ES2205257T3 - Diagnostico de una enfermedad espongiforme. - Google Patents
Diagnostico de una enfermedad espongiforme.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA PRUEBA DESTINADA A DIAGNOSTICAR LA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME ASI COMO OTROS ESTADOS DE DEMIELINIZACION EN LOS MAMIFEROS. ESTA PRUEBA DE DIAGNOSTICO INCLUYE UN ANALISIS DE ANTICUERPOS PRESENTES EN EL MAMIFERO, ANTICUERPOS VINCULADOS CON UN PEPTIDO ANTIGENICO QUE MUESTRA UNA MIMICA MOLECULAR UN PEPTIDO DE MIELINA MAMELIANA, POR EJEMPLO UN PEPTIDO QUE TIENE LAS SECUENCIAS FSWGAEGQK. ESTA INVENCION ES UTIL PARA DETECTAR EL ESB EN LOS BOVINOS, PROCEDIENDO A UN ANALISIS DE SUERO RECOGIDO EN LOS BOVINOS, CON EL FIN DE DETECTAR EN ELLOS ANTICUERPOS CONTRA UNA ESPECIE DE ACINETOBACTER, DE AGROBACTERIUM O RUMINOCOCCUS, O CONTRA UN PEPTIDO QUE TIENE UNA SECUENCIA PRESENTE EN DICHAS ESPECIES Y QUE MIMA UN PEPTIDO DE MIELINA BOVINA. ESTA INVENCION SIRVE TAMBIEN PARA IDENTIFICAR A LOS ANIMALES QUE TIENEN UNA TASA DE ANTICUERPOS DE MAS DE POR LO MENOS DOS DESVIACIONES-TIPOS CON RELACION A LA DE ANIMALES TESTIGOS SANOS.
Description
Diagnóstico de una enfermedad espongiforme.
Esta invención se refiere a la detección de la
encefalopatía espongiforme y otros estados de desmielinización en
mamíferos y esta particularmente, pero no exclusivamente,
relacionada con el diagnostico de la encefalopatía espongiforme
bobina (EEB).
La EEB es un trastorno neurológico reciente del
ganado, que fue reportado por primera vez en el Reino Unido después
de 1982, seguido de un cambio en la preparación de los piensos
"carne y hueso". La EEB ha atraído algo del interés público. Se
ha sugerido que la EEB está causada por "priones", un tipo de
proteína infecciosa.
La presente invención se basa en un modelo
alternativo de génesis de formas diversas de la encefalopatía
espongiforme y otros estados de desmielinización en mamíferos. Según
el modelo propuesto, la EEB y las enfermedades relacionadas se
conciben como enfermedades autoinmunes que surgen como resultado de
una mímica molecular entre ciertos agentes contagiosos y la mielina
del mamífero infectado. Este nuevo modelo de EEB, en particular, se
basa en las siguientes observaciones experimentales.
Una característica histopatológica característica
de la EEB es un aspecto "espongiforme", que también ocurre en
la "encefalomielitis alérgica experimental" (EAE, del inglés
Experimental Allergic Encephalomyelitis) crónica pero no aguda, al
menos en conejos y cobayas. Se informó hace más de veinticinco años
que una secuencia corta de mielina bovina (FSWGAEGQK), que resiste
la desnaturalización seguida de calentamiento a 100ºC durante una
hora, producía la parálisis de los cuartos traseros, temblores y
muerte, seguido de la inoculación a las cobayas, y que en algún
grado se parece a las características observadas en el ganado que
sufre de EEB. Según la presente invención, esta secuencia se ha
usado como una prueba para investigar proteínas que muestran una
mímica molecular. Esta secuencia, en su forma desnaturalizada, se
puede describir como encefalitogénica.
El análisis de proteínas en las bases de datos
(Genbank and SwissProt) reveló que 3 microbios mostraban una mímica
molecular de la secuencia de mielina bovina, siendo encontrada la
mejor en la
4-carboxi-muconolactona-decarboxilasa
del Acinetobacter calcoaceticus, un microbio común en el
suelo y en los sistemas de abastecimiento de agua. Las semejanzas de
series se muestran en la siguiente Tabla.
