ES2205266T3 - Metodo para detectar ige. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DESTINADO A DETECTAR IGE MEDIANTE UN RECEPTOR HUMANO FC EPSILON (FC EP R), PARA DETECTAR ANTICUERPOS DE IGE EN UNA MUESTRA BIOLOGICA QUE PROCEDE DE UN RATON, DE UN PERRO O DE UN CABALLO. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS EQUIPOS DESTINADOS A LA REALIZACION DE DICHOS PROCEDIMIENTOS.

Description

Método para detectar IgE.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método nuevo para detectar inmunoglobulina épsilon (IgE). La presente invención incluye también nuevos kits para detectar la IgE así como métodos para producir el reactivo de detección.

Fundamento de la invención

El diagnóstico de enfermedades y la determinación de la eficacia del tratamiento son herramientas importantes en medicina. En particular la detección de la producción de IgE en un animal puede ser indicativa de enfermedad. Tales enfermedades incluyen, por ejemplo, alergia, la enfermedad atópica, el síndrome de hiper IgE, las infecciones parasitarias internas y la neoplasia de células B. Además, la detección de la producción de IgE en un animal después de un tratamiento, es indicativa de la eficacia del tratamiento, tal como cuando se emplean tratamientos destinados a interrumpir la producción de IgE.

Hasta el descubrimiento de la presente invención, la detección de IgE en muestras obtenidas de animales no humanos ha sido impedida por la ausencia de reactivos adecuados para detectar IgE. Diversos compuestos han sido usados para detectar IgE en composiciones que contienen IgE. En particular han sido empleados para detectar IgE anticuerpos que se unen selectivamente a anticuerpos del idiotipo épsilon (es decir, anticuerpos anti-IgE). Estos anticuerpos anti-IgE, sin embargo, pueden soportar reacción cruzada con otros idiotipos de anticuerpos, tales como anticuerpos del isotipo gamma.. El descubrimiento de la presente invención incluye el uso de una molécula del receptor Fc épsilon (Fc_{\varepsilon}R) para detectar la presencia de IgE en una composición que se supone que puede contener IgE. La molécula de Fc_{\varepsilon}R proporciona una ventaja sobre, por ejemplo, anticuerpos anti-I, para detectar IgE debido a que la molécula de Fc_{\varepsilon}R puede unirse a una IgE con más especificidad (es decir, menor reactividad cruzada idiotípica) y más sensibilidad (es decir, afinidad) que los anticuerpos que fijan anti-IgE.

El resumen de la patente de Japón 095/007, 31 de Agosto de 1995, describe que el documento JP-092167 indica la separación de IgE por fijación de un péptido que fija IgE o un péptido de modificación que incluye un péptido que fija IgE, a un soporte soluble en agua y que une el péptido, específicamente, a la IgE. El resumen de la patente de Japón 095/006, 31 de Agosto de 1995, indica que el documento JP07-072150 describe un método para detectar o medir IgE, que puede, selectivamente, detectar o medir IgE capaz de inducir una reacción alérgica, La IgE existente en la muestra se hace reaccionar con la cadena alfa del receptor Fc_{\varepsilon} y la reacción se detecta o se mide. Se describe que el método es eficaz para el diagnóstico de alergenos y de diversas enfermedades tales como verminacions, trastornos hepáticos graves, eczema y mieloma de IgE.

Lowenthal et al., Annals of Allergy 71:481-484 indican que el suero del perro puede transferir reactividad cutánea al hombre. Aun cuando es posible que Lowenthal et al enseñan propiamente la unión de Fc_{\varepsilon}R humano a IgE canina, Lowenthal et al., sin embargo, no proporcionan datos que definan las proteinas celulares particulares responsables de la transferencia de la reactividad cutánea. Por tanto un experto en el tema podría llegar a la conclusión de que la transferencia de reactividad cutánea enseñada por Lowenthal et al, podía ser debida a una diversidad de interacciones moleculares diferentes y que la conclusión a que llegan Lowenthal et al es simplemente una interpretación. Además, Lowenthal et al no enseñan el uso de Fc_{\varepsilon}R humano purificado para detectar IgE canina. Las subunidades del Fc_{\varepsilon}R humano se conocen desde tan pronto como 1988 y nunca han sido empleadas para detectar IgE canina, felina o equina. Sin duda, la patente de EE.UU. No. 4.962.035 a Leder et al., otorgada el 9 de Octubre de 1990, describe Fc_{\varepsilon}R humano pero no indica el uso de tal Fc_{\varepsilon}R humano para detectar IgE humana o no humana. El uso de Fc_{\varepsilon}R humano purificado evita las complicaciones que se presentan por el uso de Fc_{\varepsilon}R unido a una célula, tal como la unión inespecífica de la célula portadora del Fc_{\varepsilon}R debida a moléculas adicionales presentes en la membrana celular. El que el Fc_{\varepsilon}R humano porificado detecta IgE no humana es inesperado debido a que la unión entre especies, entre un Fc_{\varepsilon}R y una IgE no es predecible. Por ejemplo, el Fc_{\varepsilon}R humano se une a IgE de la rata pero el Fc_{\varepsilon}R de la rata no se une a IgE humana.

El Fc_{\varepsilon}R de alta afinidad consta de tres cadenas de proteína, alfa, beta y gamma. Investigadores anteriores han descrito la secuencia de ácido nucléico de la cadena alfa (Kochan et al., Nucleic Acids Res. 16:3584, 1988; Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. 85:1907-1911, 1988; y Pang et al., J. Immunol. 151:6166-6174, 1993); la cadena beta (Kuster et al., J. Biol. Chem. 267:12782-12787, 1992); y la cadena gamma (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452, 1990).

Por tanto, son necesarios en la técnica métodos y kits que proporcionen la detección específica de IgE no humana.

Sumario de la invención

La presente invención incluye métodos de detección y kits que detectan IgE. Una realización de la presente invención es un método para detectar IgE que comprende: (a) poner en contacto una molécula del receptor Fc_{\varepsilon} humano (Fc_{\varepsilon}R) aislado con una composición que se supone que contiene IgE en condiciones adecuadas para la formación de un complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE, en el que la IgE esta seleccionada entre el grupo que consta de IgE canina, IgE felina e IgE equina; y (b) determinar la presencia de IgE detectando el complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE indicando la presencia del complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE la presencia de IgE. Una molécula preferida de Fc_{\varepsilon}R es en la que un grupo de hidrato de carbono de la molécula de Fc_{\varepsilon}R está conjugado a biotina.

Otra realización de la presente invención es un método para detectar IgE que comprende: (a) poner en contacto una célula recombinante con una composición que se supone que contiene IgE, en condiciones adecuadas para formar un complejo de célula recombinante:IgE, en el que la célula recombinante es una célula recombinante que expresa una molécula del Fc_{\varepsilon}R humano; y (b) determinar la presencia de IgE detectando el complejo de célula recombinante:IgE, indicando la presencia de IgE la presencia del complejo de célula recombinante:IgE. Una célula recombinante preferida incluye una célula RBL-hFc_{\varepsilon}R.

Otra realización de la presente invención es un método para detectar dermatitis alérgica por pulgas en no humanos, que comprende: (a) inmovilizar un alergeno de la pulga sobre un sustrato; (b) poner en contacto el alergeno de la pulga con una composición que se supone que contiene IgE en condiciones adecuadas para la formación de un complejo antígeno:IgE unido a dicho sustrato; (c) retirar del sustrato el material sin unir en condiciones que retienen el complejo de alergeno:IgE unido al sustrato; y (c) detectar la presencia de IgE detectando la presencia de dicho complejo de alergeno:IgE poniendo en contacto dicho complejo de alergeno:IgE con una molécula de Fc_{\varepsilon}R humano. Preferiblemente, el alergeno de la pulga es un antígeno de la saliva de la pulga y más preferiblemente productos de la saliva de la pulga y/o proteínas de la saliva de la pulga.

La presente invención incluye también un kit para llevar a cabo los métodos de la presente invención. Una realización es un kit para detectar IgE que comprende una molécula del receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano y medios para detectar una IgE incluyendo IgE canina, IgE felina e IgE equina. Otra realización es un kit de alergenos generales que comprende un alergeno no humano común a todas las regiones de los Estados Unidos de América y una molécula del receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano en la que el alergeno se une a la IgE. Otra realización es un kit para detectar dermatitis alérgica por pulgas en no humanos, que comprende una molécula del receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano y un alergeno de la pulga en el que el alergeno de la pulga se une a la IgE.

Otra realización de la presente invención es una proteína de la cadena alfa del receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano, aislada, en la que un grupo de hidrato de carbono de la proteína de la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R está conjugado a biotina. Una proteína preferida de la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R comprende Ph Fc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Descripción breve de las figuras

La Fig. 1 representa los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de la IgE canina.

La Fig. 2 representa los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE canina específicos de alergenos de plantas.

La Fig. 3 representa los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de la IgE humana o canina.

La Fig. 4 representa los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de la IgE canina específicos del alergeno de la pulga.

La Fig. 5 representa los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de la IgE canina específicos del alergeno de la pulga y específicos del antígeno de la filaria cardíaca (heartworm) (Dirofilaria immitis).

La Fig. 6 describe los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE canina específicos de la saliva de la pulga.

La Fig. 7 describe los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE felina específicos del antígeno de la filaria cardiaca.

La Fig. 8 describe los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE felina específicos del antígeno de la filaria cardiaca.

La Fig. 9 describe los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando la cadena alfa biotinilada del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE equina específicos de antígenos

La Fig 10 describe los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando células de la leucemia basófila que expresan la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE canina en sueros procedentes de perros infectados con la filaria cardiaca.

La Fig. 11 describe los resultados obtenidos en el ensayo ELISA usando células de la leucemia basófila que expresan la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano para detectar anticuerpos de IgE canina en sueros procedentes de perros sensibilizados con saliva de la pulga.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de que el receptor Fc épsilon humano, de alta afinidad, putificado (es decir, Fc_{\varepsilon}RI, al que se hace referencia en esta memoria como Fc_{\varepsilon}R) puede ser usado en ciertos métodos (por ejemplo, diagnóstico y exploración) y kits de detección a base de inmunoglobulina épsilon (a que se hace referencia en esta memoria como IgE o anticuerpo de IgE) no humana (es decir, canina, felina o equina). El uso de Fc_{\varepsilon}R humano para detectar IgE no humana es inesperado, debido a que los sistemas inmunológicos canino, felino y equino son diferentes del sistema inmunológico humano, asi como unos de otros (es decir, las moléculas importantes para el sistema inmunológico habitualmente son específicos de la especie).

Una realización de la presente invención es un método para detectar una IgE no humana usando una molécula de Fc_{\varepsilon}R humano aislada. Hay que hacer notar que la expresión "una" entidad se refiere a una o más de tal entidad; por ejemplo, una proteína se refiere a una o más proteínas o por lo menos una proteína. Por tanto, las expresiones "uno" (o "una"), "uno o más" y "por lo menos una" pueden usarse indistintamente en esta memoria. Ha de hacerse notar también que las expresiones "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pueden emplearse indistintamente. Además, un compuesto "seleccionado entre el grupo que consta de" hace referencia a uno o más de los compuestos que figuran en la lista que sigue, incluyendo mezclas (es decir, combinaciones) de dos o más de los compuestos.

Según la presente invención, una molécula del Fc_{\varepsilon}R aislada o biológicamente pura, es una molécula que ha sido separada de su medio natural. Por ello, "aislada" y "biológicamente pura" no reflejan necesariamente la extensión en que la molécula ha sido purificada. Una molécula del Fc_{\varepsilon}R humano aislada, de la presente invención, puede ser obtenida de su fuente natural (por ejemplo, de una célula cebada humana), puede ser producida usando tecnología del DNA recombinante o puede ser producida mediante síntesis química.

