ES2205437T3 - Procedimiento que permite caracterizar polipeptidos. - Google Patents

Abstract

Un método para caracterizar polipéptidos que comprende: (a) el tratamiento de una muestra que contenga una población de una pluralidad de polipéptidos con un agente de corte que se sabe que reconoce en las cadenas polipeptídicas un residuo de aminoácido específico o una secuencia de aminoácidos específica y que corta en un sitio de corte, mediante lo cual la población es cortada para generar fragmentos peptídicos; (b) el aislamiento de una primera población de fragmentos peptídicos que contiene solamente fragmentos peptídicos terminales que llevan como extremo de referencia el extremo N o el extremo C del polipéptido del que fueron fragmentados, de una segunda población de fragmentos peptídicos que no contienen el extremo de referencia, llevando cada fragmento peptídico de la primera población en el otro extremo el sitio de corte proximal al extremo de referencia, comprendiendo dicha etapa de aislamiento la inmovilización de la primera población de fragmentos peptídicos o la inmovilización de la segunda población de fragmentos peptídicos sobre un soporte sólido y (c) la determinación por espectrometría de masas de una secuencia "firma" de al menos alguno de los fragmentos aislados, secuencia "firma" que es la secuencia de un número predeterminado de residuos de aminoácidos que se extiende desde el sitio de corte; en el que una secuencia "firma" caracteriza a cada polipéptido.

Description

Procedimiento que permite caracterizar polipéptidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para caracterizar polipéptidos y a métodos para identificar y analizar tales polipéptidos.

Antecedentes de la invención

La caracterización e identificación de polipéptidos a partir de mezclas complejas de los mismos, tales como muestras de proteínas encontradas en sistemas biológicos, es un problema bien conocido en bioquímica. Los métodos tradicionales implican una variedad de etapas de fraccionamiento en fase líquida y cromatografía seguidas por caracterización mediante, por ejemplo, electroforesis en gel bidimensional. Tales métodos son propensos a artefactos y son inherentemente lentos. Además, la automatización de tales métodos es extremadamente difícil.

La Solicitud de Patente PCT/GB97/02403, registrada el 5 de Septiembre de 1997, describe un método para perfilar una población de ADNc con el fin de crear una "firma" para cada ADNc de la población. Se asume en ese método que una corta secuencia de 8 pb aproximadamente, que es determinada con respecto a un punto de referencia fijado, es suficiente para identificar casi todos los genes. Este sistema se basa en la inmovilización de la población de ADNc en el extremo 3' y el corte de la misma con una endonucleasa de restricción. Esto deja una población de fragmentos de restricción 3'. La patente describe una técnica que permite determinar una firma de 8 a 10 pares de bases aproximadamente en un número especificado de bases a partir del sitio de restricción, que es una firma suficiente para identificar casi todos los genes.

Las técnicas para determinar el perfil de proteínas, es decir para catalogar las identidades y las cantidades de las proteínas de un tejido, están menos bien desarrolladas en términos de automatización o alto rendimiento. El método clásico para perfilar una población de proteínas es mediante electroforesis bidimensional. En este método una muestra de proteína extraída de una muestra biológica es separada en una estrecha tira de gel. Esta primera separación separa normalmente las proteínas sobre la base de su punto isoeléctrico. La tira de gel completa es colocada posteriormente contra un borde de un gel rectangular. Las proteínas separadas de la tira son separadas posteriormente electroforéticamente en el segundo gel sobre la base de su tamaño. Esta tecnología es lenta y muy difícil de automatizar. Es también relativamente insensible en sus realizaciones más sencillas. Se han realizado diferentes mejoras para incrementar la resolución de proteínas mediante electroforesis en gel 2-D y para mejorar la sensibilidad del sistema. Un método para mejorar la sensibilidad de la electroforesis en gel 2-D y su resolución es analizar la proteína en manchas específicas sobre el gel mediante espectrometría de masas. Uno de tales métodos es la digestión tríptica en el gel seguida por el análisis de los fragmentos trípticos por espectrometría de masas para generar una impronta de la masa de péptidos. Si se requiere información sobre la secuencia, puede realizarse un análisis de espectrometría de masas en tándem.

Más recientemente se han hecho intentos con el fin de aprovechar la espectrometría de masas para analizar proteínas completas que habían sido fraccionadas por cromatografía líquida o por electroforesis capilar. Se han ensayado sistemas en línea que aprovechan la electroforesis capilar y la espectrometría de masas. El análisis de proteínas completas por espectrometría de masas adolece, sin embargo, de varias dificultades. La primera dificultad es el análisis de los complejos espectros de masas resultantes de los múltiples estados de ionización accesibles para las proteínas individuales. La segunda desventaja principal es que la resolución de masas de los espectrómetros de masas es actualmente bastante pobre para especies de alto peso molecular, esto es para iones que sean mayores de 4 kilodaltons de masa aproximadamente, por lo que la resolución de proteínas que están próximas en masa es difícil. Una tercera desventaja es que el análisis posterior de proteínas completas por espectrometría de masas en tándem es difícil, ya que los patrones de fragmentación de las proteínas completas son extremadamente complejos.

Biochemistry (1995) 34, 12605-12615, describe el análisis del núcleo estructural central del dominio de unión al ligando del receptor de estrógenos humano mediante corte con proteasas, y el análisis posterior de los fragmentos proteicos mediante SDS-PAGE, secuenciación N-terminal de Edman y espectrometría de masas (espectrometría de masas por ionización mediante electropulverización acoplada a HPLC).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para caracterizar polipéptidos que comprende:

(a) el tratamiento de una muestra que contenga una población de una pluralidad de polipéptidos con un agente de corte que se sabe que reconoce en las cadenas polipeptídicas un residuo de aminoácido específico o una secuencia de aminoácidos específica y que corta en un sitio de corte, mediante el cual la población es cortada para generar fragmentos peptídicos;

(b) el aislamiento de una primera población de fragmentos peptídicos que contiene solamente fragmentos peptídicos terminales que llevan como un extremo de referencia el extremo N o el extremo C del polipéptido a partir de una segunda población de fragmentos peptídicos que no contiene el fragmento de referencia, llevando cada fragmento peptídico de la primera población en el otro extremo el sitio de corte proximal al extremo de referencia, comprendiendo dicha etapa de aislamiento la inmovilización de la primera población de fragmentos peptídicos o la inmovilización de la segunda población de fragmentos peptídicos sobre un soporte sólido; y

(c) la determinación mediante espectrometría de masas de una secuencia "firma" de al menos alguno de los fragmentos aislados, secuencia firma que es la secuencia de un número de residuos de aminoácidos predeterminado que se extiende desde el sitio de corte;

en el que una secuencia firma caracteriza a cada polipéptido.

La invención describe por tanto un sistema análogo al de PCT/GB97/02403, pero para ser utilizado con proteínas. Como hay 20 monómeros que constituyen una proteína, hay muchas más variantes posibles en un sitio particular de una secuencia y por tanto la longitud requerida de la firma de una secuencia proteica es mucho más corta que la requerida de una secuencia de ADNc para identificarla exclusivamente. Esta invención puede utilizar técnicas de separación en fase líquida y espectrometría de masas para resolver proteínas y fragmentos proteicos con el fin de facilitar la automatización y evitar los artefactos y la lentitud y la falta de automatización inherentes a las técnicas basadas en un gel, tales como la electroforesis en gel 2-D.

El extremo de referencia puede estar unido a un soporte de fase sólida para inmovilizar la población de polipéptidos o los fragmentos peptídicos de los mismos. Preferiblemente, la población de polipéptidos es inmovilizada antes del tratamiento con el agente de corte. De esta forma, los fragmentos peptídicos producidos después del tratamiento con el agente de corte permanecen inmovilizados y pueden ser aislados fácilmente eliminando mediante lavado el material no deseado presente en la fase líquida. El soporte de fase sólida puede comprender esferas adecuadas u otros soportes similares bien conocidos en esta técnica. Tales soportes o sustratos pueden ser elegidos para se unan selectivamente al extremo N o al extremo C, y esto se discute con más detalle posteriormente.

