ES2204904T3

ES2204904T3 - Adn que codifica un receptor de prostaglandina, una celula hospedadora transformada con el mismo y un producto de su expresion.

Info

Publication number: ES2204904T3
Application number: ES93922119T
Authority: ES
Inventors: Staffan Lake; Johan Stjernschantz
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2013-10-01
Also published as: ATE247668T1; AU5123393A; DE69333154T2; PT672067E; SE9202892D0; JPH08502061A; EP0672067A1; US5750369A; DE69333154D1; JP3634361B2; DK0672067T3; CA2146150A1; CA2146150C; EP0672067B1; WO1994007920A1; US6416972B1

Abstract

CLONACION MOLECULAR Y EXPRESION DE UN RECEPTOR F2 ALFA DE PROSTAGLANDINA UNIDO A LA VIA DE TRANSDUCCION DE SEÑAL MEDIANTE PROTEINAS REGULADORAS (G) UNIDAS A UN NUCLEOTIDO DE GUANINA Y MEDIDO POR, POR EJEMPLO, CAMP, IP3 O CALCIO INTRACELULAR. MEDIANTE LA CONSTRUCCION DE LAS LINEAS CELULARES QUE EXPRESAN UN RECEPTOR F2 ALFA DE PROSTAGLANDINA, SE PUEDEN DETERMINAR LAS AFINIDADES Y EFICACIAS DE LOS FARMACOS AGONISTAS Y ANTAGONISTAS CON EL RECEPTOR. UNA CONSTRUCCION DE ADN RECOMBINANTE INCLUYE UN VECTOR Y UN FRAGMENTO DE ADN QUE CODIFICA UN RECEPTOR F2ALFA PROSTAGLANDINA. UNA CELULA HUESPED SE TRANSFORMA CON UNA CONSTRUCCION DE ADN RECOMBINANTE, DE TAL MANERA QUE EL FRAGMENTO DE ADN SE EXPRESE Y SE PRODUZCA EL RECEPTOR F2ALFA DE PROSTAGLANDINA. UN SISTEMA HUESPED APROPIADO INCLUYE CELULAS PROCARIOTICAS Y EUCARIOTICAS, ESPECIALMENTE CELULAS DE MAMIFEROS TALES COMO LA RATA O EL SER HUMANO. ADICIONALMENTE, PARA PROPOSITOS DE DIAGNOSTICO, LOS ANTICUERPOS DE UN RECEPTOR F2ALFA DE PROSTAGLANDINA SE PUEDEN PREPARAR MEDIANTE LA PRODUCCION DE TODO O UNA PORCION DE LA PROTEINA RECEPTORA Y UNA INYECCION DE ESTAS EN VARIOS TIPOS DE MAMIFEROS. UTILIZANDO LOS ANTICUERPOS RESULTANTES, LA EXPRESION DE UN ADNC DE RECEPTOR F2ALFA, ES DECIR SE PUEDE MEDIR LA PROTEINA RECEPTORA EN EL TEJIDO Y CELULAS.

Description

ADN que codifica un receptor de prostaglandina, una célula hospedadora transformada con el mismo y un producto de su expresión.

Antecedentes de la invención Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a la clonación molecular y a la expresión de una proteína receptora y, en particular, a un receptor de la prostaglandina F2a y fragmentos del mismo asociados con la activación de segundos mensajeros como se mide, por ejemplo, por AMPc, IP3 o calcio intracelular. La invención se refiere además a una secuencia de ADN que codifica un receptor de la prostaglandina F2a, a una molécula de ADN recombinante que incluye dicha secuencia de ADN y a células transformadas con la misma. La invención también se refiere a anticuerpos dirigidos contra el receptor de F2a y a un método de detección del receptor de F2a con el anticuerpo. La invención también se refiere a un método de detección de la presencia del receptor de F2a codificado por un fragmento de ADN en una muestra, al uso de células transformadas para la selección de fármacos, así como a los fármacos preparados usando dicho método de selección.