Una molécula del Fc_{\varepsilon}R (a la que se alude también en esta memoria como Fc_{\varepsilon}R o proteína del Fc_{\varepsilon}R) de la presenta invención puede ser una proteína de longitud total, una parte de una proteína de longitud total o cualquier homólogo de tal proteína. Tal como se emplea en esta memoria, una parte puede ser un polipéptido o un péptido. Una molécula de Fc_{\varepsilon}R de la presente invención puede comprender un Fc_{\varepsilon}R completo (es decir, las cadenas alfa, beta y gamma del Fc_{\varepsilon}R), la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R (a la que también se alude en esta memoria como cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R) o partes de la misma. Preferiblemente una molécula de Fc_{\varepsilon}R comprende por lo menos una parte de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R que se une a IgE, es decir, que es capaz de formar un inmunocomplejo con una región constante de la IgE. Preferiblemente, una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención se une a IgE con una afinidad de aproximadamente K_{a} = 10^{8}, más preferiblemente con una afinidad de aproximadamente K_{a} = 10^{9} y todavía más preferiblemente con una afinidad de aproximadamente K_{a} = 10^{10}.

La molécula del Fc_{\varepsilon}R aislada, de la presente invención, incluyendo un homólogo, puede ser identificada de un modo correcto mediante la aptitud de la molécula del Fc_{\varepsilon}R para formar un inmunocomplejo con una IgE. Ejemplos de homólogos del Fc_{\varepsilon}R incluyen proteínas del Fc_{\varepsilon}R de la que han sido suprimidos aminoácidos (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido), insertados, invertidos, sustituidos y/o derivatizados (por ejemplo, mediante glicoslación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitoilación, amidación y/o adición de glicerofosfatidil inositol) de tal modo que el homólogo incluya al menos un epítopo capaz de formar un inmunocomplejo con una IgE.

Los homológos del Fc_{\varepsilon}R pueden ser resultado de una variación alélica natural o una mutación natural. Los homólogos del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención pueden ser producidos también utilizando procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, modificaciones directas a la proteína o modificaciones al gen que codifica la proteína utilizando, por ejemplo, técnicas del DNA clásico o recombinante para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida al objetivo.

Según la presente invención, la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R humano de la presente invención es codificada por al menos una parte de la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena de codificación de un cDNA que codifica la proteina de longitd total de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R representada en esta memoria como SEQ ID NO: 1, la parte al menos que codifica el sitio de unión de la IgE de la proteína de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R. A la molécula de ácido nucleico de doble cadena que incluye tanto la cadena de codificación que tiene la SEQ ID NO: 1 como la cadena complementaria que no codifica (cuya secuencia de ácidos nucleicos puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica y que se muestra en esta memoria como SEQ ID NO: 3) se hace referencia en esta memoria como la molécula de ácido nucleico del Fc_{\varepsilon}R nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198}. La traducción de la SEQ ID NO: 1 sugiere que la molécula de ácido nucléico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198} codifica una proteína de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R de aproximadamente 257 aminoácidos a la que se hace referencia en esta memoria como PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{257}, representada por la SEQ ID NO: 2, suponiendo un marco de lectura abierto que tiene un codón de iniciación (inicio) que abarca desde el nucleótido 107 hasta el nucleótido 109 de la SEQ ID NO: 1, y un codón de terminación (detención) que abarca desde el nucleótido 878 hasta el nucleótido 880 de la SEQ ID NO: 1. La región de codificación que codifica PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{257} incluyendo el codón de detención, está representada por la molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{774} que tiene una cadena de codificación con la secuencia de los ácidos nucleicos representada en esta memoria como SEQ ID NO: 4. El cumplimiento de SEQ ID NO: 4 está representado en esta memoria como SEQ ID NO: 5. La SEQ ID NO: 1 codifica un péptido señal de aproximadamente 25 aminoácidos así como una proteína madura de aproximadamente 232 aminoácidos, denominada en esta memoria PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{232}, cuya secuencia de aminoácidos está representada en esta memoria como SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína madura aparente es denominada nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{699}; la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena de codificación, que se denomina en esta memoria SEQ ID NO: 7, codifica también un dominio transmembranal hidrófobo y una cola citoplásmica que es un grupo que abarca desde el aminoácido 205 al aminoácido 257 de la SEQ ID NO: 2. El conocimiento de estas secuencias de ácido nucleico y aminoácidos permite a los expertos en la técnica llevar a cabo modificaciones en las respectivas moléculas de ácido nucleico y proteínas, por ejemplo, desarrollar una proteína de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R con solubilidad aumentada y/o una proteína truncada (por ejemplo, un péptido) capaz de detectar IgE, por ejemplo, PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{197} y PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}. Las moléculas de Fc_{\varepsilon}R preferidas incluyen PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{257}, PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{197}, PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{232} y PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}. Las moléculas de ácido nucleico preferidas para codificar las moléculas de Fc_{\varepsilon}R incluyen nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{774}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{591}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{699} y/o nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{516}.

La proteína de la molécula de Fc_{\varepsilon}R aislada, de la presente invención, puede ser producida cultivando una célula capaz de expresar la proteína en condiciones efectivas para producir la proteína, y recuperar la proteína. Una célula preferida para cultivar es una célula recombinante que es capaz de expresar la proteína, produciéndose la célula recombinante mediante transformación de una célula hospedante con una o más moléculas de ácido nucleico de la presente invención. La transformación de una molécula de ácido nucleico en una célula puede conseguirse por cualquier método mediante el cual una molécula de ácido nucleico pueda ser insertada en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, aun cuando no se limitan a ellas, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. La célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecer en un tejido, órgano o un organismo pluricelular. Las moléculas de ácido nucleico transformadas de la presente invención, pueden permanecer extracomosómicas o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de tal modo que su aptitud para ser expresada quede retenida. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas y preferidas con la que transformar una célula son como las que se describen en esta memoria para moléculas de ácido nucleico del Fc_{\varepsilon}R adecuadas y preferidas, per se. Las moléculas de ácido nucleico particularmente preferidas para incluir en células recombinantes, de la presente invención, incluyen nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{774}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{591}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{699} y/o nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{516}.

Las células hospedantes adecuadas para transformar incluyen cualquier célula que pueda ser transformada con una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las células hospedantes pueden ser o bien células sin transformar o células que ya están transformadas con al menos una molécula de ácido nucleico. Las células hospedantes de la presente invención pueden ser o bien endógenamente (es decir, naturalmente) capaces de producir una proteína de la molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención, o pueden ser capaces de producir tales proteínas después de ser transformadas con al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las células hospedantes de la presente invención pueden ser cualesquiera células capaces de producir por lo menos una proteína de la presente invención, e incluyen células bacterianas, de hongos (incluyendo levaduras), de parásitos (incluyendo protozoos y ectoparásitos), de insecto, de otros animales y de plantas.

Preferiblemente, una célula recombinante es transfectada con una molécula recombinante de la presente invención, y es una molécula que puede incluir al menos una de cualquier molécula de ácido nucleico descrita hasta la fecha, enlazada operativamente a por lo menos una de una secuencia de control de la transcripción capaz de regular eficazmente la expresión de la molécula o moléculas de ácido nucleico en la célula que ha de ser transformada, ejemplos de las cuales se describen en la presente memoria. Una molécula recombinante particularmente preferida incluye pVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}. Detalles referentes a la producción de moléculas recombinantes que contienen la molécula de ácido nucleico de las moléculas de Fc_{\varepsilon}R se describen en esta memoria. La célula recombinante de la presente invención particularmente preferida incluye Trichoplusia ni-pVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}.

Una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención puede incluir moléculas quiméricas que comprenden una parte de una molécula del Fc_{\varepsilon}R que se une a una IgE y una segunda molécula que permite que la molécula quimérica se una a un sustrato, de tal modo que la parte del Fc_{\varepsilon}R se una a la IgE esencialmente del mismo modo que una molécula del Fc_{\varepsilon}R que no esté unida a un sustrato. Un ejemplo de una segunda molécula apropiada incluye una parte de una molécula de inmunoglobulina.

Una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención puede estar contenida en una formulación, a la que se hace referencia en esta memoria como formulación del Fc_{\varepsilon}R. Por ejemplo, un Fc_{\varepsilon}R puede combinarse con un tampón en el que el Fc_{\varepsilon}R se solubilice, y/o un soporte. Tampones y soportes adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de tampones adecuados incluyen cualquier tampón en el que un Fc_{\varepsilon}R pueda actuar uniéndose selectivamente a IgE, tal como, aun cuando no limitándose a ellos, solución salina tamponada con fosfato, agua, solución salina, tampón de fosfato, tampón de bicarbonato, tampón HEPES (solución salina tamponada con el ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico), tampón TES (solución salina tamponada con Tris-EDTA), tampón tris y tampón TAE (Tris.acetato-EDTA). Los ejemplos de soportes incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, matrices polímeras, toxoides y albúminas séricas, tales como albúmina de suero bovino. Los soportes pueden estar en mezcla con Fc_{\varepsilon}R o conjugados (es decir, unidos) al Fc_{\varepsilon}R de tal modo que no interfiera sustancialmente con la aptitud del Fc_{\varepsilon}R para unirse selectivamente a la IgE.

Un Fc_{\varepsilon}R de la presente invención puede unirse a la superficie de una célula que exprese el Fc_{\varepsilon}R. Una célula que lleva el Fc_{\varepsilon}R, preferida, incluye una célula recombinantes que expresa una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano, de la presente invención. Una célula recombinante más preferida, de la presente invención, expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una de las proteínas siguientes: PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{257} y PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{232}. Una célula recombinante todavía más preferida expresa una molécula de ácido nucleico incluyendo nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{591}, nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{699}, y/o nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{516} con una célula recombinante que expresa una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que incluye la SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 4, siendo todavía más preferida una molécula de ácido nucleico que comprende una variante alélica de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4. Una célula recombinante aún más preferida es una célula RBL-hFc_{\varepsilon}R.

Además, una formulación del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención, puede incluir no solamente un Fc_{\varepsilon}R sino también uno o más antígenos o anticuerpos adicionales útiles para detectar IgE. Tal como se emplea en esta memoria, un antígeno alude a cualquier molécula capaz de ser unida selectivamente por un anticuerpo. Tal como se emplea en esta memoria, la unión específica de una primera molécula a una segunda molécula hace referencia a la aptitud de la primera molécula para unirse preferentemente (por ejemplo, que tiene mayor afinidad, mayor avidez) a la segunda molécula en comparación con la capacidad de una primera molécula para unirse a una tercera molécula. No necesariamente la primera molécula es el ligando natural de la segunda molécula. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, anticuerpos que se unen selectivamente a la región constante de una IgE pesada (es decir, anticuerpo isotípico anti-IgE) o anticuerpos que se unen selectivamente a una IgE que tiene una especificidad antigénica específica (es decir, anticuerpo idiotípico anti-IgE). Ejemplos de tales antígenos incluyen cualquier antígeno que se sabe induce la producción de IgE. Los antígenos preferidos incluyen alergenos y antígenos de parásitos. Los alergenos de la presente invención derivan preferiblemente, de hongos, árboles, malezas, arbustos, hierbas, trigo, maíz, soja, arroz, huevos, leche, queso, bovinos (o ganadería), aves de corral, cerdos, ovejas, levaduras, pulgas, moscas, mosquitos, ácaros, moscas de agua, cínifes mordedores, piojos, abejas, avispas, hormigas, chinches o garrapatas. Un alergeno de la pulga adecuado incluye un alergeno que deriva de una pulga, en particular antígeno de saliva de pulga. El alergeno de la pulga preferido incluye un antígeno de saliva de pulga. Los antígenos de saliva de pulga preferidos incluyen antígenos tales como los descritos en la publicación de la patente PCT, No. WO 96/11271, publicada el 18 de Abril de 1996, por Franklin et al. (esta publicación se incorpora en esta memoria, por referencia, en su totalidad), siendo particularmente preferidos los productos de la saliva de la pulga y las proteínas de la saliva de la pulga. Según la presente invención una proteína de la saliva de la pulga incluye una proteína producida mediante métodos de DNA recombinante, así como también proteínas aisladas por otros métodos descritos en la publicación de patente PCT No. WO 96/11271.