En una realización, el extremo de referencia es unido al soporte de fase sólida mediante: (i) el tratamiento de los polipéptidos con un agente bloqueante con el fin de bloquear todos los grupos de referencia expuestos, que comprenden grupos carboxilo o grupos amina primaria; (ii) el corte de los aminoácidos terminales de referencia para exponer los extremos de referencia no bloqueados; y (iii) el tratamiento de los extremos de referencia no bloqueados con un agente de inmovilización capaz de acoplarse al soporte de fase sólida; donde la etapa (b) comprende la unión de los extremos de referencia tratados al soporte de fase sólida y la eliminación de los fragmentos peptídicos no unidos. En una realización alternativa, el método comprende además (i) la preparación de la muestra de la etapa (a) mediante pretratamiento de los polipéptidos con un agente bloqueante con el fin de bloquear todos los grupos de referencia expuestos, los cuales comprenden grupos carboxilo o grupos amina primaria, de tal manera que el tratamiento posterior de la muestra con el agente de corte genera fragmentos peptídicos que llevan extremos de referencia no bloqueados; (ii) la biotinilación de los extremos de referencia no bloqueados y (iii) la unión de los fragmentos peptídicos que contienen los extremos de referencia no bloqueados a un soporte de fase sólida; donde la etapa (b) comprende la elución de los fragmentos peptídicos no unidos a partir del mismo. Preferiblemente, el agente de inmovilización comprende un agente de biotinilación.

El agente de corte debe reconocer con cierta precisión un residuo de aminoácidos específico o una secuencia de aminoácidos específica. El sitio de corte puede estar en el residuo de aminoácido específico o en la secuencia de aminoácidos específica o en un desplazamiento conocido de los mismos. El agente de corte puede ser un agente de corte químico tal como bromuro de cianógeno. Preferiblemente, el agente de corte es una peptidasa, tal como una proteasa de serina, preferiblemente tripsina.

Según se discute con más detalle posteriormente, dependiendo del número de proteínas o polipéptidos en una muestra dada, puede ser ventajoso clasificar los polipéptidos en subpoblaciones manejables. La clasificación puede ser efectuada antes del tratamiento de la muestra con el agente de corte o después del corte. Según se discute con más detalle posteriormente, la muestra de la etapa (a) puede comprender una fracción subcelular. De esta forma, el método comprende además una etapa de fraccionamiento subcelular antes de la etapa (a). La muestra de la etapa (a) puede ser preparada mediante cromatografía líquida de una fracción bruta o de una fracción subcelular. Un método preferido para determinar la secuencia firma es por espectrometría de masas y ésta puede estar precedida por una etapa de cromatografía líquida de alta presión para resolver los fragmentos peptídicos. Alternativamente, los fragmentos peptídicos pueden ser sometidos a cromatografía de intercambio iónico antes de la etapa (c) seguido por secuenciación mediante espectrometría de masas.

De acuerdo con el método de la presente invención, el número predeterminado de residuos de aminoácidos requerido para constituir la secuencia firma variará de acuerdo con el tamaño de la población de polipéptidos. Preferiblemente, el número predeterminado de residuos de aminoácidos es de 3 a 30, más preferiblemente de 3 a 6.

La presente invención proporciona además un método para identificar polipéptidos en una muestra de ensayo. El método comprende la caracterización de los polipéptidos según se describió anteriormente y la comparación de las secuencias firma y de las posiciones relativas del sitio de corte obtenidas de este modo con las secuencias firma y las posiciones relativas del sitio de corte de los polipéptidos de referencia, con el fin de identificar el o cada polipéptido de la muestra de ensayo. Este método puede ser utilizado para identificar un único polipéptido desconocido o una población de polipéptidos desconocidos comparando sus características (esto es, sus secuencias firma y las posiciones relativas del sitio de corte) con las de polipéptidos previamente identificados. Se prevé que la base de datos de tales características pueda ser fácilmente recopilada.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para analizar uno o más polipéptidos específicos en una muestra de ensayo. El método comprende la realización de un método como el descrito anteriormente, en el que el agente de corte y la posición relativa del sitio de corte están predeterminados y la secuencia firma es determinada en la etapa (c) analizando una secuencia predeterminada de residuos de aminoácidos que se extiende desde el sitio de corte. Preferiblemente, el sitio de corte y la secuencia firma son predeterminados seleccionando las secuencias correspondientes de uno o más polipéptidos diana conocidos, tales como los que están disponibles en la base de datos.

Breve descripción de las figuras

La invención será descrita ahora con más detalle, a manera de ejemplo solamente, con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales:

La Figura 1 muestra un esquema de reacción de acuerdo con una realización de la invención;

La Figura 2 muestra un esquema de reacción de acuerdo con otra realización de la invención;

La Figura 3 muestra un esquema de reacción de acuerdo con una realización sencilla de la invención y

La Figura 4 muestra un esquema de reacción de acuerdo con una variación de la realización mostrada en la Figura 1.

Breve descripción de la invención Firmas proteicas

La esencia de este sistema es que se puede inmovilizar una población de proteínas sobre un sustrato de fase sólida en un extremo de la molécula. Las proteínas son direccionales, por lo que puede elegirse un extremo particular de una forma dependiente de la química del agente de inmovilización, por ejemplo puede utilizarse selectivamente el reactivo de Edman (isotiocianato de fenilo) para eliminar aminoácidos del extremo N de una proteína; sin embargo, si se utiliza isocianato de fenilo el extremo N es cubierto por un casquete. Un derivado de esta molécula que podría ser acoplado a un adaptador susceptible de ser cortado en un sustrato de fase sólida, permitiría que una proteína fuera inmovilizada en su extremo N y extraída posteriormente mediante el corte del adaptador. Durante la síntesis peptídica, el extremo C es normalmente inmovilizado como un éster de bencilo, mediante la utilización de un grupo clorometilo. Si se desea, tal química puede ser adaptada para inmovilizar proteínas en este extremo.

Una población de proteínas inmovilizadas es tratada posteriormente con una peptidasa específica de una secuencia, tal como tripsina, para dejar una población de fragmentos de corte N-terminales. Tales fragmentos pueden ser considerados análogos a una secuencia expresada que es marca para una proteína. Se pueden luego secuenciar las firmas peptídicas resultantes mediante espectrometría de masas. Los fragmentos terminales son más significativos, en cuanto a que se conoce la posición de todos los péptidos resultantes en la proteína y los extremos están normalmente accesibles en la superficie de la mayoría de las proteínas.

Clasificación de las proteínas

Obviamente, una población de proteínas extraída de una célula va a ser un número significativo de especies distintas. Si como se cree hay 15.000 genes expresados aproximadamente en la célula humana media, pueden esperarse otras tantas proteínas. Claramente no se pueden secuenciar todas éstas por espectrometría de masas en una sola etapa con la tecnología actual. Por esta razón una población de proteínas de tal tamaño necesita ser clasificada en subgrupos manejables.

Un sistema generalizado para perfilar proteínas debe intentar resolver una población de proteínas en subgrupos de tamaño relativamente uniforme razonablemente discretos. Esto se consigue muy fácilmente mediante separación sobre la base de propiedades globales de las proteínas, que varían sobre un rango amplio y continuo, tales como el tamaño y la carga superficial, que son las propiedades más eficazmente utilizadas en la electroforesis en gel 2-D. Tales separaciones pueden ser conseguidas tan rápidamente o más utilizando técnicas de cromatografía líquida. De hecho, siguiendo una separación por cromatografía líquida por otra, se pueden separar proteínas en tantas dimensiones como se requiera, ya que hay mucha más flexibilidad en los sistemas de separación por cromatografía líquida, aunque idealmente se evitarían demasiadas etapas de separación para impedir la pérdida de muestra.

La clasificación puede ser efectuada durante la extracción, después de la extracción de las proteínas de su tejido original o después del corte de los péptidos inmovilizados.

Clasificación durante el fraccionamiento celular

Las proteínas están intrínsecamente clasificadas in vivo, en términos de su compartimentación dentro de la célula. Están disponibles varias técnicas que permiten clasificar proteínas sobre la base de sus compartimientos celulares. Los protocolos de fraccionamiento implican varias técnicas de lisis celular tales como sonicación, detergentes o lisis celular mecánica que pueden ser acopladas a una variedad de técnicas de fraccionamiento, principalmente centrifugación. La separación en proteínas de membrana, proteínas citosólicas y los compartimientos subcelulares unidos a membranas principales, tales como el núcleo y las mitocondrias, es una práctica estándar. De este modo, pueden ignorarse eficazmente ciertas clases de proteínas si se elige, por ejemplo es probable que las proteínas mitocondriales no sean de interés en muchos casos. En general, los compartimientos membranal, citosólico y nuclear serán de particular interés.

Clasificación después de la extracción

Como las proteínas son moléculas muy heterogéneas, están disponibles numerosas técnicas de separación de proteínas sobre la base de su tamaño, hidrofobicidad, carga superficial y varias combinaciones de las propiedades anteriores utilizando cromatografía líquida en sus varias realizaciones. La separación es efectuada por una variedad de matrices de fase sólida derivatizadas con diferentes grupos funcionales que se adhieren a las proteínas y por tanto enlentecen el flujo de dichas proteínas a través de la columna sobre la base de las propiedades anteriores. Las moléculas son cargadas normalmente en tales columnas en condiciones que favorecen la adhesión a la matriz de fase sólida y son extraídas selectivamente mediante lavado en cantidades regularmente crecientes de un segundo tampón que favorece la elución. De esta forma, las proteínas que tienen las interacciones más débiles con una matriz dada eluyen primero.

