ES2203703T3 - Vacunas peptidicas de proteina de fusion a oncogenes. - Google Patents

Abstract

LOS PEPTIDOS QUE SOBREPASAN EL PUNTO DE FUSION, POR EJEMPLO LO PEPTIDOS BCR - ABL ASOCIADOS A LA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA (LMC), SE UNEN A LAS PRINCIPALES MOLECULAS DEL COMPLEJO DE HISTOCOMPATIBILIDAD, COMO LAS MOLECULAS DE CLASE I DEL HLA, E INDUCEN LA PROLIFERACION DE CELULAS T CITOTOXICAS. ESTOS PEPTIDOS PUEDEN UTILIZARSE COMO VACUNAS

Description

Vacunas peptídicas de proteína de fusión a oncogenes.

A lo largo de este documento, se usan las siguientes abreviaturas convencionales para referirse a aminoácidos y a restos aminoacídicos:

A	Ala Alanina	M	Met Metionina
C	Cys Cisteína	N	Asn Asparagina
D	Asp Ácido aspártico	P	Pro Prolina
E	Glu Ácido glutámico	Q	Gln Glutamina
F	Phe Fenilalanina	R	Arg Arginina
G	Gly Glicina	S	Ser Serina
H	His Histidina	T	Thr Treonina
I	Ile Isoleucina	V	Val Valina
K	Lys Lisina	W	Trp Triptófano
L	Leu Leucina	Y	Tyr Tirosina

Antecedentes de la invención

La mayoría de las leucemias humanas están asociadas a anormalidades cromosómicas producidas por mutaciones o traslocaciones genéticas que pueden crear nuevos genes híbridos capaces de expresar proteínas mutadas o fusionadas. Las proteínas de fusión anormales codificadas se caracterizan por un segmento de región de unión compuesto por una única secuencia de aminoácidos que es potencialmente inmunogénica.

En la leucemia mielocítica crónica (CML), la traslocación de t(9;22) da como resultado un gen quimérico bcr-abl que codifica una proteína de fusión de 210 kD. En células CML, pueden expresarse alternativamente dos proteínas quiméricas P210 bcr-abl que comprenden productos de la unión del exón b2a2 o de la unión del exón b3a2. Las secuencias de unión representan determinantes específicos de tumor únicos, no sólo porque contienen un conjunto agregado de secuencias de aminoácidos que normalmente no se expresan en la misma proteína, sino también porque en el punto de fusión exacto está presente un codón para un aminoácido nuevo (1,2).

De forma similar, en células de leucemia promielocítica aguda (APL) está presente una traslocación cromosómica específica que produce una proteína de 90-110 kD en la que el producto del tercer exón del gen RAR, localizado en el cromosoma 17, está fusionado a la porción amino terminal de una proteína con estructura de dedo de Zn, la PML del cromosoma 15. Otros puntos de escisión alternativos producen PML-RAR A y PML-RAR B, que se observan en el 90% de la células de pacientes con APL (3,4). Como ocurre con la CML, ambas proteínas de la APL contienen un epítopo único que consta del sitio de fusión además de un aminoácido nuevo.

Se ha demostrado que los linfocitos T humanos reconocen antígenos asociados a tumores en el caso de los antígenos de melanomas humanos (5,6), así como en el caso de una sola mutación puntual en ras, ocasionando un cambio en un solo aminoácido (7). Se han generado respuestas de linfocitos T CD4 humanos específicos in vitro contra la proteína de fusión PML-RAR hallada en células APL (8), e in vivo, contra idiotipos de inmunoglobulina de linfoma linfocítico B (9).

Los pares de proteínas encontrados en la CML y APL representan algunas de las dianas más obvias para una estrategia inmunológica para el tratamiento de estas leucemias y sirven como modelo para esta estrategia en otros neoplasmas. Aunque las proteínas bcr-abl y PML-RAR están localizadas intracelularmente, los productos de degradación enzimática de estas proteínas de fusión podrían presentarse en la superficie celular en forma de péptidos cortos, de 8 a 25 aminoácidos de longitud, dentro de las hendiduras de moléculas de HLA, y pueden ser potencialmente reconocidos por los linfocitos T. Estos péptidos se obtienen por procesamiento intracelular de proteínas exógenas y endógenas como parte de la ruta de presentación de antígenos (10). El péptido abl-bcr que incluye el punto de fusión está codificado por la cadena antisentido del gen que codifica bcr-abl. (J. Diamond, et al., Blood 85(8): 2171-2175 (1995)). El péptido RARa-PML que incluye el punto de fusión está codificado por la cadena antisentido del gen que codifica PML-RARa (M. Lafage-Pochitaloff, et al., Blood 85(5):1169-1174 (1995)).

Los motivos aminoacídicos responsables de la unión de péptidos específicos a las moléculas de HLA de clase I se han determinado para los tipos de HLA de clase I comunes por medio del uso del análisis de péptidos procesados de forma natural eluidos con ácido y por medio del uso de líneas celulares defectuosas en la carga y procesamiento de péptidos intracelulares (11-13). Más recientemente, Sette et al. (14) han desarrollado un ensayo de radiounión molecular cuantitativo para el análisis de la unión peptídica a moléculas de HLA de clase I purificadas.

Para desarrollar una estrategia de vacuna para APL y CML, las dos primeras cuestiones importantes son si las proteínas de fusión oncogénicas contienen secuencias de aminoácidos adecuadas y motivos de anclaje apropiados para unirse a las moléculas de clase I y si estos péptidos de punto de escisión pueden unirse con una afinidad suficientemente alta a la hendidura de las moléculas de HLA de clase I; esta actividad es necesaria para inducir una respuesta de linfocitos T específicos de la leucemia. En el presente documento se analiza la capacidad de una serie de péptidos sintéticos que corresponden a las secuencias de unión de bcr-abl y de las proteínas PML-RAR para unirse a moléculas de clase I humanas purificadas. El fundamento de esta estrategia era doble: 1) Los péptidos que incluyen el punto de escisión que son capaces de unirse a las moléculas de clase I podrían ser candidatos a antígeno potenciales para una inmunoterapia activa contra estas leucemias. 2) La evidencia de que no se presentan secuencias de punto de escisión específicas únicas en el contexto de las moléculas de HLA proporcionaría una base molecular para la falta de respuesta inmune a las proteínas de fusión intracelulares anormales existentes en las células leucémicas.

Cullis et al. (Leukemia (1994) 8:165-170), ensayaron 18 péptidos que incluían las secuencias de unión de las proteínas b2a2 y b3a2 para determinar su capacidad de rescatar la expresión de los alelos de clase I en dos líneas celulares humanas LBL 721.174 (T2) (HLA A2, B5) y BM 36.1 (HLA 1A, B35). Estas células son defectuosas en la carga de péptidos intracelulares de moléculas de clase I. Ninguno de los péptidos bcr-abl mejoró la expresión de los alelos de HLA A2 o HLA B35 en comparación con los péptidos de control específicos de los alelos. Los autores concluyeron que ninguno de los péptidos de CML satisface los motivos de unión a péptidos conocidos para estos alelos.

Gambacorti-Passerini, et al. no pudieron demostrar la generación de una respuesta restringida de CD8/HLA de clase I a los péptidos de fusión con puntos de escisión en la leucemia promielocítica aguda (APL). (Blood (1994) 84 (Suppl): p.618a, Abstract 2459).

Chen, et al. informaron que la inmunización de ratones con péptidos sintéticos que correspondían a la región de unión de BCR-ABL inducían linfocitos T restringidos por el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II, CD4+ específicos de péptido (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 1468-1472). Al ser proteínas humanas, tanto BCR como ABL son proteínas exógenas para los ratones. La inmunogenicidad de un péptido exógeno, incluso un péptido de punto de escisión exógeno, no esclarece directamente si los péptidos que incluyen la región de unión de dos proteínas nativas pueden estimular una respuesta inmunogénica.

Los datos presentados en el presente documento representan la primera vez que se ha demostrado que los péptidos de punto de escisión son capaces de unirse a moléculas de HLA de clase I. Además, tales péptidos de punto de escisión estimulaban la proliferación de linfocitos T citotóxicos humanos, lo que demostraba una capacidad de destruir las células que presentaban el péptido de punto escisión en la grieta de la molécula de HLA adecuada.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad y de inducir una respuesta inmune en un sujeto, y el uso de dicho péptido para la preparación de una composición farmacéutica para inducir la formación y la proliferación de linfocitos T citotóxicos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas.

El péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse específicamente a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano puede identificarse por un método que comprende: poner en contacto o incubar el péptido que incluye el punto de fusión con la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad y un péptido estándar marcado que se une a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad; y

detectar (determinar) la inhibición de la unión del péptido estándar a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad, identificando de esta manera el péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse específicamente a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad.

Además, un péptido que incluye el punto de fusión inmunogénico para las células inmunes humanas, puede identificarse por un método que comprende: poner en contacto o incubar el péptido que incluye el punto de fusión identificado con una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad y un péptido estándar marcado que se une a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad; y detectar (determinar) que el péptido que incluye el punto de fusión tiene una afinidad de unión por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad tal que la concentración que inhibe la unión del péptido estándar al la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad en un cincuenta por ciento es aproximadamente quinientos nanomolar o menor, identificando así un péptido que incluye el punto de fusión que es inmunogénico para las células inmunes humanas.