Los alergenos generales preferidos, incluyen los derivados de hierba, Meadow Fescue, Curly Dock, llantén, Mexican Firebush, Lamb's Quarters, hierba racimosa, ambrosía, salvia, olmo, cadillo, Box Elder, nogal, chopo de Virginia, fresno, abedul, cedro, roble, morera, Dermataphagoides, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Helminthosporium, Mucor, Penicillium, Pullularia, Rhizopus y/o Tricophyton. Los alergenos generales mas preferidos incluyen los derivados de Johnson Grass, Kentucki Blue Grass, Meadow Fescue, Orchard Grass, Perennial Rye Grass, Redtop Grass, Timothy Grass, Bermuda Grass, Brome Grass, Curly Dock, English Plantain, Mexican Firebush, Lamb's Quarters, Rough Pigweed, Short Ragweed, Wormwood Sage, American Elm, Common cocklebur, Box Elder, Black Walnut, Eastern Cottonwood, Green Ash, River Birch, Red Cedar, Red Oak, Red Mulberry, Cockroach, Dermataphagoides farinae, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Cladosporium herbarum, Fusarium vasinfectum, Helminthosporium sativum, Mucor recemosus, Penicillium notatum, Pullularia pullulans, Rhizopus nigricans y/o Tricophyton spp. Los alergenos tropicales preferidos incluyen los derivados de Bermuda Grass, June Bluegrass, Annual Bluegrass, Orchard Grass, Perennial Rye Grass, Timothy Grass, Meadow Fescue, Common Cocklebur, Yellow Dock, Sheep Sorrel, English Plantain, Lamb's Quarters, Rough Pigweed, Russian Thistle, Short Ragweed, Red Cedar, Cat Epithelium, Arizona Cypress, Baid Cypress, Date Palm, Australian Pine, Eucalyptus, Mango, Acacia, Grama Grass, Nettle, Western Cottonwood, Saltgrass, Dermataphagoides pteronyssimus, Aureobasidium pullulans, Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum, Drechslera sorokiniana, Fusarium roseum, Cladosporium sphserosporum, Aspergilus fumigatus, Alternaria tenuis, Dermataphagoides farinae y Syemphyllium sarciniforme. Los alergenos deséricos preferidos incluyen los derivados de Bahia Grass, Smooth Brome, Johnson Grass, Redtop Grass, False Ragweed, Carelessweed, Greasewood, Rough Marsh Elder, Kochia, Tail Ragweed, Western Ragweed, Slender Ragweed, Common Sage, Prairie Sage, Mugwort Sage y Shadscale. Los antígenos de parásitos preferidos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, antígenos de helmintos, en oarticular antígenos de la filaria cardiaca, tales como Di33 (descrito en la solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 08/715.628, presentada el 18 de Septiembre de 1996, a Grieve et al.), La expresión "derivado de" se refiere a un alergeno natural de tales plantas u organismos (es decir, un alergeno aislado directamente de tales plantas u organismos), así como también alergenos no naturales de tales plantas u organismos, que poseen por lo menos un epítopo capaz de atraer una respuesta inmune frente a un alergeno (por ejemplo, producido usando tecnología de DNA recombinante o mediante síntesis química).

La presente invención incluye también mimétopos del Fc_{\varepsilon}R humano y su uso para detectar IgE. Según la presente invención un "mimétopo" hace referencia a cualquier compuesto capaz de imitar la aptitud de una molécula del Fc_{\varepsilon}R para unirse a IgE. Un mimétopo puede ser un péptido que ha sido modificado para hacer diminuir su susceptibilidad a la degradación, pero que retiene todavía la actividad de unión a IgE. Otros ejemplos de mimétopos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, compuestos a base de hidratos de carbono, compuestos a base de lípidos, compuestos a base de ácidos nucleicos, compuestos orgánicos naturales, compuestos orgánicos derivados por síntesis, anticuerpos anti-idiotípicos y/o anticuerpos catalíticos, o sus fragmentos. Un mimétopo puede ser obtenido, por ejemplo, rastreando bibliotecas de compuestos sintéticos para determinar compuestos capaces de unirse a IgE. Un mimétopo puede ser obtenido también, por ejemplo, mediante diseño racional de fármacos. En un procedimiento operatorio de diseño racional de un fármaco, la estructura tridimensional de un compuesto de la presente invención puede ser analizada, por ejemplo, mediante resonancia magnética nuclear (NMR) o cristalografía de rayos X. La estructura tridimensional puede utilizarse luego para predecir estructuras de mimétopos potenciales, por ejemplo mediante modelos obtenidos en ordenador. Las estructuras de mimétopos predichas pueden producirse después, por ejemplo, mediante síntesis química, tecnología de DNA recombinante o aislando un mimétopo de una fuente natural. Ejemplos específicos de mimétopos del Fc_{\varepsilon}R incluyen anticuerpos anti-idiotípicos, oligonucleótidos producidos utilizando tecnología de Selex, péptidos identificados mediante rastreo aleatorio de bibliotecas de péptidos y proteínas identificadas mediante tecnología de presentación de fagos.

Una de las realizaciones de la presente invención es un método para detectar IgE no humana que incluye las etapas de: (a) poner en contacto una molécula de receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano, aislada, con una composición que se supone que contiene IgE, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE; y (b) determinar los niveles de IgE por detección de dicho complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE. La presencia de tal complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE indica que el animal produce IgE. La IgE no humana preferida para detectar usando una molécula de Fc_{\varepsilon}R humana incluye IgE canina, IgE felina, e IgE equina. El método presente puede incluir, además, la etapa de determinar si una IgE complejada con una molécula del Fc_{\varepsilon}R es lábil al calor. Métodos para determinar la labilidad al calor de IgE figuran descritos en la sección de Ejemplos. Preferiblemente, una IgE es lábil al calor cuando es incubada a 56ºC aproximadamente durante 4 horas aproximadamente. Sin obligarse por teoría alguna, la compañía Solicitante opina que las formas de IgE lábiles al calor se unen a ciertos alergenos y las formas de IgE no lábiles al calor se unen a otros tipos de alergenos. Por tanto, la detección de IgE lábil al calor, con la IgE no lábil al calor puede ser usada para discriminar entre sensibilidades de alergenos. Por ejemplo, la compañía Solicitante opina que los anticuerpos de IgE que se unen a ciertos alergenos de la pulga y ciertos alergenos de la filaria cardiaca son lábiles al calor mientras que los anticuerpos de IgE que se unen a ciertos alergenos de plantas son no lábiles al calor. Por tanto, la presencia IgE no lábil a calor puede indicar que un animal es sensible a ciertos alergenos de plantas pero no a ciertos alergenos de la pulga o de la filaria cardiaca. Además, la compañía Solicitante opina que la identificación de IgE lábil por calor y de la IgE no lábil por calor usando un Fc_{\varepsilon}R humano sugiere la presencia de diferentes sub-poblaciones de IgE que pueden o no tener estructuras sustancialmente similares a la de IgE conocida. Por tanto,, una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención puede ser útil para detectar moléculas unidas mediante la molécula del Fc_{\varepsilon}R pero no idénticas a una IgE conocida.

Tal como se emplea en esta memoria, canino alude a cualquier miembro de la familia de los cánidos, que incluye perros domésticos, perros salvajes, y perros de zoológico. Los ejemplos de cánidos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, perros domésticos, perros salvajes, zorros, lobos, chacales y coyotes.

Tal como se emplea en esta memoria, un felino se refiere a cualquier miembro de la familia de los félidos, incluyendo gatos domésticos, gatos salvajes y gatos de zoológico. Ejemplos de félidos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, gatos domésticos, leones, tigres, leopardos, panteras, pumas, linces, jaguares, leopardos cazadores y gato-tigres africano. Tal como se emplea en esta memoria, equino se refiere a cualquier miembro de la familia de los équidos, incluyendo caballos, asnos, mulas y cebras.

Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "puesta en contacto" se refiere a combinar o mezclar en este caso una composición que se supone que contiene IgE con una moléculas de Fc_{\varepsilon}R humano. La formación de un complejo entre un Fc_{\varepsilon}R y una IgE alude a la aptitud del Fc_{\varepsilon}R para unirse selectivamente a la IgE con objeto de formar un complejo estable que puede ser medido (es decir, detectado). Tal como se emplea en esta memoria la expresión "que se une selectivamente a una IgE" se refiere a la aptitud de un Fc_{\varepsilon}R de la presente invención para unirse preferentemente a IgE, sin ser capaz de unirse sustancialmente a otros isotipos de anticuerpos. La unión entre un Fc_{\varepsilon}R y una IgE se efectúa en condiciones adecuadas para formar un complejo,; tales condiciones adecuadas (por ejemplo, concentraciones, soluciones tampón, temperaturas, y tiempos de reacción) así como métodos de optimización de tales condiciones, son conocidos de los expertos en la técnica, y en esta memoria se describen ejemplos. Ejemplos de condiciones de formación de complejos han sido descritas también, por ejemplo, por Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. La referencia bibliográfica de Sambrook et al., se incorpora por referencia en esta memoria en su totalidad.

Tal como se usa en esta memoria, la expresión "detección de la formación de complejo" se refiere a determinar si se ha formado algún complejo, es decir, analizar la presencia (es decir, la existencia) de un complejo. Si se han formado complejos, la cantidad de complejos formada puede determinarse, pero no es necesario. La formación de complejo o unión selectiva entre el Fc_{\varepsilon}R y una IgE puede ser medida (es decir, detectada) empleando una diversidad de métodos estándar en la técnica (véase, por ejemplo, la referencia bibliográfica de Sambrook et al.), ejemplos de los cuales se describen en esta memoria.

En una realización una composición del presente método que se supone que contiene IgE, incluye una muestra biológica procedente de un animal. Una muestra biológica adecuada incluye, aun cuando no se limita a ella, una composición de un fluido corporal o una composición celular. Un fluido corporal hace referencia a cualquier fluido que pueda ser recogido (es decir, obtenido) de un animal, ejemplos de los cuales incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, sangre, suero, plasma, orina, lágrimas, humor acuoso, fluido del sistema nervioso central (CNF), saliva, linfa, secreciones nasales, leche y heces. Tal composición del presente método puede ser, aunque no necesariamente, tratada previamente para separar por lo menos algunos, de los isotipos de inmunoglobulina no IgE y/u otras proteínas, tales como albúmina, presentes en el fluido. Tal separación puede incluir, aun cuando no se limita a ella, poner en contacto el fluido corporal con un material tal como Proteína G, para separar anticuerpos de IgE y/o purificar por afinidad anticuerpos de IgE procedentes de otros componentes del fluido corporal, exponiendo el fluido, por ejemplo, a Concanavalin A. En otra realización, una composición incluye fluido corporal recogido que se trata previamente para concentrar la inmunoglobulina contenida en el fluido. Por ejemplo, la inmunoglobulina contenida en un fluido corporal puede ser precipitada de otras proteínas usando sulfato amónico. Una composición preferida del presente método es el suero.

En otra realización, una composición de la presente invención incluye una célula productora de IgE. Tal célula puede tener IgE unida a la superficie de la célula y/o puede secretar IgE. Ejemplos de tales células incluyen células de basófilos y células de mieloma. La IgE puede estar unida a la superficie de una célula o bien directamente a la membrana de las células o bien unida a una molécula (por ejemplo, un antígeno) unida a la superficie de la célula.

