ES2207232T3 - Una antraquinona y sus derivados. - Google Patents

Abstract

Un compuesto aislado de la siguiente fórmula: en la que cada uno de X1 y X2 son independientemente NH-A- NR1R2, y donde A es un grupo alquileno C2-8 y R1 y R2 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1- 4, hidroxialquilo C2-4 y aminoalquilo C2-4, o R1 y R2 juntos forman un grupo alquileno C2-6 que con el átomo de nitrógeno al que R1 y R2 están unidos forma un anillo heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico.

Description

Una antraquinona y sus derivados.

Esta invención se refiere a una antraquinona y sus derivados, incluyendo en particular, aunque no exclusivamente, sus aplicaciones en tecnologías de detección en un intervalo de fluorescencia.

Hay una serie de fluorocromos disponibles que se unen al DNA que cubren la región UV y visible del espectro. Recientemente, están disponibles comercialmente fluorocromos muy brillantes de cianina que se intercalan con el DNA, basados en dímeros modificados de naranja de tiazol. Estos colorantes de cianina no comparten las propiedades de penetración celular de otros fluorocromos activados por UV específicos del DNA. Además, los fluorocromos interactivos con el DNA usados comúnmente tienen marcas fluorescentes que solapan las de otros fluorocromos, activados en el intervalo espectral de la luz visible, que se usan como marcas moleculares para explorar aspectos de la biología celular o de estructuras biológicas. Ejemplos de colorantes de cianina actualmente conocidos se describen en los documentos US 5410030 y US 5436134.

La presente invención intenta desarrollar agentes interactivos con el DNA que penetran en las células, los cuales pueden proporcionar una señal de fluorescencia que se extiende hasta la región infrarroja del espectro. Un agente tal, podría, por ejemplo, ser excitado de manera óptima por los rayos láser que emiten en la línea roja en aplicaciones multi-láser/multi-fluorocromo tanto para las muestras fijadas como para las células viables.

Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):

1

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico.

El término "alquileno" se usa aquí para indicar una cadena alquílica.

En una realización preferida, cuando R^{1} y R^{2} forman un anillo heterocíclico, el anillo tiene de 3 a 7 átomos en el mismo. Preferiblemente, tanto X_{1} como X_{2} son ambos NH(CH_{2})_{2}NR^{1}R^{2}. En particular, se prefiere que R^{1} y R^{2} sean ambos grupos alquilo C_{1-4}, preferiblemente grupos metilo.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (II):

2

En una realización, el compuesto (II) puede estar en la forma de su derivado N-óxido.

El compuesto de la fórmula general (I) y sus derivados N-óxidos, y en particular el compuesto específico (II) se puede usar, por ejemplo, como un colorante de DNA y puede ser un compuesto sintético puro que es soluble en disolventes biológicamente compatibles incluyendo el agua. El compuesto (II) tiene una alta afinidad por el DNA (la constante de unión al DNA es aproximadamente 10^{7}M^{-1}) y tiene la capacidad de penetrar rápidamente en las células vivas.

El espectro de absorbancia del compuesto (II) presenta una Ex_{max} próxima a 647 nm y produce un espectro de fluorescencia que se extiende en las longitudes de onda desde 665 nm hasta más allá de 780 nm (la Ex_{max} está aproximadamente en 677,5 nm).

\newpage

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar un compuesto de la siguiente fórmula (I):

3

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico,

comprendiendo el método la etapa de hacer reaccionar un compuesto de la siguiente fórmula (III):

4

con NH_{2}-A-NR^{1}R^{2}, donde A, R^{1} y R^{2} son como se han definido antes.

El método comprende preferiblemente también la etapa de tratar el compuesto resultante con un ácido, preferiblemente ácido sulfúrico concentrado. Adicionalmente, en una realización preferida, el método puede comprender además el tratamiento subsiguiente con clorato de sodio y/o hidrógenosulfito de sodio.

La modelación ha demostrado que los compuestos de la presente invención pueden formar complejos estables intercalados con DNA. Por tanto, según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un complejo fluorescente que comprende un ácido nucleico y un compuesto de la siguiente fórmula (I):

5

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo heterocíclico,

o uno de sus derivados N-óxidos,

y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico.

El ácido nucleico es preferiblemente DNA. Se ha encontrado que el DNA puede estar presente en una célula viva. Los compuestos de la presente invención pueden teñir cromosomas humanos fijados. Cuando aumenta la relación molar DNA:compuesto, hay un desplazamiento batocrómico en el espectro de la solución del compuesto más DNA. A las altas relaciones DNA:compuesto, que se obtienen dentro de las células vivas, el desplazamiento espectral contribuye a una previa separación significativa del espectro de emisión del compuesto-DNA de la de un ejemplo de un compuesto Cy 5 con fluorescencia roja.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para analizar una célula o material biológico que contiene uno o más ácidos nucleicos, que comprende las etapas de:

a) preparar una solución biológicamente compatible que contiene un compuesto de la fórmula (I):

6

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo heterocíclico,

o uno de sus derivados N-óxidos, y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico;

b) tratar la célula o material biológico con la solución biológicamente compatible;

c) excitar el compuesto (I) en la célula o material biológico tratados con una fuente de luz; y

d) detectar la señal de fluorescencia emitida.

El compuesto de la fórmula (I) puede estar presente en su estado libre o formar complejos con otra u otras moléculas, por ejemplo por unión covalente o no covalente.

La fuente de luz proporciona preferiblemente longitudes de onda en la región espectral de las longitudes de onda de máxima absorción del compuesto (I).

Se ha encontrado que la señal de fluorescencia de los compuestos de la presente invención se extiende hasta la región del infrarrojo del espectro. El compuesto de la presente invención puede estar presente en la célula o material biológico en combinación con uno o más de otros fluorocromos o compuestos que emiten luz. Los otros fluorocromos pueden emitir en la región UV o visible del espectro. Por tanto, los compuestos de la presente invención se prestan por sí mismos al análisis multiparamétrico con otros fluorocromos con espectros que se solapan con los de las sondas de DNA de la región visible usadas comúnmente.

Se pueden usar uno o más de otros compuestos, por ejemplo, para detectar la anexina V y se usan preferiblemente en combinación con el derivado N-óxido del compuesto (I). Se puede usar el análisis por citometría de flujo, por ejemplo con el instrumento en modo de láser dual. La invención por tanto puede proporcionar un modo de discriminar las células viables intactas de las que están sufriendo las diferentes etapas de la muerte celular.

Por tanto, los compuestos de la presente invención proporcionan colorantes fluorescentes en el rojo lejano/infrarrojo que penetran en el DNA adecuados para el análisis del DNA celular en el que se pueden necesitar células intactas, por ejemplo para la detección de moléculas sobre la superficie celular (por ejemplo una molécula receptora o un marcador para diferenciación) o dentro de las células (por ejemplo, las enzimas citosólicas) por métodos que requieren el mantenimiento de la integridad de la membrana para evitar la perturbación o pérdida de tales moléculas.

Como se ha mencionado antes, en este método, los compuestos de la presente invención pueden teñir los ácidos nucleicos en los cromosomas humanos fijados, en las células fijadas y en los materiales biológicos fijados, y en procedimientos que modifican la permeabilidad de las membranas de las células vivas.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso del compuesto (I) en un ensayo biológico. El compuesto (I) puede estar presente o en su estado libre o formando complejos con otras moléculas, ya sea por unión covalente o no covalente, en el ensayo biológico. El compuesto (I) puede estar presente como uno de sus derivados N-óxidos. El ensayo biológico es preferiblemente un procedimiento de manipulación de rápida y/o de gran capacidad. El uso de los compuestos de la presente invención, como se ha indicado para el compuesto (I), como un parámetro de discriminación u orientación para los núcleos celulares, ha sido demostrado tanto por citometria de flujo como por microscopía confocal de barrido con láser.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso del compuesto (I) en citometría. El compuesto (I) está opcionalmente presente como uno de sus derivados N-óxidos. El procedimiento de citometría puede ser por ejemplo, citometría de flujo de simple haz o de haz múltiple.

