 g, 7,46 mmol) en 150 ml de cloruro de metileno en una atmósfera de argón, temperatura interna de -68ºC, se le burbujeó gas ozono. Después de 15 minutos la solución se volvió azul. Se burbujeó argón hasta que el gas de salida no tenía ozono. Después de 30 min, se añadió una solución de trifenilfosfina en DCM (30 ml), se dejó calentar lentamente a T.A. y se agitó durante 64 h. Se purificó como se ha indicado anteriormente para producir (3,03g, 90%) en forma de un aceite transparente.

(R)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-butan-1-ol (9a)

A una solución agitada del aldehído (8a) (2,132 g, 4,80 mmol) en cloruro de metileno (50 ml) en una atmósfera de argón a -70ºC se le añadió gota a gota una solución de hidruro de diisobutilaluminio en cloruro de metileno (1,0 M, 5,30 ml) durante 5 minutos. Después de 1 h a -70ºC, la TLC indicó que todo el material de partida se había consumido. Después, se añadió acetato de etilo (1,77 ml), seguido de agua (1,6 ml) y el baño de refrigeración se retiró y se reemplazó con un baño de agua. Después de 20 minutos se añadió hidrogenocarbonato sódico (629 mg, 7,49 mmol) y la mezcla se agitó durante 2,5 h. El sólido se retiró por filtración y se lavó con cloruro de metileno. El filtrado se concentró al vacío para producir un aceite transparente (9a) (2,2 g, 103%) que se usó sin purificación adicional. ^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,64(4H, m a), 7,44 a 7,25 (11H, m), 4,48 (2H, s), 3,65 (4H, m), 3,60 (1H, dd), 3,45(1H, dd), 2,73 (1H, t a), 2,02 (1H, m), 1,67 (2H, m), 1,04 (9H, s).

(S)-2-benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-butan-1-ol (9b)

A una solución del aldehído bruto en DCM (71 ml) a -68ºC en una atmósfera de argón se le añadió dibal-H mediante una jeringa durante 5 minutos. Después de 4,25 h, la TLC indicó que todo el material de partida se había consumido y se inactivó mediante la adición de EtOAc (2,50 ml). El baño de refrigeración se retiró y se reemplazó con un baño de agua y la mezcla se agitó durante 0,5 h. Después, se añadió hidrogenocarbonato sódico sólido (0,892 g, 10,63 mmol) y se agitó durante 1 h más. El sólido se retiró por filtración y se lavó con cloruro de metileno para producir (9b) en forma de un aceite bruto (2,89 g, 95%) que se usó sin purificación adicional.

(R)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-4-bromobutano (10a)

A una solución agitada del alcohol (2,142 g, 4,80 mmol) y trifenilfosfina (1,386, 5,29 mmol) en dimetilformamida se le añadió gota a gota bromo (0,272 ml, 5,29 mmol). Después de agitar durante 16 h a T.A., la mezcla se vertió en agua, el sólido se filtró y se lavó con hexano. La fracción acuosa se lavó con hexano y las fracciones orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron al vacío para dar un aceite amarillo pálido (2,98 g). La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de cloruro de metileno del 5% al 25% en hexano produjo el compuesto del título (9a, 1,14 g,46,7%) en forma de un aceite. ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,65 (4H, m), 7,47 a 7,24 (11H, m), 4,48 (2H, s), 3,69 (2H, m), 3,53 (2H, m), 3,42 (2H, t), 2,12 a 1,92 (3H, m), 1,04
(9H, s).

(R)-2-Benciloximetil-1-O(t-butildifenilsilil)-butan-4-O-metano sulfonato (9c)

A una solución agitada del alcohol bruto ( ) (2,894 g, 6,45 mmol) en cloruro de metileno y trietilamina (1,35 ml, 9,68 mmol) en una atmósfera de argón a -5ºC se le añadió gota a gota cloruro de metanosulfonilo (0,6 ml, 7,74 mmol) durante 7 minutos. La mezcla se calentó a 5ºC, se agitó durante 1,5 h más, se enfrió a 0ºC y se le añadió ácido clorhídrico diluido (1,25 M). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con cloruro de metileno. La fracción orgánica completa se lavó con una solución diluida de hidrogenocarbonato sódico, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó al vacío para producir un aceite amarillo pálido (3,40 g) que se usó sin purificación adicional. ^{1}H RMN (200 MHz) \delta 7,63 (4H, m), 7,45 a 7,23 (11H, m), 4,47 (2H, s), 4,26 (2H, dt), 3,68 (2H, m), 3,52 (2H, m), 2,88 (3H, s), 2,01(1H, m), 1,88 (2H, m), 1,04 (9H, s).