Descripción de las figuras

Figura 1A

Las secuencias de aminoácidos que rodean el punto de escisión de la proteína de fusión oncogénica CML b3a2. El aminoácido único de la unión se muestra en negrita. Todas las secuencias de 11 aminoácidos posibles se ilustran debajo de la secuencia de 21 aminoácidos, a modo de ejemplo.

Figura 1B

Las secuencias de aminoácidos que rodean el punto de escisión de la proteína de fusión oncogénica b2a2 de CML. El aminoácido único de la unión se muestra en negrita.

Figura 1C

Las secuencias de aminoácidos que rodean el punto de escisión de la proteína de fusión oncogénica PML-RARa A. El aminoácido único de la unión se muestra en negrita.

Figura 1D

Las secuencias de aminoácidos que rodean el punto de escisión de la proteína de fusión oncogénica PML-RARa B. El aminoácido único de la unión se muestra en negrita.

Figura 2 Proliferación específica de linfocitos T humanos en respuesta a la estimulación con el péptido b3a2-CML

Se estimularon Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) procedentes de un donante sano como se ha descrito previamente (E. Celis, et al., "Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 2105-2109) con un péptido derivado de b3a2-CML, de 25 aminoácidos de longitud. Después de dos series de estimulaciones (día 0 y día 12, usando PBMC autólogas sometidos a pulsos de b3a2-CML irradiados (barras negras) o fijados en paraformaldehído (barras grises) como fuente de células presentadoras de antígeno, se incubaron los linfocitos T (día 19, proporción 1:1) con PBMC antólogas en 3 condiciones: 1) sin pulsos, 2) con pulsos del péptido b3a2-CML o 3) con pulsos de un péptido control (CDR2), de 17 aminoácidos de longitud como se muestra en la figura. Después de 72 horas de cultivo, se midió la proliferación específica por medio de la incorporación de ^{3}H-timidina. Los datos muestran la proliferación específica de células T incubadas con PBMC autólogas sometidas a pulsos de péptido b3a2-CML como células presentadoras de antígeno. No se observó proliferación cuando no se añadió péptido a las APC ni cuando las APC se sometieron a pulsos del péptido de control.

Figura 3 Linfocitos T específicos de cml-b3a2: citotoxicidad contra dianas sometidas a pulsos de b3a2

Se estimularon Células Mononucleares de Sangre Periférica de un donante con HLA A3 como se ha descrito previamente (E. Celis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 2105-2109) con péptido b3a2-CML o con un péptido control derivado de VIH. Previamente se había demostrado que este péptido de control se une a moléculas de HLA A3 de clase I y que induce linfocitos T citotóxicos específicos de péptido en ensayos in vitro. En resumen, después de dos series de estimulaciones (día 0 y día 12) con péptidos, se incubaron las células (día 19 durante cuatro horas) con células transformadas con EBV autólogas marcadas con ^{51}Cr previamente sometidas a pulsos de b3a2-CML o de péptido de control VIH-A3. Se determinó el porcentaje de citotoxicidad específica calculando el porcentaje de liberación específica de ^{51}Cr: [(cpm de la muestra de ensayo - cpm de la liberación espontánea de ^{51}Cr) / (cpm de la liberación máxima de ^{51}Cr - cpm de la liberación espontánea de ^{51}Cr)] x 100. La liberación espontánea de ^{51}Cr se determinó incubando las dianas solas, en ausencia de los efectores, y la liberación máxima de ^{51}Cr se obtuvo incubando las dianas con SDS al 2%. Los datos muestran la destrucción específica porcentual de dianas sometidas a pulsos del péptido b3a2-CML (barras negras) o de péptido de control (barras grises) por las células efectoras previamente estimuladas con b3a2-CML o con péptido de control a dos proporciones E:T diferentes.

Figura 4 Secuencias de péptidos CML y de control Figura 5 Tipos de HLA de los donantes estudiados

Figuras 6A-C

Citotoxicidad específica de péptido de linfocitos T de donantes con HLA-A3 contra células RWLEU4 de CML con el mismo HLA cargadas de péptido

Las células de los donantes se estimularon con péptidos CML-A3 y CML-A3/A11 y se dejó que lisaran células RWLEU4 cargadas de péptido durante 6 horas en un ensayo de liberación de ^{51}Cr como se describe en Materiales y Métodos. Se muestra la media \pm SD (desviación típica) para cada grupo de células diana. El péptido cargado en células diana se especifica en la leyenda del donante 3 (Fig. 6A). Los péptidos cargados de los donantes 7 (Fig. 6B) y 4 (Fig. 6C) se muestran en el eje X.

Figuras 7A-B

Citotoxicidad específica de péptido de linfocitos T de los donantes con HLA-A3, A2 contra dianas cargadas de péptido

(Fig. 7A): Se estimularon células de los donantes con péptidos CML-A3 y CML-A3/A11 y se dejó que lisaran células RWLEU4 cargadas de péptido durante 6 horas en un ensayo de liberación de ^{51}Cr como se describe en Materiales y Métodos.

(Fig. 7B): Se estimularon células de los donantes con péptido FLU-A2 y se dejó que lisaran PBMC autólogas cargadas de péptido en un ensayo de liberación de ^{51}Cr como se ha descrito. Se muestra la media \pm SD para cada grupo de células diana. Los péptidos cargados se muestran en el eje x.

Figura 8 Lisis específica de péptido A3/A11 de CML contra PMBC sometidas a pulsos de péptido

Figuras 9A-C

Proliferación de linfocitos T específicos de péptido b3a2-25 de CML en tres donantes con HLA-DR 11

Se estimularon linfocitos T de donantes con el péptido b3a2-25 y se añadieron a APC autólogas irradiadas cargadas de péptido durante un ensayo de incorporación de 3H-timidina de 72 horas como se describe en Materiales y Métodos para la segunda serie de experimentos. Se muestra la media \pm SD para cada grupo de linfocitos T. Para los donantes 1 y 7 (Figs. 9A y B, respectivamente), los péptidos cargados en APC se muestran en el eje x; la proporción entre las células que respondieron y APC (T:APC) se especifica en la leyenda. En el donante 2 (Figura 9C), las proporciones entre las células que respondieron y APC se muestran en el eje x; la proliferación específica se expresa como un índice de estimulación [SI = cpm (Medias) De Cada Grupo/cpm (Medias) De APC Sin Péptido Añadido]; el péptido cargado en las APC se especifica en la leyenda.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona una composición que comprende un péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse específicamente a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad, que puede identificarse por un método que comprende: poner en contacto o incubar el péptido que incluye el punto de fusión con la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad y un péptido estándar marcado que se une a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad; y determinar la inhibición de la unión del péptido estándar a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad, identificándose de esta manera el péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse específicamente a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad.

En una realización de este método, el péptido que incluye el punto de fusión es un péptido que incluye el punto de fusión oncogénico asociado a un cáncer. Las traducciones son comunes en muchos cánceres, por ejemplo en la leucemia (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica, leucemia promielocítica aguda y leucemia de linaje mixto) cáncer hematopoyético, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, neoplasmas linfoideos, linfoma, enfermedad linfoproliferativa y un tumor. Se conocen otros cánceres en la técnica. Véase, por ejemplo, Jeffrey Cossman, Molecular Genetics in Cancer Diagnosis (Elsevier, 1990, Nueva York), y F. Mitelman, Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer (Liss, Nueva York, 1988). También se producen translocaciones en otras afecciones, por ejemplo se producen translocaciones c-myc en el linfoma de Burkitt, y en asociación con el SIDA. En una realización preferida, el péptido se asocia a la leucemia mielocítica crónica (CML). Los péptidos asociados a la CML incluyen bcr-abl y abl-bcr. Por consiguiente, los péptidos comprendidos por las composiciones de la presente invención son de diversas longitudes que incluyen el punto de fusión de las proteínas bcr-abl y las proteínas abl-bcr. En otra realización, el péptido está asociado a la leucemia promielocítica aguda. Los péptidos asociados a la leucemia promielocítica aguda incluyen PML-RAR y RAR-PML. Por consiguiente, los péptidos comprendidos en las composiciones de la presente invención son de diversas longitudes que incluyen el punto de fusión de los péptidos PML-RAR (incluyendo PML-RARa) y RAR-PML (incluyendo RARa-PML).

El péptido que incluye el punto de fusión comprendido por la composición de la invención se selecciona entre el grupo compuesto por: ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30); KQSSKALQR (SEC ID NO: 32); y HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2).

En una realización, la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad es una molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II. Los ejemplos específicos de moléculas de HLA de clase I para uso en esta invención incluyen, pero sin limitación, HLA A1, HLA A2.1, HLA A3.2, HLA A11, HLA A24, HLA B7, HLA B8 y HLA B27. Se prefiere que la molécula de HLA de clase I se seleccione entre el grupo compuesto por: HLA A3.2, HAL A11 y HLA B8. En una realización, el péptido que incluye el punto de fusión tiene un motivo de unión para la molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II.

En una realización de este método, el péptido estándar se marca con un marcador radiactivo. Muchos marcadores radiactivos adecuados son conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo yodo-125.