A modo de ejemplo, la citometría de flujo de simple haz (488 nm) ha sido usada para demostrar la utilidad de la fluorescencia del compuesto (I)-DNA nuclear (preferiblemente la fluorescencia del compuesto (II)-DNA nuclear) como un parámetro discriminatorio para las células de la sangre humana y de los linfomas, en combinación con anticuerpos marcados con fluorocromo para la detección de antígenos de superficie y reconocimiento de las subpoblaciones. Se ha encontrado que la fluorescencia del compuesto (I) refleja un contenido de DNA celular como se evidencia por los perfiles de distribución del DNA en el ciclo celular para la poblaciones de células que proliferan exponencialmente demostrando un estado de equilibrio o una distribución asíncrona de las células con respecto a la edad del ciclo celular, o para las poblaciones de células alteradas en las cuales, por ejemplo, la acción del fármaco ha causado el retraso o parada de las células en un punto dado del ciclo celular. En una realización, la citometría de flujo de haz dual (488 nm/633 nm) muestra la excitación selectiva del compuesto (I), preferiblemente del compuesto (II), y la fluoresceína en células intactas. Además, en una realización, la aplicación del compuesto (I), preferiblemente del compuesto (II), en citometría de flujo de triple haz (multilínea UV/488 nm/633 nm) se ha demostrado en aplicaciones que implican el retraso de la discriminación de la señal en la que la separación del haz permite la discriminación del haz de excitación asociado con una señal de emisión de fluorescencia con respecto al retraso de la llegada de la señal a un detector.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso del compuesto (I) en microscopía. El compuesto (I) puede estar presente como su derivado N-óxido. Preferiblemente la microscopía es microscopía confocal de barrido con láser (CLSM). A modo de ejemplo, la CLSM que emplea una excitación a una longitud de onda o de 647 nm o de 568 nm del compuesto (I) intracelular, preferiblemente del compuesto (II) intracelular, muestra la fluorescencia específicamente localizada en el núcleo revelando la estructura nuclear dentro de las células humanas vivas o fijadas.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso del compuesto (I) como un agente de tinción nuclear. El compuesto (I) puede estar presente como su derivado N-óxido.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso del compuesto (I) como un agente para formación de imágenes. El compuesto (I) puede estar presente como su derivado N-óxido.

En una realización, el compuesto (I) se puede usar como un agente de imagen en la formación de imágenes por excitación de multifotones.

La formación de imágenes con longitud de onda dual, que usa el compuesto (I) para revelar la forma nuclear, se puede utilizar para demostrar la heterogenicidad de la carga de fluoresceína dependiente de la esterasa de las células enteras en la evaluación de la función mitocondrial mediante marcado con rodamina 123. En tales aplicaciones de formación de imágenes, el compuesto (I) no presentó evidencia de fotodecoloración y fue persistente.

Por tanto, los compuestos de la presente invención se pueden considerar como un fluorocromo para su aplicación como un agente en el uso, calibración, estandarización, y configuración de sistemas basados en la fluorescencia. El compuesto preferido de la presente invención es el compuesto (II) con una bisalquilaminoantraquinona con fluorescencia roja intensa (DRAQ5).

Se ha encontrado que la alta penetración de los rayos láser de línea roja en los tejidos y las propiedades de penetración de los compuestos de la presente invención proporcionan una combinación que permite la orientación tridimensional y la localización de los núcleos dentro de los tejidos vivos. Además, la disponibilidad de los láser HeNe u otros dispositivos de emisión de luz roja, de bajo coste, con mayor potencia hace posible que los compuestos de la presente invención encuentren aplicaciones en los sistemas de detección en los que sus marcas de fluorescencia se pueden usar como un parámetro de discriminación.

Aunque la invención ha sido descrita antes, se extiende a cualquier combinación inventiva de las características indicadas antes o en la siguiente descripción.

La invención será descrita ahora, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos y ejemplos que la acompañan, y en los cuales:

las figuras 1a a 1c muestran las características espectrales de DRAQ5;

las figuras 2a a 2f muestran las características espectrales de la fluorescencia de DNA asociado con DRAQ5, detectada por CLSM;

la figura 2g muestra la imagen multifotónica de núcleos celulares teñidos por DRAQ5;

las figuras 2h a 2k muestran una comparación de las células viables teñidas por DRAQ5 o su derivado N-óxido (DRAQ5N);

las figuras 3a a 3d muestran la excitación diferencial de la fluoresceína y la DRAQ5 en células A375 viables analizadas por CLSM;

las figuras 4a a 4c muestran la excitación diferencial de la rodamina 123 y DRAQ5 en células A375 viables analizadas por microscopía confocal de barrido con láser;

la figura 5 muestra los análisis por citometría de flujo de la acumulación de DRAQ5 durante un periodo de exposición de una hora, en células HL60 viables;

las figuras 6a a 6d muestran el análisis por citometría de flujo de haz dual para la detección de la fluorescencia asociada con DRAQ5 en células HL60 viables marcadas con fluoresceína;

las figuras 7a a 7d muestran el análisis por citometría de flujo de simple haz de la fluorescencia de DRAQ5 frente a la fluorescencia de anticuerpos para células humanas cultivadas y derivadas de la sangre;

la figura 8 muestra la cuantificación por citometría de flujo de simple haz de la intensidad de fluorescencia de las células humanas cultivadas y derivadas de la sangre expuestas a DRAQ5;

la figura 9 muestra el análisis por citometría de flujo de haz dual de la expresión de la ciclina B1 específica del ciclo celular;

las figuras 10a a 10f muestran el análisis por citometría de flujo de triple haz de células de linfoma SUD4 asíncronas fijadas y teñidas con DRAQ5 y digeridas con RNasa A;

las figuras 11a a 11c muestran el análisis por citometría de flujo del contenido de DNA celular de las células de linfoma SUD4 intactas usando excitación a 488 nm, 633 nm o multilínea UV;

las figuras 12a a 12d ilustran ejemplos de acumulación celular, usando una línea celular de linfoma humano de células B, usando combinaciones de tratamientos con reactivos; y

las figuras 13a a 13d ilustran ejemplos que muestran la misma combinación de reactivos para los cultivos tratados con VP-16.

Ejemplo 1 Síntesis de DRAQ5

7

Procedimiento

Se disolvió 1,6-dicloroantraquinona (15 g, 54 mmol) en N,N-dimetiletilendiamina (47,6 g, 540 mmol) y se mantuvo a reflujo durante 16 horas. Se hizo seguimiento de la reacción por TLC (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1). Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y se diluyó con agua para precipitar el compuesto del epígrafe. El sólido filtrado se recristalizó en metanol para obtener (A) (15,89, 89%) como un sólido cristalino. Rf (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1): 0,60.

^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 9,8 (t, 2H), 7,6 (m, 4H), 6,9 (m, 2H), 3,4 (q, 4H), 2,7 (t, 4H), 2,4 (s, 12H).

Espectro de masas, m/z 381 (m^{+}+1).

Se disolvió el derivado de antraceno-9,10-diona (A) (6 g, 15,8 mmol) en 65 g de H_{2}SO_{4} concentrado y se enfrió a 10ºC. Se añadió clorato de sodio anhidro (6,5 g, 61,6 mmol) en porciones a lo largo de 1,5 horas y después se agitó la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente. La solución azul se añadió lentamente a una solución fría de hidrógenosulfito de sodio (1%, 1000 ml). Se neutralizó la mezcla a pH 7 con NaOH 5 M. El compuesto del epígrafe (B) se extrajo de la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} y se concentró en vacío. Por cromatografía en columna (SiO_{2}, CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1) se obtuvo (B)(1,2 g, 20%).

Ejemplo 2 Síntesis de DRAQ5N [1,5-bis-((2-dimetilamino-N-óxido)etil)amino)-4, 6-dihidroxiantracen-9,10-diona]

Se preparó el compuesto del epígrafe a partir del ejemplo 1 (DRAQ5) como sigue. Se añadió DRAQ5 (0,1 g, 24 mmol) a ácido meta-cloroperoxibenzoico (80% de pureza, 0,186 g, 0,95 mmol) en diclorometano seco y se dejó a -20ºC durante la noche. Se sometió el producto crudo a cromatografía en columna de sílice usando 9:1:0,1 de diclorometano:metanol:amoniaco (densidad relativa 0,88) como disolvente eluyente. Se aisló el compuesto del epígrafe como un polvo azul. Punto de fusión 221ºC.

^{1}H NMR (CD_{3}OD): \delta (delta) 7,39 (d, 2H), 7,2 (d, 2H), 4,0 (t, 4H), 3,65 (t, 4H), 3,30 (s, 12H). ^{13}H NMR (CD_{3}OD): \delta (delta) 189, 156,5, 147, 130, 122,5, 116, 69,5, 59,5, 38,5.

Espectro de masas, m/z 445 (m^{+}+1).

Ejemplo 3 Análisis espectral de DRAQ5

Los espectros de absorbancia se obtuvieron usando un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16 UV y una solución 10 \muM del agente disuelto en diclorometano y se midieron en una cubeta de cuarzo o sílice de 1 cm de paso óptico. Los espectros de fluorescencia para 0,8 ml de una solución 20 \muM de DRAQ5 en una semi-microcubeta de cuarzo o sílice de 1 cm de paso óptico se determinaron por excitación a una longitud de onda de 647 nm o haciendo seguimiento de la emisión a una longitud de onda de 670 nm. Las medidas de fluorescencia se hicieron en un espectrofotómetro Perkin-Elmer LS50 con el ancho de ranura fijado a 10 nm. El espectrofluorímetro estaba equipado con un tubo fotomultiplicador sensible al rojo (PMT; tipo R928; Hamamatsu Photonics KK, Japan). Se acumularon los datos de cuatro barridos para cada condición y se exportaron a un programa de hoja de cálculo para corregir los valores del tampón control y para determinar los máximos de emisión. La fluorescencia de DNA-DRAQ5 se midió por la adición a la cubeta de volúmenes, en microlitros, de soluciones concentradas de DNA de timo de ternera, con mezclado. Tanto el agente como el DNA se prepararon en tampón de unión al DNA (fosfato de sodio 0,05 M, pH 6,2, NaCl 0,05 M, EDTA 0,001 M; 3). Los espectros obtenidos se corrigieron en cuanto al ruido del tampón y no en cuanto a la sensibilidad espectral del PMT. Los espectros de rodamina 123 se generaron en el tampón de unión al DNA usando o bien una excitación a 488/5 nm o bien haciendo seguimiento de la emisión a 530/5 nm. Los espectros de excitación y emisión previamente publicados se obtuvieron de los archivos de la fuente original y se normalizaron para la intensidad del pico.