(R)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-4-yodo-butano (10b)

A una solución agitada del mesilato (9c) (3,40 g) (6,45 mmol) en acetona (60 ml), en una atmósfera de nitrógeno, se le añadió yoduro sódico (1,934 g, 12,9 mmol). Después, la mezcla se calentó a reflujo durante 3,5 h, se enfrió a T.A. y se concentró al vacío. Se añadieron cloruro de metileno y agua, se separó y la fase acuosa se extrajo de nuevo con cloruro de metileno. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se lavó primero con metabisulfito sódico y después con salmuera y se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró al vacío para producir un aceite amarillo pálido (3,391 g). La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de éter dietílico al 2% en hexano a éter dietílico al 5% en hexano produjo el compuesto del título (10b) (2,740 g, 76%) en forma de un aceite transparente. ^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,63 (4H, m), 7,45 a 7,22 (1H, m), 4,47 (2H, s), 3,69 (2H, m), 3,54 (2H,m), 3,18 (2H, a), 1,97 (3H, m),1,04 (9H, s).

(R)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-4-(2-amino-6-cloropurin-9-il)- butano (11a)

A una solución agitada del bromuro (10a) (1,017 g, 2,00 mmol) en dimetilformamida (9,20 ml) y 2-amino-6-cloropurina (0,340 g, 2,00 mmol) a T.A. en una atmósfera de argón se le añadió carbonato potásico (0,415 g, 3,00 mmol). Después de 22 h, la mezcla de reacción se vertió en agua y se extrajo con cloruro de metileno:metanol (99:1). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío para dar un aceite amarillo (1,287 g). La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de metanol del 1% al 3% en cloruro de metileno produjo (11a) en forma de un aceite (0,90 g, 75,1%). ^{1}H RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,62 (5H, m), 7,48 a 7,22 (11H, m), 5,04 (2H, s a), 4,47 (2H, s), 4,10 (2H, t), 3,69 (2H, d), 3,48 (1H, dd), 3,37 (1H,dd), 2,09 a 1,78 (3H, m), 1,04 (9H, s).

(S)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-4-(2-amino-6-cloropurin-9-il)- butano (11b)

A una solución agitada del yoduro (10b) (2,40 g, 4,90 mmol) en dimetilformamida (22,5 ml) se le añadieron 2-amino-6-cloropurina (834 mg, 4,91 mmol) y carbonato potásico (1,01 g, 7,38 mmol) en una atmósfera de argón a T.A. Después de 30 h se añadió metanol:cloruro de metileno (1:99, 250 ml) y la mezcla se vertió en agua (1 l). La fracción acuosa se extrajo de nuevo con metanol:cloruro de metileno (1:99, 3 x 250 ml). La fracción orgánica completa se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para dar un aceite (11,0 g, que contenía dimetilformamida residual). El aceite se recogió en cloruro de metileno (200 ml) y se lavó con agua (1 l). La fase acuosa se extrajo de nuevo con cloruro de metileno (3 x 200 ml). La fase orgánica combinada se lavó de nuevo con agua (1 l), se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para dar un aceite amarillo (3,162 g). La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con DCM, metanol:cloruro de metileno (1:99) y finalmente con metanol:cloruro de metileno (1,5:98,5) dio (11b) (2502 g, 85%) en forma de un aceite que contenía \sim5% de DMF por ^{1}H RMN.

