ES2205169T3 - Reactivos para uso como calibradores y controles. - Google Patents
Reactivos para uso como calibradores y controles.Info
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Abstract
Un método para detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método (a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dicho anticuerpo con antígeno específico para dicho anticuerpo durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos antígeno/anticuerpo, (b) detectar la presencia de dicho anticuerpo que puede estar presente en dicha muestra de ensayo, y (c) emplear, como control o calibrador uno o más reactivos cada uno de los cuales se une a dicho antígeno y es un anticuerpo monoclonal quimérico que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera de una especie hospedadora fusionada a regiones constantes de cadena ligera y pesada de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o de una especie hospedadora relacionada con la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir en base a la interreactividad inmunológica de epítopos de región constante, donde cuando se emplean uno o más reactivos como control o calibrador, dichos reactivos se unen a epítopos diferentes en dicho antígeno.
Description
Reactivos para uso como calibradores y
controles.
La presente invención se refiere a un método para
usar reactivos como calibradores (patrones) y/o controles en ensayos
y kits diagnósticos. Más específicamente, pueden usarse uno o más de
estos reactivos en lugar de plasma o suero seropositivo en la
producción de calibradores y/o controles para ensayos y kits
diagnósticos diseñados para medir cualitativa o cuantitativamente
anticuerpos específicos para un ligando deseado. Los reactivos se
autounen específicamente a un ligando predeterminado, contienen uno
o más epítopos de región constante de anticuerpo, y son homogéneos
en especificidad y afinidad. Los reactivos pueden producirse
mediante el uso hibridoma y/o tecnología de ADN recombinante.
Los anticuerpos son proteínas multidominio
compuestas por dos cadenas ligeras (L) ligeras y dos cadenas
polipeptídicas pesadas (H) idénticas, unidas conjuntamente por
enlaces disulfuro (figura 1). El domino terminal amino tanto de las
cadenas L como de las cadenas H presenta una diversidad considerable
en la secuencia de aminoácidos y en la configuración y se denomina
región variable (V). Residiendo en cada región V están tres
segmentos de variabilidad excepcional, denominados regiones
hipervariables o regiones que determinan la complementariedad (CDR),
que forman la cavidad de unión a ligando. Los otros dominios tanto
de las cadenas L como H constituyen las regiones constantes. Las
regiones constantes no están implicadas en la unión a ligando y
muestran una variación más limitada. Las regiones constantes con
especies específicas y pueden dividirse en diversas clases y
subclases basadas en diferencias en la región constante de cadena
pesada incluyendo tamaño, carga, composición de aminoácidos,
glicosilación y función biológica (Carayannopoulos, L. y Capra, J.D.
Structure and Function of Immunoglobulins, In Fundamental
Immunology, 3ª edición, Paul W.E. ed. Raven Press Ltd., Nueva York
págs. 283-314 (1993)).
El sistema inmune genera un repertorio
marcadamente diverso de moléculas de anticuerpo capaces de reconocer
virtualmente cualquier sustancia. La respuesta principal al
anticuerpo inducida por la exposición con antígeno (es decir,
cualquier sustancia capaz de suscitar una respuesta inmune, por
ejemplo, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos o
hapteno conjugado con un vehículo) da lugar a la producción de
anticuerpos predominantemente de la clase IgM. Esta respuesta es de
naturaleza policlonal ya que produce una mezcla heterogénea de
anticuerpos contra diferentes epítopos del antígeno. La exposición
posterior o prolongada con el mismo antígeno conduce una segunda
respuesta caracterizada por titulaciones de anticuerpos
significativamente mayores que las observadas en la respuesta
principal que generalmente son superiores en afinidad (medida de la
resistencia de unión entre un epítopo y el sitio de combinación del
anticuerpo) y está compuesta casi en su totalidad de la clase IgG.
La titulación de IgM específica generalmente disminuye más
rápidamente que la titulación de IgG específica. Como resultado, el
control de la clase del anticuerpo específico presente en el suero o
en otros fluidos biológicos proporciona un indicador del estado
inmune del individuo a un antígeno específico (por ejemplo, agentes
infecciosos). La clase de anticuerpo puede ser de relevancia clínica
en casos de autoinmunidad y para controlar la hipersensibilidad de
tipo I (respuestas alérgicas) asociada con la producción de
anticuerpos de clase IgE (Roitt, I. ed. Immunology, Gower Medical
Publishing Ltd., Londres, Inglaterra (1985); Paul W.E. ed.,
Fundamental Immunology, 3ª edición, Raven Press Ltd., Nueva York
(1993)).
Sin tener en cuenta la clase, las moléculas del
anticuerpo se unen a ligandos con alta afinidad y especificidad (la
capacidad para distinguir entre el epítopo al que esta dirigido y
cualquier otro epítopo) convirtiéndoles en reactivos
inmunodiagnósticos ideales. Los inmunoensayos proporcionan un método
rápido y sensible para controlar agentes infecciosos, función
fisiológica, alergia, autoinmunidad, cáncer, agentes farmacéuticos y
fármacos de abuso. Los inmunoensayos manuales y automáticos se han
diseñado para medir la respuesta del anticuerpo en general,
anticuerpo contra un antígeno específico, y antígenos o haptenos
diagnósticamente relevantes. Los inmunoensayos heterólogos
generalmente consisten en múltiples etapas de reacción y finalmente
requieren separar el reactivo inmunocomplejado de los reactivos
libres para obtener el resultado del ensayo. Por el contrario, los
inmunoensayos homogéneos son sistemas en fase de solución que no
requieren separar el reactivo complejado de los reactivos libres.
Los inmunoensayos se han desarrollado con muchos formatos
diferentes, pero pueden dividirse en dos clase principales: (1)
ensayos competitivos, (2) ensayos no competitivos (por ejemplo,
inmunométrico, de sandwich). Para los ensayos heterológos de ambas
clases, la bioquímica en fase sólida para la separación de reactivos
unidos y libres ha resultado ser revolucionaria. Los reactivos
anticuerpo o antígeno pueden unirse covalente o no covalentemente
(por ejemplo iónico, hidrófobo) a la fase sólida. Se conocen agentes
de unión para la unión covalente y pueden ser parte de la fase
sólida o de derivarse a ésta antes del recubrimiento. Son ejemplos
de fases sólidas usadas en inmunoensayos, materiales porosos y no
porosos, partículas de látex, partículas magnéticas,
micropartículas, perlas, membranas, pocillos de microtitulación y
tubos de plástico. La elección del material de fase sólida y del
procedimiento para marcar el reactivo antígeno o anticuerpo se
determina en función de las características de actuación del formato
de ensayo deseadas. Para algunos inmunoensayos, no se requiere la
marcación. Por ejemplo, si el antígeno no es una partícula
detectable tal como un glóbulo rojo, la reactividad puede
establecerse en función de la aglutinación. Como alternativa, la
reacción antígeno-anticuerpo puede dar lugar a un
cambio visible (por ejemplo, inmunodifusión radial). En muchos
casos, uno de los reactivos anticuerpo o antígeno usados en un
inmunoensayo se une a un compuesto o “marca” que genera señales.
Este compuesto o “marca” que genera señales es autodetectable o
puede hacerse reaccionar con uno o más compuestos adicionales para
generar un producto detectable. Los ejemplos de compuestos que
generan señales incluyen cromógenos, radioisótopos (por ejemplo
^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S y ^{14}C),
compuestos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina),
compuestos quimioluminiscentes, partículas, (visibles o
fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes complejantes, o
catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina,
fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano picante,
beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso del
uso de enzimas, la adición de sustratos cromo-, fluoro- o
lumo-génicos da lugar a la generación de una señal
detectable. También son útiles otros sistemas de detección tales
como fluorescencia resuelta con el tiempo, fluorescencia de reflejo
interno, amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de
polimerasa) y espectroscopía de Raman.
Se han desarrollado inmunoensayos para controlar
fluidos biológicos (por ejemplo, plasma, suero, fluido cerebro
espinal, saliva, lágrimas, fluidos nasales, o extractos acuosos de
tejidos y células) para la presencia de anticuerpo específico para
un antígeno de interés (por ejemplo, agente infeccioso,
autoantígeno, alergeno). En muchos casos, estos inmunoensayos de
anticuerpo específico se han diseñado para ser específicos de una
clase o subclase de anticuerpo. Existen dos formatos generales que
se utilizan comúnmente para controlar anticuerpos específicos en
seres humanos: (1) el antígeno está presente en una fase sólida, el
fluido biológico humano que contiene anticuerpos específicos se deja
reaccionar con el antígeno, y después, el anticuerpo unido al
antígeno se detecta con un anticuerpo anti-humano
acoplado con un compuesto que genera señales y (2) se une un
anticuerpo anti-humano a la fase sólida, y el fluido
biológico humano que contiene anticuerpos específicos se deja
reaccionar con el anticuerpo y, después, el antígeno unido a un
compuesto que genera señales se añade para detectar el anticuerpo
específico. En ambos formatos, el reactivo anticuerpo
anti-humano puede ser policlonal o monoclonal.
Además, el reactivo anticuerpo anti-humano puede
reconocer todas las clases de anticuerpos, o como alternativa, puede
ser específico para una clase o subclase particular de anticuerpo,
dependiendo del propósito deseado del ensayo. La reactividad de este
reactivo refleja el espectro de anticuerpos del que está compuesto y
los epítopos de región constante de anticuerpo particular al que se
une. Los epítopos de región constante son determinantes antigénicos
para los que puede generarse una respuesta de anticuerpos. Los
ejemplos de epítopos de región constante incluyen: epítopos de
especie invariante (epítopos específicos de una clase o subclase) y
epítopos alotípicos (presentes en algunos pero no en todos los
miembros de una especie). Los métodos para fabricar y ensayar
reactivos anticuerpo anti-humano que se unen a
epítopos de región constante son bien conocidos en la técnica.
Podrían diseñarse ensayos para controlar la respuesta a anticuerpo
específica en otras especies de una forma análoga mediante un
especialista en la técnica.
Los inmunoensayos diseñados para detectar el
anticuerpo específico proporcionan una medida de la actividad del
anticuerpo. Esto puede denominarse como titulación del anticuerpo,
por ejemplo, título de medio punto o de punto final o puede
expresarse en unidades (actividad o gravimétrico) con relación a una
norma de referencia. Los inmunoensayos y kit incluyen típicamente
uno o más componentes que contienen el anticuerpo específico a medir
que funcionan como calibradores (patrones) y/o control positivo. Los
calibradores (patrones) se usan para establecer las curvas de
calibración (patrón) para la interpolación de la concentración de
anticuerpos, o como alternativa, puede usarse un calibrador sencillo
cerca del límite positivo/negativo. El control positivo se usa para
establecer las características de actuación del ensayo y es un
indicador útil de la integridad de los reactivos. Además, los
inmunoensayos y kits para detectar el anticuerpo específico
generalmente incluyen un control negativo, tal como suero o plasma,
que no contiene reactivo anticuerpo con el antígeno de interés.
Preferiblemente, los calibradores o controles positivos se preparan
con el anticuerpo específico a medir o con un material químicamente
similar a éste. Idealmente, el calibrador o los calibradores y los
controles se fabrican para interactuar con los otros componentes de
ensayo de una forma análoga al analito del ensayo (anticuerpo
específico). Lo calibradores y controles positivos se fabrican
generalmente añadiendo cantidades conocidas de anticuerpos
específicos derivados de plasma o suero seropositivo (anticuerpo
policlonal) en el reactivo de control negativo. A menudo se incluyen
calibradores de múltiples tiempos que contienen concentraciones
variables de anticuerpo específico que abarcan el intervalo de
concentraciones para las que el ensayo está diseñado. Los
inmunoensayos cuantitativos pueden incluir hasta 8 calibradores
(patrones) para establecer una curva de calibración (patrón) a
partir de la cual los resultados pueden interpolarse. La cantidad de
anticuerpo específico asignado al calibrador o calibradores y al
control o controles se normaliza contra normas de referencia
principales. En el caso de la actividad del anticuerpo, a menudo la
norma de referencia se establece usando sueros individuales o
agrupados que se han caracterizado empíricamente con respecto a
características tales como cantidad, calidad y especificidad. La
norma de referencia puede ser unidades relativas asignadas de
actividad o puede ser una cantidad gravimétrica de anticuerpo. Para
inmunoensayos cualitativos, puede usarse un calibrador sencillo
(patrón) que se coloca cerca del límite positivo/negativo. Algunos
fabricantes se refieren al calibrador sencillo (patrón) como
calibrador de índice (Voller, A. et al., Immunoassays for the
80s, University Park Press, Baltimore (1981); Albertini, A. y Ekins,
R., eds., Monoclonal Antibodies and Developments in Immunoassay,
Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Nueva York
(1981); Butler, J., ed., Immuonchemistry of
Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton
(1991)).
Son dos ejemplos de un inmunoensayo basado en la
captura del anticuerpo inmunométrico los ensayos del anticuerpo IgM
IMx Toxo y IgG Toxo (figura 2) fabricados por los laboratorios
Abbott. Ambos ensayos son un inmunoensayo enzimático de
micropartículas (MEIA) automático que mide los anticuerpos contra
Toxoplasma gondii (T. gondii) en suero o plasma
humano (Safford, J.W. et al., J. Clin. Pathol.
44:238-242, (1991)). Un ensayo mide cualitativamente
anticuerpos IgM, indicativo de una exposición reciente o de una
infección aguda, y el otro ensayo mide cuantitativamente IgG,
indicativo de una infección crónica o pasada. T. gondii, un
parásito intracelular obligado que infecta a adultos a menudo de
forma asintomática, puede provocar graves consecuencias para el feto
debido a la transmisión transplacental que tiene lugar durante una
infección materna adquirida aguda (Remington, J.S. y Krahenbuhl
J.L., Comprehensive Immunology (A. J. Nahmias y O'Reilly, Eds) págs.
327-371. Plenum, Nueva York/Londres (1982);
Remington, J.S., Intrauterine Infections: Birth defects Origin. Ser
4:47-56. The National Foundation of the March of
Dimes, Nueva York (1968)). La determinación del estado inmune
materno ensayando la presencia de anticuerpos IgM o IgG específicos
de T. gondii puede ayudar a la determinación de embarazos de
riesgo y en el caso de individuos seronegativos permite controlar la
seroconversión que sería indicativo de una infección aguda
(Desmonts, G. y Couvreur, J., New Engl. J. Med.
290:1110-1116 (1974); McCabe, R. y Remington J.S.,
New Engl. J. Med. 318:313-317 (1988); Sibalic, D.
et al.,Gynecol. Obstet. Invest. 36:91-95
(1993)). Estos ensayos usan micropartículas recubiertas con
antígenos T. gondii como fase sólida. La muestra se añade a
las micropartículas recubiertas para permitir que los anticuerpos
específicos para T. gondii se unan. Posteriormente, se añade
una IgM anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina
(o anti-IgG humana) que se une específicamente a
anticuerpos de clase IgM (o IgG) complejados contra los antígenos
T. gondii. Después de la adición del substrato adecuado, el
porcentaje de volumen catalizado con enzima se controla basándose en
la fluorescencia.
Los calibradores y controles positivos para los
ensayos de IgM y IgG anti--T. gondii se preparan a partir de
plasma recogido de donantes humanos reactivos a T. gondii.
Tradicionalmente, el plasma o suero de titulación alta ha servido
como fuente de controles y/o calibradores (patrones) en ensayos y
kits diagnósticos diseñados para controlar la presencia de
anticuerpos humanos específicos para un antígeno dado. Éstos
incluyen ensayos para detectar anticuerpos contra el virus de la
inmunodeficiencia humana 1, el virus de la inmunodeficiencia humana
2, virus de leucemia de células T humano 1, virus de leucemia de
células T humano 2, citomegalovirus, virus de la hepatitis A, virus
de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D,
virus de la hepatitis E, virus sincitial respiratorio, virus de la
rubéola, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Cryptococcus
neoformans, HIstoplasma capsulatum, Helicobacter pylori, y
Streptococcus pyogenes. El uso de plasma o suero
seropositivo para la fabricación de calibradores (patrones) y/o
controles tiene diversos inconvenientes significativos, incluyendo:
(1) el aumento de la dificultad de generar grandes volúmenes de
plasma o suero con titulación alta, especificidad alta y falta de
anticuerpos contra otros agentes infecciosos, (2) variabilidad
considerable lote a lote durante un período de tiempo con respecto a
la titulación y especificidad que impacta en la actuación del
ensayo, (3) limitaciones inherentes con respecto a la
caracterización de un antisuero debido a su naturaleza policlonal
(heterogéneo en la clase de anticuerpos, especificidad y afinidad) y
(4) coste. De hecho, puede concebirse, que en algunos casos, pueda
ser imposible mantener la producción de calibradores y/o controles
que se basen en plasma humano seropositivo debido a problemas de
obtención. Puede resultar especialmente difícil encontrar fuentes de
titulación alta de anticuerpo IgM ya que ésta generalmente se
obtiene a partir de individuos infectados gravemente. Por ejemplo,
en Estados Unidos es difícil generar un reactivo IgM contra la
rubéola debido al satisfactorio programa de vacunación. Como la
generación de plasma o suero seropositivo adecuado es cada vez más
difícil, los costes con relación a la fabricación de calibradores y
controles aumentan, y este presupuesto económico finalmente se
traspasa al paciente. Un método alternativo para fabricar
calibradores (patrones) y/o controles positivos para ensayos y kits
diagnósticos diseñados para controlar niveles de anticuerpos
específicos representaría un avance significativo.
Los anticuerpos creados por ingeniería genética,
tales como anticuerpos quiméricos humanos/ratón, pueden usarse como
reactivos de control de calidad para ensayar la especificidad de
conjugados de anticuerpos anti-humanos y para el
control de calidad de inmunoensayo de inmunoglobulina total humana.
Además se propone que estos anticuerpos quiméricos puedan ser
reactivos útiles para la cuantificación de anticuerpos específicos
en normas de referencia. Los anticuerpos quiméricos serían útiles
para establecer una curva de respuesta a la dosis heteróloga para
interpolar la cantidad de anticuerpo en una norma de referencia
específica para un antígeno diferente (Hamilton, R.G., Ann. Biol.
Clin. 48:473-477 (1990): Butler, J.E. y Hamilton,
R.G. In Immunochemistry of Solid-phase
Immunoassay, Butler, J.E. ed. CRC Press, Boca Raton, págs.
173-198 (1991)). El término “heterólogo” indica que
el antígeno para el que los anticuerpos quiméricos son específicos
está definido, pero no está relacionado con el antígeno contra el
que se está controlando el anticuerpo específico.
La presente invención difiere de lo mencionado en
dos formas importantes: (1) los reactivos propuestos van dirigidos
a usarse, como un sustituto para el plasma o suero seropositivo, en
la fabricación de calibradores (patrones) y/o controles positivos
para inmunoensayos y kits diseñados para controlar respuestas de
anticuerpo específicas a antígeno, y (2) los reactivos propuestos se
unen al mismo o al antígeno “homologo” al que se une el anticuerpo
específico a medir. Se prefiere el uso de reactivos que se unen al
antígeno específico en el sentido de que el calibrador, el control
positivo, y la muestra de ensayo reaccionan al mismo antígeno en
condiciones idénticas, proporcionando una medida más realista de la
actividad del anticuerpo específico, y tiene la ventaja añadida de
que permite controlar la integridad del antígeno de ensayo en el
momento en que se lleva a cabo el ensayo.
Una fuente alternativa de material para la
fabricación de controles positivos en inmunoensayo diseñados para
detectar anticuerpo humano específico es el anticuerpo inmune no
humano que reacciona con un anticuerpo anti-humano
(Patente de Estados Unidos 5.008.183). El uso de sueros inmunes no
humanos (policlonales) tiene varios inconvenientes incluyendo: (a)
variabilidad lote a lote durante un período de tiempo con respecto a
la composición de la clase de anticuerpo, la títulación, la
especificidad y la afinidad que pueden impactar en la actuación del
ensayo; (b) dificultad en la caracterización debido a su composición
policlonal (por ejemplo, afinidad y especificidad heterogéneas); (c)
suministro limitado; y (d) en el caso de agentes infecciosos, un
peligro biológico potencial si se usan organismos vivos para
inmunizar.
Una fuente alternativa de material para la
fabricación de calibradores y controles para ensayos de IgM es un
anticuerpo compuesto de un resto de inmunoglobulina IgM no
específico unido covalentemente a un resto sin anticuerpo IgM
específico (Patente de Estados Unidos 5.478.753). El uso de sueros
inmunes para producir el anticuerpo compuesto tiene todos los
inconvenientes inherentes detallados anteriormente. Además, se debe
generar y purificar tanto los restos inmunes como los restos no
inmunes usados para construir el anticuerpo compuesto. Además, los
productos químicamente entrecruzados serían heterogéneos con
respecto al número y a la localización de los restos de anticuerpo
no inmunes unidos. De hecho, la unión cerca del sitio de unión puede
dar lugar a una interferencia estérica del antígeno que se une
mediante el anticuerpo específico.
El uso de los reactivos descritos en la presente
invención, que se unen a ligando, contienen uno o más epítopos de
región constante, y son homogéneos en especificidad y afinidad (es
decir, todas moléculas son uniformes con respecto a las propiedades
de especificidad y afinidad), circunven todos los problemas
asociados con el uso de sueros inmunes en la fabricación de
calibradores y controles positivos. Además, como los epítopos de
región constante son una parte integra del reactivo (es decir,
fusionados directamente al dominio de unión a ligando) se obtiene
una composición más uniforme. Además, los presentes reactivos pueden
generarse fácil y reproductiblemente en cantidades virtualmente
ilimitadas y también pueden ser útiles para cuantificar y controlar
la integridad del antígeno usado en el ensayo.