Antecedentes

Los receptores de la prostaglandina F2a pertenecen a una gran clase de receptores de hormonas que están asociados a sus rutas de transducción de señales a través de proteínas reguladoras que se unen a nucleótidos de guanina (G). Dichos receptores están entre los sistemas de receptores más estudiados. Los receptores de prostaglandinas clásicamente se han definido como receptores asociados a la estimulación de segundos mensajeros y medidos por AMP cíclico (AMPc), inositol 3-fosfato (IP_{3}) o calcio intracelular, y están acoplados a una proteína G reguladora (Muallem, Biochem. J. 263: 769-774 (1989). Por el contrario, la activación de los receptores de prostaglandinas puede producir varias respuestas, incluyendo la inhibición de la actividad adenilil ciclasa, la inhibición de la renovación de fosfatidilinositol y la inhibición de la movilización de Ca^{2+} (Muallem, Biochem. J. 263: 769-774 (1989), y Duncan, Endocrinology 128: 519-1526 (1991)). También se han acumulado indicios que sugieren una heterogeneidad en la categoría de los receptores (Balapure, Biol. Reprod. 41: 385-392 (1989)).

Previamente, se han clonado dos receptores de prostaglandinas, a saber, el receptor del tromboxano A2 de ratón y humano, y el receptor de la prostaglandina E_{3} de ratón (Hirata, Nature 349: 617-620 (1991); Namba, BBRC 184: 1197-1203 (1992); y Sugimoto, J. Biol. Chem. 267: 6463-6466 (1992), respectivamente).

Los receptores de la prostaglandina F2a son extremadamente importantes desde un punto de vista clínico terapéutico. Los fármacos que activan (agonistas) estos receptores pueden usarse para tratar el glaucoma (Alm, Arch. Ophthalmol. 109: 1564-1568 (1991)), mientras que los fármacos que bloquean (antagonistas) los receptores de F2a pueden usarse terapéuticamente para tratar estados patológicos, por ejemplo, en los pulmones y en el útero. Puede ser de valor farmacéutico el que se sea capaz de titular las prostaglandinas endógenas F2a con un receptor solubilizado, así como usar un receptor inmovilizado para la purificación de un ligando y sus análogos. A pesar de su utilidad clínica, un problema con el agonista de prostaglandina F2a y con fármacos supuestamente antagonistas disponibles actualmente, es que éstos tienen muchos efectos secundarios, al igual que otros muchos fármacos que funcionan a través de la interacción con receptores. Estos efectos secundarios predominantemente se deben a la falta de especificidad del receptor. Es decir, el fármaco en uso interacciona no sólo con los receptores de prostaglandina F2a, sino también con otros receptores, véase por ejemplo, Muallem, Biochem. J. 263: 769-774 (1989).

Un objetivo principal de la farmacología clínica y de la industria farmacéutica es el desarrollo de fármacos más selectivos con mayor eficacia que los utilizados actualmente. Los impedimentos para este proceso son la poca abundancia de proteínas receptoras de prostaglandina F2a disponibles para estudiar en tejido ocular y la falta de sistemas de modelos homogéneos adecuados de los receptores con-tra los cuales se puedan seleccionar fármacos.

Sumario de la invención

La presente invención pretende proporcionar una solución a este problema por medio de una nueva estrategia que comprende la clonación de ADNc que codifican receptores de prostaglandina F2\alpha, la construcción de vectores de expresión eucariótica que contengan estos ADNc y la creación de una serie de líneas celulares de mamíferos o células procarióticas transfectadas estables que expresen receptores funcionales de la prostaglandina F2\alpha en abundancia. Estas líneas celulares, que expresarían una población homogénea de receptores de la prostaglandina F2\alpha, pueden usarse en la industria farmacéutica o en otras industrias para la selección de fármacos y para el estudio de los receptores de la prostaglandina F2\alpha usando una diversidad de técnicas bioquímicas, fisiológicas y farmacológicas.