Un complejo puede ser detectado en una diversidad de modos, incluyendo, aun cuando no limitado al uso de uno o más de los siguientes ensayos: un inmunoensayo enzimático, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo de fluorescencia, un ensayo quimioluminiscente, un ensayo de flujo lateral, un ensayo de aglutinación, un ensayo basado en partículas (por ejemplo, usando partículas tales como, aun cuando no limitado a ellas, partículas magnéticas o polímeros plásticos, tales como glóbulos de látex o de poliestireno), un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo con BioCore™ (por ejemplo, utilizando oro coloidal) y un ensayo de inmunotransferencia (por ejemplo, una transferencia western). Tales ensayos son bien conocidos de los expertos en la técnica. Los ensayos pueden ser utilizados para proporcionar resultados cualitativos o cuantitativos, dependiendo de como sean usados. Algunos ensayos, tales como aglutinación, separación de partículas e inmunoprecipitación, pueden ser observados visualmente (por ejemplo o bien a simple vista o mediante un aparato tal como un densitómetro o un espectrofotómetro) sin necesidad de un marcador detectable. En otros ensayos, la conjugación (es decir, la fijación) de un marcador detectable al Fc_{\varepsilon}R o a un reactivo que se una selectivamente al Fc_{\varepsilon}R o a la IgE que ha de ser detectada (descrito con mayor detalle más adelante) ayuda a detectar la formación de complejos. Ejemplos de marcadores detectables incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador cromóforo o un ligando. Un ligando alude a una molécula que se une selectivamente a otra molécula. Los marcadores detectables preferidos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, la fluoresceína, un radioisótopo, una fosfatasa (por ejemplo, fosfatasa alcalina), biotina, avidina, una peroxidasa (por ejemplo peroxidasa de rábano picante) y compuestos afines a la biotina o compuestos afines a la avidina (por ejemplo, estreptavidina o inmunoPure®NeutrAvidin). Preferiblemente, la biotina está conjugada a la cadena alfa de un Fc_{\varepsilon}R. Preferiblemente un grupo de hidrato de carbono de la cadena alfa del Rc_{\varepsilon}R está conjugado a biotina. Una molécula de Fc_{\varepsilon}R preferida, conjugada a biotina, comprende

\hbox{PhFc _{\varepsilon} R \alpha  _{172} -BIOT}

(cuya producción se describe en la sección de Ejemplos).

En una realización se detecta un complejo poniendo en contacto una composición que se supone que contiene IgE, con una molécula del Fc_{\varepsilon}R que está conjugada a un marcador detectable. El marcador detectable adecuado para conjugarse a una molécula del Fc_{\varepsilon}R incluye, aun cuando no se limita a él, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador cromóforo. El marcador detectable está conjugado a una molécula del Fc_{\varepsilon}R o a un reactivo de tal modo que no bloquea la aptitud del Fc_{\varepsilon}R o del reactivo para unirse a la IgE que ha de ser detectada. Preferiblemente, un grupo de hidrato de carbono de un Fc_{\varepsilon}R está conjugado a biotina.

En otra realización, se detecta un complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE poniendo en contacto una composición que se supone contiene IgE, con una molécula del Fc_{\varepsilon}R y poniendo luego en contacto el complejo con una molécula de indicador. Las moleculas de indicador adecuadas, de la presente invención, incluyen moléculas que pueden unirse o bien a la molécula del Fc_{\varepsilon}R o bien al anticuerpo de IgE. Por tanto, la molécula de indicador puede comprender, por ejemplo, una molécula de Fc_{\varepsilon}R, un antígeno, un anticuerpo y una lectina, dependiendo de la parte del complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE que haya de detectarse. Los compuestos marcados, de identificación, preferidos, que son anticuerpos, incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-IgE y anticuerpos anti-Fc_{\varepsilon}R. Las lectinas preferidas incluyen aquellas lectinas que se unen a grupos de alto contenido de manosa. Las lectinas más preferidas se unen a grupos de alto contenido de manosa presentes en una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención producido en células de insecto. Una molécula de indicador, por si misma, puede unirse a un marcador detectable de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo puede conjugarse a biotina, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o fluoresceína.

En una realización preferida, el complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE se detecta poniendo en contacto el complejo con un reactivo que se una selectivamente a una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención. Ejemplos de tal reactivo incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, un anticuerpo que se una selectivamente a una molécula del Fc_{\varepsilon}R (al que se hace referencia en esta memoria como un anticuerpo anti-Fc_{\varepsilon}R) o un compuesto que se una selectivamente a un marcador detectable conjugado a una molécula de Fc_{\varepsilon}R. Las moléculas de Fc_{\varepsilon}R conjugadas a bitoina se detectan, preferiblemente, usando estreptavidina, y más preferiblemente usando ImmunoPure®NeutrAvidin (disponible de Pierce, Rockford, IL).

En otra realización preferida el complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE se detecta poniendo en contacto el complejo con un reactivo que se una selectivamente a un anticuerpo de IgE (al que se hace referencia en esta memoria como un reactivo anti-IgE). Ejemplos de tal reactivo anti-IgE incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, un anticuerpo secundario que es un anticuerpo anti-isotipo (por ejemplo, un anticuerpo que se une selectivamente a la región constante de una IgE), un anticuerpo que se une a la proteína de la superficie bacteriana (por ejemplo, Proteína A o Proteína G), un anticuerpo que se una a una célula (por ejemplo, una célula B, una célula T, una célula matadora natural, una célula de leucocito polimorfonuclear, una célula de monocito o una célula de un macrófago), un anticuerpo que se une a la proteína de la superficie de una célula eucariota (por ejemplo, un receptor Fc), y un anticuerpo que se una a una proteína complementaria. Los reactivos anti-IgE preferidos incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, anticuerpo D9 y anticuerpo nº 9 de CMI, anticuerpo nº 19 de CMI, anticuerpo nº 59 de CMI y anticuerpo nº 71 de CMI (obtenibles de Custom Monoclonal International, West Sacramento, CA). En particular, tal como se utiliza en esta memoria, un anticuerpo anti-Ige incluye no solamente un anticuerpo completo sino también cualquier subunidad o parte del mismo que sea capaz de unirse selectivamente a la región constante de la cadena pesada de una IgE. Por ejemplo, una parte de un reactivo anti-IgE puede incluir un fragmento Fab o un fragmento F(ab')_{2}, que están descritos con detalle por Janeway et al., en Immunobiology, the Immune System in Health and Disease, Garland Publishing, Inc, NY, 1996 (que se incorpora en su totalidad en esta memoria, como referencia).

En una realización puede formarse un complejo y detectarse en solución. En otra realización, puede formarse un complejo en el que uno o más miembros del complejo están inmovilizados (por ejemplo revestidos) sobre un sustrato. Técnicas de inmovilización son conocidas por los expertos en la técnica. Materiales sustrato adecuados incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, plásticos, vidrio, gel, celuliode, papel, PVDF [poli(fluoruro de vinilideno)], nailon, nitrocelulosa y materiales en partículas tales como látex, poliestireno, nailon, nitrocelulosa, agarosa y resina magnética. Las formas adecuadas del material sustrato incluyen, aun cuando no se limitan a ellas, un pocillo (por ejemplo, pocillos de un disco de microtiluación), una placa, una varilla de nivel (dipstick), un glóbulo, un aparato de flujo lateral, una membrana, un filtro, un tubo, un disco, una matriz de tipo del celuloide, una partícula magnética y otros materiales en partículas. Un sustrato particularmente preferido comprende una placa de ensayo ELISA, un "dipstick", una placa de radioinmunoensayo, glóbulos de agarosa, glóbulos de plástico, glóbulos de látex, membranas de inmunotransferencia y papeles de inmunotransferencia. En una realización, un sustrato, tal como un material en partículas, puede incluir un marcador detectable.

Un método preferido para detectar IgE es un ensayo de inmunoabsorción. Un ensayo de inmunoabsorción de la presente invención comprende una molécula de captura y una molécula de indicador. Una molécula de captura de la presente invención se une a una IgE de tal manera que la IgE es inmovilizada en un sustrato. Por tanto, una molécula de captura es, preferiblemente, inmovilizada en un sustrato de la presente invención, antes de exponer la molécula de captura a una composición que se supone contiene IgE. Una molécula de indicador de la presente invención detecta la presencia de una IgE unida a una molécula de captura. Por consiguiente una molécula de indicador, preferiblemente, no es inmovilizada en el mismo sustrato que la molécula de captura antes de exponer la molécula de captura a una composición que se supone contiene IgE.

El método de ensayo de inmunoabsorción preferido incluye una etapa de o bien: (a) unir una molécula de Fc_{\varepsilon}R a un sustrato antes de poner en contacto la molécula de Fc_{\varepsilon}R con una composición que se supone contiene IgE para formar un sustrato revestido con la molécula del Fc_{\varepsilon}R, o (b) unir a un sustrato una composición que se supone contiene IgE antes de poner en contacto la molécula del Fc_{\varepsilon}R con la composición que se supone contiene IgE, para formar un sustrato revestido con una composición que se supone contiene IgE. Preferiblemente, el sustrato incluye un sustrato sin revestir, un sustrato revestido con la molécula del Fc_{\varepsilon}R, un sustrato recubierto con un antígeno o un sustrato recubierto con un anticuerpo anti-IgE.

Ambas moléculas, la molécula de captura y la molécula de indicador de la presente invención, son capaces de unirse a una IgE, Preferiblemente, la molécula de captura se une a una región diferente de una IgE que la molécula de indicador, permitiendo con ello que la molécula de captura se una a una IgE al mismo tiempo que la molécula de indicador. El uso de un reactivo como molécula de captura o una molécula de indicador, depende de si la molécula está inmovilizada en un sustrato cuando la molécula se expone e una IgE. Por ejemplo, una molécula de Fc_{\varepsilon}R de la presente invención se usa como molécula de captura cuando la molécula del Fc_{\varepsilon}R está unida a un sustrato. Alternativamente, una molécula de Fc_{\varepsilon}R se usa como molécula de indicador cuando la molécula del Fc_{\varepsilon}R no está unida a un sustrato. Las moléculas adecuadas para utilizar como moléculas de captura o moléculas de indicador incluyen, aun cuando no se limitan a ellas, una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención, un reactivo de antígeno o un reactivo de anticuerpo anti-IgE de la presente invención.

El ensayo de inmunoabsorción de la presente invención puede comprender, además, una o más capas y/o tipos de moléculas secundarias u otras moléculas de unión, capaces de detectar la presencia de una molécula de indicador. Por ejemplo, un anticuerpo secundario sin marcar (es decir, sin conjugar a un marcador detectable) que se une selectivamente a una molécula de indicador, puede unirse a un anticuerpo terciario marcado (es decir, conjugado a un marcador detectable), que se une selectivamente al anticuerpo secundario. Anticuerpos secundarios, anticuerpos terciarios y otras moléculas secundarias y terciarias adecuadas, pueden seleccionarse por los expertos en la técnica, Las moléculas secundarias preferidas de la presente invención, incluyen un antígeno, un anticuerpo idiotípico anti-IgE y un anticuerpo isotípico anti-IgE. Las moléculas terciarias preferidas pueden ser seleccionadas por los expertos en la técnica en base a las características de la molécula secundaria. La misma estrategia se aplica para las capas subsiguientes.