Tradicionalmente, los ensayos y kits diagnósticos
diseñados para detectar la presencia de anticuerpos humanos
específicos para una antígeno dado (por ejemplo, virus de la
inmunodeficiencia humana 1, virus de la inmunodeficiencia humana 2,
virus de leucemia de células T humano 1, virus de leucemia de
células T humano 2, citomegalovirus, virus de la hepatitis A, virus
de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D,
virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis GB, virus sincitial
respiratorio, virus de la rubéola, Toxoplasma gondii, Trypanosoma
cruzi, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Helicobacter
pylori, y Streptococcus pyogenes) han usado plasma o
suero humano seropositivo (anticuerpo policlonal) para fabricar
calibradores (patrones) y controles. Por el contrario, la presente
invención se refiere a un método para usar reactivos como
calibradores (patrones) y/o controles en tales ensayos y kits
diagnósticos en lugar de tal plasma o suero. Más específicamente,
pueden usarse uno o más de estos reactivos en lugar del plasma o
suero positivo, como calibradores (patrones) y/o controles para
ensayos y kits diagnósticos diseñados para medir cualitativa o
cuantitativamente anticuerpos específicos para un ligando deseado.
Los reactivos se unen por sí mismos específicamente a un ligando
predeterminado, contienen uno o más epítopos de región constante a
anticuerpo, y son homogéneos o uniformes en cuanto a especificidad y
afinidad. Los reactivos pueden producirse por el uso de hibridoma
y/o tecnología de ADN recombinante.
Más específicamente, la presente invención
engloba un método para detectar la presencia de anticuerpos que
puede estar presente en la muestra de ensayo donde este método
comprende (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de
contener el anticuerpo con antígeno específico para el anticuerpo
durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para
permitir la formación de los complejos de antígeno/anticuerpo, (b)
detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en la
muestra de ensayo, y (c) emplear, como control o calibrador, un
reactivo que se una al antígeno, en el que la mejora comprende
emplear, como control o calibrador, un reactivo que comprende uno o
más epítopos de región constante de anticuerpo, donde el reactivo se
una al antígeno y es homogéneo con respecto a la especificidad y a
la afinidad.
La invención también incluye un método para
detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en
una muestra de ensayo donde el método comprende (a) poner en
contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener el anticuerpo
con el antígeno específico para el anticuerpo durante un período de
tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de
complejos antígeno/anticuerpo (b) detectar la presencia del
anticuerpo que puede estar presente en la muestra de ensayo, y (c)
emplear, como control o calibrador, dos o más reactivos que se unen
al antígeno, donde la mejora comprende emplear, como control o
calibrador, dos o más reactivos comprendiendo cada uno uno o más
epítopos de región constante de anticuerpo, donde cada uno de los
dos o más reactivos se unen a diferentes epítopos en dicho antígeno
y es homogéneo con respecto a la especificidad y afinidad.
Además, la invención engloba un método para
detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en
una nuestra de ensayo donde el método comprende (a) poner en
contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener el anticuerpo
con el antígeno específico para el anticuerpo durante un período de
tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de
complejos antígeno/anticuerpo (b) añadir un conjugado directo o
indirecto a los complejos antígeno/anticuerpo resultantes durante un
período de tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el
conjugado se una al anticuerpo unido, donde el conjugado comprende
un anticuerpo unido a un compuesto que genera señales capaz de
generar una señal detectable, (c) detectar la presencia de
anticuerpos que pueden estar presente en el compuesto de ensayo
detectando la señal generada por el compuesto que genera señales, y
(d) emplear, como control o calibrador, un reactivo que se une al
antígeno, donde la mejora comprende emplear, como dicho control o
calibrador, un reactivo que comprende uno o más epítopos de región
constante de anticuerpo, donde el reactivo se une al antígeno y es
homogéneo con respecto a la especificidad y afinidad.
La presente invención incluye adicionalmente un
método para detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar
presentes en una muestra de ensayo donde el método comprende (a)
poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener el
anticuerpo con antígeno específico para el anticuerpo durante un
período de tiempo y en condiciones suficientes que permitan la
formación de los complejos antígeno/anticuerpo (b) añadir un
conjugado directo o indirecto a los complejos antígeno/anticuerpo
resultantes durante un período de tiempo y en condiciones
suficientes que permitan que el conjugado se una al anticuerpo
unido, donde dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un
compuesto que genera señales capaz de generar una señal detectable,
(c) detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en
dicha muestra de ensayo detectando la señal generada por el
compuesto que genera señales, y (d) emplear, como control o
calibrador, dos o más reactivos que se unen al antígeno, donde la
mejora comprende emplear, como el control o calibrador, dos o más
reactivos comprendiendo cada uno, uno o más epítopos de región
constante de anticuerpo, donde cada uno de los dos o más reactivos
se une a diferentes epítopos en el antígeno y es homogéneo con
respecto a la especificidad y afinidad.
En todos los métodos anteriores, el reactivo
puede seleccionarse entre el grupo compuesto por un anticuerpo
monoclonal quimérico que comprende regiones variables de cadena H y
L de una especie hospedadora fusionada a genes de región constante
derivados de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir,
un anticuerpo monoclonal derivado de la misma especie hospedadora
que el anticuerpo a medir, un anticuerpo monoclonal derivado de una
especie con relación a la que se está analizando en función de la
interreactividad inmunológica, y un polipéptido fusionado a una
región constante de anticuerpo o un fragmento del mismo derivado de
la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o con
relación a la especie hospedadora en base a la interreactividad
inmunológica. El anticuerpo monoclonal quimérico puede comprender
varias regiones de cadena H y L derivadas de un roedor y genes de
región constante de cadena H y L derivadas de un ser humano.
Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal quimérico puede unirse
específicamente a Toxoplasma gondii y más específicamente a
proteínas P30 o P66 del mismo.
En los métodos que implican un reactivo, la
región variable de cadena H del anticuerpo monoclonal quimérico, si
tal es el reactivo, puede codificarse para la secuencia de
nucleótidos mostrada en la Figura 6 o variaciones alélicas de la
misma, y la región variable de cadena L del anticuerpo monoclonal
quimérico puede codificarse mediante la secuencia de nucleótidos
mostrada en la Figura 7 o variaciones alélicas de la misma. La
región variable de cadena H del anticuerpo monoclonal quimérico
puede tener la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 6, y
la región variable de cadena L del anticuerpo monoclonal quimérico
puede tener la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 7.
Como alternativa, la región variable de cadena H
del anticuerpo monoclonal quimérico puede codificarse mediante la
secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 8, o variaciones
alélicas de la misma, y la región variable de cadena L del
anticuerpo monoclonal quimérico puede codificarse mediante la
secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 9 o variaciones
alélicas de la misma. La región variable de cadena H del anticuerpo
monoclonal quimérico puede tener la secuencia de aminoácidos
mostrada en la Figura 8, y la región variable de cadena L del
anticuerpo monoclonal quimérico puede tener la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 9.
En los métodos anteriores que implican más de un
reactivo, donde cada uno es un anticuerpo monoclonal quimérico, la
región variable de cadena H que representa uno de los dos o más
reactivos puede codificarse mediante la secuencia de nucleótidos
mostrada en la Figura 6 o variaciones alélicas de la misma, y la
región variable de cadena L del anticuerpo monoclonal quimérico que
representa el mismo de los dos o más reactivos puede codificarse
mediante la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 7 o
variaciones alélicas de la misma, y la región variable de cadena H
del anticuerpo monoclonal quimérico que representa otro de los dos o
más reactivos puede codificarse mediante la secuencia de nucleótidos
mostrada en la Figura 8 o variaciones alélicas de la misma y la
región variable de cadena L de estos otros dos o más reactivos puede
codificarse mediante la secuencia de nucleótidos mostrada en la
Figura 9 o variaciones alélicas de la misma.
La región variable de cadena H del anticuerpo
monoclonal quimérico que representa uno de los dos o más reactivos
tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 6 y la
región variable de cadena L del anticuerpo monoclonal quimérico que
representa uno de los dos o más reactivos puede tener la misma
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 7, y la región
variable de cadena H del anticuerpo monoclonal quimérico que
representa otro de estos dos o más reactivos puede tener la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8 y la región
variable de cadena L de otro de los dos o más reactivos puede tener
la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 9.
En los métodos anteriores, el anticuerpo a
detectar en la muestra de ensayo se selecciona entre el grupo
compuesto por IgA, IgB, IgE, IgG y IgM. El antígeno puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por un agente infeccioso, un
autoantígeno, un alergeno y un compuesto farmacéutico. El agente
infeccioso puede seleccionarse entre el grupo compuesto por un
parásito, una bacteria, un hongo, una levadura y un virus. Más
específicamente, el virus puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por: virus de la inmunodeficiencia humana 1, virus de la
inmunodeficiencia humana 2, virus de leucemia en células T humano 1,
virus de leucemia en células T humano 2, citomegalovirus, virus de
la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C,
virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, virus de la
hepatitis GB, virus sincitial respiratorio y virus de la rubéola. El
parásito puede seleccionarse entre el grupo compuesto por
Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzi. Los hongos
pueden seleccionarse entre el grupo compuesto por Histoplasma
capsulatum y Cryptococcus neoformans, y la bacteria puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por Helicobacter
pylori y Streptococcus pyogenes.
La presente invención también engloba un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un antígeno específico para el anticuerpo; y b) un
control o calibrador que comprende un reactivo donde el reactivo
comprende uno o más epítopos de región constante de anticuerpo, que
se une al antígeno, y que es homogéneo con respecto a la
especificidad y afinidad.
La invención también incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un antígeno específico para el anticuerpo; y b) un
control o calibrador que comprende dos o más reactivos donde cada
uno de los dos o más reactivos comprende uno o más epítopos de
región constante de anticuerpo, se une a los diferentes epítopos en
dicho antígeno y es homogéneo con respecto a la especificidad y
afinidad.
Adicionalmente, la invención incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un antígeno específico para el anticuerpo; b) un
conjugado directo o indirecto que comprende un anticuerpo unido a un
compuesto que genera señales capaz de generar una señal detectable;
y c) un control o calibrador que comprende un reactivo donde el
reactivo comprende uno o más epítopos de región constante de
anticuerpo se une al antígeno, y es homogéneo con respecto a la
especificidad y afinidad.
Además, la invención incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un antígeno específico para el anticuerpo; b) un
conjugado directo o indirecto que comprende un anticuerpo unido a un
compuesto que genera señales capaz de generar una señal detectable;
y c) un control o calibrador que comprende dos o más reactivos donde
cada uno de los dos o más reactivos comprende uno o más epítopos de
región constante de anticuerpo, se une a los diferentes epítopos en
el antígeno, y es homogéneo con respecto a la especificidad y
afinidad.
En todos los kits anteriores, el reactivo puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por un anticuerpo monoclonal
quimérico que comprende regiones variables de cadena H y L de una
especie hospedadora fusionada a los genes de región constante
derivados de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir,
un anticuerpo monoclonal derivado de la misma especie hospedadora
que el anticuerpo a medir, un anticuerpo monoclonal derivado de una
especie con relación a la que se está ensayando en función de la
interreactividad inmunológica, y un polipéptido fusionado a una
región constante de anticuerpo o un fragmento del mismo derivado de
la misma especie hospedadora como el anticuerpo a medir o con
relación a la especie hospedara en función de la interreactividad
inmunológica.
Cuando el reactivo es un anticuerpo monoclonal
quimérico, éste comprende regiones variables de cadena H y L
derivadas de un roedor y genes de región constante de cadena H y L
derivados de un humano.
Además, el anticuerpo a detectar puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por IgA, IgD, IgE, IgG y IgM.
El antígeno de los kits puede seleccionarse entre el grupo compuesto
por un agente infeccioso, un autoantígeno, un alergeno y un
compuesto farmacéutico. El agente infeccioso puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por un parásito, una bacteria, un hongo,
una levadura y un virus. Más específicamente, el virus puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por: virus de la
inmunodeficiencia humana 1, virus de la inmunodeficiencia humana 2,
virus de leucemia de células T humano 1, virus de leucemia de
células T humano 2, citomegalovirus, virus de la hepatitis A, virus
de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D,
virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis GB, virus sincitial
respiratorio y virus de la rubéola. El parásito puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por Toxoplasma gondii y
Trypanosoma cruzi. El hongo puede seleccionarse entre el
grupo compuesto por Histoplasma capsulatum y Crytococcus
neoformans, y la bacteria puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por Helicobacter pylori y Streptococcus
pyogenes.
Adicionalmente, la presente invención incluye un
método para detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar
presentes en una muestra de ensayo donde el método comprende (a)
poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener el
anticuerpo con anti-anticuerpo específico para el
anticuerpo durante un período de tiempo y en condiciones suficientes
para permitir la formación de los complejos
anti-anticuerpo/anticuerpo, (b) detectar la
presencia del anticuerpo que puede estar presente en la muestra de
ensayo, (c) emplear, como control o calibrador, un reactivo que se
une al anti-anticuerpo, donde la mejora comprende
emplear, como el control o calibrador, un reactivo que comprende uno
o más epítopos de región constante de anticuerpo, donde el reactivo
se une a un antígeno específico para dicho anticuerpo y es homogéneo
con respecto a la especificidad y a la afinidad.
La invención también incluye un método para
detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en
una muestra de ensayo donde el método comprende (a) poner en
contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener el anticuerpo
con anti-anticuerpo específico para el anticuerpo
durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para
permitir la formación de complejos
anti-anticuerpo/anticuerpo, (b) detectar la
presencia del anticuerpo que puede estar presente en la muestra de
ensayo, (c) emplear, como control o calibrador, dos o más reactivos
que se unen al anti-anticuerpo, donde la mejora
comprende emplear, como el control o calibrador, dos o más reactivos
comprendiendo cada uno uno o más epítopos de región constante de
anticuerpo, donde cada uno de los dos o más reactivos se une a
diferentes epítopos en el antígeno y es homogéneo con respecto a la
especificidad y afinidad.
Adicionalmente, la presente invención incluye un
método para detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar
presentes en una muestra de ensayo donde el método comprende (a)
poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener el
anticuerpo con anti-cuerpo específico para el
anticuerpo durante un período de tiempo y en condiciones suficientes
para permitir la formación de los complejos
anti-anticuerpo/anticuerpo, (b) añadir un conjugado
a los complejos anti-anticuerpo/anticuerpo
resultantes durante un período de tiempo y en condiciones
suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo
unido, donde el conjugado comprende un antígeno unido a un compuesto
que genera señales capaz de generar una señal detectable, (c)
detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en la
muestra de ensayo detectando la señal generada por el compuesto que
genera señales, y (d) emplear, como control o calibrador, un
reactivo que comprende anticuerpo contra el
anti-anticuerpo, donde la mejora comprende emplear,
como control o calibrador, un reactivo que comprende uno o más
epítopos de región constante de anticuerpo, donde el reactivo se une
al antígeno y es homogéneo con respecto a la especificidad y
afinidad.
Además, otro método de la invención para detectar
la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en una
muestra de ensayo, comprende (a) poner en contacto la muestra de
ensayo sospechosa de contener el anticuerpo con un
anti-anticuerpo específico para el anticuerpo
durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para
permitir la formación de complejos
anti-anticuerpo/anticuerpo, (b) añadir un conjugado
a los complejos anti-anticuerpo/anticuerpo
resultantes, durante un período de tiempo y en condiciones
suficientes para permitir que el conjugado se una al compuesto
unido, donde el conjugado comprende un antígeno unido a un compuesto
que genera señales capaz de generar una señal detectable (c)
detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en la
muestra de ensayo detectando la señal generada por el compuesto que
genera señales, y (d) emplear, como control o calibrador, dos o más
reactivos que se unen al anti-anticuerpo, donde la
mejora comprende emplear, como control o calibrador, dos o más
reactivos comprendiendo cada uno uno o más epítopos de región
constante de anticuerpo, donde cada uno de los dos o más reactivos
se une a diferentes epítopos en el antígeno y tiene una única
especificidad y afinidad.
En los métodos presentados directamente
anteriormente, el reactivo puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por un anticuerpo monoclonal quimérico que comprende
regiones variables de cadena H y L de una especie hospedadora
fusionada con genes de región constante derivados de la misma
especie hospedadora que el anticuerpo a medir, un anticuerpo
monoclonal derivado de la misma especie hospedadora que el
anticuerpo a medir, un anticuerpo monoclonal derivado de una especie
relacionada con la que se va a ensayar en función de la
interreactividad inmunológica, y un polipéptido fusionado a una
región constante de anticuerpo o un fragmento del mismo derivado de
la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o con
relación a la especie hospedadora en función de la interreactividad
inmunológica.
Si el reactivo es un anticuerpo monoclonal
quimérico, éste comprende regiones variables de cadena H y L
derivadas de un roedor y genes de región constante de cadena H y L
derivados de un ser humano. El anticuerpo monoclonal quimérico puede
unirse específicamente a Toxoplasma gondii. Más
específicamente, el anticuerpo monoclonal quimérico puede unirse a
la proteína P30 o la proteína P60 de Toxoplasma gondii.
En los métodos que implican un reactivo, donde el
reactivo es un anticuerpo monoclonal quimérico, la región variable
de cadena H del anticuerpo monoclonal quimérico puede codificarse
mediante la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 6 o
variaciones alélicas de la misma, y la región variable de cadena L
del anticuerpo monoclonal quimérico puede codificarse mediante la
secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 7 o variaciones
alélicas de la misma. La región variable de cadena H del anticuerpo
monoclonal quimérico puede tener la secuencia de aminoácidos
mostrada en la Figura 6, y la región variable de cadena L del
anticuerpo monoclonal quimérico puede tener la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 7.
Como alternativa, la región variable de cadena H
del anticuerpo monoclonal quimérico puede codificarse mediante la
secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 8 o variaciones
alélicas de la misma, y la región variable de cadena L de
anticuerpos monoclonales quiméricos puede codificarse mediante la
secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 9 o variaciones
alélicas de la misma. La región variable de cadena H del anticuerpo
monoclonal quimérico puede tener los nucleótidos de la secuencia de
aminoácidos mostrados en la Figura 8, y la región variable de cadena
L del anticuerpo monoclonal quimérico puede tener la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 9.
En los métodos donde están implicados más de un
reactivo, la región variable de cadena H del anticuerpo monoclonal
quimérico que representa uno de los dos o más reactivos puede
codificarse mediante la secuencia de nucleótidos mostrada en la
Figura 6 o variaciones alélicas de la misma y la región variable de
cadena L del anticuerpo monoclonal quimérico que representa uno de
los dos o más reactivos puede codificarse mediante la secuencia de
nucleótidos mostrada en la Figura 7 o variaciones alélicas de la
misma, y la región variable de cadena H del anticuerpo monoclonal
quimérico que representa otro de los dos o más reactivos puede
codificarse mediante la secuencia de nucleótidos mostrada en la
Figura 9 o variaciones alélicas de la misma. La región variable de
cadena H del anticuerpo monoclonal quimérico que representa uno de
los dos o más reactivos puede tener a secuencia de aminoácidos
mostrada en la Figura 6 y la región variable de cadena L del
anticuerpo monoclonal quimérico que representa uno de los dos o más
reactivos puede tener la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 7, y la región variable de cadena H del anticuerpo monoclonal
quimérico que representa otros de los dos o más reactivos puede
tener la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8 y la
región variable de cadena L de estos de los dos o más reactivos
puede tener la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 9.
El anticuerpo a detectar en dicha muestra de
ensayo puede seleccionarse entre el grupo compuesto por IgA, IgD,
IgE, IgG y IgM. El antígeno puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por un agente infeccioso, un autoantígeno, un alergeno y
un compuesto farmacéutico. El agente infeccioso puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por un parásito, una bacteria, un hongo,
una levadura y un virus. Más específicamente, el virus puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por: virus de la
inmunodeficiencia humana 1, virus de la inmunodeficiencia humana 2,
virus de leucemia de células T humano 1, virus de leucemia de
células T humano 2, citomegalovirus, virus de la hepatitis A, virus
de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D,
virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis GB, virus sincitial
respiratorio y virus de la rubéola. El parásito puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por Toxoplasma gondii y
Trypanosoma cruzi. El hongo puede seleccionarse entre el
grupo compuesto por Histoplasma capsulatum y Crytococcus
neoformans, y la bacteria puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por Helicobacter pylori y Streptococcus
pyogenes.
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La invención también incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un anti-anticuerpo específico para el
anticuerpo; b) un antígeno específico para el anticuerpo; y c) un
control o un calibrador que comprende un reactivo donde el reactivo
comprende uno o más epítopos de región constante de anticuerpo, se
une al antígeno, y es homogéneo con respecto a la especificidad y
afinidad.
Adicionalmente, la invención incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un anti-anticuerpos específico para el
anticuerpo; b) un antígeno específico para el anticuerpo; y c) un
control o calibrador que comprende dos o más reactivos donde cada
uno de los dos o más reactivos comprende uno o más epítopos de
región constante de anticuerpo, se une a diferentes epítopos en
dicho antígeno y es homogéneo con respecto a la especificidad y a la
afinidad.
Además, la invención engloba un kit para
determinar la presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que
comprende: a) un anti-anticuerpo específico para el
anticuerpo; b) un conjugado directo o indirecto que comprende un
antígeno unido a un compuesto que genera señales capaz de generar
una señal detectable; y c) un control o calibrador que comprende un
reactivo donde el reactivo comprende uno o más epítopos de región
constante de anticuerpo, se une al antígeno y es homogéneo con
respecto a la especificidad y afinidad.