En conformidad con el nuevo modelo, ahora se ha
encontrado que el suero de ganado afectado con EEB contiene niveles
significativamente elevados de anticuerpos de la especie
Acinetobacter.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un ensayo de diagnóstico para la encefalopatía espongiforme y otros
estados de desmielinización en mamíferos, especialmente la
encefalopatía espongiforme bobina (EEB), la esclerosis múltiple
(EM), o la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ),
que comprende ensayar los anticuerpos presentes en el mamífero, que
son anticuerpos de una especie del Acinetobacter que exhiben
una mímica molecular de un péptido de mielina de mamíferos y
contienen la secuencia peptídica ISRFAWGEV.
El término "mímica molecular" se refiere a
un grado de semejanza (homología de secuencia) entre el péptido
antigénico y un péptido de mielina que da como resultado la
formación de anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con la
mielina y desmielinizan el tejido nervioso. La presencia de tales
anticuerpos a niveles elevados comparados con los encontrados en
animales no infectados es por lo tanto un marcador para la EEB, que
puede usarse para detectar la EEB en una etapa temprana a la que se
puede tomar una acción curativa u otra acción apropiada.
El ensayo se puede llevar a cabo con el uso de un
kit para ensayo de diagnóstico que contiene el Acinetobacter
completo como el antígeno de ensayo. Se puede usar cualquier
variedad de Acinetobacter que tenga el péptido antigénico
arriba identificado. Por otra parte, puede usarse como antígeno de
ensayo un péptido derivado de la bacteria, por ejemplo el péptido
aislado ISRFAWGEV o una forma sintética de este péptido. Se puede
usar cualquier tipo apropiado de procedimiento de ensayo, siendo
especialmente conveniente el método ELISA.
Los niveles de anticuerpos indicativos de EEB son
aquellos que son significativamente mayores que los niveles de
control. Normalmente, los niveles elevados en aproximadamente 2
desviaciones estándar por encima de los niveles de control se
pueden tomar como una indicación positiva, aunque pueden ser
posibles o deseables tomar márgenes en torno a esta figura con el
propósito de precaución.
Los procedimientos para llevar a cabo un ensayo
según esta invención se describen en el siguiente ejemplo
ilustrativo, basado en la comparación del suero procedente de
animales que se sabe que han tenido la EEB con el suero procedente
de animales sanos.
El suero procedente de 29 animales, que se
encontró en exámenes post-mortem que satisfacían el
criterio de EEB y el de 18 animales que no lo satisfacían se
suministraron por el Central Veterinary Laboratory (CVL) (New Haw,
Addlestone, Surrey), un organismo ejecutivo del Ministry of
Agriculture, Fisheries and Food (MAFF) del Reino Unido. Los 18
animales que no tenían EEB se habían enviado al CVL por su
comportamiento anormal pero los exámenes
post-mortem llevados a cabo por el MAFF habían
excluido EEB.
Además, se usaron como controles adicionales 30
sueros procedentes de animales con edades de menos de 30 meses
(A<30M) y 28 sueros procedentes de animales con edades de más de
30 meses (A>30M) (todos los animales Friesians). Estos se
recogieron de una granja, mantenida bajo condiciones de
"explotación orgánica" en la que no se había informado de EEB.
Las muestras de suero se obtuvieron durante una prueba de manada
rutinaria.
El Acinetobacter calcoaceticus se obtuvo
de la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.
NCIMB 10694 (Aberdeen). Los cultivos se desarrollaron en 21 matraces
en un agitador orbital durante 2 días a 30ºC, en 200 ml de un medio
nutriente (Oxoid; 25 g/l). Los matraces se inocularon con 10 ml del
correspondiente cultivo iniciador dejando la agitación a 37ºC
durante 6 horas. Los lotes de células del cultivo se recogieron
mediante centrifugación a 6.000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ºC
(MSE 18,6 x 250 ml rotor). A continuación, se lavaron los pelets de
las células tres veces con una disolución salina tamponada con
fosfato 0,15 M (PBS, del inglés phosphate-buffered
saline) (PBS; pH 7,4) antes de ser finalmente resuspendidos en 20
ml de PBS. Una muestra en blanco de la suspensión se preparó por
dilución en tampón de carbonato 0,05 M (pH 9,6) resultando una
lectura de Densidad Óptica (DO) de 0,25 en el espectrofotómetro
(Corning Model 258).