Característica espectrales e interacción de DRAQ5 con DNA

Las figuras 1a a 1c muestran las características espectrales de DRAQ5. Fig. 1a: Espectro de absorbancia en el visible para DRAQ5 (10 \muM en diclorometano).

Fig. 1b: Comparación de los espectros de excitación para las longitudes de onda de emisión especificadas para: FITC (\medcirc, emisión a 620 nm), rodamina 123 (\triangledown, 0,5 \mug/ml, emisión a 530 nm), Texas Red (\triangle, emisión a 660 nm), Cy 5,18 (\Box emisión a 715 nm), DRAQ5 (\bullet, emisión a 670 nm).

Fig. 1c: Espectros de emisión comparativos para las longitudes de onda de excitación especificadas para: FITC
(\medcirc, excitación a 425 nm), rodamina 123 (\triangledown, 0,5 \mug/ml, excitación a 488 nm), Texas Red (\triangle, excitación a 500 nm), Cy 5,18 (\Box, excitación a 570 nm), DRAQ5 20 \muM (\bullet, excitación a 647 nm), y DRAQ5 20 \muM más DNA 1280 \muM
(\blacksquare, excitación a 647 nm).

La Fig. 1a muestra el espectro de absorbancia en el visible para DRAQ5 en tampón de fosfato a pH 7,4. El espectro presentó máximos a 622 y 676 nm, en adición a los máximos a 240 y 314 nm (no se muestran datos). El coeficiente de extinción a una longitud de onda de 676 nm fue determinado como 20949 cm^{-1}mol^{-1}. Las características de fluorescencia de DRAQ5 se estudiaron para permitir la interpretación de los datos fluorométricos generados por citometría de flujo y técnicas de imagen confocal. Se generó un espectro de excitación para el intervalo 460-660 nm para emisión a una longitud de onda de 680 nm y se comparó con uno optimizado para la rodamina 123 y los de otros fluorocromos. La Fig. 1b muestra que la excitación de DRAQ5 en la región 630-650 nm es esencialmente similar al espectro de excitación del colorante de cianina Cy 5,18 (Ex_{\lambda max} 649 nm) pero distinta de la de Texas Red (Ex_{\lambda max} 596 nm), rodamina 123 (Ex_{\lambda max} 511 nm) e isotiocianato de fluoresceína (FITC; Ex_{\lambda max} 490 nm). En todos los casos mostrados en la Fig. 1, los espectros han sido normalizados para los valores de intensidad o en Ex_{\lambda max} o en Em_{\lambda max}.

El espectro de emisión de DRAQ5 solo (Fig. 1c) demostró que para la excitación a 647 nm hay una emisión significativa que se extiende en las longitudes de onda desde 665 nm hasta más allá de 780 nm con una Em_{\lambda max} de 677,5 nm. El espectro de emisión se ha desplazado significativamente hacia el rojo comparado con el de Cy 5,18. La DRAQ5 parece que presenta excitabilidad residual a longitudes de onda mucho más bajas aunque la intensidad de la fluorescencia para la excitación a la longitud de onda de 514 nm se redujo para DRAQ5 en comparación con los valores de excitación a 647 nm, manteniendo las características del espectro de excitación (no se muestran los datos).

El modelado molecular sugiere que la DRAQ5 es capaz de unirse al DNA por medio de intercalación, teniendo cada una de las cadenas laterales sobre los lados opuestos de la estructura del anillo aromático, el potencial para estabilizar la molécula sobre DNA.

Los experimentos fluorométricos indican que el DNA afecta a la fluorescencia de DRAQ5 de una manera compleja con relaciones crecientes DNA:DRAQ5 asociadas con un desplazamiento al rojo de la Em_{\lambda max} a 697 nm a una relación molar de DNA:DRAQ5 de 64. Este desplazamiento por la interacción del DNA se muestra en la Fig. 1c. A altas relaciones DNA:DRAQ5, equivalentes a las encontradas en las tinciones de células vitales, la pérdida de la señal de DRAQ5 debida a algún efecto de apagamiento colorante-colorante parece ser mínima. El desplazamiento al rojo de Em_{\lambda max} y la considerable disminución de la señal infrarrojo/infrarrojo a longitudes de onda más allá de 730 nm distingue esta sonda de Cy 5,18 a pesar de las características similares de excitación.

Ejemplo 4 Aplicaciones de imagen y microscopía de DRAQ5 como una nueva sonda de unión al DNA fluorescente en el rojo intenso/infrarrojo

Los aspectos preferidos de la invención se refieren al desarrollo de un colorante interactivo con el DNA que penetra en la célula, capaz de actuar como un marcador discriminatorio u orientador del DNA celular, con una señal de fluorescencia que se extiende a la región del infrarrojo del espectro. La invención permite que los métodos de microscopía de excitación de multi-láser, multifluorocrómicos y multifotónicos sean usados tanto en muestras fijadas como en células viables. Se describen aquí las características espectrales de DRAQ5 y se demuestran las aplicaciones potenciales de esta sonda de DNA para el análisis multiparamétrico de las células vivas y fijadas usando microscopía confocal de barrido con láser.

Cultivo celular

Se cultivó la línea de células A375 de melanoma humano como cultivo asíncrono en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 1 mM y antibióticos y se incubó a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% en aire. Para experimentos de imagen, se cultivaron las células a una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo como una monocapa sobre cubres de vidrio autoclavados en placas de 6 pocillos durante 48 horas antes del tratamiento. Las células viables adheridas se montaron en PBS fresco para microscopía. Cuando fue indicado, se fijaron las células adheridas con metanol al 70% a -20ºC durante 10 minutos antes de la rehidratación y tinción con bromuro de etidio a 5 \mug/ml durante 10 minutos en presencia de 5 mg/ml de RNasa A.

Preparación del fármaco y tratamiento

Se sintetizó DRAQ5 usando los principios descritos y se almacenó a +4ºC como una solución acuosa stock de concentración 10 mM. Las diluciones de DRAQ5 se prepararon en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron directamente a los cultivos. Se preparó diacetato de fluoresceína (FDA; Koch Light Laboratories) como una solución stock de concentración 12 mM en acetona y se almacenó a -20ºC. Se trataron las células con FDA 0,2 \muM durante 10 minutos a 37ºC bien solas o bien después de una exposición de 50 min a DRAQ5. Asimismo las células tratadas con DRAQ5 se marcaron con rodamina 123 (grado láser, Kodak) a 2 \mug/ml de medio de cultivo durante 10 min, antes del análisis.

Microscopía confocal de barrido con láser (CLSM) de las células intactas

El sistema usado fue un equipo de barrido Leica TCS 4D (LaserTechnik Gmbh, Germany) acoplado a un microscopio Leitz DM R y que opera con un láser Ominchrome de argón/criptón. El láser proporcionaba líneas de emisión a 488, 568 y 647 nm con potencia variable. Los cultivos en cubres se lavaron brevemente con PBS, se montaron en posiciones invertidas sobre portas, siendo sostenidos los cubres en los bordes por un ribeteado de vaselina para evitar que las células se compriman. Se examinaron inmediatamente los portas usando lentes de objetivo de inmersión en aceite x100 x40 con diafragma de intervalo medio y ajustes de la amplificación del fotomultiplicador. Las longitudes de onda de excitación/emisión para DRAQ5, fluoresceína y rodamina 123 fueron 647 nm/>665 nm, 488 nm/>515 nm y 488 nm/>590 nm respectivamente. Las ganancias de amplificación se ajustaron de tal modo que la muestra más fluorescente tratada con el fármaco dio unas intensidades pixel justo por debajo de la saturación. Se ajustó el nivel negro/contraste para dar efectivamente un fondo cero (<4 para el valor pixel) después de la filtración del ruido de circuito 16x de las imágenes de los controles no tratados. Usando este método, los controles no tratados, mostraron una autofluorescencia mínima y no dieron ninguna imagen discernible evitando la necesidad de una corrección del fondo. Las imágenes conseguidas se convirtieron para análisis y se combinaron usando un software de análisis de imágenes IP Lab Spectrum (Signal Analytics Corp. Vienna, VA, USA).