Para lograr este objetivo, hemos aislado un ADNc que codifica un subtipo de receptor de prostaglandina F2\alpha de rata asociado a la activación de segundos mensajeros como se mide, por ejemplo, por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular. Este ADNc que codifica un receptor de F2\alpha se inserta en diferentes vectores de expresión eucarióticos o procarióticos y se usa en la construcción de diversas líneas celulares de mamífero que expresan esta proteína funcional. Las líneas celulares resultantes que expresan el receptor de F2\alpha pueden usarse para investigar las afinidades y eficacias de fármacos agonistas y antagonistas con un receptor de F2\alpha usando diversas técnicas, tales como la unión de radioligandos y ensayos de segundos mensajeros.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un receptor de F2\alpha que está asociado a la estimulación de segundos mensajeros, tales como AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, y que se acopla a proteínas reguladoras de unión a nucleótidos de guanina (G), cuando están presentes.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un fragmento de ADN que codifica el receptor de la prostaglandina F2\alpha descrito anteriormente.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una construcción o molécula de ADN recombinante que comprende un vector y el fragmento de ADN descrito anteriormente.

Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a una célula hospedadora transformada con la construcción de ADN recombinante descrita anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proceso de producción del receptor de prostaglandina F2\alpha descrito anteriormente. El método comprende cultivar la célula hospedadora mencionada anteriormente en condiciones tales que se exprese el fragmento de ADN que codifica el receptor de F2\alpha y se produzca un receptor de prostaglandina F2\alpha.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra el receptor de F2\alpha.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de detección de la presencia de un receptor de F2a en una muestra poniendo en contacto la muestra con dicho anticuerpo.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un método de detección de la presencia en una muestra de un fragmento de ADN que codifica un receptor de F2a poniendo en contacto la muestra con una sonda de ADN que contiene un fragmento de ADN que codifica un polipéptido o proteína receptora de F2a para que hibride con el fragmento de ADN.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un método de selección de fármacos para activar o bloquear la actividad del receptor de F2a poniendo en contacto las células hospedadoras transformadas mencionadas anteriormente con los fármacos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de preparación de un fármaco, incluyendo dicho método la selección de fármacos candidatos para activar o bloquear la actividad del receptor de F2a.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un fármaco, cuya preparación incluye la selección de fármacos candidatos para activar o bloquear la actividad del receptor de F2a.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran la secuencia de un receptor de prostaglandina F2\alpha de rata y la comparación con otros receptores acoplados a proteína G.

La figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor de F2\alpha junto con la secuencia de aminoácidos deducida de la fase de lectura abierta más larga. La secuencia de nucleótidos se numera desde la supuesta metionina inicial y se indica a la izquierda de cada línea, mientras que los números de los aminoácidos se indican a la derecha de cada línea. Los supuestos sitios de N-glicosilación se indican con un asterisco. El sitio potencial de fosforilación para la proteína quinasa dependiente de AMPc está subrayado.

La figura 1B muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de un receptor de prostaglandina F2\alpha con las de otros receptores de prostaglandinas conocidos. Las secuencias de aminoácidos del receptor del tromboxano humano A2 (2) y del receptor de la prostaglandina E3 de ratón (1) se alinearon para optimizar la homología con la secuencia de un receptor de la prostaglandina F2\alpha de rata (3). Las identidades de aminoácidos entre el receptor de F2\alpha y los otros dos receptores de prostaglandinas se indican en negrita. Las supuestas regiones transmembrana (TM) se indican con líneas discontinuas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un receptor de prostaglandina F2\alpha que está asociado con la activación de segundos mensajeros, por ejemplo, como se mide por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, y que se acopla con proteínas reguladoras que se unen a nucleótidos de guanina (G), cuando están presentes. La invención también se refiere a secuencias (fragmentos) de ADN que codifican todo o parte de una proteína receptora de F2\alpha. La invención también se refiere a una construcción recombinante que contiene dichas secuencias de ADN, a células transformadas con dicha construcción y a métodos de expresión del gen del receptor. Además, la invención se refiere a un anticuerpo contra el receptor de F2\alpha y al uso del anticuerpo para detectar la presencia de un receptor de F2\alpha en la muestra. La invención también se refiere a un método para detectar la presencia en una muestra de un fragmento de ADN que codifica un receptor de F2\alpha. La invención también se refiere a un método para la selección de fármacos por medio de las células transformadas. Además, la invención se refiere a un método para la preparación de fármacos, incluyendo el método tal procedimiento de selección, así como los fármacos preparados por el método.