Existen varios formatos para cromatografía líquida, pero por la mayor velocidad de obtención de resultados y por las separaciones más discretas, los formatos de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) son los preferidos. En este formato la matriz es diseñada para que sea muy incomprimible y para que cuando sea derivatizada permita la realización de la separación cromatográfica a presiones extremadamente elevadas, lo cual favorece una separación rápida y discreta.

Clasificación de péptidos cortados

La espectrometría de masas-cromatografía líquida (LCMS) es un campo bien desarrollado. La utilización de sistemas de HPLC acoplados directamente a espectrómetros de masas con electropulverización está muy extendida. La HPLC es una manera rápida y eficaz de separar péptidos una vez que han sido cortados de su estado inmovilizado.

Alternativamente, la clasificación de péptidos mediante cromatografía de intercambio iónico podría ser ventajosa en cuanto a que los péptidos cortos podrían ser separados de una manera casi dependiente de la secuencia: los aminoácidos que son ionizables tienen valores conocidos de pKa y por tanto la elución de los péptidos de tal columna a un pH específico sería indicativa de la presencia de aminoácidos particulares en esa secuencia. Por ejemplo, los residuos de aspartato tienen un pKa de 3,9 y los residuos de glutamato de 4,3. La elución de un péptido a pH 4,3 sería indicativa de la presencia de glutamato en el péptido. Estos efectos están a veces enmascarados en las proteínas grandes pero deberían ser claros en los péptidos cortos, siendo por tanto extremadamente útiles como características para selección.

La combinación de las técnicas anteriores permitirá desarrollar diferentes protocolos de clasificación que permitirán un gran control sobre la forma del perfil de proteínas generado. De esta forma, sería alcanzable la identificación de la mayoría de las proteínas expresadas en una célula.

Secuenciación de péptidos mediante espectrometría de masas

Los péptidos pueden ser fácilmente secuenciados directamente por espectrometría de masas en tándem. En general, las mezclas de péptidos son inyectadas en el espectrómetro de masas mediante electropulverización, la cual deja a los mismos en fase de vapor. El primer espectrómetro de masas actúa como un filtro que selecciona las moléculas para entrar en el segundo espectrómetro de masas sobre la base de su relación masa-carga, de tal manera que en el segundo espectrómetro de masas entra esencialmente sólo una única especie cada vez. Al abandonar el primer espectrómetro de masas, el péptido seleccionado pasa a través de una cámara de colisión, lo cual tiene como resultado la fragmentación del péptido. Como la fragmentación tiene lugar principalmente en el enlace peptídico, el patrón de los fragmentos corresponde a una serie de subespecies de péptidos y aminoácidos que componen el péptido original. El patrón de masas característico de los aminoácidos individuales, de los 2-meros, 3-meros, etc., generado en la fragmentación del péptido es suficiente para identificar su secuencia.

El resultado final es por tanto el que una población de proteínas puede ser clasificada arbitrariamente en poblaciones de péptidos de tamaño conveniente para ser introducidos en un espectrómetro de masas en tándem con electropulverización para su secuenciación directa. La finalización de tal análisis para todas las proteínas de una célula proporcionaría un perfil de qué proteínas están presentes y en qué cantidades relativas. La cuantificación absoluta podría conseguirse "añadiendo" a una población de proteínas cantidades conocidas de proteínas particulares que se sabe que están ausentes, por ejemplo proteínas vegetales en muestras de animales o viceversa, frente a las que se pueden calibrar los resultados.

Firmas proteicas

Esta invención proporciona un método para capturar una población de proteínas sobre un sustrato de fase sólida por un extremo de cada proteína de la población. Esta invención proporciona también un método para cortar proteínas que han sido derivatizadas en un extremo con un agente que puede ser utilizado para inmovilizar ese extremo sobre un sustrato de fase sólida. Esto permite que sea capturado un único péptido de cada proteína de una población sobre un sustrato de fase sólida; de este modo los péptidos del extremo elegido pueden ser separados de los demás péptidos generados por la etapa de corte y pueden ser aislados. Esta invención proporciona también un método que permite que todos los péptidos generados en una etapa de corte que no procedan del extremo de referencia sean capturados, dejando un único péptido terminal por proteína libre en solución para el análisis.

Una población de péptidos generada de acuerdo con los métodos de esta invención puede ser analizada de varias formas, preferiblemente mediante espectrometría de masas.

Se prefieren dos formas de análisis. La primera es determinar las improntas de las masas de los péptidos para la población de péptidos firma generada. En este método se determina la masa de cada péptido, preferiblemente la masa exacta. Una proporción significativa de péptidos firma debe ser identificada exclusivamente por esta forma de análisis. Cualquier pico de masas que sea desconocido puede ser caracterizado posteriormente por la segunda forma de análisis preferido. Pueden seleccionarse iones de una masa específica por la disociación inducida por colisión en un espectrómetro de masas en tándem. Esta técnica puede ser utilizada para determinar información sobre la secuencia de un péptido.

Captura de péptidos

Esta invención proporciona métodos que aprovechan la derivatización de proteínas con varios agentes, incluyendo reactivos para secuenciar péptidos existentes, para aislar un único péptido "firma" de cada miembro de una población de proteínas. Esta invención puede ser practicada en dos formatos. Los métodos de esta invención permiten seleccionar un extremo de referencia de las proteínas de una población. En el primer formato, este extremo de referencia puede ser derivatizado con un agente de inmovilización. Si las proteínas derivatizadas de esta manera son tratadas con un agente de corte específico de una secuencia para generar péptidos, los péptidos de los extremos de referencia de las proteínas de una mezcla pueden ser capturados específicamente, dejando a los péptidos restantes libres en solución. Este primer formato es discutido en la sección siguiente encabezada "Formato 1". En el segundo formato se genera una única muestra peptídica por proteína mediante la captura de los fragmentos peptídicos que no proceden del extremo de referencia elegido, dejando así a los péptidos firma libres en solución.

Formato 1

En la realización más sencilla de esta invención, según se muestra esquemáticamente en la Figura 3, se hace reaccionar una población de proteínas con un agente de secuenciación modificado específico para un extremo de cada proteína de la población. El agente de secuenciación modificado lleva un agente de inmovilización con el fin de que las proteínas derivatizadas con el agente de secuenciación puedan ser capturadas sobre un soporte de fase sólida. Las proteínas capturadas pueden ser luego cortadas con un agente de corte específico de una secuencia. Esta etapa de corte generará una serie de fragmentos peptídicos en solución y dejará un único fragmento peptídico capturado en el soporte de fase sólida. Los péptidos libres en solución son eliminados posteriormente mediante lavado. Los péptidos inmovilizados pueden ser luego liberados del soporte de fase sólida completando la reacción de secuenciación para el aminoácido terminal acoplado. El reactivo de Edman (isotiocianato de fenilo) podría ser modificado para que llevara un agente de inmovilización, el anillo de fenilo podría ser sustituido con un grupo unido a un efector de inmovilización adecuado tal como biotina. Una población de proteínas derivatizadas con este reactivo podría ser cortada con tripsina. Los péptidos terminales derivatizados podrían ser luego inmovilizados sobre un soporte de fase sólida con avidina, permitiendo que los péptidos no derivatizados sean eliminados mediante lavado. Los péptidos podrían ser luego liberados del soporte de fase sólida rompiendo la reacción avidina-biotina. Esto dejará péptidos N-terminales libres en solución. Estos péptidos pueden ser analizados posteriormente mediante espectrometría de masas. Puede ser deseable fraccionar los péptidos antes de la espectrometría de masas, pero esta etapa de fraccionamiento es opcional. Alternativamente, podría utilizarse un agente de secuenciación C-terminal modificado para capturar las proteínas por el extremo C. El extremo C no es generalmente modificado después de la traducción y por tanto puede ser el extremo preferido para capturar una población de proteínas. Más adelante se discuten realizaciones adicionales de esta invención.