En una realización se usa un antígeno deseado como molécula de captura estando inmovilizada sobre un sustrato, tal como un pocillo de un disco de microtitulación o un dipstick. Los antígenos preferidos incluyen aquellos descritos en esta memoria. Una muestra biológica recogida desde un animal se aplica al sustrato y se incuba en condiciones adecuadas (es decir, suficientes) para permitir la formación del complejo antígeno:IgE unido al sustrato (es decir, la IgE de un muestra se une a un antígeno inmovilizado sobre un sustrato). El material en exceso sin unir (es decir, el material procedente de la muestra biológica que no se ha unido al antígeno), si hay alguno, se retira del sustrato en condiciones que retienen la unión al sustrato del complejo antígeno:IgE. En esta memoria se describen condiciones preferidas en la sección de Ejemplos y en líneas generales en el trabajo de Sambrook et al, referencia bibliográfica citada. Una molécula de indicador que puede unirse selectivamente a una IgE unida al antígeno, que puede estar conjugada a un marcador detectable (preferiblemente a un marcador enzimático, a un marcador colorimétrico, a un marcador fluorescente, a un radioisótopo, o a un ligando tal como uno de la familia de la biotina o la avidina), se añade al sustrato y se incuba para permitir la formación de un complejo entre la molécula de indicador y el complejo antígeno:IgE. La molécula de indicador en exceso se separa, se añade si se requiere un agente de revelado y el sustrato se somete a un dispositivo de detección para su análisis. Una molécula de indicador preferida para esta realización es una molécula de Fc_{\varepsilon}R, preferiblemente conjugada a biotina, a un marcador fluorescente o un marcador enzimático.

En una realización, se utiliza una molécula del Fc_{\varepsilon}R como molécula de captura estando inmovilizada sobre un sustrato, tal como un pocillo de un disco de microtitulación o un "dipstick". Se aplica al sustrato una muestra biológica recogida procedente de un animal y se incuba en condiciones adecuadas que permitan la formación del complejo de molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE unido al sustrato. El material en exceso, si lo hay, se separa del sustrato en condiciones que retengan el complejo de molécula del Fc_{\varepsilon}R:IgE unido al sustrato. Una molécula de indicador que puede unirse selectivamente a una IgE unida al Fc_{\varepsilon}R se añade al sustrato y se incuba para permitir la formación de un complejo entre la molécula de indicador y el complejo de la molécula de Fc_{\varepsilon}R:IgE. Preferiblemente, la molécula de indicador está conjugada a un marcador detectable (preferiblemente a un marcador enzimático, a un marcador colorimétrico, a un marcador fluorescente, a un radioisótopo o a un ligando tal como uno de la familia de la biotina o de la avidina). El exceso de molécula de indicador se separa, se añade un agente de revelado, si se necesita, y el sustrato se somete a un dispositivo de detección para su análisis. La molécula de indicador preferida para esta realización es un antígeno que puede unirse a IgE en la muestra biológica o un anticuerpo anti-IgE, isotípico o idiotípico, estando conjugado preferiblemente o bien a fluoresceína o bien a biotina.

En una realización, un anticuerpo anti-IgE (por ejemplo, un anticuerpo isotípico o idiotípico específico) se usa como molécula de captura estando inmovilizado sobre un sustrato, tal como un pocillo de un disco de microtítulo o un dipstick. Se aplica al sustaro una muestra biológica recogida procedente de un animal y se incuba en condiciones adecuadas para permitir la formación de complejo anticuerpo:IgE anti-IgE unido al sustrato. El material en exceso sin unir, si lo hay, se retira del sustrato en condiciones que retienen el complejo de anticuerpo:IgE anti-IgE que está unido al sustrato. Se añade al sustrato una molécula de Fc_{\varepsilon}R y se incuba para permitir la formación de un complejo entre la molécula del Fc_{\varepsilon}R y el complejo de anticuerpo:IgE ant-IgE. Preferiblemente la molécula del Fc_{\varepsilon}R está conjugada a un marcador detectable (preferiblemente a biotina, un marcador enzimático o un marcador fluorescente). El exceso de molécula de Fc_{\varepsilon}R se separa, se añade un agente de revelado, si es necesario, y el sustrato se somete a un dispositivo de detección para su análisis.

En una realización, el ensayo de inmunoabsorción de la presente invención no utiliza una molécula de captura. En esta realización, se aplica una muestra recogida procedente de un animal, a un sustrato tal como un pocillo de un disco de microtitulación o un "dipstick" y se incuba en condiciones adecuadas para permitir la unión de IgE al sustrato. Algo de la IgE presente en el fluido corporal se inmoviliza sobre el sustrato. El exceso de material sin unir, si lo hay, se separa del sustrato en condiciones que retienen la unión de la IgE al sustrato. Se añade al sustrato una molécula de Fc_{\varepsilon}R y se incuba para permitir la formación de un complejo entre la molécula del Fc_{\varepsilon}R y la IgE. Preferiblemente, la molécula del Fc_{\varepsilon}R está conjugada a un marcador detectable (preferiblemente a biotina, un marcador enzimático o un marcador fluorescente). El exceso de molécula de Fc_{\varepsilon}R se retira, se añade un agente de revelado, si es necesario, y el sustrato se somete a un dispositivo de detección para su análisis.

Otro método preferido para detectar IgE es un ensayo de flujo lateral, ejemplos de los cuales están descritos en la patente de EE.UU. No. 5.424.193, otorgada el 13 de Junio de 1995, por Pronovost et al.; la patente de EE.UU. No. 5.415.994, otorgada el 16 de Mayo de 1995, por Imrich et al.; el documento WO 94/29696, publicado el 22 de Diciembre de 1994, por Miller et al.; y el documento WO 94/01775, publicado el 20 de Enero de 1994, por Pawlak et al.; Cada una de estas publicaciones de patentes se incorpora en esta memoria por referencia, en su totalidad. En una realización una muestra biológica se coloca en un aparato de flujo lateral que incluye los componentes siguientes: (a) una estructura de soporte que define una trayectoria de flujo; (b) un reactivo marcador que comprende un glóbulo conjugado a un antígeno, estando el reactivo marcador impregnado dentro de la estructura de soporte en una zona de marcado; y (c) un reactivo de captura que comprende una composición que se une a la IgE. Los antígenos preferidos incluyen los descritos en esta memoria. El reactivo de captura está situado aguas abajo del reactivo marcador dentro de una zona de captura conectada de modo fluido con la zona de marcado, de tal modo que el reactivo marcador puede fluir desde la zona de marcado a la zona de captura. La estructura de soporte comprende un material que no impide el flujo de los glóbulos desde la zona de marcado a la zona de captura. Los materiales adecuados para usar como estructura de soporte incluyen un material iónico (es decir, aniónico o catiónico). Los ejemplos de tal material incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, nitrocelulosa (NC), PVDF, carboximetilcelulosa (CM). La estructura de soporte define una trayectoria de flujo que es lateral y está dividida en zonas, a saber, una zona de marcado y una zona de captura. El aparato puede comprender, además, una zona de recepción de muestras situada a lo largo de la trayectoria del flujo, más preferiblemente aguas arriba del reactivo marcador. La trayectoria del flujo en la estructura de soporte se crea poniendo en contacto una parte de la estructura de soporte aguas abajo de la zona de captura, preferiblemente al final de la trayectoria del flujo, con un absorbente capaz de absorber el líquido en exceso procedente de las zonas de marcado y de captura.

En esta realización, la muestra biológica se aplica a la zona de recepción de las muestras que incluye una parte de la estructura de soporte. La zona de marcado recibe la muestra procedente de la zona de recepción de las muestras que es dirigida aguas abajo por la trayectoria del flujo. La zona de marcado comprende el reactivo marcador que se une a IgE. Un reactivo marcador preferido es un antígeno conjugado, o bien directamente o por medio de un engarce, a un sustrato constituido por un glóbulo de plástico, tal como un glóbulo de látex. El sustrato incluye también un marcador detectable, preferiblemente un marcador colorimétrico. Típicamente, el reactivo marcador se impregna en la estructura de soporte por secado o mediante liofilización. La estructura de la muestra comprende también una zona de captura situada aguas abajo de la zona de marcado. La zona de captura recibe el reactivo marcador procedente de la zona de marcado que es dirigido aguas abajo por la trayectoria del flujo. La zona de captura contiene el reactivo de captura, en este caso una molécula de Fc_{\varepsilon}R, según se ha descrito anteriormente, que inmoviliza la IgE complejada con el antígeno en la zona de captura. El reactivo de captura se fija preferiblemente a la estructura de soporte por secado o liofilización. El reactivo de marcado se acumula en la zona de captura y la acumulación se verifica visualmente o mediante un dispositivo óptico de detección.

En otra realización, el aparato de flujo lateral usado para detectar IgE incluye: (a) una estructura de soporte que define una trayectoria de flujo; (b) un reactivo marcador que comprende una molécula de Fc_{\varepsilon}R según se ha descrito anteriormente, estando el reactivo marcador impregnado dentro de la estructura de soporte en una zona de marcado; y (c) un reactivo de captura que comprende un antígeno, estando situado el reactivo de captura aguas abajo del reactivo marcador dentro de una zona de captura conectada de modo fluido con la zona de marcado, de tal modo que el reactivo de marcado puede fluir desde la zona de marcado a la zona de captura. El aparato incluye también, preferiblemente, una zona de recepción de muestras situada a lo largo de la trayectoria de flujo, preferiblemente aguas arriba del reactivo de marcado. El aparato incluye también, preferiblemente, un absorbente situado al final de la trayectoria de flujo.

Una realización de la presente invención es un ensayo de inhibición en el que se determina la presencia de IgE en una composición que se supone contienen IgE, añadiendo tal composición a una molécula del Fc_{\varepsilon}R de la presente invención y una IgE aislada que se sabe que se une a la molécula del Fc_{\varepsilon}R. La ausencia de unión de la molécula del Fc_{\varepsilon}R a la IgE conocida indica la presencia de IgE en la composición que se supone contiene IgE.

La presente invención incluye también kits para detectar IgE basados en cada uno de los métodos de detección descritos. Una realización es un kit para detectar IgE que comprende una molécula de receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano y medios para detectar una IgE, incluyendo IgE canina, IgE felina y/o IgE equina. En esta memoria de describen moléculas de Fc_{\varepsilon} adecuadas y preferidas. Los medios de detección adecuados incluyen compuestos descritos en esta memoria que se unen o bien a la molécula de Fc_{\varepsilon}R o a una IgE. Un kit de la presente invención preferido comprende, además, medios de detección que incluyen uno o más antígenos descritos en esta memoria, un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a una IgE descrita en esta memoria y/o un compuesto capaz de unirse a un marcador detectable conjugado a una molécula del Fc_{\varepsilon}R (por ejemplo, avidina, estreptavidina e inmunoPure®NutrAvidin, cuando el marcador detectable es biotina). Tales antígenos inducen preferiblemente la producción de anticuerpos de IgE en animales incluyendo animales caninos, felinos y/o equinos.

Una realización preferida de un kit de la presente invención es un kit de un alergeno de pulga que comprende un alergeno de la pulga tal como los descritos en esta memoria. Un alergeno de la pulga particularmente preferido para usar con un kit de alergeno de pulga, incluye un producto de la saliva de la pulga o una proteína de la saliva de la pulga.

Otro kit preferido de la presente invención es un kit de un alergeno general que comprende un alergeno común a todas las regiones de los Estados Unidos de América y una molécula de Fc_{\varepsilon}R humano de la presente invención. Tal como se emplea en esta memoria un kit de un "alergeno general" se refiere a un kit que comprende alergenos que se encuentran sustancialmente en todas partes de los Estados Unidos de América (es decir, en esencia no limitado a ciertas regiones de los Estados Unidos). Un kit de un alergeno general proporciona ventaja sobre los kits de alergenos regionales debido a que puede usarse un kit único para ensayar un anumal ubicado en la mayor parte de las situaciones geográficas de los Estados Unidos de América. Los alergenos generales adecuados y preferidos para usar en un kit de alergeno general de la presente invención, incluye los alergenos generales descritos en esta memoria.

Otro kit preferido de la presente invención es un kit de un alergeno de un alimento que comprende un alergeno de un alimento que incluye carne de vaca, pollo, cerdo, una mezcla de pescados tal como bacalao, hipogloso o y atún de California, huevos, leche, levadura de cerveza, trigo completo, maíz, soja, queso y arroz, y una molécula de Fc_{\varepsilon}R humano de la presente invención. Preferiblemente, la carne de vaca, el pollo, el cerdo, el pescado, el maíz y el arroz, están cocidos.