La proteína o polipéptido del receptor de F2\alpha de la presente invención pertenece a una gran clase de receptores que están asociados a su transducción de señales a través de proteínas reguladoras que se unen a nucleótidos de guanina. Específicamente, el receptor de F2\alpha de la invención está asociado a la activación de segundos mensajeros como se mide, por ejemplo, por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, y se acopla a la proteína G reguladora, cuando está presente (por ejemplo, los sistemas procarióticos no tienen proteínas G reguladoras).

La expresión "receptor de F2\alpha", como se usa en este documento en el contexto de la presente invención debe entenderse en un sentido amplio. De esta manera, un receptor de F2\alpha puede tener la secuencia completa proporcionada en la figura 1A o puede tener la secuencia de aminoácidos de una molécula que tiene sustancialmente las mismas propiedades de segundo mensajero medidas, por ejemplo, por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, propiedades farmacológicas y propiedades de acoplamiento a la proteína G reguladora de la molécula correspondiente a la figura 1A (por ejemplo, variaciones alélicas de la proteína receptora de F2\alpha). Como alternativa, una proteína receptora de F2\alpha (o polipéptido) de la invención puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a cualquier porción activa o a partes de una proteína representada en la figura 1A (o sus variaciones alélicas). Como ejemplo, una proteína receptora de F2\alpha (o polipéptido) puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a un epítopo de la secuencia de la figura 1A (o una variación alélica de la misma).

El polipéptido o la proteína receptora de F2\alpha puede presentarse en una forma sustancialmente pura, es decir, en una forma sustancialmente libre de proteínas y ácidos nucleicos con los que normalmente se asocia. Una proteína receptora de F2\alpha puede purificarse usando protocolos conocidos en la técnica. Una proteína receptora de F2\alpha también puede usarse como un antígeno, en protocolos conocidos en la técnica, para producir anticuerpos contra ella, tanto monoclonales como policlonales.

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención también se refiere a secuencias de ADN (incluyendo secuencias de ADNc) que codifican la secuencia de aminoácidos completa proporcionada en la figura 1A (siendo sólo un ejemplo la secuencia de ADNc específica proporcionada en la figura 1A) o cualquier porción de la misma. Las secuencias de ADN a las que se refiere la invención también incluyen las que codifican proteínas (o polipéptidos) que tienen sustancialmente las mismas propiedades de segundos mensajeros medidas, por ejemplo, por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, propiedades farmacológicas y propiedades de acoplamiento a proteínas G reguladoras de un receptor de F2\alpha (por ejemplo, formas alélicas de la secuencia de la figura 1A).

Además, la presente invención se refiere a una construcción de ADN recombinante que incluye un vector y una secuencia de ADN como se ha descrito anteriormente (de forma ventajosa, una secuencia de ADN que codifica el receptor mostrado en la figura 1A o un receptor que tiene las mismas propiedades de segundo mensajero medidas, por ejemplo, por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, propiedades farmacológicas y propiedades de acoplamiento a proteínas G de esa proteína).

El vector puede tomar la forma de un virus o un vector plasmídico (por ejemplo, lambda ZAP II). La secuencia de ADN puede estar presente en el vector unida operativamente a elementos reguladores incluyendo, por ejemplo, un promotor. La construcción recombinante puede ser adecuada para transformar células procarióticas o eucarióticas, o de forma ventajosa, células de mamífero.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con la construcción recombinante descrita anteriormente. El hospedador puede ser procariota (por ejemplo, bacteriano), eucariota inferior (es decir, fúngico, incluyendo levaduras) o eucariota superior (es decir, todos los mamíferos, incluyendo, pero sin limitación, rata y ser humano). Por ejemplo, se han conseguido transformaciones estables en células de ovario de hámster chino (células CHO). La transformación puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica. Las células hospedadoras transformadas pueden usarse como fuente para la secuencia de ADN descrita anteriormente (secuencia que forma parte de la construcción recombinante). Cuando el receptor recombinante toma la forma de un sistema de expresión, las células transformadas pueden usarse como fuente del receptor descrito anteriormente.