(R)-2-Benciloximetil-1-O-(t-butildifenilsilil)-4-(2-amino-6-amino-7-il)butano (12b)

El compuesto del título se obtuvo en forma de una fracción de elución tardía a partir de la purificación en columna sobre gel de sílice de (11b). El aceite resultante se recristalizó en acetato de etilo:hexano para dar un sólido blanco (457 mg, 15,6%) p.f. 109-110ºC, pureza por HPLC (Método) 98,0%, m/z 603 (M+H). ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 8,33 (1H, s), 7,54 (4H, m), 7,48 a 7,23 (11H,m), 6,61 (2H, s a), 4,42 (2H, t), 4,37 a 4,27 (2H, m), 3,64 (2H, m), 3,50 (2H,m), 1,95 (1H, m), 1,83 (2H, m), 0,93 (9H, s), ^{13}C (100,6 MHz, DMSO-d_{6}) 164,25, 159,84, 149,18, 1,42,03, 138,28, 134,91, 132,86, 132,82,129,71, 128,10, 127,73, 127,25, 127,22, 114,61, 72,06, 69,42, 63,64, 44,51, 38,83, 29,92, 26,49, 18,65.

(S)-2-Benciloximetil-4-(2-amino-6-cloropurin-9-il)-butan-1-ol (13a)

A una solución agitada de (11a) (158 mg, 0,27 mmol) en tetrahidrofurano (4,0 ml) se le añadió ácido clorhídrico (2 M, 4,0 ml) en una atmósfera de argón a T.A. Después de 24 h, se añadió exceso de carbonato sódico saturado. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo y después con cloroformo. La fracción orgánica completa se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó para dar un aceite transparente (135 mg). La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente en incremento de metanol al 2% a metanol al 4% en cloruro de metileno produjo (13a) (60 mg, 66%) en forma de un aceite. Una muestra se recristalizó en acetato de etilo:hexano para producir un sólido blanco. ^{1}H RMN (400 Mhz,CDCl_{3}) \delta 7,74 (1H, s), 7,42 a 7,28 (5H, m), 5,11 (2H, s a), 4,50 (2H, dd), 4,17 (2H, m), 3,75 (2H, d), 3,56 (2H, m), 2,45 (1H, s a), 2,08 a 1,90 (2H, m), 1,83 (1H, m), m/z (FAB) 362 (M+H).e.e pos HPLC quiral (Método C) del 93,6%.

(S)-2-benciloximetil-4-(9-guaninil)-butan-1-ol (14a)

A una solución agitada de la cloropurina (13a) (325 mg, 0,9 mmol) en tetrahidrofurano (15 ml) se le añadió ácido clorhídrico (2 M, 15 ml) y se agitó a 60ºC en una atmósfera de argón durante 26 h. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua y se le añadió una solución de hidróxido sódico (10 M) hasta pH 9. La fase acuosa se extrajo con metanol:acetato de etilo (7:93, 4 x 35 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó al vacío para dar un aceite (150 mg). Tras un periodo de reposo cristalizó un sólido blanco a partir de la fase acuosa, que se retiró por filtración, se lavó con agua (5 ml) y éter dietílico y se secó al vacío para dar el compuesto del título (14a) (175 mg, 56,8%). ^{1}H RMN (400 MHz,DMSO-d_{6}) 10,55 (1H, s), 7,66 (1H, s), 7,40 a 7,22 (5H, m), 6,44 (2H, s a), 4,51 (1H, t), 4,42 (2H, t), 4,00 (2H, t), 3,49 a 3,30 (4H, m), 1,76 (2H, c), 1,64 (1H, m). Pureza por HPLC (Método) del 98,3%, e.e por HPLC quiral (Método D) del 89,6%, tiempo de retención: pico mayor 10,3 min, pico menor 6,9 minutos. (C_{17}H_{21}N_{5}O_{3}, -7,7 ppm, NH_{3}Cl) m/z 343,1617. El aceite se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente en incremento de metanol (8-22%) en cloruro de metileno para producir (14a) (87 mg, 28,2%) en forma de un aceite.

(R)-2-Benciloximetil-4-(2-amino-6-cloropurin-9-il)-butan-1-ol (13b)

A una solución agitada de (11b) (248 mg, 0,42 mmol) en THF (6,22 ml), a T.A. en una atmósfera de argón, se le añadió ácido clorhídrico (2,0 M, 6,2 ml). Después de 26 h, el tetrahidrofurano se retiró al vacío. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 ml) y la fracción orgánica completa se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó al vacío para dar un aceite. La cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con cloroformo y después con un gradiente en incremento de metanol (del 1 al 4%) dio (13b) (96 mg, 63,8%). El aceite resultante se recristalizó en acetato de etilo:hexano para dar un sólido blanco (86 mg, 57,2%). e.e por HPLC quiral (Método C) del 86,2%.