Agentes de secuenciación C-terminal

Pueden utilizarse agentes de secuenciación C-terminal no modificados para generar un péptido firma. Una realización más de la presente invención es según sigue y está descrita esquemáticamente en la Figura 1. En la primera etapa, una población de proteínas extraída de un tejido es inmovilizada no muy firmemente sobre una membrana, tal como una membrana de PVDF. Los solventes utilizados para extraer proteínas de una muestra de tejido son generalmente muy fuertes, conteniendo normalmente agentes tales como urea, tiourea y detergentes, ya que las proteínas tienen solubilidades muy variables. La inmovilización de las proteínas extraídas sobre una membrana permite que sean lavadas con otros solventes antes de la modificación. La población de proteínas así capturada es derivatizada posteriormente con un agente de acoplamiento, tal como difenil fosforoisotiocianatidato de Hewlett-Packard (Miller y col., Techniques in Protein Chemistry VI 219-227) en un método que es esencialmente el mismo que el que se utilizaría en una reacción de secuenciación normal para una sola proteína, produciendo peptidilacilisotiocianatos para todas las proteínas. El reactivo de acoplamiento reacciona también con otros grupos carboxilo libres, dando también derivados acilisotiocianato. El agente de acoplamiento puede, sin embargo, reaccionar de manera incompleta con algunas cadenas laterales de ácido carboxílico. Puede ser deseable, por tanto, llevar a cabo etapas adicionales de derivatización utilizando reactivos más reactivos para asegurar que se derivaticen todos los grupos carboxilo libres. Esta variación se muestra en la Figura 4. La población de proteínas derivatizadas es tratada posteriormente con piridina para efectuar el cierre del anillo del derivado acilisotiocianato terminal. Se puede luego cortar el residuo C-terminal mediante la adición de un agente de corte tal como trimetilsilanolato, de Hewlett-Packard, que corta el aminoácido terminal de cada proteína, liberando el derivado tiohidantoín-aminoácido del aminoácido terminal. Esto expone un carboxilo libre en el penúltimo residuo de cada proteína. Éste puede ser derivatizado específicamente con biotina utilizando 5-(biotinamido)pentilamina, ya que todos los demás grupos carboxilo están derivatizados. De esta forma todas las proteínas de una población pueden ser derivatizadas en el extremo C con biotina. La población biotinilada, todavía en la membrana de PVDF, es tratada posteriormente con un agente de corte específico de una secuencia apropiado. Se utiliza generalmente tripsina para aplicaciones de espectrometría de masas, ya que ésta deja generalmente protonado el lado N-terminal del sitio de corte, lo cual es deseable. La tripsina corta específicamente de forma adyacente a los residuos básicos. Si se utiliza un enzima, los péptidos inmovilizados tendrán que ser lavados con alguna forma de tampón fisiológico para permitir que funcione la tripsina. Esto dará lugar a una población de péptidos cortados, algunos de los cuales que están biotinilados podrán ser desprendidos de la membrana de PVDF y pasar a la solución. Los péptidos biotinilados pueden ser capturados utilizando una matriz de fase sólida derivatizada con avidina monomérica. Los péptidos no inmovilizados pueden ser eliminados posteriormente mediante lavado, dejando una población inmovilizada de péptidos C-terminales que contienen la marca utilizada para identificar proteínas en una población. Después de eliminar mediante lavado los péptidos libres, las marcas inmovilizadas pueden ser liberadas del soporte de fase sólida mediante la adición de un ácido que rompa la interacción biotina/avidina - la avidina monomérica es la mejor para este fin. En una realización alternativa, los péptidos biotinilados pueden ser capturados sobre un soporte que contenga avidina antes del corte específico de la secuencia.

Agentes de sucuenciación N-terminal

Los extremos N de una gran proporción de proteínas celulares están bloqueados. Para determinar el perfil de aquellas proteínas cuyos extremos N no están bloqueados pueden utilizarse los agentes de secuenciación N-terminal correspondientes para derivatizar los grupos amino, incluyendo el grupo amino terminal. El aminoácido terminal puede ser cortado y la amina recién expuesta en el penúltimo aminoácido puede ser derivatizada con un agente de inmovilización. Las proteínas biotiniladas pueden ser cortadas posteriormente y los péptidos firma terminales pueden ser capturados y analizados. Esto se limitaría, sin embargo, a aquellos extremos N que no estuvieran ya bloqueados.

Formato 2

Este método está mostrado esquemáticamente en la Figura 2. En este método se utiliza un reactivo que derivatiza los residuos carboxilo para generar un casquete sobre todos los residuos carboxilo, incluyendo el grupo carboxilo C-terminal, en la población de proteínas de interés. La población de proteínas es cortada posteriormente con tripsina o con otro reactivo de corte específico de una secuencia que corte en el enlace peptídico para generar un grupo amino y un grupo carboxilo en los fragmentos C-terminales y N-terminales, respectivamente. En esta etapa todos los péptidos, excepto los péptidos terminales que tienen el casquete, tendrán un carboxilo libre. Estos carboxilos libres pueden ser derivatizados con 5-(biotinamido)pentilamina o con algún otro agente de inmovilización. Si se utiliza biotina, pueden entonces capturarse todos los péptidos no C-terminales biotinilados sobre una matriz de fase sólida derivatizada con avidina. Una columna de afinidad con avidina en línea con un espectrómetro de masas permitiría eluir selectivamente los péptidos C-terminales directamente en el espectrómetro de masas para el análisis.

Esta técnica es igualmente aplicable para generar marcas peptídicas del extremo N de una población de proteínas. Pueden utilizarse reactivos que derivaticen los grupos amina para formar selectivamente un casquete sobre todos los grupos amina de una proteína, incluyendo el grupo amina N-terminal. El corte expondrá la aminas de los péptidos no terminales que pueden ser derivatizadas con biotina, permitiendo la captura selectiva de los péptidos no N-terminales. Esto es importante, ya que muchas proteínas están modificadas en el extremo N y la amina N-terminal está a menudo inaccesible a los reactivos. Por tanto, la captura selectiva de péptidos no N-terminales es un medio para generar una firma en el extremo N.

Los reactivos para derivatizar aminas y carboxilos son también más sencillos que los necesarios para los agentes de acoplamiento utilizados en las reacciones de secuenciación.

Agentes de inmovilización

Es posible capturar péptidos derivatizados con una variedad de agentes químicos. En la discusión de los métodos de esta invención se ha elegido biotina como ejemplo de agente de inmovilización debido a sus interacciones altamente específicas con avidina. Otros agentes de inmovilización además de biotina son compatibles con los métodos de esta invención. Lo que sigue a continuación son ejemplos y la invención no está limitada a los mismos.

Un adaptador para hexahistidina permitiría capturar las marcas peptídicas sobre una columna derivatizada con iones metálicos coordinados. Podrían utilizarse también en lugar de biotina diferentes interacciones anticuerpo-antígeno cuando un anticuerpo o un antígeno esté marcado en el penúltimo aminoácido.

Anticuerpos contra derivados

La modificación N-terminal más común es la acetilación. Sería posible producir un anticuerpo contra péptidos acetilados N-terminalmente con el fin de permitir que éstos sean capturados utilizando una columna de afinidad derivatizada con tal anticuerpo. Para capturar sustancialmente todas las proteínas pueden derivatizarse las proteínas restantes de una muestra, que no estén ya acetiladas, con un agente de acetilación. Las proteínas derivatizadas pueden ser luego cortadas con quimotripsina o con otro agente específico de una secuencia (la tripsina no corta en sitios de corte de proteínas acetilados). Podría utilizarse un anticuerpo anti-acetilación N-terminal inmovilizado en una matriz apropiada para generar una columna de afinidad. Tal columna podría ser utilizada para capturar firmas peptídicas con extremos N acetilados después de que hayan sido cortadas las proteínas de las que proceden.

Para capturar péptidos C-terminales, se podría producir un anticuerpo contra derivados tiohidantoína de péptidos que podría ser utilizado para capturar selectivamente un péptido de una proteína que haya sido derivatizada con un agente de acoplamiento para secuenciación antes del corte con tripsina o con otro agente de corte específico de una secuencia.

Derivatización de proteínas

Los métodos de esta invención incluyen etapas de derivatización que son requeridas para asegurar que el extremo de referencia de cada proteína de una población sea derivatizado específicamente con un agente de inmovilización en el primer formato o, en el segundo formato, para asegurar que el extremo de referencia sea bloqueado específicamente de la reacción con un agente de inmovilización. Pueden realizarse también etapas adicionales de derivatización. Éstas pueden ser deseables si se va a llevar a cabo el fraccionamiento de los péptidos firma antes del análisis por espectrometría de masas. Hay dos factores importantes que deben ser considerados con respecto a cualquier etapa de fraccionamiento. Estos factores son la resolución de la etapa de fraccionamiento y la consiguiente pérdida de muestra impuesta por el fraccionamiento.