La presencia de una proteína receptora de F2a puede detectarse en una muestra (por ejemplo, tejido humano o de otro mamífero, o un cultivo celular) poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo contra el receptor. La detección de la presencia o ausencia de un complejo formado entre el receptor y el anticuerpo puede realizarse por métodos bien conocidos en la técnica. La presencia de un segmento de ADN que codifica una proteína receptora de F2a puede detectarse en una muestra (por ejemplo, tejido humano o de otro mamífero, o un cultivo celular) poniendo en contacto la muestra con una sonda de ADN que contenga el segmento de ADN o fragmentos del mismo. Usando métodos bien conocidos en la técnica y en condiciones tales que se produzca hibridación, puede formarse un complejo entre la sonda y el segmento de ADN de la muestra. La detección de la presencia o ausencia del complejo puede realizarse por métodos bien conocidos en la técnica.

La proteína receptora de prostaglandina F2a y las secuencias de ácido nucleico de la presente invención puede usarse en un marco de investigación (por ejemplo, para facilitar el entendimiento de los mecanismos de la proteína receptora) y en un marco clínico (por ejemplo, usado como un sistema modelo del receptor con el cual seleccionar fármacos agonistas o antagonistas contra éste). Por ejemplo, los fármacos terapéuticos diseñados para interaccionar con receptores de prostaglandina F2a a menudo tienen efectos secundarios debido a la falta de especificidad del receptor. Se puede usar una línea celular que expresa un receptor de F2a para investigar las afinidades y eficacias de fármacos agonistas y antagonistas por el receptor de F2a usando diversas técnicas, tales como la unión de radioligandos y ensayos de segundos mensajeros. La actividad de la célula tratada con fármacos puede compararse con la de una célula de control para evaluar la activación o bloqueo del receptor de F2a.

Para fines diagnósticos, la expresión de un ADNc del receptor de F2a en las células puede medirse usando métodos conocidos. Para llevar a cabo esto, pueden usarse anticuerpos contra el receptor de F2a (preparado produciendo la proteína receptora de F2a completa o porciones de la misma e inyectando éstas en diversos tipos de animales, por ejemplo, conejos, ovejas, cabras o ratones).

La invención se describe con más detalle a continuación y en el siguiente ejemplo no limitante con respecto al aislamiento y caracterización de los clones de ADNc para un receptor de F2a.

Aislamiento y caracterización de clones de ADNc para un receptor de prostaglandina F2a (i) Clonación y análisis de la secuencia del ADNc del receptor de prostaglandina F2a

Para clonar un receptor de prostaglandina F2a, denominado en lo sucesivo por brevedad receptor FP, asociado a la activación de segundo mensajero medida, por ejemplo, por AMPc, IP_{3} o calcio intracelular, se usó el método de la PCR para la amplificación selectiva de secuencias de ADNc a partir de ARNm purificado del cuerpo lúteo de rata. Previamente se ha demostrado que los cuerpos lúteos ovino y bovino expresan este subtipo de receptores (Balapure, Biol. of Reproduction 41:385-392 (1989) y Orlicky, Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids 41: 51-61 (1990)). Se usó una biblioteca comercial de ADNc para obtener ADNc a partir del cuerpo lúteo de rata. La amplificación por PCR se llevó a cabo con un par de cebadores altamente degenerados derivados de la segunda, séptima, tercera y sexta regiones transmembrana de miembros de la superfamilia de receptores con siete dominios transmembrana clonados previamente. Este proceso produjo la amplificación de varios fragmentos de ADNc.