En una realización, la concentración del péptido que incluye el punto de fusión que inhibe la unión del péptido estándar en un cincuenta por ciento es aproximadamente quinientos nanomolar o menor. La "afinidad" o "afinidad de unión" del péptido que incluye el punto de fusión se define como la IC_{50} necesaria para inhibir la unión del péptido estándar para cada molécula del MHC. En una realización más específica, la concentración inhibidora es aproximadamente cien nanomolar o menor. En otra realización, la concentración inhibidora es, al menos, aproximadamente cinco nanomolar. Por lo tanto, esta invención proporciona también el método descrito anteriormente en el que la concentración inhibidora (afinidad) está comprendida entre aproximadamente cinco nanomolar y aproximadamente quinientos nanomolar.

Además de su uso en vacunas y otros usos terapéuticos in vivo y ex vivo, los péptidos que incluyen el punto de fusión de esta invención pueden usarse para detectar la presencia de la molécula del MHC apropiada en una muestra, y para cuantificar la cantidad de la molécula del MHC. Del mismo modo, los péptidos de unión al MHC de esta invención pueden usarse en experimentos de unión competitiva para identificar otros péptidos con afinidad de unión por moléculas del MHC, de forma muy similar a cómo se usaron los "péptidos estándar" en el Ejemplo 1 para identificar la afinidad de unión de los péptidos de punto de escisión descritos en el presente documento.

El péptido que incluye el punto de fusión inmunogénico para las células inmunes, puede identificarse por un método que comprende: poner en contacto o incubar el péptido que incluye el punto de fusión con una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad y un péptido estándar marcado que se une a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad; y detectar (determinar) que el péptido que incluye el punto de fusión tiene una afinidad de unión por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad tal que la concentración que inhibe la unión del péptido estándar a la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad en un cincuenta por ciento es aproximadamente quinientos nanomolar o menor, identificándose de esta manera un péptido que incluye el punto de fusión inmunogénico para las células inmunes. Preferiblemente las células inmunes son células inmunes humanas, por ejemplo linfocitos T humanos.

En una realización adicional del método para identificar un péptido que incluye el punto de fusión inmunogénico para las células inmunes comprende incubar el péptido que incluye el punto de fusión con una afinidad de quinientos nanomolar o menor con las células inmunes humanas; y observar la inducción de las células inmunes humanas. Esta etapa puede realizarse en cualquier punto del método descrito anteriormente. De forma alternativa, la incubación del péptido que incluye el punto de fusión con una afinidad de quinientos nanomolar o menor con las células inmunes humanas; y la observación de la inducción de las células inmunes humanas es en sí mismo un método completo para identificar un péptido que incluye el punto de fusión inmunogénico para las células inmunes.

En una realización, las células inmunes humanas son linfocitos T y la inducción es la inducción de los linfocitos T citotóxicos. En una realización, el péptido que incluye el punto de fusión es un péptido que incluye el punto de fusión oncogénico asociado a un cáncer. Por ejemplo, el péptido puede estar asociado a una leucemia, a un cáncer hematopoyético, y a un tumor, así como a otros cánceres conocidos por los especialistas en la técnica. En una realización preferida, la leucemia es leucemia mielocítica crónica.

El péptido que incluye el punto de fusión comprendido por la composición de la invención se selecciona entre los grupos compuestos por: ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30); KQSSKALQR (SEC ID NO: 32); y HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2).

En una realización, la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad es una molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II. Los ejemplos específicos de moléculas de HLA de clase I para uso en esta invención incluyen, pero sin limitación, HLA A1, HLA A2.1, HLA A3.2, HLA A11, HLA A24, HLA B7, HLA B8 y HLA B27. Se prefiere que la molécula de HLA de clase I se seleccione entre el grupo compuesto por: HLA A3.2, HAL A11, y HLA B8. Las moléculas de HLA de clase II adecuadas incluyen, pero sin limitación, una molécula de HLA DR, por ejemplo, HLA DR11. En una realización, el péptido que incluye el punto de fusión tiene un motivo de unión para la molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II.

En una realización de este método, el péptido estándar se marca con un marcador radiactivo. Muchos marcadores radiactivos adecuados son conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo yodo-125.

En una realización preferida, la concentración inhibidora, o afinidad de unión, es aproximadamente quinientos nanomolar o menor. En una realización, la concentración inhibidora está comprendida entre aproximadamente cinco nanomolar y aproximadamente quinientos nanomolar.

Esta invención proporciona un método para la inducción de linfocitos T citotóxicos humanos, que comprende poner en contacto un linfocito T humano con un péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse específicamente a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad. En una realización, el linfocito T humano es CD8+, CD4+, o tanto CD8+ como CD4+.

En una realización de este método, el péptido que incluye el punto de fusión es un péptido que incluye el punto de fusión asociado a un cáncer, por ejemplo a una leucemia, a un cáncer hematopoyético y a un tumor. En una realización preferida, el péptido está asociado a la leucemia mielocítica crónica.

El péptido que incluye el punto de fusión comprendido por la composición de esta invención se selecciona entre el grupo compuesto por: ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30); KQSSKALQR (SEC ID NO: 32); y HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2).

En una realización, la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad es una molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II. Los ejemplos específicos de moléculas de HLA de clase I para uso en esta invención incluyen, pero sin limitación, HLA A1, HLA A2.1, HLA A3.2, HLA A11, HLA A24, HLA B7, HLA B8 y HLA B27. Se prefiere que la molécula de HLA de clase I se seleccione entre el grupo compuesto por: HLA A3.2, HAL A11, y HLA B8. Las moléculas de HLA de clase II adecuadas incluyen, pero sin limitación, una molécula HLA DR, por ejemplo, HLA DR11. En una realización, el péptido que incluye el punto de fusión tiene un motivo de unión para la molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II.

En una realización de este método, el péptido estándar se marca con un marcador radiactivo. Muchos marcadores radiactivos adecuados son conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo yodo-125.

En una realización, la concentración del péptido que incluye el punto de fusión que inhibe la unión del péptido estándar en un cincuenta por ciento es aproximadamente quinientos nanomolar o menor. La "afinidad" o "afinidad de unión" del péptido que incluye el punto de fusión se define como la IC_{50} necesaria para inhibir la unión del péptido estándar para cada molécula del MHC. En una realización más específica, la concentración inhibidora es aproximadamente cien nanomolar o menor. En una realización, la concentración inhibidora está comprendida entre aproximadamente cinco nanomolar y aproximadamente quinientos nanomolar.

Pueden usarse péptidos de punto de escisión antigénicos para inducir CTL ex vivo. Los CTL resultantes pueden usarse para tratar la afección asociada a una proteína de fusión, tal como infecciones crónicas (virales o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas de terapia convencionales, o que no responden a una terapia con una estrategia de vacuna peptídica. Las respuestas de los CTL ex vivo a un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno tumoral) se inducen incubando las células precursoras de CTL del paciente (CTLp) en un cultivo tisular junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente de 1 a 4 semanas) en el que se activan las CTLp, maduran y se transforman en CTL efectores, los linfocitos se introducen de nuevo por infusión en el paciente, donde destruirán su célula diana específica (típicamente una célula infectada o una célula tumoral).

Esta infección proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido que incluye el punto de fusión capaz de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad e inducir una respuesta inmune en un sujeto.

En una realización de este método, el péptido que incluye el punto de fusión es un péptido que incluye el punto de fusión oncogénico asociado a un cáncer, por ejemplo a una leucemia, a un cáncer hematopoyético, y a un tumor. En una realización preferida, el péptido está asociado a la leucemia mielocítica crónica.

El péptido que incluye el punto de fusión comprendido por la composición de la invención se selecciona entre los grupos compuestos por: ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30); KQSSKALQR (SEC ID NO: 32); y HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2).

En una realización, la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad es una molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II. Los ejemplos específicos de moléculas de HLA de clase I para uso en esta invención incluyen, pero sin limitación, HLA A1, HLA A2.1, HLA A3.2, HLA A11, HLA A24, HLA B7, HLA B8 y HLA B27. Se prefiere que la molécula de HLA de clase I se seleccione entre el grupo compuesto por: HLA A3.2, HLA A11 y HLA B8. Las moléculas de HLA de clase II adecuadas incluyen, pero sin limitación, una molécula HLA DR, por ejemplo HLA DR11. En una realización, el péptido que incluye el punto de fusión tiene un motivo de unión para la molécula de HLA de clase I o de HLA de clase II.

En una realización, la composición farmacéutica comprende además un vehículo, un adyuvante, o ambos, farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, el adyuvante es QS21.

La composición farmacéutica puede formularse para su administración por cualquiera de las muchas técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, esta invención proporciona la administración de la composición farmacéutica por vía parenteral, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramucosa, tópica, oral, o por inhalación.

La composición farmacéutica puede usarse en un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición farmacéutica. En realizaciones específicas, la respuesta inmune es una respuesta inmune de CD8/HLA de clase I o una respuesta inmune de CD4/HLA de clase II. En una realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, caballo, vaca, oveja, cabra, cerdo, gato, perro, mono, simio o humano. Preferiblemente el sujeto es un ser humano.