Análisis por CLSM de la fluorescencia de DRAQ5 en células viables

Para llegar a comprender algo sobre la dependencia de la fluorescencia de DRAQ5 de la longitud de onda de excitación y la separación espectral de su señal de fluorescencia de la de otra sonda de DNA, se han comparado células teñidas con DRAQ5 o con bromuro de etidio. El intervalo de sensibilidad de la CLSM con excitación a 488 nm o a 568 nm se optimizó con respecto a la fluorescencia de las células fijadas con etanol, teñidas con bromuro de etidio (Figuras 2d-2f), mientras que la imagen con excitación a 647 nm se optimizó sobre células viables tratadas con DRAQ5 (Fig. 2c). Las figuras 2a-2f muestran que a concentraciones adecuadas de fluorocromo para obtener imágenes de los núcleos y con una apropiada filtración de la emisión, se pueden usar condiciones de excitación a 488 nm y 647 nm para obtener exclusivamente imágenes con tinción bien de bromuro de etidio o bien de DRAQ5, respectivamente. Se puede usar también DRAQ5 para obtener imágenes de células fijadas con retención de gran parte de la estructura nuclear observable en las células viables intactas (no se muestran datos). La activación de la fluorescencia se ha observado también usando excitación multifotónica de las células fijadas teñidas con DRAQ5 (células humanas del linfoma de células B; fijadas con etanol; DRAQ5 10 \muM; excitación con láser YLF de modos fijos a 15 mW usando un sistema modificado de imagen confocal MRC600; Ex_{\lambda} = 1047 nm; Em_{\lambda} = rojo lejano; Fig. 2g).

Usando la CLSM con excitación a 647 nm (Fig. 2c) hubo una clara demostración de la fluorescencia localizada en el núcleo, bastante diferente de otros agentes seleccionados basados en antraquinona y antraciclina, que produjeron tanto señales nucleares como señales citoplásmicas. La Fig. 2c muestra que las células viables tratadas con DRAQ5 presentan una clara definición de la estructura nuclear y la definición de los bordes de las regiones de la membrana nucleolar y nuclear.

Por tanto, las figuras 2a-2f muestran características espectrales de la fluorescencia de DNA asociada a DRAQ5 detectada por CLSM: Paneles a-c, excitación a longitudes de onda de 488, 568 y 647 nm respectivamente para las células viables de melanoma A375 humano. Paneles d-f, excitación a longitudes de onda de 488, 568 y 647 nm respectivamente para las células fijadas con etanol teñidas con bromuro de etidio. La imágenes miden 100 x 100 \mum.

Imagen multifotónica de DRAQ5

El principio de la microscopía de fluorescencia excitada con 2 fotones fue demostrado en primer lugar por Web y colaboradores (Science, 248, 73-76 (1990); patente de Estados Unidos 5.034.613). En esencia, esto incluye la captura de dos fotones por una molécula excitable mediante el ordenamiento de las condiciones de excitación que favorecen tales sucesos. El espectro de excitación para un fluorocromo dado para sucesos multifotónicos difiere del correspondiente espectro de excitación por un único fotón aunque los espectros de emisión son independientes del modo de excitación. El componente clave del sistema de excitación, cuando se aplica a la obtención de imágenes, es un láser sintonizable o un láser de modos fijos con longitud de onda fija, dando pulsos ultracortos con una velocidad de repetición alta. El microscopio multifotónico típicamente incorpora un láser sintonizable Ti-Sapphire que emite dentro del intervalo de longitud de onda 700-950, con una amplitud de pulsos de aproximadamente 100 femtosegundos, y una velocidad de repetición de 80 MHz. Se pueden usar también los láser de longitud de onda fija tal como un láser YLF con modos fijos que proporciona una excitación multifotónica a 1047 nm. La intensidad del pico de tales láser es tan alta que la excitación del color puede ocurrir por absorción de dos o más fotones en rápida sucesión. De forma importante, la excitación multifotónica evita la necesidad de longitudes de onda de excitación cortas (por ejemplo, UV). Además, puesto que la excitación de fluorescencia se localiza en la región del punto focal, el sistema multifotónico puede seccionar ópticamente un objeto escaneado con fotodecoloración restringida. La excitación multifotónica (dual) de DRAQ5 se ha conseguido usando el láser YLF de modos fijos y en la Fig. 2g se muestra un ejemplo de una imagen recogida que muestra la fluorescencia de las células fijadas localizada en el núcleo. Se ha observado también la excitación multifotónica de DRAQ5 en los núcleos de las células fijadas usando un láser Ti-Sapphire (bombeado con 5 W) que emite a una longitud de onda de 740 nm (consistente con la capacidad de excitar en UV a los núcleos de células tratadas con DRAQ5, como se muestra en la Fig. 11). Se espera que el espectro de excitación de DRAQ5, consistente con lo encontrado para otros fluorocromos, difiere del determinado por espectroscopía de un simple fotón. La penetración de los rayos láser infrarrojos ofrece aplicaciones para la excitación multifotónica de DRAQ5 en el barrido de sección/tejidos profundos para la localización, cuantificación y morfología de los núcleos permitiendo una reconstrucción 3D precisa de los entornos celulares complejos.

La Fig. 2g muestra la imagen multifotónica de los núcleos celulares teñidos con DRAQ5. Las células del linfoma de células B humano se fijaron con etanol y se tiñeron con DRAQ5 20 \muM. Se usó la excitación con láser YLF de modos fijos a 15 mW (Ex \lambda = 1047 nm; Em \lambda = rojo lejano) y se obtuvieron imágenes usando objetivos de aceite 60 x N.A. 1,4, un factor de zoom de 1,9 y un promedio Kalman de 37 marcos.

Análisis por CLSM de la fluorescencia de DRAQ5 y un derivado N-óxido (DRAQ5N) en células viables

Se ha intentado poner un ejemplo del efecto de los cambios de la estructura de un compuesto de la forma general del compuesto (I) sobre las características de tinción de las células viables. Un derivado N-óxido de DRAQ5 (esto es DRAQ5N) retiene la estructura general (I) pero ha perdido la carga global. El cambio afecta a la eficiencia del potencial de unión del agente en las células viables aunque se retiene la fluorescencia, las propiedades de penetración en las células y la localización en el núcleo. Las figuras 2h a 2k muestran que bajo condiciones equivalentes para la detección de la fluorescencia nuclear en células humanas viables, la intensidad de la fluorescencia nuclear integrada de DRAQ5 por sección del núcleo fue aproximadamente 10 veces mayor que el valor derivado para las células tratadas con DRAQ5N. En las publicaciones anteriores (véanse las referencias 1-10 más adelante) se han descrito las características de los N-óxidos de alquilaminoantraquinona y sus potenciales como pro-fármacos biorreductores. Por tanto el N-óxido de DRAQ5 (esto es DRAQ5N) descrito aquí compartirá las propiedades de esta clase de agentes siendo capaz de la conversión biorreductora a DRAQ5. Se sugiere en esta invención que las nuevas características de fluorescencia de DRAQ5 proporcionarán un marcador de la actividad biorreductora celular y por implicación de un estado hipóxico, en virtud de la conversión de DRAQ5N. Por tanto, la presente invención contempla el uso de DRAQ5N como un marcador de las células hipóxicas.

Por tanto, las figuras 2h a 2k muestran simultáneamente la captura por CSLM de la transmisión (paneles h y j) y las correspondientes imágenes de la fluorescencia en el rojo lejano/infrarrojo inferior (paneles i y j respectivamente) de las células viables HL60 expuestas o bien a DRAQ5 10 \muM o bien a DRAQ5N 10 \muM durante 1 h.

1. Patterson LH: Anthraquinone anticancer compounds with (disubstituted amino-N-oxide)alkylamino substituent. UK Patent GB2237283, 1989.

2. Patterson , LH. Rationale for the use of aliphatic N-oxides of cytotoxic anthraquinones as prodrug DNA binding agents: a new class of bioreductive agent. Cancer and Metastasis Revs. 12, 119-134, 1993.

3. Patterson , LH, Craven, MR, Fisher, GR and Teesdale-Spittle, P. Aliphatic amine N-oxides of DNA binding agents as bioreductive drugs. Oncology Research 6. 533-536, 1994.

4. Mckeown, SR, Hejmadi, MV, Mclntyre, lA, McAleer, JJA and Patterson . LH. AO4N: an alkylaminoanthraquínone N-oxide showing bioreductlve potential and positive interaction with radiation in vivo. Brit J Cancer, 72,76-81.

5. Mckeown, SR. Hejmadi, MV, Mclntyre, lA, McAtaar, JJA and Patterson , LH. AQ4N: an alkylaminoanthraqulnone N-oxide showing bioreductive potential and positive interaction with radiation. Brit J Cancer. 72, 76-81, 1995.