(R)-2-Benciloximetil-4-(9-guanidin)-butan-1-ol (14b)

A una solución agitada de la cloropurina (11b) (2,235 g, 3,71 mmol) en tetrahidrofurano (56 ml), en una atmósfera de argón a T.A., se le añadió ácido clorhídrico (2,0 M, 56 ml). La mezcla se calentó a una temperatura de 65-70ºC durante 20 horas, se enfrió a T.A. y se neutralizó con hidróxido sódico (12,5 M, aprox. 9 ml) hasta pH 7. El tetrahidrofurano se retiró por evaporación al vacío. La fase acuosa se extrajo con cloruro de metileno (100 ml) produciendo una emulsión y el sólido se retiró por filtración. El sólido se lavó con cloruro de metileno (100 ml, de un lavado sólido). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío para dar un aceite (1,616 g). La fase acuosa se ajustó de nuevo a pH 7 y se enfrió en un baño de hielo durante 2 h. El sólido resultante se lavó con agua y éter dietílico y se combinó con la primera extracción. El sólido combinado se recogió en metanol, se filtró y se concentró al vacío para dar (14b) (944 mg, 74,5%). Pureza por HPLC del 98,2%, e.e por HPLC quiral (Método D) del 81,4%. Una muestra (755 mg) se recristalizó en agua (aprox. 90 ml) y se dejó enfriar lentamente a T.A. El sólido resultante se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío para dar (14b) (609 mg,80,7% de recuperación). e.e por HPLC quiral (Método D) del 89,9%. Tiempo de retención: pico mayor 6,7 min, pico menor 10,4 min. Pureza por HPLC (Método B) del 98,9%. C_{17}H_{21}N_{5}O_{3}(H_{2}O)_{0,6} requiere c = 57,43; h = 6,29 y N = 19,70 encontrado C = 57,49, H 6,07 y N = 19,72.

13

Trifosfato (1b), difosfato (16b) y monofosfato (17b) de (S)-penciclovir

Una suspensión del (R)-nucleósido (14b) (174 mg, 0,51 mmol) se destiló azeotrópicamente con piridina (2 x 10 ml). A una suspensión agitada de ( ) en piridina (1,22 ml) y dimetilformamida (4,62 ml) se le añadió una solución de 2-cloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforin-4-ona (113 mg, 0,57 mmol) en dioxano (1,13 ml, más 0,5 ml de lavado). El nucleósido empezó a disolverse inmediatamente y se observó un color ligeramente amarillo. Después de 10 minutos, se añadió una solución de pirofosfato de tri-n-butilamina (336 mg) en tri-n-butilamina (0,58 ml) y dimetilformamida (2,9 ml). Después de 10 minutos más se añadió una solución de yodo (al 1% p:v) en piridina:agua (98:2; v:v; 10,2 ml). Quince minutos después de la adición del yodo la reacción se vertió en agua (80 ml) y se extrajo con cloroformo (4 x 80 ml). La fase acuosa se concentró al vacío para dar el trifosfato protegido con bencilo bruto (15b) (460 mg). A una solución del trifosfato bruto ( ) (460 mg) en agua:metanol (1:1, 80 ml) se le añadió catalizador de paladio sobre carbono (Johnson-Matthey, Tipo 4878L, 174 mg) con agitación en una atmósfera de argón. Después de 15 minutos, el catalizador se retiró por filtración sobre celite y se lavó con metanol:agua caliente (1:1, 90 ml). Al filtrado se le añadieron formiato amónico (1,0 g) y catalizador de paladio (203 mg) con agitación en una atmósfera de argón. La mezcla se calentó a reflujo, a una temperatura de 93-10ºC, durante 6 h. En este momento la reacción se había completado sólo al \sim50% como se juzgó por HPLC de intercambio aniónico (método). La mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el catalizador se lavó con caliente:metanol caliente (1:1, 200 ml). El filtrado se concentró al vacío y se liofilizó en agua (700 ml) para dar un sólido blanco (620 mg). Este sólido se sometió de nuevo a las condiciones de hidrogenación por transferencia. A una solución del trifosfato parcialmente desprotegido bruto (620 mg). Este sólido se sometió de nuevo a las condiciones de hidrogenación por transferencia. A una solución del trifosfato parcialmente desprotegido bruto (620 mg) en agua:metanol (1:1, 160 ml) se le añadieron formiato amónico (480 mg) y catalizador de paladio (50 mg) con agitación en una atmósfera de argón. La mezcla se calentó a una temperatura del baño de aceite de 80ºC durante 1,5 h, tiempo después del cual se consideró que la desprotección se había completado, \leq1% ( ) restante, como se juzgó por HPLC de intercambio aniónico. La mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el catalizador se lavó con agua:metanol caliente (1:1, 200 ml). El filtrado se concentró al vacío para dar un sólido blanco (900 mg) que se liofilizó en agua (1 x 500 ml y 1 x 150 ml) para dar (1b), (16b) y (17b) brutos (367 mg).