La composición farmacéutica puede usarse en un método para inmunizar a un sujeto contra una afección asociada a una proteína de fusión, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica. En una realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, caballo, vaca, oveja, cabra, gato, cerdo, perro, mono, simio o humano. Preferiblemente el sujeto es un ser humano.

Como se usan en el presente documento, "inmunizar" e "inmunización" engloban tanto la inmunización total como la parcial. Por consiguiente, en una realización de este método, el sujeto se vuelve parcialmente inmune a la afección. En otra realización, el sujeto se vuelve totalmente inmune a la afección.

Una vacuna puede construirse por medio de la combinación del péptido con un adyuvante adecuado (Allison, et al., "Adjuvant formulations and their mode of action" Semin. Immun. (1990) 2:369). Los adyuvantes, tales como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, BCG o alumbre son materiales bien conocidos en la técnica. Es probable que sean necesarias inyecciones múltiples (de 2 a 10) para conseguir una respuesta adecuada.

En una realización, la afección es un cáncer, por ejemplo leucemia, cáncer hematopoyético, y un tumor. En una realización preferida, el sujeto se inmuniza contra la leucemia mielocítica crónica.

El método de inmunización al que se hace referencia en el presente documento puede realizarse en un sujeto que no ha desarrollado la afección. En tal caso, el sujeto es preferiblemente alguien que tiene riesgo de desarrollar la enfermedad. Puede realizarse una determinación del riesgo basándose en la historia familiar, investigación genética, factores de riesgo conductuales, factores de riesgo ambientales, y otras consideraciones relevantes conocidas por los especialistas en la técnica. Como alternativa, el método de inmunización puede realizarse en un sujeto que tiene la afección y en el que la afección es activa, o en uno en el que la afección está remitiendo.

El péptido puede administrarse al sujeto asociado a su propio vehículo o como un homopolímero o heteropolímero de unidades peptídicas activas. Tal polímero tiene la ventaja de una mayor reacción inmunológica y, cuando se usan péptidos diferentes para formar el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de la afección, por ejemplo, el virus o células tumorales. Los vehículos útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli(lisina:ácido glutámico), influenza, proteína nuclear del virus de la hepatitis B, vacuna recombinante del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener también un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, solución salina tamponada con fosfato, o solución salina, y típicamente incluyen además un adyuvante. Y las respuestas de los CTL pueden cebarse conjugando los péptidos de la invención con lípidos, tales como P_{3}CSS. Tras la inmunización con una composición peptídica como la descrita en el presente documento, mediante inyección, aerosol, por vía oral, transdérmica u otra vía, el sistema inmune del hospedador responde a la vacuna produciendo una gran cantidad de CTL específicos para el antígeno deseado, y el hospedador se vuelve al menos parcialmente inmune a una infección posterior, o resistente a desarrollar una infección crónica.

Las cantidades precisas dependen del estado de salud y peso del paciente, del modo de administración, de la naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente varían de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 5000 \mug para un paciente de 70 kilogramos, más comúnmente de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 500 \mug por 70 kg de peso corporal.

Una estrategia alternativa disponible para la vacunación incluye la introducción de la secuencia genética que codifica los péptidos en un vector apropiado (Tindle, R.W. et al., Virology, (1994) 200:54) o como un ADN desnudo (Nabel, et al., PNAS-USA (1990) 90:11307) administrado por medio de una pistola génica, para inducir una respuesta, y el uso de un vehículo. Por ejemplo, los péptidos de esta invención pueden expresarse por hospedadores virales atenuados, tales como vaccinia o el virus de la difteria aviar. Esta estrategia implica el uso del virus de vaccinia como vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican los péptidos de la invención. Tras la introducción en un hospedador infectado de forma aguda o crónica o en un hospedador no infectado, el virus de vaccinia recombinante expresa el péptido que incluye el punto de fusión inmunogénico, y de esta manera induce una respuesta de los CTL del hospedador. Se describen vectores de vaccinia y métodos útiles en los protocolos de inmunización, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 4.722.848. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin). Se describen vectores BCG en Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Para los especialistas en la técnica será obvia una amplia diversidad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores Salmonella typhi y similares, a partir de la descripción en el presente documento.

Esta invención se entenderá mejor a partir de los Detalles Experimentales que se indican a continuación. Sin embargo, un especialista en la técnica entenderá fácilmente que los métodos y resultados específicos expuestos en este documento son meramente ilustrativos de la invención como se describe con más detalle en las reivindicaciones que siguen a continuación.

Detalles Experimentales

Primera serie de experimentos (Ejemplos 1 a 4)

Ejemplo 1 Unión específica de péptidos de proteínas de fusión oncogénicos de leucemia a moléculas de HLA de clase I Materiales y métodos

Péptidos. Se sintetizó una serie de péptidos de 8 a 11 aminoácidos de longitud, que incluyen las regiones de unión b3a2 y b2a2 de bcr-abl y el tipo A y B de PML-RAR basándose en las secuencias de aminoácidos publicadas (2,4) por Chiron/Mimotopes. Se sintetizaron péptidos estándar que se sabe que se unen de forma eficaz a HLA A1, A2.1, A3.2, A11, A24, B7, B8 y B27 y se marcaron con ^{125}I por Cytel, San Diego, CA como se describe (14, 15). Se estimó que la pureza del péptido era >90% mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Purificación de moléculas de HLA de clase I. La purificación de moléculas de HLA de clase I se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito recientemente por Sette et al. (14, 15). En resumen, después de la preparación de extractos lisados con detergente de líneas celulares EBV homocigotas para cada tipo de HLA usado en el estudio, se purificaron moléculas de HLA por cromatografía de afinidad. Las moléculas de HLA se concentraron y se determinó que su pureza era >90% mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Ensayo de unión a MHC. Se midió el péptido que se unía a moléculas de MHC de clase I como se describe (14, 15). En resumen, el ensayo se basa en la inhibición de la unión del péptido estándar radiomarcado descrito anteriormente a moléculas de MHC purificadas solubilizadas en detergente. En el ensayo de inhibición se usaron concentraciones de HLA (aproximadamente 10 nM) que producían un 15% de péptido estándar unido. Se incubó una dilución seriada de péptido que incluía el punto de escisión en la CML o en la APL (30 \muM a 1 nM) junto con 5 nM del péptido estándar radiomarcado y la molécula de HLA correspondiente apropiada. Después se determinó la radiactividad porcentual unida al MHC por exclusión molecular y se calculó la inhibición.

Resultados

Análisis de motivos de HLA de clase I. CML: Se analizó un total de 76 secuencias peptídicas posibles que incluían 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos de las regiones de unión b2a2 y b3a2 de las proteínas bcr-abl para determinar los motivos con potencial de unión a las moléculas de HLA-A de clase I más comunes (A1, A2.1, A3.2, A11, A24) y moléculas de HLA-B de las que se conocen los motivos de anclaje (B7, B8 y B27) (16-22). Estos tipos de HLA están entre los tipos predominantes expresados en la población de los Estados Unidos. Se muestran las secuencias de todos los péptidos de 11 aminoácidos de longitud que incluyen los puntos de escisión b3a2 (Figura 1A). Se incluyeron también en el análisis de unión a MHC las series de péptidos de 8, 9 y 10 aminoácidos de longitud. Se muestra también la secuencia del punto de escisión b2a2 (Fig., 1B). Basándose únicamente en sus secuencias, se predijo que 21 péptidos bcr-abl (10 para el punto de escisión b2a2 y 11 para el punto de escisión b3a2) de 8, 9 ó 10 aminoácidos de longitud tenían potencial de unión a una o más moléculas de clase I (Tabla 1).

(Tabla pasa a página siguiente)

1

APL. Se estudiaron también los 76 péptidos de longitudes apropiadas que incluían las regiones de fusión de PML-RAR A y B. Se muestran las secuencias que rodean los dos puntos de escisión (Fig. 1 C, D). Se analizaron los péptidos de 8, 9, 10 y 11 aminoácidos de longitud para determinar la presencia de motivos de anclaje específicos de HLA de clase I. Se consideraron potencialmente adecuados dos péptidos del punto de escisión PML-RAR A y 2 del punto de escisión PML-RAR B para la unión a la clase I basándose en la presencia de motivos específicos (Tabla 2).

TABLA 2 Afinidades de unión de péptidos de APL a moléculas de HLA de clase I

SEC ID NO	Fuente	Secuencia	Motivo de HLA	Afinidad (nM) A2.1
	PML-RAR\alphaA
34	1	HVASGAGEAAI	A2.1	--
35	2	VASGAGEAAI	A2.1	--
	PML-RAR\alphaB
36	1	DLSSCITQGKA	A2.1	--
37	2	CITQGKAI	A2.1	--
Un guión indica que el valor era mayor que 50 \muM.