6. Wilson, WR, Denny, WA, Pullen, SM, Thompson, KM, LI, AE, Patterson . LH. Tertiary amine N-oxides as bioreductlve drugs: DACA N-oxide, nitracrine N-oxide and AQ4N, Brit J Cancer, 74,843-47, 1996.

7. McKeown, SR, Friery, OP, Mclntyre, lA, Hejmadj, MV, Patterson LH. Evidence for a therapeutic gain when AQ4N or tirapazamine is combined with radiation Brit J Cancer 74, S39-42, 1996.

8. Hejmadi, MV, McKeown, MV, Friery, OP, Mclntyre , lA, Patterson , LH and Hirst, DG. DNA damage following combination of radiation with the bioreductive drug AQ4N: possible selective toxicity to oxic and hypoxic cells. Brlt J Cancer, 73, 499-505. 1996.

9. Smith, PJ, Blunt, NJ. Desnoyers, R, Giles, Y and Patterson , LH. DNA topoisomerase II dependent cytotoxicity of alkylaminoanthraquinones and their N-oxides. Cancer Chemotherap. Pharmacol, 39, 455-461 (1997).

10. Smith, PJ. Desnoyers. R, Blunt, N, Giles, Y and Patterson , LH. Flow cytomeric analysis and confocal imaging of anticancer alkylaminoanthraquinones and their N-oxides in intact human cells using 647 nm Krypton laser excitation. Cytometry, 27, 1,43-53, 1997.

Obtención de imágenes por CLSM de la tinción de células vitales con fluorocromo dual

Se ha intentado demostrar la separación espectral de la señal de fluorescencia de DRAQ5 de las de otros fluorocromos usados habitualmente utilizando una excitación selectiva. La Fig. 3b muestra la variación significativa de la capacidad de las células A375 para la conversión intracelular de la FDA por escisión con esterasa hasta la forma retenida de fluoresceína. La obtención de imágenes de la misma muestra usando la excitación selectiva de DRAQ5 demuestra claramente la morfología nuclear (Fig. 3c), mientras que la obtención de imágenes por transmisión (Fig. 3a) revela la forma celular global. El análisis por triple imagen identifica los pares de células hijas (marcadas x, y, y z por flechas en la Fig. 3d). La obtención dual de imágenes se ha extendido a un colorante vital capaz de definir las organelas citoplásmicas. Las figuras 4a-4c muestran las células co-marcadas con DRAQ5 (núcleos) y con rodamina 123 (mitocondrias).

Por tanto, las figuras 3a-3d muestran la excitación díferencial de la fluoresceina y la DRAQ5 en células A375 viables analizadas por CLSM. Las células se trataron con DRAQ5 10 \muM durante 1 h y posteriormente se marcaron con FDA a 1 \muM durante 15 min. Los paneles muestran las mismas vistas de imágenes como sigue: a, imagen por transmisión; b, excitación de fluoresceína a 488 nm; c, excitación a 647 nm de DRAQ5; d, imágenes combinadas a-c codificadas con azul, verde y rojo respectivamente. Las imágenes miden 250 x 250 \mum; los pares de células hijas se indican por flechas.

Las figuras 4a-4c representan las imágenes a-c que muestran la excitación diferencial de rodamina 123 y DRAQ5 en células A375 viables analizadas por microscopía confocal de barrido con láser. Las células fueron tratadas con DRAQ5 10 \muM durante 1 h y posteriormente fueron marcadas con rodamina 123 a 2 \mug/ml durante 5 minutos. Las imágenes a y b muestran la misma vista con excitación a 488 nm o a 647 nm, respectivamente. La imagen c representa las imágenes combinadas de a (codificada en verde) y b (codificada en rojo ). Las imágenes miden 100 x 100 \mum.

Ejemplo 5 Aplicaciones de DRAQ5 en la citometría de flujo como una nueva sonda de unión al DNA fluorescente en el rojo intenso/infrarrojo

La citometría de flujo, como se usa aquí, es un procedimiento para la medida de las características de dispersión de la luz y de fluorescencia de las células o partículas que pasan a través de un aparato de medir en una corriente fluida en la que las células individuales atraviesan la posición(s) focal de los rayos láser simples o múltiples. Se hace seguimiento electrónicamente del retraso en el tiempo del paso a lo largo de las posiciones focales separadas espacialmente que permite que el citómetro genere medidas multiparamétricas totalmente correlacionadas para configuraciones de haz múltiple. Se demuestra aquí el uso de DRAQ5 en sistemas de haz simple, dual y triple en un conjunto de aplicaciones usando células humanas.

Cultivo de células

Se cultivaron células HL60 (línea de células de la leucemia promielocítica humana) y células SUD4 (línea de células del linfoma de células B humano) como cultivos en suspensión en medio RMPI con 10% de suero fetal bovino, glutamína 1 mM y antibióticos y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% en aire. Para los experimentos de citometría de flujo, los cultivos en suspensión, que crecen asíncronamente se diluyeron a 2,5-4 x 10^{5} células/ml a las 2 h antes del tratamiento con el fármaco. Se obtuvieron poblaciones con el ciclo celular alterado tratando células SUD4 con el fármaco etopósido (VP-16-213) a 0,25 \muM durante 18 h. Se trataron las células con DRAQ5 y FDA como se ha descrito antes. Las concentraciones de células se determinaron usando un contador Coulter y se determinó la distribución del ciclo celular usando un algoritmo para la distribución normal de los perfiles de intensidad de fluorescencia para las células G1 y G2 teñidas por fluorocromo.

Los cultivos en suspensión se analizaron por citometría de flujo sin lavado. La sangre humana se obtuvo usando venopunción rutinaria de un donante sano y las muestras se manipularon usando procedimientos hematológicos estándar para el aislamiento de las células sanguíneas mononucleares y para el reconocimiento del antígeno de superficie usando paneles de anticuerpos (véase la Tabla 1).

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

8

^{a} Fluorescencia detectada sobre FL3 y analizada como un parámetro del área del pulso para las poblaciones de células elegidas sobre las relevantes características de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Todas las preparaciones celulares se analizaron a 2,5 x 10^{5}/ml a menos que se indique otra cosa, en solución salina tamponada con fosfato más BSA al 1% (esto es tampón de análisis) sin DRAQ5 20 \muM (0 min de exposición) o con DRAQ5 20 \muM (5 ó 120 min de exposición).

^{b} Preparación 1: células derivadas del cultivo celular de la línea del linfoma de células B foliculares humanas SUD4 y resuspendidas en tampón de análisis. El análisis paralelo de muestras usando tinción convencional con bromuro de etidio de las células permeabilizadas digeridas con RNasa A dio G1 = 34,9%, fase S = 48,0%, G2/M = 17,1% para cultivos asíncronos y G1 = 0,6%, fase S = 55,3%. G2/M = 44,0% para las células paradas en el final del ciclo celular obtenidas tratando las células con el fármaco citotóxico VP-16 (0,25 \muM durante 18 h). El análisis cuantitativo del contenido de DNA de G1 (SUD4):G1 (linfocitos diploides normales) dio una relación de 1,083.

^{c} Preparación 2: como la Preparación 1 pero procesada para análisis del antígeno de superficie usando anticuerpos marcados directamente: anti-CD54-FITC (detectado sobre el parámetro FL1), anti-CD19-PE (detectado sobre el parámetro FL2).

^{d} Preparación 3: células sanguíneas viables mononucleares de un donante normal separadas por gradiente de Ficoll. Las muestras se obtuvieron por venopunción rutinaria (relación linfocitos:monocitos = 11,5:1) y se resuspendieron en tampón de análisis.

^{e} Preparación 4: como la Preparación 3 pero procesada para análisis del antígeno de superficie usando anti-CD54-FITC.

^{f} Preparación 5: sangre entera de un donante normal procesada para análisis del antígeno de superficie, analizada como células viables usando la positividad anti-CD54-FITC como el activador maestro del parámetro FL1 para excluir las RBC. Las poblaciones separadas tienen 25,5% de linfocitos, 13,3% de monocitos, 61,2% de granulocitos.

^{g} Preparación 6: como la Preparación 5 pero después de procesada para análisis del antígeno de superficie, células fijadas y RBC lisadas en FACSLyse™ y resuspendidas en tampón de análisis. El parámetro FSC como activador maestro. Las poblaciones separadas tienen 43,7% de linfocitos, 9,7% de monocitos, 46,6% de granulocitos.

Citometría de flujo

Se analizaron las células usando uno de estos cuatro citómetros según los requerimientos de excitación.