La invención también incluye para determinar la
presencia de anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende: a)
un anti-anticuerpo específico para el anticuerpo; b)
un conjugado directo o indirecto que comprende un antígeno unido a
un compuesto que genera señales capaz de generar una señal
detectable; y c) un control o calibrador que comprende dos o más
reactivos donde cada uno de los dos o más reactivos comprende uno o
más epítopos de región constante de anticuerpo, se une a diferentes
epítopos en dicho antígeno y es homogéneo con respecto a la
especificidad y afinidad.
En los kits mencionados anteriormente, el
reactivo puede seleccionarse entre el grupo compuesto por un
anticuerpo monoclonal quimérico que comprende regiones variables de
cadena H y L de una especie hospedadora fusionada a genes de región
constante derivados de la misma especie hospedadora que el
anticuerpo a medir, una anticuerpo monoclonal derivado de la misma
especie hospedadora que el anticuerpo a medir, un anticuerpo
monoclonal derivado de una especie relacionada con la que se va a
ensayar en función de la interreactividad inmunológica y un
polipéptido fusionado a una región constante de anticuerpo o un
fragmento del mismo derivado de la misma especie hospedadora que el
anticuerpo a medir o relacionado con la especie hospedadora en
función de la interreactividad inmunológica.
Si un anticuerpo monoclonal quimérico es el
reactivo en cada uno de los kits, éste comprende regiones variables
de cadena H y L derivadas de un roedor y genes de región constante
de cadena H y L derivados de un ser humano.
El anticuerpo a detectar en dicha muestra de
ensayo puede seleccionarse entre el grupo compuesto por IgA, IgD,
IgE, IgG y IgM. El antígeno puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por un agente infeccioso, un autoantígeno, un alergeno y
un compuesto farmacéutico. El agente infeccioso puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por un parásito, una bacteria, un hongo,
una levadura y un virus. Más específicamente, el virus puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por: virus de la
inmunodeficiencia humana 1, virus de la inmunodeficiencia humana 2,
virus de leucemia de células T humano 1, virus de leucemia de
células T humano 2, citomegalovirus, virus de la hepatitis A, virus
de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D,
virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis GB, virus sincitial
respiratorio y virus de la rubéola. El parásito puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por Toxoplasma gondii y
Trypanosoma cruzi. El hongo puede seleccionarse entre el
grupo compuesto por Histoplasma capsulatum y Crytococcus
neoformans, y la bacteria puede seleccionarse entre el grupo
compuesto por Helicobacter pylori y Streptococcus
pyogenes.
La invención engloba un método para detectar la
presencia de anticuerpos, desarrollados contra más de un antígeno,
que pueden estar presentes en una muestra de ensayo donde el método
comprende (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de
contener los anticuerpos con antígenos específicos para los
anticuerpos, respectivamente, durante un período de tiempo y en
condiciones suficientes para permitir la formación de complejos
antígenos/anticuerpo, (b) añadir conjugados directos o indirectos a
los complejos antígeno/anticuerpo durante un período de tiempo y en
condiciones suficientes para permitir que los conjugados se unan a
los anticuerpos unidos, donde los conjugados comprenden un
anticuerpo unido a un compuesto que genera señales capaz de generar
una señal detectable, (c) detectar la presencia de los anticuerpos
que pueden estar presentes en la muestra de ensayo detectando la
señal generada por el compuesto que genera señales, y (d) emplear,
como controles o calibradores, reactivos que se unen a los
antígenos, donde la mejora comprende emplear, como los controles o
calibradores, reactivos, comprendiendo cada uno uno o más epítopos
de región constante de anticuerpo, donde cada uno de los reactivos
se une a dichos antígenos, respectivamente y es homogéneo con
respecto a la especificidad y afinidad.
Cada uno de los reactivos puede seleccionarse
entre el grupo compuesto por un anticuerpo monoclonal quimérico que
comprende regiones variables de cadena H y L de una especie
hospedadora fusionada con genes de región constante derivados de la
misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir, un anticuerpo
monoclonal derivado de la misma especie hospedadora que el
anticuerpo a medir o un anticuerpo monoclonal derivado de una
especie relacionada con la que va a ensayarse en función de la
interreactividad inmunológica, y un polipéptido fusionado a una
región constante de anticuerpo o un fragmento del mismo derivado de
la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o relacionado
con la especie hospedadora en función de la interreacción
inmunológica.
Las características observadas anteriormente con
respecto a todos los demás métodos también se aplican a este
método.
La invención también incluye un kit para
determinar la presencia de anticuerpos, desarrollado contra más de
un antígeno, que puede estar presente en una muestra de ensayo, que
comprende: a) antígenos específicos para los anticuerpos,
respectivamente; b) conjugados directos o indirectos comprendiendo
cada uno un anticuerpo unido a un compuesto que genera señales capaz
de generar una señal detectable; y c) controles o calibradores que
comprenden reactivos donde cada uno de los reactivos comprende uno o
más epítopos de región constante de anticuerpo, se une a los
antígenos respectivos, y es homogéneo con respecto a la
especificidad y afinidad.
En este kit, cada uno de los reactivos puede
seleccionarse entre el grupo compuesto por un anticuerpo monoclonal
quimérico que comprende regiones variables de cadena H y L de una
especie hospedadora fusionadas con genes de región constante
derivados de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir,
un anticuerpo monoclonal derivado de la misma especie hospedadora
que el anticuerpo a medir, un anticuerpo monoclonal derivado de una
especie relacionada con la que se va a ensayar en función de la
interreactividad inmunológica, y un polipéptido fusionado con una
región constante de anticuerpo o un fragmento de la misma derivado
de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o
relacionado con la especie hospedadora en función de la
interreactividad inmunológica.
Las características observadas anteriormente con
respecto a otros kits también se aplican a este kit.
La Figura 1 ilustra la estructura básica de una
molécula de anticuerpo. Las dos cadenas pesadas (H) idénticas se
componen de cuatro o cinco dominios (dependiendo de la clase del
anticuerpo) y una región de bisagra, mientras que las cadenas
ligeras (L) se componen de dos dominios. El dominio terminal amino
de las cadenas H y L se denomina región variable (V) y es
responsable de la actividad de unión a antígeno. Los otros dominios
presentes en las cadenas H y L constituyen la región constante. Se
trata de una descripción de un anticuerpo quimérico de
ratón-humano ya que las regiones V de ratón se unen
a las regiones constantes humanas.
La Figura 2 representa las etapas implicadas en
el inmunoensayo tipo captura de anticuerpo automático IgG IMx Toxo
de Abbott.
La Figura 3 representa el vector de expresión de
anticuerpo pdHL2 que contiene IgG1 humana (hu C\gammal) y genes de
región constante kappa humanos (hu C\kappa) en su configuración
genómica. Ambas unidades de trascripción contienen un elemento
potenciador de cadena H de inmunoglobulina corriente arriba
(E_{H}) y un promotor de metalotioneína I de ratón (P_{MT}). La
inserción de cassettes de región V_{\kappa} (Xba
I-Bam HI) y de región V_{H} (Xho I-Hind III)
da lugar a la expresión de anticuerpo completo. El vector también
contiene un origen bacteriano de replicación (ori) y un gen
\beta-lactamasa (amp) derivado del plásmido pBR322 y un gen dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón alterado bajo el control del potenciador de la región temprana de SC40, el promotor y las secuencias señal de poliadenilación (poli A). El gen marcador DHFR permite la selección y amplifiación en células de mamíferos con metotrexato. La construcción de IgM quimérica pJH2-24-95B 1 es una versión modificada de pdHL2. En pJH2-24-95B 1, el fragmento de relleno localizado entre los sitios Xba I y Bam HI se ha reemplazado por la cassette V_{\kappa} 5-456-210 (Figura 7). Se ha sustituido la cassette V_{H} 5-456-210 (Figura 6) para el fragmento de relleno localizado entre los sitios Xho I y Hind III. Además, la IgG1 humana se ha reemplazado por un clon genómico del gen de la región constante de IgM humana (hu C\mu). El clon hu C\mu se extiende desde Spe I hasta la unión de Eco RV/Pvu II. Son abreviaturas del sitio de restricción: B, Bam HI, H.E. Eag I; EV, Eco RV; Hind III; P. Pvu II; SII, Sac II; Sal I; Sp, Spe I; Xb, Xba I y Xh, Xho I.
\beta-lactamasa (amp) derivado del plásmido pBR322 y un gen dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón alterado bajo el control del potenciador de la región temprana de SC40, el promotor y las secuencias señal de poliadenilación (poli A). El gen marcador DHFR permite la selección y amplifiación en células de mamíferos con metotrexato. La construcción de IgM quimérica pJH2-24-95B 1 es una versión modificada de pdHL2. En pJH2-24-95B 1, el fragmento de relleno localizado entre los sitios Xba I y Bam HI se ha reemplazado por la cassette V_{\kappa} 5-456-210 (Figura 7). Se ha sustituido la cassette V_{H} 5-456-210 (Figura 6) para el fragmento de relleno localizado entre los sitios Xho I y Hind III. Además, la IgG1 humana se ha reemplazado por un clon genómico del gen de la región constante de IgM humana (hu C\mu). El clon hu C\mu se extiende desde Spe I hasta la unión de Eco RV/Pvu II. Son abreviaturas del sitio de restricción: B, Bam HI, H.E. Eag I; EV, Eco RV; Hind III; P. Pvu II; SII, Sac II; Sal I; Sp, Spe I; Xb, Xba I y Xh, Xho I.
La Figura 4 muestra una representación en forma
de diagrama de las etapas claves implicadas en la generación de la
construcción de expresión
pJH2-24-29B1. Este vector de
expresión codifica un anticuerpo IgM quimérico de
ratón-humano compuesto por regiones V de cadena H y
L del hibridoma de ratón 5-465-210 y
genes de región constante humanos. El anticuerpo quimérico es
específico para P30 de T. gondii.
La Figura 5 representa un resumen de la
estrategia usada para construir el vector de expresión
pJH3-19-95A. Esta construcción de
expresión codifica un anticuerpo IgM quimérico de
ratón-humano con regiones V de cadena H y L
derivadas del hibridoma de ratón
1-706-139 y genes de región
constante humanos. Este anticuerpo IgM quimérico se une
selectivamente a P66 de T. gondii.
La Figura 6 ilustra la secuencia de nucleótidos
de la cassette V_{H} que contiene el ADNc de V_{H} clonado a
partir del hibridoma 5-465-210
(véase SEC ID Nº: 2). Esta secuencia de aminoácidos deducida se
indica mediante un símbolo en la parte inferior de una sola letra
(véase SEC ID Nº: 1). El primer aminoácido de la proteína madura se
denomina (+1), el punto de unión de J_{H}2 a la región constante
se indica mediante una flecha, y las regiones que determinantes
complementarias (CDR) se indican como se define por Kabat E.A. et
al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª
edición, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD
(1991)). El cebador de sentido degenerado se usó para amplificar por
PCR este fragmento V_{H} a partir de ADNc extendido al nucleótido
41. Otras características para observar: (1-39),
cebador de transferencia de sentido con sitio de clonación
(Xho I); (16-72), secuencia líder;
(73-366), gen V de cadena H;
(367-384), secuencia D de cadena H;
(385-429), minigen J_{H}2 de cadena H;
(430-447), secuencia del sitio de unión y sitio de
clonación Hind III derivado del cebador de transferencia
antisentido.
La Figura 7 representa la secuencia de
nucleótidos de la cassette V_{L} que contiene el ADNc V_{\kappa}
clonado a partir del hibridoma
5-465-210 (véase SEC ID Nº: 4). La
secuencia de aminoácidos deducida se indica mediante un símbolo de
una letra (véase SEC ID Nº: 3). El primer aminoácido de la proteína
madura se denomina (+1), el punto unión de J\kappa2 y del gen
C_{\kappa} se indica mediante una fecha, se indican las CDR
denominadas como en la Fig. 6. El cebador de sentido se usó para
amplificar por PCR la región V_{\kappa} a partir del ADNc
extendido a la posición 45. Secuencias adicionales para observar:
1-(40) secuencias del cebador de transferencia de sentido incluyendo
el sitio de clonación Xba I; (17-76)
secuencia líder; (77-373), gen V de cadena \kappa;
(374-409), minigen-J_{\kappa};
(410-428), secuencia del sitio de unión y sitio de
clonación Bam HI incorporado en el cebador de transferencia
antisentido.
La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos
de la cassette V_{H} que contiene el ADNc de V_{H} clonado a
partir del hibridoma 1-706-139
(véase SEC ID Nº: 6). La secuencia de aminoácidos deducida se
muestra mediante un símbolo de una letra (véase SEC ID Nº: 5). El
primer aminoácido de la proteína madura se denomina (+1), el punto
de unión entre J_{H}4 y la región constante se marca con una
flecha y se indican las CDR determinadas en la Fig. 6. El cebador
degenerado (sentido) se usó para amplificar por PCR el ADNc de
V_{H} extendido a la posición 41. Las características adicionales
que deben observarse incluyen: (1-35), cebador de
transferencia de sentido que incluye el sitio de clonación
Xho I y el extremo 5' de la secuencia líder,
(12-68) secuencia líder; (69-362),
gen V de cadena H; (363-380), presunta secuencia de
minigen D*; (381-434) minigen de J_{H}4;
(434-452) sitios unión y de clonación Hind
III incorporados en el cebador de transferencia antisentido. * No
puede determinarse el límite exacto entre los minigenes D y J.
La Figura 9 representa la secuencia de
nucleótidos de la cassette V_{L} que contiene la región
V_{\kappa} clonada a partir de hibridoma
1-706-139 (véase SEC ID Nº: 8). La
secuencia de aminoácidos deducida se da forma de una única letra
(véase SEC ID Nº: 7). El primer aminoácido de la proteína madura se
indica como (+1), el punto de unión entre minigen J_{k} 1 y el
G_{\kappa} se identifica con una flecha, y se designan las CDR
determinadas como en la Fig. 6. El extremo 3' del cebador de sentido
degenerado usado para la amplificación de PCR de la región
V_{\kappa} a partir de ADNc está en la posición 42. Otras
características incluyen: (1-39), secuencia del
cebador de transferencia de sentido que incorpora el sitio de
clonación Xba I y las secuencias líderes 5';
(13-69) secuencias líder; (70-368),
gen V \kappa; (369-405), minigen de J_{\kappa}1;
(406-424) los sitios de unión y sitios de clonación
Bam HI incorporados en el cebador de transferencia
antisentido.
La figura 10 muestra una curva de calibración
para la IgG quimérica anti-P66 comparada con el
calibrador derivado del suero humano positivo en el ensayo IgG IMx
Toxo. El recuento de proporción (cuentas/seg/seg) se muestra en el
eje Y.
La Figura 11 ilustra una curva de calibración
obtenida para el anticuerpo IgM quimérico anti-P66
comparado con el calibrador derivado de suero humano positivo en el
ensayo IgM IMx Toxo. El calibrador de índice de 710 proporciones
(recuento de proporción = cuentas/seg/seg) se ajustó mediante la IgM
quimérica anti-P66 a una concentración de 12,3
\mug/ml.
La Figura 12 representa una curva de calibración
para la IgG quimérica anti-P30 comparada con el
suero humano positivo usado actualmente como el calibrador en el
ensayo IgG IMx Toxo. El recuento de proporción (cuentas/seg/seg) se
muestra en el eje Y.
La Figura 13 ilustra una curva de dilución
establecida en el IMx para el anticuerpo IgM quimérico
anti-P30 junto con el suero humano positivo para los
calibradores. El calibrador de índice de 560 proporciones (recuento
de proporción = cuentas/seg/seg) se ajustó satisfactoriamente
mediante la IgM quimérica anti-P30 a una
concentración de 8,4 \mug/ml.
La Figura 14 representa un análisis de
estabilidad acelerada realizada en todos los reactivos a 45ºC en el
calibrador de nivel B (0,0036 mg/ml de anti-P30 +
0,010 mg/ml de anti-P66). No se observó ninguna
diferencia para los anticuerpos recombinantes IgG quiméricos
comparados con el calibrador de suero humano. Sin embargo, el día
12, el 40% del epítopo P30 en las micropartículas no se reconoce
más mediante el anticuerpo quimérico anti-P30. r =
reactivos de ensayo; c = calibrador.
La Figura 15 muestra un análisis de estabilidad
acelerada de reactivos almacenados a 45ºC usando diluciones del
calibrador F (0,11 mg/ml de anti-P30 + 0,305 mg/ml
de anti-P30). No se observó ninguna diferencia para
los anticuerpos recombinantes IgG quiméricos comparados con el
calibrador de suero humano. Sin embargo, al día 12, 40% del epítopo
P30 en la micropartículas no se reconoce más mediante el anticuerpo
quimérico anti-P30. r = reactivos de ensayo; c =
calibrador.
La Figura 16 ilustra una comparación de mezcla de
anticuerpos monoclonales equivalentes al calibrador B (0,0037 mg/ml
de IgG1 anti-P30 + 0,020 mg/ml de IgG1
anti-P66) o calibrador F (0,011 mg/ml de IgG1
anti-P30 y 0,61 mg/ml de IgG1 quimérica
anti-P66) con calibradores (cals) fabricado con 7
lotes de antígeno independientes frente al suero humano positivo
(Ag) r = reactivos de ensayo; c = calibrador.
La presente invención se refiere a un método para
usar reactivos como calibradores (patrones) y/o controles en kits y
ensayos diagnósticos. Más específicamente, puede usarse uno o más de
estos reactivos en lugar de plasma o suero en la producción de
calibradores y controles para kits y ensayos diagnósticos diseñados
para medir cualitativa o cuantitativamente anticuerpos específicos
para un ligando deseado. Los reactivos se auto-unen
específicamente a una ligando predeterminado, contienen uno o más
epítopos de región constante de anticuerpo, y son uniformes en
especificidad y afinidad. Los reactivos pueden producirse
continuamente mediante el uso de hibridoma y/o técnica de ADN
recombinante.
Existen varias realizaciones del reactivo
identificado anteriormente. Estas realizaciones son, por ejemplo,
las que siguen:
1) un anticuerpo monoclonal quimérico que
comprende regiones variables de cadena H y L de una especie
hospedadora fusionada con los genes de región constante derivados de
la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir;
2) un anticuerpo monoclonal derivado de la misma
especie hospedadora que el anticuerpo a medir;
3) un anticuerpo monoclonal derivado de una
especie relacionada con la que va a ensayarse en función de la
interreactividad inmunológica; y
4) un polipéptido que se une específicamente a un
ligando predeterminado fusionado a una región constante de
anticuerpo o a alguna parte de una región constante de la especie
hospedadora deseada.
A continuación, las realizaciones mencionadas
anteriormente se describen con detalle:
En esta realización de la invención, el reactivo
o los reactivos usados como calibrador o control en el ensayo o kit
diagnóstico son una molécula de anticuerpo monoclonal quimérico que
comprende regiones V de cadena H y L de una especie hospedadora
fusionada a genes de región constante de cadena H y L de otra
especie hospedadora. Las regiones V de cadena L y H pueden derivarse
de cualquier vertebrado que producta anticuerpos, incluyendo, pero
sin limitación: roedor (por ejemplo, ratón, hámster, rata), pollo,
conejo, canino, felino, bovino, equino, porcino, simio (por ejemplo
chimpancé) y ser humano. La fuente de las regiones V de anticuerpo,
y el método mediante el cual se derivan se basa principalmente en
las ventajas y tecnologías conocidas por el especialista en la
técnica. Por ejemplo, las regiones V de cadena H y L (que comprenden
la parte de la molécula de anticuerpo responsable de la actividad de
unión a ligando) puede aislarse a partir de: células B sencillas,
hibridomas de célula B, células B propagadas in vitro, o
células B propagadas in vivo, por ejemplo, células B humanas
de ratones SCID (Simonsson, A.C. et al., Bio/Tecniques
18(5):862-869 (1995); Banchereau, J. et
al., Science 251:70-72 (1991); Amoroso, K. y
Lipsky, P.E., J. Immunol. 145:3155-3161 (1990);
Duchosal, M.A. et al., Nature 355:258-262
(1992)). Las regiones V de anticuerpo pueden clonarse por
procedimientos convencionales conocidos en la técnica, o mediante
modificaciones de estos procedimientos. Por ejemplo, las regiones V
pueden clonarse de acuerdo con el proceso descrito en el ejemplo III
que se muestra más adelante.
Como alternativa, los conjuntos de región V de
cadena H y L de anticuerpo con actividad de unión deseada pueden
seleccionarse mediante expresión como, por ejemplo, fragmentos Fab
(heterodímeros de V_{H} y el primer dominio de la región constante
de cadena pesada, y la cadena ligera completa), fragmentos Fv
(heterodímeros de los dominios de región V de cadena H y L) o Fv de
cadena sencilla (heterodímeros de dominios V_{H} y V_{L}
conectados por un engarce peptídico), en bacterias, por ejemplo
E. coli, o pueden seleccionarse mediante el uso de
bibliotecas combinatorias expresadas en el fago lambda, en la
superficie del bacteriófago, en la superficie de bacterias, o pueden
seleccionarse por exposición en otro sistema biológico (por ejemplo,
retrovirus o polisoma) o sistema no biológico (Better M. et
al., Science, 240-1041-1043
(1988); Skerra, A. y Pluckthun, A., Science,
240:1038-1041 (1988); Huse, W.D. et al.,
Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty, J et
al., Nature 348:552-554 (1990); Kang, A.S. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88:
4363-4366 (1991); Fuchs P. et al.,
Bio/Technology 9:1369-1372 (1991); Francisco, J.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
90:10444-10448 (1993); Mattheakis, L.C. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
91:9022-9026 (1994)). Las bibliotecas pueden estar
compuestas por: regiones V nativas aisladas de un hospedador
inmunizado o no inmunizado, regiones V sintéticas o
semi-sintéticas o regiones V modificadas (Marks,
J.D. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597
(1991); Barbas, C.F. III et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
Estados Unidos 89:4457-4461 (1992)). Ejemplos de
este último incluyen afinado de la especificidad y/o afinidad o
mutagénesis in vitro.