Síntesis de péptidos y ensayo de unión a MHC. CML: Se sintetizaron los péptidos de CML con motivos apropiados y se ensayaron para determinar la unión a moléculas de HLA purificadas. Entre los 11 péptidos b3a2 seleccionados basándose en sus motivos de HLA, 6 mostraron afinidades de unión significativas tanto por HLA A3.2 como por A11 (Tabla 1). Estas dos moléculas de clase I tienen muchas semejanzas estructurales y comparten motivos de unión similares (19). El péptido ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28) se unía con gran afinidad (<100 nM para alcanzar una inhibición del 50%) a HLA A11 y con afinidad intermedia (100-500 nM necesarios para una inhibición del 50%) a HLA A3.2. Por el contrario, el péptido KQSSKALQR (SEC ID NO: 32) mostró una gran afinidad de unión a HLA A3.2 (43 nM para una inhibición del 50%) y tenía una afinidad intermedia por HLA A11 (273 nM). Se demostró que un tercer péptido HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2) se unía con afinidad intermedia tanto a A3.2 como a A11 (400 nM y 125 nM para una inhibición del 50% respectivamente). Los 3 péptidos restantes se unían a A3.2 o A11 mucho más débilmente (>500 nM a >6 \muM para lograr una inhibición del 50%). Además, dos péptidos b3a2 se unían a HLA B8 con afinidad intermedia (GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30), 190 nM) o baja.

Ninguno de los 10 péptidos que pertenecían al punto de escisión b2a2 mostraban afinidad de unión relativa alta o intermedia (afinidad >500 nM) por ninguna de las moléculas de HLA de clase I utilizadas en el ensayo de unión. Dos péptidos mostraron una afinidad baja por HLA A11 o B8, respectivamente.

APL. Se sintetizaron cuatro secuencias de APL que contenían motivos con potencial para la unión a HLA A2.1 y se ensayaron como se describe. Ninguno de estos péptidos demostró afinidad de unión apreciable para HLA A2.1 en los ensayos competitivos (>50 \muM para una inhibición del 50%) (Tabla 2).

Discusión

Entre los 76 péptidos posibles que incluían los puntos de escisión de las proteínas de fusión CML, había 21 secuencias peptídicas con motivos de enlace potencial a HLA; cuatro péptidos, todos derivados del punto de escisión b3a2 de bcr-abl, se unían con afinidad intermedia y alta a moléculas de HLA A3.2 A11 y B8 purificadas. Esta es la primera vez que se ha demostrado que los péptidos del punto de escisión derivados del oncogén de la leucemia son capaces de unirse a moléculas de HLA de clase I y que se proporciona un fundamento para una vacuna terapéutica.

Los péptidos derivados del punto de escisión bcr-abl y PML-RAR son un sistema modelo ideal para explorar la inmunoterapia específica activa del cáncer. Estos péptidos representan antígenos potenciales en virtud de la nueva secuencia de las regiones de unión. En segundo lugar, las secuencias se encuentran únicamente en las células que pertenecen al clon leucémico. Dado que ambas proteínas de fusión están implicadas en los sucesos leucémogénicos de estas leucemias respectivas, es improbable que existan células clonogénicas negativas para el antígeno; por lo tanto, no es probable el escape debido a la pérdida de la proteína (antígeno). Finalmente, no es probable que el desarrollo de una respuesta activa específica para el antígeno sea perjudicial, ya que la diana está únicamente en las células de leucemia.

Debido a su localización intracelular, estas proteínas de fusión pueden procesarse y presentarse en la superficie celular mediante la ruta de la molécula de HLA de clase I y de esta manera pueden ser accesibles a las células CD8 citotóxicas. La detección de estos péptidos para determinar los motivos de anclaje de HLA de clase I y su ensayo para determinar la unión de HLA eficaz representa una primera etapa necesaria en el análisis de su valor como antígenos potenciales. El Experimento 2 (presentado más adelante) ilustra la capacidad de péptidos que se unen a HLA de inducir células CD8 restringidas de clase I.

Los datos que se presentan en el Ejemplo 2 apoyan la hipótesis de que los péptidos que se unen a HLA con afinidad de moderada a alta son aquellos que son capaces de estimular los linfocitos T después del procesamiento natural y de la presentación en la superficie celular dentro de la grieta del HLA apropiado. La importancia de estos péptidos de afinidad de moderada a alta en la estimulación eficaz de los linfocitos T se apoya por pruebas adicionales: 1) Los péptidos procesados de forma natural que se encuentran en la superficie de células vivas unidos a moléculas de HLA típicamente tienen una afinidad en el intervalo descrito aquí para los péptidos CML (19). 2) Sólo los péptidos que se unen a HLA con afinidades en este intervalo fueron capaces de inducir una respuesta citotóxica en modelos in vitro e in vivo (24, 25). 3) Se observó que los péptidos de la proteína intracelular MAGE de melanoma identificados mediante los motivos descritos anteriormente se expresaban de forma natural en el contexto de las moléculas de HLA apropiadas (26).

Es de un interés considerable que no se encontraran antígenos peptídicos potenciales para APL o para el péptido de fusión b2a2 de CML. Esto sugiere fuertemente que las respuestas de CD8 específicas restringidas por los tipos de HLA estudiados son improbables en pacientes con APL o en los pacientes con CML y el punto de escisión b2a2. Sin embargo, Gambacorti-Passerini et al. (8) han demostrado que pueden generarse in vitro células CD4 citotóxicas para péptidos de fusión más largos derivados de APL. Por lo tanto, la inmunidad específica también debería ser posible mediante respuestas de clase II. Además, los resultados presentados aquí proporcionan una forma para identificar otros tipos de HLA A, B, y C de clase I que son capaces de presentar péptidos APL o CML específicos.

Ciertos estudios recientes realizados en pacientes con CML que han presentado recaídas después de un trasplante de médula ósea alogénico, han demostrado que la infusión de linfocitos T de donantes puede reinducir respuestas completas duraderas. Esta observación demuestra que puede darse una respuesta inmune a la CML (27).

Ejemplo 2 Proliferación específica de linfocitos T humanos en respuesta a la estimulación con un péptido b3a2-CML

Los linfocitos humanos reconocen inmunológicamente proteínas de punto de escisión y proliferan en respuesta. Se estimularon Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) de un donante sano de la forma descrita anteriormente (E. Celis, et al., "Induction of anti- tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 2105-2109) con un péptido derivado de b3a2-CML, de 25 aminoácidos de longitud IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEC ID NO: 34). Después de dos series de estimulaciones (día 0 y día 12, usando PBMC autólogas sometidas a pulsos de b3a2-CML irradiadas (barras negras) o fijadas en paraformaldehído (barras grises) como fuente de células presentadoras de antígeno, se incubaron los linfocitos T (día 19, proporción 1:1) con PBMC autólogas en 3 condiciones: 1) sin pulsos, 2) con pulsos del péptido b3a2-CML o 3) con pulsos de un péptido de control (CDR2), de 17 aminoácidos de longitud como se muestra en la figura. Después de 72 horas de cultivo, se midió la proliferación específica por la incorporación de 3H-timidina. Los datos demuestran proliferación específica de linfocitos T incubados con PBMC autólogas sometidas a pulsos de péptido b3a2-CML como células presentadoras de antígeno. No se observó proliferación cuando no se añadió péptido a las APC o cuando las APC se sometieron a pulsos con el péptido de control. (Véase la Figura 2).

Los péptidos que se unen a HLA con afinidad de moderada a alta son aquellos que son capaces de estimular los linfocitos T después del procesamiento natural y de la presentación en la superficie celular dentro de la grieta del HLA apropiado. La importancia de estos péptidos de afinidad de moderada a alta para la estimulación eficaz de linfocitos T se apoya por pruebas adicionales (15-23): (1) Los péptidos procesados de forma natural que se encuentran en la superficie de células vivas unidos a moléculas de HLA típicamente tienen una afinidad en el intervalo descrito aquí para los péptidos CML (19). (2) Sólo los péptidos que se unen a HLA con afinidades en este intervalo fueron capaces de inducir una respuesta citotóxica en modelos in vitro e in vivo. (3) Se observó que los péptidos de la proteína intracelular MAGE en el melanoma identificados mediante los motivos descritos anteriormente se expresaban de forma natural en el contexto de las moléculas de HLA apropiadas (26).

Ejemplo 3 Linfocitos T específicos de CML-B3a2: citotoxicidad contra dianas sometidas a pulsos de b3a2

Las células efectoras estimuladas por péptidos de punto de escisión descritas en el Ejemplo 3 destruyen las células diana que presentan el péptido de punto de escisión en la grieta de las moléculas de HLA.

Se estimularon Células Mononucleares de Sangre Periférica de un donante con HLA A3 como se describe anteriormente (E. Celis, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 2105-2109) con el péptido b3a2-CML KQSSKALQR (SEC ID NO: 32) o con un péptido de control derivado de VIH. Previamente se había demostrado que este péptido de control se une a moléculas de HLA A3 de clase I y que induce linfocitos T citotóxicos específicos de péptido en ensayos in vitro. En resumen, después de dos series de estimulaciones (día 0 y día 12) con péptidos, las células se incubaron (día 19 durante cuatro horas) con células EBV transformadas autólogas marcadas con ^{51}Cr previamente sometidas a pulsos de b3a2-CML o con el péptido de control VIH-A3. Se determinó la citotoxicidad específica porcentual calculando la liberación específica porcentual de ^{51}Cr: [(cpm de la muestra de ensayo - cpm de la liberación espontánea de ^{51}Cr) / (cpm de la liberación máxima de ^{51}Cr - cpm de la liberación espontánea de ^{51}Cr)] x 100. La liberación espontánea de ^{51}Cr se determinó incubando las dianas solas, en ausencia de los efectores, y la liberación máxima de ^{51}Cr se obtuvo incubando las dianas con SDS al 2%. Los datos muestran la destrucción específica porcentual de dianas sometidas a pulsos del péptido b3a2-CML (barras negras) o del péptido de control (barras grises) por las células efectoras previamente estimuladas con péptido b3a2-CML o de control a dos proporciones E:T diferentes. (Véase la Figura 3).