Ciertas técnicas cromatográficas son "pegajosas" cuando se utilizan para la separación de péptidos, es decir, una proporción de la muestra es retenida en la matriz de separación. Es posible reducir la pérdida de muestra de este tipo mediante la derivatización de los grupos que están implicados en la adhesión a la matriz de separación. Es decir, si se está utilizando una separación por cromatografía de intercambio iónico, pueden derivatizarse las cadenas laterales iónicas y polares con reactivos que incrementen su hidrofobicidad, reduciendo así la afinidad por la matriz. Esto, sin embargo, reducirá la resolución de la separación.

Es deseable asegurar que aparezca solamente un pico de masa por péptido en el espectro de masas generado por el análisis de una población de péptidos firma. Puede ser deseable, por tanto, derivatizar cadenas laterales polares e iónicas de péptidos firma con el fin de reducir el número de estados de ionización accesibles para esos péptidos. Esta etapa debería ayudar a estimular la formación de una única especie iónica por péptido firma.

Puede ser también deseable añadir un grupo a cada péptido firma para incrementar la sensibilidad del análisis por espectrometría de masas. Un grupo "sensibilizante" particularmente bueno para ser añadido a un péptido sería un ión amonio terciario, que es una entidad cargada positivamente con excelentes propiedades de detección.

Etapas de pre-clasificación

Esta tecnología puede ser utilizada para definir el perfil de poblaciones peptídicas generadas de numerosas formas. Existen varias técnicas de fraccionamiento para subclasificar proteínas sobre la base de ciertas características. Es de particular interés el análisis de las rutas de producción de señales. La fosforilación de proteínas por las quinasas es una característica de muchas rutas de producción de señales. Las proteínas que pueden ser fosforiladas por una quinasa tienen a menudo un motivo de fosforilación corto que reconoce una quinasa. Existen anticuerpos que se unen a tales motivos, algunos se unen a las formas fosforiladas mientras que otros se unen al estado no fosforilado. Columnas de afinidad con anticuerpos o la inmunoprecipitación de subpoblaciones que son una diana para las quinasas seguido por la determinación del perfil, serían de gran interés para identificar estas proteínas y monitorizar su metabolismo simultáneamente en estudios de sistemas en modelos vivos de resolución temporal.

Muchas proteínas existen como complejos, y el análisis de tales complejos es a menudo complicado. Una proteína clonada que es un supuesto miembro de un complejo, permite generar una columna de afinidad con esa proteína para atrapar otras proteínas que se unan a ella. Esta tecnología para determinar un perfil es eminentemente adecuada para el análisis de tales complejos de proteínas capturados. Se prevén kits que incluyan columnas de afinidad con anticuerpos para analizar la transducción de señales o la localización en membranas mediante la captura de proteínas con las modificaciones post-traduccionales apropiadas, ya sea como una etapa de pre-clasificación o como una etapa de captura después del corte de una población de proteínas con un agente de corte específico de una secuencia.

Técnicas cromatográficas

Habiendo generado marcas peptídicas a partir de una población de proteínas, es deseable analizar posteriormente las marcas resultantes. La cromatografía es una etapa adicional en el análisis de una población de firmas peptídicas antes de la espectrometría de masas, pero puede ser bastante deseable dependiendo de la configuración del espectrómetro de masas utilizado.

En un método para definir el perfil proteico se requieren dos características importantes para cualquier etapa de cromatografía, alta resolución y una mínima pérdida de muestra. La resolución genera información y reduce también la complejidad de la población de marcas peptídicas que entra en el espectrómetro de masas. La segunda característica es que exista una pérdida mínima de muestra en la separación cromatográfica, que reduciría la sensibilidad de la técnica para detectar péptidos presentes con baja frecuencia en la población bajo análisis.

Derivatización de proteínas

Ciertas técnicas cromatográficas son "pegajosas" cuando se utilizan para la separación de péptidos, es decir, una proporción de la muestra es retenida en la matriz de separación. Es posible reducir la pérdida de muestra de este tipo mediante la derivatización de los grupos que están implicados en la adhesión a la matriz de separación. Es decir, si se está utilizando una separación por cromatografía de intercambio iónico pueden derivatizarse las cadenas laterales iónicas y polares con reactivos que incrementen su hidrofobicidad, reduciendo así la afinidad por la matriz. Sin embargo, esta característica necesita ser sopesada frente a la necesidad de resolución.

La utilización de agentes de secuenciación C-terminal para derivatizar los grupos carboxilo libres reducirá la adhesión entre tales péptidos y una resina de intercambio catiónico. Esto puede significar que la cromatografía de intercambio catiónico puede ser ventajosa como etapa de separación cromatográfica.

Pueden derivatizarse bastante fácilmente residuos amina acetilados con el fin de conseguir efectos similares para cromatografía de intercambio aniónico.

Análisis de péptidos por espectrometría de masas Técnicas de ionización

En general, las mezclas de péptidos son inyectadas en el espectrómetro de masas mediante electropulverización o MALDI TOF, que deja las mismas en la fase de vapor.

Ionización por electropulverización

La ionización por electropulverización requiere que la solución diluida de la biomolécula sea "atomizada" en el espectrómetro a partir de una sonda de inserción, esto es en un aerosol fino. La solución es pulverizada, por ejemplo, desde la punta de una aguja en un gradiente de campo electrostático. El mecanismo de ionización no se conoce totalmente, pero se cree que funciona en términos generales según sigue. El campo electrostático carga las gotitas formadas en el extremo de la sonda estimulando la atomización. En la corriente de nitrógeno se evapora el solvente. Con una pequeña gotita, esto tiene como resultado la concentración de la biomolécula. Dado que la mayoría de las biomoléculas tienen una carga neta, esto incrementa la repulsión electrostática de la proteína disuelta. A medida que continúa la evaporación esta repulsión resulta finalmente mayor que la tensión superficial de la gotita y la gotita "explota" produciendo gotitas más pequeñas. El campo electrostático ayuda a vencer posteriormente la tensión superficial de las gotitas cargadas. La evaporación continúa a partir de las gotitas más pequeñas, las cuales, a su vez, explotan repetitivamente hasta que las biomoléculas están esencialmente en la fase de vapor, igual que lo está todo el solvente.

Ionización química a presión atmosférica

Una técnica de ionización apropiada para ser utilizada con LCMS para el análisis de péptidos es la Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI). Ésta es una técnica basada en electropulverización en la que la cámara de ionización ha sido modificada para que incluya un electrodo de descarga que puede ser utilizado para ionizar el gas del baño, que a su vez colisionará con las moléculas de la muestra vaporizada incrementando la ionización de la muestra.

Bombardeo con átomos rápidos

Ésta es una técnica de ionización que es bastante similar a la APCI y que es altamente compatible con muestras en solución. Típicamente, puede bombearse un flujo continuo de líquido procedente de una columna de electroforesis capilar o de una columna de HPLC a través de una sonda de inserción hacia un hueco o un vidrio poroso en su extremo en el que la solución es bombardeada con átomos o iones acelerados, normalmente de xenón o cesio. La colisión con la muestra disuelta tiene como resultado la transferencia de energía cinética a, y la ionización de, la muestra.

Ionización por desorción láser asistida por la matriz (MALDI)

La MALDI requiere que la solución de biomoléculas esté incluida en un exceso molar grande de una "matriz" fotoexcitable. La aplicación de una luz láser de la frecuencia apropiada (haz de 266 nm para el ácido nicotínico) tiene como resultado la excitación de la matriz, lo cual a su vez conduce a la excitación y a la ionización de la biomolécula incluida. Esta técnica proporciona una cantidad significativa de energía de traslación a los iones, pero a pesar de esto no tiende a inducir una fragmentación excesiva. Pueden utilizarse de nuevo con esta técnica, sin embargo, voltajes de aceleración para controlar la fragmentación.

Las técnicas de MALDI pueden ser desempeñadas de dos formas. Pueden incluirse proteínas en una matriz de MALDI, en las que las propias proteínas no son excitables específicamente por láser, o bien se pueden construir marcas peptídicas que contengan los grupos necesarios para permitir la energización por láser. Este último abordaje significa que las marcas no necesitan ser incluidas en una matriz antes de la realización de la espectrometría de masas. Tales grupos incluyen restos de ácido nicotínico, sinapínico o cinámico. El corte de marcas basado en MALDI sería probablemente más eficaz con un adaptador susceptible de ser fotocortado, ya que esto evitaría una etapa de corte antes de la realización de la espectrometría de masas con MALDI. Los diferentes agentes de ionización excitables tienen frecuencias de excitación diferentes, de manera que puede elegirse para desencadenar la ionización una frecuencia diferente de la utilizada para cortar el adaptador fotolisable. Estos restos excitables son fácilmente derivatizados utilizando técnicas sintéticas estándar de química orgánica, de manera que pueden construirse marcas con múltiples masas de manera combinatoria.