Estos fragmentos se caracterizaron de forma preliminar por análisis de la secuencia de ADN. Se descubrió que uno de estos fragmentos mostraba una considerable homología de secuencia con receptores acoplados a proteína G relacionados clonados previamente y posteriormente se usó en la selección de la biblioteca de ADNc del cuerpo lúteo de rata para aislar un clon de longitud completa. Se aislaron 24 clones de ADNc con insertos de tamaños que variaban de aproximadamente 1,7 a 3,3 kb, hibridando todos ellos fuertemente con la sonda de PCR marcada con ^{32}P en el análisis de Southern. Se secuenció uno de estos clones, con un inserto de aproximadamente 3 kb, y se descubrió que presentaba una homología de secuencia de aminoácidos de más del 55% con receptores relacionados en las regiones codificantes de la secuencia. Esta homología es aproximadamente la misma en todas las combinaciones, a pesar de los diferentes receptores y también en un caso de especie diferente, humano frente a rata. En la figura 1A se muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida para el clon FP. La fase de lectura abierta más larga en este ADNc codifica una proteína de 366 restos con un peso molecular teórico de 40,65 kDa.

Aunque en esta fase de lectura hay secuencias cercanas con ATG similares a la secuencia de iniciación consenso de Kozak (Kozak, Nucleic Acid Res., 12: 857-872 (1984)), en realidad el cordón Met en posición 1 proporciona el sitio más probable (figura 1A).

Los análisis de hidrofobia de la proteína traducida revelan siete grupos de aproximadamente 20 a 25 restos hidrófobos, que se prevé que representan dominios que atraviesan la membrana, conectados por tres bucles extracelulares y tres intracelulares. Este patrón es similar al observado en otros receptores acoplados a proteína G clonados, en los que se propone que el extremo NH_{2} es extracelular y el extremo COOH se proyecta dentro del citoplasma (Dohlman, Biochemistry, 26: 2657-2664 (1987)). El extremo NH_{2} contiene dos sitios consenso de N-glicosilación mientras que el tercer bucle citoplásmico previsto muestra uno. Los sitios de reconocimiento consenso de fosforilación por la proteína quinasa dependiente de AMPc se encuentran en los bucles citoplásmicos y en la cola del carboxilo. Además, el extremo COOH largo contiene varios restos de serina que posiblemente representan sitios adicionales para la fosforilación reguladora. Se han propuesto estas fosforilaciones para la regulación de la señalización transmembrana y para la desensibilización del receptor (Sibley, Cell. 48:913-922 (1987)).

(ii) Caracterización de las secuencias de aminoácidos de un clon del receptor de la prostaglandina F2a:

En la figura 1B se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida para los clones de ADNc con las secuencias de diversos receptores de prostaglandinas. Como puede verse, las regiones de mayor identidad parecen estar dentro de los dominios que atraviesan la membrana previstos. Dentro de estas regiones, la proteína receptora FP muestra las mayores homologías de secuencia con el receptor de la prostaglandina E3 de rata y con el del tromboxano A2 de ratón y humano. Los extremos NH_{2} y COOH y los bucles extracelulares e intracelulares son significativamente más divergentes entre estos receptores. Es interesante advertir que en el tercer supuesto dominio transmembrana de FP no hay ningún resto de aspartato conservado, lo cual es común en todos los receptores de aminas biogénicas que se han secuenciado hasta el momento (Strader, FASEB J., 3: 1825-1832 (1989)). Además, el quinto dominio de FP que atraviesa la membrana también contiene dos restos de serina que están conservados entre los receptores de catecolaminas y que son críticos para el reconocimiento de los ligandos agonistas que poseen un grupo catecol (Strader, FASEB J., 3: 1825-1832 (1989).

Además, con los cebadores derivados de la secuencia que codifica el receptor de F2a y usando PCR en bibliotecas de ADNc de tejidos humanos que se espera que se expresen el receptor de F2a, se encontraron fragmentos del tamaño correcto que mostraban entre sí fragmentos de restricción idénticos. Los tejidos fueron por ejemplo, ojo, ovario, útero y riñón.

Estas observaciones sugieren que el clon de ADNc del receptor de F2a de la presente invención codifica un receptor para un ligando de prostaglandina endógeno.

Ejemplo Aislamiento y caracterización de clones de ADNc para un nuevo receptor acoplado a proteína G.