La propiedad más crítica de la combinación de
región V de anticuerpo (H y L) es que forma un sitio de unión con
las propiedades deseadas de especificidad y afinidad para el
ligando. La especificidad y afinidad requeridas se dictarán por el
uso intencionado, y dependiendo de características tales como el
formato del ensayo y la características de actuación deseadas (por
ejemplo, sensibilidad, especificidad, precisión y paralelismo). Por
ejemplo, si se requiere un calibrador o anticuerpo de control
específico para un epítopo inmunodominante particular (ligando)
sobre un antígeno, para imitar la respuesta serológica in
vivo, el conjunto de región V de cadena H y L usado para generar
el anticuerpo quimérico puede elegirse en esta base.
Los genes de región constante de anticuerpo
pueden derivarse de cualquier especie de vertebrado incluyendo, pero
sin limitación, roedor (por ejemplo, ratón, hámster, rata), pollo,
conejo, canino, felino, bovino, equino, porcino, simio (por
ejemplo chimpancé) y ser humano. La elección de la especie
hospedadora se dicta por el propósito deseado. La región constante
de anticuerpos procede de la misma especie hospedadora o de una que
está muy relacionada con el anticuerpo a medir.
Los anticuerpos monoclonales quiméricos pueden
producirse mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Por
ejemplo, los anticuerpos quiméricos pueden generarse por
recombinación homologa dirigida (Pell, H.P. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:8507-8511
(1989)): Como alternativa, los genes de región V de cadena H y L de
anticuerpo pueden clonarse en un vector o vectores de expresión de
mamífero que contienen los genes de región constante de cadena H y L
derivados de una especie hospedadora diferente. La introducción de
la construcción o construcciones de expresión en células
hospedadoras apropiadas da lugar a la producción de anticuerpos
quiméricos completos de una especificidad definida (Morrison, S.L:
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81:
6851-6855 (1984)). Se han descrito muchos vectores
de expresión de anticuerpo eucarióticos que se integran establemente
o que existen como elementos extracromosómicos y son conocidos para
los especialistas habituales en la técnica. Las unidades de
trascripción de cadena H y L pueden introducirse en la célula
hospedadora de forma individual en plásmidos separados o
conjuntamente en el mismo vector.
Un ejemplo de un vector de expresión de
anticuerpo es el plásmido pdHL2 (Figura 3), que contiene IgG1 humana
(hu C\gammal) y genes de región constante kappa humana (hu
C_{k}) en su configuración genómica (Gillies, S.D. et al.,
J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989)). Ambas
unidades de trascripción contienen un elemento potenciador de cadena
H de inmunoglobulina corriente arriba (E_{H}) y un promotor de
metalotioneína I de ratón. La inserción de cassette de región
V_{\kappa} y de región V_{H} da lugar a la expresión del
anticuerpo completo. Cada cassette de gen V incluye una secuencia
líder de inmunoglobulina 5' y un sitio donador de unión 3' del gen
V. El vector también contiene un origen bacteriano de replicación y
un gen \beta-lactamasa derivado del plásmido
pBR322 y un gen dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón alterado
bajo el control del potenciador de la región temprana de SV40, el
promotor y las secuencia señal de poliadenilación. El gen marcador
DHFR permite la selección y amplificación en células de mamíferos
con metotrexato.
Los vectores de expresión usados para producir
anticuerpos quiméricos pueden modificarse para contener cualquier
gen o genes de región constante (por ejemplo en seres humanos:
\kappa, \lambda, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2,
IgE) aislados a partir de cualquier especie de vertebrado que
fabrica anticuerpos, incluyendo pero sin limitación: roedor (por
ejemplo, ratón, hámster, rata), pollo, conejo, canino, felino,
bovino, equino, porcino, simio (por ejemplo chimpancé) y ser humano.
Por definición, la especie hospedadora a partir de la cual las
regiones V de cadena H y L se derivan será diferente de aquélla a
partir de la cual se derivan las regiones constantes de
anticuerpos.
Dependiendo del sistema de vector utilizado,
muchas líneas celulares inmortalizadas diferentes pueden servir como
hospedadores útiles, éstas incluyen pero sin limitación: mieloma
(por ejemplo, X63-Ag8.653), hibridoma
(sp2/0-Ag 14), linfoma y células de Ovario de
Hámster Chino (CHO). Las construcciones de expresión pueden
introducirse usando una variedad de técnicas, incluyendo pero sin
limitación, precipitación de fosfato cálcico, fusión de
protoplastos, lipofección, vectores lanzadera derivados de
retrovirus y electroporación. Una expresión adecuada conduce a la
secreción del anticuerpo recombinante en el medio. Como alternativa,
las células pueden lisarse y posteriormente el anticuerpo se
purifica.
Las moléculas de anticuerpo quimérico o
fragmentos de las mismas también podrían producirse en otros
sistemas, incluyendo, pero sin limitación: baculovirus, levadura,
bacterias tales como E. coli y sistemas de células libres
in vitro tales como lisado de reticulocitos de conejo
(Hasemann, C. y Capra., J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
87:3942-3946 (1990); Horwitz, A.H. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:8678-8682
(1988); Pluckthun, A., Bio/Technology 9:545-551
(1991); Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268(7):
5302-5308 (1993)).
En resumen, un anticuerpo monoclonal quimérico
comprende al menos dos (por ejemplo IgG) y hasta 10 (por ejemplo,
IgM pentamérico) sitios de unión idénticos derivados de las regiones
V de cadena H y L de una especie hospedadora unida a las regiones
constantes del anticuerpo de cadena H y L de otra especie
hospedadora. Las regiones V de cadena H y L son responsables de la
especificidad y afinidad de la unión al ligando deseado. La fuente
de las regiones constantes de cadena H y L se determina mediante la
especie hospedadora del anticuerpo a medir, en el sentido de que es
preferiblemente idéntico a ésta. Las regiones constantes no tienen
actividad de unión a ligando, pero proporcionan epítopos
serológicamente identificables (ligandos) específicos para la región
constante particular, proporcionando, de esta forma, un medio para
diferenciarlos de otras regiones constantes. La expresión de los
genes cadena H y L que codifican los anticuerpos quiméricos en, por
ejemplo, una célula hospedadora inmortalizada tal como
Sp2/0-Ag 14, da lugar a la producción de anticuerpo
quimérico monoclonal de especificidad y afinidad predeterminada y
uniforme. De esta forma, se proporciona una fuente continua de
anticuerpo quimérico con regiones V de una especificidad de unión
definida sencilla, y epítopos de región constante de cadena H y L.
Uno o más de estos reactivos podría ser útil como calibradores y/o
controles en ensayos y kits diagnósticos diseñados para medir
cualitativa o cuantitativamente niveles de anticuerpo
específico.
Un ejemplo particular de esta realización, es un
anticuerpo quimérico recombinante que contiene regiones V de cadena
H y L murinas fusionadas a regiones constantes de cadena H y L para
uso como calibrador y/o control. Esta realización de la invención se
ilustra con detalle en los ejemplos que se presentan después de la
descripción de la realización (4).
En esta realización de la invención, los
anticuerpos monoclonales pueden derivarse de cualquier vertebrado,
especie de mamífero o de otra forma que produzca anticuerpos tales
como: roedor (es decir, ratón, hámster, rata), pollo, conejo,
canino, felino, bovino, equino, porcino, simio y ser humano. La
especie hospedadora elegida está de acuerdo con el propósito deseado
del ensayo o kit.
Por ejemplo, si los anticuerpos humanos se están
midiendo, los anticuerpos monoclonales pueden establecerse a partir
de células B humanas mediante tecnología de hibridoma tradicional
como heterohibridomas de ratón: humanas, hibridomas humanas:humanas,
o mediante otros medios de inmortalización tales como por infección
del virus Epstein-Barr (Nowinski, R. et al.,
Science 210:537-539 (1980); Olsson, L. y Kaplan,
H.S., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
77:5429-5431 (1988); Rosen A. M., et al.,
Nature 267:52-54 (1977)). La creación reciente de
ratones transgénicos que llevan clones genómicos de parte de los
sitios de inmunoglobulina de cadena H y L humana proporciona la
oportunidad de establecer también hibridomas de ratón:ratón que
segregan anticuerpos humanos monoclonales de especificidades
deseadas (Lonberg, N. et al., Nature
368:856-859 (1994); Green L.L. et al., Nature
Genetics 7:13-21 (1994)).
Los anticuerpos humanos también pueden crearse
mediante el uso de tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, las
regiones V de cadena H y L (que comprenden la parte la molécula de
anticuerpo responsable de la actividad de unión a ligando) pueden
aislarse a partir de células B sencillas, células B humanas
propagadas in vitro o células B humanas propagadas en ratones
SCID (Simonsson, A.C. et al., Bio/Techniques
18(5):862-869 (1995); (Banchereau, J. et
al., Science 251:70-72 (1991); Amoroso, K. y
Lipsky, P.E., J. Immunol. 145:3155-3161 (1990);
Duchosal, M.A., et al., Nature 355:258-262
(1992)). Las regiones V de anticuerpo pueden clonarse mediante
procedimientos convencionales conocidos en la técnica, o por
modificaciones de estos procedimientos. Por ejemplo, las regiones V
pueden clonarse de acuerdo con el proceso descrito más adelante en
el Ejemplo III. Como alternativa, el conjunto de regiones de cadena
H y L humanas con actividad de unión deseada puede seleccionarse
como, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fv o Fv de cadena
sencilla, por expresión en bacterias, por ejemplo E. coli o
seleccionadas mediante el uso de bibliotecas combinatorias
expresadas en el fago lambda, en la superficie de bacteriófagos, en
la superficie de bacterias o pueden seleccionarse por exposición en
cualquier otro sistema biológico (por ejemplo retrovirus o polisoma)
o sistema no biológico (Better M. et al., Science,
240-1041-1043 (1988); Skerra, A. y
Pluckthun, A., Science, 240:1038-1041 (1988); Huse,
W.D. et al., Science 246:1275-1281 (1989);
McCafferty, J et al., Nature 348:552-554
(1990); Kang, A.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 88: 4363-4366 (1991); Fuchs P. et al.,
Bio/Technology 9:1369-1372 (1991); Francisco, J.,
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos
90:10444-10448 (1993); Mattheakis, L.C. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
91:9022-9026 (1994)). Las bibliotecas de anticuerpo
pueden consistir en: regiones V nativas de regiones V humanas
inmunizadas o no inmunizadas, sintéticas o semisintéticas, o
regiones V modificadas (Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991); Barbas, C.F. III et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:4457-4461
(1992)). Ejemplos de estas últimas incluyen afinado de especificidad
y/o afinidad mediante mutagénesis in vitro. La base primaria
para seleccionar las regiones V se basan en sus características de
unión a ligando.
Si los anticuerpos humanos se están midiendo, los
genes de región V de cadena H y L humana se clonan en un vector de
expresión de mamíferos que contiene genes de región constante de
cadena H y L humanos. La introducción de la construcción o
construcciones de expresión en células hospedadoras adecuadas da
lugar a la producción de anticuerpos humanos completos de una
especificidad definida (Dorai. H., et al., Hybridoma
11(5):667-675 (1992)). Se han descrito muchos
vectores de expresión eucarióticos para anticuerpos que se integran
establemente o que existen como elementos extracromosómicos y estos
son conocidos para los especialistas habituales en la técnica. Las
unidades de trascripción de cadena H y L pueden introducirse en la
célula hospedadora de forma individual en plásmidos separados o
conjuntamente en el mismo vector.
Un ejemplo de un vector de expresión adecuado es
el plásmido pdHL2 (Figura 3), que contiene genes de IgG1 humana (hu
C\gammal) y de región constante kappa humana (hu C\kappa) en su
configuración genómica (Gillies, S.D. et al., J. Immunol.
Methods 125:191-202 (1989)). Ambas unidades de
transcripción contienen un elemento potenciador de cadena H de
inmunoglobulina corriente arriba (E_{H}) y promotor de
metalotioneína I de ratón. La inserción de la cassette de región
V\kappa y de región V_{H} da lugar a la expresión de anticuerpos
completos. Cada cassette del gen V incluye una secuencia líder de
inmunoglobulina 5' y un sitio donador de unión 3' del gen V. El
vector también contiene un origen bacteriano de replicación y gen
\beta-lactamasa derivado del plásmido pBR322 y un
gen dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón alterado bajo el control
del potenciador de la región temprana de SV40, el promotor y las
secuencias señal de poliadenilación. El gen marcador DHFR permite la
selección y amplificación en células de mamíferos con
metotrexato.
Los vectores de expresión de anticuerpos pueden
modificarse para contener cualquiera de los genes de región
constante (en el caso de seres humanos: \kappa, \lambda, IgM,
IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAI, IgA2, IgE) aislados a partir de
cualquier especie de vertebrado que fabrique anticuerpos, incluyendo
pero sin limitación: roedor (por ejemplo, ratón, hámster, rata),
pollo, conejo, canino, felino, bovino, equino, porcino, simio (por
ejemplo chimpancé), y ser humano. Asimismo, las regiones V de cadena
H y L de anticuerpo pueden aislarse a partir de cualquier especie de
vertebrado que fabrique anticuerpos, incluyendo, pero sin
limitación: roedor (por ejemplo, ratón, hámster, rata), pollo,
conejo, canino, felino, bovino, equino, porcino, simio (por ejemplo
chimpancé) y ser humano. La introducción de regiones V de cadena H y
L en un vector de expresión de anticuerpo que contiene regiones
constantes de cadena H y L derivadas de la misma especie
hospedadora, da lugar a la formación de anticuerpos monoclonales
recombinantes. De esta forma, los anticuerpos monoclonales de
cualquier clase o subclase pueden producirse a partir de cualquier
especie de vertebrado que fabrique anticuerpos mediante el uso de
ADN recombinante, hibridoma o una combinación de estas tecnologías.
La especie hospedadora elegida está de acuerdo con el propósito
deseado del ensayo.
Dependiendo del vector o vectores de expresión,
muchas líneas celulares inmortalizadas diferentes pueden servir como
hospedadores adecuados, éstas incluyen, pero sin limitación:
mieloma, (por ejemplo, X63-Ag8.653), hibridoma
(Sp2/0-Ag14), linfoma y células de Ovario de Hámster
Chino (CHO). Las construcciones de expresión pueden introducirse
usando una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación,
precipitación de fosfato cálcico, fusión de protoplastos,
lipofección, vectores lanzadera derivados de retrovirus y
electroporación. Una expresión adecuada conduce a secreción del
anticuerpo recombinante en el medio. Como alternativa, las células
pueden lisarse y el anticuerpo puede purificarse posteriormente.
Las moléculas de anticuerpo o fragmentos de los
mismos también podrían producirse en otros sistemas, incluyendo,
pero sin limitación: baculovirus, levadura, bacterias tales como
E. coli y sistemas en células libres in vitro tales
como lisado de reticulocitos de conejo (Hasemann, C. y Capra., J.D.
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:3942-3946
(1990); Horwitz, A.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 85:8678-8682 (1988); Pluckthun, A.,
Bio/Technology 9:545-551 (1991); Nicholls et
al., J. Biol. Chem. 268(7): 5302-5308
(1993)).
Los anticuerpos monoclonales producidos por
hibridoma, ADN recombinante o por una combinación de estas
tecnologías pueden contener al menos dos (por ejemplo IgG) y hasta
10 (por ejemplo IgM pentamérico) sitios de unión idénticos con
especificidad y afinidad al ligando deseado determinado por las
regiones V de cadena H y L. Los anticuerpos completos contienen las
regiones constantes de cadena H y L entera y, de esta forma, todos
los epítopos antigénicos asociados. Además, los anticuerpos son
monoclonales, por lo que son de especificidad y afinidad definida
sencilla y pueden producirse en cantidades ilimitadas. Pueden usarse
uno o más de estos reactivos como calibradores y/o controles en
ensayos y kits diagnósticos diseñados para medir cualitativa o
cuantitativamente niveles de anticuerpo específico.
Una realización adicional de la invención incluye
un anticuerpo monoclonal derivado de una especie muy relacionada a
la que se está ensayando. La relación de las especies se define en
función de la interreactividad inmunológica de los epítopos de
región constante. Al menos un epítopo de región constante es el
mismo o sustancialmente el mismo que el de la especie que se está
ensayando. El epítopo o epítopos compartidos pueden no ser
químicamente idéntico, pero presentan un parecido químico en la
estructura 3-dimensional. Los anticuerpos
monoclonales pueden derivarse de cualquier especie de vertebrado, de
mamífero o de otro tipo que fabrique anticuerpos tales como: roedor
(por ejemplo, ratón, hámster, rata), pollo, conejo, canino, felina,
bovino, equino, porcino, simio y ser humano. La especie hospedadora
elegida está de acuerdo con el propósito deseado del ensayo y en
función de la reactividad con el reactivo que se une específicamente
a uno o a más epítopos de región constante de la especie del
anticuerpo a ensayar.
Por ejemplo, si se está midiendo el anticuerpo
humano, un anticuerpo monoclonal generado a partir de otro primate
tal como el chimpancé, puede ser suficiente como calibrador o
control. Las diferencias en el nivel molecular entre secuencias de
región constante de anticuerpo de chimpancé y humanas son más o
menos equivalentes a los que se encuentran entre alotipos de ser
humano (Ehrlich, P.H. et. al., Hum. Antibod. Hybridomas
1:23-26 (1990); Ehrlich, P.H. et al., Mol.
Immunol. 28:319-322 (1991)). Los anticuerpos
monoclonales pueden proceder del chimpancé mediante el uso del
hibridoma o de la tecnología de ADN recombinante. En este último
caso, las regiones V de cadena H y L (que comprenden la parte de la
molécula de anticuerpo responsable de la actividad de unión a
ligando) pueden aislarse a partir de células B de chimpancé
sencillas, células B de chimpancé propagadas in vitro o in
vivo (por ejemplo, ratones SCID). Las regiones V de anticuerpo
pueden clonarse por procedimientos convencionales conocidos en la
técnica o por modificaciones de estos procedimientos. Por ejemplo,
las regiones V pueden clonarse de acuerdo con el proceso descrito
más adelante en el Ejemplo III.
Como alternativa, los conjuntos de región V de
cadena H y L de chimpancé con actividad de unión deseada pueden
seleccionarse como, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fv o Fv
monocatenario, por expresión en bacterias, por ejemplo, E.
coli o pueden seleccionarse mediante el uso de bibliotecas
combinatorias expresadas en el fago lambda, o en la superficie del
bacteriófago, en la superficie de bacterias, o puede seleccionarse
por exposición en cualquier sistema biológico (por ejemplo,
retrovirus o polisoma) o no biológico (Better M. et al.,
Science, 240-1041-1043 (1988);
Skerra, A. y Pluckthun, A., Science, 240:1038-1041
(1988); Huse, W.D. et al., Science
246:1275-1281 (1989); McCafferty, J et al.,
Nature 348:552-554 (1990); Kang, A.S. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88: 4363-4366
(1991); Fuchs P. et al., Bio/Technology
9:1369-1372 (1991); Francisco, J., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:10444-10448
(1993); Mattheakis, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
Estados Unidos 91:9022-9026 (1994)). Las bibliotecas
de anticuerpo pueden estar compuestas de: regiones V nativas de un
chimpancé inmunizado o no inmunizado, regiones V sintéticas o
semisintéticas, o regiones V de chimpancé modificado. Los ejemplos
de este último incluyen afinado de especificidad y/o afinidad por
mutagénesis in vitro. Las bases principales para seleccionar
las regiones V se basa en sus características de unión a
ligando.
Los genes de región V de cadena H y L de
chimpancé pueden clonarse en un vector de expresión de mamífero que
contienen genes de región constante de chimpancé. La introducción de
la construcción o construcciones de expresión en células
hospedadoras adecuadas da lugar a la producción de anticuerpos de
chimpancé completos de una especificidad definida. Se han descrito
muchos vectores de expresión eucarióticos para anticuerpos que se
integran de forma estable o que existen como elementos
extracromosómicos, y estos son conocidos para los especialistas
habituales en la técnica. Las unidas de trascripción de cadena L y H
pueden introducirse en la célula hospedadora de forma individual en
plásmidos separados o conjuntamente en el mismo vector.
Un ejemplo de un vector de expresión que puede
modificarse para expresar anticuerpos de chimpancé es el plásmido
pdHL2 (Figura 3). Este vector contiene genes de IgG1 humana (hu
C\gammal) y de región constante kappa humana (hu C\kappa) en su
configuración genómica (Gillies, S.D. et al., J. Immunol.