La mitad de esto se purificó para dar:

50 mg de PCV.TP

40 mg de PCB.DT

10 mg de PCV.MP

14

Trifosfato (1a), difosfato (16a) y monofosfato (17a) de (R)-penciclovir

El (S)-nucleósido (14a) (174 mg, 0,51 mmol) se fosfeniló y se convirtió en el (15a) protegido con bencilo en condiciones idénticas a las descritas para la síntesis del enantiómero (15b) anterior. El trifosfato bencilado bruto (15a) se recogió en agua:metanol (1:1, 80 ml) y se agitó con catalizador de paladio sobre carbono (Tipo 487L, 175 mg). Después de 20 minutos la mezcla se filtró a través de celite y el catalizador se lavó con agua:metanol (1:1, 80 ml). El filtrado se usó para la reacción de desbencilación por hidrogenación por transferencia. Al filtrado (160 ml) se le añadieron formiato amónico (530 mg) y catalizador de paladio sobre carbono (153 mg) y se agitó en una atmósfera de argón. La mezcla se calentó a una temperatura del baño de aceite de 76-88ºC, y se controló por HPLC de intercambio aniónico (Método). Después de 3,5 h se añadió catalizador de paladio (305 mg) y después de 5,5 h se añadió más catalizador de paladio (142 mg). Después de 6,5 h la reacción se filtró a través de celite y el catalizador se lavó con agua:metanol caliente (1:1, 200 ml) y el filtrado se concentró al vacío. El filtrado se disolvió en agua:metanol (1:1, 160 ml), formiato amónico (265 mg) y catalizador de paladio (105 mg). La mezcla se agitó en una atmósfera de argón y se calentó en un baño de aceite a una temperatura de 76-80ºC. Después de 5,5 h, se consideró que la desprotección se había completado según mostró el análisis por HPLC de intercambio aniónico, \leq1% () restante. La mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el catalizador se lavó con metanol:agua caliente (1:1, 100 ml). El filtrado se concentró al vacío y se destiló azeotrópicamente con agua (25 ml) para dar un aceite (830 mg). Después, se liofilizó en agua (1 x 300 ml y 1 x 125 ml) para dar un sólido blando (376 mg).

Referencias

1. Sime, J. T., Barnes, R. D., Elson, S. W., Jarvest, R. L. y O'Toole, K.J., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1992, 1653-1658; Hannah, J., Tolman, R. L., Karkas, J. D. Liou, R., Perry, H. C. y Field, A. K., J. Heterocyclic Chem., 1989, 26, 1261-1276.

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4. Harnden, M. R., Jarvest, R. L., Bacon, T. H. y Boyd, M R., J. Med.Chem., 1987, 30, 1636-1642; Geen, G. R., Grinter, T. J., Kincey, P. M. y Jarvest, R. L., Tetrahedron, 1990, 46, 6903-6914.

5. En la ^{13}C RMN infra-acoplada de ( ) la purina C-5 (114,53 ppm) está acoplada a la purina H-8 y al grupo metileno (C-4) del cambio lateral de butilo y aparece como un cuadruplete. En cuanto a la purina C-4 (164,12 ppm), aparece como un doblete ya que sólo está acoplada al protón en C-8 de la purina.

6. Marugg, J. E., Tromp, M., Kuyl-Yeheskiel, E., van der Marel, G. A. y Van Boom, J. H., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 2661-2664.