Todas las técnicas anteriores son utilizadas de manera rutinaria con péptidos y proteínas y son los métodos de ionización preferidos para esta invención.

Sensibilidad de la espectrometría de masas y cuantificación de marcas peptídicas

El resultado final es por tanto el que una población de proteínas puede ser clasificada arbitrariamente en poblaciones de péptidos del tamaño conveniente para ser añadidos a un espectrómetro de masas para su análisis. La terminación de tal análisis para todas las proteínas de una célula proporcionaría un perfil de qué proteínas están presentes y en qué cantidades relativas. Podría realizarse una cuantificación absoluta "añadiendo" a una población de proteínas cantidades conocidas de proteínas particulares que se sabe que están ausentes, por ejemplo proteínas vegetales en muestras animales o viceversa, frente a las cuales se calibran los resultados. Pueden determinarse cantidades internas midiendo las cantidades relativas de ciertas proteínas presentes a concentraciones relativamente fijas en la mayoría de las células, tales como las histonas. Diferentes técnicas acopladas a ciertas geometrías de los espectrómetros de masas permiten una buena cuantificación con un espectrómetro de masas. Estas cuestiones son tratadas en profundidad en GB 9719284.3.

Geometrías de los analizadores de masas

La espectrometría de masas es una disciplina muy diversa y existen numerosas configuraciones de analizadores de masas que pueden ser combinadas a menudo en una variedad de geometrías que permiten el análisis de moléculas orgánicas complejas tales como las marcas peptídicas generadas con esta invención.

Medida exacta de masas

Los espectrómetros de masas de doble enfoque son capaces de medir masas moleculares con una precisión muy elevada, esto es, de fracciones de dalton. Esto permite distinguir con facilidad moléculas con una masa total idéntica pero con diferentes composiciones atómicas, ya que las ínfimas diferencias en la masa de los diferentes isótopos atómicos permiten tales distinciones. Esta técnica puede ser muy eficaz para determinar las masas moleculares de una población de marcas peptídicas, ya que permitiría la identificación de una proporción significativa de péptidos sin requerir ninguna secuenciación, aunque algunos tuvieran la misma masa íntegra. Los pocos péptidos ambiguos restantes podrían ser analizados mediante espectrometría de masas en tándem según se discute a continuación.

Secuenciación de marcas peptídicas mediante espectrometría de masas en tándem

Pueden secuenciarse fácilmente péptidos mediante espectrometría de masas en tándem. La espectrometría de masas en tándem describe varias técnicas en las cuales los iones de una muestra son seleccionados por un primer analizador de masas sobre la base de su relación masa/carga para un análisis posterior por la fragmentación inducida de esos iones seleccionados. Los productos de la fragmentación son analizados por un segundo analizador de masas. El primer analizador de masas de un instrumento en tándem actúa como un filtro que selecciona los iones para entrar en el segundo analizador de masas sobre la base de su relación masa/carga, de tal manera que una especie de solamente una única relación masa/carga, normalmente sólo un único ión peptídico, entra cada vez en el segundo analizador de masas. Al abandonar el primer analizador de masas, el péptido seleccionado pasa a través de una cámara de colisión, lo cual tiene como resultado la fragmentación del péptido. Como la fragmentación tiene lugar principalmente en el enlace peptídico, el patrón de fragmentos corresponde a una serie de subespecies de péptidos y aminoácidos que componen el péptido original. El patrón de masas distinto de los aminoácidos individuales, de los 2-meros, 3-meros, etc., generado en la fragmentación de un péptido es suficiente para identificar su secuencia.

FUENTE DE IONES\rightarrowMS1\rightarrowCÉLULA DE COLISIÓN\rightarrowMS2\rightarrowDETECTOR DE IONES

Son posibles varias geometrías en tándem. Pueden utilizarse instrumentos "sectoriales" convencionales en los que el sector eléctrico proporciona la primera fase de analizador de masas, el sector magnético proporciona el segundo analizador de masas, estando colocada una célula de colisión entre los dos sectores. Esta geometría no es ideal para la secuenciación de péptidos. Para secuenciar péptidos podrían utilizarse dos analizadores de masas sectoriales completos separados por una célula de colisión. Una geometría más típica utilizada es un cuadrupolo triple en el que el primer cuadrupolo filtra los iones para la colisión. El segundo cuadrupolo de un cuadrupolo triple actúa como cámara de colisión, mientras que el último cuadrupolo analiza los productos de fragmentación. Esta geometría es bastante favorable. Otra geometría más favorable es un instrumento en tándem Cuadrupolo/Tiempo de Vuelo Ortogonal, en el que la alta velocidad de barrido de un cuadrupolo está acoplada a la mayor sensibilidad de un analizador de masas TOF para identificar los productos de fragmentación.

Secuenciación con trampas de iones

Los espectrómetros de masas de Trampa de Iones son parientes del espectrómetro de cuadrupolo. La trampa de iones tiene generalmente una construcción de 3 electrodos - un electrodo cilíndrico con electrodos "casquete" en cada extremo formando una cavidad. Se aplica un potencial de radiofrecuencia sinusoidal al electrodo cilíndrico, mientras que los electrodos casquete son sometidos a polarización con potenciales DC o CA. Los iones inyectados en la cavidad son forzados a una trayectoria circular estable por el campo eléctrico oscilante del electrodo cilíndrico. Sin embargo, para una amplitud dada del potencial oscilante, ciertos iones tendrán una trayectoria inestable y serán expulsados de la trampa. Una muestra de iones inyectada en la trampa puede ser expulsada secuencialmente de la trampa de acuerdo con su relación masa/carga alterando el potencial de radiofrecuencia oscilante. Los iones expulsados pueden ser detectados posteriormente, permitiendo la producción de un espectro de masas.

Las trampas de iones son operadas generalmente con una pequeña cantidad de un "gas de baño", tal como helio, presente en la cavidad de la trampa de iones. Éste incrementa la resolución y la sensibilidad del dispositivo por la colisión con los iones atrapados. Las colisiones incrementan la ionización cuando una muestra es introducida en la trampa y amortiguan la amplitud y la velocidad de las trayectorias de los iones, manteniéndolas más próximas al centro de la trampa. Esto significa que cuando cambia el potencial oscilante, los iones cuyas trayectorias se vuelven inestables ganan energía más rápidamente, con relación a los iones circulantes amortiguados, y salen de la trampa en un grupo más compacto, dando picos más grandes y más estrechos.

Las trampas de iones pueden remedar las geometrías de los espectrómetros de masas en tándem, de hecho pueden remedar múltiples geometrías de los espectrómetros de masas, permitiendo análisis complejos de los iones atrapados. Una única especie de masa de una muestra puede ser retenida en una trampa, esto es, todas las demás especies pueden ser expulsadas y posteriormente la especie retenida puede ser excitada cuidadosamente sobreponiendo una segunda frecuencia oscilante sobre la primera. Los iones excitados colisionarán luego con el gas del baño y se fragmentarán si están suficientemente excitados. Los fragmentos pueden entonces ser analizados posteriormente. Puede retenerse un fragmento iónico para un análisis posterior expulsando otros iones y excitando luego el fragmento iónico para que se fragmente. Este proceso puede ser repetido siempre que exista muestra suficiente para permitir un análisis posterior. Debe señalarse que estos instrumentos retienen generalmente una elevada proporción de fragmentos iónicos después de la fragmentación inducida. Estos instrumentos y los espectrómetros de masas FTICR (discutidos más adelante) representan una forma de espectrometría de masas en tándem resuelta temporalmente en lugar de la espectrometría de masas en tándem resuelta espacialmente que se encuentra en los espectrómetros de masas lineales.

Para determinar el perfil proteico de una población peptídica, una trampa de iones es un instrumento bastante bueno. Una muestra de marcas peptídicas puede ser inyectada en el espectrómetro. Las marcas peptídicas que se espera que aparezcan en un perfil, tales como las proteínas constitutivas o los péptidos de histonas de muestras de células eucariotas, pueden ser expulsadas específicamente y cuantificadas rápidamente. Los péptidos restantes pueden ser sometidos a un barrido. Los péptidos totalmente nuevos pueden ser luego retenidos selectivamente de las muestras posteriores de la población peptídica y puede inducirse su fragmentación, permitiendo la adquisición de datos sobre la secuencia de ese péptido. Alternativamente, una Trampa Iónica puede constituir la primera fase de un instrumento de geometría en tándem.