Methods 125:191-202 (1989)). Ambas unidades de
trascripción contienen un elemento potenciador de cadena H de
inmunoglobulina corriente arriba (EH) y el promotor de
metalotioneína I de ratón. La inserción de las cassettes de región
V\kappa y de región V_{H} da lugar a la expresión de anticuerpo
completo. Cada cassette del gen V incluye una secuencia líder de
inmunoglobulina 5' y un sitio donador de unión 3' del gen V. El
vector también contiene un origen bacteriano de replicación y un gen
\beta-lactamasa derivado del plásmido pBR322 y un
gen dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón alterado bajo el control
del potenciador de la región temprana de SV40, el promotor y las
secuencias señal de poliadenilación. El gen marcador DHFR permite la
selección y amplificación en células de mamífero con
metotrexato.
Los vectores de expresión de anticuerpo pueden
modificarse para contener cualquiera de los genes de región
constante (en el caso de los seres humanos: \kappa, \lambda,
IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE) aislados a partir
de cualquier especie de vertebrado que produzca anticuerpos,
incluyendo, pero sin limitación: roedor (por ejemplo, ratón,
hámster, rata), pollo, conejo, canino, felino, bovino, equino,
porcino, simio (por ejemplo chimpancé), y ser humano. Asimismo, las
regiones V de cadena H y L de anticuerpo pueden aislarse a partir de
cualquier especie de vertebrado que fabrique anticuerpos,
incluyendo, pero sin limitación: roedor, (por ejemplo, ratón,
hámster, rata), pollo, conejo, canino, felino, bovino, equino,
porcino, simio (por ejemplo chimpancé) y ser humano. La introducción
de regiones V de cadena H y L en un vector de expresión de
anticuerpo que contiene regiones constantes de cadena H y L
derivadas de la misma especie hospedadora da lugar a la formación de
anticuerpos monoclonales recombinantes. De esta forma, los
anticuerpos monoclonales de cualquier clase o subclase pueden
producirse a partir de cualquier especie de vertebrado que fabrique
anticuerpos mediante el uso de ADN recombinante, hibridoma, o una
combinación de estas tecnologías. La especie hospedadora elegida
está de acuerdo con el propósito deseado del ensayo.
Dependiendo del sistema del vector, muchas líneas
celulares inmortalizadas diferentes pueden servir como hospedadores
adecuados. Éstas incluyen, pero sin limitación: mieloma (por ejemplo
X63-Ag8.653), hibridoma
(Sp2/0-Ag14), linfoma y células de Ovario de Hámster
Chino (CHO). Las construcciones de expresión pueden introducirse
usando una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación,
precipitación de fosfato cálcico, fusión de protoplastos,
lipofección, vectores lanzadera derivados de retrovirus y
electroporación. Una expresión adecuada conduce a la secreción del
anticuerpo del chimpancé recombinante en el medio. Como alternativa,
las células pueden lisarse y posteriormente el anticuerpo puede
purificarse.
Las moléculas de anticuerpo o fragmentos de los
mismas también podrían producirse en otros sistemas, incluyendo,
pero sin limitación: baculovirus, levadura, bacterias tales como
E. coli, y sistemas en células libres in vitro tales
como lisado de reticulocitos de conejo (Hasemann, C. y Capra., J.D.
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:3942-3946
(1990); Horwitz, A.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 85:8678-8682 (1988); Pluckthun, A.,
Bio/Technology 9:545-551 (1991); Nicholls et
al., J. Biol. Chem. 268(7): 5302-5308
(1993)).
Los anticuerpos monoclonales producidos por
hibridoma, ADN recombinante u otra combinación de estas tecnologías
pueden contener al menos dos (por ejemplo IgG) y hasta 10 (IgM
pentamérico) y sitios de unión idénticos con especificidad y
afinidad para el ligando deseado determinado por las regiones V de
cadena H y L. Los anticuerpos completos contienen las regiones
constantes de cadena H y L enteras y, de esta forma, todos los
epítopos antigénicos asociados. Sin embargo, los anticuerpos son
monoclonales, y de esta forma, son de una especificidad y afinidad
definida sencilla y pueden producirse en cantidades ilimitadas.
Pueden usarse uno o más de estos reactivos como calibradores y/o
controles en ensayos y kits diagnósticos diseñados para medir
cualitativa o cuantitativamente niveles de anticuerpo
específico.
Una cuarta realización de la invención se refiere
a un polipéptido capaz de unirse específicamente a un ligando
predeterminado fusionado con una región constante de anticuerpo o
con alguna parte de una región constante de anticuerpo (uno o más
dominios de región constante o uno o más epítopos individuales
derivados de la región constante de anticuerpo) de la especie
hospedadora deseada. Esto incluye cualquiera de las siguientes
fusiones a toda o a parte de una región constante de anticuerpo de
cualquier especie deseada: (1) polipéptido cortos, tales como uno
derivado de una CDR de una molécula de anticuerpo o los
seleccionados en función de la especificidad de ligando mediante el
uso de, por ejemplo, tecnología de exposición de fago; (2) un
dominio de anticuerpo derivado del mismo tal como un minicuerpo; (3)
fragmentos Fv; y (4) fragmentos Fv monocatenarios (Levi, M. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
90:4374-4378 (1993); Smith, G.P. Science
228:1315-1317 (1985); Martin, F. et al., EMBO
J. 13(22):5303-5309 (1994)). Esta molécula
puede consistir en una o más cadenas polipeptídicas. Esta
realización puede producirse fácilmente usando una amplia variedad
de vectores bacterianos bien conocidos en la técnica. Los fragmentos
de anticuerpos y derivados de los mismos también puede producirse en
otros sistemas hospedadores no limitados pero que incluyen células
eucarióticas (Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 90:7995-7999 (1993)).
Los reactivos derivados de esta realización
contienen un polipéptido que se une al ligando elegido con la
especificidad y afinidad deseadas. Este polipéptido se fusiona a una
región constante de anticuerpo entero, a uno o más dominios de la
región constante, o a uno o más epítopos de la región constante
elegida. La elección de la región constante de anticuerpo o
fragmento de la misma se dicta por el uso deseado. Estos reactivos,
ya se produzcan en sistemas de expresión eucariótica o procariótica,
proporcionan una fuente continua de un reactivo que se une a un
ligando predeterminado, que es de naturaleza “monoclonal” ya que es
uniforme en especificidad y afinidad, y contiene al menos un epítopo
de región constante. Pueden usarse un o más de estos reactivos como
calibradores y/o controles en ensayos y kits diagnósticos diseñados
para medir cualitativa o cuantitativamente los niveles de anticuerpo
específico.
Cualquiera de los reactivos descritos en las
realizaciones 1-4, pueden usarse individualmente o
como alternativa, más de uno de estos reactivos puede usarse para
producir calibradores (patrones) y/o controles para un inmunoensayo.
Se prevé que un calibrador y/o control pueden estar compuestos por
una mezcla de dos o más reactivos: (a) reconocer diferentes epítopos
en un antígeno dado, (b) uno o más epítopos diferentes en más de un
antígeno (por ejemplo, proteínas P30 y P66 de T. gondii), o
uno o más epítopos en antígenos derivados de más de una fuente (por
ejemplo, antígeno pg41 de VIH-1 y antígeno pg36 de
VIH-2, para controlar los anticuerpos tanto de
VIH-1 como de VIH-2 en el mismo
ensayo). La decisión de cómo usar la mayoría de estos reactivos para
producir un calibrador (patrón) y/o control depende del formato del
ensayo y de las características de actuación deseadas (por ejemplo,
especificidad, sensibilidad, precisión, paralelismo), se basa en
observaciones empíricas y puede determinarse por métodos mejor
conocidos en la técnica.
El uso de cualquiera de los reactivos mencionados
como alternativa a la generación de plasma o suero humano positivo
de titulación alta para la producción de calibradores (patrones) y/o
controles en ensayos y kits diagnósticos proporciona varias ventajas
importantes:
(1) disponibilidad: Estos reactivos pueden
producirse fácil y reproductiblemente en grandes cantidades. La
escala de producción puede confeccionarse fácilmente para pedir,
proporcionando un suministro interno renovable.
(2) homogeneidad: Todos estos reactivos son de
naturaleza “monoclonal” en el sentido de que son uniformes en
especificidad y afinidad. Esto reduce dramáticamente la variación
lote a lote. Esto se da a diferencia de los conjuntos de plasma
humano que varían en la concentración del anticuerpo, titulación del
anticuerpo específico y, especificidad, afectando por lo tanto la
actuación del inmunoensayo.
(3) control de la especificidad del epítopo: se
puede dictar fácilmente la especificidad y afinidad del reactivo.
Esto proporciona un mayor nivel de control sobre la actuación y
capacidad de fabricación del inmunoensayo.
(4) se permite una caracterización más completa
de los calibradores y controles, asegurando de esta forma la calidad
del reactivo, y proporcionando también reactivos potencialmente
útiles para controlar el recubrimiento del antígeno en la fase
sólida, reduciendo de esta forma la variación lote a lote en la
concentración del antígeno. Para algunos ensayos, más de un antígeno
proteico se recubre en la fase sólida. Si, por ejemplo, las
proteínas se recubren en micropartículas, si una se monitorizó
recubriéndola con un policlonal, sería necesario recubrirlas
individualmente y posteriormente mezclar las micropartículas. Por el
contrario, con estos reactivos, las perlas podrían
co-recubrirse con todas las proteínas y podría
determinarse la densidad de cada una. Estos reactivos también
proporcionan una herramienta para evaluar la estabilidad y/o
consistencia del lote a lote de epítopos específicos en el
antígeno.
(5) reducción de costes de producción: la
disponibilidad ilimitada acoplada con la naturaleza homogénea del
reactivo ayuda en la optimización de la metodología de purificación,
ayudando a reducir la fabricación, el ensayo y los costes
relacionados con la regulación, y
(6) seguridad: el uso de fluidos biológicos (por
ejemplo, plasma, suero) para fabricar calibradores y controles es
potencialmente biopeligroso. La sustitución de estos reactivos para
fluidos biológicos en la fabricación de calibradores y/o controles
debería reducir significativamente el riesgo de peligro biológico
asociado con estos productos.
Además del uso en ensayos y kits con anticuerpos
de detección y control para agentes infecciosos (por ejemplo, virus
de la inmunodeficiencia humana 1, virus de la inmunodeficiencia
humana 2, virus de leucemia de células T humano 1, virus de
leucemia de células T humano 2, megalovirus, virus de la hepatitis
A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis B, virus de la
hepatitis D, virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis GB,
virus sincitial respiratorio, virus de la rubéola, Toxoplasma
gondii, Trypanosoma cruzi, Cryptococcus neoformans, Histoplasma
capsulatum, Helicobacter pylori y Streptococcus
pyogenes), los reactivos descritos en la presente invención
también pueden usarse para controlar respuestas de anticuerpo contra
cualquier otro antígeno. En particular, los reactivos pueden usarse
en kits y ensayos que controlan anticuerpos contra autoantígenos,
alergenos, agentes farmacéuticos y otros antígenos medioambientales.
Estos ensayos pueden diseñarse para controlar/medir todos los
anticuerpos reactivos, o como alternativa, clases o subclases
específicas del anticuerpos reactivos. Los agentes descritos son
útiles como calibradores/o controles para controlar respuestas de
anticuerpo en seres humanos así como en cualquier otra especie de
vertebrado capaz de generar una respuesta de anticuerpo y, de esta
forma, tienen aplicaciones en la medicina humana así como en
veterinaria.
La presente invención puede ilustrarse mediante
el uso de los siguientes ejemplos no limitantes.
Los hibridomas
1-706-139 (IgG2b/\kappa) y
5-465-210 (IgG2a/\kappa),
específicos para proteínas de Toxoplasma P66 y P30, respectivamente,
se establecieron por fusión de células de bazo Swiss Webster
inmunizadas con el hibridoma no segregado Sp2/0-Ag14
en los laboratorios Abbott (Abbott Park, IL). Los hibridomas se
pasaron en IMDM (550 mg de glucosa/l) suplementado con suero bovino
fetal al 10% (FBS), L-glutamina 8 mM, 100U de
penicilina/ml y 100 \mug/ml de estreptomicina (IMDM completo). Las
células Sp2/0 Ag 14 (Laboratorios Abbott; American Type Culture
Collection, Rockville, MD) usadas para electroporación se pasaron en
D-MEM de alta glucosa que contenía
L-glutamina suplementada con FBS al 10%, piruvato
sódico 1 mM, HEPES 10 mM y 10 \mug/ml de gentamicina
(D-MEM completo). Las células Sp2/0 Ag 14
(Laboratorios Abbott) usadas para la transfección por fusión de
protoplastos se introdujeron en D-MEM (Catálogo Nº
11995) suplementado con FBS al 20%, 0,8 \mug/ml de
8-azaguanina (Sigma Chemical Company, St. Louis,
MO), 50 U/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina.
Los transfectantes que segregan anticuerpo
quimérico se introdujeron en IMDM completos suplementados con 0,1
\muM de metotrexato (MTX) adquirido por Sigma, Adria Laboratories
(Columbus, OH) o Lederele Laboratories (Carolina, Puerto Rico). A
menos que se especifique otra cosa, todos los suplementos y medios
de cultivo de tejidos se adquirieron por BRL Life Technologies
(Gaithersburg, MD). Las células se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al
5%.
Los cebadores para clonar y secuenciar se
adquirieron por Operon Technologies, Inc (Alameda, CA) a menos que
se especifique otra cosa. Los cebadores usados para el aislamiento
de regiones variables (V) de inmunoglobulina y para la transferencia
de fragmentos se purificaron por HPLC. Los reactivos de los kits
Perkin-Elmer GeneAmp (Perkin-Elmer
Corporation, Foster City, CA), incluyendo ADN polimerasa AmpliTaq,
se usaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante para
amplificaciones de reacción en cadena de polimerasa (PCR). La
trascripción inversa y las reacciones de PCR se realizaron en un
ciclador térmico GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer). Las
enzimas de restricción se adquirieron por BRL Life Technologies o
New England BioLabs (Bervely, MA) y las digestiones se realizaron
según la recomendación del fabricante. A menos que se indique de
otra forma, los fragmentos de ADN usados para clonar se aislaron en
agarosa con un punto de fusión bajo (LMP) (FMC Corporation,
Rockland, ME). En resumen, se extrajeron fragmentos deseados a
partir de gel, se cortaron en piezas pequeñas y se añadieron a 400
\mul de TE [ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (EDTA; pH 8,0,
BRL Life Technologies),
tris(hidroximetil)aminometano-clorhidrato
10 mM (Tris-HCl; pH 8,0; BRL Life Technologies)] en
un tubo de microfuga eppendorf. La agarosa se fundió a 68ºC y se
extrajo con 800 \mul de fenol saturado con tampón (BRL Life
Technologies) mezclándolo vorticialmente durante un minuto y
centrifugación a 14.000 x g en una microcentrífuga. La fase acuosa
se transfirió a un nuevo tubo y se añadió una décima parte de
volumen de LiCl_{2} 10 M (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El
tubo se centrifugó aproximadamente durante 5 minutos. La fase acuosa
se transfirió a un nuevo tubo y se precipitó con 2,5 volúmenes de
etanol absoluto (-20ºC, McCormick Distilling Co., Weston, MO). El
ADN se sedimentó aproximadamente durante 15 minutos y se lavó 2X con
etanol al 70% (-20ºC). El ADN se resuspendió en H_{2}O o TE. Las
uniones se realizaron usando un kit de unión de ADN Stratagene
(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) como recomienda el
fabricante. A excepción de los estudios sobre fusión de
protoplastos, la transformaciones bacterianas se realizaron usando
células de componente DH5\alpha MAX EFFICIENCY (BRL Life
Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. La selección de
transformantes para identificar los clones deseados se realizó por
análisis de digestión con enzimas de restricción de ADN miniprep y/o
por PCR de colonias. El ADN miniprep se preparó con el Sistema de
Purificación Magic Miniprep (Promega Corporation, Madison, WI) o con
el Kit Prep de Plásmidos EasyPrep (Pharmacia Biotech, Inc.,
Piscataway, NJ) siguiendo las especificaciones del fabricante. Para
seleccionar PCR de colonias, las colonias individuales se recogieron
a partir de placas de transformación y se transfirieron en un
pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo liso (Costar,
Cambridge, MA) que contenía 100 \mul de H_{2}O estéril. Una
tercera parte del volumen se transfirió a una segunda placa y se
almacenó a 4ºC. La placa de 96 pocillos origina se sometió a
microondas durante 5 minutos para romper las células. Después, un
\mul de volumen se transfirió a un tubo de PCR como plantilla. Se
añadieron nueve \mul de una mezcla principal de PCR que contenía 1
\mul de tampón 10X PCR, 1 \mul de dNTP 2 mM, 1 \mul (10 pmol)
de cebador de sentido, 1 \mul (10 pmol) de cebador
anti-sentido, 0,08 \mul de ADN polimerasa de
AmpliTaq (0,4 unidades) y 4,2 \mul de H_{2}O al tubo PCR. Todos
los reactivos PCR se adquirieron por Perkin-Elmer
Corporation. Las reacciones se amplificaron generalmente para
20-25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos,
50-60ºC (dependiendo de las temperaturas de
recorrido del cebador) durante 30 segundos y 72ºC durante 60
segundos. Los cebadores fueron dependientes en el inserto y las
condiciones del ciclo se modificaron en función de las temperaturas
de recorrido del cebador y la longitud del producto esperado.
Después de la ciclación, se cargó aproximadamente 1/3 del volumen de
reacción en un gel de agarosa para el análisis. Las colonias que
contenían los clones deseados se propagaron a partir de la placa de
transferencia.
Se usó un kit de purificación de ARNm Pharmacia
QuickPrep de acuerdo con las especificaciones del fabricante para
aislar ARNm de 1X10^{7} células de hibridoma. La síntesis de ADN
complementario monocatenario (ADNc) y la amplificación de PCR se
realizaron con un kit PCR de ARN Perkin Elmer GeneAmp. Para la
síntesis de ADNc específica de regiones V de cadena pesada (H), se
usaron 90 ng de ARNm de hibridoma purificado y 10 pmol del cebador
M-IgG2b (Tabla I) o M-IgG2a,
conteniendo ambos un sitio Bgl II, para
1-706-139 y
5-465-210; respectivamente. El
cebador de ADNc específico de ambas regiones variables (V) de cadena
ligera kappa (\kappa) se realizó con el cebador
MK-REV que contenía un sitio Bgl II. Las
reacciones de trascripción inversas se incubaron a 42ºC durante 60
minutos, después a 99ºC durante 5 minutos. Las reacciones de PCR
(100 \mul de volumen; 50 pmol de cada cebador) se establecieron de
acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para la
amplificación de la región V_{H}
1-706-139, se usaron cebador de
sentido MHV-9 y el cebador M-IgG2b.
La región V\kappa 1-706-139 se
amplificó con cebadores MKV-1 (sentido) y
MK-REV. Para la amplificación de la región V_{H}
5-465-210, se usaron cebadores
MHV-7 (sentido) y M-IgG2a. La
amplificación de la región V\kappa
5-465-210 se realizó con cebadores
MKV-2 (sentido) y MK-REV. Todos los
cebadores de sentido contenían un sitio Sal I. Las
amplificaciones consistían en 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos,
52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. Los productos
derivados de PCR se aislaron mediante el Sistema de Purificación de
ADN Promega Magic PCR Preps (Madison, WI). Los fragmentos de V_{H}
y V\kappa se digirieron con Sal I y Bgl II y se
ligaron en pUC218 digerido con Sal I y Bam HI (BRL
Life Technologies). Los plásmidos
pJH6-20-94A1 y
pJH6-14-94A5 contienen regiones
V_{H} y V\kappa, respectivamente, se clonaron a partir del
hibridoma 1-706-139. Los plásmidos
pJH6-30-94A1 y
pJH7-31-94D3 contienen regiones
V_{H} y V\kappa, respectivamente, se aislaron a partir del
hibridoma 5-465-210.
El vector de expresión de inmunoglobulina pdHL2
(figura 3; Gillies, S.D. et al., (1989) J. Immunol. Methods
125:191-202) se modificó para la expresión de IgM
humana (Figura 4) reemplazando la región constante de IgG1 humana
(G\gammal) con un clon genómico de la región constante IgM humana
(C\mu). La primera etapa fue introducir un sitio de restricción
Spe I en el sitio Sac II 31 pb corriente arriba del
primer exón de C\gammal. El oligonucleótido de cadena codificante
Spe-1, 5'd[GGAACTAGTGGAGC]3' (SEC ID
Nº: 18) se hibridó al oligonucleótido Spe-2,
5'd[TCCACTAGTTCCGC]3' (dejando salientes Sac
II) (SEC ID Nº: 19) y se unió a pdHL2 digerido con Sac II,
proporcionando el vector pAG/SpeI.
El gen C\gammal en pAG/SpeI se flanqueó
mediante los sitios Spe I y Eag I (localizados 7 pb
corriente abajo del codón de terminación) y se retiró mediante una
digestión doble con tres enzimas. Un fragmento que contenía un clon
genómico de la porción secretora de C\mu se generó por
amplificación de PCR usando 1 ng de la cassette del vector H + L Nº
1 (8/89) Hyland (Abbott Biotech) como plantilla y 50 pmol de los
cebadores 5'huM-B (Tabla 2), que contenían un sitio
Spe I y 3'-huMEag, que contenían un sitio
Eag I. La amplificación consistió en 24 ciclos de 94ºC
durante 30 segundos, 63ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 90
segundos. El producto de C\mu de IgM 1180 pb (posición 219 a
través de 2099 en Dorai, H. y Gillies, S.D., Nucleic Acids Research
17:6412 (1989)) se aisló con gel, se digirió doblemente con
Spe I y Eag I y se clonó en pAG/SpeI (reemplazando el
gel IgG1) para generar pAG/SpeI/huM.