Ejemplo 4 Vacunación de pacientes con leucemia mielocítica crónica con péptidos de punto de escisión específicos de tumor Adyuvante

La razón más importante de la deficiente respuesta del hospedador contra la mayoría de los antígenos tumorales es que los antígenos tumorales son simplemente malos inmunógenos, primordialmente debido a que son autoantígenos y pueden ser tolerados inmunológicamente. Aunque la tolerancia inmunológica clásica resulta de la destrucción de linfocitos B y T autorreactivos durante las primeras fases del desarrollo, está claro que muchos linfocitos B y T capaces de reaccionar contra autoantígenos existentes en los tumores están presentes en los pacientes con melanoma, aunque rara vez inducen autoinmunidad. Los mecanismos descritos para explicar esto incluyen la presentación de antígeno ineficaz, anergia de linfocitos B y T periféricos e incapacidad de la célula tumoral de inducir una "segunda señal" necesaria para activar los linfocitos T de forma eficaz.

La inmunización contra los péptidos CML se realiza usando el adyuvante inmunológico QS-21. Se ha descrito que ciertas vacunas que contienen diversos antígenos proteicos más QS-21 inducen linfocitos T citotóxicos contra las células diana que expresan estos antígenos (24-27).

QS-21 es un adyuvante inmune diseñado para potenciar las respuestas inmunitarias. QS-21 es un carbohidrato extraído de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Se ha descrito la composición de monosacáridos, el peso molecular, el efecto adyuvante y la toxicidad de una serie de las saponinas. QS-21 se ha seleccionado debido a su adyuvancia y falta de toxicidad. Ha resultado ser seguro y relativamente no tóxico al nivel de dosificación propuesto y altamente eficaz para aumentar la inmunogenicidad de una vacuna de subunidad FeLV en gatos y de una vacuna recombinante de VIH-1 en macacos (25,26). También se ha informado que las vacunas que contienen diversas proteínas más QS-21 inducen linfocitos T citotóxicos contra dianas que expresan estos antígenos (26).

Agente terapéutico

Péptidos CML de Clase I: Los cuatro péptidos, de 9 y 11 aminoácidos de longitud, se han sintetizado por síntesis de fase sólida F-MOC y se han purificado por HPLC. Se ha evaluado su pureza mediante análisis de la secuencia de aminoácidos por espectrometría de masas. La secuencia se ha verificado por espectrometría de masas.

Péptidos CML de Clase II: Se ha sintetizado un único péptido, de 25 aminoácidos de longitud, por síntesis de fase sólida F-MOC y se ha purificado por HPLC. La pureza se ha evaluado mediante análisis de la secuencia de aminoácidos por espectrometría de masas. La secuencia se ha verificado por espectrometría de masas.

Las secuencias de aminoácidos son:
1.	ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28)
2.	KQSSKALQR (SEC ID NO: 32)
3.	HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2)
4.	GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30)
5.	IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEC ID NO: 34).

Preparación y ensayo de la vacuna

Se evalúa el contenido en endotoxina por ensayo limulus y se demuestra que es inferior a 0,3 U/ml. Se confirma la esterilidad IS por ausencia de crecimiento bacteriano en placas de agar. Los ensayos para micoplasmas son negativos. Además, se confirma la seguridad global en ratones y cobayas.

Preparación de la vacuna: 10 \mug, 30 \mug, 100 \mug, o 300 \mug de cada péptido (50, 150, 500, 1500 de péptido total) se mezclan con 100 \mug de QS-21 en 0,5 ml de PBS (solución salina tamponada con Fosfato, pH 7,4) y se introducen en viales. La vacuna se almacena congelada por debajo de -20ºC. El QS-21 es un producto de Cambridge Biotech Corporation, Worcester, MA, y se usa bajo IND.

Tratamiento TABLA 3

Semanas
	Antes	0	2	4	6	10	12
Tratamiento
Vacunaciones		X	X	X	X	X
Seguimiento Clínico
Examen Físico	X	X	limitado	limitado	limitado	limitado	limitado
Radiografía de tórax	X
Perfil de detección	X		X		X		X
Recuento sanguíneo completo/DIF	X	X	X	X	X	X	X
Aspiración de médula ósea	X						X
Citogenética	X						X*
Tipificación de HLA	X						X*
PCR para bcr/ab1	X
Ensayos de Investigación
Proliferación serológica		X			X		X
		X			X		X
Citotoxicidad		X			X		X
Hipersensibilidad retardada		X			X		X
* Las pruebas genéticas y PCR se realizan si el paciente presente remisión clínica

Tratamiento

Se administran cinco vacunas durante un periodo de 10 semanas. El primer grupo de pacientes recibe 50 \mug de péptido por dosis, los grupos posteriores reciben 150, 500 ó 1500 \mug de péptido por dosis, respectivamente. (Como hay cinco péptidos, la dosis total de cada péptido por inyección es 10 \mug en el primer nivel, y así sucesivamente.) Todas las vacunaciones se administran por vía subcutánea rotando los sitios entre las extremidades. No se aumentan las dosis dentro de cada grupo. Se observa a los pacientes durante 2 horas después de la vacunación. Dos semanas después de la última vacuna se reevalúa a los pacientes.

Esquema de aumento de la dosis

La toxicidad que limita la dosis (DLT) se define como cualquier toxicidad de grado 4. Si no se observan casos de DLT entre los tres pacientes iniciales con un nivel de dosificación, se aumenta la dosis para el grupo sucesivo de tres pacientes. Si se observa un caso de DLT entre los tres pacientes para un nivel de dosificación dado, se tratan 3 pacientes más a ese nivel. Si se observan 2 casos de DLT en cualquier nivel, se detiene el aumento de la dosis. La MTD se define como el nivel de dosificación más alto en el que no se observa más de un caso de DLT. Al final del estudio de aumento de dosis, pueden añadirse más pacientes con HLA-A3, -A11 o -B8 al nivel MTD (o al nivel máximo si no se alcanza la MTD) hasta que se haya evaluado un total de 14 pacientes con unos de estos tipos de HLA. No se acumulan pacientes sin estos tipos de HLA al final del estudio de aumento de la dosis. Si, en cualquier momento, el grupo de pacientes en este nivel muestra una incidencia de DLT superior al 30%, no se añaden más pacientes. De esta forma puede considerarse la seguridad de la vacuna, puede definirse mejor la MTD y puede evaluarse la posible actividad de la vacuna en los pacientes que tienen más probabilidad de respuesta. Con 4 dosis posibles, este esquema de aumento de la dosis implica un mínimo de 2 pacientes y un máximo de 36 pacientes. Basándose en el predominio de los tipos de HLA relevantes y la esperada falta de toxicidad, se prevé que se acumularán 25 pacientes en el estudio.

Riesgos

Son posibilidades teóricas reacciones autoinmunes o de hipersensibilidad a los componentes de la vacuna o a los antígenos de ensayo de piel. Se cree que la expresión de la secuencia peptídica completa está restringida únicamente a las células de leucemia. Por consiguiente, las reacciones autoinmunes se consideran improbables. La toxicidad esperada con esta dosis de QS-21 incluye inflamación local leve en los sitios de inyección y fiebre ocasional.

Criterios de toxicidad: La toxicidad se clasifica de acuerdo con los criterios comunes de toxicidad creados por el Instituto Nacional del Cáncer.

Evaluación de los pacientes

A las 2 semanas del estudio, a los pacientes se les practica una radiografía de tórax, un examen físico completo, un perfil de detección, recuento sanguíneo completo con diferencial, aspiraciones de médula ósea para determinar la morfología, y electrólitos. Antes de la admisión deben haberse obtenido la citogenética y PCR del tipo de punto de escisión bcr/abl y los resultados deben estar disponibles. En el momento de la primera vacunación se practica un recuento sanguíneo completo. Debe estar disponible la tipificación de HLA completa para HLA-A, -B, DR antes de la admisión durante la sección de fase II del ensayo.

Respuesta serológica. Se extrae sangre periférica (10 ml) inmediatamente antes de las vacunaciones primera y cuarta (6 semanas), y posteriormente 2 semanas después de la última vacunación (12 semanas). Se ensaya el suero de los pacientes por ELISA para determinar los anticuerpos contra péptidos CML y antígenos relacionados. Los pacientes con titulaciones que, como se demuestra por el ELISA, reaccionan específicamente con CML se consideran respondedores serológicos. Si la serología es positiva, puede extraerse una muestra de 10 ml 1, 3, y 6 meses después de la última vacunación.