Un kit de la presente invención, preferido, incluye aquellos en los que el alergeno está inmovilizado en un sustrato. Si un kit comprende dos o más antígenos, el kit puede comprender una o más composiciones, cada una de las cuales comprende un antígeno. Por tanto, cada alergeno puede ser ensayado por separado. Un kit puede contener también dos o más reactivos de diagnóstico para IgE, antígenos y/o anticuerpos de IgE aislados adicionales, según se ha descrito en esta memoria. Son particularmente preferidos los kits utilizados en la forma de un ensayo de flujo lateral. Está dentro del alcance de la presente invención el que un kit para el ensayo de flujo lateral pueda incluir uno o más aparatos de ensayo de flujo lateral. Varios aparatos de flujo lateral pueden estar unidos unos a otros en un extremo de cada aparato, creando con ello una estructura semejante a la de un abanico.

En particular un método y un kit de la presente invención son útiles para diagnosticar condiciones anormales en animales, que están asociadas con niveles cambiantes de IgE. Las condiciones particularmente preferidas para establecer el diagnóstico incluyen alergias, infecciones parasíticas y neoplasias. Por ejemplo, un método y un kit de la presente invención son particularmente útiles para detectar dermatitis alérgica por pulgas (FAD) cuando tal método o kit incluye el uso de un antígeno obtenido de la saliva de la pulga. La FAD se define como una respuesta hipersensible a picaduras de pulga. Preferiblemente, se obtiene una composición que se supone contiene IgE de un animal sospechoso de tener FAD.Los animales preferidos incluyen los descritos en esta memoria, siendo los más preferidos los perros y los gatos. Además, los métodos y kits de la presente invención son particularmente útiles para detectar infecciones por helmintos, en particular infecciones de filaria cardiaca, cuando tales métodos o kits incluyen el uso de un antígeno de helminto, tal como el Di33. Preferiblemente, se obtiene una composición que se supone contiene IgE de un animal sospechoso de tener una infección por helmintos. Los animales preferidos incluyen los descritos en esta memoria, siendo los más preferidos los perros y los gatos.

Los ejemplos que siguen se proporcionan con el fin de ilustración y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Este ejemplo describe la construcción de un baculovirus recombinante que expresa una parte truncada de la cadena \alpha del receptor Fc_{\varepsilon} humano.

Se produjo del modo siguiente la molécula recombinante pVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}, que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R, ligado operativamente a secuencias del control de la transcripción de la polihedrosis del baculovirus. Un clon de cDNA que codifica la cadena alfa (cadena \alpha) de longitud total del receptor Fc_{\varepsilon} humano fue obtenido del Dr. Jean-Pierre Kiner (Universidad de Harvard, Cambridge, MA). El clon de cDNA incluía una inserción de 1198 nucleótidos aproximadamente, a la que se alude en esta memoria como nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198}. La secuencia de los ácidos nucleicos de la cadena de codificación de nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198} se denomina en esta memoria SEQ ID NO: 1. La traducción de SEQ ID NO: 1 indica que la molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198} codifica una proteína de longitud total de la cadena \alpha del receptor Fc_{\varepsilon} humano, de 257 aminoácidos aproximadamente, a la se alude en esta memoria como PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{257}, que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, suponiendo un marco de lectura abierto en el que el codón de iniciación abarca desde el nucleótido 107 hasta el nucleótido 109 de SEQ ID NO: 1 y el codón de terminación abarca desde el nucleótido 878 hasta el nucleótido 880 de SEQ ID NO: 1. El complemento de SEQ ID NO: 1 está representado en esta memoria por SEQ ID NO: 3. La proteína madura propuesta (es decir, la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R desde la que ha sido desdoblada la secuencia señal) denominada en esta memoria PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{232}, contiene 232 aminoácidos, aproximadamente, y está representada en esta memoria como SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico que codifica PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{232} se designa en esta memoria como nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{629}, cuya cadena (hebra) codificante está representada por SEQ ID NO: 7.

Para producir una forma secretada del dominio extracelular de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R, el dominio transmembranal hidrófobo y la cola citoplasmática de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R codificada por nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198} fueron separadas del modo siguiente. Un fragmento de 612 nucleótidos aproximadamente que contenía la molécula de ácido nucleico del dominio extracelular de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R fue amplificada por PCR desde el nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{1198} usando el cebador delantero EJH 040 que contenía un sitio BamHI que tenía la secuencia de ácido nucleico 5' CGC GGA TCC TAT AAA TAT GGC TCC TGC CAT GG3' (denominada SEQ ID NO: 8) y un cebador inverso ANTI-SENTIDO de IgE que contenía un sitio EcoRI que tenía la secuencia de ácido nucleico 5' GGC GAA TTC TTA AGC TTT TAT TAC AG 3' (denominada en esta memoria SEQ ID NO:9). El producto resultante de la PCR se sometió a digestión con BamHI y EcoRI produciendo nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}. La molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612} contenía un fragmento de 591 nucleótidos aproximadamente que codifica el dominio extracelular de la cadena \alpha de Fc_{\varepsilon} humano que se extiende desde el nucleótido 107 hasta el nucleótido 697 de la secuencia SEQ ID NO: 1, designada en esta memoria como molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{591}, cuya cadena codificante posee una secuencia de ácido nucleico designada SEQ ID NO: 10. La traducción de la secuencia SEQ ID NO: 10 indica que la molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{619} codifica una proteína del Fc_{\varepsilon} de aproximadamente 197 aminoácidos, a la que se denomina en esta memoria PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{197}, que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11. La molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612} codifica una forma secretable de la cadena \alpha del Fc_{\varepsilon}R humano que no posee una secuencia conductora, que se designa en esta memoria como PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13. La región de codificación de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} se denomina nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{516}, cuya cadena codificante posee una secuencia de ácido nucleico denominada SEQ ID NO: 12. El complemento de la secuencia SEQ ID NO: 12 está representado aquí por SEQ ID NO: 14.

Con objeto de producir una molécula recombinante de baculovirus capaz de dirigir la producción de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{197}, la molécula de ácido nucleico nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612} fue subclonada en sitios únicos BamHI y EcoRI del plásmido transportador del baculovirus pVL 1392 (obtenible de Pharmingen, San Diego, CA) produciendo una molécula recombinante a la que se designa en esta memoria como PVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}. La molécula recombinante resultante PVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}. fue verificada para determinar la apropiada orientación de la inserción por mapeo de restricción.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la producción de la proteína PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}.

La molécula recombinante pVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612} fue co-transfectada con un DNA lineal de baculovirus Baculogold (disponible de Pharmingen) en células de Trichoplusia ni (disponibles de Invitrogen Corp., San Diego, CA; células High Five™) usando el método siguiente. Cultivos de 1,5 litros, aproximadamente, de Medium ex-Cell libre de suero (disponible de Invitrogen) fueron sembrados con aproximadamente 1 x 10^{6} células por ml de medio. Las células de Trichoplusia ni fueron infectadas con la molécula recombinante pVL-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612} en una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 unidades que forman partícula (pfu) por célula, produciendo las células recombinantes Trichoplusia ni-nhFc_{\varepsilon}R\alpha_{612}. Se dejó que prosiguiera la infección a una temperatura controlada de 27ºC durante 48 horas, produciendo la proteína recombinante PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}. Después de la infección las células fueron separadas del medio mediante centrifugación y el medio se congeló a -70ºC.

La proteína PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} fue purificada partiendo del medio de cultivo descrito inmediatamente antes mediante cromatografía de afinidad, usando un anticuerpo de IgE producido por la línea de células de mieloma U266DI (American Tissue Catalogue No. TIB 196) ligada a sefarosa 4B. La composición de aminoácidos y la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} purificada fueron determinadas usando métodos estándar en la técnica. Los resultados indicaron que la proteína PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} había sido procesada apropiadamente por las células de Trichoplusia ni.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la biotinilación de una proteína recombinante de la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano.

La proteína recombinante PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} purificada por cromatografía de afinidad, preparada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2, fue biotinilada del modo siguiente. Aproximadamente 440 microgramos (\mug) de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172} se diluyeron en 1,5 mililitros (ml) aproximadamente de solución tampón de acetato (NaAc 0,1M, pH 5,5) que contenía aproximadamente 200 microlitros (\mul) de NaIO_{4} 0,1 M). La mezcla se incubó durante 29 minutos aproximadamente, sobre hielo, y se añadieron después de la incubación 2 \mul, aproximadamente, de glicerina. La mezcla se sometió luego a diálisis frente a 2 litros aproximadamente de tampón de acetato en una casete de 3 ml Slide-A-Lyzer (disponible de Pierce, Rockford, IL), 2 veces durante 2 horas aproximadamente cada vez. Aproximadamente 3,72 \mug de hidrazida de biotina LC (disponible de Pierce) se disolvieron en 200 \mul aproximadamente de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se inyectaron en la casete. La casete fue balanceada a temperatura ambiente durante 2 horas proximadament. Después de incubar, la mezcla que contenía la proteína recombinante y la biotina fue dializada 3 veces, la primera vez durante 18 horas aproximadamente y dos veces durante 2 horas, aproximadamente, cada vez a 5ºC frente a solución salina tamponada con fosfato. La proteína biotinilada fue recuperada de la diálisis, y se denomina en esta memoria PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la detección de IgE canina en un ensayo ELISA en fase sólida, usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Pocillos de dos placas de microtitulación Immulon II (disponibles de Dynatech, Alexandria, VA) fueron revestidos con muestras duplicadas de aproximadamente 100 \mul/pocillo de varias concentraciones de IgE canina purificada, como se indica en la Fig. 1. La IgE canina se obtuvo partiendo de un hibridoma que produce IgE canina, tal como el heterohibridoma 2.39 (descrito por Gebhard et al., Immunology, 85:429-434, 1995) y se diluyó en un tampón CBC (Na_{2}CO_{3} 15 mM y NaHCO_{3} 34,8 mM, pH 9,6). Las placas revestidas fueron incubadas durante la noche a 4ºC. Después de incubar, la solución que contenía IgE canina fue retirada de cada placa y las placas fueron transferidas en seco. Después las placas fueron bloqueadas usado aproximadamente 200 \mul/pocillo de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,25% contenida en solución salina tamponada con fosfato (PBSB) durante 1 hora aproximadamente, a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas luego cuatro veces con Tween 20 al 0,05% en PBS (PBST) usando un lavador automático (disponible de Dynatech). Muestras experimentales constituidas por aproximadamennte 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT, 40 \mug/ml, (aproximadamente 145 \mug/ml; descrito en el Ejemplo 3), contenidas en PBSB con Tween 20 al 0,05% (PBSBT), fueron añadidas a cada pocillo de una placa revestida con IgE canina. Muestras testigo constituidas por aproximadamente 100 \mul de anticuerpo monoclonal anti-IgE canina biotinilado D9 (suministrado por Dr. DeBoer, U de Wisconsin, Madison, WI) fueron añadidos a cada pocillo de la otra placa revestida con IgE canina. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente y luego lavadas cuatro veces con PBST. Aproximadamente 100 \mul de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, aproximadamente 0,25 ug/ml (disponible de Kirkegaard y Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD: diluida en PBST) fueron añadidos a cada pocillo que recibieron muestras experimentales o testigo. Las placas fueron incubadas luego durante 1 hora a temperatura ambiente y lavadas cuatro veces con PBST. Se añadieron aproximadamente 100 \mul de sustrato TMB (disponible de KPL), que había sido calentado previamente a temperatura ambiente). Las placas fueron incubadas entonces durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se añadieron aproximadamente 100 \mul/pocillo de Stop Solution (disponible de KPL). Se leyeron las densidades ópticas en un lector de placas de microtitulación Spectramax (disponible de Molecular Devices Inc,), a 450 nm, al cabo de 10 minutos después de añadir la Stop Solution.