Citómetro A: Excitación por láser de criptón a 647 nm con alta potencia y haz simple: El sistema era un citómetro construido a petición del cliente al que se incorporó un láser de criptón Innova 3000K (Coherent Corp., Palo Alto, CA, USA) ajustado a la línea de 647 nm. Se recogieron emisiones de dispersión de luz directa, de dispersión de luz a 90º y de fluorescencia para 1 x 10^{4} células usando el parámetrode dispersión de luz a 90º como la señal maestra. El sistema óptico permitió el análisis de diferentes longitudes de onda de emisión de fluorescencia incluyendo: >715 nm (denominada infrarrojo inferior) y, como se indica aquí fluorescencia >780 nm (infrarrojo). Se analizaron la dispersión de la luz directa y la dispersión de la luz a 90º, para la identificación de los restos celulares. La potencia del láser se fijó a 200 mW y se usaron amplificadores lineales para las señales de fluorescencia. Los elementos ópticos de análisis incluyeron un espejo dicroico frío a 675 nm, la temperatura ambiental del laboratorio fue aproximadamente 12ºC y el reservorio de cubierta se mantuvo a 10ºC. Los filtros fueron suministrados por Melles Griot. Se calcularon los parámetros mediana, media y modo para la distribución de los valores de la intensidad de fluorescencia a lo largo de una población celular dada. En todos los experimentos, los valores de la mediana y la media produjeron resultados muy similares. Se registraron sólo los valores de la mediana porque este parámetro es menos afectado por la presencia de células altamente fluorescentes más allá del límite superior de cuantificación.

Citómetro B: Excitación por láser de haz dual a 633 nm con baja potencia y a 488 nm con alta potencia: El sistema fue un clasificador celular FACS 440 (Beckton Dickinson Inc., Cowley, UK) que incorpora un láser de ion argón de Spectra Physics (máximo 500 mW de salida), ajustado a la línea de 488 nm (100 mW de salida), y un láser secundario de helio-neón Spectra Physics 156 que emite a 633 nm (emisión < 5mW),con una separación temporal del haz de aproximadamente 30 \mus. Se recogieron emisiones de dispersión de luz directa, de dispersión de luz a 90ºC y de fluorescencia para 1 x 10^{4} células usando el parámetro de dispersión de luz directa como la señal maestra desde el haz primario a 488 nm, mientras que la dispersión lateral se recogió a través de un filtro d paso de banda de 488/10 nm. Los elementos ópticos de análisis incluyeron : i) un espejo dicroico frío (transmisión > 675 nm), ii) fluorescencia de la fluoresceína excitada por el haz a 488 nm, detectada con un PMT guardado por un filtro de paso de banda de 535/15 nm sin señal de retraso, y iii) un PMT sensible al rojo con un retraso apropiado, adicionalmente guardado por un filtro de paso largo a 620 nm, para detectar el haz transmitido de la fluorescencia asociada a DRAQ5 a longitudes de onda más allá de 675 nm (rojo alto y extendiéndose hasta la región infrarrojo del espectro). Se analizaron la dispersión de la luz directa y la dispersión de la luz a 90º para excluir todos los restos celulares. Todos los parámetros se adquirieron en el canal de resolución 256 con un software Consort 30 (Becton Dickinson) y se analizaron después con software WinMDI (J. Trotter, La Jolla, CA). El sistema empleó los mismos elementos ópticos de análisis cuando se usó en el modo de haz simple a 488 nm pero sin retraso de la señal para el PMT sensible al rojo.

Citómetro C: Excitación por láser de criptón a 488 nm con baja potencia y haz simple: El sistema era un FACScan (Beckton Dickinson Inc., Cowley, UK) que incorpora un láser de ion argón (máximo 15 mW de salida), ajustado a la línea de 488 nm. Se recogieron emisiones de dispersión de luz directa, de dispersión de luz a 90º y de fluorescencia para 1 x 10^{4} células usando el parámetrode dispersión de luz directa como la señal maestra. Los elementos ópticos del sistema estándar proporcionaron los parámetros del PMT, FL1 (azul)/FL2 (verde)/FL3 (rojo) con el análisis de pulsos realizado sobre las señales que originan el FL3.

Citómetro D: Excitación por láser de triple haz a 633 nm con media potencia, a 488 nm con media potencia y a multilínea UV con media potencia: El sistema fue un clasificador celular FACS Vantage (Beckton Dickinson Inc., Cowley, UK) que incorpora un láser Coherent Enterprise II que emite simultáneamente a longitudes de onda multilínea UV (intervalo de 350-360 nm) y 488 nm con los haces preparados como no colineales usando separadores dicroicos. Se usaron elementos ópticos que combinan los haces para alinear el haz UV con el emitido por un láser de helio-neón Spectra Physics 127-35 (máximo 35 mW de salida), que emite a 633 nm con una separación temporal de aproximadamente 25 \mus de la del haz primario a 488 nm. Se recogieron emisiones de dispersión de luz directa, de dispersión de luz a 90º y de fluorescencia para 1 x 10^{4}células usando el parámetrode dispersión de luz directa, como la señal maestra para el haz primario a 488 nm, mientras que la dispersión lateral se recogió a través de un filtro de paso de banda de 488/10 nm. Los elementos ópticos de análisis fueron: i) las señales que originan el haz primario analizadas a FL1 (filtro FITC, filtro de barrera de 530/30 nm) después de transmisión en los dicroicos SP610 y SP560, o a FL2 (filtros de barrera de 585/42 nm o 575/26 nm) después de transmisión en un dicroico SP610 y de reflexión en un dicroico SP560, o en FL3 (filtros de barrera de LP175 nm) después de reflexión en un dicroico SP610; ii) las señales que originan el haz retardado analizadas en FL4 (filtro de barrera de LP695 nm) o en FL5 (filtro de barrera de DF424/44 nm) después transmisión o reflexión en dicroicos LP640 nm respectivamente. Se analizaron la dispersión de luz directa y la dispersión de la luz a 90º para excluir todos los restos celulares. Todos los parámetros se analizaron usando un software CellQuest (Becton Dickinson).

Fluorescencia de la célula entera detectada por citometría de flujo

A pesar de que la excitación de DRAQ5 sea óptima a la longitud de onda del láser de 647 nm, los estudios preliminares indicaron que la sonda podría ser excitada sub-óptimamente a longitudes de onda más bajas, incluyendo la multilínea UV 488 nm, 514 nm y 633 nm. En esta invención se ha buscado evaluar DRAQ5 como una sonda de DNA para uso en citometría de flujo comparando las configuraciones de los cuatro diferentes citómetros.

Citómetro A: Excitación por láser de criptón a 647 nm con alta potencia y haz simple.

Citómetro B: Excitación por láser de haz dual a 633 nm con baja potencia y a 488 nm con alta potencia.

Citómetro C: Excitación por láser de criptón a 488 nm con baja potencia y haz simple.

Citómetro D: Excitación por láser de triple haz a 633 nm con media potencia, a 488 nm con media potencia y a multilínea UV con media potencia.

La Fig. 5 demuestra que usando un láser HeNe de baja potencia (Citómetro B), no tiene lugar una separación completa de las señales de autofluorescencia y de DRAQ5 para las células viables HL-60 tratadas con concentraciones de DRAQ5 bajas, no saturantes. Estudios posteriores (no se muestran datos) indican que se podría alcanzar la separación completa después de dos horas de incubación con DRAQ5 20 \muM. Sin embargo, incluso bajo estas condiciones limitantes de excitación la señal de DRAQ5 derivada a 633 nm muestra una clara relación líneal dosis-respuesta (véase el gráfico insertado de la Fig. 5) que llega hasta aproximadamente 2,5 \muM, comparable con la linealidad obtenida para la excitación óptima a 647 nm (usando el Citómetro A) y la detección a las longitudes de onda > 780 nm.

Las figuras 6a y 6b demuestran que se puede usar un láser HeNe de baja potencia (Citómetro B) para identificar la fluorescencia asociada a DRAQ5 en las células cargadas con fluoresceína analizadas en una configuración de haz dual. Las figuras 6c y 6d demuestran que es posible la co-excitación de DRAQ5 y fluoresceína usando un haz simple de longitud de onda de 488 nm (Citómetro B). Hay una clara separación de señales, debida a los distintos espectros no solapantes, a pesar de la señal de baja intensidad derivada de la excitación sub-óptima de DRAQ5.

Se ha intentado demostrar la utilidad de DRAQ5 en un citómetro de simple haz (esto es FACScan™; Citómetro C). Las figuras 7a-7d presentan resultados típicos que demuestran la capacidad de DRAQ5 para identificar las células nucleadas en poblaciones complejas. La Fig. 7a muestra la detección de la distribución del ciclo celular frente a la expresión del antígeno de superficie celular para las células intactas. La Fig. 7b muestra la discriminación de los subconjuntos según el potencial de tinción mientras que las figuras 7c y 7d demuestran la aplicación de DRAQ5 para detectar las células nucleadas en la sangre entera y en la sangre lisada. Los factores relativos a la capacidad de DRAQ5 para teñir los núcleos se analizan en la tabla. Usando células asíncronas cultivadas viables (Preparación 1) la DRAQ5 tiñó rápidamente las células de una manera reproducible y generó la fluorescencia distinta de la autofluorescencia de fondo. Los valores grandes de sd se derivan de la dispersión de las células a lo largo del ciclo celular. El valor medio refleja el contenido medio de DNA celular como se evidencia por el incremento de 1,7 veces para las poblaciones de G2 paradas. El procesado de las células para el análisis del antígeno de superficie (Preparación 2) no afecta a las características anteriores. El aislamiento de las células sanguíneas mononucleares intactas (Preparaciones 3 y 4) proporciona muestras que se pueden teñir dentro de un intervalo de densidad celular conveniente y se pueden procesar para el análisis del antígeno de superficie. En las preparaciones 3 y 4 se ha observado de forma consistente un mejor potencial de tinción de los monocitos frente a los linfocitos (1,14-1,4 veces) lo que indica que el potencial de tinción de las células viables se puede usar como un factor para la discriminación de las subpoblaciones. Los resultados para la sangre entera muestran que las células nucleadas (incluyendo los granulocitos) se pueden teñir hasta un grado similar en presencia (Preparación 5) de glóbulos rojos (RBC) o después de la lisis y fijación media de los RBC (Preparación 6).