Para clonar un receptor FP, se usó el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ADNc de una biblioteca de ADNc del cuerpo lúteo de rata, en el vector lambda ZAP^{c}II (Stratagene, Nº de Catálogo 936504). Se amplificaron 1 x 10^{6} pfu de la biblioteca y se preparó el ADN de lambda como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (1990) 1.13.1-1.13.3. Se sometieron 50 ng del ADN de lambda a 45 ciclos de amplificación de PCR en un volumen de reacción total de 25\mul con una concentración 1\muM de cada uno de los dos cebadores:

TM206: 5'ATI I(CT)(CG) (TA)I(TC) (TC)TG GCI ITI ICC GAT 3'

TM710: 5'C(GT)(AG) AAI AGI AT(AG) TAI ACC CAI GGG TC 3'; y dNTPs 200\muM y 2 u de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer-Cetus, USA). El tiempo usado fue de 45 segundos (en el primer ciclo de 3 minutos) a 95 grados Celsius, 3 minutos a 50 grados Celsius y 3 minutos a 72 grados Celsius. La etapa a 72 grados Celsius se amplió 6 segundos en cada ciclo. Los productos de reacción se purificaron por electroforesis en agarosa LMP al 1% (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA, Nº de catálogo 162-0020). Las bandas individuales se escindieron del gel y se sometieron a 20 ciclos de amplificación por PCR en un volumen total de reacción de 20\mul con una concentración 100\muM de cada uno de los dos cebadores descritos anteriormente, es decir:

TM206: 5'ATI I(CT)(CG) (TA)I(TC) (TC)TG GCI ITI ICC GAT 3'

TM710: 5'C(GT)(AG) AAI AGI AT(AG) TAI ACC CAI GGG TC 3'; y dNTPs 200\muM y 2,5 u de Taq ADN polimerasa. El tiempo usado fue idéntico al tiempo descrito anteriormente.

Los productos de reacción se unieron con el vector PCR1000 de acuerdo con las instrucciones del kit de TA Cloning (Invitrogen Corporation, USA, Nº de Catálogo K2000-1). El plásmido obtenido se denominó pKGE858. La minipreparación del ADN plasmídico se realizó con un kit Qiagene-tip 100 (Diagene-GmbH, Alemania). La secuenciación del inserto se realizó de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. De ese modo, los insertos de ADNc se secuenciaron con cebadores homólogos a las regiones del sitio de clonación múltiple de M13. Para revelar las secuencias completas de ADNc, se usó la estrategia del desplazamiento a través del gen (gene walking). Todos los análisis de secuencia se llevaron a cabo en un sistema de secuenciación de ADN de Applied Biosystems modelo 373A (Applied Biosystems Inc. U.S.A.) de acuerdo con el protocolo de Applied Biosystems para su kit de secuenciación cíclica Taq Dye Dioxy Terminator. Los datos primarios generados se procesaron en un ordenador VAX usando los programas de análisis de secuencia del Genetics Computer Group Inc., Madison, USA (Devereux, Nucleic Acids Research 12 (1):387-395 (1984)). Se descubrió que uno de los insertos mostraba homología de secuencia con receptores relacionados (el receptor del tromboxano A2 humano y posteriormente también con otros receptores de prostaglandinas clonados; Hirata, Nature 349:617-620 (1991), Sugimoto, J. Biol. Chem. 267:6463-6466 (1992), y Namba, BBRC 184: 1197-1203 (1992)). Posteriormente, este inserto se usó como sonda para seleccionar la biblioteca de ADNc del cuerpo lúteo de rata para aislar un clon de longitud completa. Con el inserto descrito anteriormente se analizaron 1 x 10^{6} recombinantes de la biblioteca de ADNc del cuerpo lúteo de rata, construida en el vector Lambda ZAP II. La sonda, que constaba del fragmento de 600 pb NotI/HindIII del plásmido pKGE858 obtenido anteriormente, se marcó por el sistema de marcaje de ADN Amersham Megaprime (Amersham, Inglaterra, RPN1607). Se hibridaron filtros de nitrocelulosa por duplicado (Hybond-N, Amersham, Inglaterra) en sulfato de dextrano al 10% (p/v), dodecil sulfato sódico al 1%, cloruro sódico 1 M y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón sonicado (Boehringer Mannheim, Alemania) con la sonda descrita anteriormente durante 16 h a 65 grados Celsius. Se llevó a cabo un lavado de alta rigurosidad de los filtros con 2 x SSC y dodecil sulfato sódico al 1% a 65 grados Celsius durante 30 minutos. Los clones de fago que hibridaron positivamente se purificaron adicionalmente por una segunda selección usando la misma sonda que en la selección inicial. Se expandieron 25 clones de fago de hibridación positiva en E. coli XL1-Blue (Stratagene, U.S.A.) y el conjunto de fagos resultante se usó para preparar plásmidos pBluescript que contenían ADNc por escisión del fagémido usando el fago adyuvante R408 de acuerdo con el protocolo de Stratagene. Se preparó el ADN del plásmido con Qiagene-tip 100 (Diagene GMBH, Alemania) y posteriormente se analizó por análisis de restricción. Los cuatro plásmidos con los insertos más largos se analizaron por métodos de secuenciación de ADN bien conocidos en la técnica. La secuencia de ADN de uno de estos insertos se muestra en figura 1A.