Los resultados, mostrados en la Fig. 1, indican que la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano detecta la presencia de IgE canina (círculos cerrados) en un ensayo en fase sólida, de un modo similar al del anticuerpo testigo que se une específicamente a la IgE canina. (D9; círculos abiertos).

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Ejemplo 5

Este ejemplo describe la detección de IgE canina específica de alergenos de plantas usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II (disponible de Dynatech) fueron revestidos o bien con aproximadamente 100 \mul/pocillo de alergeno de Kentucky Blue Grass, 1 \mug/ml, o aproximadamente 100 \mul/pocillo de alergeno Green Ash, aproximadamente 1 \mug/ml (ambos disponibles de Greer Inc, Lenoir, NC) ambos diluidos en tampón CSC. La placa se incubo durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueo y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Dos colecciones diferentes de sueros caninos fueron añadidas luego a los pocillos revestidos con antígeno. La primera colección estaba constituida por sueros aislados de 8 perros que se indicó era reactivo al alergeno. La segunda colección estaba constituida por sueros aislados de 8 perros que se indicó que no era reactivo al alergeno. Cada una de las colecciones de sueros se diluyó 1:10 ó 1:100 en PBST. Aproximadamente 100 \mul de cada concentración de cada muestra de sueros diluida se añadió a los pocillos y se sometió a incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó después cuatro veces con PBST. Aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT, 40 \mug/ml, (descrita en el Ejemplo 3), contenida en PBSBT se añadió a los pocillos revestidos con antígeno. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavó la placa cuatro veces con PBST. Se añadieron aproximadamente 100 \mul/pocillo de aproximadamente 0,25 \mug/ml de neutravidina conjugada a peroxidasa de rábano picante (disponible de Pierce) contenida en PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavó la placa y se detectó la presencia de neutravidina unida a la placa empleando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados señalados en la Fig. 2 indican que la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano detecta la presencia de anticuerpos de IgE canina que se unen específicamente a un alergeno común de hierba o a un alergeno común de árboles. Además, la detección de anticuerpos de IgE canina depende de la dosis.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe la detección de IgE canina total usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II (disponible de Dynatech) fueron revestidos con aproximadamente 100 \mul/pocillo de una concentración de aproximadamente 1 \mug/ml de anticuerpo nº 6 anti-IgE canina, de CMI (disponible de Custom Monoclonals International, West Sacramento, CA) diluido en tampón CBC. La placa se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueó y se lavó como se ha descrito en el Ejemplo 4. Aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:60 en PBSBT de muestras de suero procedentes de una diversidad de fuentes, se añadieron luego a varios pocillos revestidos con anticuerpo anti-IgE. Las muestras incluían (1) suero procedente de un perro que se sabía era alérgico a saliva de pulga; (2) suero procedente de perros infectados con D. immitis; (3) y (4) una colección de sueros de perro procedentes de calibradores definidos como alergia canina (disponibles de BioProducts DVM, Tempe, AZ); (5) colecciones de sueros de perro que contenían anticuerpos que poseen bajo potencial de unión a alergeno de Kentucky Blue Grass; (6) colecciones de sueros de perro que poseen alto potencial de unión al alergeno de Kentucky Blue Grass; (7) una colección de sueros de perro procedente de sueros de perros que se sabe son alérgicos a la saliva de la pulga, la muestra fue inactivada por calor (a 56ºC durante 4 horas); (8) una colección de sueros de perro procedente de perros que se sabe eran alérgicos a la saliva de la pulga; o (9) una colección de sueros de perro procedente de perros criados en una instalación aislada (es decir, un testigo negativo). Un conjunto de muestras testigo positivas constituidas por IgE derivada del heterohibridoma canino descrito en el Ejemplo 4, se añadió también a la placa para generar una curva estándar. La placa incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavó cuatro veces con PBST. La presencia de IgE canina se detectó usando o bien aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT, (descrita en el Ejemplo 3) o aproximadamente 100 \mul/pocillo de aproximadamente 1 \mug/ml de anticuerpo nº 19 anti-IgE canina, CMI (disponible de Custom Monoclonals International), ambos contenidos en PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó luego, se puso en contacto con aproximadamente 0,25 ug/ml de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, se lavó de nuevo, y se detectó la presencia de estreptavidina unida a la placa usando el método descrito en el Ejemplo 4. Las lecturas de las densidades ópticas obtenidas para las muestras testigo se utilizaron para generar una curva estándar que se usó para determinar la IgE total unida a los pocillos que habían recibido muestras de ensayo.

Los resultados, mostrados en la Fig. 3, indican que las IgE caninas procedentes de una diversidad de sueros de perro. son detectadas usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R de un modo similar al de uso de un anticuerpo que se una específicamente a IgE canina. La ausencia de cantidades detectables de IgE en la muestra tratada por calor (Muestra 7) indica que el anticuerpo detectado por PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT es IgE. Además, los resultados indican que la PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT es un reactivo eficaz para detectar IgE que se une a alergeno de Kentucky Blue Grass, Muestras 5 y 6), así como un antígeno de parásito (D. Immitis, Muestra 2).

Ejemplo 7

Este ejemplo describe la detección de IgE canina en sueros de perro aislados de perros de los que se conoce que son alérgicos a saliva de la pulga, usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II fueron revestidos con aproximadamente 100 \mul/pocillo de diversas concentraciones de proteína fspN recombinante, de saliva de pulga, (descrita en la publicación de patente PCT No. WO 96/11271, referencia biblliografica anterior, (las concentraciones se indican en la Fig. 4) diluida en tampón CBC. La placa se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueó después y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Aproximadamente 100 \mul/pocillo de una solución 1:10 en PBSBT de una colección de sueros aislados de perros que se sabía producen IgE que se une específicamente a saliva de pulga. Algunos pocillos no recibieron los sueros de perro de modo que pudieran determinarse los niveles de unión de fondo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó cuatro veces con PBST. Se añadieron aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de una solución que contenía 40 \mug/ml de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT. (descrita en el Ejemplo 3) en PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó luego, se puso en contacto con una solución que contenía 0,25 ud/ml de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, se lavó de nuevo, y se detectó la presencia de estreptavidina unida a la placa usando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados, mostrados en la Fig. 4, indican que la IgE canina que se une específicamente a un antígeno de la saliva de la pulga, es detectada usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe la detección de IgE canina total en sueros aislados de perros que se sabe que son alérgicos a saliva de pulga, perros infectados con filaria cardiaca y perros libres de patógenos específicos (SPF). usando la PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II fueron revestidos con aproximadamente 100 \mul/pocillo de una solución de aproximadamente 1 \mug/ml de anticuerpo nº 6 anti-IgE canina, CMI (disponible de Custom Monoclonals International) en tampón de CBC. La placa se incubó durante la noche a 4ºC. Se bloqueó la placa y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Se añadieron a varios pocillos revestidos con el anticuerpo anti-IgE canina, 100 \mul/pocillo de diferentes muestras de fluidos que contenían IgE en PBSBT. Las muestras incluían: (1) 100 \mug/ml de IgE canina purificada, procedente del heterohibridoma descrito en el Ejemplo 4; (2) una dilución 1:10 de una colección de sueros procedentes de perros que se sabe eran alérgicos a la saliva de la pulga; (3) una dilución 1:10 de la misma colección de sueros que en (2) pero inactivada por calor; (4) una dilución 1:10 de suero procedente de un perro que se sabía que tenía dermatitis alérgica clínica por pulgas (perro CPO2); (5) una dilución 1:10 de suero de CPO2 inactivado por calor; (6) una dilución 1:10 de suero procedente de un perro infectado con filaria cardiaza (perro 417); (7) una dilución 1:10 de suero de 417 inactivado por calor; (8) una dilución 1:10 de una colección de sueros procedentes de perros infectados con filaria cardiaca; (9) una dilución 1:10 de la misma colección de sueros que en (8) pero inactivada por calor; y (10) una colección de sueros procedentes de perros hechos crecer en una instalación aislada. Cada muestra se diluyó en PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó cuatro veces con PBST. Se añadieron aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de una solución que contenía 40 \mug/ml de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT (descrita en el Ejemplo 3), en el seno de PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó luego, se puso en contacto con una solución que contenía 0,25 ug/ml de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, se lavó de nuevo, y se detectó la presencia de estreptavidina unida a la placa usando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados, mostrados en la Fig. 5, indican que la IgE canina procedente de perros alérgicos a la saliva de la pulga y procedente de perros infectados con filaria cardiaca, se detecta usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano. Además, la ausencia de señal colorimétrica en muestras de sueros inactivados por calor indica que el anticuerpo unido al anticuerpo anti-IgE y detectado por la cadena alfa del Pc_{\varepsilon}R es un anticuerpo del isotipo épsilon y no otro isotipo.

Ejemplo 9

Este ejemplo describe la detección de IgE que se une específicamente a la saliva de la pulga, usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II fueron revestidos con aproximadamente 100 \mul/pocillo de una solución de aproximadamente 0,1 \mug/ml de saliva de pulga, recogida usando el método descrito en la publicación de la patente PCT No. WO 96/11271, referencia citada, en el seno de tampón CPC. La placa se incubó, se bloqueó y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Las muestras que contenían IgE descritas en el Ejemplo 8 fueron aplicadas luego a la placa revestida con la saliva de pulga. La placa se trató luego usando el método descrito en el Ejemplo 8.

Los resultados, mostrados en la Fig. 6, indican que la IgE canina que se une específicamente a saliva de la pulga, contenida en suero, es detectada usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano. Además, la ausencia de señal colorimétrica en muestras de suero inactivado por calor indica que el anticuerpo unido a la saliva de la pulga, detectado por la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R, es un anticuerpo del isotipo épsilon.

Ejemplo 10

Este ejemplo describe la detección de IgE felina usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II fueron revestidos con aproximadamente 100 \mul/pocillo de una solución que contenía aproximadamente 10 \mug/ml de proteína Di33 (descrita en la solicitud de patente de EE.UU. Ser No. 08/715.628, referencia citada) o 10 \mug/ml de homogeneizado crudo de filaria cardiaca, ambos en el seno de tampón CBC. El homogeneizado crudo de la filaria cardiaca es el sobrenadante clarificado de un homogeneizado de filarias cardiacas adultas en el seno de PBS. La placa se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueó y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Muestras de suero procedentes de 2 gatos infectados con filaria cardiaca fueron añadidas luego a pocillos revestidos con la Di33 y a pocillos revestidos con antígeno de la filaria cardiaca. Se añadieron a la placa aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:10 en PBSBT de sueros procedentes del gato nº AXH4 o del gato nº MGC2, infectados con filaria cardiaca. Muestras testigo negativas constituidas por suero procedente de sangrados antes de la infección del gato nº AXH3 y del gato nº MGC2 se añadieron también a la placa en una dilución 1:10 en el seno de PBSBT. Una muestra testigo positiva constituida por una colección de sueros procedentes de perros infectados con filaria cardiaca, fue añadida también a la placa en una dilución de 1:10, en el seno de PBSBT.

La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavó cuatro veces con PBST, Se añadieron aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de una solución que contenía 40 \mug/ml de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT (descrita en el Ejemplo 3) en el seno de PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó luego, se puso en contacto con una dilución 1:4000 de una solución que contenía 0,5 mg/ml de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, se lavó de nuevo, y se detectó la presencia de estreptavidina unida a la placa usando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados, mostrados en la Fig. 7, indican que la IgE felina, que se une específicamente a homogeneizado crudo de filaria cardiaca o proteína Di33, se detecta usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano.