Espectrometría de masas de resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier (FTICR MS)

La espectrometría de masas FTICR tiene características similares a las de las trampas de iones en cuanto a que una muestra de iones es retenida en una cavidad, pero en la FTICR MS los iones son atrapados en una cámara de alto vacío por campos eléctricos y magnéticos cruzados. El campo eléctrico es generado por un par de electrodos de placa que forman dos lados de una caja. La caja está contenida en el campo de un imán superconductor que junto con las dos placas, las placas de captura, fuerzan a los iones inyectados a una trayectoria circular entre las placas de captura, perpendicular al campo magnético aplicado. Los iones son excitados a órbitas más grandes mediante la aplicación de un pulso de radiofrecuencia a dos "placas transmisoras" que forman los dos lados opuestos adicionales de la caja. El movimiento cicloideo de los iones genera los campos eléctricos correspondientes en los dos lados opuestos restantes de la caja que contienen las "placas receptoras". Los pulsos de excitación excitan los iones hacia órbitas más grandes que decaen a medida que el movimiento coherente de los iones se pierde a través de las colisiones. Las señales correspondientes detectadas por las placas receptoras son convertidas en un espectro de masas mediante el análisis de la transformada de Fourier.

Para los experimentos de fragmentación inducida, estos instrumentos pueden funcionar de una manera similar a una trampa iónica - todos los iones excepto una única especie de interés pueden ser expulsados de la trampa. Puede introducirse en la trampa un gas de colisión y puede inducirse la fragmentación. Los iones fragmentados pueden ser analizados posteriormente. Generalmente los productos de la fragmentación y el gas del baño se combinan para dar una resolución pobre si son analizados por TF de las señales detectadas por las "placas receptoras", sin embargo los iones fragmentados pueden ser expulsados de la cavidad y analizados en una configuración en tándem con un cuadrupolo, por ejemplo.

Para la determinación del perfil de proteínas podría utilizarse FTICR MS y puede ser ventajoso, ya que estos instrumentos tienen una resolución de masas muy elevada, permitiendo una medida exacta de las masas de tal manera que pueden resolverse péptidos con la misma masa íntegra pero con diferentes composiciones atómicas. Además, las marcas peptídicas no identificadas pueden ser analizadas posteriormente por fragmentación.

Inmovilización de proteínas

Se ha acumulado una gran cantidad de conocimiento sobre la química específica de proteínas, particularmente en el área de la síntesis orgánica de péptidos.

\bullet R.B. Merrifield, Science 232: 341-347, 1986.

\bullet S.B.H. Kent, "Chemical Synthesis of Peptides and Proteins", Annu. Rev. Biochem. 1988. 57: 957-989.

Adaptadores

Una característica importante de esta invención son los adaptadores susceptibles de ser cortados para sus biomoléculas relevantes. Los adaptadores fotocortables son particularmente deseables ya que permiten un corte rápido, sin reactivos. Para referencias, ver:

\bullet Theodora W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 1981, Wiley-Interscience.

Sobre grupos fotoextraíbles:

\bullet Patchornik, J. Am. Chem. Soc. 92: 6333-, 1970.

\bullet Amit y col., J. Org. Chem. 39: 192-, 1974.

Cromatografía Líquida:

\bullet R. Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", Springer-Verlag, 1982.

\bullet M. Deutscher, "Guide to Protein Purification", Academic Press, 1990.

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas con electropulverización es la técnica preferida para secuenciar péptidos ya que es una técnica muy suave y puede ser acoplada directamente a la biología molecular en fase líquida utilizada en esta invención. Para una discusión completa de las técnicas de espectrometría de masas ver:

\bullet K. Biemann, "Mass Spectrometry of Peptides and Proteins", Annu. Rev. Biochem. 1992, 61: 977-1010.

\bullet R.A.W. Johnstone and M.E. Rose, "Mass Spectrometry for chemists and biochemists" 2ª edición, Cambridge University Press, 1996.

Experimento Esquema de la realización de la determinación del perfil de proteínas

Éste comprende un sistema en el que

(i) una proteína tiene sus grupos carboxilo protegidos, el último aminoácido eliminado dejando solamente un grupo carboxilo libre en el extremo cortado.

(ii) Éste se hará reaccionar con un agente de biotinilación, de tal manera que el extremo carboxi sea marcado con biotina.

(iii) La proteína es fragmentada con una proteasa para dejar fragmentos peptídicos, estando biotinilado solamente el carboxilo uno.

La biotina es utilizada para unir el fragmento C-terminal a estreptavidina inmovilizada, o preferiblemente a avidina monomérica, de la que puede ser liberado con un ácido suave y hacerse disponible para MS-MS.

Todos los reactivos están disponibles y la química es generalmente bien conocida según sigue:

(i) La técnica de secuenciación carboxi-terminal de proteínas está establecida. Señalamos que el método de Boyd y col. (Boyd, V.L., Bozzini, M., Guga, P.J., DeFranco, R.J., Yuan, P.-M., Loudon, G.M. y Nguyen, D.; J. Org. Chem., 60, 2581 (1995)) bloquea los carboxilos de la cadena lateral de los residuos de aspartato y glutamato por amidación durante la eliminación del aminoácido terminal.

(ii) La biotinilación del grupo carboxilo libre en el extremo carboxi puede ser realizada utilizando 5-(biotinamido) pentilamina/1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida clorhidrato, que está comercializado por Pierce y Warriner (Lee, K.Y., Birckbichler, P.J. y Patterson, M.K., Clin. Chem., 34, 906 (1988)) para tal fin.

(iii) La fragmentación de proteínas sobre una membrana con proteasas es una técnica establecida (Sutton, C.W., Pemberton, K.S., Cottrell, J.S., Corbett, J.M., Wheeler, C.H., Dunn, M.J. y Pappin, D.J, Electrophoresis, 16, 308 (1995)) y Millipore Corporation produce Immobilon®-CD y otras membranas de PVDF para ese fin. La avidina monomérica es producida por Pierce y Warriner y permite la liberación de moléculas biotiniladas utilizando biotina 2 mM en solución salina tamponada con fosfato.

La etapa restante del método es la utilización de membranas de PVDF (como las utilizadas para tripsinización) en lugar de membranas Zitex® para la reacción de secuenciación (I).

Metodología Unión de lisozima a una membrana de PVDF

Fragmentos cuadrados de 0,5 mm de PVDF (Millipore) fueron humedecidos con isopropanol e incubados en lisozima (Pharmacia) 20 mg/ml en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las membranas fueron luego secadas al aire y almacenadas a 4ºC hasta su utilización.

Modificación (protección de los grupos carboxilo) de la lisozima unida a PVDF

La solución de modificación fue preparada mezclando 62 mg de 2-etil-5-fenilisoxazolio-3' sulfonato (Aldrich) con 50 \mul de diisopropiletilamina (Aldrich) en 2 ml de CH_{3}CN. Se añadieron a cada membrana 100 \mul de solución de modificación y se incubaron a temperatura ambiente durante 4 horas.

Después de la incubación se añadieron 900 \mul de agua y cada membrana fue agitada suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Cada membrana fue luego transferida a 50 \mul de CH_{3}CN, se añadieron 450 \mul de agua y las membranas fueron agitadas suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Cada membrana fue transferida posteriormente a 500 \mul de ácido trifluoroacético al 2% e incubada a temperatura ambiente durante una noche.

Digestión con tripsina

Cada membrana fue transferida a 250 \mul de una solución de bicarbonato de amonio 25 mM pH 7,6 y agitada suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Cada proteína/membrana que contenía proteínas fue añadida/transferida a 200 \mul de la solución de bicarbonato de amonio pH 7,6 que contenía 5 \mug de tripsina e incubada a 37ºC durante una noche.

Elución de la proteína/fragmentos peptídicos de la membrana

Cada membrana fue transferida a 100 \mul de una solución de ácido fórmico 50%/etanol 50% e incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos para extraer la proteína/péptidos. Las membranas fueron retiradas posteriormente y se añadieron 300 \mul de agua a la solución de ácido fórmico 50%/etanol 50% que contenía la proteína/péptidos.

Análisis

Los compuestos siguientes fueron analizados mediante HPLC de fase reversa:

40 \mug de tripsina en PBS; 40 \mug de lisozima en PBS; 40 \mug de lisozima digerida con tripsina; 40 \mug de tripsina digerida con tripsina; lisozima modificada unida a la membrana digerida con tripsina; membrana sometida al protocolo de modificación sin lisozima y digerida con tripsina; lisozima unida a la membrana sin modificar y digerida con tripsina; lisozima unida a la membrana modificada sin digestión con tripsina.