Respuesta linfocítica. Se extrae sangre periférica (hasta 150 ml) antes del tratamiento y a las 6 y 12 semanas durante el tratamiento como se indica en la Tabla 3. Si se induce la reactividad de los linfocitos T, puede extraerse una muestra adicional a las 6-10 semanas después de la última vacunación para determinar la duración de esta reactividad. Se analizan los linfocitos de sangre periférica (PBL) para determinar la proliferación, citotoxicidad, y frecuencia del precursor.

Hipersensibilidad de tipo retardado (DHT). Se mide individualmente la DTH contra los péptidos (10 \mug por dosis de ensayo) antes de la primera vacunación y a las 6 y 12 semanas. Los ensayos de control de DTH incluyen también el virus de la parotiditis y Trichophyton.

Curso clínico. Se evalúa a los pacientes en el momento de cada vacunación y 2 semanas después de la última vacunación. El perfil de detección, el recuento sanguíneo completo, y el diferencial se realizan en el momento de las vacunaciones segunda y cuarta y 2 semanas después de la sexta vacunación. Se evalúan la citogenética y el análisis PCR de los puntos de escisión para los pacientes en remisión hematológica completa a las 12 semanas, o al final del estudio. Si son negativos, a partir de ese momento según esté indicado clínicamente. Se practica a los pacientes en remisión hematológica una aspiración de médula ósea en la semana 12, o al final del estudio y a partir de ese momento según esté indicado clínicamente.

Segunda serie de experimentos Materiales y métodos

Síntesis de péptidos. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos derivados de b3a2 de CML y los péptidos control se muestran en la Figura 4. Se estimó que la pureza del péptido era superior al 90% mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Líneas celulares. La línea celular derivada de CML RWLEU4 (HLA A3, A30, B27, B35) se usó como diana para CTL específicos de péptido correspondientes a HLA-A3. Esta línea celular se caracteriza por una proteína de fusión bcr-abl con punto de escisión b2a2. También se realizaron experimentos de CTL usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas como dianas.

Generación de respuestas de linfocitos T específicos de péptido a partir de PBMC humanas. Se estimularon PBMC de siete donantes sanos in vitro con los péptidos apropiados de unión a HLA derivados del punto de escisión CML-b3a2 y con el péptido más largo 25 mero b3a2, usando un protocolo adaptado de Celis et al. (10). En resumen, se estimularon PBMC aisladas recientemente con células presentadoras de antígeno (APC), autólogas, irradiadas, cargadas de péptido, purificadas con ácido, en presencia de interleuquina-2 humana recombinante (rhlL-2, 5 a 20 UI/ml; Hoffman-La Roche, Nutley, NJ), IL-7 humana recombinante (IL-7, 20 ng/ml; Genzyme, Cambridge (MA), y suero humano AB inactivado térmicamente al 5% (Sigma, St. Louis, MO). Después de 12 días en cultivo, se realizó una segunda estimulación. Estas APC eran PBMC autólogas cargadas de péptido, previamente cultivadas in vitro en presencia de 200 ng/ml o factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos rh (GM-CSF, Immunex, Seattle, WA) durante 14 días. Para el pulso de péptidos de las APC, cada péptido derivado de b3a2 se añadió con una concentración final de 50 \mug/ml durante la primera estimulación y de 15 \mug/ml durante la segunda estimulación. Después de un total de 19 días de cultivo, los linfocitos T estimulados con péptido se recogieron y se analizaron para determinar la citotoxicidad específica de péptido y la proliferación como se describe a continuación.

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Ensayo de citotoxicidad de CTL. La línea celular diana RWLEU4 derivada de CML, las PBMC autólogas diana, o las PBMC alogénicas diana se marcaron con 100 \muCi/10^{6} células de ^{51}Cr durante 1 hora, se lavaron y después se sometieron a pulsos con el péptido CML apropiado de HLA correspondiente o con péptidos de control (20 \mug/ml) durante 2 horas. Las células diana se mezclaron con efectores con diversas proporciones entre efector y diana (E:T): después de 6 horas de incubación a 37ºC, se determinó la citotoxicidad específica calculando la liberación específica porcentual de ^{51}Cr: [(cpm de la Muestra de Ensayo - cpm de la liberación Espontánea de ^{51}Cr)/(cpm de la liberación Máxima de ^{51}Cr - cpm de la liberación Espontánea de ^{51}Cr)]. La liberación espontánea se determinó incubando las dianas solas con medio, y la liberación máxima de ^{51}Cr se obtuvo incubando las dianas con dodecilsulfato sódico (SDS) al 2%.

Ensayo de proliferación de linfocitos. Se usaron linfocitos estimulados con el péptido b3a2-25 como linfocitos con respuesta. Como fuente de APC, se cultivaron PBMC autólogas sometidas o no a pulsos de los péptidos b3a2-25 o de control con los linfocitos respondedores en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos con diversas proporciones entre célula respondedora y APC. Después de 72 horas en cultivo, las células se incubaron con 0,5 \muCi/pocillo de ^{3}H-timidina durante 5 horas y se recogieron. Después se midió la incorporación de ^{3}H-timidina usando un contador \beta.

Resultados

Inducción de respuestas primarias de CTL a péptidos derivados de b3a2. Previamente se había demostrado que cuatro péptidos derivados del punto de escisión b3a2 eran capaces de unirse a moléculas de HLA de clase I humanas (Figura 4). (8) Tres péptidos compartían las propiedades de unión con moléculas de HLA-A3 y -A11 y, por lo tanto, se identificaron como CML-A3 (mayor afinidad de unión a HLA-A3), CML-A11 (mayor afinidad de unión a HLA-A11), y CML-A3/A11 (afinidad intermedia de unión tanto a moléculas de HLA-A3 como a -A11). El cuarto péptido, CML-B8, demostró una afinidad de unión intermedia a HLA-B8.

Se estimularon PBMC de siete voluntarios normales (Figura 5, donantes no. 3 a 9) con APC autólogas sometidas a pulsos de péptidos derivados de b3a2 de unión a HLA apropiados y se ensayaron para determinar la citotoxicidad específica de péptido. Las PMBC con HLA-A3 se sometieron a pulsos de péptidos CML-A3, CML-A3/A11, o péptidos de control A2; las PMBC con HLA-A11 se sometieron a pulsos tanto de péptidos CML-A11 como de CML-A3/A11. Las PBMC con HLA-B8 se sometieron a pulsos sólo de péptido HLA-B8. Después, las PBMC se ensayaron frente a dianas con el HLA correspondiente o no correspondiente. Las dianas se cargaron con péptidos de unión a A3, A3/A11, A11, B8, o A2. En los cuatro donantes con HLA-A3 se indujeron CTL específicos de péptido CML-A3/A11 y se observó lisis específica de células RWLEU4 correspondientes a HLA-A3 sometidas a pulsos de péptido CML-A3/A11 (Figs. 6A-C y 7A). No se observó destrucción específica cuando las dianas no se habían sometido a pulsos de péptidos o se sometieron a pulsos de péptidos irrelevantes, tales como un péptido derivado del virus de la influenza que se une a HLA-A2. La línea RWLEU4 se usó como línea celular diana en este sistema porque procede de un paciente con CML, pero no contiene el punto de escisión b3a2.

En uno de los cuatro donantes con HLA A3 ensayados, se observaron también CTL específicos de péptido CML-A3 capaces de destruir células RWLEU4 sometidas a pulsos del péptido (Fig. 7A).

Como alternativa al uso de líneas celulares de CML, también se investigó la citotoxicidad contra células recientes. En uno de los tres donantes con HLA-A3, el péptido CML-A3/A11 también fue capaz de inducir una alta tasa de destrucción específica de PBMC sometidas a pulsos de péptido con HLA correspondiente, mientras que no se observó destrucción cuando se sometieron a pulsos de este péptido PBMC no correspondientes alogénicas (Figura 8). En otro donante con HLA A3, se observó también una destrucción específica significativa de PBMC autólogas sometidas a pulsos de CML-A3/A11, pero se observó también alguna destrucción de dianas cargadas con un péptido no relacionado.

Para excluir la destrucción no específica de células diana sometidas a pulsos de CML-A3 o CML-A3/A11, se estimularon por separado PBMC del donante no. 9 (HLA-A3, A2), en el que se habían inducido CTL específicos, con el HLA-A2 que se une al péptido FLU-A2. Se indujeron CTL específicos de A2 en estas PBMC, que lisaron únicamente las PBMC autólogas cargadas de péptido FLU-A2 y no las PBMC cargadas de péptido CML-A3 o CML-A3/A11 (Fig. 7B). Por consiguiente, la destrucción no puede estar mediada por una lectina no específica o efecto de unión.

En dos donantes con HLA-A11 y dos con HLA-B8 ensayados, no se indujeron CTL específicos de péptido después de la estimulación de sus PBMC con péptidos CML-A11, CML- A3/A11, o CML-B8, respectivamente.