La Fig. 8 resume las diferencias, dependientes de la concentración de DRAQ5, en la tinción por DRAQ5 de las poblaciones celulares viables obtenidas usado los métodos de preparación 1 y 2 (véanse las notas al pie de la tabla). Las poblaciones muestran curvas de titulación similares, teniendo lugar la saturación de una manera que refleja el contenido relativo de DNA (para un tipo dado de células, por ejemplo SUD4) o el potencial de tinción nuclear (por ejemplo, linfocitos frente a monocitos) a concentraciones \geq 10 \muM.

La Fig. 9 demuestra la utilidad de DRAQ5 para la detección de la expresión específica del ciclo celular de una proteína intracelular, en células fijadas, detectada usando anticuerpos marcados con fluorocromo activados por longitudes de onda de 488 nm (FITC) y multilínea UV (Citómetro D). Las figuras 10a-10f muestran que en una configuración de triple haz (Citómetro D) es posible demostrar la fluorescencia de DRAQ5 activada por dos haces separados con discriminación sobre un tercero para el seguimiento de los sucesos del ciclo celular relativamente raros tales como la alta expresión de ciclina B1 en G2/M de los cultivos asíncronos.

Por tanto, la Fig. 5 muestra el análisis por citometría de flujo de la acumulación de DRAQ5, durante un periodo de exposición de una hora, en células HL60 viables. Los histogramas de distribución de frecuencias corresponden a una excitación a longitud de onda de 633 nm de baja potencia usando el Citómetro B. Símbolos: \medcirc, \blacktriangle, y \oblong, representan 0, 5 y 10 \muM de DRAQ5 respectivamente. Gráfico insertado: linealidad de dosis DRAQ5/respuesta usando dos citómetros diferentes (especialmente B y A con coeficientes de correlación de 0,96 y 0,97 para excitaciones a 633 nm y 647 nm respectivamente).

Las figuras 6a a 6d muestran el análisis por citometría de flujo por haz dual (Citómetro B) para la detección de la fluorescencia asociada a DRAQ5 en células HL60 viables marcadas con fluoresceína. Gráficos representativos de dos variables por citometría de flujo de las señales de fluorescencia de la célula entera en verde (FL2-altura; fluoresceína) frente a rojo intenso/infrarrojo inferior (FL1-altura; DRAQ5). Los paneles a y b muestran la excitación por haz dual de fluoresceína (488 nm) y DRAQ5 (633 nm a baja potencia). Panel a: FDA (0,2 \muM durante 10 min solo); panel b, células pretratadas con DRAQ5 5 \muM durante 1 hora antes del tratamiento con FDA. Los paneles c y d repiten las mismas condiciones de tratamiento celular excepto el uso de la excitación por simple haz a 488 nm para la fluoresceína y DRAQ5. Las cifras indican el porcentaje de sucesos elegidos dentro de las regiones del cuadrante.

Las figuras 7a a 7d muestran el análisis por citometría de flujo de haz simple (Citómetro C) de la fluorescencia de DRAQ5 (FL3-área) frente a la fluorescencia de anticuerpos (monitorización por FL2-altura de los anti-CD19 marcados con ficoeritrina o monitorización por FL1-altura de los anti-CD45 marcados con FITC) para células humanas cultivadas y derivadas de la sangre. Las suspensiones celulares (2,5 x 10^{5}/ml) se mantuvieron en solución salina tamponada con fosfato que contiene seroalbúmina bovina al 1%. Las subpoblaciones celulares mononucleares de sangre humana, obtenidas usando separación estándar por gradiente de Ficoll, se identificaron y separaron de acuerdo con sus características de dispersión directa y lateral de la luz. Se excluyeron los dobletes por análisis de pulsos separando sobre los valores de los parámetros FL3-área normal frente a los valores de los parámetros FL3-anchura. Panel a: células cultivadas asíncronas de linfoma SUD4. Panel b: subpoblaciones celulares mononucleares de sangre obtenidas usando separación estándar por gradiente de Ficoll. Panel c: sangre entera (activada en sucesos con CD45+). Panel d: sangre entera lisada. Subpoblaciones marcadas con flechas: G1, S y G2/M representan fases del ciclo celular; L, linfocitos; M, monocitos; G, granulocitos, N, núcleos que carecen de membranas plasmáticas.

La Fig. 8 muestra una cuantificación citométrica baja de haz simple (Citómetro C) de la intensidad de fluorescencia de células humanas cultivadas y derivadas de la sangre expuestas a DRAQ5 a temperatura ambiente durante 5 min. Los datos son la media de los valores (\pm SD) y representan los resultados de un experimento típico. Símbolos: \medcirc, células de linfoma SUD4 asíncronas cultivadas; \Box, células SUD4 expuestas a VP-16 0,25 \muM durante 18 h para detener las células en las fases S y G2 del ciclo celular; \bullet, linfocitos; \oblong, monocitos.

La Fig. 9 muestra el análisis por citometría de flujo de haz dual (Citómetro D) de la expresión de la ciclina B1 específica del ciclo celular. Las células SUD4 fijadas, digeridas con RNasa A y teñidas con DRAQ5 (FL3: excitación a 488 nm) se obtuvieron de un cultivo asíncrono expuesto a VP-16 0,25 \muM durante 18 h para acumular las células en G2/M. Se hizo seguimiento de la proteína ciclina B1 expresada en la fase G2/M por inmunofluorescencia indirecta usando un segundo anticuerpo marcado con AMCA (FL5-altura; excitación a multilínea UV) para detectar la unión de la IgG monoclonal de ratón anti-ciclina B1 (GNS1). Los paneles a y c muestran los anticuerpos controles (IgG no específica más el segundo anticuerpo). Los paneles b y d muestran los resultados para el anticuerpo específico más el segundo anticuerpo. Los anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. Subpoblaciones marcadas con flechas: G1, S y G2/M representan fases del ciclo celular: la flecha sin letras muestra la posición esperada de las células que expresan altos niveles de ciclina B1 y localizada en G2/M del ciclo celular.

Las figuras 10a a 10f muestran el análisis por citometría de flujo de triple haz (Citómetro D) de células de linfoma SUD4 asíncronas fijadas y teñidas con DRAQ5 y digeridas con RNasa A. La fluorescencia de DRAQ5 (altura del pulso) se monitorizó por FL3 (excitación a 488 nm) y FL4 (excitación a 633 nm). La proteína Cdc2 independiente del ciclo celular y la proteína ciclina B1 expresada en la fase G2/M se monitorizaron por inmunofluorescencia indirecta usando un segundo anticuerpo marcado con FITC (FL1-altura; excitación a 488 nm) para detectar la unión de la IgG policlonal de conejo anti-Cdc2 p34 (H-297), y el segundo anticuerpo marcado con AMCA (FL5-altura; excitación a multilínea UV) para detectar la unión de la IgG monoclonal de ratón anti-ciclina B1 (GNS1). Los anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. Paneles: a y b, DNA frente a Cdc-2 p34; c y d, DNA frente a ciclina B1; e y f, histogramas de DNA para longitudes de onda de excitación en el azul y en el rojo respectivamente. Subpoblaciones marcadas con flechas: G1, S y G2/M representan fases del ciclo celular: HCyB, células que expresan altos niveles de ciclina B1 localizadas en G2/M del ciclo celular.

\newpage

Análisis por citometría de flujo de la excitación en multilínea UV de células teñidas con DRAQ5

Los picos de absorbancia observados para las longitudes de onda < 400 nm dan a entender que debería ser posible la excitación del cromóforo a longitudes de onda en el UV cercano, (no se muestran datos). Se ha demostrado que los núcleos teñidos con DRAQ5 de células vivas se pueden excitar en la región del UV cercano del espectro como se muestra por el uso de la citometría de flujo en multilínea UV (Citómetro D; figuras 11a-11c). Aunque la excitación con UV es menos eficiente que a la longitud de onda de 647 nm (Fig. 11b) y la detección requiere el aumento de la amplificación de la señal del fotomultiplicador, las intensidades de fluorescencia reflejan claramente la distribución del contenido del DNA celular (Fig. 11c). Esto demuestra que en las combinaciones de triple haz, la DRAQ5 puede proporcionar una señal discriminatoria de DNA derivada de longitudes de onda de excitación en el intervalo UV y visible.