Ejemplo 11

Este ejemplo describe la detección de IgE felina usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Varios pocillos de una placa de microtitulación Immulon II fueron revestidos con Di33 según se ha descrito en el Ejemplo 10, en el seno de tampón CBC. La placa se incubó durante la noche a 4ºC. La placa se bloqueó y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Muestras de sueros procedentes de 2 gatos infectados con filaria cardiaca fueron añadidas luego a pocillos revestidos con Di33. Aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:10 en el seno de PBSBT de suero procedente del gato nº MGC2 infectado con filaria cardiaca y una colección de sueros procedentes de gatos infectados con filaria cardiaca, así como muestras inactivadas por calor de cada uno de estos sueros, fueron añadidas a la placa. Una muestra de testigo positivo constituida por una colección de sueros procedentes de perros infectados con filaria cardiaca fue añadida también a la placa, en una dilución de 1:10 en el seno de PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó cuatro veces con PBST. Se añadieron aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de una solución que contenía 40 \mug/ml de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT (descrita en el Ejemplo 3), en el seno de PBSBT. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó luego, se puso en contacto con estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, y se detectó la presencia de estreptavidina unida a la placa usando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados, que se indican en la Fig. 8, indican que la IgE felina procedente de gatos infectados con filaria cardiaca, que se une específicamente al antígeno de la filaria cardiaca Di33, se detecta usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano. Además, la ausencia de señal colorimétrica en muestras de sueros inactivados por calor, indica que el anticuerpo unido a la proteína Di33 y detectado mediante la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano es un anticuerpo del isotipo épsilon.

Ejemplo 12

Este ejemplo describe la detección de IgE equina en un ensayo ELISA en fase sólida usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT.

Suero de caballo procedente de un caballo que se sabía que era alérgico a ciertos alergenos y suero de caballo procedente de un caballo que se sabía que no era alérgico a los mismos alergenos, fueron ensayados para determinar la presencia de IgE usando PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT, del modo siguiente. Una placa de North Atlantic/Ohio Valley Regional Panel de un kit de IgE específica de alergeno, Canilec^{TM} (disponible de BioProducts DVM) se bloqueó y se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Dos muestras de diluciones aproximadamente 1:10 de sueros de los dos caballos, fueron preparadas empleando PBSBT. Las dos muestras fueron añadidas a la placa bloqueada y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó según se ha descrito en el Ejemplo 4. Se añadieron a cada pocillo aproximadamente 100 \mul/pocillo de una dilución 1:4000 de una solución que contenía 40 \mug/ml de PhFc_{\varepsilon}R\alpha_{172}-BIOT (descrita en el Ejemplo 3), contenida en PBSBT. La placa se lavo luego, se puso en contacto con una dilución 1:4000 de una solución que contenía 0,5 mg/ml de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, se lavó de nuevo y se detectó la presencia de estreptavidina usando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados, que se muestran en la Fig. 9, indican que la IgE equina procedente de un caballo que se sabe que es alérgico a ciertos alergenos, que se une específicamente a ciertos alergenos de plantas y ácaros, se detecta usando la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano.

\newpage

Ejemplo 13

Este ejemplo describe la detección de IgE canina en un ensayo Elisa en fase sólida usando células basofílicas transfectadas con la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano.

Células basofílicas de la leucemia de la rata (RBL) traansfectadas con una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena alfa de Fc_{\varepsilon}R humano (a las que se hace referencia en esta memoria como células RBL-hFc_{\varepsilon}R; descritas por Miller et al., Science 244:334-337, 1989) fueron usadas para detectar IgE canina del modo siguiente. 4 x 10^{4} células RBL-hFc_{\varepsilon}R, aproximadamente, contenidos en medio Eagles modificado, de Earles, que contenía suero fetal bovino (EMEM-FBS) al 10% fueron añadidas a cada pocillo de placas de cultivo de tejidos, de fondo plano, de 96 pocillos. Las células RBL-hFc_{\varepsilon}R fueron incubadas durante la noche a 37ºC. Después de la incubación las placas fueron lavadas 4 veces con PBST. Las células fueron fijadas entonces durante 2 minutos aproximadamente usando aproximadamente 200 \mul por pocillo de alcohol absoluto, a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas después 8 veces con PBST para retirar el alcohol residual.

Se prepararon diluciones en serie en el seno de EMEM-FBS (las concentraciones se muestran en la Fig. 10), usando una colección de sueros procedentes de perros infectados con filaria cardiaca. Se prepararon diluciones en serie en el seno de EMEM-FBS (las concentraciones se muestran en la Fig. 11) usando una colección de sueros procedentes de perros sensibilizados a saliva de pulga. Se prepararon muestras adicionales en las que ambas asociaciones de sueros fueron inactivadas por calor durante aproximadamente 4 horas a 56ºC. Las muestras tratadas por calor fueron diluidas como se ha descrito antes.

Aproximadamente 100 \mul de cada dilución de cada una de las muestras de sueros se añadieron a pocillos separados que contenían células RBL-hFc_{\varepsilon}R fijadas y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 1 hora aproximadamente. Después de la incubación las placas fueron lavadas 4 veces con PBST. Se añadió a cada pocillo aproximadamente 5 \mug de un anticuerpo monoclonal de IgG murina anti-IgE canina (es decir, el anticuerpo monooclonal Custom nº 71; disponible de Custom Monoclonal International), en el seno de 100 \mul de EMEM-FBS. Las placas fueron incubadas durante aproximadamente 30 minutos a 37ºC. Después de incubar, las placas fueron lavadas 4 veces con PBST. Se añadió a cada pocillo 100 ng aproximadamente de anti-IgG murina de asno marcada con peroxidasa de rábano picante (disponible de Jackson Laboratories, Westgrove, PA) en el seno de 100 \mul de EMEM-FBS, y las placas fueron incubadas durante 30 minutos aproximadamente a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas fueron lavadas 4 veces con PBST. La presencia de anti-IgG murina unida a las placas, indicando con ello la aptitud de las células RBL-hFc_{\varepsilon}R para unirse a la IgE canina, se detectó usando el método descrito en el Ejemplo 4.

Los resultados, que se muestran en la Fig. 10, indican que la IgE canina procedente de perros infectados con filaria cardiaca (\blacklozenge) es detectada usando células RBL-hFc_{\varepsilon}R que expresan la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano. Además, la ausencia de señal colorimétrica en muestras de tales sueros inactivadas por calor sueros (\blacksquare) indica que el anticuerpo detectado por la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R sobre las células RBL-hFc_{\varepsilon}R, es un anticuerpo del isotipo épsilon. De modo semejante, los resultados que se muestran en la Fig. 11 indican que la IgE canina procedente de perros sensibilizados con saliva de pulga (\blacklozenge) se detecta usando células RBL-hFc_{\varepsilon}R que expresan la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R humano. Además, la ausencia de señal colorimétrica en muestras de muestras inactivadas por calor de tales sueros (\blacksquare) indica que el anticuerpo detectado por la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R sobre las células RBL-hFc_{\varepsilon}R es un anticuerpo del isotipo épsilon.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Heska Corporation

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 1825 Sharp Point Drive

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Fort Collins

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: CO

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAIS: Estados Unidos de América

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 80525

\vskip0.333000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (970) 493-7272

\vskip0.333000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (970) 484-9505

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA DETECTAR IgE

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: LAHIVE AND COCKFIELD, LLP

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 28 STATE STREET

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: BOSTON

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAIS: ESTADOS UNIDOS de América

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 02109

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Windows 95

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: ASCII DOS TEXT

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/756.387

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN: 26 Noviembre 1996

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Rothenberger, Scott D.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 41.277

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE SUMARIO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (617) 227-7400

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (617) 742-4214

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1198 nucleótidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 107..877

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD 257 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1198 nucleótidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGíA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3:

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 774 nucleótidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..774

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4

5

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 774 nucleótidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 699 nucleótidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..699

\vskip0.666000\baselineskip

(III)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID: NO: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGCGGATCCT ATAAATATGG CTCCTGCCAT GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGCGAATTCT TAAGCTTTTA TTACAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 591 nucleótidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..591

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10

\vskip1.000000\baselineskip

10

100

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 197 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11

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11

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12

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(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 516 nucleótidos

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENAMIENTO: una sola cadena

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii)

RASGO DISTINTIVO

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(A)

NOMBRE/CLAVE

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..516

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12

12

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID: NO: 13:

13

Claims (10)

1. Un método para detectar IgE que comprende:

(a) poner en contacto una molécula de receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano aislado con una composición que se supone que contiene IgE, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo de molécula Fc_{\varepsilon}R:IgE, en el que dicha IgE está seleccionada entre el grupo que consta de IgE canina, IgE felina e IgE equina; y

(b) determinar la presencia de IgE detectando dicho complejo de molécula Fc_{\varepsilon}R:IgE, indicando la presencia de dicho complejo de molécula Fc_{\varepsilon}R:IgE, la presencia de IgE.

2. Un método para detectar IgE no humana que comprende:

(a) poner en contacto una célula recombinante con una composición que se supone que contiene IgE no humana, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo de célula recombinante:IgE, en el que dicha célula recombinante es una célula recombinante que expresa una molécula de Fc_{\varepsilon}R humano, y

(b) determinar la presencia de IgE no humana detectando dicho complejo de célula recombinante:IgE, indicando la presencia de dicho complejo de célula recombinante:IgE, la presencia de IgE.

3. Un kit para detectar IgE, que comprende una molécula de receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano y medios para detectar una IgE seleccionada entre el grupo que consta de IgE canina, IgE felina e IgE equina.

4. Un kit de alergeno general para la detección de IgE no humana, que comprende un alergeno no humano, común a todas las regiones de los Estados Unidos de América, y una molécula de receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano en el que el alergeno se une a la IgE.

5. Un método para detectar dermatitis alérgica por pulgas en no humanos, que comprende:

(a) inmovilizar sobre un sustrato un alergeno de pulga

(b) poner en contacto dicho alergeno de pulga con una composición que se supone que contiene IgE, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo de alergeno IgE unido a dicho sustrato;

(c) retirar de dicho sustrato el material sin unir, en condiciones que retienen unido a dicho sustrato el complejo de alergeno:IgE.; y

(d) detectar la presencia de IgE detectando la presencia de dicho complejo de alergeno:IgE por puesta en contacto de dicho complejo de alergeno:IgE con una molécula del receptor Fc_{\varepsilon}R humano.

6. Un kit para detectar dermatitis alérgica por pulgas en no humanos, que comprende una molécula de receptor Fc_{\varepsilon} humano (Fc_{\varepsilon}R) y un alergeno de pulga, en el que el alergeno de pulga se une a la IgE.

7. Una proteína de la cadena alfa del receptor Fc_{\varepsilon} (Fc_{\varepsilon}R) humano, aislada, en la que un grupo de hidrato de carbono de dicha proteína de la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R está conjugado a biotina

8. La invención según la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, en la que dicha molécula de Fc_{\varepsilon}R comprende al menos una parte de la cadena alfa del Fc_{\varepsilon}R que se une a IgE.

9. El método según la reivindicación 1, 2 ó 5, en el que dicha composición que se supone que contiene IgE, comprende una composición seleccionada entre el grupo que consta de sangre, suero, plasma, orina, lágrimas, humor acuoso, fluido del sistema nervioso central (CNF), saliva, linfa, secreciones nasales, leche y heces.

10. El método según la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa seleccionada entre el grupo que consta de la unión de dicha molécula de Fc_{\varepsilon}R a un sustrato antes de llevar a cabo la etapa (a) para formar un sustrato revestido con la molécula de Fc_{\varepsilon}R; y unir dicha composición que se supone que contiene IgE a un sustrato antes de llevar a cabo la etapa (a) para formar un sustrato revestido con la composición que se supone que contiene IgE, en el que dicho sustrato está seleccionado entre el grupo que consta de un sustrato sin revestir, un sustrato revestido con una molécula de Fc_{\varepsilon}R. un sustrato revestido con un antígeno y un sustrato revestido con un anticuerpo anti-IgE.