Los plásmidos pAG/huM/\alphatoxo y
pAG/huM/\alphatoxo 5-465 se construyeron por
transferencia de los conjuntos de región V
1-706-139 y
5-465-210, respectivamente, en
pAG/SpeI/huM (véase la siguiente sección). Estudios preliminares con
estas construcciones revelaron niveles bajos de expresión de IgM
recombinante por lo que las construcciones se modificaron
adicionalmente. Un clon genómico de la porción secretora del gen
C\mu que contiene secuencias señal poli A de IgM nativa se
amplificó por PCR, en las condiciones detalladas anteriormente,
usando 1 ng de ADN
pN\cdot\chi-\muTNP plasmídico (obtenido a partir del Dr. Marc Shulman, University of Toronto, Toronto, Ontario; Boulianne, G.L. et al., Nature 312:643-646 (1984)) como plantilla y 50 pmol de cada uno de los cebadores 5'huM-B y 3'amp-hoM (conteniendo un sitio EcoR V). El producto PCr de C\mu aislado con gel (posición 128 a través de 2278 en Word, C.J. et al., International Immunology 1:296-309 (1989)) se unió en el vector pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI), siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante. Se identificó un clon que contenía el inserto de C\mu y se denominó pGEM/IgM. El inserto de IgM entero se secuenció para verificar su integridad.
pN\cdot\chi-\muTNP plasmídico (obtenido a partir del Dr. Marc Shulman, University of Toronto, Toronto, Ontario; Boulianne, G.L. et al., Nature 312:643-646 (1984)) como plantilla y 50 pmol de cada uno de los cebadores 5'huM-B y 3'amp-hoM (conteniendo un sitio EcoR V). El producto PCr de C\mu aislado con gel (posición 128 a través de 2278 en Word, C.J. et al., International Immunology 1:296-309 (1989)) se unió en el vector pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI), siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante. Se identificó un clon que contenía el inserto de C\mu y se denominó pGEM/IgM. El inserto de IgM entero se secuenció para verificar su integridad.
El plásmido pGEM/IgM se modificó extendiendo las
secuencias intrón 5' nativas corriente arriba del exón C\mu 1. El
fragmento intrón (extremo 5' en la posición 17 en Word, C.J. et
al., International Immunology 1:296-309 (1989))
se amplificó por PCR usando 1 ng de ADN plasmídico
pN\cdot\chi-\muTNP como plantilla y 50 pmol de
cada uno de los cebadores 5-SPL/Spe que contenían un
sitio Spe I y 3-SPL (ambos sintetizados en
Abbott). Después de 24 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 45 segundos, el fragmento intrón
se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó. Tanto el producto
intrón como el vector pGEM/IgM se digirieron con Spe I y
Bsu 36 I (New England Biolabs), se aislaron con gel y se
unieron para generar la construcción del gen C\mu humana
pJH2-14-95A3. El inserto intrón se
caracterizó por secuenciación.
El plásmido pAG/huM/\alphatoxo
5-465 se modificó reemplazando su segmento del
C\mu con el segmento del gen C\mu humano que contenía intrón 5'
nativo y secuencia señal poli A, presentes en
pJH2-14-95A3 (denominado C\mu
completo). El plásmido pAG/huM/\alphatoxo 5-465 se
digirió doblemente con Spe I y Pvu II (corriente abajo
del sitio de adición de poli A C\gammal; posición 2137 con el Nº
de Acceso de GenBank Z17370) y el esqueleto del vector se aisló con
gel. El gen C\mu completo se volvió a liberar a partir de
pJH2-14-95A3 por digestión con
Spe I y Eco RV. La unión de los fragmentos aislados
con gel dio lugar al plásmido
pJH2-24-95B1 (Figura 3). Este vector
de expresión contiene genes V_{H} y V\kappa murinos aislados a
partir de hibridoma, 5-465-210, y
clones genómicos de genes C\mu y C\kappa humanos.
Se construyó una segunda versión de este vector
de expresión, pJH3-19-95A, que
contenía genes V\kappa y V_{H} clonados a partir de hibridoma,
1-706-139, reemplazando el fragmento
Xba II-Hind III en
pJH2-24-95B1 (que contenía la región
constante kappa V\kappa 5-465-210
y V_{H} 5-465-210) con el
fragmento Xba I-Hind III análogo aislado a partir de
plásmido pAG/huM/\alphatoxo (Figura 5). Los vectores de expresión
IgM finales pJH2-24-95B1 y
pJH3-19-95A se introdujeron ambos en
E. coli C600R^{-} (American Type Culture Collection) en la
preparación para la transfección por fusión de protoplastos.
La regiones V\kappa y V_{H} clonadas a
partir de los hibridomas se introdujeron como cassettes en el vector
de expresión de inmunoglobulina pAG/SpeI/huM que contenía unidades
de trascripción para C\kappa humano y C\mu humano. La expresión
adecuada de las regiones V\kappa y V_{H} requiere la adición de
parte de las secuencias líderes 5' y de las uniones del donador de
unión 3'. Estas regiones se incorporaron en cebadores (Tabla 2)
usados para la transferencia mediada por PCR secuencial de regiones
V\kappa y V_{H} en el vector de expresión. Para la transferencia
del gen V\kappa 1-706-139, se
usaron el cebador 5' (líder)
VK1-706-5', que contenía un sitio
Xba I, y el cebador 3'
VK1-706-3' que contenía una unión y
el sitio Bam HI. Para la amplificación de la región V_{H}
1-706-139, se usaron el cebador 5'
(líder) VH1-706-5' que contenía un
sitio Xho I y el cebador 3'
VH1-706-3' que contenía un sitio
Hind III. Para la transferencia del gen V\kappa
5-465-210, se usaron el cebador 5'
(líder) VK5-465-5' que contenía un
sitio Xba I y el cebador 3'
VK5-465-3' que contenía un sitio en
cursiva Bam HI. Para la transferencia del gen V_{H}
5-465-210, se usaron el cebador 5'
(líder) VH5-465-5' con un sitio
Xho I y el cebador 3',
VH5-465-3', que contenía un sitio
Hind III. Las reacciones con un volumen de
100 \mul incluyeron 50 pmol de cada cebador y 1 ng de la plantilla plasmídica [pJH6-14-94A5 (1-706-139 V\kappa); pJH6-20-94A1 (1-706-139 V_{H}); pJH7-31-94D3 (5-465-210 V\kappa): o pJH6-30-94A1 (5-465-210 V_{H}). La amplificación consistió en 22 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. Los productos V\kappa derivados de PCR se digirieron con Xba I y Bam HI y se clonaron en el vector (pAG/SpeI/huM) digerido con Xba I y Bam HI. Posteriormente, el producto V_{H} se introdujo en el vector que contenía V\kappa usando Xho I y Hind III. La integridad de los insertos de V\kappa y V_{H} se estableció por análisis secuencial. Los vectores de expresión resultantes, pAG/huM/\alphatoxo y pAG/huM/toxo 5-465, contienen los conjuntos de región V 1-706-139 y 5-465-210 (V\kappa y V_{H}), respectivamente.
100 \mul incluyeron 50 pmol de cada cebador y 1 ng de la plantilla plasmídica [pJH6-14-94A5 (1-706-139 V\kappa); pJH6-20-94A1 (1-706-139 V_{H}); pJH7-31-94D3 (5-465-210 V\kappa): o pJH6-30-94A1 (5-465-210 V_{H}). La amplificación consistió en 22 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. Los productos V\kappa derivados de PCR se digirieron con Xba I y Bam HI y se clonaron en el vector (pAG/SpeI/huM) digerido con Xba I y Bam HI. Posteriormente, el producto V_{H} se introdujo en el vector que contenía V\kappa usando Xho I y Hind III. La integridad de los insertos de V\kappa y V_{H} se estableció por análisis secuencial. Los vectores de expresión resultantes, pAG/huM/\alphatoxo y pAG/huM/toxo 5-465, contienen los conjuntos de región V 1-706-139 y 5-465-210 (V\kappa y V_{H}), respectivamente.
Para generar una construcción para la expresión
de las regiones V\kappa y V_{H} funcionales del hibridoma
1-706-139 como IgG1, el fragmento
Xba I-Hind III que engloba ambas regiones se escindió
a partir de pAG/huM\alphatoxo y se introdujo en pdHL2 digerido con
Xba I y Hind III, proporcionando la construcción de
expresión denominada pJH9-14-94/4.1.
Se usa el mismo procedimiento para transferir el conjunto del gen
V\kappa y V_{H} aislado a partir del hibridoma
5-465-210 del plásmido
pAG/huM/\alphatoxo 5-465 en pdHL2 para generar la
construcción de expresión,
pdHL-2/5-465 (clon 1).
La plantilla plasmídica para secuenciar se
preparó con Sistemas de Purificación de ADN Magic Miniprep o
Maxiprep (Promega), el kit EasyPrep Plasmid Prep (Pharmacia) o por
unión de CsCl (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2ª
edición, Cold Spring Harbor, Nueva York, Cold Spring Harbor Press
(1989)). Se siguieron los procedimientos recomendados por los
fabricantes para la preparación de los plásmidos con los kits. Las
secuencias nucleotídicas se determinaron manualmente mediante la
versión 1.0 de Sequenase con un kit de Secuenciación de ADN
Sequenase 7-deaza-dGTP (Amersham
Life Science, Inc., Arlington Heights, IL) o por secuenciación
automática usando el kit de secuenciación de autolectura de
Pharmacia y el secuenciador de ADN ALF. Los cebadores del vector
(Tabla 3) ALF M13 Universal (Pharmacia) y ALF M13 Inverso
(Pharmacia) se usaron para secuenciar insertos de V_{H} y
V\kappa. Los clones múltiples de las regiones V_{H} y V\kappa
generadas por PCR se secuenciaron para controlar los errores
inducidos por ADN polimerasa AmpliTaq.
Los cebadores usados para secuenciar los
fragmentos de V_{H} y V\kappa clonados en los vectores de
expresión de mamíferos incluyeron los cebadores:
pdHL2-4F, pdHL2-7F,
pdHL2-43, pdHL2-44,
pdHL2-52 y pdHL2-53. Además,
T1706H-A y T1706H-B, para
1-706-139 V_{H};
T1706K-A y T1706K-B para
1-706-139 V\kappa;
T5465H-A, T5465H-B y
T5465H-C para
5-465-210 V_{H} y
T5465K-A, T5465K-B y
T5465K-C para la región V\kappa clonada a partir
de 5-465-210.
Los cebadores usados para secuenciar el clon
genómico de IgM humana se enumeran en la Tabla 4.
Los plásmidos usados para la electroporación se
purificaron por unión de CsCl (Sambrook J. et al., Molecular
Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York, Cold Spring
Harbor Press (1989)). Para la transfección por electroporación, las
células Sp2/0-Ag14 en crecimiento de fase log se
recogieron y se lavaron dos veces en 10 ml de solución salina
tamponada con fosfato Dulbeccos (D-PBS, BRL Life
Technologies) y se resuspendieron en D-PBS a una
concentración de 1X10^{7} células/ml. Se añadieron diez \mug de
ADN plasmídico linealizado con Sal I a 1X10^{7} células
Sp2/0-Ag14 en una cubeta de electroporación
Bio-Rad (Melville, NY) con un hueco de 0,4 cm en un
total de 1 ml de D-PBS. El ADN y las células se
incubaron en hielo durante 10 minutos. La cubeta se colocó en la
cámara de un aparato de Pulsación Génica Bio Rad a 0,18 kv y 960
\muF de capacidad. Se aplicó corriente y la cubeta se mezcló para
eliminar el gradiente de pH. Las células se colocaron en hielo
durante 5 minutos antes de someterlas a plaquetas. Las células se
transfirieron a medios de D-MEM competitivos de 19
ml y se mezclaron suavemente. Se añadieron 100 \mul de suspensión
celular a cada uno de los pocillos de dos clusters de cultivo de
tejido de 96 pocillos (fondo liso; Costar) y se incubó a 37ºC en
CO_{2} 5'. Después de 24 horas, los 100 \mul de
D-MEM completo suplementados con 0,1 \muM de MTX
(Sigma) se añadieron a cada pocillo, y las placas se incubaron como
se ha indicado anteriormente. Después de 48 horas, los 100 \mul de
medio se retiraron de cada pocillo, y se volvieron a añadir 100
\mul de D-MEM completo con 0,1 \muM de MTX. Este
proceso se repitió después de 48 horas. Las placas se incubaron
posteriormente durante 10 a 21 días hasta que las colonias empezaron
aparecer. Los sobrenadantes se recogieron a partir de cultivos que
contenían colonias resistentes a MTX y se ensayaron por ELISA (véase
más adelante) con respecto a la presencia del anticuerpo
quimérico.
Un segundo método para establecer transfectantes
de Sp2/0-Ag 14 fue una versión modificada de la
técnica de fusión de protoplastos (Sandri-Golden,
R.M. et al., Molecular and Cellular Biology
1:743-852 (1981); Gillies, S.D. et al., Cell
33:717-728 (1983)): Los plásmidos se propagaron en
E. coli C600R^{-} para generar protoplastos. Las bacterias
crecieron a 37ºC con aireación vigorosa en 50 ml de medio que
contenía 10 mg/ml de sales M9 (BRL Life Technologies), ácidos
Casamino al 0,8% (Difco, Detroilt, MI), glucosa al 0,5% (BRL Life
Technologies), CaCl_{2} 0,1 mM (Sigma), MgSO_{4} 1 mM (Sigma) y
50 \mug/ml de ampicilina (Sigma) a una absorbancia a 600 nm de
0,5-0,6. Se añadió cloranfenicol (Sigma) a 200
\mug/ml, y el cultivo se incubó como se ha indicado anteriormente
durante 18-22 horas más. Las células se sedimentaron
a 1100 x g durante 12 minutos a 4ºC y se resuspendieron en 2,5 ml de
sacarosa al 20% (Sigma) en Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0
(BRL Life Technologies) a 4ºC. Se añadió una solución de lisozima de
5 mg/ml (Pharmacia) en Tris-HCl 0,25 M (pH 8,0) y la
mezcla se colocó sobre hielo. Después de una incubación de 5
minutos, se añadió 1,0 ml de EDTA 0,25 M (pH 8,0; BRL Life
Technologies) y la mezcla se mantuvo sobre hielo durante 5 minutos
más. Después, se añadió lentamente un ml de Tris-HCl
0,05 M (pH 8,0). La suspensión se incubó a 37ºC durante 10 minutos.
Posteriormente, se usaron 20 ml de D-MEM (Nº de
Catálogo 11995, BRL Life Technologies) suplementado con MgCl_{2}
10 mM (Sigma) y sacarosa al 10% (Sigma) a temperatura ambiente para
diluir lentamente la solución de protoplastos. La mezcla se mantuvo
a temperatura ambiente durante 2,5 horas. Se sedimentaron
aproximadamente 5X10^{6} células de Sp2/0 Ag 14 recogidas en el
crecimiento de fase log a 350 x g durante 5 minutos. Las células se
resuspendieron suavemente en la suspensión de protoplastos. Esta
suspensión se transfirió a una placa de 60 mm y se centrifugó a 650
x g durante 8 minutos. El sobrenadante se aspiró y se añadieron 1,5
ml de PEG al 50% p/v (Sigma Hybri Max) en PBS precalentado a 37ºC.
La placa se centrifugó a 110 x g hasta que transcurrieron 90
segundos desde el punto de la adición de PEG. Las células se
resuspendieron suavemente midiéndolas con la pipeta en dos volúmenes
de 5 ml y un volumen de 10 ml de solución de lavado precalentado
(D-MEM suplementado con FBS al 1%, 50 U/ml de
penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina) que se añadieron a un
tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 15 ml de la solución de
lavado. Después de la centrifugación a 225 x g durante 7,5 minutos,
las células se resuspendieron en medio de plaquetas
(D-MEM suplementado con FBS al 10%, 50 U/ml de
penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 100 \mug/ml de
canamicina) (Sigma) y se colocaron en placas en una placa de 96
pocillos y se incubaron a 37ºC. Después de 24 horas (día 1), se
añadió medio selectivo (D-MEM suplementado con FBS
al 10% y 0,1 \muM de MTX). El día 5, se añadieron 50 \mul del
medio selectivo por pocillo. Después de dos días, se retiraron 100
\mul/pocillo y se añadieron 100 \mul de medio selectivo nuevo
por pocillo. Las colonias resistentes a MTX se ensayaron para la
secreción de anticuerpo quimérico por ensayo ELISA.
Los transfectantes se ensayaron por ELISA para la
producción de IgG1 quimérica. Las placas EIA (96 pocillos, Nunc
Immulon, Naperville, IL) se recubrieron con 100 \mul de IgG
anti-humana de ratón (cadena H + L; Jackson Immuno
Research, West Grove, PA) a 1,5 \mug/ml y se incubaron a 37ºC
durante 1 hora. Las placas se lavaron 4 veces en 1 X de solución
salina tamponada con fosfato de Dulbecco, sin Ca o Mg
(D-PBS; BRL Life Technologies). Los pocillos se
bloquearon con 200 \mul de leche seca no grasa al 2,0% (Carnation
Company, Los Angeles, CA) en 1X
D-PBS durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente. Se usaron como convención IgG humana purificada (Jackson Immuno Research) o anticuerpo IgG1 quimérico purificado (Laboratorios Abbott) diluido en 1X D-PBS con leche seca no grasa al 2% y Tween-20 al 0,05% (Bio Rad). Los patrones y los sobrenadantes de cultivo se añadieron a la placa por duplicado, 100 \mul/pocillo, se incubaron a 37ºC durante 1 hora, después se lavaron 4 veces en D-PBS con Tween-20 al 0,1%. A cada pocillo, se le añadió 100 \mug de IgG anti-humana de ratón (cadena H + L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research) a 0,45 \mug/ml y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente. El ensayo se desarrolló usando un kit reactivo OPD (Laboratorios Abbott) y se leyeron en un lector de placa de 96 pocillos Bio-Rad.
D-PBS durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente. Se usaron como convención IgG humana purificada (Jackson Immuno Research) o anticuerpo IgG1 quimérico purificado (Laboratorios Abbott) diluido en 1X D-PBS con leche seca no grasa al 2% y Tween-20 al 0,05% (Bio Rad). Los patrones y los sobrenadantes de cultivo se añadieron a la placa por duplicado, 100 \mul/pocillo, se incubaron a 37ºC durante 1 hora, después se lavaron 4 veces en D-PBS con Tween-20 al 0,1%. A cada pocillo, se le añadió 100 \mug de IgG anti-humana de ratón (cadena H + L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research) a 0,45 \mug/ml y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente. El ensayo se desarrolló usando un kit reactivo OPD (Laboratorios Abbott) y se leyeron en un lector de placa de 96 pocillos Bio-Rad.
El ELISA se modificó para ensayar la producción
de IgM quimérica. Las placas se recubrieron con 0,36 \mug/ml de
IgM de cabra anti-humana (Fc_{5\mu} - específico,
Jackson Immuno Research) en D-PBS. Se usó como
convención IgM humana ChromPure (mieloma, toda la molécula, Jackson
ImmunoResearch). La IgM de cabra anti-humana marcada
con peroxidasa (Fc_{5\mu}, Jackson ImmunoResearch) a 0,8 \mug/ml
se usó como el conjugado de anticuerpo enzimático.
Las concentraciones de anticuerpo se determinaron
por inmunodifusión radial (RID). Los sobrenadantes de cultivo
celular de siete-catorce días se mezclaron
vorticialmente y después se aplicaron 5 ó 10 \mul de muestras de
IgG y IgM, respectivamente, a cada pocillo de IgM humana o placas
RID de IgM humana (The Binding Site, San Diego, CA). En cada
plaqueta se realizó un conjunto de patrones (25, 50, 75, 100 y 150
\mug/ml). El patrón para IgG1 quimérica fue IgG1
anti-P66 purificada con la proteína A, y el patrón
IgGM fue IgM humana ChromPure (Jackson Immuno Research). Las placas
se incubaron invertidas a 35-37ºC durante
16-22 horas. El diámetro de cada anillo se determinó
en milímetros usando un lector de placa electrónica RID (The Binding
Site) que se calibró con la placa de calibración proporcionada por
el sitio de unión.
Para purificar anticuerpos IgG1 quiméricos, los
sobrenadantes de cultivo de dializaron inicialmente durante una
noche contra fosfato sódico 0,1 M (pH 8,2) y con azida sódica al
0,1%, después se filtraron mediante un filtro de 0,2 \muM.
Después, la preparación se pasó a una columna que contenía resina
PerSeptive Biosystems Poros 50A (Cambridge, MA) usando un sistema de
cromatografía de baja presión Bio-Rad a
250-500 cm/hora. El anticuerpo se eluyó con citrato
0,1 M, NaCl 0,15 M pH 3,0 y fracciones conjugadas se dializaron
contra PBS (fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM) pH 7,2.
Para purificar anticuerpos IgM quiméricos, los
sobrenadantes de cultivo se diluyeron 1:1 con H_{2}O y la
preparación se cargó en una columna que contenía 175 ml de resina
DEAE FastFlow (Pharmacia) equilibrada con PBS a un caudal de 10
ml/minuto. El anticuerpo se eluyó con fosfato sódico 10 mM NaCl 300
mM a un pH 7,2.
Para establecer la viabilidad de usar anticuerpos
monoclonales de ratón-humanos quiméricos como
controles y calibradores en inmunoensayos diseñados para medir
anticuerpos humanos específicos para un agente de inmunización, se
seleccionó un ensayo T. gondii como sistema modelo y
representa una realización de la invención.