Los ensayos ELISA, del ingles
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, se llevaron a
cabo en la manera convencional. Brevemente, las placas ELISA se
revistieron con bacterias durante toda la noche a 4ºC y las
posiciones no específicas se bloquearon con PBS que contenía 01%
Tween, 0,2% de ovalbúmina (Sigma, Grade III), las placas se lavaron
y se añadió una disolución 1/200 de ensayo o suero de control. Las
placas se incubaron a 37ºC durante 1 hora, se lavaron y se añadió
anti- inmunoglobilina de vaca de conejo (IG+IgA+IgM) (1:4000) (Dako
Ltd.). Las placas se volvieron a incubar durante 2 horas, se
lavaron y se añadió el substrato. La reacción se detuvo con una
disolución de fluoruro sódico de 2 mg/ml (Sigma). Las placas se
leyeron a 630 nm sobre un lector de placas de microvaloración
(Dynatech MR 600) y los resultados se expresaron como DO \pm D.E.
(Desviación Estándar). Todos los estudios se llevaron a cabo bajo
un código que el analista no conocía cuales eran los sueros de
control o los sueros de ensayo. La unidades de DO medidas para los
anticuerpos de inmunoglobulina total en los diferentes grupos se
compararon usando la prueba de la t de Student.
1. Diluir el antígeno en un tampón de
revestimiento, añadir 200 \mul a cada pocillo. Incubar durante
toda la noche a 4ºC cubierto con una lámina.
2. Lavar el antígeno, usando un tampón de
lavado/incubación; los pocillos de la placa deberán estar
completamente llenos durante las etapas de lavado mientras que el
Tween-20 previene que cualquier forma de proteína
adicional se absorba sobre el plástico. Lavar 3 veces, dejando
aproximadamente intervalos de 4 minutos a temperatura ambiente.
3. Incubar la placa a 37ºC durante 1 hora con
0,2% de Ovalbúmina en un tampón de lavado/incubación.
4. Añadir 200 \mul del suero de ensayo. Las
diluciones se hacen en tampón de lavado/incubación. Incubar durante
2 horas a 37ºC, cubierto con una lámina.
5. Repetir el proceso de lavado como se indica en
el paso 2.
6. Añadir 200 \mul de anticuerpo secundario
conjugado con peróxidasa de rábano silvestre (HRP, del inglés
Horseradish Peroxide), también diluido en disolución tampón de
lavado/incubación.
7. Repetir el proceso de lavado como se indica en
el paso 2.
8. Añadir 200 \mul de substrato (ABTS) a los
pocillos; dejar desarrollar el color durante aproximadamente 20
minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Detener la reacción
con 100 \mul de disolución para parar la reacción y leer la placa
a 630 nm.
Los anticuerpos de A. Calcoaceticus de la
inmunoglobulina total (IgG + IgA + IgM) eran significativamente
elevados en los sueros con EEB (media \pm D.E.: 0,99 \pm 0,05)
cuando se comparaban con los controles de CVL (0,65 \pm 0,06)
(t=4,48, p<0,001), los controles procedentes de la explotación
orgánica con edades de más de 30 meses (0,57 \pm 0,03) (t=7,19,
p<0,001) y los controles procedentes de la explotación orgánica
con edades de menos de 30 meses (0,53 \pm 0,02) (t=8,84,
p<0,001). Estos resultados se muestran en la Figura adjunta.