Las figuras 11a-11c muestran la excitación de DRAQ5 a 488 nm (panel a), 647 nm (panel b), o multilínea UV (intervalo 350-360 nm; panel c) en células de linfoma SUD4 intactas para emisión a longitudes de onda >695 nm y analizadas por citometría de flujo con haz múltiple (Citómetro D). Las líneas en negrita reflejan el contenido de DNA celular de las células teñidas con DRAQ5, las líneas simuladas representan las células control no teñidas, las líneas de puntos representan microperlas de referencia teñidas con aloficocianina (APC) de referencia usadas como estándares excitables a 647 nm.

Ejemplo 6 Acumulación celular diferencial de un derivado N-óxido de DRAQ5 (DRAQ5NO) en la discriminación de células intactas y células muertas

La capacidad para discriminar células viables intactas de las que sufren las diferentes etapas de la muerte celular se puede conseguir a través de la acumulación celular diferencial de sondas químicas que incluyen ciertos fluorocromos. Un tipo particular de muerte celular, denominado apoptosis, tiene etapas iniciales fácilmente discernibles que pueden ocurrir en las células intactas. La discriminación se usa extensamente tanto en los ensayos biológicos como en los clínicos. Por ejemplo, los ensayos por citometría de flujo pueden permitir la identificación, cuantificación, análisis, preparación o exclusión de subconjuntos celulares. La absorción y retención de la sonda depende de múltiples factores, incluyendo la integridad de la membrana plasmática (por ejemplo, que afecta a la entrada de la sonda) y el comportamiento intracelular de la sonda (por ejemplo, la unión de la sonda al DNA nuclear). Los ensayos fluorométricos actuales de la muerte celular pueden usar la capacidad de las células viables intactas para permanecer sin teñirse debido a la exclusión de la sonda (por ejemplo, la tinción fluorescente del DNA con yoduro de propidio) mientras que las células con membranas afectadas permiten el acceso de la sonda al DNA nuclear. Las células que están sufriendo las primeras etapas de la muerte celular apoptótica se pueden identificar por la unión a la superficie celular del compuesto químico marcado con el fluorocromo, anexina V, pero no muestran ninguna pérdida de la integridad de la membrana. Las últimas etapas de la muerte celular y apoptosis, cuando las membranas plasmáticas llegan a romperse, están asociadas con una alta unión a la anexina V y alta tinción del DNA con yoduro de propidio.

Se pone aquí como ejemplo el uso de un derivado N-óxido de DRAQ5 (DRAQ5NO) que proporciona una mejora de la discriminación de las células vivas y muertas. El DRAQ5NO es capaz de entrar dentro de las células viables intactas y de ser retenido en ellas a un bajo nivel, proporcionando una discriminación positiva de las células intactas. En combinación con una sonda secundaria (por ejemplo anexina V) hay una mejor discriminación de las etapas de la progresión celular a través del proceso de la muerte celular o apoptosis. Las cuatro etapas, según los patrones de tinción son:

Etapa 1: DRAQ5NO positiva/anexina V negativa (células viables intactas)

Etapa 2: DRAQ5NO positiva/anexina V positiva (células en las etapas apoptóticas iniciales)

Etapa 3: DRAQ5NO altamente positiva/anexina V positiva (últimas etapas apoptóticas/células muertas)

Etapa 4: DRAQ5NO negativa/anexina V positiva (restos celulares no nucleados).

Las figuras 12a-12d y las figuras 13a-13d ilustran ejemplos, que usan una línea celular de linfoma de células B humano capaz de progresión a través de la apoptosis en respuesta al fármaco anti-cáncer VP-16 (etopósido) para una exposición de 18 h a concentración 0,25 \muM. Las células se prepararon por métodos estándar para la unión de anexina V-FITC, se expusieron simultáneamente a DRAQ5NO 50 \muM y después se diluyeron 1:5 en solución salina tamponada con fosfato antes del análisis por citometría de flujo usando el Citómetro D. El instrumento se usó en un modo de láser dual con una excitación de FITC a longitud de onda de 488 nm (monitorizada por el parámetro FL1-H) y una excitación de DRAQ5NO a longitud de onda de 633 nm (monitorizada por el parámetro FL4-H). Las figuras 12a-12d muestran las combinaciones de los tratamientos con reactivos (Anx = anexina V-FITC; AQ5N = el derivado N-óxido de DRAQ5) para las células control y las figuras 13a-13d muestran la misma combinación de reactivos para los cultivos tratados con VP-16 (esto es VP). Los resultados muestran el bajo nivel de tinción por DRAQ5NO conseguido en las poblaciones de la etapa 1 y el mayor nivel en las células de la etapa 3. La frecuencia de las células que son positivas a la anexina V se aumenta por el tratamiento con VP-16 pero comprende tres poblaciones (etapas 2-4) discernibles usando el análisis del cuadrante que se muestra en los gráficos. La mejora proporcionada por el uso de DRAQ5NO es con respecto a dos características. En primer lugar, las ventajosas propiedades espectrales del derivado de DRAQ5 que permite la separación de los sucesos de excitación de la sonda por el uso de dos láser y/o el solapamiento espectral de las señales de emisión de la sonda muy reducido. En segundo lugar, la discriminación positiva de las células intactas de los restos celulares no nucleados.

Claims (27)

1. Un compuesto aislado de la siguiente fórmula:

9

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que X_{1} y X_{2} son NH(CH_{2})_{2}NR^{1}R^{2}.

3. Un compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que R^{1} y R^{2} son un alquilo C_{1-4}.

4. Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R^{1} y R^{2} son metilo.

5. Una composición acuosa que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un método para preparar un compuesto de la siguiente fórmula:

10

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico,

comprendiendo el método la etapa de hacer reaccionar un compuesto de la siguiente fórmula:

11

con NH_{2}-A-NR^{1}R^{2}, donde A, R^{1} y R^{2} son como se han definido antes, para proporcionar un compuesto resultante, cuyo compuesto resultante puede además ser tratado opcionalmente con un ácido.

7. Un método según la reivindicación 6, que comprende también la etapa de un tratamiento subsiguiente con clorato de sodio y/o hidrógenosulfito de sodio.

8. Un complejo fluorescente que comprende un ácido nucleico y un compuesto de la siguiente fórmula:

12

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo heterocíclico,

o uno de sus derivados N-óxidos,

y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico.

9. Un complejo según la reivindicación 8, en el que el ácido nucleico es DNA.

10. Un complejo según la reivindicación 9, en el que el DNA está presente en una célula viva.

11. Un método para analizar una célula o material biológico que contiene uno o más ácidos nucleicos, que comprende las etapas de:

a) preparar una solución biológicamente compatible que contiene un compuesto de la fórmula (I):

13

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo heterocíclico,

o uno de sus derivados N-óxidos,

y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico;

b) tratar la célula o material biológico con la solución biológicamente compatible;

c) excitar el compuesto (I) en la célula o material biológico tratados con una fuente de luz; y

d) detectar la señal de fluorescencia emitida.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la fuente de luz proporciona una o más longitudes de onda en la región espectral de las longitudes de onda de máxima absorción del compuesto (I).

13. Un método según las reivindicaciones 11 ó 12, en el que el compuesto (I) está presente en la célula o material biológico con uno o más de otros fluorocromos o compuestos que emiten luz.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que los fluorocromos emiten en la región UV o visible del espectro.

15. Un método según las reivindicaciones 13 ó 14, en el que uno o más de los otros fluorocromos se usan para detectar la unión de la anexina V.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende la etapa de análisis por citometría de flujo.

17. El uso de un compuesto de la siguiente fórmula:

14

\newpage

en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son independientemente NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4} y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo heterocíclico,

o uno de sus derivados N-óxidos,

y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico,

como un colorante del DNA.

18. El uso de un compuesto según la reivindicación 17, en un ensayo biológico.

19. El uso de un compuesto según la reivindicación 18, en el que el compuesto está presente como un derivado N-óxido.

20. El uso de un compuesto según la reivindicación 18, en citometría.

21. El uso de un compuesto según la reivindicación 20, en el que el compuesto está presente como un derivado N-óxido.

22. El uso de un compuesto según las reivindicaciones 20 ó 21, en el que la citometría es citometría de flujo de haz simple o haz múltiple.

23. El uso de un compuesto según la reivindicación 17, en microscopía.

24. El uso de un compuesto según la reivindicación 23, en el que el compuesto está presente como un derivado N-óxido.

25. El uso de un compuesto según las reivindicaciones 23 ó 24, en el que la microscopía es microscopía confocal de barrido con láser.

26. El uso de un compuesto según la reivindicación 17, como un agente de tinción nuclear.

27. El uso de un compuesto según la reivindicación 17, como un agente de formación de imágenes.