Se estableció un panel de anticuerpos
monoclonales a partir del ratón inmunizado con T. gondii.
Esta panel fue específico para muchos antígenos T. gondii
diferentes. La primera etapa fue identificar anticuerpos
monoclonales con características deseadas de afinidad y
especificidad. Se eligieron anticuerpos monoclonales que reaccionan
contra P66 y P30, dos proteínas diagnósticamente útiles de T.
gondii. Los anticuerpos monoclonales se seleccionaron en función
de su capacidad para inhibir la unión de plasma positivo humano a
T. gondii en un esfuerzo por identificar los que reaccionan
con epítopos inmunodominantes. En función de este análisis (datos no
mostrados), se seleccionaron dos anticuerpos monoclonales,
1-706-139 y
5-465-210, específicos para P66 y
P30 de T. gondii, respectivamente.
Las células de hibridoma que producen los
anticuerpos monoclonales sirvieron como fuente de ARNm para la
preparación de ADNc. Para facilitar la clonación de regiones V de
cadena H y L expresas, se preparó la síntesis de ADNc específica con
oligonucleótidos que hibridan para el extremo 5' de las regiones
constantes. Para ADNc V_{H}, se usaron cebadores IgG2b o cebadores
específicos de IgG2a con ARNm aislado a partir de los hibridomas
1-706-139 y
5-465-210, respectivamente. Ambos
ADNc V_{L} se iniciaron con un cebador de región constante
\kappa murina. La amplificación por PCR de las regiones V del
anticuerpo se realizaron con cebadores degenerados que hibridan las
secuencias líderes del gen V_{H} y V\kappa conservadas (Jones,
S.T. y Bendig, M.M., Bio/Technology 9:88-89 (1991))
junto los cebadores de región constante. Los productos de
amplificación se clonaron en pUC18 y se secuenciaron. Los múltiples
clones de cada producto de PCR se secuenciaron para resolver
cualquier error inducido por polimerasa Taq.
Las secuencias de ADNc de VL_{H} y V_{L}
aisladas a partir del hibridoma
5-465-210 se muestran en las figura
6 y 7 en su formato de cassette final. El ADNc de V_{H} codifica
un gen de región V completa compuesto por una secuencia líder, un
gen V_{H} y una región D reajustada a J_{H}2. El gen V_{H}
parece ser un miembro del subgrupo murino IIB (Kabat E.A. et
al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª
edición, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD
1991)). El cebador de amplificación de la región líder degenerad se
extendió al nucleótido 41, por lo que la secuencia de ADNc auténtica
comienza en la posición 42 y se extiende a la posición 430. El ADNc
V_{L} consiste en una secuencia líder en un gen V\kappa
reajustado a un minigen J\kappa. El gen V\kappa es aparentemente
un miembro del subgrupo V\kappaIII. El segmento J\kappa contiene
cuatro desacoplamientos de la secuencia de la línea germinal
publicada del minigen aislado de la cepa de ratón BALB/c (Sakano, H.
et al., Nature 280:288-294 (1979); Max, E.E.
et al., Pro. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
76:3450-3454 (1979); Max, E.E. et al., J.
Biol. Chem. 256:5116-5120 (1981)). Estos
desacoplamientos pueden reflejar mutaciones somáticas o representar
diferencias en la secuencia de línea germinal ya que en este estudio
se utilizaron ratones Swiss Webster. El cebador de región líder
degenerado usado para aislar la región V\kappa expresada se
extendió al nucleótido 45, de esta forma la secuencia de ADNc
auténtica se extiende de la posición 46 a la posición 409.
La secuencia de ADNc V_{H} clonada a partir del
hibridoma 1-706-139 se ilustra en la
Figura 8. El cebador PCR de la región líder degenerado finaliza en
el resto 41, por lo que la secuencia de ADNc auténtica se extiende
de la posición 42 a la 434. La región V_{H} expresada incluye
secuencias líderes, un gen V_{H}, aparentemente del subgrupo IIA.
(Kabat E. A. et al., Sequences of Proteins Of Immunological
Interest, 5ª edición, U.S. Department of Health and Human Services,
Bethesda, MD (1991)), un segmento D y un minigen J_{H}4. No pudo
determinarse el límite exacto entre los segmentos D y J_{H}4. La
secuencia del ADNc V_{L} aislada a partir del hibridoma
1-706-139 se muestra en la Figura 9.
El cebador usado para amplificar el fragmento V_{L} finalizó en el
nucleótido 42, por lo que la secuencia de ADNc real se extiende de
la posición 43 a la 405. El ADNc V_{L} está compuesto por una
secuencia líder y un gen V\kappa, probablemente procedente del
subgrupo V\kappaII, reajustado a J\kappa1.
El objetivo de este estudio fue producir
anticuerpos de ratón-humanos quiméricos que
contuvieran regiones V derivadas de los hibridomas murinos y de las
regiones constantes humanas. Para facilitar la expresión, los ADNc
de cadena V_{H} y V_{L} se modificaron para que contuvieran una
secuencia líder 5' completa, un sitio donador de unión 3' y sitios
de clonación flanqueantes. Los cassettes de transferencia V_{H} y
V_{L} (Figuras 6-9) se generaron por amplificación
de PCR con oligonucleótidos sintéticos que contenían los elementos
requeridos en sus extremos 5' y en las secuencias 3' específicas
para cada región V. Se determinó una secuencia líder apropiada para
cada gen V en función de su homología con respecto a otras
secuencias de región V en la base de datos que incluían su secuencia
líder nativa. En todos los casos, se ha eliminado el intrón de la
región V líder. Se recreó un sitio donador de unión en cada cassette
de región V en el extremo 3' de los exones VDJ o VJ de los ADNc
incorporando un fragmento intrón sintético. La unión del sitio de
unión entre las regiones constantes y V sirve para mantener la
integridad de ambas secuencias codificantes. Además, esto permite
que las cassettes V se coloquen corriente arriba de cualquier región
constante, además de la versatilidad del sistema.
Después, los ADNc modificados se introdujeron en
vectores de expresión de mamíferos corriente abajo de secuencias
reguladoras que proporcionan una expresión de nivel alto. El vector
pdHL2 (Figura 3) contiene unidades transcripcionales para genes de
cadena H y L de anticuerpo bajo el control de un potenciador de
cadena H de inmunoglobulina de ratón y de un promotor de
metalotioneína I. El plásmido pdHL2 contiene genes de región
constante kappa humana (C\kappa) y IgG1 (C\gammal) en su
configuración genómica (Gillies, et al., J. of Immunol.
Methods 125:191-202 (1989)). La introducción de las
cassettes de región V_{H} y V\kappa murina da lugar a la
expresión del anticuerpo quimérico de ratón-humano.
Además, pdHL2 contiene un gen DHFR mutado que permite la selección
de transfectantes basados en la resistencia de MTX (Gillies et
al., J. of Immunol. Methods 125:191-202 (1989)).
Las cassettes de ADNc V_{H} y V\kappa
5-465-210 se introdujeron en pdHL2,
generando el vector de expresión
pdHL-2/5-465. Este vector codifica
el anticuerpo IgG1 quimérico específico para P30. Asimismo, las
cassettes de la región V_{H} y V\kappa
1-706-139 se clonaron en pdHL2
proporcionando pJH9-14-94/4.1,
codificando el anticuerpo IgG1 quimérico específico para el antígeno
P66.
Para producir anticuerpos de clase IgM de
ratón-humano quiméricos, pdHL2 se modificó mediante
el reemplazo del C\gammal con un clon genómico del gen IgM humano
(C\mu) (Figura 4). El vector de expresión que contiene C\mu se
denominó pAG/SpeI/huM. En este vector IgM de primera generación, se
mantuvieron secuencias señal poli A y no trasladadas 3' presentes
originalmente corriente abajo de C\gammal. Las construcciones de
expresión IgM quimérica se generaron por la transferencia secuencial
de las cassettes V\kappa y V_{H} en este vector. En experimentos
preliminares con estas construcciones, todos los transfectantes
tuvieron niveles de secreción muy bajos (<1 \mug/ml) de IgM
quimérico (datos no mostrados).
En un esfuerzo para mejorar la producción de IgM
quimérico, se generaron nuevas construcciones en las que el gen
C\mu y la secuencias señal poli A (originalmente corriente abajo
de C\gammal) se reemplazaron con un clon genómico de la porción
secretora de C\mu humano incluyendo el intrón 5' nativo (contiene
el sitio aceptor de unión), secuencias no trasladadas 3' y
secuencias señal poli A (Figura 4). El análisis de secuencias del
clon C\mu reveló únicamente un cambio de base sencilla con
relación a la secuencia de línea germinal publicada (Word C.J. et
al., International Immunology, 1:296:309 (1989)), la inserción
de una T entre los restos 1583 y 1584 en el intrón
C\mu3-C\mu4. Se esperaba que esta alteración
efectuara la expresión del gen C\mu. La construcción de la
expresión IgM que contenía las regiones V_{H} y V\kappa
5-465-210 se denominó
pJH2-24-95B1 (Figura 3). El
reemplazo del conjunto de región V
5-465-210 con un fragmento
Xba I-Hind III que contenía las cassettes V_{H} y
V\kappa 1-706-139 (Figura 5),
proporcionaron pJH3-19-94A
plasmídico, que codificaba IgM quimérico específico para P66.
Las construcciones de expresión de anticuerpos
quiméricos se transfectaron en las células
Sp2/0-Ag14 no productoras. Ambas construcciones IgG1
quimérica se introdujeron por electroporación mientras que las
construcciones IgM quimérica se transfectaron por fusión de
protoplastos. Los transfectantes se seleccionaron en presencia de
0,1 \muM de MTX. Las múltiples colonias resistentes a MTX de cada
transfección se seleccionaron para la producción del anticuerpo
quimérico usando ELISA de anticuerpo anti-humano.
Los que resultaron positivos se expandieron y se clonaron. Los
niveles de secreción de las transfectomas se determinaron por
inmunodifusión radial (Tabla 5). Los clones que segregan niveles
altos de anticuerpos quiméricos se subclonaron adicionalmente. Los
niveles de producción observados para los anticuerpos IgG1
quiméricos anti-P30 y anti-P60
fueron de 90 \mug/ml o superior. Se obtuvo un transfectante que
segrega anticuerpo IgM quimérico anti-P30 a niveles
en exceso de 100 \mug/ml por fusión de protoplastos. La
transfección de la construcción IgM quimérica
anti-P66 ha tenido un éxito más limitado. Se han
obtenido transfectomas que segregan la IgM quimérica, pero los
niveles de secreción han sido bajos (<1 \mug/ml). Todos estos
transfectantes se han mantenido en 0,1 \muM de MTX. En función de
estudios previos, el aumento de la concentración de MTX puede además
aumentar la producción de los anticuerpos quiméricos (Gillies, et
al., J. of Immunol Methods 125:191-202 (1989):
Lo. K.-M- y S.D. Gillies, Biochimica et Biophysica Acta
1088:217-224 (1991)). En tres de cuatro casos, los
niveles de expresión del anticuerpo quimérico recombinante
producidos por las transfectomas exceden en realidad los niveles de
producción de anticuerpos de los hibridomas a partir de los cuales
se derivaron. Se han conseguido niveles de secreción necesarios para
permitir la fabricación económica. Otra ventaja del sistema
recombinante es que se puede generar fácilmente diferentes clases de
anticuerpos (es decir, IgG1 y IgM) con especificidades de unión
idénticas.
La Tabla 5 que se muestra a continuación
representa los niveles de expresión de los anticuerpos quiméricos
producidos usando los procedimientos mostrados anteriormente:
* Las células se cultivaron a una densidad de 0,5
x 10^{6}. Los niveles de expresión se determinaron el día 7
para
los clones y el día 14 para los subclones (S) por el ensayo RID.
los clones y el día 14 para los subclones (S) por el ensayo RID.
Para determinar si los anticuerpos quiméricos
retuvieron su actividad de unión a antígeno nativa y si fueron
capaces de funcionar como controles/calibradores, se ensayaron por
inmunoensayo. Los anticuerpos IgG1 quiméricos purificados con la
proteína A y IgM quimérica fraccionada sobre DEAE se examinaron con
respecto a la inmunorreactividad a T. gondii en los ensayos
de IgG y IgM IMx Toxo de los Laboratorios Abbott (Safford, J.W.,
et al., J. Clin. Pathol. 44:238-242 (1991)).
Estos ensayos son inmunoensayos enzimáticos de micropartículas
automáticos (MEIA) diseñados para medir cuantitativa (IgG) y
cualitativamente (IgM) los anticuerpos contra T. gondii en
suero y plasma humano.
Las etapas básicas del ensayo IgG IMx Toxo se
representan en la Figura 2. El ensayo usa micropartículas
recubiertas con antígenos de T. gondii como fase sólida. La
muestra se añade a las micropartículas recubiertas para permitir a
los anticuerpos específicos la unión de T. gondii. Después,
las micropartículas se transfieren en un matriz de fibra de vidrio y
se lavan abundantemente para retirar cualquier anticuerpo no unido.
Posteriormente, se añade el anticuerpo IgG de cabra
anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina que se
une específicamente a anticuerpos de vidrio de IgG complejados
contra los antígenos T. gondii en las micropartículas. El
anticuerpo no unido se retira por lavado y el complejo conjugado de
antígeno -IgG del paciente- IgG anti-humana se
detecta por la adición del substrato
4-metilumbeliferil fosfato (MUP). La desfosforilación de MUP por la fosfatasa alcalina puede evaluarse por el grado de formación del compuesto fluorescente metilumbeliferona (MU) medido en el instrumento IMX (Fiore, M., et al., Clin. Chem. 34:1726-1732 (1988)). Este ensayo cuantitativo incluye un conjunto de 6 calibradores para establecer una curva de calibración. Los calibradores se preparan con anticuerpo IgG anti-T. gondii humano diluido en el suero humano en seis concentraciones diferentes 0, 10, 50, 75, 150 y 300 IU de anticuerpo IgG/ml. Los calibradores se refieren a la convención internacional de la Organización Mundial de la Salud para el suero anti-T. gondii. Los calibradores se realizan en lugar de la muestra y se registró en un diagrama una curva de calibración. Los resultados se interpolan a partir de la curva de calibración de seis puntos para cuantificar los niveles de IgG en las muestras. Para este ensayo, el control positivo de IgG anti-T. gondii se prepara con 20 IU/ml de IgG anti-T. gondii humana diluida en el suero humano.
4-metilumbeliferil fosfato (MUP). La desfosforilación de MUP por la fosfatasa alcalina puede evaluarse por el grado de formación del compuesto fluorescente metilumbeliferona (MU) medido en el instrumento IMX (Fiore, M., et al., Clin. Chem. 34:1726-1732 (1988)). Este ensayo cuantitativo incluye un conjunto de 6 calibradores para establecer una curva de calibración. Los calibradores se preparan con anticuerpo IgG anti-T. gondii humano diluido en el suero humano en seis concentraciones diferentes 0, 10, 50, 75, 150 y 300 IU de anticuerpo IgG/ml. Los calibradores se refieren a la convención internacional de la Organización Mundial de la Salud para el suero anti-T. gondii. Los calibradores se realizan en lugar de la muestra y se registró en un diagrama una curva de calibración. Los resultados se interpolan a partir de la curva de calibración de seis puntos para cuantificar los niveles de IgG en las muestras. Para este ensayo, el control positivo de IgG anti-T. gondii se prepara con 20 IU/ml de IgG anti-T. gondii humana diluida en el suero humano.
El ensayo IgM de IMx Toxo fabricado por los
laboratorios Abbott es un MEIA automático diseñado para medir
cualitativamente los anticuerpos IgM contra T. gondii. El
formato del ensayo es similar al del ensayo IgG IMx Toxo pero el
conjugado de fosfatasa alcalina es un anticuerpo IgG de cabra
anti-humano. El resultado del ensayo se expresa cono
un valor de índice que es porcentaje de la cantidad de muestras
sobre el calibrador de índice. El calibrador de índice se prepara
con anticuerpos IgM anti-T. gondii humanos en suero humano y
se coloca cerca del límite positivo/negativo. El control positivo se
prepara de la misma forma y se establece para proporcionar un valor
de índice de 1,5 X el calibrador de índice.
\newpage
Las diluciones en serie por duplicado del
anticuerpo IgG1 quimérico anti-P66 a una
concentración inicial de 11,59 mg/ml y el suero de control positivo
IMx Toxo se realizaron en suero humano negativo (diluyente del
calibrador). Las diluciones se realizaron por duplicado y se
determinó el recuento de proporción. El anticuerpo IgG1 quimérico
anti-P66 tuvo una curva de gran radio a
concentraciones superiores a 0,7 mg/ml, alcanzando un recuento de
proporción de 2070 a 11,59 mg/ml (Figura 10). El recuento de
proporción del calibrador 300 IU/ml (calibrador F IMx) fue de 2572.
El aplanamiento al final de la curva observada con anticuerpo IgG1
quimérico anti-P66 refleja probablemente la
saturación de los sitios de unión anti-P66 en el kit
IMx.
Para examinar la actuación de un anticuerpo IgM
quimérico monoclonal, se diluyeron en series dobles IgM
anti-P66 purificada a 0,210 mg/ml y el control
positivo IgM IMx Toxo en un diluyente de calibrador de índice. Estas
diluciones se realizaron por duplicado y se compararon con el
control positivo y el calibrador de índice (Figura 11). Los valores
pronosticados para el recuento de proporción equivalente para el
control positivo y el calibrador de índice dedujeron las curvas de
dilución para determinar la concentración de anticuerpos. La
proporción del calibrador de índice de 710 y la proporción del
control positivo de 1078 se obtuvieron a 0,0123 mg/ml y a 0,0209
mg/ml de IgM quimérica, respectivamente. Estos datos demuestran que
la IgM quimérica anti-P66 monoclonal funciona como
calibrador de índice aceptable y control positivo en este ensayo. De
esta forma, parece que el anticuerpo quimérico
anti-P66 puede sustituir al plasma humano positivo
en la fabricación del calibrador de índice y del control positivo de
este ensayo. En contraste con la IgG1 quimérica
anti-P66, la recuento de proporción no permanece
estancada incluso en la concentración más alta ensayada. Esto puede
ser debido a las diferencias estructurales entre IgG1 y IgM, ya que
se esperaba que la densidad del epítopo fuera aproximadamente
equivalente en los dos ensayos. La mayor parte de IgM se segrega
como un pentámero, proporcionando un mayor número de epítopos de
región constante, comparado con la estructura dimérica de IgG1.
Presumiblemente, en el caso del ensayo IgM Toxo, la mayoría de los
anticuerpos secundarios unidos a enzimas (IgM
anti-humana) se une al complejo
antígeno-anticuerpo, comparado con el ensayo IgG
Toxo (IgG anti-humana), dando lugar a una
amplificación adicional de la señal.
El anticuerpo IgG1 quimérico
anti-P30 purificado a una concentración de 0,87
mg/ml y el suero humano positivo Toxo IMx (calibrador F, 300 IU/ml)
se diluyeron en serie dos veces en el diluyente del calibrador para
proporcionar niveles de anticuerpo a lo largo del intervalo dinámico
(0-300 IU/ml) del ensayo. Estas diluciones se
realizaron por triplicado y la recuento de proporción
(cuentas/seg/seg) dedujeron las curvas de dilución. El anticuerpo
IgG1 anti-P30 quimérico y el suero de control
positivo tuvieron curvas de dilución paralelas (Figura 12). El
calibrador de suero humano de 300 IU/ml (calibrador F), tuvo un
recuento de proporción de 3015. La IgG1 quimérica
anti-P30 alcanzó una recuento de proporción
equivalente a una concentración de 0,11 mg/ml. El no aplanamiento de
la curva obtenida con el anticuerpo quimérico
anti-P30 se observó hasta la recuento de proporción
de 4261 observada a una concentración de 0,87 mg/ml. En función de
estos datos, la IgG1 quimérica anti-P30 obtuvo una
señal aceptable para una curva de calibración IMx. Estos datos
demuestran que un anticuerpo quimérico, específico para una epítopo
sencillo en P30, tiene el potencial para reemplazar el suero humano
positivo usado como calibradores y controles en este ensayo.
Para examinar la actuación de un anticuerpo IgM,
la IgM anti-P30 purificada a 0,104 mg/ml y el
control positivo de IgM IMx Toxo se diluyeron en un diluyente de
calibrador de índice en diluciones en serie realizadas dos veces.
Esas diluciones se realizaron por duplicado y se compararon con el
control positivo y el calibrador de índice (Figura 13). Los valores
pronosticados para la recuento de proporción equivalente con
respecto al control positivo y al calibrador de índice se dedujeron
a partir de las curvas de dilución y se determinaron las
concentraciones de anticuerpo. La proporción del calibrador de
índice de 560, y la proporción del control positivo de 1050 se
obtuvieron a 0,0084 mg/ml y 0,0145 mg/ml de la IgM quimérica
anti-P30, respectivamente. Estos datos demuestran
que puede obtenerse un valor de límite de IMx aceptable con el
anticuerpo IgM quimérico anti-P30 monoclonal.