Inducción de la proliferación primaria de linfocitos T contra péptidos derivados de b3a2. Para explorar la capacidad de un péptido P210 derivado de CML-b3a2 de ser presentado por moléculas de MHC de clase II, se usó un péptido más largo (identificado como b3a2-25, cuya secuencia se muestra en la Figura 4), que incluye el punto de escisión b3a2, para estimular la proliferación de linfocitos T específicos en siete donantes sanos (Figura 5, donantes 1 a 7). En tres de los siete donantes, los linfocitos T sensibilizados al péptido b3a2-25 demostraron proliferación específica contra PBMC autólogas sometidas a pulsos de péptido como fuente de APC (Fig. 9A-C). No se observó proliferación específica cuando las APC autólogas no se habían sometido a pulsos de los péptidos o se habían sometido a pulsos de péptidos no relacionados tales como mRASp21 o CDR2. Todas los respondedores expresaron la molécula de HLA de clase II DR11; la otra molécula DR en dos de estos donantes (DR1 y DR8, respectivamente) estaba compartida por otros donantes que no proliferaron. Por consiguiente, estos datos sugieren que el péptido b3a2-25 contiene un motivo de unión para la molécula DR11.

Para eliminar la posibilidad de que un péptido b3a2-25 induzca la proliferación mitogénica no específica, se estimularon por separado PBMC del donante no. 2 con un péptido 17-mero b2a2 y se ensayaron frente a APC autólogas sin péptidos o sometidas a pulsos de péptidos b2a2-17, b3a2-25 o mRasp21. Se observó proliferación específica (índice de estimulación de 1,8 a 2,5 con una proporción T:APC de 1:2) únicamente cuando se ensayaron los linfocitos T sensibilizados al péptido b2a2-17 contra APC sometidas a pulsos de b2a2; las APC sin péptidos o sometidas a pulsos de péptidos b3a2-25 o mRasp21 no indujeron proliferación específica.

Discusión

Los resultados presentados anteriormente demuestran que los péptidos derivados del punto de escisión bcr-acl b3a2, que previamente se habían considerado capaces de unirse a moléculas de HLA de clase I, no podían inducir linfocitos T citotóxicos restringidos de clase I, específicos de péptido, en cuatro de los siete donantes sanos de HLA correspondiente ensayados. Además, un péptido derivado de b3a2 más largo, b3a2-25, fue capaz de inducir la proliferación de linfocitos T específicos de péptido en tres de los siete donantes estudiados. La proliferación específica de péptido puede ser de clase II, restringida a HLA-DR11, ya que la estimulación se observó en los tres donantes con HLA-DR11 y en ninguno de los cuatro donantes sin HLA-DR11. Estos experimentos proporcionan pruebas de una respuesta citolítica inmune humana contra los péptidos derivados del oncogén CML bcr-abl y confirman la utilidad de vacunas basadas en péptidos que incluyen el punto de fusión para esta enfermedad.

Debido a que la proteína de fusión bcr-abl, en condiciones fisiológicas, es intracelular, no es probable que tenga éxito una estrategia humoral para la terapia usando anticuerpos monoclonales; sin embargo es factible una estrategia basada en los linfocitos T. Los ensayos clínicos usando infusiones de linfocitos T para eliminar las células de la CML en el transplante de médula ósea (BMT) proporciona evidencia del poder de tal estrategia cuando se usan linfocitos T alorreactivos (11). Los péptidos derivados de bcr-abl pueden considerarse antígenos específicos de tumor verdaderos, tanto en virtud de la nueva secuencia de aminoácidos en las regiones de unión como por su expresión exclusiva en células que pertenecen al clon leucémico. Además, debido a que estas proteínas de fusión están implicadas directamente en eventos leucemogénicos, es improbable el escape de células de CML negativas para la proteína de fusión.

Las proteínas de fusión derivadas de CML son parte del conjunto de proteínas intracelulares que está disponible para ser procesado y presentado en forma de péptidos cortos en la superficie celular mediante la ruta de las moléculas de HLA de clase I. De esta forma, los péptidos se hacen accesibles a los linfocitos citotóxicos CD8+ (3). Los péptidos de clase I presentados no derivan aleatoriamente de las proteínas originales, sino que deben contener secuencias de aminoácidos específicas que sirvan como "motivos de anclaje" para la unión del péptido a la grieta de una molécula de MHC particular (12). La demostración de la unión de los péptidos del punto de fusión bcr-abl a las moléculas de HLA de clase I era un primer paso necesario en su evaluación como antígenos tumorales potenciales (8). Los resultados presentados anteriormente, que demuestran que al menos dos de estos péptidos cortos son también inmunogénicos en un ensayo de citotoxicidad in vitro primario y que, por lo tanto, son capaces de inducir una respuesta citotóxica de linfocitos T específica en los seres humanos, demuestra la utilidad de una estrategia de vacunación contra la CML.

La evidencia directa de péptidos b3a2 en la superficie de células de CML se obtiene mediante análisis por espectrometría de masas de péptidos endógenos eluidos de la molécula de HLA de clase I apropiada en células de CML con el punto de escisión b3a2 (13).

Los datos presentados anteriormente demuestran que un péptido derivado del punto de escisión b3a2 más largo, b3a2-25, inducía la proliferación de linfocitos T específicos en tres donantes normales que compartían la molécula de HLA-DR11. La secuencia b3a2-25 contiene un motivo de HLA-DR a lo largo del punto de escisión (14). La prueba de que la secuencia de fusión b3a2 contiene motivos de anclaje de clase II capaces de inducir la proliferación de linfocitos T también tiene implicaciones importantes para la inmunoterapia específica activa para la CML. in vivo, las proteínas de fusión CML pueden liberarse como consecuencia de la muerte celular; después de la internalización en APC locales, las proteínas pueden procesarse y presentarse en la superficie celular en el contexto de una molécula de HLA de clase II (HLA-DR). El CD4 "adyuvante" específico de péptido resultante puede ser importante para generar una respuesta citotóxica de CDB sostenida y potente. Además, se han observado respuestas de CD4 citotóxicos contra otras células de leucemia (15).

Referencias Referencias para los antecedentes y el ejemplo 1 de la primera serie de experimentos

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14. Véase el Ejemplo 1.

15. Kubo R.T., A. Sette, H.M. Grey, E. Appella, K. Sakaguchi, N.Z. Zhu, D. Arnott. N. Sherman, J. Shabanowitz, H. Michel, W.M. Bodnar, T.A. Davis, and D.F. Hunt. 1994. Definition of specific peptide motifs for four major HLA-A alleles. J. Immunol. 152:3913.

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18. Kawakami Y., S. Eliyahu, K. Sakaguchi, P.F. Robbins, L. Rivoltini, J.R. Yanelli, E. Appella, and S.A. Rosenberg. 1994. Identification of the immunodominant peptides of the MART -1 human melanoma antigen recognized by the majority of HLA-A2 restricted tumor infiltrating Iymphocytes. J. Exp. Med. 180:347.

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11. Mackinnon S, Papadopoulos EB, Carabasi MH, Reich L, Collins NH, Boulad F, Castro-Malaspina H, Childs BH, Gillio AP, Kernan NA, Small TN, Young JW, O'Reilly RJ: Adoptive immunotherapy evaluating doses of donor leukocytes for relapse of chronic myeloid leukemia after bone marrow transplantation: separation of graft-verus-leukemia responses from graft-versus-disease. Blood 86:1261, 1995

12. Falf K, Rotzchke O, Stevanic S, Jung G, Rammansee HG: Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351:290, 1991

13. Hunt DF, Henderson RA, Shabanowitz J, Sakaguchi K, Michel H, Servilir N, Cox AL, Appella E, Engelhard VH: Characterization of peptides bound to the class I molecule HLA A2.1 by mass spectrometry. Science 255:1261, 1992

14. Hammer J, Valsasnini P, Tolba K, Bolin D, Higelin J, Takacs B, Senigaglia F: Promiscuous and allele-specific anchors in HLA-DR-binding peptides. Cell 74;197, 1993

15. Gambacorti-Passerini C, Grignani F, Arienti F, Pandolfi PP, Pellicci PG, Parmiani G: Human CD4 Iymphocytes specifically recognize a peptide representing the fusion region of the hybrid protein pml/RAR\alpha present in acute promyelocytic leukemia cells. Blood 81:1369, 1993.

Claims (7)

1. Una composición que comprende un péptido que comprende aminoácidos cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre el grupo compuesto por las siguientes: 1) ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28); 2) KQSSKALQR (SEC ID NO: 32); 3) HSATGFKQSSK (SEC ID NO: 2); 4) GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30); y 5) IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEC ID NO: 34).

2. La composición de la reivindicación 1 que comprende un vehículo, y una cantidad del péptido eficaz para inducir la formación y proliferación de linfocitos T citotóxicos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PEMC) humanas en un sujeto.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que las células mononucleares de sangre periférica humanas son linfocitos CD8+.

4. La composición de la reivindicación 2, en la que las células mononucleares de sangre periférica humanas son linfocitos CD4+.

5. Uso de un péptido que comprende aminoácidos cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre el grupo compuesto por las siguientes: 1) ATGFKQSSK (SEC ID NO: 28); 2) KQSSKALQR (SEC ID NO: 32); 3) HSATGFKQ-
SSK (SEC ID NO: 2); 4) GFKQSSKAL (SEC ID NO: 30); y 5) IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEC ID NO: 34) para la preparación de una composición farmacéutica para inducir la formación y proliferación de linfocitos T citotóxicos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que las células mononucleares de sangre periférica humanas son linfocitos CD8+.

7. El uso de la reivindicación 5, en el que las células mononucleares de sangre periférica humanas son linfocitos CD4+.