7. Ludwig, J. y Eckstein, F., J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635.

8. Wasson, B. K., Gleason, C. H., Levi, I, Parker, J. M., Thompson, L. M. y Yates, C. H., Can. J. Chem 1961, 39, 923-932.

Descripción 2

Preparación de fosfato de (R)-PCV - método alternativo 9-(4-Hidroxi-3-O-monometoxitritilmetilbut-1-il)guanina (9-S y 9-R)

Se secó 9-(4-O-isobutiril-3-hidroximetilbut-1-il)guanina (4-R, pico 1 o 4-S, pico 2, respectivamente) (0,3 g, 0,9 mmol) a alto vacío durante 2 h y después se disolvió en DMF (3 ml). A la solución resultante se le añadió N,N-dimetilformamida dimetilacetal (0,75 ml, 5,5 mmol). La mezcla de reacción se dejó durante una noche a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se siguió por UV (desaparición del máximo a \lambda = 254 nm, y aparición de un nuevo máximo a \lambda = 301 nm, correspondiente al 4-R o 4-S protegido con exoamino). Después de que se completase la reacción, la DMF se evaporó a presión reducida y después el residuo se disolvió en piridina anhidra (5 ml). A la solución resultante se le añadió cloruro de monometoxitritilo (0,3 g, 0,95 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante una noche y después se le añadió una solución concentrada de NH_{4}OH (5 ml). Todo el conjunto se dejó durante una noche (el máximo en \lambda = 301 desapareció) y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El residuo oleoso se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y la solución se extrajo con H_{2}O (3 x 5 ml). La fracción orgánica se secó sobre MgSO_{4} y después se evaporó el CH_{2}Cl_{2}. Se disolvió de nuevo la 9-(4-O-isobutiril-3-O-monometoxitritilmetil-but-1-il)guanina bruta (7) en CH_{2}Cl_{2} y después se añadió gota a gota a hexano. El precipitado se filtró y se secó a presión reducida. El rendimiento fue de 0,3 g de cada isómero de 7. El compuesto 7 (0,3 g) se disolvió en DMF (7,5 ml) y CH_{3}OH (7,5 ml) y después a la solución resultante se le añadió NaOH 1 M (3 ml) para retirar la protección de isobutirilo. Después de 3 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se neutralizó con Dowex 50W x 8 (en forma de piridinio). La resina se filtró y después se lavó con CH_{3}OH. El filtrado y los lavados se combinaron y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El 9 bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando un gradiente por etapas de CH_{3}OH en CH_{2}Cl_{2} del 0 al 8% como sistema de disolventes de elución. El rendimiento de 9-R fue de 0,11 g (25%) y el de 9-S de 0,26 g (55%). 9-R: TLC (CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH, 9:1) R_{f} 0,12; UV (C_{2}H_{5}OH al 95%), \lambda_{max} 235, \lambda_{min} 224, \lambda_{sh} 246, 263; 9-S: TLC (CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH, 9:1) R_{f} 0,12; UV (C_{2}H_{5}OH al 95%), \lambda_{max} 235, \lambda_{min} 223, \lambda_{sh} 243, 263. Nota: El MMTrPCV (9) se sintetizó con y sin protección del grupo guanina exoamino. Los rendimientos son comparables.

Trifosfato de 9-(4-hidroxi-3-hidroximetil-but-1-il)guanina (10-R y 10-S)