Valoraciones de anticuerpos (barra = media) para
los 30 controles con edades de menos de 30 meses (A<30 meses),
los 28 controles con edades de más de 30 meses (A>30 meses), los
18 controles procedentes del Central Veterinary Laboratory (CVL)
comparadas con los 29 sueros con EEB, cuando se ensayaron contra la
Acinetobacter calcoaceticus (Figura 1-a) y
E. Coli (Figura 1-b). (La línea punteada
representa los límites de confianza del 95% para la media de los
controles: A<30m + A>30m - una prueba de cola) (DO= densidad
óptica, del inglés Optical Density).
No había diferencia significativa entre los
controles procedentes del CVL y los controles procedentes de una
explotación orgánica con edades de más de 30 meses, pero había una
diferencia pequeña, significativa estadísticamente, con el suero
procedente de animales con edades de menos de 30 meses (t=2,41,
p<0,05). Una re- examinación del suero de control procedente de
CLS con el nivel más alto de anti-Acinetobacter de 1,16 DO,
mostró que procedía de un animal de control clínicamente normal,
diagnosticado como negativo a la EEB según el criterio de
diagnóstico legal, y que también era negativo cuando se probó para
las fibras asociadas al temblor (scrapie). Sin embargo, este caso,
tenía una vacuolación de materia blanca de la substabtia nigra y de
la cápsula interna, aunque esto se había visto con anterioridad no
se consideró significante.
Un resultado claro de estos estudios, es que al
menos en una "encefalopatía espongiforme transmisible" (EET,
del ingles Transmissible Spongiform Encephalophathy), esto es la
EEB, se puede demostrar una respuesta inmune específica contra un
microbio que se encuentra fácilmente en el medio del ganado y que
también ocurre que posee una secuencia molecular que se parece a la
mielina bovina.
Otras formas de encefalopatía espongiforme
incluyendo la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ)
y esclerosis múltiple (EM) están abiertas a la explicación con el
mismo modelo que se ha indicado para la EEB. En la actualidad suero
con la ECJ y con la EM está sometido a ensayo para confirmar la
presencia de anticuerpos de reacción cruzada.
Claims (13)
1. Un método de ensayar la encefalopatía
espongiforme y otros estados desmielinizantes en mamíferos,
especialmente la encefalopatía espongiforme bobina (EEB), la
esclerosis múltiple (EM), o la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (ECJ), que comprende ensayar los
anticuerpos presentes en una muestra recogida de un mamífero que son
anticuerpos a una especie del Acinetobacter que a su vez
contiene la secuencia peptídica ISRFAWGEV.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
la especie del Acinetobacter es Acinetobacter
calcoaceticus.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, que
usa como antígeno de ensayo la bacteria completa de la especie
Acinetobacter.
4. Un método según la reivindicación 1, que usa
como antígeno de ensayo un péptido que tiene la secuencia
ISRFAWGEV.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para la EEB en ganado.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para la esclerosis múltiple en seres
humanos.
7. Un método para ensayar la EEB en ganado, que
comprende ensayar una muestra biológica recogida del ganado para
anticuerpos de una especie del Acinetobacter que contiene la
secuencia peptídica ISRFAWGEV.
8. Un método según la reivindicación 7, que
comprende identificar animales que tienen un nivel de anticuerpos
de al menos aproximadamente dos desviaciones estándar por encima del
nivel de los animales de control sanos.
9. Un kit de ensayo de diagnóstico para detectar
la encefalopatía espongiforme o el estado desmielinizante en
mamíferos por el método de la reivindicación 1, en el que el
antígeno de ensayo es una bacteria de una especie de
Acinetobacter que contiene la secuencia peptídica ISRFAWGEV o
es un péptido antigénico que tiene una secuencia ISRFAWGEV.
10. Un kit de ensayo de diagnóstico según la
reivindicación 9, en el que el péptido antigénico es un péptido
sintético.
11. Un kit de ensayo de diagnóstico según la
reivindicación 9 ó 10, para la EEB en ganado.
12. Un kit de ensayo de diagnóstico según la
reivindicación 9 ó 10, para la EM en seres humanos.
13. Un kit de ensayo de diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que es un kit para
ensayo ELISA.
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