Se realizó un análisis sobre la estabilidad
acelerada de los anticuerpos IgG quiméricos en el formato del ensayo
IgG Toxo por componentes de estrés térmico a 45ºC durante hasta 12
días. Para la IgG1 quimérica anti-P30 y una mezcla
de los dos monoclonales (IgG1 anti-P30 +
anti-P66), las diluciones se realizaron por
duplicado contra el ensayo de la curva de calibración en el ensayo
IgG Toxo IMx. Se usó una curva punto a punto fija para predecir las
concentraciones de anticuerpos quiméricos necesarios para igualar
los calibradores del anticuerpo humano actuales. Para el análisis de
estabilidad, se examinaron dos niveles de calibradores, el
calibrador B de 10 IU/ml y el calibrador F de 300 IU/ml. La recuento
de proporción equivalente al calibrador B se obtuvo 0,0036 mg/ml de
IgG1 anti-P30 o con una mezcla de 0,0036 mg/ml de
IgG anti-P30 y 0,010 mg/ml de IgG1
anti-66. Los reactivos del kit y los calibradores se
almacenaron durante un período de hasta 12 días a
2-8ºC o 45ºC. Los días 0, 4, 8 y 12, los ensayos se
realizaron con reactivos de ensayo y la actuación se registró en un
diagrama contra el calibrador B humano convencional (Figura 14).
Todos los reactivos del kit y los anticuerpos quiméricos fueron
estables a 2-8ºC. Por el contrario, cuando los
reactivos del kit se almacenaron a 45ºC, el día 4, hubo una
reducción del 30% en la recuento de proporción observada para la
IgG1 anti-P30 comparado con el calibrador B humano
convencional. El día 12 a 45ºC, la señal obtenida con la IgG1
anti-P30 se redujo aproximadamente en un 50%. La
pérdida de actividad no fue debida a la falta de estabilidad de la
IgG1 quimérica, ya que bajo estas condiciones, fue tan estable como
los anticuerpos del calibrador humano convencional. La reducción en
la recuento de proporción parece que es debida a la pérdida de
epítopo P30 reconocido por este anticuerpo quimérico monoclonal.
Cuando se examinó la mezcla de anticuerpo, las características de
actuación fueron similares a las observadas para el calibrador de
anticuerpo humano. Parece que el epítopo P66 reconocido por el
anticuerpo anti-P66 monoclonal es más estable en
estas condiciones, y que compensa el estrés térmico inducido por la
pérdida de epítopo P30.
Para conseguir los niveles del calibrador F, se
usaron 0,110 mg/ml de IgG1 anti-P30 o una mezcla de
0,110 de IgG1 anti-P30 y 0,305 mg/ml de IgG1
anti-P66. La actuación del ensayo con los reactivos
de ensayo con relación a la observada con el calibrador humano
convencional se muestra en la Figura 15. Todos los reactivos del kit
y los anticuerpos quiméricos fueron estables cuando se almacenaron a
2-8ºC. Se observaron resultados similares en el
nivel del calibrador B, hubo un declive progresivo en la recuento de
proporción observada con el anticuerpo anti-P30
cuando se almacenó a 45ºC. La combinación de los monoclonales
anti-P30 y anti-P66, mostró
características de estabilidad aceptables cuando se comparó con el
calibrador F humano nativo incluso después del estrés térmico a
45ºC. La pérdida de estabilidad con el anticuerpo quimérico
anti-P30 parece que es debida a la pérdida del
epítopo P30 reconocida por este monoclonal, ya que el anticuerpo
quimérico anti-P30 no mostró ninguna diferencia en
la estabilidad con relación a los anticuerpos del calibrador
humano.
Estos datos demuestran que los anticuerpos
quiméricos pueden producirse teniendo características de estabilidad
adecuadas para la fabricación comercial. La lenta descomposición
observada con el estrés térmico del epítopo P30 subraya la
importancia de elegir cuidadosamente el epítopo reconocido por el
anticuerpo quimérico. En este caso, se realizó una comparación entre
las características de unión de un anticuerpo quimérico monoclonal y
las de un antisuero policlonal. En este último caso, los epítopos
múltiples en un antígeno dado (por ejemplo P30) se reconocen, y la
pérdida de cualquiera de estos puede no apreciarse. Una ventaja de
esta tecnología es que se pueden seleccionar los anticuerpos
monoclonales murinos candidatos para propiedades deseadas antes de
clonar las regiones V y producir el anticuerpo quimérico. Las
propiedades del anticuerpo quimérico reflejarán las del anticuerpo
donador original. Para el ensayo IgG IMx Toxo, mezclando los
anticuerpos quiméricos anti-P30 y
anti-P66, las características combinadas
proporcionan un nivel de actuación equivalente a los calibradores de
anticuerpo humano convencional. Esto establece que los anticuerpos
quiméricos pueden utilizarse como controles y calibradores en lugar
de suero humano positivo. En algunos casos, puede ser suficiente un
anticuerpo quimérico monoclonal sencillo. En otros casos, puede ser
necesario un conjunto de más de un anticuerpo quimérico para
alcanzar las características de actuación del ensayo deseadas.
Para examinar si hubo una variación significativa
lote a lote en la expresión de los epítopos P30 y P66 reconocidos
por los anticuerpos quiméricos, las mezclas de los anticuerpos
quiméricos anti-P30 y anti-P66 en
los niveles del calibrador B y del calibrador F se ensayaron con
múltiples lotes de antígenos. Los resultados de este análisis con
siete lotes independientes de antígenos se muestran en la Figura 16.
La actuación de ambas mezclas de anticuerpos quiméricos
anti-P66 y anti-P30 se compararon
(en la variabilidad del ensayo) con el calibrador de suero humano
IMx actual. Esto valida además el potencial de los anticuerpos
quiméricos de ratón-humano como un sustituto para
los anticuerpos humanos positivos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Hackett, Jr., John R.
\hskip3,25cmHoff, Jane A.
\hskip3,25cmOstrow, David H.
\hskip3,25cmGolden, Alan M.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Reactivos para uso como calibradores y controles
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 70
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Abbott Laboratories
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 100 Abbott Park Road
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Abbott Park
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: IL
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 60064-3500
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.30
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Becker, Chery L.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35,441
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5865.US.01
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 847-935-1729
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 847-938-2623
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 138 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 447 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 131 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 428 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 141 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 452 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 131 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 424 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTCGGATAG ATCTAGTGGA TAGACTGATG G
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTCGGATAG ATCTAGTGGA TAGACCGATG G
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTCGGATAG ATCTTGGATG GTGGGAAGAT G
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACTAGTCG ACATGGMTTG GGTGTGGAMC TTGCTATTCC TG
\hfill42
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACTAGTCG ACATGAAGTT GCCTGTTAGG CTGTTGGTGC TG
\hfill42
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACTAGTCG ACATGGRATG GAGCKGGRTC TTTMTCTT
\hfill38
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACTAGTCG ACATGGAGWC AGACACACTC CTGYTATGGG T
\hfill41
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGACTGTAAC TAGTCCTGCG GGTCCTCAGG GAGTGCATCC GCCCCAACCC TTTTCCCCCT
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipC
\hfill61
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGACGGGGAA TTCTCACAGG AGAC
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGAACTAGTG GAGC
\hfill14
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCCACTAGTT CCGC
\hfill14
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACGTCATCCG ACCCCCTACAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCCCCAAA GCCAAGGTCA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCCAGCTTC ACCAGATCCC TCGAC
\hfill25
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCCAGCTTC ACCAGATCCC TCGAG
\hfill25
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCCACCTGCC TCACCTTAG
\hfill19
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGAATGGCCA CGTCATCCG
\hfill19
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCCAATGCAC TGGGTGAAGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCAAACCGTC CCTTGAAGTC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTTACATTG GTATCTGCAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCAGAAAATC GGTTGGAAAC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGAGACTCCA ACCATGGGAT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGATAGAGTG GGTGACACAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCCCTGCCCT TGAATTTCTC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTAGAGCTCTC AGAGATGGAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTATGCTGCA TCCAACCTAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGATGAATGTT GAGGGTGAAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATACAAGAAC AACTCTGACA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTCTTCGTCC CACCCCGCG
\hfill19
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCCATGTGT GTCCCCGGTG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATCCTTTGCC AGATCTTCC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACTCTTGCCC CTCTTCCTGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACCAGCGCC CCAATGCCTG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTTGCATGCA CACACAGAGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCATCCACTG CACGAAGACG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGGGCAGGTC TGTGTGGGTC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCATGGTTCCC ACCCAAAGAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACTCTTTGGC CTCAGCCTGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCACACCACG TGTTCGTCTG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTGCATGCAA ACTAACCGTG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTCCTCCCA TATGGTCGAC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAGGCCCGAT GTCTACTTGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCATGGGCC ACCACGCAGG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCGAGGAT GACTGGAATT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTGGTCACA TACTTCTCCG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGGGAGCTGC ATGTGTCAG
\hfill19
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAGACACTGG ACGCTGAACC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGATCTAGCG GCCGTCGCAC TCAGTAGCAG GTGCCAGCTG TGTCGGAC
\hfill48
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGATCGAGA TATCAAGCCA CTGAGGCACG CAGGTGGGTG
\hfill40
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 58:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCAGGTGACT GAACTAGTCC TTGGTGGGGC AGCCACAGCG
\hfill40
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 59:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCACGAAGTC TAGACCTCAA ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTG
\hfill47
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 60:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAATCTATGG ATCCTGACAC ACTTACGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTC C
\hfill51
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 61:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACTATACT CGAGACATCA TGGCTTGGGT GTGGACCTTG CTA
\hfill43
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 62:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.333000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTCAGATCAA GCTTGACACA CTTACCTGAG GAGACGGTGA CTGAGGTTCC
\hfill50
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 63:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCACGAAGTC TAGAGCTCTC AGAGATGGAG TCAGACACAC TCCTGCTA
\hfill48
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 64:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAATCTATGG ATCCTAGACAC ACTTACGTTT TATTTCCAGC TTGGTCCCCG
\hfill50
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 65:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACTATACT CGAGACTCCA ACCATGGGAT GGAGCTGGAT CTTTCTC
\hfill47
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 66:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTCAGATCAA GCTTGACACA CTTACCTGAG GAGACTGTGA GAGGGGTG
\hfill48
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 67:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTAAAACGAC GGCCAGT
\hfill17
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 68:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAGGAAACAG CTATGAC
\hfill17
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 69:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAGCGGATAA CAATTTCACA CAGG
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 70:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGTAAAACGA CGGCCAGT
\hfill18
Claims (31)
1. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos que pueden estar presentes en una muestra de ensayo,
comprendiendo dicho método (a) poner en contacto dicha muestra de
ensayo sospechosa de contener dicho anticuerpo con antígeno
específico para dicho anticuerpo durante un período de tiempo y en
condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos
antígeno/anticuerpo, (b) detectar la presencia de dicho anticuerpo
que puede estar presente en dicha muestra de ensayo, y (c) emplear,
como control o calibrador uno o más reactivos cada uno de los cuales
se une a dicho antígeno y es un anticuerpo monoclonal quimérico que
comprende regiones variables de cadena pesada y ligera de una
especie hospedadora fusionada a regiones constantes de cadena ligera
y pesada de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o
de una especie hospedadora relacionada con la misma especie
hospedadora que el anticuerpo a medir en base a la interreactividad
inmunológica de epítopos de región constante, donde cuando se
emplean uno o más reactivos como control o calibrador, dichos
reactivos se unen a epítopos diferentes en dicho antígeno.
2. El método de la reivindicación 1 que comprende
las etapas de añadir un conjugado directo o indirecto a dichos
complejos antígeno/anticuerpo resultantes durante un período de
tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho
conjugado se una a dicho anticuerpo unido, donde dicho conjugado
comprende un anticuerpo unido a un compuesto que genera señales
capaz de generar una señal detectable, y de detectar la presencia de
dicho anticuerpo que puede estar presente en dicha muestra de ensayo
detectando la señal generada por dicho compuesto que genera
señales.
3. Un kit para determinar la presencia de
anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende:
a. un antígeno específico para dicho anticuerpo;
y
b. un control o calibrador que comprende uno o
más reactivos cada uno de los cuales se une a dicho antígeno y es un
anticuerpo monoclonal quimérico que comprende regiones variables de
cadena pesada y ligera de una especie hospedadora fusionada a
regiones constantes de cadena pesada y ligera de la misma especie
hospedadora que el anticuerpo a medir o de una especie hospedadora
con relación a la misma especie hospedadora que el anticuerpo a
medir en función de la interreactividad inmunológica de epítopos de
región constante, donde cuando dicho control o calibrador comprende
dos o más reactivos, dichos reactivos se unen a diferentes epítopos
en dicho antígeno.
4. El kit de la reivindicación 3 que comprende
adicionalmente un conjugado directo o indirecto que comprende un
anticuerpo unido a un compuesto que genera señales capaz de generar
una señal detectable.
5. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos que pueden estar presentes en una muestra de ensayo,
comprendiendo dicho método (a) poner en contacto dicha muestra de
ensayo sospechosa de contener dicho anticuerpo con
anti-anticuerpo específico para dicho anticuerpo
durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para
permitir la formación de complejos
anti-anticuerpo/anticuerpo, (b) detectar la
presencia de dicho anticuerpo que puede estar presente en dicha
muestra de ensayo, y (c) emplear, como control o calibrador uno o
más reactivos cada uno de los cuales se une a dicho
anti-anticuerpo y es un anticuerpo monoclonal
quimérico que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera
de una especie hospedadora fusionadas a regiones constantes de
cadena pesada y ligera de la misma especie hospedadora que el
anticuerpo a medir o de una especie hospedarora relacionada con la
misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir en función de la
interreactividad inmunológica de los epítopos de región constante,
donde dicho uno o más reactivos se unen a un antígeno específico
para dicho anticuerpo y, cuando se emplean dos o más reactivos, se
unen a diferentes epítopos en dicho antígeno.
6. El método de la reivindicación 5, que
comprende las etapas de añadir un conjugado a dichos complejos
anti-anticuerpo/anticuerpo resultantes durante un
período de tiempo y en condiciones suficientes para permitir que
dicho conjugado se una a dicho anticuerpo unido, donde dicho
conjugado comprende un antígeno unido a un compuesto que genera
señales capaz de generar una señal detectable y de detectar la
presencia de dicho anticuerpo que puede estar presente en dicha
muestra de ensayo detectando la señal generada por dicho compuesto
que genera señales.
7. Un kit para determinar la presencia de
anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende:
a. un anti-anticuerpo específico
para dicho anticuerpo; y
b. un antígeno específico para dicho anticuerpo o
un conjugado directo o indirecto que comprende un antígeno unido a
un compuesto que genera señales capaz de generar una señal
detectable; y
c. un control o calibrador que comprende uno o
más reactivos cada uno de los cuales se une a dicho antígeno y es un
anticuerpo monoclonal quimérico que comprende regiones variables de
cadena pesada y ligera de una especie hospedadora fusionada a
regiones constantes de cadena pesada y ligera de la misma especie
hospedadora que el anticuerpo a medir o de una especie hospedadora
con relación a la misma especie hospedadora que el anticuerpo a
medir en función de la interreactividad inmunológica de los epítopos
de región constante, donde cuando dicho control o calibrador
comprende dos o más reactivos, dichos reactivos se unen a
diferentes epítopos en dicho antígeno.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 5 y 6 donde se emplea un reactivo como
calibrador o control.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 5 y 6 donde uno o más reactivos que se unen a
diferentes epítopos en dicho antígeno se emplean como calibrador o
control.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 5 y 6 donde cada uno de dichos anticuerpos
monoclonales quiméricos comprende regiones variables de cadena
pesada y ligera de una roedor fusionadas a regiones constantes de
cadena pesada y ligera de un ser humano.
11. El método de la reivindicación 10 donde dicho
roedor es un ratón.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 5 y 6 donde el anticuerpo monoclonal
quimérico se une específicamente a Toxoplasma gondii,
preferiblemente a proteínas P30 o P66 del mismo.
13. El método de la reivindicación 8 donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina codificada por la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 2 o variaciones alélicas de la misma y una región
variable de cadena ligera murina codificada por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 4 o variaciones alélicas de la
misma.
14. El método de la reivindicación 8 donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 1 y una región variable de cadena ligera murina que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.
15. El método de la reivindicación 8, donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina codificada por la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 6 o variaciones alélicas de la misma y una región
variable de cadena ligera murina codificada por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 8, o variaciones alélicas de la
misma.
16. El método de la reivindicación 8 donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 5 y una región variable de cadena ligera murina que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7.
17. El método de la reivindicación 9, donde uno
de dichos anticuerpos monoclonales quiméricos comprende una región
variable de cadena pesada murina codificada por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o variaciones alélicas de la misma y
una región variable de cadena ligera murina codificada por la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 4. o variaciones alélicas
de la misma y otro de dichos anticuerpos monoclonales quiméricos
comprende una región variable de cadena pesada murina codificada por
la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 6 o variaciones
alélicas de la misma y una región variable de cadena ligera murina
codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 o
variaciones alélicas de la misma.
18. El método de la reivindicación 9 donde uno de
dichos anticuerpos monoclonales quiméricos comprende una región
variable de cadena pesada murina que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y una región variable de cadena
ligera murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
3 y otro de dichos anticuerpos monoclonales quiméricos comprende una
región variable de cadena pesada murina que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 y una región variable de cadena
ligera murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
7.
19. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 3, 4 y 7 donde dicho calibrador o control comprende
un reactivo que se une a dicho antígeno.
20. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 3, 4 y 7 donde dicho calibrador comprende dos o más
reactivos que se unen a diferentes epítopos en dicho antígeno.
21. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 3, 4 y 7 donde cada uno de dichos anticuerpos
monoclonales quiméricos comprende regiones variables de cadena
pesada y ligera de un roedor fusionadas a regiones constantes de
cadena ligera y pesada de un ser humano.
22. El kit de la reivindicación 20 donde dicho
roedor es un ratón.
23. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 5 y 6 donde el anticuerpo monoclonal
quimérico se une específicamente a Toxoplasma gondii,
preferiblemente a las proteínas P30 o P66 de la misma.
24. El kit de la reivindicación 19 donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina codificada por la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 2 o variaciones alélicas de la misma y una región
variable de cadena ligera murina codificada por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 4 o variaciones alélicas de la
misma.
25. El kit de la reivindicación 19, donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 1 y una región variable de cadena ligera murina que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.
26. El kit de la reivindicación 19, donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina codificada por la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 6 o variaciones alélicas de la misma y una región
variable de cadena ligera murina codificada por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 o variaciones de alélicas de la
misma.
27. El kit de la reivindicación 19 donde dicho
anticuerpo monoclonal quimérico comprende una región variable de
cadena pesada murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 5 y una región variable de cadena ligera murina que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7.
28. El kit de la reivindicación 20 donde uno de
dichos anticuerpos monoclonales quiméricos comprende una región
variable de cadena pesada murina codificada por la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o variaciones alélicas de la misma y
una región variable de cadena ligera murina codificada por la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 4 o variaciones alélicas
de la misma y otro de dichos anticuerpos monoclonales quiméricos
comprende una región variable de cadena pesada murina codificada por
la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 6 o variaciones
alélicas de la misma y una región variable de cadena ligera murina
codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 o
variaciones alélicas de la misma.
29. El kit de la reivindicación 20 donde uno de
dichos anticuerpos monoclonales quiméricos comprende una región
variable de cadena pesada murina que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y una región variable de cadena
ligera murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
3 y otro de dichos anticuerpos monoclonales quiméricos comprende una
región variable de cadena pesada murina que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 y una región variable de cadena
ligera murina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
7.
30. Un método para detectar la presencia de
anticuerpos, desarrollados contra más de un antígeno, que pueden
estar presentes en la una muestra de ensayo donde dicho método
comprende (a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa
de contener dichos anticuerpos con antígenos específicos para dichos
anticuerpos, respectivamente, durante un período de tiempo y en
condiciones suficientes para permitir la formación de complejos
antígeno/anticuerpo, (b) añadir conjugados directos o indirectos a
dichos complejos antígeno/anticuerpo durante un período de tiempo y
en condiciones suficientes para permitir que dichos conjugados se
unan a dichos anticuerpos unidos, donde dichos conjugados comprenden
un anticuerpo unido a un compuesto que genera señales capaz de
generar una señal detectable, (c) detectar la presencia de dichos
anticuerpos que pueden estar presentes en dicha muestra de ensayo
detectando la señal generada por dicho compuesto que genera señales,
y (d) emplear, como controles o calibradores, reactivos que se unen
a dichos antígenos, caracterizados porque cada uno de dichos
reactivos se une a dichos antígenos, respectivamente, y es un
anticuerpo monoclonal quimérico que comprende regiones variables de
cadena ligera y pesada de una especie hospedadora fusionada a
regiones constantes de cadena ligera y pesada de la misma especie
hospedadora que el anticuerpo a medir o de una especie hospedadora
relacionada con la misma especie hospedadora que el anticuerpo a
medir en función de la interreactividad inmunológica de epítopos de
región constante.
31. Un kit para determinar la presencia de
anticuerpos, desarrollados contra más de un antígeno, que puede
estar presente en una muestra de ensayo que comprende:
a. antígenos específicos para dichos anticuerpos,
respectivamente;
b. conjugados directos o indirectos comprendiendo
cada uno de ellos un anticuerpo unido a un compuesto que genera
señales capaz de generar una señal detectable; y
c. controles y calibradores que comprenden
reactivos que se unen a dichos antígenos respectivos, donde cada uno
de dichos reactivos es un anticuerpo monoclonal quimérico que
comprende regiones variables de cadena pesada y ligera de una
especie hospedadora fusionada a regiones constantes de cadena pesada
y ligera de la misma especie hospedadora que el anticuerpo a medir o
de un especie hospedadora relacionada con la misma especie
hospedadora que el anticuerpo a medir en función de la
interreactividad inmunológica de los epítopos de región
constante.
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