Se secó 9-(4-hidroxi-3-O-monometoxitritilmetil-but-1-il)guanina (9-S o 9-R) (60 mg, 0,11 mmol) al vacío durante una noche a temperatura ambiente y después se inyectaron DMF (3,6 ml) y piridina anhidra (1,2 ml) a través del tabique en el matraz de reacción con barra agitadora. Durante todas las manipulaciones se mantuvo una pequeña presión positiva de nitrógeno en el recipiente de reacción conectándolo con una globo cargado de nitrógeno. Se inyectó una solución 1 M preparada recientemente de 2-cloro-4H-1,2,3-dioxafosforin-4-ona (5) en dioxano anhidro (0,55 ml) en la solución bien agitada de 9. Después de 15 min se inyectó rápidamente una solución 0,5 M de bis(tri-n-butilamonio)pirofosfato (6) en DMF anhidra (1,5 ml) seguido de tri-n-butilamina (1 ml). Después de 15 min, la mezcla de reacción se dividió en dos partes iguales (de 3,9 ml cada una) y se añadieron a una solución al 25% de yodo en piridina/THF que contenía agua hasta que se alcanzó un exceso de yodo. El exceso de yodo se destruyó después de 15 min mediante la adición de unas gotas de una solución acuosa al 5% de NaHSO_{3} y la mezcla de reacción se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió de nuevo en H_{2}O (5 ml). Después del reposo durante 30 min a temperatura ambiente, la solución se evaporó a sequedad y después se añadió AcOH al 80% (25 ml). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 0,5 h y después el AcOH se coevaporó a sequedad con n-BuOH. El residuo se trató con H_{2}O (8 ml) y después la suspensión resultante se extrajo con CH_{2}Cl_{2}(3 x 2 ml). La fracción de H_{2}O que contenía el producto se separó y se filtró a través de Acrodisc LC 13 PVDF (0,45 \mum, Gelman). El PCVTP bruto se purificó por FPLC usando HiLoad 26/10, columna Q Sepharose Fast Flow Pharmacia. La columna se eluyó con un gradiente de tampón TEAB (pH 7,0) de 0,05 a 0,7 M, a un caudal de 10 ml/min. Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se liofilizaron. El rendimiento del trifosfato de PCV 10-R y 10-S fue de 90 A_{260} unidades cada uno (aprox. 3,5 mg asumiendo \varepsilon_{PCVTP}= 11,5 X 10^{3}). 10-R: UV (H_{2}O) \lambda_{máx} 253, \lambda_{sh} 262; HPLC (columna: 4,6 x 100 mm, Rainin Hydropore SAX, gradiente: de NH_{4}K_{2}PO_{4} 10 mM al 10% que contenía CH_{3}OH al 10% a NH_{4}K_{2}PO_{4} 125 mM que contenía CH_{3}OH al 10% en 15 min, pH 5,5, caudal de 1 ml/min, detección: 254 nM) R_{t} 9,8; MS/ESI 492,0 [M - H]. 10-S: UV (H_{2}O) \lambda_{máx} 252, \lambda_{máx} 265; HPLC (columna: 4,6 x 100 mm, Rainin Hydropore SAX, gradiente: de NH_{4}K_{2}PO_{4} 10 mM al 10%, CH_{3}OH al 10% a NH_{4}K_{2}PO_{4} 125 mM, CH_{3}OH al 10% en 15 min, pH 5,5; caudal de 1 ml/min, detección: 254 nm) R_{t} 9,0; MS/ESI 492,0 [M - H].

Claims

1. Uso de un bioprecursor del enantiómero (R) del trifosfato del compuesto de fórmula

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es decir, (R)-PCV-TP, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH-1 o VHB,

donde el bioprecursor es un derivado de (R)-PCV-monofosfato que libera (R)-PCV- monofosfato intracelularmente, que a su vez se convierte en (R)-PCV-TP.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el derivado se selecciona entre

- un conjugado de (R)-PCV-monofosfato acoplado a PL-ASOR, de fórmula

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donde el conjugado puede tener múltiples restos de (R)-PCV-monofosfato por molécula de proteína;

- el derivado de fosfolípido de fórmula

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- el derivado de (R)-MP-bis(POM) de fórmula

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- y el derivado de (R)-MP-difenil éster de fórmula

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3. Uso de un bioprecursor del enantiómero (R) del trifosfato del compuesto de fórmula (A)

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es decir, (R)-PCV-TP, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH-1 o infecciones por VHB,

donde el bioprecursor es un derivado de difosfato de dimiristoilglicerol de fórmula

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que libera (R)-PCV-monofosfato intracelularmente, que a su vez se convierte en (R)-PCV-TP.

4. Un conjugado de (R)-PCV-monofosfato acoplado a PL-ASOR, de fórmula

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donde el conjugado puede tener múltiples restos de (R)-PCV-monofosfato por molécula de proteína.

5. El derivado de fosfolípido de fórmula

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6. El derivado de (R)-MP-bis(POM) de fórmula

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7. El derivado de (R)-MP-difenil éster de fórmula

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8. El derivado de difosfato de dimiristoilglicerol de fórmula

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