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Para detectar el receptor de F2a en los tejidos que se espera que lo expresen, se usaron cebadores derivados de la secuencia que codifica el receptor F2a en las regiones transmembrana (TM) VI y VII. La secuencia del cebador en TM VI fue:

5'-CCAGCTTCTGGGTATAATGTGTGT-3',

y la secuencia del cebador en TM VII fue:

5'-AGCAGSATATARGCCCAGGGGTCCAAGATCTGGTTCCRGGWTGCCATKCG-3'.

El producto amplificado tenía un tamaño de 173 pb. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como se ha indicado anteriormente. Cortando el fragmento con la enzima de restricción HaeIII, que es única en el fragmento humano, se obtuvieron dos bandas con tamaños de 100 y 73 pb, respectivamente. Todos los fragmentos de las bibliotecas de ADNc mostraron estas características.

El contenido completo de todas las referencias citadas en este documento anteriormente se incorporan como referencia.

Aunque la invención anterior se ha descrito con ciertos detalles para facilitar su claridad y comprensión, será evidente para un especialista en la técnica tras la lectura de esta descripción que pueden realizarse diversos cambios en la forma y en los detalles sin apartarse del verdadero alcance de la invención.

Claims

1. Una forma pura de un receptor de la prostaglandina F2a, donde dicho receptor tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la mostrada en la figura 1A.

2. Un anticuerpo contra el receptor de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un fragmento de ADN que codifica un receptor de la prostaglandina F2a, donde dicho fragmento de ADN codifica las secuencias de aminoácidos indicadas en la figura 1A.

4. Una construcción de ADN recombinante que contiene:

(i): un vector y,

(ii): un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una construcción de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho vector es un vector de expresión eucariótico.

6. Una construcción de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho vector es un vector de expresión procariótico.

7. Una construcción de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, 5 ó 6, donde dicho fragmento de ADN codifica una secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1A.

8. Una célula hospedadora transformada con una construcción de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

9. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha célula es una célula eucariótica.

10. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha célula es una célula procariótica.

11. Un método de detección de la presencia de un receptor de prostaglandina F2a en una muestra, que comprende las fases de poner en contacto dicha muestra con al menos un anticuerpo de la reivindicación 2 y detectar la presencia o ausencia de un complejo formado entre dicho receptor y el anticuerpo.

12. Un método de selección de fármacos que interaccionan con un receptor de prostaglandina F2a, que comprende poner en contacto un receptor de prostaglandina F2a activo producido por una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 con un fármaco, en condiciones que activen o bloqueen las funciones del receptor, y detectar la presencia o ausencia de la actividad del receptor de prostaglandina F2a.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende poner en contacto el fármaco con la célula hospedadora.