Resultados

Hemos realizado ahora la operación utilizando membranas de PVDF en lugar de membranas Zitex® para la reacción de secuenciación (I). Hemos encontrado que el cromatograma de HPLC de fase reversa para determinar lisozima (utilizada como una proteína típica) obtenido después del tratamiento con las reacciones de secuenciación sobre una membrana de PVDF y tripsinización, del cual se ha sustraído el cromatograma para el mismo proceso en ausencia de lisozima, es similar al obtenido para lisozima tripsinizada directamente. Por tanto, las tecnologías son compatibles y pueden ser utilizadas para generar péptidos "firma" para la identificación por MS-MS (datos no mostrados).

Clave de las figuras

Figura 1

Etapa 1: Extraer las proteínas con solventes fuertes y capturar las proteínas extraídas sobre una membrana de PVDF

Etapa 2: Las proteínas inmovilizadas lábilmente pueden ser lavadas para eliminar los solventes fuertes

Etapa 3: Tratar las proteínas con un agente de acoplamiento C-terminal

Etapa 4: Tratar las proteínas derivatizadas con un agente de ciclación y cortar luego el aminoácido terminal de la proteína derivatizada

Etapa 5: Biotinilar el grupo carboxilo del penúltimo aminoácido recién expuesto

Etapa 6: Lavar las proteínas unidas a la membrana para eliminar los agentes químicos y cortar las proteínas con tripsina en un tampón fisiológico

Etapa 7: Capturar los fragmentos terminales sobre esferas con avidina

Etapa 8: Eliminar mediante lavado los péptidos libres y liberar posteriormente las "marcas" peptídicas capturadas para su análisis

Etapa 9: Analizar mediante MS o LC/MS/MS o MS/MS

Figura 2

Etapa 1: Extraer las proteínas con solventes fuertes y capturar las proteínas extraídas sobre una membrana de PVDF

Etapa 2: Las proteínas inmovilizadas lábilmente pueden ser lavadas para eliminar los solventes fuertes

Etapa 3: Tratar las proteínas con un agente de acoplamiento C-terminal

Etapa 4: Lavar las proteínas unidas a la membrana para eliminar los agentes químicos y cortar las proteínas con tripsina o con otro agente de corte específico de una secuencia en un tampón fisiológico

Etapa 5: Biotinilar los extremos carboxilo recién expuestos

Etapa 6: Capturar los fragmentos terminales sobre esferas con avidina, por ejemplo en una columna de afinidad

Etapa 7: Analizar el C-terminal eluido por MS o LC/MS/MS o MS/MS

Figura 3

Etapa 1: Extraer las proteínas con solventes fuertes y capturar las proteínas extraídas sobre una membrana de PVDF

Etapa 2: Las proteínas inmovilizadas lábilmente pueden ser lavadas para eliminar los solventes fuertes

Etapa 3: Tratar las proteínas con un agente de acoplamiento C-terminal que lleve un determinante de inmovilización

Etapa 4: Lavar las proteínas unidas a la membrana para eliminar los agentes químicos y cortar las proteínas con tripsina en un tampón fisiológico

Etapa 5: Capturar los fragmentos terminales sobre esferas con avidina

Etapa 6: Eliminar mediante lavado los péptidos libres y liberar posteriormente las "marcas" peptídicas capturadas para su análisis

Etapa 7: Analizar mediante MS o LC/MS/MS o MS/MS

Figura 4

Etapa 1: Extraer las proteínas con solventes fuertes y capturar las proteínas extraídas sobre una membrana de PVDF

Etapa 2: Las proteínas inmovilizadas lábilmente pueden ser lavadas para eliminar los solventes fuertes

Etapa 3: Tratar las proteínas con un agente de acoplamiento C-terminal

Etapa 4: Tratar las proteínas acopladas con un reactivo de derivatización para asegurar que se forme un casquete sobre todos los carboxilos expuestos

Etapa 5: Tratar las proteínas derivatizadas con un agente de ciclación y cortar luego el aminoácido terminal de la proteína derivatizada

Etapa 6: Biotinilar el grupo carboxilo del penúltimo aminoácido recién expuesto

Etapa 7: Lavar las proteínas unidas a la membrana para eliminar los agentes químicos y cortar las proteínas con tripsina en un tampón fisiológico

Etapa 8: Capturar los fragmentos terminales sobre esferas con avidina

Etapa 9: Eliminar mediante lavado los péptidos libres y liberar posteriormente las "marcas" peptídicas capturadas para su análisis

Etapa 10: Analizar mediante MS o LC/MS/MS o MS/MS

Claims (16)

1. Un método para caracterizar polipéptidos que comprende:

(a) el tratamiento de una muestra que contenga una población de una pluralidad de polipéptidos con un agente de corte que se sabe que reconoce en las cadenas polipeptídicas un residuo de aminoácido específico o una secuencia de aminoácidos específica y que corta en un sitio de corte, mediante lo cual la población es cortada para generar fragmentos peptídicos;

(b) el aislamiento de una primera población de fragmentos peptídicos que contiene solamente fragmentos peptídicos terminales que llevan como extremo de referencia el extremo N o el extremo C del polipéptido del que fueron fragmentados, de una segunda población de fragmentos peptídicos que no contienen el extremo de referencia, llevando cada fragmento peptídico de la primera población en el otro extremo el sitio de corte proximal al extremo de referencia, comprendiendo dicha etapa de aislamiento la inmovilización de la primera población de fragmentos peptídicos o la inmovilización de la segunda población de fragmentos peptídicos sobre un soporte sólido y

(c) la determinación por espectrometría de masas de una secuencia "firma" de al menos alguno de los fragmentos aislados, secuencia "firma" que es la secuencia de un número predeterminado de residuos de aminoácidos que se extiende desde el sitio de corte;

en el que una secuencia "firma" caracteriza a cada polipéptido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el extremo de referencia es unido a un soporte de fase sólida para inmovilizar la población de polipéptidos o de fragmentos peptídicos de los mismos.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la población de polipéptidos es inmovilizada antes del tratamiento con el agente de corte.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o con la reivindicación 3, en el que el extremo de referencia es unido al soporte de fase sólida mediante:

(i) el tratamiento de los polipéptidos con un agente bloqueante para bloquear todos los grupos de referencia expuestos, que comprenden grupos carboxilo o grupos de aminas primarias;

(ii) el corte de los aminoácidos terminales de referencia para exponer los extremos de referencia no bloqueados y

(iii) el tratamiento de los extremos de referencia no bloqueados con un agente de inmovilización capaz de acoplarse al soporte de fase sólida;

en el que la etapa (b) comprende la unión de los extremos de referencia tratados al soporte de fase sólida y la eliminación de los fragmentos peptídicos no unidos.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

(i) la preparación de la muestra de la etapa (a) mediante pretratamiento de los polipéptidos con un agente bloqueante para bloquear todos los grupos de referencia expuestos, que comprenden grupos carboxilo o grupos de aminas primarias, de tal manera que el tratamiento posterior de la muestra con el agente de corte genera fragmentos peptídicos que llevan extremos de referencia no bloqueados;

(ii) el tratamiento de los extremos de referencia no bloqueados con un agente de inmovilización capaz de acoplarse a un soporte de fase sólida y

(iii) la unión de los fragmentos peptídicos que contienen los extremos de referencia no bloqueados al soporte de fase sólida;

en el que la etapa (b) comprende la elución del mismo de los fragmentos peptídicos no unidos.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 o con la reivindicación 5, en el que el agente de inmovilización comprende un agente de biotinilación.

7. un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el grupo de referencia es carboxilo.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente de corte comprende una peptidasa.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra de la etapa (a) comprende una fracción subcelular.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la preparación de la muestra de la etapa (a) por cromatografía líquida.

11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la espectrometría de masas está precedida por una etapa de cromatografía líquida de alta presión para resolver los fragmentos peptídicos.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los fragmentos peptídicos son sometidos a cromatografía de intercambio iónico antes de la etapa (c).

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el número predeterminado de residuos de aminoácidos es de 3 a 30.

14. Un método para identificar polipéptidos en una muestra de ensayo, que comprende la caracterización de los polipéptidos según un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la comparación de las secuencias "firma" y de las posiciones relativas del sitio de corte obtenidas de este modo con las secuencias "firma" y las posiciones relativas del sitio de corte de polipéptidos de referencia con el fin de identificar el o cada polipéptido de la muestra de ensayo.

15. Un método para analizar uno o más polipéptidos específicos de una muestra de ensayo, que comprende la realización de un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el agente de corte y la posición relativa del sitio de corte están predeterminados y la secuencia "firma" es determinada en la etapa (c) mediante el análisis para determinar una secuencia predeterminada de residuos de aminoácidos que se extiende desde el sitio de corte.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de corte y la secuencia "firma" son predeterminados seleccionando las secuencias correspondientes de uno o más polipéptidos diana conocidos.